12_Detectie_kweek_en_identificatie.pptx

# Diagnostische principes en technieken in de medische microbiologie Hier volgt een gedetailleerde studiehandleiding voor "Diagnostische principes en technieken in de medische microbiologie", gebaseerd op de verstrekte documentinhoud (pagina's 12-24, 26-45). ## 1. Diagnostische principes en technieken in de medische microbiologie Dit deel behandelt de algemene principes van diagnostiek in de medische microbiologie, de diverse methoden voor het aantonen van pathogenen en immuniteit, en de interpretatie van laboratoriumresultaten. ### 1.1 De taken van het medisch microbiologisch laboratorium Het medisch microbiologisch laboratorium voert onderzoek uit op aanvraag van de arts met als doel: * Vaststellen of een patiënt een infectie heeft. * Identificeren van de verwekker(s) van de infectie. * Bepalen van bruikbare antimicrobiële middelen (antibiogram). Daarnaast adviseert het laboratorium over de juiste staalafname en staalbewaring. De technieken omvatten microscopie, kweek met identificatie, antigeendetectie, moleculaire detectietechnieken en serologie. Het antibiogram is niet alleen belangrijk voor de individuele patiënt, maar ook voor de gemeenschap door het monitoren van resistentiecijfers en epidemiologie. ### 1.2 Microbiologische etiologie aantonen: met welke technieken? Vaak is een klinisch beeld niet voldoende specifiek om de diagnose en verwekker direct te identificeren. Diagnostische technieken bieden hierbij uitkomst. De methoden kunnen grofweg worden onderverdeeld in: * **Directe detectie:** * Microscopie * Niet-microscopische methoden (bv. antigeendetectie, genoomdetectie) * **Detectie na amplificatie (kweek of moleculair):** * Kweek van micro-organismen * Moleculaire amplificatietechnieken (bv. PCR) * **Immunologische detectie:** * Serologie (detectie van antilichamen) * Huidtesten #### 1.2.1. Microscopie Gewone lichtmicroscopie, met een maximale vergroting van ongeveer 1000x, maakt objecten groter dan 0,2 micrometer zichtbaar. Het kan gebruikt worden voor het aantonen van fungi, parasieten en voor urineweginfecties ('wet stain'). Voor bacteriën is meestal een 1000x vergroting met gefixeerd en gekleurd preparaat nodig. * **Gramkleuring:** Dit is de meest gebruikte kleuring in de bacteriologie. Het onderscheid tussen grampositieve (blauw) en gramnegatieve (rood) bacteriën is gebaseerd op de celwandsamenstelling (hoeveelheid peptidoglycaan). Dit kan cruciaal zijn voor de initiële diagnose, bijvoorbeeld bij verdenking op meningitis, waarbij grampositieve en gramnegatieve diplokokken direct aanwijzingen geven voor de behandeling (pneumokok vs. meningokok). * **Zuurvaste kleuring (bv. Ziehl-Neelsen, Auramine):** Gebruikt voor het aantonen van zuurvaste bacteriën, met name mycobacteriën. Deze kleuringen maken gebruik van intracellulaire kleurstoffen die resistent zijn tegen een zuur-alcohol mengsel, dankzij de mycolzuurmantel van de bacteriën. Auramine kleuring maakt gebruik van fluorescentie. * **Fluorescentiemicroscopie:** Kan gebruikt worden om micro-organismen aan te tonen na kleuring met een antiserum met een fluorescerende marker, of met een DNA-probe (FISH). Antigenen van bacteriën en virussen kunnen ook met deze techniek worden opgespoord door middel van directe of indirecte immunofluorescentie. * **Elektronenmicroscopie (EM):** Nodig voor het zichtbaar maken van virussen. Zeer zelden gebruikt in de routinediagnostiek. **Tip:** Microscopie biedt een snelle, goedkope methode met een directe indicatie van de verwekker, vooral bij meningitis. Nadelen zijn de beperkte specificiteit en de mogelijke interferentie met de normale flora. #### 1.2.2. Niet-microscopische methoden Deze methoden detecteren pathogenen zonder gebruik te maken van lichtmicroscopie of amplificatie. Ze zijn gebaseerd op antilichaam-antigeen reacties of nucleïnezuur hybridisatie. * **Antigeendetectie:** Sneltesten, vaak gebaseerd op immunochromatografie of ELISA, kunnen antigenen van bacteriën, virussen, schimmels en protozoa aantonen. Voorbeelden zijn C. difficile toxine in feces, rotavirus in stoelgang, en Plasmodium spp. antigenen bij malaria. * **Nucleïnezuur hybridisatie (in situ):** Kan worden gebruikt om genetisch materiaal van pathogenen direct in weefsels aan te tonen. **Tip:** Deze methoden zijn snel en kunnen vaak ter plekke worden uitgevoerd, maar de gevoeligheid kan beperkt zijn. Ze zijn nuttig voor specifieke pathogenen waarvoor snelle diagnostiek gewenst is. #### 1.2.3. Basistechniek voor kweek van micro-organismen Kweek berust op het principe dat micro-organismen zich vermenigvuldigen onder optimale omstandigheden (voedingsbodem, temperatuur, atmosferische condities). * **Kweekbodems:** * **Vloeibare kweekbodems:** Gebruikt voor het opsporen van groei (troebelheid) en voor verder onderzoek naar bacteriële kenmerken. * **Agarbodems:** Hierop ontstaan zichtbare kolonies, waarbij één bacterie idealiter één kolonie vormt. Kweekplaten worden vaak uitgesmeerd in verdunningen om geïsoleerde kolonies te verkrijgen voor identificatie. Resultaten kunnen kwalitatief (groei/geen groei), semi-kwantitatief (+, ++, +++), of kwantitatief (kolonievormende eenheden per volume, KVE/CFU) worden gerapporteerd. * **Selectieve en differentiële bodems:** Specifieke stoffen kunnen worden toegevoegd aan kweekbodems om de groei van bepaalde micro-organismen te bevorderen (selectief) of om onderscheid te maken tussen soorten op basis van kolonie-uiterlijk (bv. kleur door chromogene stoffen) of enzymatische activiteit (bv. hemolyse op bloedagar). **Tip:** Het belang van de juiste staalafname en de interpretatie van kweekresultaten in de context van de normale flora is cruciaal. * **Identificatie van de opgegroeide bacteriën:** Na kweek worden bacteriën geïdentificeerd op basis van: * Gramkleur en celvorm. * Uiterlijk van kolonies (grootte, kleur, geur). * Fysiologische en biochemische eigenschappen (bv. suiker- of aminozuurafbraak, enzymatische tests). * Genetisch profiel (bv. 16S rRNA gen sequentie). * Serologische reacties (agglutinatie met specifieke antilichamen). #### 1.2.4. Enzymatische en serologische identificatie Dit omvat een reeks biochemische tests die de enzymatische capaciteit van bacteriën onderzoeken om specifieke substraten af te breken. Vroeger werden hiervoor uitgebreide 'batterijen' van chemische tests gebruikt; tegenwoordig zijn er geautomatiseerde systemen die dit sneller en efficiënter doen. #### 1.2.5. Identificatie met MaldiTOF massaspectrografie Matrix-assisted laser desorption/ionization Time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie is een moderne techniek die sinds ongeveer tien jaar in diagnostische laboratoria wordt gebruikt. Het maakt snelle (binnen een kwartier na kolonie-isolatie) en universele identificatie van bacteriën en gisten mogelijk door het analyseren van hun eiwitprofiel, dat als een 'fingerprint' dient. Dit resulteert in een aanzienlijke tijdwinst ten opzichte van klassieke methoden. #### 1.2.6. Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen vereisen speciale kweekomstandigheden: * **Anaeroben:** Vereisen kweekomstandigheden zonder zuurstof, zowel tijdens transport als in het laboratorium. Speciale anaerobe kasten of zakken worden hiervoor gebruikt. * **Trage groeiers of niet op klassieke bodems:** Mycobacteriën (weken), Mycoplasmata (microscopische kolonies op speciale media), Chlamydia (alleen op cellijnen). * **(Bijna) onkweekbare bacteriën:** Sommige kunnen alleen in een diermodel worden gekweekt (bv. Mycobacterium leprae in gordeldier), andere helemaal niet in vitro. * **Schimmels en gisten:** Groeien vaak op speciale media, soms langzamer dan bacteriën. * **Virussen:** Vereisen levende cellijnen voor kweek. Obligaat intracellulaire parasieten. * **Protozoa:** Niet routinematig kweekbaar. **Tip:** Voor veel van deze moeilijk kweekbare micro-organismen worden steeds vaker moleculaire detectietechnieken (bv. PCR) ingezet als alternatief of aanvulling op de kweek, vooral als een antibiogram niet noodzakelijk is. ### 1.3 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek De interpretatie van bacteriologisch onderzoek vereist een strategische aanpak: * **Focus op de klinische vraag:** Het laboratorium identificeert niet alle aanwezige bacteriën, maar richt zich op de pathogenen die de klinische vraag verklaren. * **Kennis van de normale flora:** Het laboratorium moet onderscheid kunnen maken tussen commensale flora en pathogenen. * **Staaltypes:** De aard van het staal bepaalt mede de interpretatie: * **Type I (steriele plaatsen):** Bloed, gewrichtsvocht, pleuravocht. Gevonden micro-organismen zijn bijna altijd pathogenen, mits aseptisch afgenomen. Huidbewoners die worden aangetroffen, worden vaak als contaminanten beschouwd. * **Type II (potentieel steriele plaatsen, passage door niet-steriele zones):** Sputum, urine. Hierbij is er een risico op contaminatie. Metingen zijn vaak semi-kwantitatief of kwantitatief om significante aantallen te onderscheiden van normale flora. Kwaliteitsindicatoren zoals het aantal plaveiselcellen (sputum) of de cel/witbalans (urine) zijn belangrijk. * **Type III (gemengd met normale flora):** Feces, keeluitstrijkje, wondvocht, vagina. Hierbij is specifieke kennis van pathogenen en vaak selectieve kweekbodems nodig. Kwantiteit kan ook hier belangrijk zijn (bv. Candida-overgroei). * **Belang van communicatie:** De aanvragende arts moet de klinische vraag duidelijk communiceren, en indien er een specifieke verwachting is (bv. op basis van reizen, immuunsuppressie), moet dit worden doorgegeven aan de microbioloog. #### 1.3.1. Staaltypes in detail * **Type I Staal:** Afkomstig van een locatie zonder normale flora. Elk gevonden micro-organisme is potentieel pathogeen. Aseptische afname is cruciaal. Hemoculturen zijn een speciaal type Type I staal, waarbij een grote hoeveelheid bloed in een rijk medium wordt geïncubeerd. * **Type II Staal:** Afkomstig van een locatie die normaal steriel is, maar waar de afname door een zone met normale flora passeert (bv. sputum dat door de keel gaat). Maatregelen bij afname, transport en verwerking zijn gericht op het minimaliseren van contaminatie. Kwantitatieve kweek en het opsporen van bekende pathogenen zijn hierbij belangrijk. Kwaliteitsindicatoren (bv. plaveiselcellen in sputum, neutrofielen in urine) helpen bij de interpretatie. * **Type III Monsters:** Een mix van pathogenen en normale flora. Identificatie vereist kennis van specifieke pathogenen en vaak selectieve media. Kwantiteit kan relevant zijn (bv. Candida-infectie bij overgroei). #### 1.3.2. Belang van aspect tijd bij diagnose door kweek Kweekgebaseerde diagnostiek is relatief tijdrovend. Gewone bacteriologische kweek met identificatie duurt doorgaans 24-48 uur. Antibiogrammen vereisen nog eens 24-48 uur. Trager groeiende micro-organismen (virussen, mycobacteriën, anaeroben) vergen nog meer tijd, waardoor snellere non-culture technieken (zoals PCR en serologie) vaak de voorkeur krijgen. ### 1.4 Detectie na moleculaire amplificatie Moleculaire technieken, voornamelijk gebaseerd op PCR (Polymerase Chain Reaction) of reverse transcriptie-PCR (RT-PCR voor RNA), maken het mogelijk om genetisch materiaal van pathogenen te amplificeren en aan te tonen. * **Kenmerken:** * Vaak kwantitatief (bv. via CT-waarden of ijkcurves). * Zeer specifiek en gevoelig, wat zowel een voordeel als een nadeel kan zijn (risico op vals-positieve resultaten door contaminatie). * Breed toepassingsgebied voor alle pathogenen (bacteriën, virussen, schimmels, protozoa). * Kan worden gecombineerd met sequencing voor typeren van stammen of varianten. * **Toepassingen:** * **Bacteriën:** Aanwezigheid aantonen (bv. 16S rRNA gen), identificatie van moeilijk kweekbare soorten, detectie van resistentiegenen, stamtypering. * **Virussen:** Aanwezigheid aantonen en kwantificeren (bv. HIV, CMV, HBV), typeren van virale varianten, bepalen van antivirale resistentie op genetisch niveau. * **Schimmels en Protozoa:** Aanwezigheid aantonen in diverse staaltypes. **Tip:** Moleculaire amplificatie is een krachtige tool voor snelle en gevoelige diagnostiek, maar vereist strenge maatregelen om moleculaire contaminatie op het laboratorium te voorkomen. ### 1.5 Serologie Serologie detecteert antilichamen in serum (of ander lichaamsvocht) die door het lichaam zijn aangemaakt als reactie op een infectie. * **Principes:** * **Indirecte detectie:** Het toont geen pathogeen aan, maar het immuunantwoord erop. Dit betekent dat er geen informatie is over de aanwezigheid van het actieve agens, tenzij het agens per definitie nauwelijks uit het lichaam wordt geëlimineerd (bv. HIV). * **Meetinstrumenten:** Meestal gebaseerd op ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) of immunochromatografie (sneltesten). * **Specifieke antistoffen:** * **IgM:** Wijst meestal op een recente of acute infectie. De productie begint binnen een week en piekt binnen twee weken, waarna de titers na enkele maanden afnemen. * **IgG:** Wordt later gedetecteerd (na meer dan een week) en kan levenslang detecteerbaar blijven (niet altijd). Een viervoudige toename van de IgG-titer in twee opeenvolgende monsters (met minstens twee weken ertussen) duidt op een recente infectie of reactivatie. * **Interpretatie:** * **Windowfase:** De periode tussen infectie en detecteerbaarheid van antilichamen (vooral IgM en antigenen) of genetisch materiaal. Moleculaire technieken kunnen deze fase soms overbruggen. * **Vals-negatief:** Kan optreden bij patiënten met een verstoord immuunsysteem (bv. neonaten, ouderen, immuungedeprimeerden) die onvoldoende antistoffen produceren. * **Vals-positief:** Kan optreden bij passieve immunisatie (bv. transplacentair verkregen antistoffen bij neonaten, na transfusie met plasma) of bij polyklonale activatie van B-cellen (bv. bij Epstein-Barr virus infectie, wat kan leiden tot positieve resultaten voor andere antigenen). * **Titerbepaling:** Kwantificeren van antilichamen kan inzicht geven in de fase van de infectie of een herinfectie aantonen (boostreactie). * **Toepassingsgebieden:** Vooral voor virussen met een chronisch verloop, en voor bacteriële infecties die moeilijk te kweken zijn (bv. syfilis, Ziekte van Lyme). Ook voor screening van dragers (HIV, HBV, HCV) en het opvolgen van vaccinatiestatus. **Tip:** Serologie biedt een stabiele, relatief goedkope methode voor het aantonen van doorgemaakte infecties, maar de indirecte aard van de detectie is een belangrijke beperking. Een combinatie met andere technieken is vaak nodig voor een volledige diagnose. --- # Directe detectiemethoden van micro-organismen Directe detectiemethoden van micro-organismen omvatten een reeks technieken die worden gebruikt om pathogenen direct aan te tonen, wat cruciaal is voor diagnose en behandeling. ## 2. Directe detectiemethoden van micro-organismen Medisch microbiologische laboratoria ondersteunen artsen bij het diagnosticeren van infecties door pathogenen op te sporen, de verwekker te identificeren en informatie te verstrekken over geschikte antimicrobiële middelen. Naast microscopische technieken worden ook niet-microscopische methoden, detectie na amplificatie en serologische tests ingezet. ### 2.1 Microscopische methoden Microscopie maakt directe observatie van micro-organismen mogelijk. #### 2.1.1 Gewone lichtmicroscopie * **Vergroting:** Maximaal bereik is ongeveer $1000 \times$, waardoor objecten kleiner dan $0,2$ micrometer zichtbaar zijn. * **Toepassingen:** Kan worden gebruikt voor het aantonen van grotere structuren zoals schimmels en parasieten, of in urineweginfecties en vaginale uitstrijkjes ('wet stain'). * **Beperkingen:** Voor een duidelijk beeld van bacteriën is een hogere vergroting en kleuring noodzakelijk. Virussen, mycoplasmata en chlamydiae zijn niet zichtbaar met