Biotechnology

# Climate change and its impact on flooding events Here is a detailed study guide section on climate change and its impact on flooding events: ## 1. Climate change and its impact on flooding events Global climate change is leading to more frequent and intense weather-related disasters, significantly impacting agricultural production and global ecosystems, with floods being a major concern. ### 1.1 The changing climate and disaster frequency The Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) reports highlight a discernible increase in the frequency and intensity of both warming and precipitation events. When compared to the pre-industrial era (1850-1900), global average temperatures have risen by approximately 1.3 degrees Celsius, with temperature extremes experiencing even greater increases. Precipitation events, crucial for understanding flood risks, have also intensified, with observed increases of seven to ten percent in wetness. Projections indicate that a four-degree Celsius global temperature rise would triple the likelihood of severe flood events and increase their intensity by approximately one-third. #### 1.1.1 Relationship between global temperature rise and disaster occurrence The occurrence of climate-related disasters, such as droughts, floods, and storms, is directly correlated with changes in global temperature. * Droughts can lead to a thirty-four percent loss in production. * Floods result in a twenty-one percent loss in production. * Storms cause nineteen percent loss in production. The incidence of floods and storms, in particular, shows a much steeper incline in frequency as global temperatures rise compared to other types of disasters. This escalation in extreme weather events has profound implications for agricultural productivity and global food security. > **Tip:** Understand the concept of moving averages when analyzing temporal data of disaster occurrences, as it helps to smooth out short-term fluctuations and reveal underlying cyclical patterns and long-term trends. ### 1.2 Regional variations and extreme precipitation events The impact of climate change on flood frequency is not uniform globally. While some regions are projected to experience increased flooding, others may face greater drought conditions. Europe, for example, is experiencing a dual threat, with some areas facing increased drought and others more frequent floods. These regional impacts are influenced by microclimates, which play a significant role in how different areas respond to global climate shifts. Latin America, East Asia (particularly India and Southeast Asia), and Sub-Saharan Africa are identified as regions particularly vulnerable to increased flood events. These areas are experiencing heavy precipitation events, defined as more than 100 millimeters of rain per 24-hour period. > **Example:** A notable event occurred in Turis-Valencia in October 2024, where the region experienced 185 millimeters of rain in just one hour, illustrating the extreme intensity of some precipitation events. In Southeast Asian regions, rainfall rates can even exceed 200 millimeters per hour. Similarly, a storm in Belgium in 2021 saw some areas receive over 100 millimeters of rain in a short period, leading to widespread flooding. ### 1.3 Impacts of flooding on agriculture and ecosystems Flooding events have significant and devastating impacts on both natural and agricultural ecosystems. The primary consequences include crop losses and substantial economic costs due to water saturation. As global population growth necessitates increased agricultural production, land use intensification, unfortunately, often leads to more extensive flooding. This creates a critical challenge: meeting food demands while mitigating the environmental consequences of expanded agricultural areas. The loss of agricultural productivity extends beyond staple crops, affecting the availability of essential micronutrients. Studies subjecting crops to elevated carbon dioxide levels (approaching 600 parts per million) have shown significant reductions, at least thirty to forty percent, in certain vitamins and minerals, especially B vitamins. ### 1.4 Plant adaptations to flooding stress Plants have evolved various adaptive strategies to cope with flooding, which can manifest as waterlogging (affecting only roots) or submergence (involving aerial parts). These strategies can be categorized into morphological, biochemical, and molecular responses. #### 1.4.1 Morphological and anatomical adaptations * **Aerenchyma formation:** This involves the creation of air-filled channels within plant tissues, particularly in the cortical region of roots. These channels facilitate gas diffusion, allowing oxygen to reach submerged or waterlogged tissues. * **Pneumatophores:** These are specialized roots that grow upwards out of the water or mud to access atmospheric oxygen. They exhibit negative gravitropism, contrasting with the typical positive gravitropism of roots. * **Lenticels:** These are small pores or openings in the periderm (bark) of stems that allow for improved gas exchange with the atmosphere. * **Adventitious roots (AR):** In response to ethylene signaling, plants can form adventitious roots on their stems. The emergence of these roots involves programmed cell death (PCD) of overlying epidermal tissues, enabling the roots to pierce through. This process can be driven by mechanical pressure exerted by the growing AR primordia. * **Hypertrophic growth:** This refers to the lateral expansion of plant organs, particularly stems, which can be induced by ethylene accumulation under flooding conditions. * **Leaf morphology changes:** In some species, such as deepwater rice, leaf sheaths become longer relative to the leaf blade, and leaves may adopt an upright position (hyponastic growth) to improve gas exchange. #### 1.4.2 Metabolic and physiological adaptations Flooding leads to a significant change in the concentration of key gases, including oxygen ($O_2$), carbon dioxide ($CO_2$), ethylene ($C_2H_4$), and nitric oxide (NO). The reduced solubility and diffusion rate of gases in aqueous environments exacerbate oxygen deprivation. * **Energy crisis and carbohydrate starvation:** During submergence, plants face an "energy crisis" due to limited oxygen for aerobic respiration. This leads to carbohydrate starvation. * **Anaerobic respiration and fermentation:** Plants can switch to anaerobic respiration and fermentation pathways to regenerate $NAD^+$ and produce ATP. However, this process yields significantly less ATP (around 2 ATP molecules per glucose molecule) compared to aerobic respiration (approximately 32 ATP molecules). Common end products include ethanol, lactate, and alanine. * **Metabolic shifts for ATP production:** Plants may stimulate the breakdown of sucrose via sucrose synthase and increase amylase activity to break down starch. The resulting glucose-6-phosphate feeds into glycolysis, enabling limited ATP production. * **$NAD^+$ regeneration:** Fermentation pathways are crucial for regenerating $NAD^+$ from NADH, which is essential for sustaining glycolysis. * **Metabolic channeling (e.g., Alanine and GABA shunts):** The pyruvate produced during glycolysis can be converted to alanine, or enter the ethanol fermentation pathway. The alanine shunt, involving the conversion of glutamate to 2-oxoglutarate, can lead to increased succinate levels, which can then be used for oxidative phosphorylation to produce additional ATP and conserve the limited oxygen. The GABA shunt, involving the conversion of glutamate to GABA by glutamate decarboxylase (GAD), consumes protons, helping to stabilize intracellular pH which can drop during fermentation. #### 1.4.3 Hormonal regulation and signaling * **Ethylene ($C_2H_4$):** Ethylene plays a central role in mediating many flooding responses. Its accumulation is influenced by both increased biosynthesis and reduced diffusion/biosynthesis rates due to lower oxygen availability. Ethylene is involved in promoting adventitious root formation, hypertrophic growth, and shoot elongation. * **Abscisic acid (ABA) and Gibberellins (GA):** The balance between ABA and GA is crucial. Under flooding, ethylene can indirectly lead to a decrease in ABA levels (through downregulation of NCED and upregulation of ABA degradation) and an increase in GA levels. GA is a key hormone promoting shoot elongation. * **Nitric oxide (NO):** NO can act as a systemic signaling molecule in response to hypoxia, originating from the root transition zone. It can catalyze the upregulation of hypoxia-responsive genes and contribute to hypoxic acclimation. * **Reactive Oxygen Species (ROS):** ROS are generated during flooding, particularly through the activation of NADPH oxidases (RBOH). While ROS can contribute to programmed cell death in some contexts (e.g., enabling adventitious root emergence), they also play signaling roles and can accumulate, leading to oxidative stress upon desubmergence. #### 1.4.4 Molecular mechanisms: transcription factors and signaling pathways * **Group VII Ethylene Response Factors (ERFs):** These transcription factors are critical sensors of low oxygen conditions. In *Arabidopsis thaliana*, this group includes HRE1, HRE2, RAP2.2, RAP2.3, and RAP2.12. In rice, SUB1A, SUB1B, SUB1C, SK1, and SK2 are key members. * **N-end Rule Pathway (NERP):** This pathway regulates the stability of Group VII ERFs. Under normoxic conditions, the N-terminus of these proteins is modified, leading to their ubiquization and degradation by the proteasome. Under hypoxia, this modification is inhibited, allowing the ERFs to accumulate and bind to hypoxia-responsive elements (HREs) in the promoters of target genes. * **RAP2.12:** This ERF is a primary sensor of low oxygen in *Arabidopsis*. It can be sequestered by an ACBP (acyl-CoA-binding protein) at the plasma membrane under normoxia, preventing its translocation to the nucleus. Upon hypoxia, it dissociates from ACBP and moves to the nucleus to activate gene expression. * **Anaerobiosis Responsive Elements (AREs):** These are cis-acting elements in the promoters of anaerobically induced genes (ANP genes). Redox-sensitive transcription factors interact with AREs to promote the transcription of ANPs involved in various metabolic adjustments. * **Phytohemoglobins:** These proteins act as oxygen sensors and are involved in NO scavenging and maintaining redox balance. #### 1.4.5 Low Oxygen Escape Strategy (LOES) vs. Low Oxygen Quiescence Strategy (LOQS) Plants exhibit different primary strategies for coping with flooding: * **Low Oxygen Escape Strategy (LOES):** This strategy aims to increase gas exchange with the atmosphere. It involves enhanced shoot elongation, hyponastic growth, formation of a gas film on leaves, and specialized root structures like aerenchyma and adventitious roots. Genes like SNORKEL (SK1/SK2) are involved in promoting elongation growth via GA signaling. This strategy is particularly prominent in deepwater rice cultivars that can grow rapidly to stay above the water surface. * **Low Oxygen Quiescence Strategy (LOQS):** This strategy focuses on growth constraint and minimizing energy expenditure. It involves reducing carbohydrate consumption, relying on glycolysis, starch catabolism, and ethanolic fermentation for ATP production, and synthesizing proteins involved in metabolite transport, ROS protection, and chaperone activity. Genes like SUB1A are associated with this strategy, dampening responsiveness to GA by upregulating negative regulators of GA signaling (e.g., SLR1 and SLRL1). SUB1A also plays a role in enhancing the upregulation of genes associated with ROS amelioration and dehydration tolerance upon re-oxygenation after flooding. > **Example:** Deepwater rice cultivars like 'Plai Ngam' employ LOES, capable of growing up to one centimeter per hour to escape rising water levels. Flood-tolerant low-land varieties, such as 'FR13A', utilize LOQS and can tolerate flooding for extended periods (over two weeks). #### 1.4.6 Post-submergence stress Following the receding of floodwaters (desubmergence), plants face new challenges: * **Oxidative stress:** Rapid re-exposure to oxygen can lead to the accumulation of Reactive Oxygen Species (ROS), causing cellular damage. * **Dehydration stress:** Reduced hydraulic conductivity developed during flooding can lead to a "pseudo-drought" condition in the shoot, even when roots are still in moist soil. SUB1A plays a critical role in helping plants employing LOQS to recover from these post-submergence stresses by upregulating genes involved in ROS detoxification and ABA-mediated dehydration responses. ### 1.5 Crop development and future directions The increasing frequency and intensity of flood events underscore the urgent need to develop crops with enhanced resilience to flooding. This involves exploring the genetic variation within model, crop, and wild species to identify traits that confer flood tolerance. Understanding the ecophysiological and agronomic relevance of these traits is crucial for breeding programs aimed at securing agricultural production in a changing climate. --- # Plant responses to flooding and hypoxia Plants have evolved sophisticated mechanisms to cope with the stressful conditions imposed by flooding and the resultant hypoxia (low oxygen). These responses encompass morphological, biochemical, and metabolic adaptations aimed at survival and restoration of homeostasis. ### 2.1 The increasing relevance of flooding and hypoxia Global climate change is leading to an increased frequency and intensity of extreme weather events, including floods. This poses a significant threat to both natural and agro-ecosystems, resulting in substantial crop losses and economic costs. As global temperatures rise, the likelihood and severity of flood events are projected to increase, necessitating the development of crops with enhanced resilience. ### 2.2 Understanding flooding and hypoxia Flooding can manifest in various forms, including waterlogging (affecting only the roots) and submergence (affecting aerial parts, either partially or completely). The duration, water level, and temperature of the flood are critical factors. Flooding dramatically alters the concentration of key gases, notably oxygen ($\text{O}_2$), carbon dioxide ($\text{CO}_2$), ethylene ($\text{C}_2\text{H}_4$), and nitric oxide (NO), which have profound signaling roles. During submergence, plants face an energy crisis due to carbohydrate starvation and compromised aerobic respiration. As water recedes, they can experience oxidative stress from reactive oxygen species (ROS) accumulation and dehydration stress due to reduced hydraulic conductivity. * **Normoxia:** Refers to normal or oxygen-repleted conditions, typically around $21\%$ $\text{O}_2$ at $20^\circ\text{C}$ and $1$ atm. * **Hypoxia:** Refers to oxygen levels below normoxia but not necessarily zero. * **Anoxia:** Refers to the complete absence of oxygen. Oxygen sensing in plants can occur through two main mechanisms: * **Indirect $\text{O}_2$ sensing:** Detecting changes in homeostasis as a consequence of oxygen deprivation, such as altered levels of adenylates ($\text{AMP/ADP/ATP}$), pyruvate, $\text{pH}$, calcium ($\text{Ca}^{2+}$), ROS, and reactive nitrogen species (RNS). * **Direct $\text{O}_2$ sensing:** Involves the molecular interaction of oxygen with a specific sensor protein or chemical compound, triggering a response cascade. ### 2.3 Morphological and anatomical adaptations Plants employ a range of structural modifications to survive flooding and hypoxia. These adaptations are often tissue-specific and can be influenced by hormones like ethylene. #### 2.3.1 Root and stem adaptations * **Aerenchyma formation:** This involves the creation of air channels within the cortical tissues of roots and stems. It is a programmed cell death process that forms interconnected air spaces, facilitating faster diffusion of gases to submerged tissues. * **Pneumatophores:** These are specialized aerial roots that exhibit negative gravitropism, growing upwards out of the water or mud to access atmospheric oxygen. * **Lenticels:** These are small pores on the surface of stems, particularly prominent in plants undergoing secondary growth, that allow for enhanced gas exchange. * **Hypodermal suberization (ROL barrier):** To prevent the leakage of oxygen from aerenchyma to the surrounding soil (Radial Oxygen Loss or ROL), a barrier of suberin is deposited in the hypodermis. Suberin is a waxy substance that repels water and gases, creating a barrier that extends to the root meristem to ensure oxygen supply for growth. * **Adventitious root formation:** Ethylene plays a crucial role in the emergence of adventitious root primordia from the pericycle. The growing root exerts significant force on overlying tissues, inducing pressure-driven programmed cell death (PCD) in the epidermal layer, allowing for emergence. Ethylene also promotes ROS formation, making the outer tissues more susceptible to PCD. #### 2.3.2 Shoot adaptations * **Hypertrophic growth:** This refers to the lateral expansion of stems and other aerial organs, often induced by ethylene accumulation. * **Hyponastic growth:** In response to submergence, some plants, particularly deep-water rice, exhibit hyponastic growth where leaves are held upright, facilitating gas exchange. * **Leaf morphology changes:** Adaptations can include longer leaf sheaths relative to leaf blades, which help in gas exchange. * **Formation of a gas film on leaves:** In some species, a gas film trapped on the leaf surface can aid in gas exchange. ### 2.4 Biochemical and metabolic adaptations Flooding and hypoxia trigger significant metabolic shifts to conserve energy and maintain essential cellular functions. #### 2.4.1 Energy crisis and ATP production Under low oxygen conditions, aerobic respiration is compromised, leading to an energy crisis and carbohydrate starvation. Plants must rely on alternative pathways to generate ATP. * **Fermentation:** This process regenerates $\text{NAD}^+$ and allows for continued glycolytic flux, albeit with significantly reduced ATP yield (e.g., $2$ ATP per glucose molecule via substrate-level phosphorylation, compared to $32$ ATP from complete aerobic respiration). Common fermentation end products include ethanol, lactate, and alanine. * **Metabolic shifts to save and produce ATP:** * **Sucrose breakdown:** While direct breakdown of sucrose by invertase may be inhibited, breakdown via sucrose synthase is stimulated. The resulting products feed into glycolysis. * **Starch catabolism:** In some species, amylase activity increases to break down starch, providing glucose for glycolysis. * **Fermentation pathways:** * **Ethanol fermentation:** Pyruvate is converted to ethanol. * **Lactic acid fermentation:** Pyruvate is converted to lactic acid. * **Alanine synthesis:** Pyruvate can be converted to alanine, coupled with the conversion of glutamate to 2-oxoglutamate. This shunt can increase succinate levels, which can enter oxidative phosphorylation to produce some ATP and conserve oxygen. * **GABA shunt:** Glutamate can be converted to gamma-aminobutyric acid (GABA) by glutamate decarboxylase (GAD). This reaction consumes protons, helping to stabilize $\text{pH}$ which can drop due to fermentation. #### 2.4.2 Anaerobic proteins (ANPs) Hypoxia and anoxia induce the expression of anaerobic proteins (ANPs). These proteins are primarily involved in the degradation of sugars and starch, glycolysis, and fermentation. The promoters of ANP genes contain anaerobiosis-responsive elements (AREs), which are thought to interact with redox-sensitive transcription factors that become activated under low oxygen conditions. #### 2.4.3 Phytohemoglobins These proteins act as oxygen sensors and are involved in nitric oxide (NO) scavenging, contributing to the maintenance of redox balance. ### 2.5 Hormonal signaling in flooding responses Several plant hormones play critical roles in mediating responses to flooding and hypoxia. #### 2.5.1 Ethylene ($\text{C}_2\text{H}_4$) Ethylene is a key signaling molecule in flooding responses. Its accumulation is partly due to reduced diffusion and biosynthesis. The conversion of its precursor, ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid), to ethylene by ACC oxidase requires oxygen, and this reaction is slowed under hypoxic conditions. * **Ethylene's roles:** * Induces adventitious root primordia formation. * Promotes ROS formation, contributing to programmed cell death for root emergence. * Induces hypertrophic growth in shoots. * Mediates hyponastic growth in some species. * Influences the expression of genes like *SNORKEL* (SK1/SK2) involved in the escape strategy. * In some contexts, ethylene can also dampen ethylene responses itself. #### 2.5.2 Abscisic acid (ABA) and Gibberellin (GA) The balance between ABA and GA is crucial for regulating shoot elongation during submergence. * **ABA:** Its biosynthesis is downregulated (e.g., via NCED repression), and its degradation is upregulated, leading to a rapid decrease in ABA levels upon submergence. * **GA:** Its levels increase, promoting cell elongation. Ethylene can influence this balance by blocking ABA action, thus allowing GA to rise. #### 2.5.3 Expansins These cell wall-loosening proteins are upregulated, particularly under GA regulation. GA stimulates expansin expression and proton pump activity, which acidifies the cell wall. This weakens the cell wall, allowing for turgor pressure-driven elongation. ### 2.6 Strategies for flood tolerance Plants have developed distinct strategies to survive flooding: #### 2.6.1 Low oxygen escape strategy (LOES) This strategy is employed by plants that need to rapidly grow out of flooded conditions. * **Key features:** Hyponastic growth, enhanced shoot elongation, formation of a gas film on leaves, aerenchyma formation, radial oxygen loss (ROL) barrier, and adventitious root formation. * **Hormonal regulation:** Mediated by ethylene, which promotes shoot elongation through increased GA signaling (e.g., via SK1/SK2 genes). #### 2.6.2 Low oxygen quiescence strategy (LOQS) This strategy focuses on minimizing energy expenditure to conserve resources during prolonged flooding. * **Key features:** Growth constraint, ATP