01 inleiding & techniek 25-26 & notes.pdf-summary_removed.pdf-summary_removed.pdf

# Voorbereiding en beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Hieronder volgt de samenvatting voor het examenonderwerp "Voorbereiding en beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)". ## 1. Voorbereiding en beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Dit topic beschrijft de algemene principes van TEM-beeldvorming, de stappen die nodig zijn om biologisch materiaal voor te bereiden, inclusief fixatie, contrastering, dehydratatie, inbedding en snijden, en de analyse van celstructuren met hoge resolutie. ### 1.1 Algemene principes van TEM-beeldvorming Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) maakt gebruik van elektronenbundels met een zeer korte golflengte, die buiten het zichtbare spectrum van het menselijk oog vallen. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op de strooiing van elektronen door de atomen van het weefsel. Dicht(er)e structuren absorberen meer elektronen en verschijnen donkerder, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten en lichter verschijnen. Biologisch materiaal vertoont van nature geringe densiteitsverschillen, wat de noodzaak van 'contrastering' onderstreept [1](#page=1) [5](#page=5) [6](#page=6). #### 1.1.1 Elektronenmicroscopie vs. Lichtmicroscopie In tegenstelling tot lichtmicroscopen die glaslenzen gebruiken, zet elektronenmicroscopie (EM) elektromagnetische magneten in als lenzen om elektronenbundels te focussen en te manipuleren. Het cruciale voordeel van EM ligt in de veel kleinere golflengte van elektronen vergeleken met zichtbaar licht (400-800 nm voor licht). De golflengte van elektronen is zo klein dat in principe individuele atomen waargenomen kunnen worden [5](#page=5). #### 1.1.2 Technische vereisten voor elektronenmicroscopie Het gebruik van elektronen brengt specifieke technische uitdagingen met zich mee: * Elektronen worden gemakkelijk gestopt door gasmoleculen, wat vereist dat de microscoop in een nagenoeg absoluut vacuüm functioneert [5](#page=5). * Er moet onder hoogspanning worden gewerkt om de elektronen voldoende snelheid te verlenen [5](#page=5). * Elektrische en magnetische velden zijn noodzakelijk als lenzen om de elektronenstraal te sturen [5](#page=5). #### 1.1.3 Beeldvorming in TEM TEM maakt gebruik van elektronen die door een ultradun preparaat heen gaan. De resolutie van TEM kan tot 1 nm reiken. Beeldvorming is gebaseerd op de verstrooiing van elektronen op zware atoomkernen in het preparaat [13](#page=13) [5](#page=5) [6](#page=6). > **Tip:** De 'kleuring' in TEM verwijst naar het gebruik van zware metalen om densiteitsverschillen te vergroten, niet naar ware kleuren zoals in lichtmicroscopie [2](#page=2). > **Voorbeeld:** Zonder de contrastering met zware metalen zouden de verschillende membranen en organellen in een cel nauwelijks te onderscheiden zijn in de TEM vanwege hun vergelijkbare densiteit [2](#page=2). ### 1.2 Voorbereidingsstappen van biologisch materiaal voor TEM De voorbereiding van biologisch materiaal voor TEM omvat een reeks essentiële stappen die gericht zijn op het behoud van ultrastructuur en het creëren van voldoende contrast. De algemene procedure omvat fixeren, inbedden en snijden, en kleuren of contrasteren [10](#page=10) [1](#page=1) [2](#page=2) [6](#page=6) [7](#page=7) [9](#page=9). #### 1.2.1 Fixatie Fixatie is de eerste en cruciale stap om de fijne intracellulaire structuren zo intact mogelijk te behouden en degradatie te stoppen door enzymen te denatureren. Wanneer weefsel uit zijn in vivo situatie wordt verwijderd, worden afbraakenzymen actief die leiden tot weefseldegradatie [1](#page=1) [7](#page=7) [9](#page=9). * **Doel:** Behoud van oorspronkelijke structuur, stoppen van afbraakprocessen, en celmembranen doorlaatbaar maken voor latere componenten [1](#page=1) [7](#page=7). * **Methoden:** * **Bevriezen (koude fixatie):** Stopt enzymatische reacties snel en bewaart epitopen beter. Wordt gebruikt voor snelle diagnoses van biopten en tumoren [7](#page=7). * **Chemische fixatieven:** Denatureren eiwitten door cross-linking of precipitatie. * **Glutaaraldehyde:** Een bivalente crosslinker voor aminegroepen (voornamelijk in eiwitten), gebruikt voor EM [6](#page=6) [7](#page=7). * **Osmiumtetroxide:** Een sterk oxidans dat lipiden en eiwitten stabiliseert en ook als contrasteringsmiddel kan dienen [1](#page=1) [6](#page=6). * **Formaldehyde/formol:** Gebruikt voor lichtmicroscopie (LM) [7](#page=7). * **Artefacten bij fixatie:** Veranderingen die ontstaan tijdens de fixatie en afwijken van de in vivo situatie, zoals structuurveranderingen of het op een andere plaats voorkomen van componenten [7](#page=7). #### 1.2.2 Spoeling en 'kleuring' (contrastering) Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het biologisch materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen om het contrast te vergroten [1](#page=1) [6](#page=6). * **Doel:** Verhoging van de densiteitsverschillen tussen celregio's, wat cruciaal is voor beeldvorming [1](#page=1). * **Gebruikte middelen:** * **Osmiumtetroxide:** Dient zowel als fixatief als contrasteringsmiddel en draagt bij aan het contrast van membranen [1](#page=1) [6](#page=6). * **Uranylacetaat:** Wordt gebruikt als contrasteringsvloeistof en in negatieve kleuring [13](#page=13) [1](#page=1). * **Kaliumpermanganaat:** Een contrasteringsmiddel [1](#page=1). * **Loodcitraat:** Wordt gebruikt als contrasteringsvloeistof [1](#page=1). * **Mechanisme:** Metaalverbindingen weerkaatsen elektronen. Structuren die zich specifiek aan deze metalen binden (bv. vetrijke membranen, DNA-clusters, cytoskeletelementen) verschijnen als donkere plekken in het beeld [1](#page=1). #### 1.2.3 Negatieve kleuring Bij deze techniek worden virusdeeltjes of andere structuren omgeven door een zwaar metaalzout (zoals uranylacetaat of fosfowolframzuur). Het metaal vult de ruimte rond het preparaat, waardoor het preparaat zelf wit afsteekt tegen een zwarte achtergrond [13](#page=13) [6](#page=6). #### 1.2.4 Shadowing (schaduwbestuiving) Dit is een techniek waarbij het preparaat vanuit een schuine hoek wordt bestoven met een verdampt metaal (zoals platina, goud of chroom). Hierdoor ontstaat een driedimensionaal effect doordat de ene kant van de structuur wordt belicht en de andere kant in de schaduw ligt [13](#page=13) [6](#page=6). * **Rotary shadowing:** Een specifieke vorm waarbij het preparaat onder een zeer lage hoek op een roterend specimen wordt bestoven, vaak gebruikt voor visualisatie van nucleïnezuren [13](#page=13) [6](#page=6). #### 1.2.5 Dehydratatie Om ultradunne coupes te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, is het verwijderen van water noodzakelijk. Dit gebeurt door het materiaal te spoelen met oplossingen van ethanol of aceton met toenemende concentraties. Het weefsel wordt eerst gedehydrateerd met een reeks alcoholbaden, gevolgd door een 'clearing'-stap met een mengbare substantie zoals tolueen [10](#page=10) [2](#page=2). > **Tip:** Hoewel er alternatieve hydrofobe harsen met hydrofiele groepen en hydrofiele inbedmiddelen bestaan, zijn deze over het algemeen minder stabiel en resulteren ze in inferieure morfologie [8](#page=8). #### 1.2.6 Inbedding in hars Na dehydratatie wordt het materiaal geïnfiltreerd met een nog niet-gepolymeriseerde kunsthars. Het hars-doordrongen materiaal wordt vervolgens in een houder geplaatst, waarna polymerisatie plaatsvindt door warmte, magnetronstraling, of UV-licht, resulterend in harde, snijbare blokjes. Voor EM zijn hardere inbedmiddelen, zoals harsen of plastics, nodig om dunnere coupes mogelijk te maken [10](#page=10) [2](#page=2) [9](#page=9). * **Vereisten voor inbedmiddelen:** Het inbedmiddel moet het weefsel volledig kunnen binnendringen; anders ontstaat materiaal met verschillende hardheden, wat het snijden bemoeilijkt [8](#page=8). #### 1.2.7 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden Voor het verkrijgen van coupes met een dikte van ongeveer 70 nm zijn speciale messen van gespleten glas of diamanten messen vereist, gebruikt met een ultramicrotoom [10](#page=10) [2](#page=2). * **Dikte van de coupes:** * **Paraffine (voor LM):** Maakt coupes van 5-10 micrometer mogelijk, snijdbaar met een stalen mes [10](#page=10) [8](#page=8). * **Harsen en plastics (voor EM):** Laten coupes toe tot 70 nanometer (50-100 nm ), snijdbaar met glazen of diamanten messen [10](#page=10) [13](#page=13) [6](#page=6) [8](#page=8). #### 1.2.8 Opvangen van coupes op een gridje Een kleine hoeveelheid water achter het mes dient als smeermiddel en voor het opvangen van de fragiele coupes. De coupes worden van het wateroppervlak 'opgeschept' op een metalen schijfje van minder dan 5 mm doorsnee met een roosterpatroon, een zogenaamd gridje. Coupes voor LM worden op draagglaasjes geplaatst [10](#page=10) [2](#page=2) [8](#page=8). ### 1.3 Analyse en resolutie in TEM Met TEM kunnen structuren van cellulaire organellen met hoge resolutie worden waargenomen. Vergrotingen van ongeveer 40.000 keer en insets van 200.000 keer zijn mogelijk [13](#page=13) [2](#page=2). #### 1.3.1 Analyse van tracheaalepitheel TEM-analyse van het epitheel van de trachea onthult verschillende celtypen en structuren [3](#page=3). * **Ondersteunende structuren:** Het epitheel rust op een basaal membraan (BM, basale lamina) dat overgaat in fibreus bindweefsel, bestaande uit fibrocyten, collageenvezels (Co) en elastinevezels (El) [3](#page=3). * **Celtypen:** * **Gecilieerde cellen:** Gekenmerkt door lange cilia, veel mitochondria en enig glad endoplasmatisch reticulum (SER). De cilia zijn begrensd door een dubbelbladige biologische membraan, vergelijkbaar met microvilli (MV) [3](#page=3). * **Mucus-producerende cellen:** Gekenmerkt door overvloedig ruw endoplasmatisch reticulum (ER), een uitgebreid Golgi-apparaat (G), en mucus-gevulde secretiedruppels (MD) [3](#page=3). > **Tip:** De cilia en microvilli zijn beide begrensd door een "unit membrane" (UM), wat wijst op een gemeenschappelijke membraanstructuur [3](#page=3). #### 1.3.2 Speciale EM-technieken voor TEM Naast standaard TEM-preparaten, worden technieken zoals vries-breek (freeze-fracture) en vries-ets (freeze-etching) toegepast om membraanstructuren te visualiseren [13](#page=13) [3](#page=3). * **Vries-breek (freeze-fracture):** Breekt cellulaire membranen doorgaans tussen het binnen- en buitenblad, waardoor interne membraanstructuren, waaronder eiwitten, zichtbaar worden. Het vloeibare mozaïekmodel van de biologische membraan wordt hierdoor geïllustreerd. Eiwitten kunnen geassocieerd worden met de cytoplasmatische (P) of extracellulaire (E) membraanhelft [3](#page=3). * **Vries-ets (freeze-etching):** Genereert meer 3D-structuur door een dunne laag ijs te verwijderen via sublimatie onder vacuüm, waardoor diepere structuren blootgelegd worden [3](#page=3). > **Voorbeeld:** Een 3D-reconstructie van een deel van het kernoppervlak toont