deze techniek. * **Kleuringen:** * **Gramkleuring:** De meest gebruikte kleuring in de bacteriologie. Het principe berust op de verschillen in celwandsamenstelling (hoeveelheid peptidoglycaan). Grampositieve bacteriën kleuren blauw, gramnegatieve bacteriën kleuren rood. Dit kan direct diagnostische informatie opleveren, met name bij verdenking op meningitis (diplokokken). * **Zuurvaste kleuringen (bv. Ziehl-Neelsen, Auramine):** Gebruikt voor het aantonen van zuurvaste bacteriën, met name mycobacteriën (zoals *Mycobacterium tuberculosis*). Deze kleuringen maken gebruik van intracellulaire kleurstoffen die bestand zijn tegen ontkleuring met zuur en alcohol, dankzij de mycolzuurmantel van de celwand. Auraminekleuring werkt fluorescerend en is sneller en gevoeliger. * **Fluorescentiemicroscopie:** Maakt detectie mogelijk van micro-organismen of weefsels die gekleurd zijn met een fluorescent gelabeld antiserum of probe (bv. FISH - Fluorescence In Situ Hybridization). Antigenen van bacteriën en virussen kunnen worden aangetoond. #### 2.1.2 Elektronenmicroscopie (EM) * **Toepassing:** Noodzakelijk voor het visualiseren van virussen. * **Gebruik:** Zelden gebruikt in routinediagnostiek vanwege de hoge kosten en complexiteit. #### 2.1.3 'Wet stain' en preparaten * **Toepassing:** Een natte preparaat (zonder fixatie of kleuring) kan worden gebruikt voor het direct bekijken van bijvoorbeeld parasieten (*Trichomonas vaginalis*) of gisten in vaginale uitstrijkjes. * **Cytopathogeen effect:** Virussen worden indirect zichtbaar gemaakt door hun destructieve effect op celculturen waarin ze worden gekweekt. > **Tip:** Microscopie biedt snelle resultaten en is waardevol voor specifieke indicaties zoals meningitis of het beoordelen van de staalkwaliteit, maar de interpretatie kan bemoeilijkt worden door de aanwezigheid van normale flora of de onspecifieke morfologie van micro-organismen. ### 2.2 Niet-microscopische methoden (antigeendetectie) Deze methoden detecteren direct pathogenen of delen daarvan, zonder gebruik te maken van microscopie en zonder *in vitro* amplificatie. Ze zijn nuttig wanneer micro-organismen te klein, verborgen zijn of geen typische morfologie hebben. * **Principe:** Meestal gebaseerd op antilichaam-antigeenreacties, of soms nucleïnezuurhybridisatie *in situ*. * **Voorbeelden:** * **Bacteriën:** Antigeentesten op urine voor *Streptococcus pneumoniae* (bij verdenking op pneumonie) of detectie van *Clostridioides difficile* toxine in feces. * **Virussen:** Sneltests voor rotavirus (feces), respiratoir syncytieel virus (RSV) of influenza (ademhalingsmonsters). Detectie van hepatitis B virus (HBV) S-antigeen of HIV p24-antigeen in bloed om de vensterperiode te verkorten. *In situ* hybridisatie voor humaan papillomavirus (HPV) in cervicale specimens. * **Schimmels:** Detectie van galactomannan-polysaccharide (een component van de celwand van *Aspergillus spp.*) in serum. Deze tests maken vaak gebruik van een sandwich ELISA-principe. * **Protozoa:** Sneltests voor *Plasmodium spp.* antigeen in bloed (bij verdenking op malaria), vaak gebaseerd op immunochromatografie (vergelijkbaar met zwangerschapstests). > **Tip:** Antigeendetectietests zijn snel, eenvoudig uit te voeren en vereisen minimale infrastructuur. Hun gevoeligheid kan echter beperkt zijn, en de resultaten zijn specifiek voor het gedetecteerde agens, waardoor andere oorzaken van ziekte mogelijk gemist worden. ### 2.3 Detectie na amplificatie Deze methoden maken gebruik van de replicatie-eigenschappen van micro-organismen of de amplificatie van hun genetisch materiaal. #### 2.3.1 Kweek van micro-organismen Dit is een basistechniek waarbij micro-organismen worden gekweekt op geschikte voedingsbodems onder optimale omstandigheden om hun groei en vermenigvuldiging te bevorderen. * **Optimale omstandigheden:** Omvatten de juiste voedingsbronnen (suikers, N-bronnen, mineralen), temperatuur (ongeveer $36$ °C) en atmosferische condities (aeroob, anaeroob, capnofiel). * **Vloeibare vs. Vaste kweekbodems:** Vloeibare bodems worden troebel bij groei. Vaste bodems (met agar) vormen kolonies die visueel kunnen worden beoordeeld op soort en aantal. * **Selectieve en differentiële bodems:** * **Selectieve bodems:** Bevatten stoffen die de groei van bepaalde micro-organismen remmen, waardoor klinisch relevante soorten beter zichtbaar worden. Antibiotica kunnen worden toegevoegd om resistente stammen op te sporen (bv. MRSA-screening). * **Differentiële bodems:** Bevatten pH-indicatoren of chromogene stoffen die kolonies verschillende kleuren geven, wat helpt bij identificatie. * **Hemolyse:** Het vermogen van bacteriën om rode bloedcellen te lyseren kan op bloedagar worden waargenomen en is nuttig voor de identificatie van o.a. streptokokken. #### 2.3.2 Identificatie van opgegroeide bacteriën Na kweek worden bacteriën geïdentificeerd op basis van diverse kenmerken: * **Morfologie:** Gramkleur, celvorm, kolonie-eigenschappen (grootte, randen, kleur, geur). * **Fysiologische en biochemische eigenschappen:** Afbraak van suikers en aminozuren, groei onder specifieke omstandigheden, productie van metabolieten. * **Genetisch profiel:** DNA- of RNA-analyse. * **Serologische methoden:** Gebruik van specifieke antilichamen. ##### 2.3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie Traditioneel werden batches van enzymatische tests gebruikt om de biochemische eigenschappen van bacteriën te bepalen. Serologische tests met antilichamen, soms gebonden aan latexdeeltjes, kunnen ook worden gebruikt voor identificatie (bv. agglutinatie). ##### 2.3.2.2 Identificatie met MALDI-TOF massaspectrografie Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie is een revolutionaire techniek die snel en universeel bacteriën identificeert op basis van hun eiwitprofiel. Het biedt een aanzienlijke tijdwinst vergeleken met klassieke methoden. #### 2.3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen vereisen speciale kweekomstandigheden: * **Anaeroben:** Vereisen kweekomstandigheden zonder zuurstof, inclusief transport. * **Trage groeiers:** Zoals mycobacteriën, die weken kunnen duren om te groeien. * **Mycoplasmata, Chlamydiae:** Vereisen speciale media of celculturen. Chlamydiae worden momenteel vaker gedetecteerd met moleculaire methoden. * **Virussen:** Vereisen celculturen en worden vaak gedetecteerd via cytopathogeen effect of moleculaire technieken. * **Schimmels en gisten:** Kunnen op verschillende media groeien, soms langzamer dan bacteriën. * **Protozoa:** Routinematig niet kweekbaar. #### 2.3.4 Interpretatie van bacteriologisch onderzoek De interpretatie van kweekresultaten vereist kennis van de normale flora en de klinische vraag. Niet alle gevonden bacteriën zijn pathogenen. * **Staaltypes:** * **Type 1:** Monsterniveau van een steriele locatie (bv. bloed, gewrichtsvocht). Elke gevonden bacterie is waarschijnlijk een pathogeen. Aseptische afname is cruciaal. * **Type 2:** Monster dat een niet-steriele locatie passeert (bv. sputum, urine). Maatregelen bij afname, transport en verwerking zijn nodig om contaminatie met normale flora te minimaliseren. Kwantitatieve tellingen zijn hierbij vaak informatief. * **Type 3:** Monster met een mengsel van pathogenen en normale flora (bv. feces, keeluitstrijk, wondvocht). Kennis van specifieke pathogenen en selectieve kweekbodems zijn essentieel. Kwantificering kan belangrijk zijn bij overgroei. #### 2.3.5 Belang van tijd bij kweekdiagnostiek Kweekgebaseerde diagnostiek is doorgaans tijdrovend, variërend van 24-48 uur voor standaardbacteriën tot weken voor complexere organismen. Dit kan leiden tot vertraging in behandeling. #### 2.3.6 Detectie na moleculaire amplificatie (bv. PCR) Moleculaire technieken, met name Polymerase Chain Reaction (PCR), amplificeren genetisch materiaal (DNA of RNA na reverse transcriptie) van micro-organismen. * **Voordelen:** Zeer gevoelig en specifiek, toepasbaar