production via glycolysis and fermentation, starch catabolism, and synthesis of protective proteins (chaperones, ROS scavengers). * **Hormonal regulation:** Ethylene can induce genes like *SUB1A* which dampens GA responsiveness by upregulating negative regulators of GA signaling (e.g., SLR1 and SLRL1, which are DELLA proteins). * **Post-submergence recovery:** *SUB1A* also enhances the upregulation of genes involved in ROS detoxification and ABA-mediated dehydration responses, facilitating better recovery after flooding. ### 2.7 Direct low oxygen sensing mechanisms Specific transcription factors, particularly Group VII Ethylene-Response Factors (ERFs), are central to direct oxygen sensing. * **Group VII ERFs:** In *Arabidopsis thaliana*, these include *HRE1*, *HRE2*, *RAP2.2*, *RAP2.3*, and *RAP2.12*. In rice, prominent examples are *SUB1A*, *SUB1B*, *SUB1C*, *SK1*, and *SK2*. * **N-end rule pathway (NERP):** These ERFs possess a conserved N-terminal sequence that targets them for degradation under normoxic conditions via the NERP. Under hypoxia, this degradation is inhibited, allowing the ERFs to translocate to the nucleus and activate hypoxia-responsive genes. * **Normoxic degradation:** Involves cleavage of the terminal methionine by methionine amino peptidases (MAPs), oxidation of the exposed cysteine to cysteine sulfonic acid by plant cysteine oxidases (PCOs), arginylation by arginine tRNA transferases (ATE1/2), and subsequent ubiquitination and proteasomal degradation. * **Hypoxic stabilization:** The oxidation step (by PCO) is inhibited in hypoxia, preventing the degradation cascade and allowing ERFs to accumulate. * **RAP2.12:** This ERF acts as a primary sensor of low oxygen in *Arabidopsis*. It can be sequestered by an acyl-CoA-binding protein (ACBP) at the plasma membrane under normoxia, protecting it from degradation. Upon hypoxia, it dissociates from ACBP and translocates to the nucleus. ### 2.8 Systemic hypoxia signaling Hypoxia can trigger systemic signaling pathways that coordinate responses throughout the plant. * **Nitric Oxide (NO):** In maize, NO generated in the root transition zone acts as a signaling molecule, upregulating hypoxia-responsive genes and contributing to hypoxic acclimation of the entire root. NO is produced as a byproduct of mitochondrial electron transport chain under low oxygen conditions and is a catalyst for the NERP. * **1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC):** The ethylene precursor ACC can act as a signaling molecule independently of ethylene. Its accumulation during flooding, due to insufficient oxygen for conversion to ethylene, suggests a role in systemic signaling from roots to shoots. * **Ethylene ($\text{C}_2\text{H}_4$):** While its production is hindered under hypoxia, accumulated ethylene can still play a role in systemic signaling. > **Tip:** Understanding the interplay between different hormones (ethylene, ABA, GA) and transcription factors (Group VII ERFs) is crucial for comprehending the complexity of plant responses to flooding and hypoxia. > > **Example:** The contrasting roles of *SNORKEL* (promoting escape via elongation) and *SUB1A* (promoting quiescence and recovery) in rice highlight the diverse strategies plants employ based on their genetic makeup and the environmental context. --- # Molecular mechanisms of low oxygen sensing and signaling This topic delves into how plants perceive and respond to low oxygen conditions (hypoxia), focusing on the intricate signaling pathways involving ethylene, reactive oxygen species (ROS), and specific transcription factors. ### 3.1 Sensing of low oxygen levels Plants employ both direct and indirect mechanisms to sense changes in oxygen concentration. #### 3.1.1 Indirect oxygen sensing Indirect sensing involves detecting changes in cellular homeostasis that occur as a consequence of oxygen deprivation. These changes include: * Alterations in adenylate levels ($AMP/ADP/ATP$). * Changes in pyruvate concentration. * Shifts in cellular $pH$. * Fluctuations in intracellular $Ca^{2+}$. * Accumulation of reactive oxygen species ($ROS$) and reactive nitrogen species ($RNS$). #### 3.1.2 Direct oxygen sensing Direct sensing involves the direct molecular interaction of oxygen with specific sensor proteins or chemical compounds, which then triggers a signaling cascade. ### 3.2 Key signaling molecules and pathways #### 3.2.1 Ethylene Ethylene plays a crucial role in mediating plant responses to flooding and hypoxia. Its accumulation is influenced by several factors under low oxygen conditions: * **Reduced biosynthesis:** The final step in ethylene biosynthesis, catalyzed by ACC oxidase, requires oxygen. Under hypoxia, this reaction is significantly slowed, leading to lower ethylene production rates. * **Accumulation:** While production is reduced, ethylene can also accumulate due to reduced diffusion from tissues and its increased synthesis under certain conditions, particularly in deepwater rice. * **Signaling role:** Ethylene is a central signaling molecule that triggers various adaptive responses. For instance, it is involved in the formation of adventitious roots and hyponastic growth. It also plays a role in the regulation of submergence-induced shoot elongation. #### 3.2.2 Reactive Oxygen Species (ROS) ROS are key signaling molecules in plant responses to hypoxia, particularly under waterlogging and subsequent re-oxygenation. * **Ethylene-triggered ROS:** Ethylene can activate NADPH oxidases ($RBOH$), which convert oxygen to superoxide radicals ($O_2^{\ast-}$) and subsequently to hydrogen peroxide ($H_2O_2$). * **Pressure-driven ROS:** Mechanical stress, such as that exerted by emerging adventitious roots, can also induce ROS-dependent programmed cell death ($PCD$) in surrounding tissues, making them more amenable to penetration. * **Oxidative stress:** Upon desubmergence, plants experience oxidative stress due to the rapid re-exposure to oxygen, leading to ROS accumulation. #### 3.2.3 Ethylene-Response Factor (ERF) transcription factors ERFs are a large family of transcription factors that play critical roles in plant stress responses, including those to hypoxia. * **Group VII ERFs:** A specific subfamily of ERFs (Group VII) is directly involved in sensing and responding to low oxygen conditions. Key examples include $HRE1$ and $HRE2$ in *Arabidopsis thaliana* and $SUB1A$, $SUB1B$, $SUB1C$, $SK1$, and $SK2$ in rice. * **N-end rule pathway (NERP):** The N-terminal region of Group VII ERFs is crucial for their oxygen-dependent regulation. Under normoxia, a specific N-terminal sequence is targeted for degradation via the N-end rule pathway. This involves: 1. Cleavage of the terminal methionine by methionine amino peptidases ($MAPs$). 2. Oxidation of the exposed cysteine to cysteine sulfonic acid ($C^{\ast}$) by plant cysteine oxidases ($PCO$). This step is inhibited under hypoxia. 3. Addition of an arginine residue by arginyl-tRNA transferases ($ATE1/2$) to the oxidized cysteine. 4. Recognition of the arginylated protein by E3 ligases (e.g., $PRT6$), leading to polyubiquitination. 5. Degradation of the ubiquitinated ERF by the 26S proteasome. * **Hypoxia-induced stabilization:** Under hypoxia, the oxidation of cysteine to $C^{\ast}$ is inhibited, preventing the subsequent steps of the NERP. This leads to the stabilization of Group VII ERFs, allowing them to translocate to the nucleus and bind to hypoxia-responsive elements ($HREs$) in the promoters of target genes, thereby activating the transcription of hypoxia-responsive genes. * **Role in adaptive strategies:** * In deepwater rice, ethylene-induced ERFs like $SK1/2$ (SNORKEL) promote shoot elongation for escape from submergence by increasing gibberellin ($GA$) accumulation. * In submergence-tolerant rice, ethylene-induced $SUB1A$ dampens responsiveness to $GA$ by upregulating negative regulators of $GA$ signaling, such as $SLR1$ and $SLRL1$. $SUB1A$ also enhances the expression of genes involved in ROS detoxification and dehydration tolerance, aiding in recovery after submergence. * **RAP2.12:** This Group VII ERF in *Arabidopsis* is considered a primary sensor of low oxygen. It can be protected from degradation under normoxia by binding to an acyl-CoA-binding protein ($ACBP$) at the plasma membrane. Upon hypoxia, it dissociates from $ACBP$ and translocates to the nucleus. ### 3.3 Metabolic adjustments under low oxygen Plants undergo significant metabolic changes to conserve energy and produce ATP under hypoxic conditions. * **ATP conservation:** Reduced $ATP$ production due to inhibited photosynthesis and aerobic respiration necessitates strategies to minimize energy expenditure. * **Alternative metabolic pathways:** * **Glycolysis and fermentation:** Increased flux through glycolysis leads to pyruvate production. Pyruvate can then be converted to lactic acid, ethanol, or alanine. Ethanolic fermentation and alanine production are crucial for sustaining some energy generation, with $ATP$ production being significantly lower than in aerobic respiration (e.g., 2 $ATP$ molecules per glucose molecule compared to 32). * **Sucrose metabolism:** Instead of regular breakdown via invertase, sucrose is broken down via sucrose synthase, leading to products that feed into glycolysis. * **Starch catabolism:** Amylase activity increases in some species, breaking down starch into glucose, which then enters glycolysis. * **GABA shunt:** The conversion of glutamate to $GABA$ by glutamate decarboxylase ($GAD$) consumes protons, helping to stabilize intracellular $pH$ which can drop due to fermentation. This pathway also contributes to $ATP$ production and oxygen conservation. * **Anaerobic proteins (ANPs):** The expression of specific anaerobic proteins is induced under hypoxia and anoxia. These proteins are involved in sugar and starch degradation, glycolysis, and fermentation, as well as chaperone activity. Their promoters often contain anaerobiosis-responsive elements ($AREs$), which are targeted by redox-sensitive transcription factors. ### 3.4 Systemic hypoxia signaling Hypoxia can trigger signals that are transmitted throughout the plant, coordinating responses across different tissues. * **Nitric oxide (NO):** In *Zea mays*, $NO$ generated in the root apex, particularly in the transition zone, acts as a systemic signal. $NO$ can be a byproduct of mitochondrial electron transport under hypoxia and is a catalyst for the upregulation of hypoxia-responsive genes through the $NERP$. * **1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC):** The precursor to ethylene, $ACC$, can act as a signaling molecule itself, independently of ethylene. Under flooding conditions where ethylene biosynthesis is impaired, significant accumulation of $ACC$ occurs. As $ACC$ is soluble and readily transported, it can act as a systemic signal from waterlogged roots to shoots. ### 3.5 Morphological and physiological adaptations Plants have developed various morphological and physiological adaptations to survive flooding and hypoxia. #### 3.5.1 Root adaptations * **Aerenchyma formation:** The development of air channels within the root cortex facilitates gas diffusion to oxygen-deprived tissues. * **Pneumatophores:** Specialized roots that grow upwards out of the water or mud to access atmospheric oxygen. * **Lenticels:** Small pores on stems and roots that improve gas exchange. * **Radial oxygen loss (ROL) barrier:** The deposition of suberin in the hypodermis and outer root tissues acts as a barrier to prevent the loss of oxygen from aerenchyma to the surrounding soil, ensuring it reaches the root tip. * **Adventitious root (AR) formation:** Ethylene-mediated induction of adventitious root primordia, coupled with pressure-driven programmed cell death in overlying tissues, allows for the emergence of new roots to access oxygen. #### 3.5.2 Shoot adaptations * **Hyponastic growth:** Upward orientation of leaves, which can increase gas exchange with the atmosphere. * **Enhanced shoot elongation (Low Oxygen Escape Strategy - LOES):** Rapid elongation of shoots, often mediated by hormones like ethylene and gibberellins, allows plants to reach the water surface and access atmospheric oxygen. This is observed in deepwater rice varieties. * **Growth constraint (Low Oxygen Quiescence Strategy - LOQS):** In flood-tolerant varieties, growth is suppressed to minimize energy expenditure. This strategy relies on metabolic adjustments and the expression of tolerance genes. * **Hypertrophic growth:** Lateral expansion of stems and shoots. * **Epinasty:** Downward bending of leaves due to ethylene-induced asymmetrical growth. * **Stomatal closure:** While potentially leading to reduced photosynthesis, it can help conserve water and reduce oxygen demand. * **Leaf senescence and abscission:** In severe cases, the plant may shed leaves to reduce metabolic load. #### 3.5.3 Hydraulic alterations * **Reduced hydraulic conductance:** Flooding can impair water transport through the xylem due to factors like xylem embolism and impaired aquaporin function, leading to a state of "pseudo-drought" in the shoot. * **Post-submergence stress:** Upon re-oxygenation, plants face oxidative stress and dehydration stress due to reduced hydraulic conductivity. $SUB1A$ plays a role in enhancing recovery from these stresses. > **Tip:** Understanding the distinction between LOES and LOQS in rice is crucial for grasping the different adaptive strategies plants employ under flooding. LOES prioritizes escape through rapid growth, while LOQS focuses on survival through energy conservation and stress tolerance. > **Example:** Deepwater rice cultivars that exhibit rapid shoot elongation (LOES) to escape submergence often show increased ethylene production and elevated gibberellin levels, facilitated by specific ERF transcription factors like SNORKEL. In contrast, submergence-tolerant varieties using LOQS, like those expressing SUB1A, prioritize suppressing growth and enhancing stress resilience mechanisms. --- # Flood adaptation strategies in rice cultivars Rice cultivars employ distinct strategies to survive submergence, primarily categorized as the 'low oxygen escape strategy' (LOES) and the 'low oxygen quiescence strategy' (LOQS), each with a unique genetic basis and physiological response to low oxygen conditions. ### 4.1 The challenge of flooding for plants Flooding events, characterized by waterlogging (roots submerged) or complete submergence (aerial parts submerged), are increasing in frequency and intensity due to global climate change. These conditions drastically alter the soil gas composition, leading to decreased oxygen ($O_2$), increased carbon dioxide ($CO_2$), and altered levels of ethylene ($C_2H_4$) and nitric oxide (NO). The reduced solubility and diffusion rate of gases in water, approximately ten thousand times lower than in air, are primary issues. Flooding impacts plants by: * Compromising aerobic respiration, leading to an energy crisis and carbohydrate starvation. * Reducing photosynthesis due to limited $CO_2$ availability. * Disrupting aerobic respiration, which impairs the plant's ability to maintain energy levels. * Inducing oxidative stress and dehydration stress upon water recession. ### 4.2 General plant responses to hypoxia and submergence Plants have evolved adaptive responses to low oxygen (hypoxia) and submergence, involving both morphological and biochemical changes in roots and shoots. #### 4.2.1 Morphological and anatomical adaptations * **Aerenchyma formation:** Development of air channels within cortical tissues, facilitating gas diffusion to submerged tissues. This often involves programmed cell death (PCD) in cortical parenchyma. * **Pneumatophores:** Specialized aerial roots that grow upwards from the mud to reach atmospheric oxygen, exhibiting negative gravitropism. * **Lenticels:** Small pores on stems that enhance gas exchange. * **Adventitious root (AR) formation:** Roots that develop from non-root organs, such as stems. Ethylene plays a crucial role in the emergence of ARs through the cortex and overlying epidermal layers via a process involving pressure-driven PCD. * **Hypertrophic growth:** Lateral expansion of organs, often induced by ethylene. * **Hyponastic growth:** Upright orientation of leaves, contrasting with epinasty (downward bending) which occurs due to ethylene accumulation and asymmetrical growth. #### 4.2.2 Biochemical and metabolic adaptations * **Anaerobic respiration and fermentation:** When aerobic respiration is compromised, plants shift to glycolysis and fermentation to regenerate $NAD^+$ and produce limited ATP. This yields end products such as ethanol, lactate, and alanine. Substrate-level phosphorylation produces significantly less ATP per glucose molecule (typically 2 ATP) compared to aerobic respiration (32 ATP). * **Metabolic flux adjustments:** Under hypoxia, glucose breakdown through sucrose synthase is stimulated, feeding into glycolysis. Starch catabolism via amylase also increases to provide glucose. * **GABA shunt:** The conversion of glutamate to $\gamma$-aminobutyric acid (GABA) by glutamate decarboxylase (GAD) consumes protons, helping to stabilize intracellular pH, which tends to decrease due to fermentation. This pathway also contributes to oxygen conservation and ATP production. * **Anaerobic proteins (ANPs):** Induced under hypoxia/anoxia, these proteins are involved in sugar and starch degradation, glycolysis, and fermentation, alongside chaperones. Their transcription is regulated by anaerobiosis-responsive elements (AREs) in their promoters, often involving redox-sensitive transcription factors. * **Phytohemoglobins:** Act as oxygen sensors, scavenge nitric oxide (NO), and help maintain redox balance. #### 4.2.3 Signaling pathways * **Ethylene ($C_2H_4$) signaling:** Ethylene accumulation is a key response to flooding. Its biosynthesis can be affected by reduced oxygen availability, particularly the final ACC oxidase step. Ethylene triggers various adaptive responses, including adventitious root formation, hypertrophic growth, and hyponasty. * **Reactive oxygen species (ROS):** ROS play a dual role, being involved in signaling pathways that promote adaptation (e.g., triggering PCD for organ emergence) but also contributing to oxidative stress upon re-oxygenation. * **Nitric oxide (NO):** Involved in systemic hypoxia signaling, NO can be generated in roots and catalyze the upregulation of hypoxia-responsive genes and NERP (N-end rule pathway). * **1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC):** The precursor to ethylene, ACC can act as a signaling molecule independently of ethylene, transported from roots to shoots. ### 4.3 Ethylene-induced flooding adaptation strategies in rice Rice, particularly deepwater rice varieties, exhibits remarkable flood tolerance, allowing for the study of distinct adaptation strategies. These strategies are often associated with specific ethylene-induced responses. #### 4.3.1 Low oxygen escape strategy (LOES) LOES aims to increase gas exchange with the atmosphere by enhancing shoot elongation. This strategy is characteristic of deepwater rice cultivars that can survive prolonged submergence by rapidly growing upwards to reach the water surface. * **Mechanism:** * **Hyponastic growth and enhanced shoot elongation:** This is a primary response to escape submergence. * **Hormonal regulation:** * **Ethylene accumulation:** Increased ethylene levels, both newly synthesized and accumulated, promote shoot elongation. * **ABA and GA balance:** Ethylene acts by inhibiting abscisic acid (ABA) synthesis and degradation, leading to increased gibberellin (GA) levels. GA is a major hormone promoting elongation. * **Expansin regulation:** GA stimulates the expression of expansins, cell wall loosening proteins, which are crucial for cell expansion and elongation growth. * **SNORKEL (SK) genes:** These genes, belonging to Group VII Ethylene-Response Factors (ERFs), are upregulated by ethylene and are critical for promoting GA-mediated elongation growth, allowing rice to escape submergence. * **Trapped gas film:** Formation of a gas film on leaves can aid in gas exchange. * **Leaf morphology changes:** Development of longer leaf sheaths relative to leaf blades. * **Root adaptations:** Aerenchyma formation and the development of a barrier to radial oxygen loss (ROL barrier) in roots, along with adventitious root formation, further support survival. #### 4.3.2 Low oxygen quiescence strategy (LOQS) LOQS focuses on minimizing energy expenditure by constraining growth and relying on efficient ATP production through alternative metabolic pathways. This strategy is employed by flood-tolerant low-land rice varieties to survive flash floods or shorter periods of submergence. * **Mechanism:** * **Growth constraint:** Plants enter a resting state to conserve energy. * **Metabolic adjustments for ATP production:** * **Glycolysis and fermentation:** Efficient ATP production via substrate-level phosphorylation, including ethanolic fermentation. * **Starch catabolism:** Breakdown of stored starch to glucose, feeding into glycolysis. * **Protein synthesis:** Upregulation of proteins involved in metabolite transport, ROS protection (chaperones), and stress response. * **SUB1A gene:** This gene, also belonging to Group VII ERFs, is induced by ethylene. However, unlike SK genes, SUB1A dampens responsiveness to GA by upregulating genes like SLENDER RICE 1 (SLR1) and SLRL1, which are negative regulators of GA signaling (DELLA proteins). This inhibition of elongation prevents excessive energy expenditure. * **Post-submergence recovery:** SUB1A also enhances the upregulation of genes involved in ROS detoxification and ABA-mediated dehydration responses, facilitating better recovery after flooding recedes. ### 4.4 Genetic basis and direct low oxygen sensing Group VII ERF transcription factors (TFs) play a central role in sensing and responding to low oxygen conditions in both Arabidopsis and rice. * **Group VII ERFs:** In Arabidopsis, genes like HRE1, HRE2, RAP2.2, RAP2.3, and RAP2.12 are hypoxia-responsive. In rice, SUB1A, SUB1B, SUB1C, SK1, and SK2 are key members. * **N-end rule pathway (NERP):** These ERF proteins possess a characteristic conserved N-terminus containing methionine and cysteine. Under