01 inleiding & techniek 25-26 & notes.pdf-summary_removed.pdf

# Voorbereiding en analyse van biologisch materiaal met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) De voorbereiding van biologisch materiaal voor TEM-analyse omvat diverse stappen die cruciaal zijn om structuren met hoge resolutie zichtbaar te maken . ### 1.1 Algemene principes van TEM-beeldvorming Elektronenmicroscopie maakt gebruik van elektronenbundels met een korte golflengte, die buiten het zichtbare spectrum van het menselijk oog vallen. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op elektronenstrooiing door de atomen van het weefsel. Dicht(er)e structuren absorberen meer elektronen en verschijnen donkerder, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten en lichter verschijnen. Biologisch materiaal vertoont van nature geringe densiteitsverschillen, wat de noodzaak van 'contrastering' onderstreept . ### 1.2 Voorbereidingsstappen van biologisch materiaal De voorbereiding van biologisch materiaal voor TEM omvat een reeks essentiële stappen die gericht zijn op het behoud van ultrastructuur en het creëren van voldoende contrast . #### 1.2.1 Fixatie De eerste stap is de fixatie van ruwe materiaalstukjes, zoals weefselbrokjes of losse cellen, met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde. Het doel van fixatie is om de fijne intracellulaire structuren zo intact mogelijk te behouden en de celmembranen doorlaatbaar te maken voor de componenten die in latere stappen worden gebruikt . #### 1.2.2 Spoeling en 'kleuring' (contrastering) Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het biologisch materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen. Deze stoffen, zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat of kaliumpermanganaat, binden zich specifiek aan bepaalde celregio's, waaronder vetrijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern, en eiwitrijke structuren zoals cytoskeletelementen. Metaalverbindingen weerkaatsen elektronen, waardoor de ermee gemerkte structuren als donkere plekken verschijnen in de microscoop. Dit proces wordt 'kleuren' genoemd, hoewel het geen werkelijke kleuren betreft. Een verhoging van deze densiteitsverschillen, ook wel contrasteren genoemd, is cruciaal voor de beeldvorming. Osmiumtetroxide kan zowel als fixatief als contrasteringsmiddel dienen, en draagt bij aan het contrast van membranen. Uranylacetaat en loodcitraat worden gebruikt als contrasteringsvloeistof [14](#page=14) . > **Tip:** De 'kleuring' in TEM verwijst naar het gebruik van zware metalen om densiteitsverschillen te vergroten, niet naar ware kleuren zoals in lichtmicroscopie . > **Voorbeeld:** Zonder de contrastering met zware metalen zouden de verschillende membranen en organellen in een cel nauwelijks te onderscheiden zijn in de TEM vanwege hun vergelijkbare densiteit . #### 1.2.3 Dehydratatie Om ultradunne coupes (60 tot 90 nm dikte) te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, is het verwijderen van water uit het monster noodzakelijk. Dit gebeurt door het materiaal te spoelen met oplossingen van ethanol of aceton met toenemende concentraties . #### 1.2.4 Inbedding in hars Na de dehydratatie wordt het materiaal geïnfiltreerd met een nog niet-gepolymeriseerde kunsthars. Vervolgens wordt het hars-doordrongen materiaal in een houder geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule. Polymerisatie van de hars kan plaatsvinden door middel van warmte, magnetronstraling, of katalysatie met ultraviolet licht, resulterend in harde, goed snijbare blokjes materiaal . #### 1.2.5 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden Voor het verkrijgen van coupes met een dikte van ongeveer 70 nm zijn speciale messen van gespleten glas of diamanten messen vereist. Het snijden gebeurt met behulp van een ultramicrotoom . #### 1.2.6 Opvangen van coupes op een gridje Een kleine hoeveelheid water achter het mes dient als smeermiddel en voor het opvangen van de coupes. De fragiele coupes worden van het wateroppervlak 'opgeschept' op een metalen schijfje van minder dan 5 mm doorsnee met een roosterpatroon, een