op een breed scala aan pathogenen (bacteriën, virussen, schimmels, protozoa). Resultaten zijn vaak kwantitatief. * **Toepassingen:** Detectie van moeilijk kweekbare organismen, aanwijzen van resistentiegenen, typeren van stammen en het onderzoeken van microbiële diversiteit (microbioom). * **Beperkingen:** Gevoeligheid kan leiden tot valspositieve resultaten door contaminatie. Er is strikte controle op moleculaire contaminatie in het laboratorium nodig. ### 2.4 Serologie Serologische methoden detecteren antilichamen geproduceerd door het immuunsysteem van de patiënt als reactie op een infectie. * **Principe:** Meestal gebaseerd op technieken zoals ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), die antigenen van het pathogeen gebruiken om antilichamen in patiëntserum te detecteren. * **Informatie:** Geeft indirect bewijs van contact met een agens, maar informeert niet direct over de aanwezigheid van het actieve agens. * **Interpreteren van resultaten:** * **IgM antistoffen:** Wijzen meestal op een recente infectie. * **IgG antistoffen:** Kunnen wijzen op een vroegere infectie, maar ook op een recente infectie of reactivatie. Een viervoudige stijging in IgG-titer tussen twee monsters, genomen met minimaal twee weken ertussen, suggereert een recente infectie. * **Vensterperiode (window phase):** De periode tussen infectie en detecteerbaarheid van antilichamen. Moleculaire technieken zoals PCR kunnen deze periode overbruggen. * **Beperkingen:** Vals negatieve resultaten kunnen optreden bij immuungecompromitteerde patiënten. Vals positieve resultaten kunnen voorkomen bij passieve immunisatie (bv. neonaten met maternale antilichamen, na transfusie met immuunglobulinen). * **Toepassingen:** Screening op dragerschap (bv. HIV, HBV, HCV), bepaling van vaccinatiestatus (bv. HBV), diagnostiek van virale infecties met chronisch verloop en bepaalde bacteriële infecties (bv. syfilis, Lyme-ziekte). > **Tip:** Serologie is een stabiele en relatief goedkope diagnostische methode, maar het is essentieel om te onthouden dat het een indirecte aanwijzing is van infectie. Combinatie met andere methoden (bv. moleculaire detectie) kan de diagnostische zekerheid vergroten. --- # Kweek en identificatie van micro-organismen Hier is een gedetailleerd studiegids-overzicht voor "Kweek en identificatie van micro-organismen", gebaseerd op de verstrekte documentatie. ## 3. Kweek en identificatie van micro-organismen Dit hoofdstuk behandelt de fundamentele technieken voor het kweken van micro-organismen, het gebruik van gespecialiseerde kweekmedia, en diverse methoden voor de identificatie van opgekweekte bacteriën, waaronder enzymatische, serologische en massaspectrografische benaderingen. ### 3.1 Diagnostiek en de rol van het laboratorium Het medisch microbiologisch/virologisch laboratorium speelt een cruciale rol in de diagnostiek van infectieziekten. Artsen vragen onderzoeken aan om te bepalen of een patiënt een infectie heeft, wat de verwekker is, en welke antimicrobiële middelen effectief zijn. Het laboratorium ondersteunt dit met diverse technieken, waaronder microscopie, kweek met identificatie, antigeendetectie, moleculaire detectietechnieken en serologie. Het belang van een correcte staalafname en -bewaring is hierbij essentieel, aangezien pre-analytische fouten de resultaten sterk kunnen beïnvloeden. #### 3.1.1 Taken van het medisch microbiologisch laboratorium De primaire taken omvatten: * Het vaststellen van een mogelijke infectie. * Identificatie van de specifieke verwekker. * Het bepalen van de gevoeligheid van de verwekker voor antimicrobiële middelen (antibiogram). * Epidemiologische surveillance (bijvoorbeeld via 'fingerprinting' of resistentiecijfers). #### 3.1.2 Aanvraagformulieren en staalafname Aanvraagformulieren, nu vaak elektronisch, vereisen gedetailleerde patiëntinformatie en de afnamedatum om de pre-analytische fase te documenteren. Specifieke vragen over de klinische presentatie (bv. type hepatitis, asymptomatische infectie) leiden tot gerichte testen. De wijze van staalafname is van groot belang voor de betrouwbaarheid van de resultaten. * **Hemoculturen (bloedkweek):** Belangrijk bij verdenking op sepsis. * **Urine:** Verschillende afnamemethoden (gewoon, midstream, via sonde, blaaspunctie) beïnvloeden de kans op contaminatie. Blaaspunctie geeft het meest betrouwbare resultaat qua steriliteit. * **Kathetertip:** Voor het aantonen van infecties gerelateerd aan medische lijnen. * **Prostaatmassage:** Om materiaal uit de prostaat te verkrijgen. #### 3.1.3 Microbiologische etiologie aantonen: technieken Wanneer het klinische beeld niet eenduidig is, worden diverse diagnostische technieken ingezet: * **Microscopie:** Gebruikelijk voor het aantonen van morfologie van bacteriën, gisten en parasieten. Voor een gedetailleerd beeld van bacteriën is fixatie en kleuring (bv. Gram-kleuring) nodig. Virussen zijn hiermee niet zichtbaar. * **Niet-microscopische methoden:** Directe detectie van antigenen of genetisch materiaal, vaak met behulp van antilichamen of probes. * **Detectie na amplificatie:** Moleculaire technieken zoals PCR om genetisch materiaal te vermenigvuldigen. * **Immunologische methoden:** Serologie (detectie van antilichamen) of huidtests. ### 3.2 Directe detectie Directe detectiemethoden maken het mogelijk om micro-organismen of hun componenten te identificeren zonder eerst in vitro amplificatie. #### 3.2.1 Microscopie Gewone lichtmicroscopie kan objecten tot ongeveer 0,2 micrometer (µm) zichtbaar maken. Zonder fixatie en kleuring is deze methode vooral nuttig voor grotere structuren zoals schimmels en parasieten, of voor een eerste indruk bij urineweginfecties en vaginale uitstrijkjes (wet mount). Voor een duidelijker beeld van bacteriën is een vergroting van 1000x, met fixatie en kleuring, vereist. De Gram-kleuring is hierbij de meest gebruikte methode in de bacteriologie. * **Gram-kleuring:** Verdeelt bacteriën in Gram-positief (blauw/paars) en Gram-negatief (rood) op basis van hun celwandsamenstelling (peptidoglycaanlaag). Dit kan snel essentiële informatie opleveren, met name bij verdenking op meningitis (pneumokokken vs. meningokokken). * **Gram-positieve diplokokken:** Duiding op *Streptococcus pneumoniae* (pneumokok). Behandeling met ceftriaxon. Geen secundaire gevallen te verwachten. * **Gram-negatieve diplokokken:** Duiding op *Neisseria meningitidis* (meningokok). Behandeling met smal spectrum penicilline of amoxicilline. Preventieve maatregelen voor contactpersonen zijn noodzakelijk. * **Zuurvaste kleuring (bv. Ziehl-Neelsen, Auramine):** Specifiek voor mycobacteriën (zoals *Mycobacterium tuberculosis*) vanwege hun mycolzuurrijke celwand. Auramine is een fluorescerende kleurstof, wat het detecteren van lage bacteriële ladingen vergemakkelijkt met een fluorescentiemicroscoop. * **Fluorescentiemicroscopie:** Gebruikt fluorescerende markers (op antistoffen of probes) om micro-organismen of hun componenten zichtbaar te maken. Dit is waardevol voor het opsporen van antigenen van bacteriën en virussen. * **Elektronenmicroscopie (EM):** Nodig voor het zichtbaar maken van virussen, maar wordt zelden in de routinediagnostiek gebruikt. **Tip:** Microscopie biedt snelle resultaten, kost relatief weinig infrastructuur, en kan helpen bij het inschatten van staalkwaliteit (bv. contaminatie van sputum met speekselcellen). Het is echter niet altijd specifiek genoeg en kan beperkt worden door de normale flora. #### 3.2.2 Niet-microscopische methoden Deze methoden detecteren pathogeen-specifieke moleculen zonder noodzakelijkerwijs op microscopie te vertrouwen. * **Antigeendetectie:** Gebruikt antilichamen om antigenen van micro-organismen te detecteren. Voorbeelden zijn sneltesten voor *Clostridioides difficile* toxine in feces, of RSV en rotavirus in respiratoire of fecale monsters. Ook antigenen van virussen zoals HBV (HBsAg) en HIV (p24Ag) kunnen vroeg in de infectie gedetecteerd worden. * **Nucleïnezuur hybridisatie (in situ):** Kan worden gebruikt om genetisch materiaal van pathogenen direct in weefsels aan te tonen, zoals HPV in cervicale specimen. * **Schimmelantigeendetectie:** Bijvoorbeeld galactomannan polysaccharide, een component van de celwand van *Aspergillus spp.