normoxia, this N-terminus undergoes oxygen-dependent post-translational modifications (PTMs) via NERP, leading to their degradation by the proteasome. * **Normoxic degradation:** Terminal methionine is cleaved by methionine amino peptidases (MAPs). The exposed cysteine is oxidized to cysteine sulfonic acid ($C^*$) by plant cysteine oxidase (PCO). An arginine residue is added by arginine tRNA transferases (ATE1/2), targeting the protein for ubiquitination and degradation by the 26S proteasome. * **Hypoxic stabilization:** Under hypoxia, the oxidation of cysteine is inhibited, preventing the formation of $C^*$. This stabilizes the ERF proteins, allowing them to translocate to the nucleus and bind to hypoxia-responsive elements (HRPEs) in the promoters of target genes, thereby activating hypoxia-responsive transcription. * **RAP2.12:** In Arabidopsis, RAP2.12 is considered a primary sensor of low oxygen. It can be protected from degradation under normoxia by binding to acyl-CoA binding protein (ACBP) at the plasma membrane, allowing for a rapid response upon hypoxia by dissociating and translocating to the nucleus. * **Functional significance:** Loss-of-function mutants for ERFVII in plants demonstrate their critical importance in waterlogging responses. Modifications to the N-terminus of RAP2.12 can reduce plant vigor and submergence tolerance, highlighting the significance of this regulatory mechanism. > **Tip:** Understanding the differential roles of SNORKEL (SK) genes versus SUB1A in regulating GA responses under ethylene signaling is crucial for comprehending the divergence between the escape and quiescence strategies in rice. > **Example:** Overexpression of SUB1A in submergence-sensitive rice cultivars has been shown to confer significant tolerance to prolonged submergence, demonstrating its critical role in the quiescence strategy and minimizing injury. --- ## Common mistakes to avoid - Review all topics thoroughly before exams - Pay attention to formulas and key definitions - Practice with examples provided in each section - Don't memorize without understanding the underlying concepts

| Term | Definition | |------|------------| | Climate Change | A long-term shift in global or regional climate patterns, primarily attributed to the increase in greenhouse gas concentrations in the atmosphere, leading to rising global temperatures and altered weather patterns. | | Flooding Events | An overflow of water that submerges land that is usually dry, characterized by increased frequency and intensity due to climate change, with significant impacts on agriculture and ecosystems. | | Extreme Weather Events | Weather phenomena that are at the extremes of the historical distribution, such as severe floods, droughts, storms, and heatwaves, which are becoming more frequent and intense with climate change. | | Global Temperature Increase | The observed rise in the average temperature of Earth's climate system, currently around 1.3°C above pre-industrial levels, leading to various climatic shifts and an increase in extreme weather. | | Agricultural Production Losses | Reductions in the yield and output of crops and livestock due to climate-related disasters such as floods, droughts, and storms, impacting global food security and economic stability. | | Waterlogging | A condition where soil remains saturated with water, preventing adequate aeration of plant roots and negatively affecting plant growth and survival by limiting oxygen availability. | | Submergence | A type of flooding where aerial plant parts, such as stems and leaves, are covered by water, leading to an "energy crisis" for the plant due to carbohydrate starvation and limited respiration. | | Hypoxia | A condition in which an organism, tissue, or cell experiences a lower level of oxygen than is required, often occurring in waterlogged or submerged plant tissues, leading to adaptive responses. | | Normoxia | The normal or oxygen-repleted condition, typically considered to be around 21% oxygen at standard temperature and atmospheric pressure, as opposed to hypoxic or anoxic conditions. | | Anaerobic Respiration | A metabolic process that produces ATP energy in the absence or near-absence of oxygen, often involving fermentation pathways that result in end products like ethanol or lactic acid. | | Fermentation | A metabolic process that converts sugar to acids, gases, or alcohol, occurring in yeast and bacteria, or in muscle cells during strenuous exercise. In plants, it's a key process under low oxygen. | | Ethylene | A plant hormone that plays a crucial role in various growth and developmental processes, including responses to environmental stresses like flooding, where its accumulation triggers adaptation strategies. | | ROS (Reactive Oxygen Species) | Chemically reactive molecules containing oxygen that can damage cells, but also act as signaling molecules in plants, especially in response to stress, including the oxidative stress that can occur after flooding. | | Acclimation | The physiological or behavioral adjustments made by an organism in response to a change in its environment, such as plants developing morphological and biochemical changes to tolerate flooding. | | Low Oxygen Escape Strategy (LOES) | A plant's adaptive response to low oxygen conditions, aiming to increase gas exchange with the atmosphere through mechanisms like shoot elongation and hyponastic growth. | | Low Oxygen Quiescence Strategy (LOQS) | A plant's adaptive strategy to survive low oxygen conditions by minimizing energy expenditure, involving growth constraint and efficient ATP production through anaerobic pathways. | | Aerenchyma | Specialized tissues in some plants that contain large intercellular air spaces, facilitating gas exchange and oxygen transport to submerged or waterlogged roots. | | Pneumatophores | Modified root structures that grow upward from the soil or water surface, typically in mangrove trees, to facilitate gas exchange for submerged root systems. | | Lenticels | Small pores on the surface of stems and roots of woody plants that allow for gas exchange between the internal tissues and the atmosphere. | | Adventitious Roots | Roots that arise from any plant organ other than the primary root, often forming in response to environmental cues like flooding as an escape strategy. | | Programmed Cell Death (PCD) | An evolutionarily conserved process of cell suicide, which plays vital roles in development and in removing damaged or infected cells, and can be involved in plant adaptation to stress. | | Hydraulic Conductance | A measure of the ease with which water can move through a plant's vascular system (xylem) from the soil to the leaves, which can be impaired by flooding leading to a "pseudo-drought" effect. | | ABA (Abscisic Acid) | A plant hormone involved in various physiological processes, including stress responses such as stomatal closure and growth inhibition, and its levels are often affected by flooding. | | GA (Gibberellin) | A class of plant hormones that promote stem elongation and seed germination, and are involved in plant responses to flooding, particularly in escape strategies. | | Expansins | Proteins that play a critical role in cell wall loosening, enabling cell expansion and growth. Their activity is often regulated by plant hormones like GA during plant responses to submergence. | | ERFs (Ethylene-Response Factors) | A large family of transcription factors that play key roles in plant responses to various stresses, including hypoxia and flooding, often by regulating the expression of specific genes. | | N-end Rule Pathway (NERP) | A protein degradation pathway that targets proteins for degradation based on the identity of their amino-terminal residue, and plays a role in regulating plant responses to low oxygen conditions. | | Phytohemoglobins | Proteins found in some plants that are involved in oxygen sensing, scavenging of nitric oxide, and maintaining redox balance, particularly important in adapting to hypoxic environments. | | Systemic Hypoxia Signaling | The communication of low oxygen stress throughout a plant, involving signaling molecules like nitric oxide (NO) and ethylene precursors, to coordinate adaptive responses in different tissues. | | ACC (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid) | The immediate precursor to ethylene in plant biosynthesis, which can accumulate significantly under flooding conditions and act as a signaling molecule itself. | | Global Climate Change | Long-term shifts in temperatures and weather patterns, driven by human activities, leading to an increased frequency and intensity of extreme events like floods, impacting global agriculture. | | IPCC (Intergovernmental Panel on Climate Change) | An international body that assesses the science related to climate change, providing comprehensive reports on its causes, impacts, and future risks, including changes in precipitation and temperature extremes. | | :-------------------------------------------- | :----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- | | Anoxia | A complete absence of oxygen in an environment, representing the most extreme low-oxygen condition that plants may encounter, posing significant challenges to cellular respiration and energy production. | | Flooding | An environmental condition characterized by the inundation of plant tissues with water, leading to reduced oxygen availability and impacting various physiological processes. | | Heavy Precipitation | Rainfall exceeding 100 mm within a 24-hour period, often leading to flash floods and significant disruption to natural and agricultural ecosystems. | | Hyponastic Growth | A type of plant growth where leaves or organs are oriented upwards or outwards, often observed as a response to flooding to maximize light capture and gas exchange with the atmosphere. | | Hypertrophic Growth | Increased lateral expansion of plant organs, such as stems, often induced by ethylene under flooding conditions, contributing to buoyancy and improved access to atmospheric oxygen. | | Indirect O2 Sensing | A mechanism where plants detect a change in cellular homeostasis, such as altered levels of adenylates or pH, as a consequence of oxygen deprivation, rather than directly sensing oxygen molecules. | | Metabolic Acclimation | The physiological and biochemical adjustments plants make to survive low oxygen stress, including changes in glycolysis, fermentation pathways, and substrate utilization to optimize ATP production. | | Quiescence | A resting state adopted by plants under stress, characterized by reduced growth and metabolic activity to conserve energy and survive unfavorable conditions like flooding. | | Radial Oxygen Loss (ROL) Barrier | A physiological adaptation in plant roots, often involving suberin deposition, that prevents the leakage of oxygen from the root tissues into the surrounding soil, thus conserving oxygen internally. | | Reactive Oxygen Species (ROS) | Chemically reactive molecules containing oxygen, such as superoxide radicals and hydrogen peroxide, which can be signaling molecules or cause oxidative stress and cellular damage under certain conditions. | | Acclimation to hypoxia | The process involving morphological and biochemical changes in plant organs and tissues that enable adaptation to conditions of low oxygen availability. | | Aerobic respiration | A metabolic process that requires oxygen to generate energy (ATP) from glucose and other organic molecules, yielding carbon dioxide and water as byproducts. | | Alanine | An amino acid produced as an end-product of fermentation, which plays a role in sustaining some level of energy production in plants under low oxygen stress. | | Anaerobic proteins (ANPs) | Proteins synthesized in response to hypoxia or anoxia, primarily involved in the degradation of sugars and starches, glycolysis, and fermentation pathways, often including chaperones. | | Adventitious roots (AR) | Roots that develop from any plant organ other than the primary root, often formed on stems or leaves, and are involved in flooding adaptation strategies. | | Ascorbate | A molecule that can act as an antioxidant and is involved in the mitigation of oxidative stress. | | ATP (Adenosine Triphosphate) | The primary energy currency of cells, produced through cellular respiration and fermentation. | | ATP synthesis | The process by which ATP is generated, including substrate-level phosphorylation during glycolysis and fermentation, and oxidative phosphorylation in mitochondria. | | ABA-8'ox | An enzyme involved in the degradation of Abscisic Acid (ABA). | | ABCG exporting long chain FA | A type of ATP-binding cassette transporter involved in exporting long-chain fatty acids, which are components of suberin. | | ACC oxidase | An enzyme that catalyzes the conversion of ACC to ethylene, requiring oxygen for its activity. | | ACC synthase | Enzymes involved in the biosynthesis of ACC. | | Cell death | The termination of a cell's life, which can be programmed and play a role in plant development and adaptation, such as in adventitious root emergence. | | Chlorophyll fluorescence | A technique used to assess photosynthetic efficiency and plant stress levels by measuring the light re-emitted by chlorophyll molecules. | | CO2 (Carbon Dioxide) | A gas involved in photosynthesis and respiration, whose concentration can change during flooding. | | Cortical parenchyma | The tissue layer in plant roots located between the epidermis and the endodermis, which can be modified to form aerenchyma. | | Cytosolic pH | The acidity or alkalinity of the cytoplasm within a cell, which can be affected by metabolic processes like fermentation. | | Deepwater rice | A specialized cultivar of rice adapted to survive prolonged and deep flooding conditions by employing escape strategies. | | DELLA proteins | A family of proteins that act as negative regulators of Gibberellic Acid (GA) signaling, thereby inhibiting elongation growth. | | Desubmergence | The process of a plant emerging from a submerged state, which can lead to oxidative stress and dehydration. | | Direct O2 sensing | The mechanism by which a cell directly perceives oxygen levels through molecular interaction with a sensor protein or chemical compound, initiating a response cascade. | | Drought | A prolonged period of abnormally low rainfall, leading to a shortage of water. | | Elongation growth | The process by which plant organs increase in length, often regulated by hormones like Gibberellic Acid (GA) and influenced by ethylene. | | Embrio | Embryo. | | Embryonic | Relating to or forming an embryo. | | Endogenous | Originating from within the plant. | | ERF (Ethylene-Response Factor) | A family of transcription factors that play crucial roles in plant development and stress responses, particularly in mediating ethylene signaling and hypoxia responses. | | Ethane | A simple alkane gas, sometimes found in plant tissues. | | Ethanol | An alcohol produced as an end-product of alcoholic fermentation. | | Ethylene (C2H4) | A plant hormone involved in various developmental processes and stress responses, including flooding adaptation and shoot elongation. | | Ethylene biosynthesis | The metabolic pathway by which ethylene is produced in plants, involving precursors like ACC. | | Ethylene signaling | The complex network of molecular events initiated by ethylene perception, leading to downstream physiological responses. | | Exosmosis | The movement of water out of a cell or tissue. | | Gas film | A layer of gas that can form on plant surfaces, such as leaves, during submergence to facilitate gas exchange. | | GABA (Gamma-aminobutyric acid) | An amino acid that can be produced via the GABA shunt, contributing to pH stabilization and stress response. | | GA (Gibberellic Acid) | A plant hormone promoting cell elongation and growth, often interacting with ABA in a balanced manner. | | GA signaling | The cascade of molecular events triggered by Gibberellic Acid perception, leading to specific cellular responses. | | GAD (Glutamate decarboxylase) | An enzyme that catalyzes the conversion of glutamate to GABA, consuming protons and helping to stabilize pH. | | Glc-6-P (Glucose-6-phosphate) | A key intermediate in glycolysis, formed from glucose. | | Glucose-UDP | A sugar nucleotide intermediate. | | Glutamate | An amino acid involved in various metabolic pathways, including the GABA shunt. | | Glycolysis | The initial metabolic pathway in carbohydrate breakdown, converting glucose into pyruvate and generating a small amount of ATP. | | Growth control | The regulation of plant development and increase in size, influenced by hormones and environmental factors. | | H2O2 (Hydrogen Peroxide) | A reactive oxygen species (ROS) that can be produced during oxidative stress and plays signaling roles. | | Heterotrophic | Organisms that cannot produce their own food and rely on consuming other organisms. | | Hijau | Green (Indonesian/Malay, not relevant to the academic context). | | Hormonal interactions | The complex interplay between different plant hormones in regulating physiological processes. | | HRPE (Hypoxia Responsive Element) | A DNA sequence found in the promoter region of hypoxia-responsive genes that binds to transcription factors to regulate gene expression. | | Hydraulic conductivity | The ability of a plant's vascular system (xylem) to conduct water. | | Hydrolic conductance | Synonym for hydraulic conductivity. | | Hypobiosis | A state of reduced metabolic activity, similar to quiescence. | | Ion transport | The movement of ions across cell membranes, crucial for maintaining cell potential and turgor. | | Invertase | An enzyme that breaks down sucrose into glucose and fructose. | | IPPC (Intergovernmental Panel on Climate Change) | An international body that assesses the science related to climate change. | | Lactate | Lactic acid, an end-product of lactic acid fermentation. | | Ligand | A molecule that binds to a receptor or sensor protein. | | Low oxygen sensing | The physiological process by which plants detect and respond to reduced oxygen concentrations. | | L-threonine | An amino acid. | | MAPs (Methionine amino peptidases) | Enzymes that cleave methionine from the N-terminus of proteins, a step in the N-end rule pathway. | | Metabolic changes | Alterations in the biochemical reactions occurring within cells. | | Metabolic flux | The rate at which metabolites are processed through a metabolic pathway. | | Metabolite | A substance formed or used during metabolism. | | Metallothioneins | Proteins that bind to metal ions and play a role in mitigating oxidative stress by scavenging reactive oxygen species. | | Microclimates | Localized variations in climate conditions. | | Mitochondria | Organelles within eukaryotic cells responsible for cellular respiration and ATP production. | | Mitochondrial ETC (Electron Transport Chain) | A series of protein complexes in the inner mitochondrial membrane that generate ATP through oxidative phosphorylation. | | Morphological adaptations | Changes in the physical structure or form of plant organs to suit environmental conditions. | | NAD+ | Nicotinamide adenine dinucleotide, a coenzyme involved in redox reactions, regenerated during fermentation. | | NERP (N-end rule pathway) | A protein degradation pathway regulated by the N-terminal amino acid of a protein, significantly influenced by oxygen levels and involved in hypoxia responses. | | Nitrite | A polyatomic ion with the formula NO2−. | | Nitrogen (N) | An essential nutrient for plant growth. | | NO (Nitric Oxide) | A signaling molecule in plants, involved in systemic hypoxia signaling and regulating gene expression. | | NO scavenging | The process of removing or neutralizing nitric oxide. | | Non-circular TCA flux | A modified flux through the tricarboxylic acid cycle, where intermediates may not fully cycle back. | | O2•- (Superoxide radical) | A highly reactive oxygen species formed during oxidative stress. | | O2 saturation | The degree to which oxygen is dissolved in a liquid. | | Osmosis | The movement of water across a semipermeable membrane from an area of high water concentration to an area of low water concentration. | | Oxidative stress | Cellular damage caused by an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and the body's ability to detoxify them. | | Oxygen conservation | Mechanisms employed by plants to reduce oxygen consumption or utilize available oxygen more efficiently. | | Oxygen deprivation | A reduction in the availability of oxygen. | | Oxygen levels | The concentration of oxygen in a given environment. | | Oxygen sensing | The process by which organisms detect and respond to changes in oxygen concentration. | | Oxygen signaling | The molecular pathways activated by oxygen levels, influencing cellular processes. | | Partial submergence | A type of flooding where only a portion of the plant's aerial parts are submerged. | | Pentuple mutant | A mutant organism lacking five specific genes. | | Plant biotechnology | The application of biological principles and techniques to modify plants for specific purposes. | | Plant development | The series of changes a plant undergoes from germination to maturity. | | Plant physiology | The study of the functions and mechanisms of living plants. | | Plant responses | The physiological and biochemical reactions of plants to environmental stimuli. | | Plant vigor | The overall health and strength of a plant. | | PM (Plasma Membrane) | The outer boundary of the cytoplasm of a cell, enclosing the protoplasm. | | Post-translational modification (PTM) | Chemical modifications that occur to a protein after its synthesis, affecting its function and stability. | | Precursor | A substance from which another substance is formed. | | Pressure-driven PCD | Programmed cell death that is induced by mechanical pressure. | | Primary sensor | The initial molecule or receptor that detects a stimulus. | | Production loss | Reduction in yield or output, particularly in agriculture. | | Protective mechanisms | Biological strategies employed to defend against harm or damage. | | Protein synthesis | The process by which cells build proteins. | | Proteasome (26S proteasome) | A large protein complex in cells that degrades unwanted or damaged proteins. | | Pseudodrought | A state of