zogenaamd gridje . ### 1.3 Analyse en resolutie Met TEM kunnen structuren van cellulaire organellen met hoge resolutie worden waargenomen. Een voorbeeld toont twee aangrenzende pancreascellen, waarbij details zoals de kern (N), mitochondria (M), lysosomen (L), ruw endoplasmatisch reticulum (RER) en de dubbelbladige plasmamembranen (PM) zichtbaar zijn. Vergrotingen van ongeveer 40.000 keer en insets van 200.000 keer zijn mogelijk . ### 1.4 Analyse van epitheel van de trachea met behulp van microscopietechnieken Dit onderwerp bespreekt de analyse van het epitheel van de trachea (luchtpijp) met behulp van verschillende microscopietechnieken, met name transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM), om de structuur en celtypen te onderscheiden . #### 1.4.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse van tracheaalepitheel TEM-analyse van het epitheel van de trachea onthult twee primaire celtypen: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen . ##### 1.4.1.1 Ondersteunende structuren Het epitheel rust op een basaal membraan (BM, basale lamina) dat overgaat in fibreus bindweefsel, bestaande uit fibrocyten, collageenvezels (Co) en elastinevezels (El) . ##### 1.4.1.2 Celtypen in het tracheaalepitheel * **Gecilieerde cellen:** Deze cellen zijn gekenmerkt door de aanwezigheid van lange cilia en bevatten veel mitochondria en enig glad endoplasmatisch reticulum (SER). De cilia zijn begrensd door een dubbelbladige biologische membraan, vergelijkbaar met microvilli (MV), en kunnen longitudinaal, schuin of dwars worden doorgesneden . * **Mucus-producerende cellen:** Deze cellen worden geïdentificeerd door de overvloed aan ruw endoplasmatisch reticulum (ER), een uitgebreid Golgi-apparaat (G), en mucus-gevulde secretiedruppels (MD) . > **Tip:** De cilia en microvilli zijn beide begrensd door een "unit membrane" (UM), wat wijst op een gemeenschappelijke membraanstructuur . ##### 1.4.1.3 Technieken in TEM Naast standaard TEM-preparaten, worden ook technieken zoals vries-breek (freeze-fracture) en vries-ets (freeze-etching) toegepast om membraanstructuren te visualiseren . * **Vries-breek:** Deze techniek breekt cellulaire membranen doorgaans tussen het binnen- en buitenblad, waardoor de interne membraanstructuren, waaronder eiwitten, zichtbaar worden. Het vloeibare mozaïekmodel van de biologische membraan wordt hierdoor geïllustreerd, waarbij eiwitten geassocieerd kunnen worden met de cytoplasmatische (P) of extracellulaire (E) membraanhelft . * **Vries-ets:** Deze methode genereert meer 3D-structuur door een dunne laag ijs te verwijderen via sublimatie (vast naar gas) onder vacuüm, waardoor diepere structuren blootgelegd worden . Visualisatie na deze vries-technieken gebeurt door bestuiving met zware atomen voor TEM of SEM, of door het maken van een replica om de elektronenpassage in TEM te verbeteren . > **Voorbeeld:** Een TEM-opname van een replica van een vriesbreekpreparaat van een darmepitheelcel toont organellen zoals microvilli (MV), celmembraan (CM), mitochondriën (M), Golgi-apparaat (G), nucleus (N) en kernporiën . #### 1.4.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) analyse van tracheaalepitheel SEM-analyse van het epitheel van de trachea toont eveneens de twee celtypen: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen. De mucus-producerende cellen vertonen een koepelvormig oppervlak . ##### 1.4.2.1 Monsterpreparatie voor SEM Monsters die met SEM worden bekeken, moeten geleidend worden gemaakt voor elektriciteit. Dit gebeurt door ze met een sputtercoater te voorzien van een uiterst dun laagje (1,5-3 nanometer) goud of goud/palladium . #### 1.4.3 Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) Cryo-ET is een techniek voor 3D-reconstructie die gebaseerd is op een serie 2D-projecties, verkregen door het object of de detector rond een as te kantelen . ##### 1.4.3.1 Principe van Cryo-ET De reconstructie gebeurt door het progressief berekenen van terugprojecties naar een virtueel 3D-beeld van het originele object. De nauwkeurigheid van het gereconstrueerde beeld neemt toe naarmate meer projecties