de structuur van nucleaire pore complexe (NPC) en ruw endoplasmatisch reticulum (RER) in de celkern van de slijmzwam *Dictyostelium discoideum* [5](#page=5). ### 1.4 Vergelijking TEM en SEM | Kenmerk | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | | :-------------------- | :---------------------------------------------------------------------- | :---------------------------------------------------------------------- | | Focus | Interne structuur van ultradunne preparaten | Oppervlaktestructuur van preparaten | | Preparatie | Vereist ultradunne secties (50-100 nm) | Preparaten mogen groter en dikker zijn, maar moeten metaal-gecoat zijn | | Principe beeldvorming | Doorlating van elektronenbundel, verstrooiing door zware atomen | Scanning met elektronenbundel, detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen | | Beeldweergave | Op een fluorescerend scherm | Computergestuurde 3D-reconstructie van gedetecteerde signalen | | Resolutie | Tot 1 nm | Typisch enkele nanometers, afhankelijk van de bundel en detector | --- # Microscopietechnieken voor analyse van tracheaalepitheel Dit onderwerp behandelt de toepassing van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM) voor de gedetailleerde analyse van het epitheel van de trachea, inclusief celtypes en ondersteunende structuren, alsook specifieke preparatietechnieken . ### 2.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse van tracheaalepitheel TEM-analyse van het tracheaalepitheel maakt de identificatie van twee primaire celtypen mogelijk: gecilieerde cellen en mucus-producerende cellen [3](#page=3). #### 2.1.1 Ondersteunende structuren Het epitheel van de trachea is gelegen op een basaal membraan (BM), ook wel basale lamina genoemd, dat overgaat in fibreus bindweefsel. Dit bindweefsel bevat fibrocyten, collageenvezels (Co) en elastinevezels (El) [3](#page=3). #### 2.1.2 Celtypen in het tracheaalepitheel * **Gecilieerde cellen:** Deze cellen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van lange cilia. Ze bevatten talrijke mitochondria en enige hoeveelheid glad endoplasmatisch reticulum (SER). De cilia zelf zijn begrensd door een dubbelbladige biologische membraan, vergelijkbaar met microvilli (MV). Doorsneden van cilia kunnen longitudinaal, schuin of dwars georiënteerd zijn [3](#page=3). * **Mucus-producerende cellen:** Deze cellen zijn herkenbaar aan een overvloed aan ruw endoplasmatisch reticulum (ER), een ontwikkeld Golgi-apparaat (G) en secretoire druppels gevuld met mucus (MD) [3](#page=3). > **Tip:** Zowel cilia als microvilli zijn omgeven door een "unit membrane" (UM), wat duidt op een gemeenschappelijke membraanstructuur [3](#page=3). #### 2.1.3 Technieken in TEM Naast standaard TEM-preparatie, worden gespecialiseerde technieken zoals vries-breek (freeze-fracture) en vries-ets (freeze-etching) gebruikt om membraanstructuren te bestuderen [3](#page=3). * **Vries-breek:** Deze techniek zorgt voor het breken van cellulaire membranen, typisch tussen het binnenste en buitenste leaflet. Dit legt de interne membraanstructuren, inclusief eiwitten, bloot en illustreert het vloeibare mozaïekmodel van biologische membranen, waarbij eiwitten geassocieerd kunnen zijn met de cytoplasmatische (P) of extracellulaire (E) helft van het membraan [3](#page=3). * **Vries-ets:** Deze methode creëert een meer driedimensionale weergave door een dunne laag ijs te verwijderen via sublimatie (vast naar gasvormig) onder vacuüm, waardoor diepere structuren zichtbaar worden [3](#page=3). Na deze vries-technieken wordt visualisatie bereikt door bestuiving met zware atomen voor zowel TEM als SEM, of door het maken van een replica ter verbetering van de elektronenpassage in TEM [4](#page=4). > **Voorbeeld:** Een TEM-opname van een replica van een vriesbreekpreparaat van een darmepitheelcel kan organellen zoals microvilli (MV), celmembraan (CM), mitochondriën (M), Golgi-apparaat (G), nucleus (N) en kernporiën tonen [4](#page=4). ### 2.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) analyse van tracheaalepitheel SEM-analyse van het tracheaalepitheel toont ook de twee primaire celtypen: gecilieerde cellen en mucus-producerende cellen. De mucus-producerende cellen vertonen kenmerkend een koepelvormig oppervlak [4](#page=4). #### 2.2.1 Monsterpreparatie voor SEM Monsters die voor SEM-analyse worden gebruikt, moeten geleidend gemaakt worden. Dit wordt bereikt door de monsters te coaten met een zeer dun laagje (1,5 tot 3 nanometer) goud of goud/palladium met behulp van een sputtercoater [4](#page=4). ### 2.3 Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) Cryo-ET is een techniek voor 3D-reconstructie die gebaseerd is op een reeks 2D-projecties, verkregen door het object of de detector rond een as te kantelen [4](#page=4). #### 2.3.1 Principe van Cryo-ET De reconstructie vindt plaats door het geleidelijk berekenen van terugprojecties om een virtueel 3D-beeld van het originele object te vormen. De nauwkeurigheid van het gereconstrueerde beeld verbetert met een groter aantal projecties en kleinere hoekverschillen tussen deze projecties, wat leidt tot een vermindering van artefacten veroorzaakt door ontbrekende wiggen (missing-wedge) [4](#page=4). > **Voorbeeld:** Het principe van Cryo-ET kan worden geïllustreerd aan de hand van de reconstructie van een 2D-beeld uit 1D-projecties, waarbij een hogere beeldkwaliteit wordt bereikt met meer projecties over een groter hoekbereik [4](#page=4). #### 2.3.2 Toepassing van Cryo-ET