water deficit in shoots that mimics drought conditions, occurring even when roots are in waterlogged soil. | | Pyruvate | A key intermediate molecule in glycolysis and fermentation. | | Pyruvate decarboxylase (PDC) | An enzyme involved in alcoholic fermentation. | | RCN1 | A gene (reduced culm number) related to ABCG transporters involved in suberin formation. | | Reactive nitrogen species (RNS) | Molecules derived from nitrogen, such as nitric oxide and peroxynitrite, that can cause cellular damage. | | Receding water | The withdrawal of floodwaters. | | Redox balance | The equilibrium between the processes of oxidation and reduction within a cell. | | Related to AP2 (RAP) | A classification for certain transcription factors related to the APETALA2 (AP2) family. | | Relative leaf water content | A measure of the amount of water in a leaf relative to its full hydration capacity. | | Respiratory burst NADPH-oxidase homolog (RBOH) | Enzymes that produce reactive oxygen species (ROS) through the oxidation of NADPH. | | Rice (Oryza sativa) | A staple food crop widely cultivated globally, serving as a model for flood tolerance studies. | | Root apex | The tip of a plant root, containing the root meristem. | | Root meristem | The actively dividing tissue at the tip of a plant root responsible for root growth. | | Root-shoot communication | The signaling and transport of substances between the root and shoot systems of a plant. | | ROS accumulation | The buildup of reactive oxygen species in cells. | | ROS-dependent PCD | Programmed cell death that is triggered or mediated by reactive oxygen species. | | ROS detoxification | The process of neutralizing or removing reactive oxygen species from cells. | | ROL barrier (Radial Oxygen Loss barrier) | A layer, typically composed of suberin, deposited in plant roots to prevent the leakage of oxygen to the surrounding soil. | | Rumex sp. | A genus of plants in the family Polygonaceae. | | Rumex acetosa | Sorrel, a species within the Rumex genus. | | Salinity | The salt content of soil or water. | | Seasonal events | Events that occur at specific times of the year, such as monsoons. | | Secondary growth | The increase in girth of plant stems and roots due to cell division in the vascular cambium and cork cambium. | | Shoot elongation | The increase in length of the aerial parts of a plant. | | Shoot morphology | The form and structure of a plant's shoots. | | Shunts | Metabolic pathways that deviate from the main metabolic route. | | Signaling cascades | A series of biochemical reactions in response to a stimulus that amplify and transmit the signal. | | SLR1 (SLENDER RICE 1) | A negative regulator of GA signaling in rice, belonging to the DELLA protein family. | | SLR1/SLRL1 | Genes encoding DELLA proteins that inhibit GA responses. | | SNORKEL (SK1/SK2) | Genes in rice that promote shoot elongation and escape from submergence by increasing GA accumulation. | | Solanum lycopersicum | The scientific name for the tomato plant. | | Sorrel | Common name for plants in the Rumex genus. | | Spatial signal | A signal that indicates location or position. | | Starch catabolism | The breakdown of starch into smaller sugars. | | Stomatal closure | The closing of stomata, pores on the leaf surface that regulate gas exchange, often triggered by water deficit or stress. | | Suberization | The deposition of suberin, a waxy substance, in cell walls, contributing to barrier formation. | | Substrate-level phosphorylation | The direct transfer of a phosphate group from a substrate molecule to ADP to form ATP, occurring during glycolysis and fermentation. | | Sucrose synthase | An enzyme that breaks down sucrose, providing substrates for glycolysis. | | Sugars | Simple carbohydrates that serve as energy sources. | | Sulfonic acid | An organic compound containing a C-SO3H group. | | Superoxide dismutase (SOD) | An enzyme that catalyzes the conversion of superoxide radicals into oxygen and hydrogen peroxide, playing a crucial role in antioxidant defense. | | Systemic signaling | Signaling that occurs throughout the entire plant, coordinating responses across different tissues and organs. | | T carbohydrates | Carbohydrates. | | Terminal electron acceptor | The final molecule in an electron transport chain that accepts electrons. | | Tissue specificity | The characteristic localization of a physiological process or response within particular plant tissues. | | Tomato | A common garden plant and its edible fruit. | | Transcription factor (TF) | A protein that binds to specific DNA sequences to control the rate of transcription of genetic information from DNA to messenger RNA. | | Transition zone | A region in the root between the root meristem and the elongation zone, involved in systemic signaling. | | Translocation | The movement of substances within a plant. | | Turgor pressure | The pressure exerted by the contents of a plant cell against its cell wall. | | Twinset | A hormonal balance where two hormones (e.g., GA and ABA) regulate each other. | | Ubi promotor | A promoter derived from the ubiquitin gene, commonly used for ubiquitous gene expression in plants. | | UDP (Uridine diphosphate) | A nucleotide that serves as a coenzyme in various metabolic pathways. | | UP-regulates | Increases the activity or expression of something. | | Water replacement | The process of refilling tissues or cells with water. | | Wild species | Species of plants that grow in natural environments without human cultivation. | | Xylem | The vascular tissue in plants that conducts water and dissolved nutrients from the roots to the rest of the plant. | | Xylem embolism | The formation of air bubbles within xylem vessels, which can block water transport. | | Zea mays | The scientific name for corn or maize. | | Ethylene-Response Factors (ERFs) | A large family of transcription factors that regulate gene expression in response to ethylene signaling. Certain ERFs, particularly Group VII ERFs, are critically involved in mediating plant responses to hypoxia and submergence, influencing strategies like elongation or quiescence. | | SUB1A | A key Group VII Ethylene-Response Factor (ERF) gene in rice that confers submergence tolerance. It plays a crucial role in the Low Oxygen Quiescence Strategy (LOQS) by dampening the plant's responsiveness to gibberellins (GAs) and enhancing tolerance to post-submergence stress. | | Gibberellin (GA) | A class of plant hormones that promote stem elongation and are crucial for growth and development. In flood adaptation, GA levels are often modulated; increased GA promotes elongation in escape strategies, while repression of GA is associated with quiescence strategies. | | Abscisic Acid (ABA) | A plant hormone involved in stress responses, including drought and osmotic stress. During submergence, ABA levels typically decrease in deepwater rice varieties employing escape strategies, while its role in quiescence strategies is linked to dehydration tolerance post-submergence. | | Nitric Oxide (NO) | A signaling molecule that can be generated during mitochondrial respiration under hypoxic conditions and plays a role in systemic hypoxia signaling, potentially by catalyzing the N-end rule pathway and upregulating hypoxia-responsive genes. | | 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) | The immediate precursor to ethylene in plant biosynthesis. Under flooding conditions, reduced oxygen can limit the conversion of ACC to ethylene, leading to ACC accumulation, which may also act as a signaling molecule itself. | | Dehydration Stress | A stress experienced by plants when they lose water faster than they can absorb it. In post-flooding scenarios, reduced hydraulic conductance can contribute to a form of dehydration stress even when roots are still wet. | | Lowland Rice | Rice cultivars typically grown in fields that can be intermittently flooded but are not adapted to deep or prolonged submergence. They exhibit varying degrees of flood tolerance, with some employing quiescence strategies. |

# Introductie tot immunologie en het immuunsysteem Immunologie bestudeert het immuunsysteem en hoe het het lichaam beschermt tegen ziekteverwekkers en andere schadelijke entiteiten. Het immuunsysteem omvat alle cellen en moleculen die een rol spelen in immuunreacties [10](#page=10) [21](#page=21) [9](#page=9). ## 1.1 Wat is immunologie? Immunologische biotechnologie richt zich op het omzetten van componenten van het immuunsysteem in een bruikbare vorm voor diverse toepassingen. Voorbeelden hiervan zijn diagnostische tests, zoals de 5-panel drug test, en preventieve methoden zoals vaccinatie. De geschiedenis van immunologie kent mijlpalen zoals de variolatie voor pokken, wat later evolueerde naar vaccinatie door Edward Jenner met het koepokkenvirus [10](#page=10) [11](#page=11) [14](#page=14) [15](#page=15) [19](#page=19). ## 1.2 Immuniteit en het immuunsysteem Immuniteit wordt gedefinieerd als resistentie tegen een infectieus antigeen. De immuunrespons is de gecoördineerde reactie van alle immuuncellen en moleculen tegen een dergelijk antigeen. Het immuunsysteem heeft meerdere functies: het bestrijden van schadelijke micro-organismen, het afweren van tumoren en het opruimen van oude, versleten cellen. Er is een noodzakelijke balans tussen beschermende immuniteit en immunopathologie, wat kan leiden tot aandoeningen zoals allergieën [21](#page=21) [24](#page=24). ## 1.3 Lijnen van verdediging Het immuunsysteem kent drie lijnen van verdediging [33](#page=33): ### 1.3.1 Eerste barrière tegen potentiële indringers Dit omvat fysieke/mechanische, biochemische en biologische barrières [25](#page=25). * **Fysieke/mechanische barrières:** Huid en slijmvliezen, ondersteund door trilharen, zuurtegraad, vetzuren, slijm, urinestroom en luchtstroom. De darmwand, met zijn mucosa, submucosa, spierlaag en serosa, vormt een belangrijk voorbeeld van een slijmvliesbarrière, waarbij tight junctions een cruciale rol spelen in de integriteit [27](#page=27) [28](#page=28) [30](#page=30). * **Biochemische barrières:** Lage pH in de maag, lysozym in tranen, en vetzuren op de huid [25](#page=25). * **Biologische barrières:** De microbiële flora van de darm en andere slijmvliesoppervlakken [25](#page=25). Aantasting van deze barrièrefunctie kan plaatsvinden door verstoring van de darmflora, ontstekingen van de darmwand, stress, gebruik van bepaalde geneesmiddelen of een tekort aan vitamine B12 [31](#page=31). ### 1.3.2 Eerste lijnsverdediging: aangeboren immuunsysteem (innate immuunsysteem) Dit systeem is aangeboren, komt snel tot stand en is niet-specifiek. Belangrijke componenten zijn [35](#page=35) [39](#page=39): * **Fagocytose:** Het proces waarbij pathogenen worden opgenomen en afgebroken door fagocyten zoals macrofagen (Ma), monocyten (Mo), granulocyten (Gr) en dendritische cellen (DC). Fagocytose wordt bevorderd door opsonisatie, waarbij micro-organismen worden bedekt met antilichamen en complementfactoren [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41) [42](#page=42) [92](#page=92). * **Eiwitten:** Antimicrobiële eiwitten zoals lactoferrine, defensines, collectines, interferonen en factoren van het complementsysteem [45](#page=45) [72](#page=72). * **Complementsysteem:** Een groep van ongeveer 20-30 plasma-eiwitten die in niet-actieve vorm circuleren en geactiveerd kunnen worden door pathogenen of door antilichamen. Het complementsysteem speelt een rol bij opsonisatie, lysis, ontsteking en B-cel activatie. Er zijn drie activeringsroutes: de klassieke route (indirect via antilichamen of CRP), de MBL-route (direct via mannosebindend lectine) en de alternatieve route (direct via factor B en D) [46](#page=46) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [79](#page=79) [80](#page=80) [82](#page=82) [84](#page=84). * **NK-cellen (Natural Killer cells):** Deze lymfocyten kunnen virus-geïnfecteerde cellen, intracellulaire bacteriën en tumorcellen aanvallen [47](#page=47) [98](#page=98). * **Interferonen (INF):** Cytokines die de virusreplicatie remmen en macrofagen en NK-cellen activeren [47](#page=47) [73](#page=73) [74](#page=74). Het doel van het aangeboren immuunsysteem is om infecties in toom te houden, maar voor volledige opruiming is verworven immuniteit nodig [48](#page=48). ### 1.3.3 Tweede lijnsverdediging: verworven immuunsysteem (adaptive immuunsysteem) Dit systeem is verworven, komt traag tot stand en is specifiek. Het wordt onderverdeeld in humorale en cellulaire immuniteit [35](#page=35) [49](#page=49). * **Humorale immuniteit:** Gemedieerd door B-lymfocyten, die antilichamen (Ab) produceren. Deze antilichamen kunnen extracellulaire pathogenen zoals bacteriën, virussen en wormen neutraliseren of opsoniseren. Effector B-cellen differentiëren tot plasmacellen die grote hoeveelheden antilichamen produceren [49](#page=49) [51](#page=51) [52](#page=52) [55](#page=55). * **Cellulaire immuniteit:** Gemedieerd door T-lymfocyten [49](#page=49). * **T-helpercellen (Th of CD4+):** Scheiden cytokines uit die macrofagen activeren en B-cellen stimuleren tot proliferatie en antilichaamproductie [55](#page=55). * **Cytotoxische T-cellen (Tc of CD8+):** Doden direct virus-geïnfecteerde cellen en andere intracellulaire pathogenen [55](#page=55). Het verworven immuunsysteem werkt nauw samen met het aangeboren immuunsysteem [36](#page=36). ## 1.4 Cellen van het immuunsysteem ### 1.4.1 Primaire lymfoïde organen Dit zijn de organen waar immuuncellen ontstaan en rijpen [61](#page=61). * **Beenmerg:** Plaats van vorming van B-lymfocyten [52](#page=52). * **Thymus:** Plaats van rijping van T-lymfocyten [52](#page=52) [58](#page=58). ### 1.4.2 Secundaire lymfoïde organen Dit zijn de organen waar immuuncellen pathogenen tegenkomen en waar immuunresponsen plaatsvinden. Antigeen kan via diverse routes getransporteerd worden naar deze organen, waarbij dendritische cellen een cruciale rol spelen als antigeenpresenterende cellen (APC) [62](#page=62) [63](#page=63) [64](#page=64). ## 1.5 Belangrijke celtypes in het immuunsysteem * **Fagocyten:** Monocyten (Mo), macrofagen (Ma), granulocyten (Gr) en dendritische cellen (DC) zijn betrokken bij fagocytose. Monocyten circuleren in het bloed en differentiëren in weefsels tot macrofagen of dendritische cellen. Granulocyten, waaronder neutrofielen, basofielen en eosinofielen, circuleren ook in het bloed [41](#page=41) [89](#page=89) [90](#page=90). * **NK-cellen:** Een type lymfocyt dat virus-geïnfecteerde cellen en tumorcellen kan aanvallen [98](#page=98). * **Dendritische cellen (DC):** Belangrijke antigeenpresenterende cellen die zowel tot het aangeboren als het verworven immuunsysteem behoren [100](#page=100). ## 1.6 MHC-moleculen Major Histocompatibility Complex (MHC)-moleculen spelen een sleutelrol bij antigeenpresentatie [56](#page=56). * **MHC-I:** Aanwezig op vrijwel alle lichaamscellen (behalve rode bloedcellen en geslachtscellen). Ze presenteren peptiden van cytoplasmatische eiwitten aan CD8+ T-cellen (Tc) [56](#page=56). * **MHC-II:** Voornamelijk aanwezig op fagocyten. Ze presenteren peptiden van extracellulaire eiwitten (opgenomen via endocytose) aan CD4+ T-helpercellen (Th) [56](#page=56). ## 1.7 Primaire immuunrespons en geheugen Het eerste contact met een antigeen leidt tot de activatie en proliferatie van een beperkt aantal lymfocyten met de juiste antigeenreceptor (klonale expansie). Een deel van deze cellen differentieert tot effectorcellen, terwijl een ander deel geheugencellen vormt. Het verworven immuunsysteem heeft een 'geheugen', wat resulteert in een snellere, heviger en hogere affiniteitsrespons bij herhaalde blootstelling aan hetzelfde antigeen [55](#page=55) [58](#page=58) [59](#page=59) [65](#page=65). ## 1.8 De keerzijde van een goed werkend immuunsysteem Een te zwak werkend immuunsysteem kan leiden tot immuundeficiënties (aangeboren of verworven), zoals bij HIV-infectie. Een te sterk werkend immuunsysteem kan allergieën en overgevoeligheidsreacties veroorzaken. Verkeerd werkende immuunsystemen kunnen leiden tot auto-immuunziekten. Ongecontroleerde werking kan resulteren in tumoren [66](#page=66). --- # Het verworven immuunsysteem: humorale en cellulaire respons Het verworven immuunsysteem, ook wel het adaptieve immuunsysteem genoemd, biedt een specifieke en trage maar langdurige verdediging tegen pathogenen, onderverdeeld in humorale (B-cel) en cellulaire (T-cel) respons [49](#page=49). ### 2.1 Algemene principes van het verworven immuunsysteem Het verworven immuunsysteem wordt gekenmerkt door specificiteit, waarbij lymfocyten (B- en T-cellen) op hun celoppervlak antigen-receptoren dragen. Deze cellen ondergaan proliferatie en differentiatie na herkenning van een specifiek antigeen. De reactie is traag in opbouw maar creëert immunologisch geheugen [49](#page=49) [50](#page=50) [58](#page=58). ### 2.2 Vergelijking humorale en cellulaire immuniteit | Kenmerk | Humorale immuniteit (B-cellen) | Cellulaire immuniteit (T-cellen) | | :---------------------- | :-------------------------------------------------------------- | :----------------------------------------------------------------- | | **Cellen** | B-cellen | T-cellen | | **Vorming** | Beenmerg | Thymus | | **Antigeenherkenning** | Direct | Indirect via MHC | | **Antigeenreceptor** | Membraan-antilichamen (Ig) | T-celreceptor (TCR) | | **Antigenen** | Zeer divers: eiwitten, vetten, koolhydraten | Peptide | | **Lokalisatie antigenen** | Extracellulair | Intracellulair | | **Effectormechanisme** | Uitgescheiden antilichamen (AL) | Effectorcellen die cytokines of perforines en granzymes uitscheiden | | **Micro-organismen** | Bacteriën, virussen, wormen etc. waarvoor AL gevormd worden | Virussen en andere intracellulaire pathogenen | | **Effect van AL** | MO geïnactiveerd of opgeruimd door fagocytose | Lymfocyten zelf verzorgen de afweer | #### 2.2.1 Rol van antilichamen (AL) in humorale immuniteit B-cellen produceren membraan-antilichamen (mIg), die antigenen herkennen. Na binding van een antigeen aan de mIg, in combinatie met hulp van T-helpercellen (Th), worden B-cellen geactiveerd tot plasmacellen die antilichamen secreteren. Antilichamen zijn de effectormoleculen van de humorale respons en hebben verschillende functies : * **Neutralisatie, agglutinatie, precipitatie en opsonisatie:** Deze mechanismen leiden tot inactivatie van het micro-organisme en bevorderen fagocytose . * **Activatie van het complementsysteem:** Dit kan indirect door antilichamen leiden tot lysis van de cel . ##### 2.2.1.1 Structuur van antilichamen Antilichamen (Ig) bestaan uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens. Ze hebben een Fab-deel (fragment antigen-binding) en een Fc-deel (fragment crystallizable) . * Het **Fab-deel** bindt het antigeen via een variabel deel . * Het **Fc-deel** is constant en verantwoordelijk voor de effectorfuncties . ##### 2.2.1.2 Klassen van antilichamen Er zijn vijf klassen immunoglobulinen (Ig) met verschillende eigenschappen en functies : * **IgM:** Ongeveer 10% van de antilichamen; vormt een pentameer met 10 bindingsplaatsen . * **IgA:** 15-20%; de meest voorkomende in speeksel, colostrum, melk en diverse secreties . * **IgG:** 70-75%; moeders IgG zorgt voor immuniteit bij neonaten in de eerste levensmaanden . * **IgE:** Zeer laag percentage; aanwezig op basofielen en mestcellen; mogelijk rol in immuniteit tegen wormen en geassocieerd met allergische ziekten . * **IgD:** Minder dan 1%; biologische functie grotendeels onbekend, rol in lymfocytdifferentiatie . ##### 2.2.1.3 Antigenen en epitopen Een antigeen is elke molecule die specifiek herkend wordt door het verworven immuunsysteem. Elk antilichaam bindt aan een specifiek deel van het antigeen, genaamd een epitoop . > **Tip:** Het verworven immuunsysteem kan tegen één bepaald pathogeen verschillende antilichamen ontwikkelen die elk een ander epitoop herkennen. ### 2.3 Cellulaire respons: T-helpercellen (Th) en Cytotoxische T-cellen (Tc) De cellulaire respons wordt primair uitgevoerd door T-lymfocyten, specifiek T-helpercellen (Th) en cytotoxische T-cellen (Tc) . #### 2.3.1 T-helpercellen (Th) Th-cellen worden beschouwd als de "dirigenten" van het immuunsysteem, voornamelijk door de productie van cytokines zoals interleukines (IL), TNF en IFN . * **Th1-cellen:** Belangrijk voor het aansturen van ontstekingsprocessen (via TNF-α) en het activeren van effector-Tc-cellen en macrofagen (via IFN-γ) . * **Th2-cellen:** Stimuleren B-cel differentiatie tot plasmacellen, wat leidt tot de productie van antilichamen. Ze spelen ook een rol bij allergische reacties . > **Tip:** De balans tussen Th1 en Th2 respons is cruciaal. Een verstoorde balans kan leiden tot auto-immuunziekten of allergieën. #### 2.3.2 Cytotoxische T-cellen (Tc) Tc-cellen (ook wel CD8+ T-cellen genoemd) zijn verantwoordelijk voor het direct doden van geïnfecteerde cellen. Dit gebeurt op twee manieren : 1. **Vrijgave van toxische enzymen:** Tc-cellen scheiden perforines en granzymes uit, die apoptose (geprogrammeerde celdood) in de doelwitcel induceren . 