met kleinere hoekverschillen kunnen worden gecombineerd, wat leidt tot minder "artefacten" door ontbrekende wiggen (missing-wedge) . > **Voorbeeld:** Het principe kan geïllustreerd worden voor de reconstructie van een 2D-beeld uit 1D-projecties, waarbij een betere beeldkwaliteit wordt bereikt met meer projecties over een groter hoekbereik . ##### 1.4.3.2 Toepassing van Cryo-ET Cryo-ET kan worden gebruikt voor de gedetailleerde reconstructie van cellulaire structuren, zoals nucleaire pore complexen (NPC's). Door verschillende NPC's te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt . > **Voorbeeld:** Een 3D-reconstructie van een deel van het kernoppervlak toont de structuur van nucleaire pore complexe (NPC) en ruw endoplasmatisch reticulum (RER) in de celkern van de slijmzwam *Dictyostelium discoideum* . --- Dit onderdeel behandelt de essentiële stappen en technieken voor de preparatie en observatie van biologisch materiaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), met een focus op de specifieke vereisten voor deze geavanceerde microscopietechniek. ### 1.1 Algemene principes van elektronenmicroscopie en TEM Elektronenmicroscopie (EM) maakt gebruik van elektronenbundels in plaats van licht om structuren te visualiseren die met een lichtmicroscoop (LM) niet te onderscheiden zijn, wat resulteert in aanzienlijk hogere resoluties en vergrotingen. In tegenstelling tot lichtmicroscopen, die glaslenzen gebruiken, zet EM elektromagnetische magneten in als lenzen om elektronenbundels te focussen en te manipuleren. Er is een bron, een elektronenkanon, dat elektronen genereert door de verhitting van een filament in een hoog-vacuüm omgeving, waarna deze elektronen naar een anode worden getrokken. Elektromagnetische lenzen, waaronder een condensorlens en een objectieflens, sturen de elektronen [22](#page=22). Het cruciale voordeel van EM ligt in de veel kleinere golflengte van elektronen vergeleken met zichtbaar licht. De golflengte van licht varieert van 400 tot 800 nanometer (nm), waardoor objecten kleiner dan dit niet waarneembaar zijn met een LM. De golflengte van elektronen is echter zo klein dat in principe individuele atomen waargenomen kunnen worden [22](#page=22). Er zijn echter technische complicaties verbonden aan het gebruik van elektronen: * Elektronen worden gemakkelijk gestopt door gasmoleculen, wat vereist dat de elektronenmicroscoop in een nagenoeg absoluut vacuüm functioneert [22](#page=22). * Er moet onder hoogspanning worden gewerkt om de elektronen voldoende snelheid te verlenen [22](#page=22). * Elektrische en magnetische velden zijn noodzakelijk als lenzen om de elektronenstraal te sturen [22](#page=22). #### 1.1.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) TEM maakt gebruik van elektronen die door een ultradun preparaat heen gaan. De resolutie van TEM kan tot 1 nm reiken. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op de verstrooiing van elektronen op zware atoomkernen in het preparaat [23](#page=23). ##### 1.1.1.1 Preparatie- en kleuringstechnieken voor TEM Omdat biologisch materiaal van zichzelf weinig contrast geeft in een TEM, zijn aangepaste fixatie- en kleuringstechnieken essentieel [23](#page=23). * **Fixatie:** Biologisch materiaal wordt gefixeerd met glutaaraldehyde, een bivalente crosslinker voor aminegroepen (voornamelijk in eiwitten), en osmiumtetroxide, een sterk oxidans dat lipiden en eiwitten stabiliseert [23](#page=23). * **Kleuring:** Om contrast te creëren, wordt het materiaal blootgesteld aan verbindingen van zware metalen, zoals osmium, die elektronen weerkaatsen en zich aan specifieke structuren binden. Deze structuren verschijnen dan als donkere gebieden in het beeld, terwijl structuren met minder affiniteit voor deze 'kleurstoffen' meer elektronen doorlaten en lichter worden weergegeven. Als coupes te dik zouden zijn, zouden alle elektronen tegengehouden worden, wat resulteert in een zwart beeld [23](#page=23). * **Negatieve kleuring:** Hierbij worden virusdeeltjes of andere structuren omgeven door een zwaar metaalzout (zoals uranylacetaat of fosfowolframzuur). Het