Cryo-ET kan worden toegepast voor de gedetailleerde reconstructie van cellulaire structuren, zoals nucleaire pore complexen (NPC's). Door verschillende NPC's te analyseren en de beelden ervan te middelen, kunnen nog meer structurele details zichtbaar worden gemaakt [4](#page=4). --- # Geavanceerde elektronenmicroscopietechnieken en hun toepassingen Dit topic behandelt geavanceerde elektronenmicroscopietechnieken die gebruikt worden voor gedetailleerde 3D-reconstructies en analyse van cellulaire structuren op hoge resolutie [13](#page=13) [4](#page=4). ### 3.1 Vries-technieken voor monsterpreparatie Vries-technieken zijn cruciaal voor het visualiseren van biologische structuren, met name membraanstructuren, met hoge resolutie in elektronenmicroscopie [13](#page=13). #### 3.1.1 Vries-breek (freeze-fracture) en vries-ets (freeze-etching) Deze technieken worden specifiek gebruikt om membraanstructuren gedetailleerd te bestuderen. Na deze vries-technieken kan visualisatie plaatsvinden door bestuiving met zware atomen voor TEM of SEM, of door het maken van een replica om de elektronenpassage in TEM te verbeteren [13](#page=13) [4](#page=4). > **Voorbeeld:** Een TEM-opname van een replica van een vriesbreekpreparaat van een darmepitheelcel toont organellen zoals microvilli (MV), celmembraan (CM), mitochondriën (M), Golgi-apparaat (G), nucleus (N) en kernporiën [4](#page=4). #### 3.1.2 Monsterpreparatie na vries-technieken * **Visualisatie met TEM of SEM:** Na vries-technieken kan het monster bestoven worden met zware atomen voor TEM of SEM [4](#page=4). * **Replica maken voor TEM:** Een replica kan gemaakt worden om de elektronenpassage in TEM te verbeteren [4](#page=4). ### 3.2 Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) Cryo-ET is een geavanceerde techniek die 3D-reconstructies van objecten mogelijk maakt uit een serie 2D-projecties [13](#page=13) [4](#page=4). #### 3.2.1 Principe van Cryo-ET De reconstructie van een 3D-beeld gebeurt door het progressief berekenen van terugprojecties naar een virtueel 3D-model van het originele object. De nauwkeurigheid van het gereconstrueerde beeld neemt toe naarmate meer projecties met kleinere hoekverschillen kunnen worden gecombineerd. Dit leidt tot minder "artefacten" door ontbrekende wiggen (missing-wedge) [4](#page=4). > **Voorbeeld:** Het principe kan geïllustreerd worden voor de reconstructie van een 2D-beeld uit 1D-projecties, waarbij een betere beeldkwaliteit wordt bereikt met meer projecties over een groter hoekbereik [4](#page=4). #### 3.2.2 Toepassing van Cryo-ET Cryo-ET wordt gebruikt voor de gedetailleerde reconstructie van cellulaire structuren. Een specifieke toepassing is de analyse van nucleaire pore complexen (NPC's). Door verschillende NPC's te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt [4](#page=4). ### 3.3 Analyse van grotere volumes met SBF-SEM en FIB-SEM Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) zijn geavanceerde technieken voor de analyse van grotere cellulaire volumes. Beide technieken maken gebruik van de in-situ verwijdering van dunne lagen van een preparaat binnen de vacuümkamer van een SEM [13](#page=13) [14](#page=14). #### 3.3.1 Serial Block-Face SEM (SBF-SEM) Bij SBF-SEM wordt materiaal verwijderd met een diamantmes. Na laagverwijdering wordt het oppervlak gescand, en dit proces herhaalt zich, resulterend in opeenvolgende beelden die gebruikt worden voor een 3D-reconstructie [14](#page=14). #### 3.3.2 Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM) FIB-SEM gebruikt een focused ion beam (FIB) om materiaal weg te etsen. Dit iteratieve proces maakt 3D-reconstructies van grote volumes op hoge resolutie mogelijk en is nuttig voor het prepareren van specifieke gebieden [14](#page=14). > **Toepassing:** Deze technieken zijn essentieel voor het bestuderen van de driedimensionale architectuur van cellen en weefsels op een niveau dat met conventionele microscopie niet haalbaar is [14](#page=14). ### 3.4 Overige geavanceerde EM-technieken Naast de hierboven genoemde technieken, zijn er nog andere speciale EM-technieken van belang [13](#page=13). #### 3.4.1 Negatieve kleuring Bij negatieve kleuring wordt het monster geïncubeerd met een zwaar metaal, waardoor het monster wit verschijnt tegen een zwarte achtergrond [13](#page=13). #### 3.4.2 Shadowing (rotary shadowing) Bij rotary shadowing wordt het preparaat onder een schuine hoek bestoven met metaal (bijvoorbeeld platina, goud) om structuren te visualiseren [13](#page=13). #### 3.4.3 Detectie van specifieke eiwitten met TEM De detectie van specifieke eiwitten binnen cellen kan met TEM worden uitgevoerd. Dit gebeurt bijvoorbeeld door gebruik te maken van antilichamen die specifiek binden aan doelwiteiwitten en vervolgens gekoppeld zijn aan een marker die zichtbaar is onder de microscoop [14](#page=14). --- # Histologische technieken en kleuringen voor microscopie Dit topic behandelt de essentiële preparatie- en kleuringstechnieken die nodig zijn om weefselstructuren zichtbaar te maken voor observatie onder de licht- en elektronenmicroscoop. ### 4.1 Vereiste stappen in histologische technieken Om cellen en weefsels onder de lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM) te kunnen bestuderen, zijn specifieke preparatietechnieken noodzakelijk. Biologisch materiaal is vaak te dik en bevat te weinig contrast om direct geobserveerd te kunnen worden. Histologische technieken maken het mogelijk weefsels voldoende dun te snijden en het contrast te verhogen om structuurdetails zichtbaar te maken [6](#page=6) [7](#page=7). #### 4.1.1 Algemene procedure De algemene procedure omvat de volgende stappen [7](#page=7): 1. **Fixeren**: Behoud van de oorspronkelijke structuur door denaturatie van eiwitten [7](#page=7). 