2. **Binding aan apoptose-inducerende receptoren:** Tc-cellen kunnen binden aan specifieke receptoren op de doelwitcel die apoptose signaleren . > **Let op:** De werking van Tc-cellen vertoont gelijkenissen met die van NK-cellen (Natural Killer cells), een onderdeel van het aangeboren immuunsysteem. #### 2.3.3 Regulerende T-cellen (Treg) Naast Th1 en Th2 spelen regulerende T-cellen (Treg) een belangrijke rol bij het handhaven van de balans en het beheersen van de duur en intensiteit van de immuunrespons . ### 2.4 Interactie tussen humorale en cellulaire immuniteit De meeste infecties activeren zowel een humorale als een cellulaire respons. Hoewel de humorale immuniteit voornamelijk antibacterieel wordt geacht en de cellulaire immuniteit antiviraal, is dit geen strikte scheiding. Antilichamen kunnen ook de verspreiding van virussen tegengaan, en sommige intracellulaire bacteriën kunnen alleen door een goed functionerend cellulair immuunsysteem worden opgeruimd. B-cellen hebben vaak ook helper T-cellen nodig voor volledige activatie . ### 2.5 MHC-klassen en antigeenpresentatie De presentatie van antigenen aan T-cellen gebeurt via MHC-moleculen [56](#page=56). * **MHC klasse I:** Aanwezig op vrijwel alle cellen (behalve rode bloedcellen en geslachtscellen). Ze presenteren peptiden afkomstig uit het cytoplasma (bijvoorbeeld virale eiwitten) aan CD8+ cytotoxische T-cellen [56](#page=56). * **MHC klasse II:** Worden enkel aangetroffen op specifieke fagocyten (antigeen-presenterende cellen, APC's). Ze presenteren peptiden die via endocytose zijn opgenomen (bijvoorbeeld bacteriële eiwitten) aan CD4+ T-helpercellen [56](#page=56). ### 2.6 Klonale expansie en geheugen Bij het eerste contact met een antigeen worden slechts enkele lymfocyten met de 'passende' antigeenreceptor geactiveerd. Deze cellen ondergaan klonale expansie (delen en prolifereren). Een deel van deze cellen differentieert tot effectorcellen (zoals plasmacellen of effector Tc-cellen), terwijl een ander deel behouden blijft als geheugencellen. Deze geheugencellen zorgen voor een snellere en sterkere respons bij een herinfectie [55](#page=55) [58](#page=58) [59](#page=59). #### 2.6.1 Diversiteit van T- en B-cellen Elke B-cel en elke T-cel is gespecialiseerd in de herkenning van slechts één specifiek antigeen, wat leidt tot een grote diversiteit aan T- en B-cellen in het lichaam. Er worden miljoenen rijpe T-cellen per dag aangemaakt. Het humorale immuunsysteem kan naar schatting minstens $10^8$ verschillende antilichamen produceren, en het cellulaire immuunsysteem eveneens $10^8$ verschillende T-celreceptoren [57](#page=57) [58](#page=58). --- # Sleutelprincipes van immuunrespons en immunopathologie Dit deel behandelt fundamentele principes van de immuunrespons, waaronder chemotaxis, specificiteit, geheugen, vaccinatie, en diverse vormen van immunopathologie zoals allergieën en auto-immuunziekten . ### 3.1 Chemotaxis en celmigratie Chemotaxis en celmigratie zijn essentiële processen tijdens ontsteking, waarbij immuuncellen naar de plaats van infectie worden geleid. Het proces omvat de volgende stappen : 1. **Verhoogde bloedtoevoer** naar het getroffen gebied . 2. **Verhoogde permeabiliteit van haarvaten**, waardoor grotere, oplosbare immuunmediatoren de plaats van infectie kunnen bereiken . 3. **Migratie van witte bloedcellen (leukocyten)** naar de plaats van infectie. Aanvankelijk migreren vooral neutrofielen, gevolgd door monocyten (die macrofagen worden) en lymfocyten . Het migratieproces verloopt via interacties tussen moleculen op het oppervlak van leukocyten en bijpassende moleculen op geactiveerd endotheel. Eenmaal in het weefsel migreren de cellen naar de ontstekingshaard door **chemotaxis**, een proces van chemische aantrekking. Een belangrijke chemische mediator die neutrofielen en monocyten aantrekt, is C5a, een fragment van een complementcomponent. Het gehele proces van het verlaten van cellen uit de bloedbaan wordt **diapedese** genoemd. De cyclus van ontsteking wordt samengevat als: ontsteking (cytokines) ➔ chemotaxis (chemokines) ➔ celmigratie . ### 3.2 Specificiteit en geheugen van de immuunrespons De immuunrespons is specifiek, wat betekent dat het gericht is tegen bepaalde antigenen, en kent een geheugencomponent. Het proces van immuunherkenning, activatie, proliferatie en differentiatie duurt enkele dagen, wat resulteert in een merkbare respons pas na een zekere 'lag' fase . ### 3.3 Vaccinatie Vaccinatie is gebaseerd op de principes van specificiteit en het geheugen van het verworven immuunsysteem. Het doel van vaccinatie is om pathogenen of toxines onschadelijk te maken, zonder hun antigeniciteit te verliezen. Een voorbeeld is de difteriebacterie die toxines produceert; deze toxines kunnen worden behandeld met formaline, waardoor hun toxiciteit verdwijnt maar de antigenen behouden blijven. Het resulterende, ontgiftigde toxine (toxoïd) wordt gebruikt als vaccin . Na vaccinatie treedt er een **primaire immuunrespons** op. Bij een volgende blootstelling aan hetzelfde antigeen vindt er een **secundaire immuunrespons** plaats, die sneller, effectiever en met een grotere affiniteit van antistoffen (AL) verloopt . ### 3.4 Immunopathologie Het immuunsysteem is niet feilloos en kan op verschillende manieren falen. Deze falen kunnen worden onderverdeeld in : * Te zwakke immuunrespons . * Te sterke immuunrespons (overgevoeligheid) . * Immuunreacties op het verkeerde moment of tegen het verkeerde (bv. transplantaties, bloedtransfusies) . * Ongecontroleerde immuunactiviteit (bv. bloedkankers) . #### 3.4.1 Allergie en overgevoeligheid Allergie en overgevoeligheid zijn vormen waarbij het immuunsysteem overmatig reageert op lichaamsvreemde stoffen (allergenen). Het document onderscheidt vier typen overgevoeligheidsreacties (details van punt 4.3.3.1 op pagina 53-59 zijn uitgesloten) : 1. **IgE-afhankelijke allergie (Type I)**: Na herhaaldelijk contact met het allergeen storten mestcellen hun inhoud uit. Voorbeelden hiervan zijn astma, constitutioneel eczeem en hooikoorts. Verschillende allergenen kunnen hetzelfde IgE-molecuul binden door gedeelde epitopen, wat leidt tot kruisreactiviteit (bv. appel, meloen, perzik, hazelnoot, berkenpollen delen epitopen). De **allergische mars** beschrijft een leeftijdsgerelateerd patroon in de expressie van allergieën en de betrokken organen, waarbij verschillende vormen zich achtereenvolgens of overlappend kunnen voordoen. De diagnose kan gesteld worden via anamnese, huidpriktest, bloedtest en provocatietesten (die gevaarlijk kunnen zijn). Deze tests tonen atopie aan, het vermogen om specifiek IgE te maken en een allergische reactie te geven, maar geven geen informatie over de manifestatie als ziekte . 2. **Cytotoxische reactie (Type II)**: Antigenen binden zich op eigen cellen of weefsels, waarna antistoffen (AL) niet alleen deze antigenen herkennen, maar ook een reactie tegen eigen cellen of weefsels induceren. Dit komt vaak voor bij geneesmiddelen . 3. **Ag-AL complexen neerslaan (Type III)**: Antigen-antilichaamcomplexen slaan neer, trekken neutrofielen aan en activeren het complementsysteem, wat weefselschade veroorzaakt. Een voorbeeld is Systemische Lupus Erythematosus . 4. **Vertraagd-type-overgevoeligheid van Th1 (Type IV)**: Effector Th1-cellen activeren lokaal macrofagen, wat leidt tot ontsteking. Een voorbeeld hiervan is een nikkelallergie . > **Tip:** Bij het bestuderen van immunopathologie is het belangrijk om onderscheid te maken tussen de verschillende typen overgevoeligheidsreacties en de specifieke mechanismen die aan de basis liggen van elk type. #### 3.4.2 Transplantatie en afstoting Bij transplantatie spelen transplantatieantigenen een cruciale rol. Deze omvatten componenten van het **Major Histocompatibility Complex (MHC)**, namelijk MHC-I (aanwezig op de meeste cellen) en MHC-II (aanwezig op antigeen-presenterende cellen - APCs). MHC-moleculen zijn sterk polymorf en verschillen daardoor aanzienlijk tussen individuen. Daarnaast spelen bloedgroepantigenen ook een rol, aangezien niet elk individu dezelfde bloedgroepantigenen bezit. Het immuunsysteem kan deze transplantatieantigenen herkennen als 'vreemd', wat leidt tot afstoting . --- # Immunologische biotechnologie en diagnostische technieken Dit deel introduceert de praktische toepassingen van immunologie in de biotechnologie, met een gedetailleerde beschrijving van diverse technieken voor antigeen-antilichaam interacties en hun toepassingen. ## 4.1 Immunologische technieken in de biotechnologie Immunologische technieken vinden brede toepassing in diverse sectoren zoals de geneeskunde, landbouw, forensisch onderzoek en de voedingsindustrie. Ze maken gebruik van de specifieke interactie tussen antigenen (Ag) en antistoffen (AL) om doelmoleculen te detecteren en te kwantificeren. Er bestaan meer dan honderd verschillende immunologische technieken, waarvan de meest significante en hun toepassingen in deze cursus worden besproken . ### 4.1.1 Basisprincipes van antigeen-antilichaam interacties De kern van immunologische technieken is het sleutel-slot-principe, waarbij de binding tussen een antigeen en een antilichaam plaatsvindt via niet-covalente bindingen. Deze bindingen omvatten waterstofbruggen, elektrostatische krachten, Van der Waals interacties en hydrofobe interacties. Deze interacties zijn reversibel . ### 4.1.2 Antiserum, serum en bloedplasma * **Antiserum**: Bloedserum van een mens of dier dat geïmmuniseerd is tegen bepaalde vergiften of ziekteverwekkers, en daardoor specifieke antistoffen bevat . * **Serum**: De waterige fractie van gestold bloed, vergelijkbaar met bloedplasma maar zonder de stollingseiwitten zoals fibrinogeen . * **Bloedplasma**: Het vloeibare deel van het bloed na verwijdering van bloedcellen en bloedplaatjes, dat wel nog stollingseiwitten bevat . ## 4.2 Productie van antilichamen ### 4.2.1 Productie van polyklonale antisera Polyklonale antisera worden geproduceerd in een dier na immunisatie met een lichaamsvreemde stof (antigeen). Elk B-lymfocyt produceert een specifiek antilichaam tegen een bepaald epitoop van het antigeen, wat resulteert in een mengsel van verschillende antistoffen in het bloed. Het isoleren van individuele antilichamen uit een polyklonaal antiserum is praktisch onmogelijk, en twee polyklonale antisera zijn nooit identiek . ### 4.2.2 Productie van monoklonale antisera (Hybridoma Technologie) Monoklonale antilichamen (mAL) worden geproduceerd door één specifieke B-lymfocyt. De **Hybridoma Technologie**, ontwikkeld door Köhler en Milstein in 1975, is de grondslag voor de productie van mAL . **Vergelijking polyklonale vs. monoklonale AL:** | Kenmerk | Polyklonale AL | Monoklonale AL | | :--------------- | :------------------------------------------------------ | :-------------------------------------------------- | | Productie | Uit serum van geïmmuniseerd dier | Geproduceerd door één specifieke B-lymfocyt | | Kosten | Goedkoop | Duur | | Samenstelling | Mengsel van AL (herkennen verschillende epitopen) | Slechts één soort AL (herkent één epitoop) | | Specificiteit | Minder specifiek | Zeer specifiek | | Consistentie | Variabel tussen batches | Consistent tussen batches | | [ ](#page=153) | | | . **Stappen van de Hybridoma Technologie:** 1. **Immunisatie**: Activatie van B-lymfocyten in een proefdier door injectie van het antigeen (Ag). Herhaalde toediening (boosting) kan de respons versterken . 2. **Isolatie van plasmacellen**: Na immunisatie wordt de milt geïsoleerd, omdat deze veel antilichaam-producerende plasmacellen bevat . 3. **Onsterfelijk maken van plasmacellen (Immortalisație)**: Plasmacellen worden gefuseerd met myelomacellen (kankercellen afkomstig van B-cel tumoren). Dit maakt de cellen onsterfelijk en in staat om buiten het lichaam te vermenigvuldigen . 4. **Selectieproces (HAT-selectie)**: Het mengsel na celfusie wordt gekweekt op een selectief **HAT-medium** (hypoxanthine, aminopterine, thymidine) (#page=158,159). Alleen hybridoma's overleven op dit medium omdat ze gebruik kunnen maken van zowel de de novo synthese pathway (via aminopterine blokkade) als de salvage pathway (via hypoxanthine en thymidine) voor nucleïnezuren, dankzij de eigenschappen van zowel de plasmacel als de myelomacel . > **Tip:** De HAT-selectie is cruciaal om ongefusionneerde myelomacellen en plasmacellen te elimineren. * Ongefusionneerde myelomacellen sterven af in het HAT-medium omdat ze de HGPRT-enzymdeficiëntie hebben en de salvage pathway niet kunnen gebruiken . * Ongefusionneerde plasmacellen hebben een beperkte levensduur in vitro. * Hybridoma's, die gefuseerde cellen zijn van een myelomacel en een plasmacel, zijn onsterfelijk en hebben de HGPRT van de plasmacel. 5. **Screening**: De overlevende hybridoma's worden verdeeld over kweekputjes, elk met één hybridoma. Vervolgens wordt getest welke cellen de gewenste antilichamen produceren, vaak met behulp van ELISA . 6. **Productie**: De geselecteerde hybridoma's kunnen de monoklonale antistoffen in vitro in kweekmedium produceren of in vivo in de buikholte van proefdieren . #### 4.2.2.1 Engineering van antilichamen Door aanpassingen in het DNA dat codeert voor antilichamen, kunnen deze worden gemodificeerd om hun affiniteit en specificiteit te verhogen, chimeriche of gehumaniseerde antilichamen te produceren, immunotoxinen te creëren of heteroconjugaten te vormen. Dit maakt ze geschikt voor gerichte therapieën en diagnostiek (#page=166,167,168) . * **Chimere AL**: Combinatie van muis Fab-deel en humaan Fc-deel . * **Gehumaniseerde AL**: Voornamelijk humaan met specifieke epitopen van muis AL . * **Immunotoxinen**: Tumor-specifieke mAL gekoppeld aan toxinen . * **Heteroconjugaten**: Bi-specifieke AL of hybriden van verschillende AL-moleculen . ## 4.3 Antigeen-antilichaam interacties: Affiniteit, Aviditeit en Specificiteit ### 4.3.1 Affiniteit Affiniteit is de bindingssterkte tussen een monovalent antigeen en één enkele bindingsplaats van een antilichaam. De dissociatieconstante ($K_d$) geeft de concentratie antigeen aan die nodig is om de helft van de bindingsplaatsen van antilichamen te bezetten. Een kleinere $K_d$ duidt op een hogere affiniteit. Affiniteitsmaturatie is een proces waarbij de gemiddelde affiniteit van antilichamen in een populatie stijgt na herhaald contact met het antigeen . ### 4.3.2 Aviditeit Aviditeit is de algehele bindingssterkte tussen een multivalent antigeen en een antilichaam. Natuurlijke antigenen hebben vaak meerdere epitopen, waardoor meerdere antilichamen kunnen binden. Een laag-affiniteits IgM-molecuul kan bijvoorbeeld zeer sterk binden aan een multivalent antigeen door de som van de vele interacties, wat leidt tot een hoge aviditeit . ### 4.3.3 Specificiteit en kruisreactiviteit * **Specificiteit**: De mogelijkheid van een antilichaam om te reageren met slechts één specifiek epitoop . * **Kruisreactiviteit**: De mogelijkheid van een antilichaam om te reageren met meerdere epitopen, wat vergelijkbaar is met kruisallergieën bij IgE . ## 4.4 Antigeen-antilichaam interacties: Diverse technieken Diverse technieken maken gebruik van Ag-AL interacties voor detectie en kwantificatie. ### 4.4.1 Precipitatiereacties: Immunodiffusietechnieken Deze technieken maken gebruik van de vorming van onoplosbare antigen-antilichaamcomplexen (precipitaten). Ze kunnen worden onderverdeeld in vloeibare en vaste fasesystemen . #### 4.4.1.1 Vloeibare fasesystemen * **Turbidimetrie**: Meet de troebelheid van oplossingen die ontstaan door de vorming van oplosbare immuuncomplexen, veroorzaakt door de toevoeging van antigeen aan een overmaat aan antiserum. De toename in absorptie over tijd is maatgevend voor de antigeenconcentratie . * **Nefelometrie**: Gebruikt laserlicht dat verstrooid wordt door immuuncomplexen in oplossing. De onbekende antigeenconcentratie wordt bepaald aan de hand van een standaardcurve . #### 4.4.1.2 Vaste fasesystemen Deze systemen maken gebruik van een gel (agar of agarose) als medium voor diffusie (#page=176,179). Agarose wordt over het algemeen als superieur beschouwd vanwege het ontbreken van negatieve ladingen . 1. **Passieve immunodiffusie**: * **Radiale immunodiffusie (RID - Mancini-techniek)**: Een kwantitatieve methode waarbij antigeen wordt geplaatst in een putje in een gel die antilichamen bevat. De grootte van de diffusiezone is evenredig met de antigeenconcentratie (#page=180,181) . * **Radiale tweezijdige immunodiffusie (Ouchterlony-techniek)**: Een kwalitatieve methode waarbij zowel antigeen als antilichaam diffunderen vanuit afzonderlijke putjes naar elkaar toe in een gel, wat resulteert in zichtbare precipitatielijnen (#page=180,182). Het proces omvat wassen om oplosbare eiwitten te verwijderen en eiwitkleuring . 2. **Immuno-elektroforese**: Scheidt antigenen op basis van hun lading via elektroforese voordat precipitatie plaatsvindt. * **Grabar & Williams methode**: Antigenen worden gescheiden door elektroforese, gevolgd door diffusie van antilichamen langs de elektroforesebaan (#page=184,185). De afstand van de precipitatielijnen is semi-kwantitatief . * **Countercurrent- & Rocket-elektroforese**: Deze technieken combineren elektroforese met diffusie om de gevoeligheid te verhogen (#page=184,188) . * **Countercurrent-elektroforese**: Antigeen en antilichaam migreren naar elkaar toe onder invloed van een elektrisch veld. Dit is een variant van de Ouchterlony-techniek met een 10-20 keer hogere gevoeligheid . * **Rocket-elektroforese**: Een variant van de Mancini-techniek waarbij antilichamen immobiel zijn en antigenen migreren door de gel, waardoor een 'rocket'-vormige precipitatielijn ontstaat . > **Tip:** Voor zowel countercurrent- als rocket-elektroforese is het cruciaal dat de ladingen van antigeen en antilichaam bij de gekozen pH voldoende verschillen. Indien nodig, kan een van de componenten chemisch gemodificeerd worden . ### 4.4.2 Agglutinatiereacties Agglutinatie treedt op wanneer antilichamen deeltjes (zoals rode bloedcellen of latexdeeltjes) aan elkaar koppelen, wat resulteert in zichtbare aggregaten. Deze reacties zijn gevoeliger dan precipitatietesten omdat de geaggregeerde deeltjes groter zijn en beter zichtbaar . * **Hemagglutinatie**: Gebruikt rode bloedcellen (RBC) als deeltjes. * **Actieve hemagglutinatietest**: Toont de aanwezigheid van antilichamen tegen RBC aan. Een titer kan worden bepaald, wat de concentratie antilichamen tegen een specifiek antigeen aangeeft (semi-kwantitatief) . * **Bloedgroepentest**: Gebruikt hemagglutinatie om bloedgroepen (AB0 en resus-systeem) te bepalen door de aanwezigheid van specifieke antigenen op RBC's te detecteren met specifieke antilichamen (#page=199,200). Natuurlijk voorkomende antistoffen (anti-A en anti-B) spelen hierbij een cruciale rol . * **Virus hemagglutinatie assay**: Maakt gebruik van de capaciteit van virussen (zoals influenza) om RBC's te aggregeren door binding aan sialoze receptoren op de RBC's . * **Latexagglutinatie**: Latexdeeltjes worden gecoat met antilichamen of antigenen en gemengd met het te onderzoeken monster. Een voorbeeld is de detectie van C-reactief proteïne (CRP). Dit is een indirecte agglutinatiereactie . ### 4.4.3 Complementfixatie Deze test wordt gebruikt om de aanwezigheid van lage concentraties van bepaalde antigenen of antilichamen te bepalen, waarbij complement wordt geabsorbeerd tijdens de Ag-AL reactie. Indicatorcellen (RBC gecoat met test-antilichamen) worden gebruikt om de aanwezigheid van complement te detecteren; als er complement gefixeerd is door de Ag-AL reactie, zullen de indicatorcellen niet lyseren. Een positieve test (met gezochte antilichamen) resulteert in lysering van de indicatorcellen, wat een negatief resultaat betekent voor complementfixatie . ### 4.4.4 Neutralisatietest Serum neutralisatietesten worden beschouwd als de gouden standaard voor de detectie en kwantificatie van antilichamen en kunnen informatie geven over recente infecties of de effectiviteit van vaccinatie . * **Plaque reductie neutralisatie test**: Wordt gebruikt om antilichamen tegen virussen te detecteren. Indien het serum antilichamen bevat, worden de virussen geneutraliseerd en zullen er geen of minder 'plaque units' ontstaan op de gastheercellen. Een negatieve test (geen antilichamen) resulteert in plaquevorming . ### 4.4.5 Immunoassays Immunoassays (IA) zijn methoden om de aanwezigheid of concentratie van een stof in een oplossing te bepalen, gebruikmakend van de hoge specificiteit van antilichamen. Ze bieden voordelen op het gebied van prijs, specificiteit, gevoeligheid en tijd . #### 4.4.5.