metaal vult de ruimte rond het preparaat, waardoor het preparaat zelf wit afsteekt tegen een zwarte achtergrond [23](#page=23). * **Shadowing (schaduwbestuiving):** Dit is een techniek waarbij het preparaat vanuit een schuine hoek wordt bestoven met een verdampt metaal (zoals platina, goud of chroom). Hierdoor ontstaat er een driedimensionaal effect doordat de ene kant van de structuur wordt belicht en de andere kant in de schaduw ligt [23](#page=23). * **Rotary shadowing:** Een specifieke vorm van shadowing waarbij het preparaat onder een zeer lage hoek op een roterend specimen wordt bestoven, vaak gebruikt voor visualisatie van nucleïnezuren [23](#page=23). * **Ultradunne secties:** Voor TEM worden ultradunne coupes van 50-100 nm gemaakt na fixatie. Vanwege de dunheid van de coupes is expertise vereist voor een correcte driedimensionale interpretatie [23](#page=23). ##### 1.1.1.2 Toepassingen van TEM TEM wordt gebruikt om de interne structuur van objecten te bestuderen, zoals weefsels, cellen en virussen. Voorbeelden van TEM-analyse zijn de visualisatie van het coronavirus, een plantenvirus, collageenvezels en poliovirusdeeltjes [23](#page=23). ### 1.2 Vereiste stappen in histologische technieken voor microscopie Om cellen en weefsels onder de lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM) te kunnen bestuderen, zijn specifieke preparatietechnieken noodzakelijk. Biologisch materiaal is vaak te dik en bevat te weinig contrast om direct geobserveerd te kunnen worden. Histologische technieken maken het mogelijk weefsels voldoende dun te snijden en contrast te verhogen om structuurdetails zichtbaar te maken [19](#page=19) [34](#page=34). #### 1.2.1 Algemene procedure De algemene procedure omvat de volgende stappen [34](#page=34): 1. **Fixeren:** Behoud van de oorspronkelijke structuur door denaturatie van eiwitten [20](#page=20) [34](#page=34). 2. **Inbedden en snijden:** Het weefsel wordt ingebed in een hard materiaal en in dunne coupes gesneden [21](#page=21) [34](#page=34). 3. **Kleuren of contrasteren:** Verbetering van het zichtbare contrast in de coupes [19](#page=19) [34](#page=34). #### 1.2.2 Fixatie Fixatie stopt afbraakprocessen door enzymen te denatureren. Wanneer een weefsel uit zijn in vivo situatie wordt verwijderd, worden afbraakenzymen actief die leiden tot weefseldegradatie. Om deze afbraakprocessen tegen te gaan, moet de activiteit van deze eiwitten gestopt worden door denaturatie [20](#page=20). * **Methoden van fixatie:** Denaturatie van eiwitten kan op twee manieren plaatsvinden [20](#page=20): * **Bevriezen (koude fixatie):** Dit stopt enzymatische reacties snel. Koude fixatie maakt snelle verwerking van materiaal mogelijk en bewaart epitopen beter voor immuunkleuringen. Het wordt veel gebruikt in pathologielaboratoria voor snelle diagnoses van biopten en tumoren, zelfs tijdens operaties [20](#page=20). * **Chemische fixatieven:** Deze middelen denatureren eiwitten door ze te cross-linken (bv. met formaldehyde/formol, glutaraldehyde) of neer te slaan (precipiteren) (bv. met alcohol of aceton). Door cross-linking blijven cel/weefselcomponenten behouden voor latere procedures. Chemische fixatieven resulteren over het algemeen in een betere morfologie. Formol wordt gebruikt voor LM en glutaraldehyde voor EM [20](#page=20) [34](#page=34). * **Artefacten bij fixatie:** Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in vivo situatie worden artefacten genoemd. Dit kan leiden tot structuurveranderingen (bv. het ontstaan van een holte rond kraakbeencellen) of het op een andere plaats voorkomen van componenten (bv. glycogeendrift in een leverpreparaat) [20](#page=20) [34](#page=34). #### 1.2.3 Inbedden Inbedden houdt in dat het gefixeerde materiaal wordt omwikkeld en doordrongen met een inbedmiddel. Het inbedmiddel is een substantie die in het weefsel binnendringt en vervolgens hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken. Veelgebruikte inbedmiddelen zijn paraffine, hars en plastics [21](#page=21). * **Vereisten voor inbedmiddelen:** Voor het verkrijgen van goede coupes moet het inbedmiddel het