2. **Inbedden en snijden**: Het weefsel wordt ingebed in een hard materiaal en in dunne coupes gesneden [7](#page=7). 3. **Kleuren of contrasteren**: Verbetering van het zichtbare contrast in de coupes [7](#page=7). #### 4.1.2 Fixatie Fixatie stopt afbraakprocessen door enzymen te denatureren. Wanneer een weefsel uit zijn in vivo situatie wordt verwijderd, worden afbraakenzymen actief die leiden tot weefseldegradatie. Om deze afbraakprocessen tegen te gaan, moet de activiteit van deze eiwitten gestopt worden door denaturatie [7](#page=7). ##### 4.1.2.1 Methoden van fixatie Denaturatie van eiwitten kan op twee manieren plaatsvinden [7](#page=7): * **Bevriezen (koude fixatie)**: Dit stopt enzymatische reacties snel. Koude fixatie maakt snelle verwerking van materiaal mogelijk en bewaart epitopen beter voor immuunkleuringen. Het wordt veel gebruikt in pathologielaboratoria voor snelle diagnoses van biopten en tumoren, zelfs tijdens operaties [7](#page=7). * **Chemische fixatieven**: Deze middelen denatureren eiwitten door ze te cross-linken (bv. met formaldehyde/formol, glutaraldehyde) of neer te slaan (precipiteren) (bv. met alcohol of aceton). Door cross-linking blijven cel/weefselcomponenten behouden voor latere procedures. Chemische fixatieven resulteren over het algemeen in een betere morfologie. Formol wordt gebruikt voor LM en glutaraldehyde voor EM [7](#page=7). ##### 4.1.2.2 Artefacten bij fixatie Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in vivo situatie worden artefacten genoemd. Dit kan leiden tot structuurveranderingen (bv. het ontstaan van een holte rond kraakbeencellen) of het op een andere plaats voorkomen van componenten (bv. glycogeendrift in een leverpreparaat) [7](#page=7). #### 4.1.3 Inbedden Inbedden houdt in dat het gefixeerde materiaal wordt omwikkeld en doordrongen met een inbedmiddel. Het inbedmiddel is een substantie die in het weefsel binnendringt en vervolgens hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken. Veelgebruikte inbedmiddelen zijn paraffine, hars en plastics [7](#page=7). ##### 4.1.3.1 Vereisten voor inbedmiddelen Voor het verkrijgen van goede coupes moet het inbedmiddel het weefsel volledig kunnen binnendringen. Als dit niet gebeurt, ontstaat materiaal met verschillende hardheden, wat het snijden bemoeilijkt [8](#page=8). ##### 4.1.3.2 Het proces van inbedden Inbedmiddelen die gebruikt worden in de routine histologie zijn hydrofoob. Aangezien biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%), moet dit water eerst verwijderd worden met behulp van een stijgende reeks alcoholbaden (bv. 30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Vervolgens wordt tolueen gebruikt voor 'clearing', een substantie die mengbaar is met zowel alcohol als het hydrofobe inbedmiddel [8](#page=8). > **Tip**: Hoewel er alternatieve hydrofobe harsen met hydrofiele groepen en hydrofiele inbedmiddelen bestaan, zijn deze over het algemeen minder stabiel en resulteren ze in inferieure morfologie [8](#page=8). #### 4.1.4 Snijden Door de hardheid van het inbedmateriaal kan het weefsel in dunne plakken gesneden worden [8](#page=8). ##### 4.1.4.1 Dikte van de coupes * **Paraffine**: Maakt coupes van 5-10 micrometer mogelijk, wat doorlaatbaar is voor licht. Paraffine wordt verwarmd tot ongeveer 55°C, waardoor het smelt en in het weefsel kan dringen. Bij deze temperatuur blijven veel epitopen nog bewaard [8](#page=8). * **Harsen en plastics**: Laten coupes toe tot 70 nanometer, wat doorlaatbaar is voor elektronen. De polymerisatie van hars gebeurt bij 60-65°C. Omdat de meeste harsen moeilijk uit het weefsel te etsen zijn (in tegenstelling tot paraffine), zijn ze minder geschikt voor immuunkleuringen [8](#page=8). ##### 4.1.4.2 Gebruik van de microtoom Het snijden van het ingebedde, harde materiaal gebeurt met een microtoom. Microtomen voor paraffine-ingebed materiaal zijn uitgerust met stalen messen. Microtomen voor harsen en plastics gebruiken glazen of diamanten messen [8](#page=8). ##### 4.1.4.3 Plaatsing van de coupes Coupes voor LM-analyse worden aangebracht op draagglaasjes. Coupes voor EM worden op metalen (koper, nikkel) roostertjes geplaatst, aangeduid als grids [8](#page=8). ### 4.2 Kleuringen en contrasttechnieken Omdat biologisch materiaal van zichzelf weinig contrast geeft, zijn aangepaste fixatie- en kleuringstechnieken essentieel voor microscopische observatie [6](#page=6). #### 4.2.1 Kleuringen voor elektronenmicroscopie (EM) Voor TEM worden ultradunne coupes van 50-100 nm gemaakt na fixatie. Om contrast te creëren, wordt het materiaal blootgesteld aan verbindingen van zware metalen, zoals osmium, die elektronen weerkaatsen en zich aan specifieke structuren binden. Deze structuren verschijnen dan als donkere gebieden in het beeld, terwijl structuren met minder affiniteit voor deze 'kleurstoffen' meer elektronen doorlaten en lichter worden weergegeven. Als coupes te dik zouden zijn, zouden alle elektronen tegengehouden worden, wat resulteert in een zwart beeld [6](#page=6). ##### 4.2.1.1 Negatieve kleuring Hierbij worden virusdeeltjes of andere structuren omgeven door een zwaar metaalzout (zoals uranylacetaat of fosfowolframzuur). Het metaal vult de ruimte rond het