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ELISA is een veelzijdige techniek die een enzym als marker gebruikt (#page=216,219). Diverse varianten bestaan : * **Directe ELISA**: Het antilichaam is direct gelabeld met een enzym . * **Gebruikte enzymen**: Mierikswortelperoxidase (HRP), alkalische fosfatase (AP), of biotine met streptavidine-enzymconjugaat (#page=219,220,221,222) . * **Chromogene substraten**: TMB voor HRP (resulteert in een blauwe kleur) en BCIP/NBT voor AP (resulteert in een donkerblauwe neerslag) . * **Indirecte ELISA**: Een gelabeld secundair antilichaam bindt aan het primaire antilichaam dat het antigeen bindt (#page=217,224,225) . * **Sandwich ELISA**: Het antigeen wordt ingeklemd tussen twee antilichamen (één op de drager, één gelabeld) (#page=226,227). Dit type assay biedt hoge gevoeligheid en specificiteit . * **Competitieve ELISA**: Gebruikt competitie tussen het te meten antigeen in het monster en een gelabeld antigeen voor binding aan een vast antilichaam, of vice versa (#page=228,230) . * **Niet-competitieve ELISA**: Het gemeten signaal is recht evenredig met de concentratie van het te bepalen antigeen . * **Competitieve ELISA**: Het gemeten signaal is omgekeerd evenredig met de concentratie van het te bepalen antigeen. Voorbeelden zijn de detectie van antilichamen in een monster door competitie met gelabelde antigenen op de plaat, of de detectie van antigenen door competitie met gelabelde antigenen op de plaat (#page=231,232) . * **ELISPOT**: Een zeer gevoelige immunoassay die de vrijlating van cytokines door cytokine-secreterende cellen meet. De detectie van een zichtbare 'spot' correspondeert met een individuele cel die een cytokine uitscheidt (#page=234,235) . * **In-cell ELISA**: Detecteert doelwiteiwitten binnen cellen na fixatie en lysering. Vergelijkbaar met indirecte ELISA . #### 4.4.5.2 Radio-Immuno Assay (RIA) RIA, ontwikkeld in de jaren '60, maakt gebruik van radioactieve isotopen (zoals $^{125}$I, $^3$H, of $^{14}$C) als marker en is zeer gevoelig (#page=215,238) . * **RAST (Radioallergosorbenttest)**: Een speciaal type RIA voor het opsporen van allergeen-specifieke IgE-antilichamen in voeding en huisstofmijt. De hoeveelheid radioactiviteit is recht evenredig met het IgE-gehalte in het bloed . #### 4.4.5.3 Immunoblotting & Immunoprecipitatie Deze technieken zijn voornamelijk kwalitatief of semi-kwantitatief en worden gebruikt om antigenen uit complexe mengsels op te sporen en te identificeren . * **Western Blotting**: Complexe mengsels worden eerst gescheiden in een analytische gel en vervolgens overgebracht naar een membraan (blot) voor identificatie met specifieke antisera (#page=242,243) . * **Immunoprecipitatie**: Een alternatief voor Western Blotting wanneer antigenen tijdens de scheidingsprocedure kunnen denatureren. Hierbij worden gelabelde antigenen gebonden met specifieke antilichamen, de complexen geprecipiteerd, en vervolgens de componenten gescheiden en geanalyseerd via een gel en autoradiogram . #### 4.4.5.4 Fluorescentietechnieken (Immunofluorescentie) Deze technieken gebruiken fluorescente moleculen, zoals fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), die licht absorberen bij een bepaalde golflengte en dit met een andere kleur uitzenden. Ze kunnen direct of indirect worden uitgevoerd . ### 4.5 Toepassingen van immunologische technieken Immunologische technieken hebben diverse praktische toepassingen: * **Detectie van genetisch gemodificeerde organismen (GGO)**: * **Roundup Ready Soja (RRS)**: Detectie van het CP4 EPSPS-eiwit met behulp van teststrips of ELISA (#page=247,251,254). De teststrips zijn kwalitatief en kunnen een transgenische sojaboon op 1000 detecteren. ELISA-tests bieden (semi-)kwantitatieve analyse . * **Bt-katoen**: Opsporen van cry-eiwitten (geproduceerd door Bacillus thuringiensis) in zaden met behulp van ELISA of teststrips . * **Zwangerschapstest**: Detectie van humaan chorion gonadotropine (hCG) in urine, mogelijk vanaf de eerste dag van een gemiste menstruatie (#page=256,257). Deze tests werken vaak volgens een sandwichprincipe met drie antilichamen . * **Drugstests**: * **Cannabis-drugstest**: Detectie van THC-metabolieten met een competitieve ELISA, vaak in teststrips (#page=259,260) . * **Multidrug speekseltest**: Detectie van verschillende drugs (cannabis, amfetaminen, heroïne, morfine, cocaïne) in speeksel, werkend op een vergelijkbare manier als zwangerschapstests . * **Glutentest**: Opsporen van gluten in voeding via een teststrip, gebaseerd op ELISA met G12 glutenantilichamen die het meest toxische fragment van gluten opsporen . * **Epitoop mapping**: Technieken om de specifieke bindingsplaatsen op antigenen te identificeren . * **Affiniteitschromatografie**: Een zuiveringstechniek die gebruik maakt van de specifieke binding tussen antigenen en antilichamen . --- # Vaccinatie: principes, types en toepassingen Vaccinatie is een cruciale preventieve medische ingreep die het immuunsysteem activeert om bescherming op te bouwen tegen specifieke ziekteverwekkers. ### 6.1 Inleiding en historiek De oorsprong van vaccinatie ligt in de praktijk van variolatie, waarbij korsten van pokkeninfecties werden gebruikt om immuniteit op te wekken, zij het met aanzienlijke risico's. Edward Jenner introduceerde in 1796 de term vaccinatie, gebaseerd op zijn observatie dat melkmeisjes die koepokken (veroorzaakt door het Vaccinia-virus) hadden doorgemaakt, immuun waren voor de menselijke pokken. Louis Pasteur ontwikkelde later verdere principes, waaronder het verminderen van de virulentie van ziekteverwekkers door verhitting, en bedacht de term 'vaccin' ter ere van Jenner. Het principe van immunologisch geheugen werd pas later begrepen . ### 6.2 Principes van vaccinatie Een vaccin moet veilig zijn, de juiste immuniteit opwekken en betaalbaar zijn. Er bestaan twee vormen van immunisatie: passieve en actieve immunisatie . #### 6.2.1 Passieve immunisatie Passieve immunisatie omvat de toediening van reeds gevormde antilichamen (AL) afkomstig van een ander individu of een andere soort. Het beschermende effect treedt onmiddellijk op, maar de toegediende AL worden vaak snel verbruikt. AL van vreemde afkomst kunnen gevaarlijk zijn. Voorbeelden zijn de behandeling na een beet van een giftige slang of bij besmetting met rabiës . #### 6.2.2 Actieve immunisatie Actieve immunisatie, oftewel vaccinatie in de gebruikelijke zin, is de toediening van antigenen (Ag) die het humorale en cellulaire immuunsysteem stimuleren. Dit proces versterkt de afweer en bouwt bescherming op, die tientallen jaren kan duren. Het is doorgaans goedkoop en wordt meestal tijdens de eerste levensjaren toegediend, met uitzonderingen zoals griepvaccins voor risicopatiënten of vaccins voor verre reizen . ### 6.3 Antigenen gebruikt in vaccins De effectiviteit van een vaccin hangt af van het aantal antigenen van de microbe dat in het vaccin behouden blijft. Levende organismen zijn meestal effectiever dan dode organismen. Een uitzondering hierop zijn toxinen, waarbij het vaccin gericht is op het toxine zelf . #### 6.3.1 Levende vaccins Levende vaccins maken gebruik van natuurlijke of verzwakte organismen . * **Levend natuurlijk vaccin:** Voorbeelden zijn vaccinia, maar deze worden niet standaard gebruikt . * **Levend verzwakt vaccin:** Hierbij wordt een humaan pathogeen zodanig verzwakt dat de virulentie afneemt, terwijl de antigenen behouden blijven. Voorbeelden zijn het BCG-vaccin (tegen *Mycobacterium tuberculosis*) en vaccins tegen polio, mazelen en rodehond. Deze vaccins ontstaan vaak door toeval gebaseerde mutaties . > **Tip:** Levend verzwakte vaccins zijn zeer effectief en kunnen zelfs kudde-immuniteit veroorzaken, waarbij ook ongevaccineerde individuen beschermd worden. De toekomst ligt echter bij plaatsgerichte mutaties met recombinante DNA-technologie . Het poliovaccin kent zowel een levende (Sabin) als een dode (Salk) variant; de Sabin-variant kan oraal worden toegediend, maar er is een risico op terugval naar virulentie . #### 6.3.2 Dode vaccins Dode vaccins bevatten intacte maar niet-levende organismen. Hoewel sommig effectief zijn, is hun effectiviteit soms matig of betwistbaar . #### 6.3.3 Geïnactiveerde toxinen (toxoïden) Dit zijn de meest succesvolle bacteriële vaccins en maken gebruik van geïnactiveerde toxinen. Een klassiek voorbeeld is het tetanusvaccin, dat beschermt tegen het toxine (tetanospasmine) geproduceerd door *Clostridium tetani* (#page=278, 279) . #### 6.3.4 Subcellulaire fragmenten en oppervlakte-antigenen (Subunitvaccins) Deze vaccins bevatten subcellulaire fragmenten of oppervlakte-antigenen van de microbe. Ze zijn veilig en effectief omdat ze enkel de essentiële antigenen bevatten en niet de gehele microbe, wat de kans op nevenwerkingen minimaliseert. Dit is vooral effectief tegen bacteriën met kapsels (polysacchariden) en virussen zoals Hepatitis-B, die hun oppervlaktemantel (HBs) overproduceren. Het identificeren van de juiste antigenen kan tijdrovend zijn, maar eenmaal ontdekt, kan een subunitvaccin snel geproduceerd worden. Vaccins tegen Hepatitis B en HPV zijn hier goede voorbeelden van (#page=283, 284) . #### 6.3.5 Verdere ontwikkeling van gentherapie in vaccins Genklonering wordt ingezet om vaccins te ontwikkelen waarbij het gen voor een antigeen wordt ingebracht in een drager, die vervolgens *in situ* antigenen produceert. Dit kan via : * **Replicerende of niet-replicerende virussen als vector:** Zoals vaccinia, mazelen of adenovirussen . * **Verzwakte bacteriën als vector:** Hoewel minder gebruikt . * **DNA-vaccins:** Intramusculaire injectie van DNA gekoppeld aan een promotor in een plasmide . * **RNA-vaccins:** Rechtstreekse inbreng van RNA via vetdruppeltjes, dat wordt vertaald naar antigenen . * **Virus-like particle (VLP) vaccins:** Injectie van de eiwitmantel van een virus zonder het genetisch materiaal . #### 6.3.6 Anti-idiotype vaccins Deze categorie vaccins wordt niet nader uitgewerkt in de documentatie, maar er wordt verwezen naar een website die acht verschillende vaccin-types, toegepast op het coronavirus, bespreekt . ### 6.4 Effectiviteit van vaccins De effectiviteit van vaccins wordt bepaald door: 1. **Juiste soort immuniteit induceren:** Antilichaam-gemedieerde immuniteit voor toxinen en extracellulaire pathogenen, en celgemedieerde immuniteit voor intracellulaire pathogenen . 2. **Stabiliteit tijdens opslag:** Vooral cruciaal voor levende vaccins die een koude keten vereisen . 3. **Voldoende immunogeniciteit:** Dode vaccins vereisen vaak adjuvanten om de immunogeniciteit te verhogen, zoals aluminiumzouten (bv. Al(OH)3) (#page=289, 290). Levende (verzwakte) vaccins zijn over het algemeen effectiever dan dode . #### 6.4.1 Adjuvantia Adjuvantia, zoals aluminiumzouten, verhogen de antilichaamproductie aanzienlijk wanneer ze worden toegevoegd aan antigenen. Ze kunnen echter ontstekingen veroorzaken en de celgemedieerde respons is vaak lager. De ontwikkeling van nieuwe adjuvantia die mucosal toediening mogelijk maken en compatibel zijn met DNA- en kanker-vaccins is een uitdaging . ### 6.5 Vaccinveiligheid Vaccins worden onderworpen aan strikte opvolging en controle via klinische studies voordat ze op de markt komen. Lokale pijn of zwelling, en lichte koorts, worden als normale bijwerkingen beschouwd. Ernstigere complicaties kunnen te wijten zijn aan contaminatie van het vaccin (ongewenste eiwitten, toxinen, levende virussen), onvoldoende inactivatie van vaccins, of overgevoeligheid van de patiënt, wat een contra-indicatie kan zijn voor levende vaccins . ### 6.6 Huidige vaccins en toepassingen Dankzij vaccinatie komen ziekten zoals pokken en kinderverlamming niet meer voor in België. Andere ziekten, zoals mazelen en difterie, komen veel minder vaak voor. Vaccinatieprogramma's, gefinancierd door de overheid, bieden basisvaccinaties gratis aan. Naast basisvaccinaties zijn er ook aanbevolen vaccinaties, vaak met herhaalmomenten . #### 6.6.1 Vaccinatie tegen kanker De introductie van kanker-antigenen via dragers in de bloedbaan wordt onderzocht als preventieve of therapeutische strategie tegen kanker . #### 6.6.2 Anti-conceptievaccins Deze vaccins, ook wel immunologische contraceptiva genoemd, zijn gericht op het onderbreken van bevruchting en implantatie door immuniteit te introduceren tegen zwangerschapshormonen, zoals human chorionic gonadotropin (hCG). Deze zijn succesvol gebleken bij bavianen en, tijdelijk en zonder serieuze bijwerkingen, bij mensen. Ze bieden nieuwe mogelijkheden voor gezinsplanning, hoewel culturele en ethische aspecten in overweging moeten worden genomen . ### 6.7 Toekomstperspectief De toekomst van vaccinatie richt zich op de juiste distributie van vaccins, de ontwikkeling van nieuwe vaccins tegen specifieke ziekten, en de mogelijkheid van één vaccin tegen meerdere ziekten . > **Tip:** Voor het examen is het belangrijk om de theoretische concepten zoals reproductie, immunologische responsen (IR), immuunsystemen (IS) en pathways grondig te kennen, naast de praktische toepassingen van vaccins . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Immunologisch Immuunsysteem | Het immuunsysteem is een complex netwerk van cellen, weefsels en organen dat samenwerkt om het lichaam te beschermen tegen ziekteverwekkers zoals bacteriën, virussen en parasieten. Het is essentieel voor het handhaven van de gezondheid. | | Aangeboren Immuunsysteem | Dit is de eerste verdedigingslinie van het lichaam. Het is een niet-specifieke en snelle immuunrespons die bij de geboorte aanwezig is en reageert op algemene kenmerken van ziekteverwekkers. | | Verworven Immuunsysteem | Dit is de tweede, meer specifieke en trage immuunrespons. Het ontwikkelt zich gedurende het leven na blootstelling aan specifieke antigenen en onthoudt deze voor toekomstige reacties (immunologisch geheugen). | | Antigen | Een molecule, meestal een eiwit of polysaccharide, dat door het immuunsysteem herkend wordt als lichaamsvreemd en een immuunrespons kan opwekken. | | Antilichaam (AL) | Geproduceerde eiwitten door B-lymfocyten (plasmacellen) die specifiek binden aan antigenen om deze te neutraliseren, te markeren voor vernietiging of het complementsysteem te activeren. Ook bekend als immunoglobulinen (Ig). | | Lymfocyt | Een type witte bloedcel dat essentieel is voor het immuunsysteem. De belangrijkste typen zijn B-lymfocyten (produceren antilichamen) en T-lymfocyten (helpen bij de regulatie van de immuunrespons en doden geïnfecteerde cellen). | | B-lymfocyt | Een type lymfocyt dat betrokken is bij de humorale immuunrespons. Na activering differentiëren B-cellen tot plasmacellen die grote hoeveelheden antilichamen produceren. | | T-lymfocyt | Een type lymfocyt dat verschillende rollen vervult in de immuunrespons. Helper T-cellen (Th) coördineren de immuunrespons, terwijl cytotoxische T-cellen (Tc) geïnfecteerde cellen doden. | | Humorale Immuniteit | Het deel van het verworven immuunsysteem dat berust op antilichamen geproduceerd door B-lymfocyten. Het richt zich voornamelijk op extracellulaire pathogenen. | | Cellulaire Immuniteit | Het deel van het verworven immuunsysteem dat berust op T-lymfocyten, met name cytotoxische T-cellen, om geïnfecteerde cellen of kankercellen direct te elimineren. | | Fagocytose | Een proces waarbij bepaalde immuuncellen (fagocyten zoals macrofagen en neutrofielen) ziekteverwekkers, celresten of vreemde deeltjes "opeten" en vernietigen. | | Fagocyt | Een immuuncel die in staat is tot fagocytose. Belangrijke voorbeelden zijn macrofagen, monocyten, neutrofielen en dendritische cellen. | | Macrofaag | Een type fagocyt die grote ziekteverwekkers, celresten en andere vreemde deeltjes kan opruimen. Ze spelen ook een rol bij het presenteren van antigenen aan T-cellen. | | Neutrofiel | Een type granulocyt en fagocyt die een belangrijke rol speelt in de vroege immuunrespons tegen bacteriële infecties. Ze worden snel aangetrokken tot ontstekingshaarden. | | Cytokine | Signaalmoleculen die worden uitgescheiden door immuuncellen en andere cellen. Ze reguleren de immuunrespons, celgroei, differentiatie en ontsteking. Voorbeelden zijn interleukines, interferonen en TNF. | | Ontsteking | Een beschermende reactie van het lichaam op letsel of infectie, gekenmerkt door roodheid, warmte, zwelling en pijn. Het trekt immuuncellen naar het getroffen gebied. | | Complement Systeem | Een groep plasma-eiwitten die, wanneer geactiveerd, helpt bij de eliminatie van pathogenen via verschillende mechanismen, waaronder lysis, opsonisatie en ontsteking. | | Opsonisatie | Het proces waarbij pathogenen worden bedekt met moleculen (zoals antilichamen en complementfactoren) die fagocytose bevorderen door fagocyten te herkennen en eraan te binden. | | NK-cel (Natural Killer cel) | Een type lymfocyt die deel uitmaakt van het aangeboren immuunsysteem. NK-cellen kunnen geïnfecteerde cellen en kankercellen herkennen en doden zonder voorafgaande sensibilisatie. | | Antigenpresenterende cel (APC) | Cellen die antigenen verwerken en presenteren aan T-lymfocyten, wat cruciaal is voor het initiëren van een specifieke immuunrespons. Dendritische cellen, macrofagen en B-cellen fungeren als APCs. | | MHC (Major Histocompatibility Complex) | Een groep genen die coderen voor eiwitten op het celoppervlak die betrokken zijn bij de herkenning van zelf versus niet-zelf door het immuunsysteem. Ze presenteren antigenen aan T-cellen. | | Epitop | Het specifieke deel van een antigeen waaraan een antilichaam of T-celreceptor bindt. | | Immunologisch Geheugen | Het vermogen van het immuunsysteem om zich eerdere blootstellingen aan antigenen te "herinneren", wat leidt tot een snellere en sterkere reactie bij herhaalde blootstelling. | | Vaccin | Een biologisch preparaat dat het immuunsysteem stimuleert om immuniteit tegen een bepaalde ziekte op te bouwen, meestal door een verzwakte of geïnactiveerde vorm van de ziekteverwekker of delen daarvan toe te dienen. | | Passieve Immunisatie | Het toedienen van reeds gevormde antilichamen (uit een andere persoon of dier) om onmiddellijke bescherming te bieden tegen een infectie of toxine. Het effect is tijdelijk. | | Actieve Immunisatie | Het stimuleren van het eigen immuunsysteem van een persoon om antilichamen en celgemedieerde immuniteit te produceren door toediening van een vaccin. Dit leidt tot langdurige bescherming. | | Toxoïde | Een geïnactiveerd toxine van een bacterie dat zijn immunogene eigenschappen behoudt maar zijn schadelijke effecten niet meer heeft. Toxoïden worden gebruikt in vaccins tegen toxine-producerende bacteriën. | | Allergie | Een overmatige immuunrespons van het lichaam tegen normaal gesproken onschadelijke stoffen (allergenen) uit de omgeving. | | Auto-immuunziekte | Een aandoening waarbij het immuunsysteem per abuis eigen lichaamseigen weefsels aanvalt en beschadigt. | | ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) | Een veelgebruikte immunologische techniek die antilichamen en enzymen gebruikt om de aanwezigheid of concentratie van specifieke antigenen of antilichamen in een monster te detecteren. | | Immunopathologie | De studie van ziekten die worden veroorzaakt door een disfunctie van het immuunsysteem, zoals auto-immuunziekten, allergieën en immuundeficiënties. | | Chemotaxis | Het proces waarbij cellen, zoals immuuncellen, worden aangetrokken naar een bepaalde locatie door chemische signalen (chemokines). | | Cytotoxische T-cel (Tc) | Een type T-lymfocyt dat specifiek geïnfecteerde cellen, kankercellen of getransplanteerde cellen kan herkennen en doden. | | Helper T-cel (Th) | Een type T-lymfocyt dat cruciaal is voor het coördineren van de immuunrespons. Ze helpen bij het activeren van B-cellen en cytotoxische T-cellen door het uitscheiden van cytokines. | | Plasmabestrijding | Dit lijkt een typfout te zijn in het document. De meest waarschijnlijke bedoeling is "plasmacelproductie", wat de productie van antilichamen door plasmacellen beschrijft. | | Serologische Test | Een laboratoriumtest die gebruikt maakt van antigen-antilichaam reacties in het bloedserum om de aanwezigheid van specifieke antigenen of antilichamen te detecteren, vaak gebruikt voor diagnostiek van infectieziekten. | | Immunodiffusie | Een immunologische techniek waarbij antigenen en antilichamen door een gel diffunderen en een neerslaglijn vormen waar ze elkaar ontmoeten, gebruikt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse. | | Agglutinatie | Een proces waarbij gesuspendeerde deeltjes, zoals rode bloedcellen of bacteriën, samenklonteren door binding met antilichamen. Wordt gebruikt in diagnostische tests zoals bloedgroepbepaling. | | Hemagglutinatie | Een specifieke vorm van agglutinatie waarbij rode bloedcellen samenklonteren, vaak geïnduceerd door virussen of antilichamen die aan rode bloedcellen binden. | | Complementfixatie Test | Een laboratoriumtest die de activiteit van het complementsysteem meet. Het wordt gebruikt om de aanwezigheid van antigenen of antilichamen te detecteren, gebaseerd op de consumptie van complement. | | Neutralisatietest | Een test die de aanwezigheid van antilichamen meet door hun vermogen te beoordelen om de infectieuze of toxische activiteit van een virus, bacterie of toxine te neutraliseren. | | Immunofluorescentie | Een techniek die fluorescerende kleurstoffen gebruikt die aan antilichamen zijn gekoppeld om specifieke antigenen in cellen of weefsels te visualiseren onder een fluorescente microscoop. | | Hybridoma Technologie | Een methode voor de productie van monoklonale antilichamen door de fusie van een antilichaam-producerende B-cel met een myeloomcel (kankercel). De resulterende hybride cellen (hybridoma's) produceren grote hoeveelheden specifieke antilichamen. | | Monoklonaal Antilichaam | Een antilichaam geproduceerd door een enkele klone van B-cellen, wat betekent dat alle antilichamen identiek zijn en binden aan hetzelfde specifieke epitoop op een antigeen. | | Polyklonaal Antilichaam | Een mengsel van antilichamen geproduceerd door verschillende klonen van B-cellen, die binden aan verschillende epitopen op hetzelfde antigeen. | | Griepvirus | Een virus dat griep veroorzaakt, een besmettelijke ziekte van de luchtwegen. | | Vaccinatieprogramma | Een georganiseerd plan voor de toediening van vaccins aan een populatie om immuniteit tegen specifieke ziekten te verhogen en uitbraken te voorkomen. | | Genetisch Gewijzigde Organisme (GGO) | Een organisme waarvan het genetisch materiaal (DNA) opzettelijk is aangepast met behulp van gentechnologie. | | HCG (humaan choriongonadotrofine) | Een hormoon dat wordt geproduceerd tijdens de zwangerschap, voornamelijk door de placenta. Het wordt gedetecteerd in zwangerschapstests. | | Epitoop Mapping | Het proces van het identificeren van de specifieke epitopen op een antigeen waaraan antilichamen of T-celreceptoren binden. | | Affiniteitschromatografie | Een techniek die gebruik maakt van de specifieke binding tussen een ligand en een doelwitmolecule (bv. antigeen-antilichaam) om ze van elkaar te scheiden. | | Aviditeit | De totale bindingssterkte tussen een antigeen en meerdere antilichamen, of tussen een multivalent antigeen en een antilichaam met meerdere bindingsplaatsen. | | Specificiteit | Het vermogen van een antilichaam om specifiek te binden aan één bepaald antigeen of epitoop. | | Kruisreactiviteit | Het vermogen van een antilichaam om te binden aan meerdere antigenen of epitopen die structureel vergelijkbaar zijn. | | Immunoessay | Een algemene term voor laboratoriumtests die antigen-antilichaam interacties gebruiken om de aanwezigheid of concentratie van een specifieke stof te meten. | | Radio-Immuno Assay (RIA) | Een gevoelige techniek voor het meten van antigenen of antilichamen met behulp van radioactief gemerkte reagentia. | | Western Blotting | Een techniek die wordt gebruikt om specifieke eiwitten in een complex mengsel te identificeren, na scheiding door elektroforese en overbrenging naar een membraan. | | Immunoprecipitatie | Een techniek die antilichamen gebruikt om specifieke antigenen uit een oplossing te precipitaten, vaak gevolgd door analyse van het precipitaat. | | Immunofluorescentie | Een techniek die fluorescerende antilichamen gebruikt om specifieke antigenen in cellen of weefsels te visualiseren onder een microscoop. | | Humaan Choriongonadotrofine (hCG) | Een hormoon dat tijdens de zwangerschap wordt geproduceerd door de placenta en dat door zwangerschapstests wordt gedetecteerd. | | GGO (Genetisch Gemodificeerd Organisme) | Een organisme waarvan het DNA is gewijzigd door gentechnologie. | | Bt-katoen | Katoen dat genetisch gemodificeerd is om de Bt-toxine te produceren, waardoor het resistent is tegen bepaalde insectenplagen. | | Coeliakie | Een chronische auto-immuunziekte waarbij het eten van gluten leidt tot schade aan de dunne darm. |

# Ontwerp en materialen voor organ-on-chip apparaten Dit onderwerp verkent de essentiële materialen en ontwerpstrategieën die ten grondslag liggen aan de creatie van organ-on-chip (OoC) apparaten, met een focus op de uitdagingen en voordelen die gepaard gaan met materialen zoals glas, PDMS en plastic chips. ## 1. Ontwerp en materialen voor organ-on-chip apparaten ### 1.1 Fundamenten van organ-on-chip ontwerp Organ-on-chip (OoC) technologie streeft ernaar om fysiologische omstandigheden van menselijke organen zo nauwkeurig mogelijk na te bootsen in een chipomgeving, wat leidt tot meer accurate en betrouwbare in-vitro modellen. Dit omvat het integreren van de specifieke celtypen van een orgaan, het nabootsen van hun 3D-structuur en het simuleren van relevante mechanische en