*, dat in serum kan worden gemeten. * **Protozoaire antigeendetectie:** Zoals Plasmodium spp. antigenen in bloed voor malaria. **Tip:** Deze testen zijn vaak snel (binnen enkele minuten tot uren), eenvoudig uit te voeren en vereisen weinig gespecialiseerde apparatuur. Een nadeel kan de beperkte gevoeligheid zijn en de kosten per test bij eenmalig gebruik. Ze genereren ook meer afval in vergelijking met kweekmethoden. ### 3.3 Detectie na amplificatie Dit omvat methoden die gericht zijn op het vermenigvuldigen van genetisch materiaal van micro-organismen of op hun vermenigvuldiging zelf (kweek). #### 3.3.1 Basistechniek voor kweek van micro-organismen Kweek is gebaseerd op de eigenschap van micro-organismen om zich te vermenigvuldigen onder optimale omstandigheden (voedingsbron, temperatuur, atmosferische condities). * **Optimale omstandigheden:** * **Voedingsbron:** Suikers, stikstofbronnen (bv. vleesextract, soja), mineralen, buffer. * **Temperatuur:** Vaak rond 36 °C. * **Atmosfeer:** Aerobe, anaerobe, of capnofiele (verhoogde CO2) condities. * **Kweekmedia:** * **Vloeibare kweekbodems:** Veroorzaken troebeling bij groei, gebruikt voor verdere karakterisering. * **Agarbodems:** Vormen vaste kolonies. De grootte, vorm en kleur van kolonies kunnen al suggestief zijn voor bepaalde micro-organismen. Uitspreiden in verdunningszones (dilutie-enting) is essentieel voor isolatie van individuele kolonies. Resultaten kunnen kwalitatief (groei/geen groei) of semi-kwantitatief (+, ++) worden gerapporteerd. Kwantitatieve resultaten worden uitgedrukt in kolonie-vormende eenheden (KVE of CFU) per volume. * **Selectieve media:** Bevatten toevoegingen die de groei van ongewenste micro-organismen onderdrukken, waardoor klinisch relevante soorten beter zichtbaar worden. Dit kan door antibiotica, specifieke voedingsstoffen, of pH-indicatoren die verschillende kleuren veroorzaken. * **Differentiatie media:** Gebruiken indicatoren (bv. pH-indicators, chromogene stoffen) om kolonies met verschillende eigenschappen (bv. suikerfermentatie, enzymactiviteit) te onderscheiden. * **Bloedagar:** Verbeterde groei voor veel micro-organismen en maakt detectie van hemolyse (lysis van rode bloedcellen) mogelijk, een belangrijk kenmerk bij o.a. streptokokken. **Tip:** De juiste kweekbodem is cruciaal voor het isoleren van specifieke pathogenen uit een mengflora. #### 3.3.2 Identificatie van de opgegroeide bacteriën Na kweek worden bacteriën geïdentificeerd op basis van diverse eigenschappen: * **Morfologie:** Gramkleur en celvorm (staafjes, kokken, spirocheten, etc.). * **Kolonie-eigenschappen:** Grootte, randen, kleur, pigmentatie, geur. * **Fysiologische en biochemische kenmerken:** * Afbraak en assimilatie van koolhydraten, aminozuren en andere substraten. * Groei onder specifieke omstandigheden (temperatuur, pH, zoutconcentratie). * Productie van metabolieten (bv. enzymen). * **Celwandsamenstelling.** * **Genetisch profiel:** Totaal DNA, ribosomaal RNA (bv. 16S rRNA sequentie). * **Serologische eigenschappen:** Reactie met specifieke antilichamen (bv. agglutinatie). ##### 3.3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie * **Enzymatische tests:** Bepalen de aanwezigheid van specifieke enzymen die bacteriën kunnen produceren. Voorbeelden zijn ureasetesten of testen voor de afbraak van diverse suikers. Vroeger werden hiervoor uitgebreide 'batterijen' van chemische testjes gebruikt; tegenwoordig gebeurt dit vaak geautomatiseerd. * **Serologische identificatie:** Maakt gebruik van antilichamen om specifieke antigenen op het oppervlak van bacteriën te detecteren. Dit kan leiden tot zichtbare klontering (agglutinatie) wanneer antilichamen (bv. gebonden aan latexpartikels) reageren met bacteriële antigenen. ##### 3.3.2.2 Identificatie met MALDI-TOF massaspectrografie Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie is een revolutionaire techniek voor bacteriële identificatie. * **Principe:** Een kleine hoeveelheid gekweekte bacterie wordt gemengd met een matrix en bestraald met een laser. Dit leidt tot ionisatie en fragmentatie van bacteriële eiwitten. De massa-tot-ladingverhouding van de resulterende ionen wordt gemeten via de tijd die ze nodig hebben om een detector te bereiken (Time Of Flight). Dit genereert een uniek 'piekenpatroon' of 'vingerafdruk' van de bacterie. * **Voordelen:** Universeel toepasbaar (geen voorkennis van bacteriegroep nodig), snel (resultaten binnen ~15 minuten na staalbereiding) en zeer specifiek. Dit leidt tot een significante tijdswinst ten opzichte van klassieke methoden. **Tip:** MALDI-TOF heeft de identificatie van micro-organismen in diagnostische laboratoria aanzienlijk versneld en verbeterd. #### 3.3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen vereisen speciale kweekomstandigheden of groeien zeer langzaam. * **Anaeroben:** Vereisen kweekomstandigheden zonder zuurstof, inclusief transport zonder contact met lucht. * **Trage groeiers:** Mycobacteriën hebben weken nodig voor zichtbare groei. Mycoplasmata vormen microscopische kolonies op speciale media. * **Obligate intracellulaire parasieten:** Chlamydiae kunnen alleen op cellijnen gekweekt worden. * **(Bijna) onkweekbare bacteriën:** Sommige bacteriën kunnen *in vitro* niet gekweekt worden, zoals *Mycobacterium leprae* of *Treponema pallidum*, en vereisen experimentele modellen in dieren. * **Schimmels en gisten:** Groeien vaak op bacteriële media, maar kunnen ook specifieke media of langere incubatietijden vereisen. * **Virussen:** Vereisen levende celculturen voor kweek. De detectie gebeurt via cytopathogeen effect, immuundetectie of nucleïnezuurhybridisatie. * **Protozoa:** Routinematige kweek is vaak niet haalbaar. **Tip:** Voor veel van deze 'moeilijk kweekbare' pathogenen worden tegenwoordig snellere moleculaire detectietechnieken (zoals PCR) ingezet, tenzij specifieke eisen zoals een antibiogram levende bacteriën vereisen. #### 3.3.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek De interpretatie van kweekresultaten is cruciaal en vereist afstemming met de klinische vraagstelling. Het doel is niet om alle aanwezige bacteriën te identificeren, maar om de klinisch relevante verwekker(s) te detecteren. * **Strategie:** 1. Afstemmen op de klinische vraag (bv. keeluitstrijkje voor *Streptococcus pyogenes*). 2. Gebruik van geschikte kweekmedia (standaard of selectief) om potentiële pathogenen te isoleren. 3. Identificatie van de gevonden kolonies. 