preparaat, waardoor het preparaat zelf wit afsteekt tegen een zwarte achtergrond [6](#page=6). ##### 4.2.1.2 Shadowing (schaduwbestuiving) Dit is een techniek waarbij het preparaat vanuit een schuine hoek wordt bestoven met een verdampt metaal (zoals platina, goud of chroom). Hierdoor ontstaat er een driedimensionaal effect doordat de ene kant van de structuur wordt belicht en de andere kant in de schaduw ligt [6](#page=6). ##### 4.2.1.3 Rotary shadowing Een specifieke vorm van shadowing waarbij het preparaat onder een zeer lage hoek op een roterend specimen wordt bestoven, vaak gebruikt voor visualisatie van nucleïnezuren [6](#page=6). #### 4.2.2 Kleuringen voor lichtmicroscopie (LM) Histologische kleuringen maken weefselstructuren zichtbaar die anders transparant zouden zijn, door gebruik te maken van verschillen in de chemie van het weefsel, voornamelijk via ionische binding [11](#page=11). ##### 4.2.2.1 Hematoxyline en Eosine (H/E) kleuring De meest gebruikte routinekleuring [11](#page=11). * **Hematoxyline**: Werkt als een kationische, basische kleurstof in combinatie met aluminiumzouten. Het kleurt negatief geladen, basofiele celbestanddelen (zoals nucleïnezuren in de celkern) blauw tot donkerpaars [11](#page=11). * **Eosine**: Een anionische, zure kleurstof die reageert met positief geladen, acidofiele componenten (zoals eiwitten in het cytoplasma) en deze roze kleurt [11](#page=11). Met H&E kleuring kleuren kernen blauw, terwijl cytoplasma en extracellulaire matrix roze kleuren. Verschillen in heterochromatinecondensatie zijn diagnostisch belangrijk [11](#page=11). > **Tip**: H&E kleuring is niet compatibel met immunofluorescentie. Hematoxyline zonder eosine kan nuttig zijn als tegenkleuring [11](#page=11). ##### 4.2.2.2 Specifieke kleurtechnieken * **Indifferente kleurstoffen**: Kleuren voornamelijk vetten aan, zoals Oil Red O [11](#page=11). * **Immunohistochemische kleuring**: Gebruikt antilichamen gekoppeld aan een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud om specifieke eiwitten te detecteren [11](#page=11). * **Enzymkleuringen**: Tonen de activiteit van specifieke enzymen aan met behulp van een enzymspecifiek substraat [11](#page=11). #### 4.2.3 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen (fluorochroomen) om specifieke moleculen of structuren te visualiseren [11](#page=11). ### 4.3 Toepassingen van microscopietechnieken * **TEM**: Wordt gebruikt om de interne structuur van objecten te bestuderen, zoals weefsels, cellen en virussen. Voorbeelden van TEM-analyse zijn de visualisatie van het coronavirus, een plantenvirus, collageenvezels en poliovirusdeeltjes [6](#page=6). * **LM**: De resolutie van LM wordt typisch bepaald door het objectief en de golflengte van licht, rond 200 nm [10](#page=10). * **Klaarveldmicroscoop (bright field)**: Gebruikt doorvallend wit licht en bestaat uit een condensor, objectief en ocularen [10](#page=10). * **Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen**: * **Fasecontrastmicroscopie**: Benut faseverschuivingen voor contrast in ongekleurde preparaten, ideaal voor levende celculturen [10](#page=10). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski)**: Gebruikt interferentie van gepolariseerd licht om contrast te genereren [10](#page=10). * **Digitale microscopie**: Maakt gebruik van videocamera's en computerverwerking voor dynamische beelden, inclusief _real-time en _time-lapse opnamen [10](#page=10). * **Fluorescentiemicroscopie**: Wordt gebruikt voor _life cell imaging [10](#page=10). > **Tip**: Bij het observeren van levende, ongekleurde cellen zijn fasecontrast- of DIC-microscopen vaak essentieel om structuren zichtbaar te maken, omdat deze technieken het inherente contrast van de cel benutten [11](#page=11). --- # Lichtmicroscopie en fluorescentiemicroscopie Dit topic biedt een gedetailleerd overzicht van diverse lichtmicroscopietechnieken, waaronder klaarveld-, fasecontrast-, DIC- en fluorescentiemicroscopie, met de bijbehorende principes, toepassingen en specifieke kleuringen voor biologische analyse. ### 5.1 Lichtmicroscopie (LM) Lichtmicroscopie maakt gebruik van zichtbaar licht en lenzen om beelden van biologische monsters te vergroten, waarbij de resolutie typisch rond de 200 nanometer ligt, bepaald door de golflengte van het licht en de eigenschappen van het objectief [10](#page=10). #### 5.1.1 Klaarveldmicroscoop De klaarveldmicroscoop is de meest basale vorm van lichtmicroscopie en maakt gebruik van doorvallend wit licht. Het systeem bestaat uit een condensor om het licht te bundelen, een objectief voor de primaire vergroting, en oculairlenzen voor de uiteindelijke vergroting [10](#page=10). ##### 5.1.1.1 Kleuringen voor klaarveldmicroscopie Om structuren zichtbaar te maken die anders transparant zouden zijn, worden histologische kleuringen toegepast. Deze maken gebruik van verschillen in de chemische samenstelling van weefselcomponenten, voornamelijk door ionische binding [11](#page=11). * **Hematoxyline/Eosine (H/E):** Dit is de meest gebruikte routinekleuring. Hematoxyline, een basische kleurstof gecombineerd met aluminiumzouten, kleurt negatief geladen, basofiele celcomponenten (zoals celkernen) blauw tot donkerpaars. Eosine, een zure kleurstof, kleurt positief geladen, acidofiele componenten (zoals eiwitten in het cytoplasma) roze. Kernen kleuren blauw, cytoplasma en extracellulaire matrix roze, waarbij verschillen in heterochromatinecondensatie diagnostisch relevant zijn [11](#page=11). * **Tip:** H&E kleuring is niet compatibel met immunofluorescentie. Hematoxyline alleen kan als tegenkleuring dienen [11](#page=11). * **PAS (Periodic Acid-Schiff):** Deze kleuring kleurt vrije suikers aan [10](#page=10). * **Indifferente kleurstoffen:** Deze kleuren voornamelijk vetten, zoals Oil Red O [11](#page=11). #### 5.1.2 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen Voor het observeren van levende cellen, die vaak weinig inherent contrast hebben, zijn specifieke technieken ontwikkeld die het inherente contrast van de cel benutten [10](#page=10) [11](#page=11). ##### 5.1.2.1 Fasecontrastmicroscopie Deze techniek benut de faseverschuivingen die optreden wanneer licht door structuren met verschillende brekingsindices gaat. Door deze faseverschillen om te zetten in helderheidsverschillen, worden structuren zichtbaar in ongekleurde preparaten, wat ideaal is voor levende celculturen [10](#page=10). ##### 5.1.2.2 Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski) DIC-microscopie maakt gebruik van de interferentie van gepolariseerd licht om contrast te genereren. Dit resulteert in beelden met een pseudo-3D-uiterlijk, wat zeer nuttig is voor het bestuderen van celmorfologie en dynamische processen [10](#page=10). #### 5.1.3 Digitale microscopie Digitale microscopie integreert videocamera's en computerverwerking om beelden te digitaliseren en te analyseren. Dit maakt dynamische beeldvorming mogelijk, inclusief *real-time* en *time-lapse* opnames [10](#page=10). ### 5.2 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen, ook wel fluorochromen genoemd, om specifieke moleculen of structuren te visualiseren. Dit is een veelgebruikte techniek voor *life cell imaging* [10](#page=10) [11](#page=11). #### 5.2.1 Werkingsprincipe Fluorescerende stoffen absorberen licht van een bepaalde golflengte (excitatie) en zenden dit licht vervolgens uit op een langere golflengte (emissie). Een excitatiefilter laat alleen het excitatielicht door, terwijl een barrièrefilter het emissielicht doorlaat en het excitatielicht blokkeert [12](#page=12). #### 5.2.2 Typen fluorescentiemicroscopen ##### 5.2.2.1 Epifluorescentiemicroscopie Bij epifluorescentiemicroscopie wordt het preparaat geëxciteerd met kortgolvig licht dat via de objectieflens invallend is, en wordt het emissielicht met een langere golflengte ook via dezelfde objectieflens gedetecteerd. Essentiële onderdelen zijn de excitatiebron (vaak een kwiklamp of LED), golflengtefilters (excitatiefilter, dichroïsche spiegel die licht weerkaatst en doorlaat, en een emissiefilter) en een detector (oog of camera) [12](#page=12). ##### 5.2.2.2 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) CLSM gebruikt een laser als excitatiebron en een *pinhole* (klein gaatje) vóór de detector. Dit *pinhole* elimineert licht dat niet in het brandvlak is geëxciteerd, waardoor strooilicht wordt gereduceerd en de resolutie en het contrast aanzienlijk verbeteren. CLSM maakt het mogelijk om optische coupes te maken en zo 3D-reconstructies te realiseren, en is zeer geschikt voor *time-lapse* analyses van levende cellen [12](#page=12). #### 5.2.3 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie kent een breed scala aan toepassingen in de biologische analyse: * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Gebruikt om intracellulaire ionenconcentratieveranderingen te meten, zoals de concentratie van calciumionen ($Ca^{2+}$) met bijvoorbeeld Fura-2 [12](#page=12). * **Immunofluorescentiemicroscopie:** Detecteert specifieke eiwitten door gebruik te maken van antilichamen die gelabeld zijn met een fluorachroom, wat de lokalisatie van deze eiwitten in de cel of weefsel bestudeert [12](#page=12). * **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Technieken zoals het koppelen van Groene Fluorescente Proteïne (GFP) aan specifieke eiwitten maken het mogelijk om de eiwitexpressie, -lokalisatie en -beweging in levende cellen te volgen [12](#page=12). * **Visualisatie van organellen:** Specifieke kleurstoffen kunnen organellen zoals lysosomen en mitochondria zichtbaar maken [12](#page=12). * **Meerdere eiwitten tegelijk:** Door gebruik te maken van fluorochromen met verschillende emissiespectra, kunnen twee of meer verschillende eiwitten tegelijk worden gekleurd om hun co-lokalisatie (het al dan niet samen voorkomen in dezelfde celregio) te bestuderen [12](#page=12). #### 5.2.4 Geavanceerde fluorescentietechnieken * **Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie:** Softwarematige beeldverwerking die het effect van out-of-focus licht corrigeert, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en een betere signaal-ruisverhouding [12](#page=12). * **4D Live Cell Imaging:** Een geavanceerde techniek die snelle 3D-multi-kleurenimaging combineert met *time-lapse* opnames, waardoor dynamische processen in levende cellen over tijd en in drie dimensies kunnen worden bestudeerd [12](#page=12). * **Virtuele microscopie:** Een digitale simulatie van microscopie waarbij volledige preparaten digitaal worden gescand, wat de analyse en het delen van beelden vereenvoudigt [12](#page=12). ### 5.3 Histologische kleuringen (Algemeen) Histologische kleuringen zijn essentieel om structuren zichtbaar te maken die anders transparant zouden zijn. Ze werken door middel van verschillen in de chemie van het weefsel, voornamelijk via ionische binding. Naast H&E zijn er ook specifieke kleurtechnieken [11](#page=11). * **Immunohistochemische kleuring:** Gebruikt