weefsel volledig kunnen binnendringen. Als dit niet gebeurt, ontstaat materiaal met verschillende hardheden, wat het snijden bemoeilijkt [21](#page=21). * **Het proces van inbedden:** Inbedmiddelen die gebruikt worden in de routine histologie zijn hydrofoob. Aangezien biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%), moet dit water eerst verwijderd worden met behulp van een stijgende reeks alcoholbaden (bv. 30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Vervolgens wordt tolueen gebruikt voor ‘clearing’, een substantie die mengbaar is met zowel alcohol als het hydrofobe inbedmiddel [21](#page=21). > **Tip:** Hoewel er alternatieve hydrofobe harsen met hydrofiele groepen en hydrofiele inbedmiddelen bestaan, zijn deze over het algemeen minder stabiel en resulteren ze in inferieure morfologie [21](#page=21). #### 1.2.4 Snijden Door de hardheid van het inbedmateriaal kan het weefsel in dunne plakken gesneden worden [21](#page=21). * **Dikte van de coupes:** * **Paraffine:** Maakt coupes van 5-10 micrometer mogelijk, wat doorlaatbaar is voor licht. Paraffine wordt verwarmd tot ongeveer 55°C, waardoor het smelt en in het weefsel kan dringen. Bij deze temperatuur blijven veel epitopen nog bewaard [21](#page=21). * **Harsen en plastics:** Laten coupes toe tot 70 nanometer, wat doorlaatbaar is voor elektronen. De polymerisatie van hars gebeurt bij 60-65°C. Omdat de meeste harsen moeilijk uit het weefsel te etsen zijn (in tegenstelling tot paraffine), zijn ze minder geschikt voor immuunkleuringen [21](#page=21). * **Gebruik van de microtoom:** Het snijden van het ingebedde, harde materiaal gebeurt met een microtoom. Microtomen voor paraffine-ingebed materiaal zijn uitgerust met stalen messen. Microtomen voor harsen en plastics gebruiken glazen of diamanten messen [21](#page=21) [22](#page=22). * **Plaatsing van de coupes:** Coupes voor LM-analyse worden aangebracht op draagglaasjes. Coupes voor EM worden op metalen (koper, nikkel) roostertjes geplaatst, aangeduid als grids [22](#page=22). ### 1.3 Vergelijking TEM en SEM | Kenmerk | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | | :------------------ | :-------------------------------------- | :----------------------------------------------------------------- | | Focus | Interne structuur van ultradunne preparaten | Oppervlaktestructuur van preparaten | | Preparatie | Vereist ultradunne secties (50-100 nm) | Preparaten mogen groter en dikker zijn, maar moeten metaal-gecoat zijn | | Principe beeldvorming | Doorlating van elektronenbundel, verstrooiing door zware atomen | Scanning met elektronenbundel, detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen | | Beeldweergave | Op een fluorescerend scherm | Computergestuurde 3D-reconstructie van gedetecteerde signalen | | Resolutie | Tot 1 nm | Typisch enkele nanometers, afhankelijk van de bundel en detector | --- Dit onderwerp behandelt de methoden en technieken die worden gebruikt voor de gedetailleerde voorbereiding en analyse van biologisch materiaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), met een focus op de procedures die leiden tot structurele visualisatie op ultrahoge resolutie. ### 1.1 Voorbereiding van materiaal voor microscopische analyse De succesvolle toepassing van microscopische technieken, zowel lichtmicroscopie (LM) als elektronenmicroscopie (EM), is sterk afhankelijk van de juiste preparatie van biologisch materiaal. Dit proces omvat doorgaans fixatie, dehydratatie, inkapseling en snijden om dunne, observeerbare secties te verkrijgen [35](#page=35). #### 1.1.1 Fixatie Fixatie stabiliseert de cellulaire structuren en voorkomt degradatie. De keuze van het fixatiemiddel is afhankelijk van de microscopische techniek en de moleculen die men wil bestuderen [35](#page=35). #### 1.1.2 Dehydratatie en 'clearing' Om het gebruik van waterige oplossingen te vermijden tijdens de inbedding, moet het weefsel eerst worden gedehydrateerd met een reeks alcoholbaden, gevolgd door een 'clearing'-stap met een mengbare substantie zoals tolueen [35](#page=35). #### 1.1.3 Inbedden Het gefixeerde materiaal wordt omwikkeld