4. Rapportage van alleen de klinisch significante pathogenen. Normale flora wordt als "banale flora" of "commensaal" gerapporteerd. * **Staaltypes:** * **Type 1 (steriele locaties):** Bloed, gewrichtsvocht, hersenvocht. Detectie van bacteriën wijst bijna altijd op een pathogeen, tenzij het contaminanten zijn (vaak huidbewoners). Aseptische afname is hierbij essentieel. * **Type 2 (door niet-steriele zones passerend):** Sputum, urine. Deze stalen bevatten altijd enige contaminatie van normale flora. Men zoekt naar de meest waarschijnlijke pathogenen en hanteert kwantitatieve drempels. Indicatoren zoals neutrofielen (infectie) of plaveiselcellen (sputumkwaliteit) zijn nuttig. * **Type 3 (mengsels van pathogenen en flora):** Feces, keeluitstrijkjes, wonden. Hierbij is kennis van de specifieke verwekkers van een bepaalde infectie essentieel. Selectieve media en kwantitatieve aspecten (bv. overgroei van *Candida*) zijn belangrijk. **Tip:** Communicatie met het laboratorium is essentieel, vooral als er een ongebruikelijke infectie wordt vermoed of als de klinische vraag afwijkt van de standaardonderzoeken. #### 3.3.4.1 Belang van aspect tijd (bij diagnose door kweek) Kweekgebaseerde diagnostiek is doorgaans tijdrovend. * **Kweek + identificatie:** Vereist meestal 24-48 uur (soms langer voor trage groeiers). * **Antibiogram:** Voegt nog eens 24-48 uur toe na de initiële kweek. * **Trage groeiers (bv. mycobacteriën, virussen, anaeroben):** Kunnen dagen tot weken incubatietijd nodig hebben. **Tip:** De lange analysetijd kan frustrerend zijn. Waar mogelijk worden snellere (non-culture) technieken ingezet, zeker voor urgente diagnoses. #### 3.3.5 Detectie na moleculaire amplificatie (bv. PCR) Moleculaire technieken, met name Polymerase Chain Reaction (PCR), zijn zeer gevoelige en specifieke methoden voor het detecteren van genetisch materiaal. * **Principe:** Gericht vermenigvuldigen van specifieke DNA- of RNA-sequenties van een pathogeen. * **Toepassingen:** * **Identificatie van bacteriën:** Aantonen van specifieke genen (bv. 16S rRNA) of resistentiegenen, typeren van stammen. * **Virussen:** Aantonen en kwantificeren van viraal genetisch materiaal (bv. HIV, CMV, HBV). Dit kan de vensterperiode aanzienlijk verkorten ten opzichte van serologie. * **Schimmels en protozoa:** Directe detectie uit biopten, feces of bloed. * **Wormen:** Detectie uit feces of serum. * **Voordelen:** Zeer hoge gevoeligheid en specificiteit, breed toepassingsgebied. Kan ook worden gecombineerd met sequencing voor gedetailleerde typering. * **Nadelen:** Potentieel voor valspositieve resultaten door contaminatie in het laboratorium (vanwege de gigantische amplificatie). Vereist strikte procedures om moleculaire contaminatie te voorkomen. **Tip:** Moleculaire detectie is essentieel voor pathogenen die moeilijk te kweken zijn of wanneer een snelle diagnose cruciaal is, zoals bij virale infecties met een lange vensterperiode. ### 3.4 Serologie Serologie detecteert de immuunrespons van het lichaam tegen een infectie, door de aanwezigheid van antilichamen (IgM, IgG) in serum of andere lichaamsvloeistoffen te meten. * **Principe:** Gebaseerd op de binding van specifieke antilichamen van de patiënt aan bekende antigenen van een pathogeen (of vice versa, detectie van antigenen met antilichamen). ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) is een veelgebruikte methode. * **Interpretatie:** * **IgM-antilichamen:** Wijzen doorgaans op een recente infectie (piek na ~2 weken, verdwijnen na enkele maanden). * **IgG-antilichamen:** Kunnen pas na enkele weken detecteerbaar zijn en zijn vaak levenslang aanwezig (duiding op een doorgemaakte infectie of vaccinatie). * **Vensterperiode (Window Phase):** De periode na infectie waarin de kiem aanwezig is, maar de immuunrespons nog niet detecteerbaar is (zowel PCR als serologie kunnen vals negatief zijn). Moleculaire technieken kunnen deze periode verkorten. * **Titerbepaling:** De concentratie van antilichamen, uitgedrukt als een titer (bv. 1:1.000.000). Een viervoudige stijging van de IgG-titer in twee opeenvolgende serumstalen (met minstens twee weken ertussen) is indicatief voor een recente of reactiverende infectie. * **Toepassingen:** Vooral voor virale infecties (met chronisch verloop of dragerschap), maar ook voor moeilijk te kweken bacteriën (bv. syfilis, Lyme-ziekte). Nuttig voor screening (bv. hepatitis B, HIV) en het controleren van vaccinatiestatus. * **Beperkingen:** * **Indirecte meting:** Geeft geen directe informatie over de aanwezigheid van de actieve kiem. * **Vals negatief:** Bij immuungecompromitteerde patiënten, pasgeborenen, of in de vensterperiode. * **Vals positief:** Bij passieve immunisatie (bv. via transfusies of van moeder op kind) of door polyklonale B-cel activatie (bv. bij Epstein-Barr virus infectie). **Tip:** Serologie is een stabiele, relatief goedkope en snel uitvoerbare diagnostische methode, maar vereist zorgvuldige interpretatie in het licht van de klinische presentatie en de timing van de infectie. De combinatie met antigen- of PCR-detectie kan de diagnostische zekerheid vergroten. --- # Moleculaire detectie en serologie Deze sectie behandelt moderne detectiemethoden zoals PCR voor moleculaire amplificatie en serologische technieken voor het aantonen van antilichamen als bewijs van infectie of immuniteit. ### 4.1 De taken van het medisch microbiologisch lab Het medisch microbiologisch labo heeft tot taak om, op aanvraag van een arts, te bepalen of een patiënt een (actieve) infectie heeft, wat de verwekker is, en welke antimicrobiële middelen effectief zijn. Daarnaast adviseert het labo over de juiste monstername en -bewaring. De technieken die hiervoor gebruikt worden omvatten microscopie, kweek met identificatie, antigeendetectie, moleculaire detectietechnieken en serologie. Het antibiogram, hoewel primair voor de individuele patiënt, draagt ook bij aan epidemiologische inzichten met betrekking tot antibioticaresistentie voor de gemeenschap. ### 4.2 Directe detectie Directe detectie omvat methoden die pathogenen of hun componenten rechtstreeks in een klinisch monster aantonen, zonder dat er eerst sprake is van amplificatie. #### 4.2.1 Microscopie Gewone lichtmicroscopie kan objecten tot ongeveer 0,2 micrometer zichtbaar maken. Zonder kleuring of fixatie is deze methode bruikbaar voor het aantonen van grotere structuren zoals schimmels en parasieten, en in urine- of vaginale uitstrijken. Voor gedetailleerde observatie van bacteriën is echter een vergroting van 1000x en gefixeerde, gekleurde preparaten noodzakelijk. De Gram-kleuring is de meest gebruikte kleuring in de bacteriologie, waarbij bacteriën worden ingedeeld op basis van hun celwandsamenstelling in Gram-positief (blauw) en Gram-negatief (rood). Zuurvaste kleuringen worden gebruikt voor mycobacteriën. Virussen, mycoplasma's en chlamydia's zijn met deze technieken niet zichtbaar, hoewel ze indirect aangetoond kunnen worden via hun effect op celculturen of door middel van immunofluorescentie met specifieke antilichamen. Elektronenmicroscopie (EM) is nodig om virussen direct te visualiseren, maar wordt zelden in routine-diagnostiek gebruikt. > **Tip:** De Gram-kleuring is een krachtige en snelle methode voor de initiële diagnose van bacteriële infecties, met name bij meningitis, waar het onderscheid tussen Gram-positieve en Gram-negatieve diplokokken direct behandelingsimplicaties heeft. #### 4.2.2 Niet-microscopische methoden Deze methoden worden gebruikt wanneer microscopie niet volstaat, bijvoorbeeld omdat de kiem te klein is, verborgen zit of geen typisch voorkomen heeft. Ze zijn vaak gebaseerd op antilichaam-antigeenreacties of nucleïnezuurhybridisatie. * **Antigeendetectie:** Sneltesten, vaak gebaseerd op immunochromatografie (vergelijkbaar met zwangerschapstesten) of ELISA, kunnen antigenen van pathogenen aantonen. Voorbeelden zijn snelle coronatesten, detectie van *C. difficile* toxine in feces, rotavirusantigenen in stoelgang, RSV in respiratoire monsters, en HBsAg of HIV p24-antigeen in bloed om de vensterperiode te verkorten. Ook de detectie van galactomannan polysaccharide voor schimmelinfecties (*Aspergillus spp.