antilichamen gelabeld met een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud om specifieke eiwitten te detecteren [11](#page=11). * **Enzymkleuringen:** Tonen de activiteit van specifieke enzymen aan door gebruik te maken van een enzymspecifiek substraat [11](#page=11). ### 5.4 Microscopietechnieken voor biologische analyse (Overzicht) Verschillende microscopietechnieken worden gebruikt voor de observatie van cellen en weefsels, elk met hun specifieke toepassingen en resoluties [10](#page=10). #### 5.4.1 Algemene preparatie voor LM en EM Voor microscopische analyse ondergaan biologische monsters typisch een reeks voorbereidingsstappen: * **Fixatie:** Het behouden van de structuur van het monster [9](#page=9). * **Dehydratatie en 'clearing':** Verwijdering van water met alcoholbaden, gevolgd door een 'clearing'-stap met een mengbare substantie zoals tolueen om de inbedding te vergemakkelijken [10](#page=10). * **Inbedden:** Het monster wordt omwikkeld met een inbedmiddel dat hard wordt, waardoor het snijdbaar wordt. Paraffine wordt gebruikt voor LM, terwijl harsen of plastics nodig zijn voor de dunnere coupes van EM [10](#page=10). * **Snijden:** Met behulp van een microtoom worden dunne coupes gemaakt. LM gebruikt paraffine coupes van 5-10 µm dik op glas terwijl EM coupes van 70 nm dik op metalen roosters (grids) gebruikt [10](#page=10). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een microscopietechniek die elektronenbundels gebruikt die door een ultradun preparaat gaan om structuren met een zeer hoge resolutie, tot op nanometer niveau, zichtbaar te maken. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een microscopietechniek waarbij een elektronenbundel over het oppervlak van een preparaat wordt gescand, waarbij het beeld wordt gevormd door teruggekaatste en secundaire elektronen, ideaal voor het bestuderen van oppervlaktestructuren. | | Fixatie | Het proces waarbij biologisch materiaal wordt gestabiliseerd met chemische of fysieke methoden om cellulaire structuren te behouden en degradatie door enzymen te voorkomen, essentieel voor microscopische analyse. | | Contrastering (kleuring) | Het gebruik van zware metalen of andere stoffen om de densiteitsverschillen in biologisch materiaal te vergroten, waardoor structuren beter zichtbaar worden in een elektronenmicroscoop. | | Dehydratatie | Het proces van het verwijderen van water uit biologisch materiaal, meestal met oplossingen van ethanol of aceton met toenemende concentraties, ter voorbereiding op inbedding en microscopische analyse. | | Inbedding in hars | Het doordringen van gedehydrateerd biologisch materiaal met een nog niet-gepolymeriseerde kunsthars die vervolgens polymeriseert om een hard blok te vormen, waardoor het materiaal ultradun gesneden kan worden. | | Ultradun snijden | Het proces van het snijden van ultradunne coupes (typisch 50-100 nm dik) uit ingebed biologisch materiaal met behulp van een ultramicrotoom en specifieke messen, noodzakelijk voor TEM-analyse. | | Grids (microscopie) | Kleine metalen schijfjes met een roosterpatroon, waarop de ultradunne coupes voor elektronenmicroscopie worden geplaatst voor observatie. | | Basale lamina (basale membraan) | Een dunne laag extracellulaire matrix die onder het epitheel rust en dient als ondersteuning en scheiding tussen epitheelcellen en het onderliggende bindweefsel. | | Cilia | Kleine, haarachtige uitsteeksels op het oppervlak van bepaalde cellen die kunnen helpen bij de voortbeweging van vloeistoffen of deeltjes. | | Microvilli | Vingerachtige uitsteeksels op het celoppervlak die de oppervlakte vergroten voor absorptie of secretie, vergelijkbaar met cilia maar kleiner en talrijker. | | Vries-breek (freeze-fracture) | Een techniek die cellulaire membranen doorsnijdt om de interne membraanstructuren, zoals eiwitten, zichtbaar te maken voor elektronenmicroscopie. | | Vries-ets (freeze-etching) | Een techniek waarbij een dunne laag ijs van een bevroren preparaat wordt verwijderd via sublimatie onder vacuüm, om diepere structuren bloot te leggen voor driedimensionale visualisatie. | | Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) | Een techniek voor 3D-reconstructie die gebruik maakt van een serie 2D-projecties van een monster, verkregen door het monster te kantelen, om gedetailleerde driedimensionale beelden van cellulaire structuren te creëren. | | Hematoxyline en Eosine (H/E) kleuring | De meest gebruikte routinekleuring in de histologie; hematoxyline kleurt kernen blauw/paars (basofiel) en eosine kleurt cytoplasma en extracellulaire matrix roze (acidofiel). | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopietechniek die fluorescerende kleurstoffen gebruikt om specifieke moleculen of structuren te visualiseren door hun absorptie en emissie van licht bij verschillende golflengtes. | | Confocale laser scanning microscopie (CLSM) | Een type fluorescentiemicroscoop die een laser als excitatiebron gebruikt en een pinhole om strooilicht te elimineren, wat resulteert in hoge resolutie en 3D-reconstructies. | | SBF-SEM (Serial Block-Face SEM) | Een geavanceerde SEM-techniek waarbij materiaal seriëel wordt verwijderd met een ultramicrotoom, waarna het oppervlak wordt gescand om 3D-reconstructies van grotere volumes mogelijk te maken. | | FIB-SEM (Focused Ion Beam SEM) | Een SEM-techniek die een gefocusseerde ionenbundel gebruikt om materiaal weg te etsen, waardoor 3D-reconstructies op hoge resolutie van grote volumes mogelijk zijn. |