en doordrongen met een inbedmiddel dat hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken. Klassieke, hydrofobe inbedmiddelen zoals paraffine worden gebruikt na dehydratatie en 'clearing'. Voor EM zijn hardere inbedmiddelen, zoals harsen of plastics, nodig om dunnere coupes mogelijk te maken [35](#page=35). #### 1.1.4 Snijden Met behulp van een microtoom worden dunne coupes gemaakt [35](#page=35). * **LM:** Paraffine coupes van 5-10 µm dik, snijdbaar met een stalen mes. Coupes worden op glazen draagglas geplaatst [35](#page=35). * **EM:** Hars/plastic coupes van 70 nm dik, snijdbaar met glazen of diamanten messen. Coupes worden op metalen roosters (grids) geplaatst [35](#page=35). ### 1.2 Microscopietechnieken voor biologische analyse Verschillende microscopietechnieken worden gebruikt voor de observatie van cellen en weefsels, elk met hun specifieke toepassingen en resoluties. #### 1.2.1 Lichtmicroscopie (LM) De resolutie van LM wordt typisch bepaald door het objectief en de golflengte van licht, rond 200 nm [35](#page=35). * **Klaarveldmicroscoop (bright field):** Gebruikt doorvallend wit licht en bestaat uit een condensor, objectief en oculairen [36](#page=36). * **Kleuringen:** Hematoxyline/Eosine (HE) kleurt verschillende celcomponenten aan op basis van lichtabsorptie. PAS kleurt vrije suikers aan [36](#page=36). * **Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen:** * **Fasecontrastmicroscopie:** Benut faseverschuivingen voor contrast in ongekleurde preparaten, ideaal voor levende celculturen [36](#page=36). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski):** Gebruikt interferentie van gepolariseerd licht om contrast te genereren [36](#page=36). * **Digitale microscopie:** Maakt gebruik van videocamera's en computerverwerking voor dynamische beelden, inclusief _real-time en _time-lapse opnamen [36](#page=36). * **Fluorescentiemicroscopie:** Wordt gebruikt voor _life cell imaging [36](#page=36). > **Tip:** Bij het observeren van levende, ongekleurde cellen zijn fasecontrast- of DIC-microscopen vaak essentieel om structuren zichtbaar te maken, omdat deze technieken het inherente contrast van de cel benutten [36](#page=36). #### 1.2.2 Histologische kleuringen Histologische kleuringen maken weefselstructuren zichtbaar die anders transparant zouden zijn, door gebruik te maken van verschillen in de chemie van het weefsel, voornamelijk via ionische binding [37](#page=37). * **Hematoxyline en Eosine (H/E) kleuring:** De meest gebruikte routinekleuring [37](#page=37). * **Hematoxyline:** Werkt als een kationische, basische kleurstof in combinatie met aluminiumzouten. Het kleurt negatief geladen, basofiele celbestanddelen (zoals nucleïnezuren in de celkern) blauw tot donkerpaars [37](#page=37). * **Eosine:** Een anionische, zure kleurstof die reageert met positief geladen, acidofiele componenten (zoals eiwitten in het cytoplasma) en deze roze kleurt [37](#page=37). * Met H&E kleuring kleuren kernen blauw, terwijl cytoplasma en extracellulaire matrix roze kleuren. Verschillen in heterochromatinecondensatie zijn diagnostisch belangrijk [37](#page=37). > **Tip:** H&E kleuring is niet compatibel met immunofluorescentie. Hematoxyline zonder eosine kan nuttig zijn als tegenkleuring [37](#page=37). * **Specifieke kleurtechnieken:** * **Indifferente kleurstoffen:** Kleuren voornamelijk vetten aan, zoals Oil Red O [38](#page=38). * **Immunohistochemische kleuring:** Gebruikt antilichamen gekoppeld aan een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud om specifieke eiwitten te detecteren [38](#page=38). * **Enzymkleuringen:** Tonen de activiteit van specifieke enzymen aan met behulp van een enzymspecifiek substraat [38](#page=38). #### 1.2.3 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen) om specifieke moleculen of structuren te visualiseren [38](#page=38). * **Werkingsprincipe:** Fluorescerende stoffen absorberen licht van een bepaalde golflengte (excitatie) en zenden dit uit op een langere golflengte (emissie). Een excitatiefilter laat absorptiestraling door, terwijl een barrièrefilter deze moet tegenhouden [38](#page=38). * **Typen fluorescentiemicroscopen:** * **Epifluorescentiemicroscopie:** Exciteert het preparaat met kortgolvig licht en detecteert emissielicht van langere golflengte. Kenmerkende onderdelen zijn de excitatiebron, golflengtefilters (excitatiefilter, dichroïsche spiegel, emissiefilter) en een detector [38](#page=38). * **Confocale laser scanning microscopie (CLSM):** Gebruikt een laser als excitatiebron en een pinhole om strooilicht te elimineren, wat resulteert in hogere resolutie en contrast. Maakt 3D-reconstructies mogelijk en is geschikt voor time-lapse analyses [38](#page=38). * **Toepassingen van fluorescentiemicroscopie:** * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Meten intracellulaire ionenconcentratieveranderingen, zoals Ca²⁺ met Fura-2 [39](#page=39). * **Immunofluorescentiemicroscopie:** Detecteert specifieke eiwitten met gelabelde antilichamen om hun lokalisatie te bestuderen [39](#page=39). * **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Maakt detectie en tracking van specifieke eiwitten in levende cellen mogelijk [39](#page=39). * **Visualisatie van organellen:** Lysosomen en mitochondria kunnen worden gevisualiseerd [39](#page=39). * **Meerdere eiwitten tegelijk:** Kleuring van twee verschillende eiwitten is mogelijk om colocalisatie aan te tonen [39](#page=39). * **Geavanceerde fluorescentietechnieken:** * **Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie:** Softwarematige bewerking van beelden voor hogere resolutie [39](#page=39). * **4D Live Cell Imaging:** Combineert snelle 3D-multi-kleurenimaging met time-lapse opnames [39](#page=39). * **Virtuele microscopie:** Digitale simulatie van microscopie met volledig ingescande preparaten [39](#page=39). #### 1.2.4 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopie gebruikt elektronenbundels in plaats van licht, wat resulteert in een veel hogere resolutie, tot op atomair niveau. De golflengte van elektronen is aanzienlijk kleiner dan die van licht [39](#page=39). * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** Een elektronenbundel wordt door een ultradun preparaat gestuurd, en het beeld wordt gevormd door de verstrooide elektronen. De resolutie kan 1 nm bedragen. TEM is geschikt voor het bestuderen van de interne structuren van objecten zoals weefsels, cellen en virussen [40](#page=40). * **Fixatie en Kleuring voor TEM:** Biologisch materiaal heeft van zichzelf weinig contrast in TEM. Verbetering wordt bereikt met verbindingen van zware metalen (osmiumtetroxide, uranylacetaat, loodcitraat) die elektronen weerkaatsen. Ultradunne secties (50-100 nm) zijn vereist [40](#page=40). * **Speciale EM technieken voor TEM:** * **Negatieve kleuring:** Het monster wordt geïncubeerd met een zwaar metaal, waardoor het monster wit verschijnt tegen een zwarte achtergrond [40](#page=40). * **Shadowing (rotary shadowing):** Het preparaat wordt onder een schuine hoek bestoven met metaal (bijv. platina, goud) om structuren te visualiseren [40](#page=40). * **Scanning-elektronenmicroscopie (SEM):** Een elektronenbundel wordt over het oppervlak van het preparaat gescand. Het beeld wordt gevormd door gereflecteerde en secundaire elektronen. SEM is geschikt voor het in beeld brengen van het oppervlak van weefsels en materialen. Het preparaat moet geleidend gemaakt worden, vaak door coating met goud of goud/palladium [40](#page=40). * **Technische complicaties en interpretatie:** EM vereist hoog vacuüm, hoge spanning en specifieke elektromagnetische lenzen. Interpretatie kan complex zijn door verschillende doorsneden van structuren [40](#page=40). #### 1.2.5 Speciale EM-technieken * **Vries-breek (freeze-fracture) en Vries-ets (freeze-etching):** Gebruikt om membraanstructuren gedetailleerd te bestuderen [40](#page=40). * **Cryo-elektronen-tomografie:** Maakt 3D-reconstructies van objecten mogelijk uit een serie 2D-projecties [40](#page=40). * **SBF-SEM & FIB-SEM:** Serial Block Face Scanning Electron Microscopy en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy maken gebruik van ultramicrotomie of ionenlasers om materiaal weg te