*) valt hieronder. * **Nucleïnezuurhybridisatie (in situ):** Kan gebruikt worden om genetisch materiaal van pathogenen in weefsels aan te tonen, zoals HPV in cervicale specimen. > **Tip:** Niet-microscopische directe detectiemethoden zijn vaak snel (zelfde dag, soms binnen minuten) en eenvoudig uit te voeren, maar de gevoeligheid kan beperkt zijn. Ze zijn nuttig in situaties waar snelle resultaten cruciaal zijn of waar microscopische detectie niet mogelijk is. ### 4.3 Detectie na amplificatie Amplificatietechnieken, met name PCR, spelen een cruciale rol in de moderne diagnostiek door de hoeveelheid genetisch materiaal van een pathogeen exponentieel te vermenigvuldigen, waardoor zelfs zeer lage concentraties detecteerbaar worden. #### 4.3.1 Basistechniek voor kweek van micro-organismen Microbiologische kweek berust op het principe dat micro-organismen zich vermenigvuldigen onder optimale omstandigheden (voedingsstoffen, temperatuur, atmosferische condities). Dit leidt tot zichtbare kolonies op vaste media of vertroebeling in vloeibare media. De identificatie van opgegroeide bacteriën gebeurt op basis van morfologische kenmerken (Gram-kleuring, celvorm), uitzicht van de kolonies, en fysiologische en biochemische eigenschappen (bv. suikerafbraak, enzymproductie). Selectieve en differentiële media worden gebruikt om specifieke pathogenen te isoleren uit gemengde flora. #### 4.3.2 Identificatie van de opgegroeide bacteriën Na kweek wordt de identiteit van bacteriën vastgesteld op basis van diverse eigenschappen. ##### 4.3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie Traditioneel werd gebruik gemaakt van biochemische testbatterijen die enzymatische activiteit van bacteriën beoordelen. Serologische identificatie, bijvoorbeeld door agglutinatie met specifieke antilichamen, kan ook worden toegepast. ##### 4.3.2.2 Identificatie met MaldiTOF massaspectrografie Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time Of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie is een revolutionaire techniek die snelle en universele identificatie van bacteriën en gisten mogelijk maakt. Door het 'fingerprint'-patroon van eiwitten in de cel te analyseren, kunnen micro-organismen efficiënt en binnen enkele minuten tot uren worden geïdentificeerd, wat een aanzienlijke tijdwinst oplevert ten opzichte van klassieke methoden. #### 4.3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen zijn moeilijk of niet kweekbaar met standaardmethoden. * **Anaeroben:** Vereisen kweekomstandigheden zonder zuurstof. * **Trage groeiers:** Zoals mycobacteriën, die weken nodig hebben om te groeien. * **Obligaat intracellulaire pathogenen:** Zoals chlamydia's en virussen, die op specifieke cellijnen moeten worden gekweekt. * **Niet-kweekbare micro-organismen:** Zoals *Mycobacterium leprae* en *Treponema pallidum*, die in vivo of in diermodellen kunnen worden gekweekt. Voor veel van deze micro-organismen worden moleculaire detectietechnieken zoals PCR steeds vaker toegepast vanwege hun snelheid en gevoeligheid. #### 4.3.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek Bij bacteriologisch onderzoek is het essentieel om de kweek- en identificatietechnieken af te stemmen op de klinische vraagstelling, in plaats van alle aanwezige bacteriën te identificeren. De interpretatie is sterk afhankelijk van het type staal (steriel, semi-steriel of met normale flora) en de klinische context. ##### 4.3.4.1 Staaltypes * **Type 1:** Stalen afkomstig van een normaal steriele locatie (bv. bloed, gewrichtsvocht). De detectie van enig micro-organisme is hier doorgaans pathogeen. * **Type 2:** Stalen afkomstig van een normaal steriele locatie, maar die tijdens afname gecontamineerd kunnen raken met normale flora (bv. sputum, urine). Hierbij is kwantitatieve analyse en kennis van de normale flora cruciaal voor interpretatie. * **Type 3:** Stalen die per definitie vermengd zijn met de commensale flora (bv. feces, keeluitstrijk). Selectieve media en kennis van specifieke pathogenen zijn hierbij noodzakelijk. > **Tip:** Goede communicatie tussen de aanvragende arts en het laboratorium is van groot belang voor de juiste interpretatie van diagnostische resultaten, vooral bij ongewone klinische beelden of verwachtingen. ##### 4.3.4.2 Belang van aspect tijd (bij diagnose door kweek) Kweekgebaseerde diagnostiek is tijdrovend, met resultaten die vaak 24-48 uur duren voor bacteriën, en langer voor trage groeiers of virussen. Hoewel tussentijdse informatie soms nuttig kan zijn, is de lange analysetijd een beperking, wat de voorkeur voor snellere technieken zoals PCR en serologie bij urgente gevallen verklaart. #### 4.3.5 Detectie na moleculaire amplificatie Moleculaire amplificatietechnieken, voornamelijk gebaseerd op (reverse transcriptie-)PCR, zijn zeer specifiek en gevoelig. * **Toepassingen:** Detectie van genetisch materiaal van bacteriën (inclusief moeilijk kweekbare soorten), virussen, schimmels, protozoa en wormen. Dit kan direct uit een staal, of in combinatie met kweek voor resistentiebepaling of typering. Voor virussen is het meten van de hoeveelheid genetisch materiaal (kwantitatieve PCR) vaak informatief. * **Voordelen:** Hoge specificiteit en gevoeligheid, brede toepasbaarheid, snelle resultaten mogelijk. * **Nadelen:** Gevoeligheid kan leiden tot vals-positieve resultaten door contaminatie. > **Tip:** PCR is een onmisbare techniek geworden, vooral voor pathogenen die moeilijk of traag te kweken zijn, en voor het detecteren van resistentiegenen. De combinatie met sequencing kan verdere typering van stammen of virale varianten mogelijk maken. ### 4.4 Serologie Serologie maakt gebruik van de immuunrespons van het lichaam op een infectie. Er wordt gezocht naar antilichamen (meestal in serum) die door het lichaam zijn aangemaakt als reactie op de aanwezigheid van een pathogeen. * **Principe:** ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) is een veelgebruikte techniek waarbij antigenen op een drager worden vastgezet en de aanwezigheid van specifieke antilichamen in het patiëntenserum wordt gedetecteerd met behulp van enzymgelabelde antilichamen. * **Interpretatie:** * **IgM-antilichamen:** Wijzen doorgaans op een recente infectie en zijn vaak binnen één week detecteerbaar, piekend na twee weken en verdwijnend na enkele maanden. * **IgG-antilichamen:** Worden meestal na meer dan één week detecteerbaar en kunnen levenslang aanwezig blijven. Een viervoudige toename in IgG-titer tussen twee opeenvolgende serumstalen (met minimaal twee weken ertussen) duidt op een recente infectie of reactivatie. * **Vensterperiode (window phase):** De periode tussen infectie en detecteerbaarheid van antilichamen, waarin de patiënt wel infectieus kan zijn maar serologisch nog negatief is. Moleculaire technieken zoals PCR kunnen deze periode verkorten. * **Beperkingen:** Serologie is een indirecte methode; de aanwezigheid van antilichamen bewijst niet altijd dat het pathogeen nog actief aanwezig is. Vals-negatieve resultaten kunnen optreden bij immuungecompromitteerde patiënten of neonaten. Vals-positieve resultaten kunnen voorkomen bij passieve immunisatie (bv. na transfusie) of bij overdracht van maternale antilichamen aan neonaten. > **Tip:** Bij de interpretatie van serologische resultaten is het cruciaal om rekening te houden met de kinetiek van de immuunrespons (IgM vs. IgG, titerveranderingen) en mogelijke confounders zoals vaccinatiestatus, eerdere infecties en immuunstatus van de patiënt. * **Toepassingsgebied:** Vooral nuttig voor virale infecties met een chronisch verloop, en voor bacteriële infecties die moeilijk te kweken zijn (bv. syfilis, ziekte van Lyme). Serologie wordt ook gebruikt voor het screenen van dragers van infectieziekten (bv. HIV, HBV) en voor het monitoren van vaccinatiestatus. Voor de preventie van bijvoorbeeld CMV- en Toxoplasma-infecties bij zwangere vrouwen is serologie ook van belang. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Diagnostiek | Het proces van het identificeren van een ziekte of aandoening op basis van symptomen, klinische bevindingen en laboratoriumresultaten. Dit omvat het aantonen van pathogenen en het beoordelen van de immuunreactie van het lichaam. | | Staalafname | Het zorgvuldig verzamelen van biologisch materiaal (zoals bloed, urine, sputum) van een patiënt om dit te onderwerpen aan laboratoriumonderzoek voor diagnostische doeleinden. | | Staalbewaring | Het correct opslaan van verzamelde biologische monsters onder specifieke omstandigheden (temperatuur, tijd) om de integriteit van pathogenen of andere analytische componenten te behouden tot het moment van analyse. | | Pathogenen | Micro-organismen, zoals bacteriën, virussen, schimmels en parasieten, die ziekte kunnen veroorzaken bij een gastheer. | | Immuniteit | De toestand van weerstand tegen een bepaalde ziekte of infectie, verkregen door blootstelling aan het agens of door vaccinatie, wat resulteert in de productie van specifieke antilichamen. | | Microscopie | Een techniek die gebruik maakt van een microscoop om structuren te vergroten die te klein zijn om met het blote oog te zien, zoals micro-organismen en cellulaire structuren. | | Gramkleuring | Een differentiële kleuringstechniek die wordt gebruikt om bacteriën te classificeren in twee hoofdgroepen: grampositief (blauw) en gramnegatief (rood), gebaseerd op de samenstelling van hun celwand. | | Kweek | Een laboratoriummethode waarbij micro-organismen uit een biologisch monster worden vermeerderd op een voedingsbodem onder gecontroleerde omstandigheden om hun aanwezigheid, identificatie en gevoeligheid voor antimicrobiële middelen te bepalen. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Een moleculaire techniek die wordt gebruikt om specifieke segmenten van DNA of RNA exponentieel te amplificeren, waardoor zelfs sporen van genetisch materiaal detecteerbaar worden. | | ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) | Een veelzijdige immunologische test die antilichamen of antigenen detecteert door middel van een enzymatische reactie die een kleurverandering veroorzaakt, vaak gebruikt voor serologische diagnostiek. | | Flora (Microbiële flora) | De gemeenschap van micro-organismen die van nature op of in het menselijk lichaam leven, zoals op de huid, in de darmen en in de luchtwegen, en die over het algemeen geen ziekte veroorzaken (commensalen). | | Kinetiek van de immuunreactie | De tijdsafloop en de dynamiek van de immuunrespons van het lichaam op een infectie of antigen, inclusief de productie van antilichamen (zoals IgM en IgG) en de activiteit van immuuncellen. | | Antigeen | Een molecuul, meestal een deel van een pathogeen, dat een immuunrespons kan opwekken, met name de productie van specifieke antilichamen. | | Antilichaam (IgM, IgG) | Eiwitten geproduceerd door B-cellen van het immuunsysteem die specifiek binden aan antigenen. IgM is meestal de eerste antistof die wordt geproduceerd tijdens een acute infectie, terwijl IgG wijst op een eerdere blootstelling of een langdurige immuunrespons. | | Cytopathogeen effect | Veranderingen in gastheercellen die veroorzaakt worden door infectie met een virus, zichtbaar onder de microscoop en gebruikt voor virusdiagnostiek. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopietechniek waarbij specimens worden belicht met fluorescentie en licht van een langere golflengte wordt uitgezonden, vaak gebruikt in combinatie met antilichamen gemerkt met fluorescerende stoffen voor specifieke detectie. | | FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) | Een moleculaire techniek die fluorescerende probes gebruikt om de aanwezigheid van specifieke DNA- of RNA-sequenties direct in cellen of weefsels aan te tonen. | | Zuurvaste kleuring | Een speciale kleuringstechniek, zoals Ziehl-Neelsen of auramine, die wordt gebruikt om mycobacteriën (zoals de veroorzaker van tuberculose) te identificeren vanwege hun resistente celwand die de kleurstof vasthoudt. | | Amplificatie | Het proces van het vermenigvuldigen van een specifiek moleculair doelwit, zoals DNA of RNA, om het detecteerbaar te maken. PCR is een veelgebruikte methode voor amplificatie. | | Kweekbodem | Een voedingsmedium, zowel vloeibaar als vast (agar), dat wordt gebruikt om de groei van micro-organismen in het laboratorium te ondersteunen en te faciliteren. | | Selectieve bodem | Een kweekbodem die stoffen bevat die de groei van bepaalde micro-organismen bevorderen en de groei van andere onderdrukken, waardoor specifieke pathogenen beter geïsoleerd en geïdentificeerd kunnen worden. | | Differentile bodem | Een kweekbodem die ingrediënten bevat die verschillende micro-organismen op een zichtbare manier laten verschillen, bijvoorbeeld door kleurverandering of specifieke kolonie-morfologie, wat helpt bij de identificatie. | | Hemolyse | De afbraak van rode bloedcellen, wat een kenmerk kan zijn van bepaalde bacteriën (zoals streptokokken) en wordt waargenomen op bloedagar kweekbodems, resulterend in een helder (beta-hemolyse) of groenachtig (alfa-hemolyse) gebied rond de kolonie. | | Enzymatische identificatie | Een methode om bacteriën te identificeren op basis van de enzymen die ze produceren en metabolische reacties die ze ondergaan, vaak door middel van testbatterijen of geautomatiseerde systemen. | | Serologische identificatie | Het identificeren van micro-organismen met behulp van antilichamen die specifiek aan hun antigenen binden, vaak in de vorm van agglutinatietesten of immunofluorescentie. | | MALDI-TOF massaspectrografie | Een techniek die de massa-tot-lading-verhouding van moleculen (voornamelijk eiwitten) in een microbieel monster meet na ionisatie door een laser, waardoor snelle en nauwkeurige identificatie van bacteriën en gisten mogelijk is. | | Anaeroben | Micro-organismen die kunnen groeien in afwezigheid van zuurstof. | | Obligate parasieten | Organismen die alleen kunnen overleven en zich voortplanten in de cellen van een levende gastheer; virussen zijn hier een voorbeeld van. | | Commensale flora | Micro-organismen die normaal gesproken op of in het lichaam aanwezig zijn zonder ziekte te veroorzaken en vaak voordeel halen uit de gastheer zonder deze significant te schaden. | | Pre-analytische fase | De periode van monstername, transport en voorbereiding in het laboratorium voordat de feitelijke analyse plaatsvindt. Kwaliteitsproblemen in deze fase kunnen leiden tot onjuiste resultaten. | | Kwantitatieve analyse | Een laboratoriumtest die niet alleen de aanwezigheid van een stof of micro-organisme bepaalt, maar ook de hoeveelheid ervan in het monster, vaak uitgedrukt als een concentratie of telling (bv. KVE/CFU per ml). | | Moleculaire amplificatie | Technieken zoals PCR die de hoeveelheid specifiek genetisch materiaal (DNA of RNA) verhogen, waardoor detectie van zelfs zeer lage niveaus mogelijk wordt. | | Reverse transcriptie PCR (RT-PCR) | Een variant van PCR die wordt gebruikt om RNA te detecteren. Het RNA wordt eerst omgezet in complementair DNA (cDNA) met behulp van reverse transcriptase, waarna dit cDNA wordt geamplificeerd door PCR. | | Serologie | Het onderzoek van serum, specifiek de detectie van antilichamen, om een infectie of immuunrespons aan te tonen. | | Windowfase (Vensterperiode) | De periode na infectie waarin een pathogeen nog niet detecteerbaar is met bepaalde tests (bv. serologie) maar de patiënt wel al infectieus kan zijn. | | Titer | De hoogste verdunning van een serum of andere vloeistof die nog een meetbaar effect vertoont, bijvoorbeeld het neutraliseren van een antigeen of het veroorzaken van een zichtbare reactie in een immunologische test. | | Affiniteit | De sterkte van de binding tussen een antilichaam en zijn antigen. Hogere affiniteit betekent een sterkere en specifiekere binding. | | Clonaliteit | Het ontstaan van een groep identieke cellen uit één enkele voorlopercel, bijvoorbeeld bij de immuunrespons waar B-cellen specifiek antilichamen maken tegen een bepaald antigen. | | Polyklonale activatie | Een immuunrespons waarbij meerdere verschillende B-celklonen worden geactiveerd, vaak door virussen of bacteriële toxines, wat leidt tot de productie van diverse antilichamen, niet noodzakelijk specifiek voor één pathogeen. | | Vals positief | Een testresultaat dat aangeeft dat een stof of micro-organisme aanwezig is, terwijl dit in werkelijkheid niet zo is. | | Vals negatief | Een testresultaat dat aangeeft dat een stof of micro-organisme afwezig is, terwijl dit in werkelijkheid wel aanwezig is. | | Dragerschap | De toestand waarbij een individu een pathogeen bij zich draagt en potentieel kan verspreiden zonder zelf significante ziekteverschijnselen te vertonen. |