chemische prikkels, zoals vloeistofstromen. ### 1.2 Materialen voor OoC-apparaten De keuze van materialen is cruciaal voor de functionaliteit en betrouwbaarheid van OoC-apparaten. Verschillende materialen bieden specifieke voordelen en brengen uitdagingen met zich mee. #### 1.2.1 Glas Glas is een ideaal materiaal vanwege zijn uitstekende optische helderheid, wat essentieel is voor real-time celobservatie onder een microscoop. Het is ook inert, wat ongewenste interacties met de cellen of de experimentele media minimaliseert. * **Voordelen:** * Uitstekende optische transparantie. * Chemische inertie. * **Nadelen:** * Moeilijk te bewerken voor de creatie van microfluïdische kanalen, wat krachtige en dure apparatuur vereist (bijvoorbeeld lasers). * Glas laat geen lucht door, wat een uitdaging kan zijn aangezien cellen zuurstof en kooldioxide nodig hebben. Dit kan echter worden opgelost door slim ontwerp of specifieke coatings. #### 1.2.2 Polydimethylsiloxaan (PDMS) PDMS is een elastisch polymeer dat veel wordt gebruikt in de beginfase van OoC-onderzoek vanwege de toegankelijkheid en kosteneffectiviteit. * **Voordelen:** * Zeer goedkoop en gemakkelijk te fabriceren. * Laat zuurstof door, wat essentieel is voor cellevensvatbaarheid. * Eenvoudige creatie van microfluïdische kanalen door middel van giettechnieken. * **Nadelen:** * Absorptie van medicijnen en andere verbindingen uit de experimentele media, wat kan leiden tot onderestimatie van de werkelijke concentraties en dus tot misleidende resultaten. Dit wordt beschouwd als een "blinde vlek" bij het testen van medicijnen. * Flexibel, wat betekent dat het kan vervormen en bewegingen kan veroorzaken die de vloeistofstromen beïnvloeden. Cellen kunnen daardoor minder stabiel gepositioneerd zijn. #### 1.2.3 Plastic chips Commercieel verkrijgbare plastic chips bieden een oplossing met complexe designs die direct beschikbaar zijn. * **Voordelen:** * Beschikbaarheid van complexe, kant-en-klare ontwerpen. * Lage absorptie van verbindingen in vergelijking met PDMS. * Stevig en mechanisch stabiel. * **Nadelen:** * Potentieel meer interactie met de inhoud van de chip vergeleken met glas. * Het zelf maken van mallen voor plastic chips kan kostbaar zijn (ongeveer 20.000 dollar). ### 1.3 Ontwerpfilosofieën voor celintegratie en fysiologische simulatie De manier waarop cellen in de chip worden geplaatst en de fysiologische omgeving die wordt nagebootst, zijn fundamenteel voor het succes van een OoC-apparaat. #### 1.3.1 Cell-based engineering versus self-assembly Er zijn twee primaire benaderingen voor het creëren van weefselstructuren in OoC: * **Engineering van cellen:** Hierbij worden cellen direct gemanipuleerd en geplaatst, bijvoorbeeld door gebruik te maken van transwells. Transwells zijn membranen die een celkweekkamer opdelen in twee compartimenten, waardoor verschillende media aan de boven- en onderkant kunnen worden toegevoegd om celgroei te analyseren. Dit kan leiden tot artificiële omstandigheden. * **Self-assembly van cellen:** Dit is de ultieme vorm van engineering waarbij de cellen zichzelf organiseren tot de gewenste structuur. Dit bootst natuurlijke weefselvorming na. #### 1.3.2 Nabootsing van de fysiologische omgeving Het simuleren van de fysiologische omgeving is essentieel voor nauwkeurige modellen. * **Microfluïdische kanalen:** Deze worden gebruikt om vloeistofstromen te creëren die de bloedcirculatie of andere lichaamsvloeistoffen nabootsen. * **Vloeistofstromen:** Het variëren van vloeistofstromen kan verschillende fysiologische processen simuleren, zoals het knipperen van het oog door pulsatiele stromen te introduceren. * **3D-structurering:** Het gebruik van structuren zoals "pilaren" kan helpen om weefsel op zijn plaats te houden of zelfs dienen als sensoren. * **ECM-nabootsing:** Extracellulaire matrix (ECM) kan worden nagebootst met materialen zoals hydrogels (bijvoorbeeld op basis van gelatine of collageen). Gelatine is vaak makkelijker te hanteren dan collageen. #### 1.3.3 Positionering van weefsel in de chip De oriëntatie en positionering van weefsel in de chip zijn kritisch: * **Cellen op de bodem:** De cellen worden direct op de bodem van de plaat geplaatst. * **Vloeistof boven en onder cellen:** Dit vereist ondersteuning, zoals een membraan, om te voorkomen dat het weefsel naar beneden zakt. * **Vloeistof links en rechts van weefsel:** Deze opstelling minimaliseert de impact van zwaartekracht op het weefsel. #### 1.3.4 Gebruik van sensoren en metingen Integratie van sensoren, zoals gouden elektroden, maakt het mogelijk om fysiologische signalen te meten zonder het weefsel te beschadigen. Dit kan variëren van weerstandsmetingen tot het detecteren van celactiviteit. Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) en non-linear Electrical Resistance (nTEER) zijn voorbeelden van technieken die worden gebruikt voor barrièresensing. ### 1.4 Toepassingen en specifieke voorbeelden #### 1.4.1 Cornea-on-a-chip Een specifiek voorbeeld is de ontwikkeling van een cornea-on-a-chip. Dit omvat het nabootsen van de verschillende lagen van de cornea: epitheel, stroma en endotheel. * **Stroma:** Kan worden nagebootst met hydrogels zoals gelatine, waarin stromale cellen (keratinocyten) worden ingebed. * **Epitheel:** Kan worden aangebracht op de stromale laag. * **Endotheel:** De derde laag, die essentieel is voor hydratatie, is vaak de meest uitdagende om succesvol te integreren. * **Simulatie van ooglidbewegingen:** Door pulsatiele vloeistofstromen te gebruiken, kan het knipperen van het oog worden nagebootst. #### 1.4.2 Spier-on-a-chip OoC-apparaten kunnen ook worden gebruikt om spierweefsel, zoals hartspiercellen, te bestuderen. Pilaren kunnen hier worden gebruikt om de cellen te stimuleren tot samentrekken en de effecten van medicijnen te meten. ### 1.5 Voordelen en nadelen van organ-on-chip technologie #### 1.5.1 Voordelen * **Fit-for-purpose ontwerp:** De complexiteit van de chip kan worden aangepast aan de specifieke onderzoeksvraag. * **Verbeterde fysiologische relevantie:** Nabootsing van de fysiologische omgeving leidt tot accuratere modellen dan statische modellen. * **Niet-invasieve monitoring:** Weefsel kan worden gemonitord zonder de integriteit ervan te doorbreken. * **Miniaturisatie en replicaten:** Door het miniaturiseren van weefsels kunnen meer replicaten worden gemaakt, wat de statistische kracht van experimenten verhoogt. #### 1.5.2 Nadelen * **Complexiteit en customisatie:** Er zijn veel commerciële chips beschikbaar, wat de keuze complex maakt. * **Validatie van biologisch weefsel:** Eerst moet worden getest of het biologische weefsel goed functioneert buiten de chip. * **Technische uitdagingen:** Problemen met zuurstofuitwisseling, mechanische stabiliteit van componenten (zoals tubing) en contaminatie. * **Tijdsintensief proces:** De ontwikkeling en validatie van robuuste OoC-modellen kan jaren duren. * **Schaalbaarheid:** Technieken zoals EIS zijn momenteel niet schaalbaar genoeg voor massale screening. ### 1.6 De weg naar robuuste OoC-modellen Het creëren van een succesvol OoC-model vereist een gestructureerde aanpak: * **Biomateriaal screening:** Selectie van geschikte biocompatibele materialen, zoals hydrogels, en het uitvoeren van viabiliteitstesten. * **Cellulaire integriteit:** Zorgen dat de cellen individueel functioneren zoals verwacht buiten de chip en zich goed gedragen binnen de chip. * **Fysiologische stimulatie:** Nabootsen van relevante omstandigheden zoals stroming om celgedrag en barrièrefunctie te evalueren. * **Robuuste metingen:** Ontwikkelen van snelle, schaalbare en betrouwbare methoden voor het meten van barrièrefunctie en celrespons. * **Validatie:** Het model moet worden gevalideerd tegen bekende fysiologische en farmacologische reacties, waarbij de resultaten vergeleken worden met diermodellen waar nodig. > **Tip:** Bij het werken met PDMS is het cruciaal om rekening te houden met de absorptie van medicijnen. Dit kan leiden tot onjuiste conclusies over de effectiviteit van medicijnen. Overweeg alternatieve materialen of corrigerende maatregelen indien mogelijk. > **Tip:** De validatie van een OoC-model is net zo belangrijk als het ontwerp zelf. Een model is slechts zo goed als de karakterisatie en de bewijzen die de superioriteit ervan aantonen ten opzichte van bestaande methoden. > **Tip:** Combineer verschillende meetmethoden om een compleet beeld te krijgen van de barrièrefunctie en celgezondheid. Niet één enkele techniek is altijd perfect. --- # Nabootsten van de fysiologische omgeving en celgedrag in organ-on-chip modellen Organ-on-chip systemen hebben tot doel de fysiologische omgeving van menselijke organen zo nauwkeurig mogelijk na te bootsen om zo accuratere en betrouwbaardere modellen te creëren dan traditionele methoden. ### 2.1 De fysiologische omgeving nabootsen Het nabootsen van de fysiologische omgeving is cruciaal voor het creëren van accurate modellen. Dit omvat het repliceren van de complexe architectuur, de mechanische stimuli en de vloeistofstromen die in vivo aanwezig zijn. #### 2.1.1 Fysiologische omgeving in de cornea De cornea, het voorste transparante deel van het oog, is een complex weefsel dat uit meerdere lagen bestaat, elk met specifieke functies: * **Epitheel:** Een meerlagige structuur van keratinocyten die het oog beschermen en geactiveerd worden bij verwondingen. * **Stroma:** De dikste laag, voornamelijk bestaande uit collageenvezels, die zorgt voor de structurele integriteit en transparantie. * **Endotheel:** Een enkele laag cellen die de hydratatie van de cornea reguleert en de transparantie behoudt. Het endotheel neemt af bij veroudering, wat bij konijnen anders is, aangezien het endotheel daar goed blijft groeien. #### 2.1.2 Microfluïdische chips en vloeistofstromen Microfluïdische chips maken het mogelijk om dynamische fysiologische omstandigheden na te bootsen, zoals de vloeistofstromen die in het lichaam voorkomen. Door vloeistofstromen door microkanalen te leiden, kunnen mechanische prikkels op de cellen worden toegepast, wat belangrijk is voor het behoud van hun fenotype en functie. #### 2.1.3 Vormgeven van celarchitectuur en weefselintegriteit Verschillende methoden worden gebruikt om celarchitectuur en weefselintegriteit te creëren en te behouden: * **Transwells:** Deze systemen gebruiken een membraan om een celkweekput op te delen in twee compartimenten. Dit maakt het mogelijk om verschillende groeimedia toe te voegen, wat de cellen helpt bij het organiseren in specifieke structuren, zoals meerlagige epithelia. * **Spheroids:** Cellen kunnen zichzelf organiseren tot 3D-bolletjes (spheroids) in suspensie, wat een meer representatieve weefselstructuur biedt dan 2D-celculturen. * **Zelf-engineering door cellen:** In organ-on-chip systemen kunnen cellen zichzelf organiseren en lagen opbouwen, vergelijkbaar met de manier waarop weefsels zich in vivo ontwikkelen. * **Pilaren en Fasegeleiders:** Pilaren kunnen worden gebruikt om weefsels op hun plaats te houden of als sensoren. Fasegeleiders (plastic randen tussen extracellulaire matrix (ECM) en cellen of kanalen) kunnen capillaire krachten gebruiken om weefsels op hun plaats te houden. ### 2.2 Materialen voor organ-on-chip systemen De keuze van materiaal voor de chip is essentieel voor de functionaliteit en reproduceerbaarheid van het model. #### 2.2.1 Glas Glas is een ideaal materiaal vanwege zijn optische transparantie, wat visualisatie van de cellen mogelijk maakt. Echter, het maken van microfluïdische kanalen in glas vereist dure apparatuur en technieken zoals krachtige lasers of sterke chemicaliën. Bovendien laat glas geen lucht door, wat een uitdaging kan zijn aangezien cellen zuurstof en CO2 nodig hebben. #### 2.2.2 Polydimethylsiloxaan (PDMS) PDMS is een elastisch polymeer dat goedkoop is en makkelijk te verwerken. Het laat zuurstof door, wat gunstig is voor celgroei. Echter, PDMS heeft ook nadelen: * **Absorptie van medicijnen:** PDMS kan medicijnen absorberen, wat kan leiden tot 'blinde vlekken' in experimenten en tot onderschatting van de werkelijke concentratie van stoffen. * **Mechanische flexibiliteit:** De elasticiteit van PDMS kan leiden tot ongewenste vloeistofstromen en moeilijkheden bij het positioneren van cellen. #### 2.2.3 Kunststof chips Commercieel verkrijgbare kunststof chips bieden vaak complexe designs en hebben een lage absorptie voor verschillende stoffen. Het zelf produceren van kunststof chips kan echter kostbaar zijn vanwege de benodigde mallen. Kunststof kan ook meer interactie vertonen met de cellen en de experimentele stoffen. ### 2.3 Methoden voor celgedrag en weefselintegriteit monitoren en stimuleren Het monitoren en stimuleren van celgedrag is cruciaal voor het valideren van organ-on-chip modellen. #### 2.3.1 Barrière Sensing De integriteit van celbarrières kan worden gemeten met behulp van verschillende technieken: * **Weerstandmetingen:** De elektrische weerstand van de celbarrière kan worden gemeten met sensoren. Een hogere weerstand indiceert een intacte barrière. * **Diffusiesnelheid van tracers:** Fluorescente stoffen (tracers) kunnen worden toegevoegd om de diffusiesnelheid door de celbarrière te meten. Een langzamere diffusie duidt op een betere barrière. * **Elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS):** Een techniek die de elektrische eigenschappen van de celbarrière onderzoekt. Het nadeel is dat het relatief lang duurt (ongeveer 7 minuten per staal), wat de schaalbaarheid beperkt. * **Normalized Transepithelial Electrical Resistance (nTEER):** Een meer robuuste methode die de weerstand normaliseert ten opzichte van de barrière in open toestand (bijvoorbeeld cellen in PBS). Dit helpt om onderscheid te maken tussen functionele barrières en dode barrières. #### 2.3.2 Stimulatie van celgedrag Fysiologische omstandigheden kunnen worden nagebootst om celgedrag te stimuleren: * **Variëren van vloeistofstromen:** Door de snelheid en frequentie van vloeistofstromen te variëren, kan bijvoorbeeld het knipperen van het oog worden nagebootst. Dit kan de celrespons beïnvloeden en de stabiliteit van de celbarrière testen. * **Toedienen van stoffen:** Medicijnen of andere chemicaliën kunnen worden toegevoegd om de effecten op het weefsel te evalueren. #### 2.3.3 Hydrogelen en ECM-componenten Hydrogelen, zoals gelatine, worden gebruikt om de extracellulaire matrix (ECM) na te bootsen. Gelatine is makkelijker te hanteren dan puur collageen. Low-viscosity gelatine vereist geen verwarming of afkoeling, wat de procesvoering vereenvoudigt. ### 2.4 Voordelen en nadelen van organ-on-chip modellen #### 2.4.1 Voordelen * **Accuratere modellen:** Nabootsing van de fysiologische omgeving leidt tot meer representatieve modellen dan traditionele 2D-celculturen. * **Fit-for-purpose design:** Chips kunnen worden ontworpen voor specifieke toepassingen, waardoor de complexiteit kan worden aangepast aan de behoefte. * **Niet-invasieve monitoring:** Weefsels kunnen worden gemonitord zonder ze te beschadigen, bijvoorbeeld door geautomatiseerd te samplen. * **Miniaturisatie:** De kleine schaal maakt het mogelijk om meer replicaten te produceren en efficiënter te werken. * **Geautomatiseerde testen:** Automatisering van processen zoals hydrogel testen verhoogt de efficiëntie. #### 2.4.2 Nadelen * **Focus op custom chips:** Er zijn veel verschillende chips op de markt, wat de keuze kan bemoeilijken. * **Validatie van biologisch weefsel:** Het is cruciaal om te verifiëren of het biologische weefsel daadwerkelijk goed functioneert in de chip en niet de chip zelf problemen veroorzaakt (bv. zuurstofuitwisseling). * **Tijdsintensief proces:** De ontwikkeling en validatie van organ-on-chip modellen kan lang duren (5-10 jaar). * **Technische uitdagingen:** Tubing kan leiden tot contaminatie en chaos. Het integreren van chips in geautomatiseerde systemen kan complex zijn. * **Interpretatie van data:** Het combineren van verschillende meetmethoden en het correct interpreteren van de data is essentieel. **Tip:** De validatie van een organ-on-chip model is net zo belangrijk als de constructie ervan. Het model is slechts zo goed als de karakterisering die ervan wordt gedaan. **Voorbeeld:** Het testen van de permeabiliteit van medicijnen door een cornea-on-chip model moet worden vergeleken met de permeabiliteit in een echt cornea-weefsel om de representativiteit te valideren. Naast het meten van de barrière-integriteit met sensoren, is het essentieel om ook visueel te inspecteren hoe de cellen zich gedragen onder verschillende omstandigheden. --- # Validatie en toepassing van organ-on-chip modellen voor onderzoek Dit deel behandelt de essentiële stappen in de validatie van organ-on-chip (OOC) modellen, inclusief het beoordelen van barrièrefuncties en toxiciteitstesten, alsook de uitdagingen bij het interpreteren van data voor de ontwikkeling van betrouwbare in vitro modellen. ### 3.1 Ontwerpfilosofieën en materialen voor organ-on-chip chips De keuze van materialen voor OOC-chips is cruciaal en wordt bepaald door de vereisten van het specifieke orgaan of weefsel dat wordt nagebootst. #### 3.1.1 Materiaaloverwegingen * **Glas:** * **Voordelen:** Optisch helder, wat essentieel is voor celobservatie. * **Nadelen:** Moeilijk te bewerken om microfluïdische kanalen te creëren. Glas is impermeabel voor gassen zoals zuurstof en kooldioxide, wat essentieel is voor celmetabolisme. Dit vereist geavanceerde technieken om diffusie mogelijk te maken. Het maken van microstructuren in glas vereist krachtige lasers of sterke chemicaliën, wat leidt tot dure apparatuur. * **PDMS (Polydimethylsiloxaan):** * **Voordelen:** Een elastisch polymeer dat goedkoop is en waarmee gemakkelijk microfluïdische kanalen gemaakt kunnen worden. Het laat zuurstof door, wat een groot voordeel is voor celcultuur. * **Nadelen:** PDMS heeft een inherente absorptie van bepaalde medicijnen, wat kan leiden tot een "blinde vlek" in experimenten. Dit kan ten onrechte suggereren dat een medicijn langzaam door een barrière gaat, terwijl het feitelijk aan het PDMS hecht. Vanwege de flexibiliteit kan PDMS echter vervormen, wat onbedoelde vloeistofstromen kan veroorzaken en cellen kunnen zich verplaatsen naar ongewenste locaties. * **Kunststof chips:** * **Voordelen:** Complexe designs zijn direct verkrijgbaar op de markt. Ze hebben een lage absorptie voor verschillende verbindingen en zijn stevig. * **Nadelen:** Meer interactie met de inhoud van de chip is mogelijk. Het zelf produceren van kunststof chips met specifieke mallen kan kostbaar zijn, tot wel twintigduizend dollars. #### 3.1.2 Structurele componenten en celoriëntatie OOC-chips bieden diverse manieren om weefsel te structureren en te ondersteunen, wat afwijkt van traditionele methoden zoals transwells. * **Ondersteuning van weefsel:** * **Transwells:** Weefsel ligt op een membraan in een afgescheiden compartiment. * **Chip-gebaseerde systemen:** * Cellen op de bodem van een plaat. * Vloeistof zowel boven als onder de cellen, wat ondersteuning zoals een membraan vereist om instorting door zwaartekracht te voorkomen. * Vloeistofstromen links en rechts van het weefsel, wat minder risico op zwaartekrachtproblemen met zich meebrengt. * **Mechanische ondersteuning en positionering:** * **Dunne membranen:** Gebruikt voor ondersteuning in vloeistofstromen. * **Speciale membranen:** Ontwikkeld voor specifieke toepassingen. * **Flexibele structuren:** Kunnen de druk in onderste vloeistofkanalen veranderen om fysiologische omstandigheden, zoals ademhaling, na te bootsen. * **Pilaren:** Kunnen gebruikt worden om weefsel op zijn plaats te houden, zoals pilaren die collageen in een cornea-on-chip model positioneren. Deze kunnen ook als sensoren functioneren. * **Phase guides:** Plastische randen tussen de extracellulaire matrix (ECM) en cellen of kanalen die capillaire krachten benutten om het weefsel op zijn plaats te houden. #### 3.1.3 Het creëren van de fysiologische omgeving Het nabootsen van de natuurlijke fysiologische omgeving is essentieel voor het verkrijgen van accurate modellen. * **Vloeistofstromen:** Microfluïdische kanalen in de chips maken het mogelijk om de vloeistofstromen van het lichaam na te bootsen. Dit kan door middel van pompen die continu of pulsatieel medium verversen en blootstelling aan fysiologische stromingssnelheden simuleren. * **3D-structurering van weefsel:** * **Spheroids:** Cellen organiseren zich in 3D-bollen. * **Hydrogels:** Vaak gebaseerd op gelatine, om de ECM na te bootsen. Gelatine wordt gebruikt als een afgeleide van collageen, wat makkelijker te hanteren is. Low-viscositeit gelatine, afkomstig van vis, vereist geen verwarming of koeling en kan via fotomaskers worden gestold. * **Zelf-assemblage versus engineering:** * **Cellen zelf laten organiseren:** De cellen worden in de chip geplaatst en krijgen de vrijheid om zichzelf te organiseren. * **Gemanipuleerde celcultuur:** Cellen worden genetisch aangepast of behandeld met stoffen om ze richting specifieke celtypes te sturen. Dit kan echter leiden tot onverwachte resultaten, zoals het ontwikkelen van corneale organoïden in plaats van retinale organoïden. * **Transwells:** Een traditionele methode waarbij een membraan de well verdeelt, waardoor verschillende media aan boven- en onderkant toegevoegd kunnen worden. Dit is echter een artificiële opstelling. #### 3.1.4 Voorbeelden van orgaanmodellen * **Cornea-on-a-chip:** * **Constructie:** Kan bestaan uit gelatine met stromale cellen, gevolgd door het selectief verharden van de gel tussen twee kanalen. De epitheel- en endotheellaag worden vervolgens aangebracht. * **Validatie:** De barrièrefunctie van de cornea wordt getest door middel van sensoren die de weerstand meten of door de diffusiesnelheid van fluorescente stoffen te meten. Het simuleren van oogknipperen door variërende vloeistofstromen is een belangrijk onderdeel van de validatie. * **Hartspier-on-a-chip:** * **Concept:** Hartcellen vormen organoïden rond twee pilaren, die tevens als sensoren dienen. Medicijnen kunnen worden toegevoegd om de effecten op de hartcellen te bestuderen. ### 3.2 Validatie van organ-on-chip modellen De validatie van OOC-modellen is een multidisciplinair proces dat erop gericht is om de betrouwbaarheid en accuraatheid van de in vitro systemen te waarborgen. #### 3.2.1 Barrière-eigenschappen en permeabiliteitstesten Het meten van de barrièrefunctie is cruciaal voor