nemen, wat 3D-reconstructies van dikkere monsters mogelijk maakt [40](#page=40). ### 1.3 Celkweek en monsterpreparatie voor analyse Celkweek is een basis voor veel microscopische technieken, met name voor het bestuderen van levende cellen. De preparatie van specimens is cruciaal voor kwalitatief hoogwaardige beelden [41](#page=41). #### 1.3.1 Detectie van specifieke eiwitten met behulp van TEM De detectie van specifieke eiwitten binnen cellen kan met TEM worden uitgevoerd, bijvoorbeeld door gebruik te maken van antilichamen die specifiek binden aan doelwiteiwitten en vervolgens gekoppeld zijn aan een marker die zichtbaar is onder de microscoop [41](#page=41). #### 1.3.2 Analyse van grotere volumes met SBF-SEM en FIB-SEM Voor de analyse van grotere cellulaire volumes zijn SBF-SEM en FIB-SEM geavanceerde technieken. Beide technieken maken gebruik van de in-situ verwijdering van dunne lagen van een preparaat binnen de vacuümkamer van een SEM [41](#page=41). * **Serial Block-Face SEM (SBF-SEM):** Materiaal wordt verwijderd met een diamantmes. Na laagverwijdering wordt het oppervlak gescand, en dit proces herhaalt zich, resulterend in opeenvolgende beelden voor een 3D-reconstructie [42](#page=42). * **Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM):** Gebruikt een focused ion beam (FIB) om materiaal weg te etsen. Dit iteratieve proces maakt 3D-reconstructies van grote volumes op hoge resolutie mogelijk en is nuttig voor het prepareren van specifieke gebieden [42](#page=42). Deze technieken zijn essentieel voor het bestuderen van de driedimensionale architectuur van cellen en weefsels op een niveau dat met conventionele microscopie niet haalbaar is [42](#page=42). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Term | Definitie | | Celcultivering | Het proces waarbij cellen uit een orgaan of tumor in vitro worden gekweekt, wat onderzoek vereenvoudigt en specifieke omstandigheden vereist voor celoverleving en groei. | | Medium (celcultuur) | Een voedingsoplossing die essentiële componenten bevat voor celgroei en -overleving, zoals isotonische zouten, een energiebron (glucose), aminozuren, vitamines en vaak serum. | | CO2-incubator | Een apparaat dat een gecontroleerde omgeving creëert voor celculturen, met nauwkeurige regulatie van temperatuur, luchtvochtigheid en CO2-concentratie, essentieel voor het handhaven van de pH van het medium. | | Laminaire flowbench | Een werkbank die een steriele werkomgeving creëert door continue luchtstroom met een HEPA-filter, om contaminatie van celculturen met micro-organismen te voorkomen. | | Cryopreservatie | Het proces van het invriezen van cellen bij extreem lage temperaturen, zoals in vloeibare stikstof (-196°C), voor langdurige opslag en latere reactivering. | | Zelfvernieuwing (stamcellen) | Het vermogen van stamcellen om zichzelf te delen en identieke kopieën van zichzelf te produceren, wat essentieel is voor het behoud van de stamcelpopulatie. | | Differentiatie (stamcellen) | Het proces waarbij stamcellen zich ontwikkelen tot gespecialiseerde celtypen die de organen en weefsels van een organisme vormen. | | Pluripotente stamcellen | Stamcellen die het vermogen hebben om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen van het lichaam. | | Multipotente stamcellen | Stamcellen met een beperkter differentiatiepotentieel dan pluripotente stamcellen, beperkt tot een specifieke cel- of weefsellijn. | | Immunohistochemische kleuring | Een techniek die gebruikmaakt van de specifieke binding tussen antigenen en antilichamen, waarbij het antilichaam is voorzien van een kleurstof, om bepaalde bestanddelen in cellen of weefsels aan te kleuren. | | CFTR-eiwit | Het Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator-eiwit, dat een cruciale rol speelt bij het transport van chloride-ionen over de celmembraan en waarvan defecten mucoviscidose veroorzaken. | | Subcellulaire mislocatie | Het fenomeen waarbij een eiwit niet correct wordt gevouwen en achterblijft in een bepaald celcompartiment (zoals het endoplasmatisch reticulum) in plaats van naar zijn beoogde locatie te worden getransporteerd. |