modellen die fysiologische barrières nabootsen, zoals de cornea of darmepitheel. * **Weerstandsmetingen:** * **Elektrische weerstand:** Kan gemeten worden met sensoren, wat een indicatie geeft van de integriteit van de celbarrière. * **TEER (Transepithelial Electrical Resistance):** Een standaardmethode om de barrière-integriteit te meten. * **nTEER (normalized TEER):** Een geavanceerdere methode die rekening houdt met het feit dat de barrière open en gesloten kan zijn, en normaliseert de metingen. Dit maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen functionele barrières en dode cellen of debris. * **Permeabiliteitstesten met tracers:** * **Fluorescente stoffen (tracers):** Worden toegevoegd om de diffusiesnelheid door de celbarrière te meten. Dit kan gecombineerd worden met fluorescente microscopie om gaten in de barrière te visualiseren. * **Uitdagingen:** Tracers zijn niet altijd representatief voor de werkelijke farmacokinetiek van medicijnen. Het selecteren van medicijnen met verschillende eigenschappen is nodig om de permeabiliteit van de cornea-on-chip te correleren met die van een echte cornea. * **Multiplexing:** Het combineren van verschillende meetmethoden, zoals weerstandsmetingen en tracer-diffusie, voor een meer complete karakterisering. * **Groeisnelheden en celviabiliteit:** * Het monitoren van celgroei en viabiliteit over tijd is essentieel. Modellen worden geëvalueerd op basis van hun vermogen om fysiologische groeisnelheden te behalen. * **KSFM (Keratinocyte Serum-Free Medium):** Een medium dat gebruikt kan worden om celgroei te beoordelen. * **Testen met chemicaliën:** * **Calcium:** Kan gaten in de barrière veroorzaken. * **DMSO (Dimethylsulfoxide):** Kan kleine gaten veroorzaken. * **PBS (Phosphate-Buffered Saline):** Veroorzaakt doorgaans geen schade. * **Biomaterialen screening:** Het testen van de biocompatibiliteit van hydrogels is cruciaal, aangezien vervorming of loslaten van het materiaal de resultaten kan beïnvloeden. #### 3.2.2 Toxiciteitstesten en medicijnontwikkeling OOC-modellen worden steeds vaker ingezet voor toxiciteitstesten en het screenen van potentiële medicijnen. * **Toxiciteitsbeoordeling:** * **Categorieën van stoffen:** Stoffen worden gecategoriseerd op basis van hun schadelijkheid (bv. stoffen die alles vernietigen, stoffen die geen schade aanrichten, en stoffen die milde irritatie veroorzaken). * **Vergelijking met diermodellen:** Voor mild irriterende stoffen kunnen OOC-modellen een alternatief bieden voor dierproeven, hoewel konijnenmodellen nog steeds nodig kunnen zijn voor bepaalde nuances. * **Integratie met toxicologie:** Samenwerking met toxicologieafdelingen is noodzakelijk om methoden zoals LC-MS (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry) te integreren voor het meten van medicijnconcentraties. * **Medicijnontwikkeling:** * Het screenen van medicijnen met verschillende eigenschappen helpt bij het selecteren van veelbelovende kandidaten. * **Onderzoek naar chip-specifieke effecten:** Het is belangrijk om te valideren of de chemicaliën zelf een invloed hebben op de chip. Vergelijking van data van verschillende chip-types is een manier om dit te beoordelen. * **Viabiliteit over tijd:** Bestuderen hoe de cellen en het model functioneren na blootstelling aan medicijnen gedurende langere perioden. #### 3.2.3 Uitdagingen en toekomstige richtingen Ondanks de vooruitgang blijven er uitdagingen bestaan bij de implementatie van OOC-modellen. * **Schaalbaarheid en standaardisatie:** * Hoewel OOC-modellen miniaturisatie mogelijk maken, waardoor meer replicaten gemaakt kunnen worden, is de totale testtijd aanzienlijk. * Het maken van robuuste, reproduceerbare modellen vereist gestandaardiseerde protocollen. * De complexe tubing en aansluitingen op kleine schaal kunnen een bron van contaminatie en chaos vormen. Het gebruik van een platform waar de tubing aan één kant is bevestigd en de chip in een apparaat wordt geklikt, minimaliseert dit risico. * **Modelvalidatie en acceptatie:** * Het verkrijgen van bewijs dat OOC-modellen superieur zijn aan bestaande methoden kan lang duren, mogelijk vijf tot tien jaar. * Het is essentieel om eerst de biologische functionaliteit van het weefsel buiten de chip te testen voordat het in de chip wordt geïntegreerd. * Mechanische aspecten, zoals het simuleren van een ooglid, kunnen experimenten bemoeilijken. * **Data-interpretatie:** * Het interpreteren van data van complexe OOC-systemen vereist gespecialiseerde kennis. Combinatie van verschillende meetmethoden is vaak noodzakelijk om een compleet beeld te krijgen. * Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) is een krachtige techniek, maar de lange meettijd van zeven minuten per staal beperkt de schaalbaarheid. * Het vinden van de juiste balans tussen het creëren van een barrière en het behouden van celviabiliteit is een continue uitdaging. Het "short cut" van het direct aanbrengen van een volledige barrière kan een snellere piekwaarde opleveren, maar vereist ook een langere stabilisatietijd. > **Tip:** Het combineren van verschillende validatiemethoden, zoals weerstandsmetingen, tracerstudies en visuele inspectie met microscopie, is cruciaal voor een grondige evaluatie van OOC-modellen. > **Voorbeeld:** Bij het testen van een cornea-on-a-chip model, kan het variëren van de pompsnelheid om oogknipperen na te bootsen en het meten van de veranderende weerstand van de celbarrière waardevolle inzichten geven in de fysiologische respons van het model. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Organ on a chip | Een geavanceerde in vitro modeltechnologie die de structuur en functie van menselijke organen nabootst op microfluïdische chips, waardoor fysiologische processen nauwkeuriger bestudeerd kunnen worden. | | Epitheel | Een type weefsel dat de buitenkant van het lichaam bekleedt, organen bekleedt en lichaamsholtes vormt, en vaak een beschermende en absorberende functie heeft. | | Keratinocyten | De belangrijkste celtypen in het epitheel, die keratine produceren en een cruciale rol spelen bij de bescherming en genezing van de huid en andere epitheliale weefsels. | | Stroma | Het ondersteunende weefsel van een orgaan, bestaande uit bindweefsel, bloedvaten en zenuwen, dat structurele ondersteuning biedt en betrokken is bij de functie van het orgaan. | | Endotheel | Een dunne laag cellen die de binnenkant van bloedvaten, lymfevaten en andere lichaamsholtes bekleedt, en een belangrijke rol speelt bij de regulatie van bloeddruk, ontstekingsreacties en bloedstolling. | | Spheroid | Een driedimensionale bolvormige aggregaat van cellen, die kan ontstaan wanneer cellen zichzelf organiseren in afwezigheid van een celkweekmedium of ondersteunende structuur. | | Transwell | Een type celkweekapparaat dat bestaat uit een putje met een membraan aan de bodem, waardoor twee compartimenten ontstaan die gescheiden worden door het membraan, wat de studie van celpolariteit en permeabiliteit mogelijk maakt. | | Epigenetica | De studie van erfelijke veranderingen in genexpressie die niet gepaard gaan met veranderingen in de DNA-sequentie zelf, en die invloed kunnen hebben op de ontwikkeling en differentiatie van cellen. | | Microfluïdische kanalen | Zeer kleine kanalen met afmetingen in de orde van micrometers, gebruikt in microfluïdische apparaten om kleine hoeveelheden vloeistof te manipuleren en te bestuderen. | | PDMS (Polydimethylsiloxaan) | Een veelgebruikt polymeer in de microfluïdische technologie, bekend om zijn elasticiteit, biocompatibiliteit en kosteneffectiviteit, wat het geschikt maakt voor de fabricage van microfluïdische chips. | | Hydrogel | Een netwerk van polymeerketens die water kunnen absorberen en vasthouden, en vaak worden gebruikt als biomateriaal in tissue engineering en drug delivery vanwege hun zachte en hydraterende eigenschappen. | | ECM (Extracellulaire matrix) | Een complex netwerk van macromoleculen zoals collageen, elastine en glycoproteïnen dat buiten de cellen in weefsels wordt aangetroffen en structurele ondersteuning biedt, celgroei reguleert en celgedrag beïnvloedt. | | Fotomasker | Een mal die wordt gebruikt om patronen op een oppervlak aan te brengen, vaak met behulp van UV-licht, en die wordt toegepast in de productie van microfluïdische chips en halfgeleiders. | | Chemische crosslinking | Een proces waarbij chemische verbindingen worden gevormd tussen polymeerketens, wat resulteert in een versterkt en gestabiliseerd materiaal, vaak gebruikt om hydrogels te verharden. | | Capillaire krachten | De krachten die ontstaan door de interactie tussen een vloeistof en de wanden van een dun kanaal, die kunnen worden gebruikt om vloeistoffen te transporteren of structuren op hun plaats te houden. | | Toxiciteitstest | Een laboratoriumtest die de schadelijke effecten van een stof op levende organismen of cellen evalueert, gebruikt om de veiligheid van medicijnen, chemicaliën en materialen te beoordelen. | | nTEER (Normalized Transepithelial Electrical Resistance) | Een methode om de integriteit van epitheliale barrières te meten door de elektrische weerstand te normaliseren ten opzichte van een controleconditie, wat aangeeft hoe goed de barrière stoffen doorlaat. |

# De aard en doelen van toxicologie Toxicologie is de wetenschappelijke discipline die zich bezighoudt met de schadelijke effecten van stoffen op levende organismen en het milieu [1](#page=1). ### 1.1 Definitie en kernvragen van toxicologie Toxicologie definieert zichzelf als de wetenschap die onderzoek doet naar de schadelijke effecten op de gezondheid van mens en milieu, veroorzaakt door stoffen in onze voeding en leefomgeving. Het veld probeert antwoorden te vinden op fundamentele vragen zoals [1](#page=1): * Hoe giftig is een stof werkelijk [1](#page=1)? * Zijn voedseladditieven een gevaar voor de gezondheid [1](#page=1)? * Veroorzaken specifieke stoffen zoals dioxinen kanker [1](#page=1)? * Is iets dat chemisch is per definitie gevaarlijk en iets dat natuurlijk is per definitie veilig [1](#page=1)? * Moeten we het consumeren van fruit vermijden vanwege het gebruik van pesticiden [1](#page=1)? ### 1.2 Hoofddoel van toxicologie Het primaire doel van toxicologie is het identificeren van toxines (gifstoffen) en het bepalen van hun toxische dosis. Dit stelt ons in staat om de gezondheids- en milieurisico's van chemische stoffen in te schatten [2](#page=2). ### 1.3 Nevendoelen van toxicologie Naast het hoofddoel heeft toxicologie ook belangrijke neventoelen. Deze omvatten het geven van advies over het meest geschikte tegengif (antidotum) en het aanbevelen van andere therapeutische maatregelen om een geïntoxiceerd persoon of dier te behandelen [2](#page=2). > **Tip:** Onthoud dat de definitie van "giftig" niet absoluut is, maar afhankelijk van de dosis, blootstelling en het organisme [1](#page=1) [2](#page=2). > **Example:** Een toxicoloog zou onderzoeken of de hoeveelheid parabenen in cosmetica schadelijk is voor de menselijke gezondheid door de dosis te vergelijken met bekende toxische niveaus [1](#page=1) [2](#page=2). --- # Factoren die toxiciteit bepalen en effecten van toxische stoffen Om een toxische werking te hebben, moet een chemische stof eerst opgenomen worden in het lichaam en de plaats bereiken waar de toxische werking kan worden uitgeoefend, waarbij het aantal biologische barrières gepasseerd moet worden. De toxiciteit van een stof wordt bepaald door de interactie tussen het menselijk lichaam en de chemische stof, de dosis waarbij een toxisch effect optreedt, en de individuele gevoeligheid van verschillende mensen. Soms kunnen synergetische effecten optreden [4](#page=4). ### 2.1 Factoren die de toxiciteit bepalen #### 2.1.1 Opname, distributie en eliminatie De opname van een stof kan op verschillende manieren plaatsvinden: oraal via het maagdarmstelsel, via de longen voor giftige gassen, rechtstreeks in de bloedbaan (intraveneus), of via de huid, ogen of slijmvliezen. De stof moet vervolgens de plaats bereiken waar de toxische werking kan worden uitgeoefend, wat inhoudt dat er biologische barrières gepasseerd moeten worden [4](#page=4). De interactie tussen het lichaam en de stof kan leiden tot een directe werking op de plaats van inname, of eerst na opname in het lichaam en omzetting in een gifstof. De uitscheiding uit het lichaam kan plaatsvinden via de nieren (urine), maar ook via gal, zweet- en speekselklieren, longen en melk. Als de snelheid van inname groter is dan de snelheid van metabolisme of secretie, kan de stof zich ophopen in lichaamsweefsels en nooit geëlimineerd worden. Dit leidt meestal tot chronische toxiciteit, waarbij effecten pas na langdurige of herhaaldelijke blootstelling optreden [4](#page=4). #### 2.1.2 Dosis en individuele gevoeligheid De dosis waarbij een toxisch effect optreedt, is een cruciale factor in de toxiciteit. Daarnaast speelt de individuele gevoeligheid van verschillende mensen een belangrijke rol [4](#page=4). ### 2.2 Effecten van toxische stoffen De effecten van toxische stoffen kunnen worden ingedeeld naar de aard van de toxische respons, of een stof lokaal of systemisch werkt, en naar het weefsel- of orgaantype dat wordt aangetast [5](#page=5) [6](#page=6). #### 2.2.1 Indeling naar de aard van de toxische respons * **Biochemisch:** Celbeschadiging [5](#page=5). * **Fysiologisch:** Bijvoorbeeld bloeddrukwijzigingen [5](#page=5). * **Mutageen:** Beschadiging van DNA, wat leidt tot erfelijke veranderingen [5](#page=5). * **Carcinogeen:** Kankerverwekkend, waarbij controle over celreplicatie verloren gaat en tumoren worden veroorzaakt [5](#page=5). * **Teratogeen:** Veroorzaakt afwijkingen bij de foetus [5](#page=5). * **Reprotoxisch:** Negatieve effecten op de vruchtbaarheid of schadelijk voor het ongeboren kind [5](#page=5). #### 2.2.2 Indeling naar lokaal versus systemisch effect * **Lokale toxische respons:** Treedt op de plaats van het eerste contact met de stof. Een voorbeeld is het ontstaan van brandwonden op de huid bij uitwendige blootstelling aan sterke zuren [5](#page=5). * **Systemische toxische respons:** De toxische effecten worden geproduceerd in een ander weefsel dan het contactpunt. Een voorbeeld is methanol, dat wordt omgezet in mierenzuur. Dit zuur kan zich ophopen in het lichaam, wat leidt tot een daling van de pH van het bloed (metabole acidose). Dit kan de oogzenuw in het netvlies beschadigen en leiden tot slechtziendheid [5](#page=5). #### 2.2.3 Indeling naar weefsel/orgaantype * **Hepatotoxines:** Toxisch voor de lever [6](#page=6). * **Nefrotoxines:** Toxisch voor de nieren [6](#page=6). * **Neurotoxines:** Werken in op het zenuwstelsel [6](#page=6). * **Enterotoxines:** Actief in het maagdarmkanaal [6](#page=6). * **Dermatoxines:** Werken in op de huid [6](#page=6). * **Genitotoxines:** Tast urinewegen of geslachtsorganen aan [6](#page=6). * **Amnesiatoxines:** Leiden tot geheugenverlies, bijvoorbeeld door overmatig alcoholgebruik [6](#page=6). #### 2.2.4 Accumulatie van toxische stoffen in de voedselpiramide Persistente stoffen hebben een lange biologische halveringstijd en worden langzaam afgebroken. Hierdoor hopen ze zich op in het weefsel van het organisme, met name stoffen met een lipofiel karakter. Deze stoffen worden via de voedselketen doorgegeven aan andere organismen, waardoor de concentraties steeds hoger worden. Organismen aan het einde van de voedselketen, meestal vleeseters, worden dan aan de hoogste doses blootgesteld [6](#page=6). --- # Dosis-responsrelaties en toxicologische normen Dit deel verkent hoe de hoeveelheid van een stof gerelateerd is aan de mate van toxiciteit, inclusief acute en chronische toxiciteit, en de verschillende normen en limieten die worden gehanteerd in voeding en omgevingsveiligheid [7](#page=7). ### 3.1 Dosis-responsrelatie De dosis-responsrelatie beschrijft de relatie tussen de hoeveelheid van een stof (dosis) en het effect dat deze stof veroorzaakt op een organisme (respons). Dit wordt gezien als een glijdende schaal, niet als een zwart-wit situatie, met een minimale effect level. Bij geneesmiddelen kan er een therapeutische (gunstige), toxische (ongunstige) of zelfs dodelijke dosis zijn; een veilige medicinale stof heeft geen overlap tussen de therapeutische en dodelijke dosiscurven [7](#page=7). ### 3.2 Acute toxiciteit Acute toxiciteit betreft de gevolgen op korte termijn na eenmalige toediening van een stof. De maatstaf voor acute toxiciteit is de LD50-waarde [8](#page=8). #### 3.2.1 De LD50-waarde De Letale Dosis 50% (LD50) is de dosis waarbij 50% van de blootgestelde organismen overlijdt. Een lagere LD50-waarde duidt op een hogere toxiciteit. Deze waarde wordt uitgedrukt in microgrammen of milligrammen per kilogram levend weefsel. De LD50 vormt de basis voor veel toxicologische normen [8](#page=8). #### 3.2.2 Bezwaren tegen de LD50-test De LD50-test kent diverse bezwaren: 1. **Geen bruikbare waarde op zich:** De dodelijke dosis varieert sterk per individu, afhankelijk van de lichamelijke conditie en medische aandoeningen. Het is mogelijk om meer dan de LD50-dosis te overleven of minder dan de LD50-dosis te sterven. Meer specifieke criteria zijn de LDlo (Lethal Dose Low), de laagst gekende dosis met een dodelijke afloop, en de LD100 (Lethal Dose 100%), de dosis waarbij 100% sterft [9](#page=9). 2. **Gebaseerd op dierproeven:** Er zijn grote gevoeligheidsverschillen tussen soorten, waardoor de LD50-dosis altijd met vermelding van het testorganisme moet worden gegeven. Dit biedt geen garantie dat de cijfers voor dieren ook voor mensen gelden. Vaak wordt een veiligheidsfactor van 10 ingebouwd bij normstelling, hoewel mensen soms minder gevoelig zijn [9](#page=9). > **Voorbeeld:** Theobromine in chocolade is voor mensen relatief veilig (ongeveer 46,7 kg chocolade nodig om dodelijke dosis te bereiken), maar gevaarlijk voor kleine honden (ongeveer 1 kg chocolade kan al fataal zijn) [9](#page=9). 3. **Verschil in toedieningswijze:** De LD50 kan variëren afhankelijk van hoe de stof wordt toegediend (oraal, inademing, huid, injectie) [10](#page=10). 4. **Weinig informatie over niet-letale effecten:** De dodelijke dosis zegt weinig over de concentratie waarbij toxische effecten beginnen te manifesteren. Sommige chemicaliën hebben een hoge letale dosis, maar al bij een veel lagere dosis toxische effecten [10](#page=10). 5. **Ethisch bezwaar:** Er zijn ethische bezwaren tegen dierproeven met dodelijke afloop. Tegenwoordig wordt daarom zoveel mogelijk ingezet op in vitro onderzoek met celculturen en weefselfragmenten [10](#page=10). #### 3.2.3 Voorbeelden van acute toxiciteit Het is mogelijk om eerder te sterven aan watervergiftiging dan aan cafeïnevergiftiging, afhankelijk van factoren zoals het drinken op een lege maag en de persoonlijke drinkgeschiedenis [10](#page=10). ### 3.3 Chronische toxiciteit Chronische toxiciteit bestudeert de effecten van langdurige blootstelling aan een stof, ook bij herhaalde blootstelling gedurende beperkte tijd. Stoffen kunnen carcinogeen, mutageen of reprotoxisch zijn. De maatstaf hiervoor is de NOAEL-waarde [11](#page=11) [8](#page=8). #### 3.3.1 De NOAEL-waarde De No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) is de dosis (in milligram per kilogram lichaamsgewicht per dag) waarbij geen nadelige effecten worden vastgesteld. Deze waarde vormt de basis voor normen die gelden voor voeding. Het laagste niveau waarbij wel een effect wordt waargenomen, is de LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level) [11](#page=11). ### 3.4 Toxicologische normen in voeding Verschillende normen worden gehanteerd om de veiligheid van stoffen in voeding te waarborgen. #### 3.4.1 Aanvaardbare dagelijkse dosis (ADI) De Aanvaardbare Dagelijkse Dosis (ADI) is de maximale hoeveelheid van een stof die levenslang en dagelijks kan worden ingenomen zonder nadelige gevolgen voor de gezondheid. Deze wordt uitgedrukt in milligrammen (of microgrammen) per kilogram lichaamsgewicht per dag. De ADI geldt voor zowel bewust toegevoegde stoffen als contaminanten. Stoffen die kankerverwekkend zijn, krijgen geen ADI, omdat ze niet in voeding zouden mogen voorkomen [12](#page=12). De ADI wordt bepaald op basis van de NOAEL met een veiligheidsfactor van 1/100 (een factor van 1/10 voor mogelijke verschillen tussen dieren en mensen, en een factor van 1/10 voor gevoeligheid tussen mensen, met name voor kwetsbare groepen zoals kinderen, ouderen, zieken of zwangere vrouwen (YOPI - Young, Old, Pregnant, Immunocompromised) [12](#page=12). De berekening is dosis-afhankelijk van het lichaamsgewicht; een kind weegt minder dan een volwassene, dus de toegestane hoeveelheid per dag is lager [12](#page=12). #### 3.4.2 Maximale Residu Limiet (MRL) De Maximale Residu Limiet (MRL) is een productnorm die het wettelijk toegestane maximale restgehalte van een stof in of op levensmiddelen aangeeft. Deze norm wordt vastgesteld per specifieke stof-levensmiddelcombinatie. De MRL dient ter controle op misbruik van gewasbeschermingsmiddelen, biociden en diergeneesmiddelen. Het doel is dat zelfs bij het eten van grote hoeveelheden producten, de ADI van de consument niet wordt overschreden [12](#page=12). #### 3.4.3 Generally Recognized As Safe (GRAS) GRAS staat voor "Algemeen erkend als veilig" en is een term die door de Amerikaanse FDA wordt gebruikt. Het geeft aan dat een voedingsadditief door experts als veilig is bevonden voor gebruik in voeding, waardoor het is vrijgesteld van premarket review en goedkeuring door de FDA onder de voorwaarden van het beoogde gebruik. Dit principe sluit aan bij vertrouwelijkheid en heeft geen officiële waarde in Europa [13](#page=13). #### 3.4.4 Quantum Satis (QS) Quantum Satis is een Latijnse term die "zoveel als nodig is" betekent. Dit wordt gebruikt in de Europese levensmiddelenregelgeving voor additieven die niet schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid. Het betekent dat een additief in de benodigde hoeveelheid mag worden toegevoegd om het gewenste resultaat te bereiken, maar niet meer, om consumenten te beschermen tegen buitensporige en onnodige toevoegingen [13](#page=13). ### 3.5 Normen voor kinderen Zeer jonge kinderen zijn bijzonder gevoelig voor vreemde stoffen. Hun metabolisme (enzymen voor detoxicatiereacties) en uitscheidingsorganen zijn nog niet volledig ontwikkeld. Ook hebben ze nog lage gehalten aan eiwitten die vreemde stoffen binden in het bloed, en fysiologische barrières zoals de bloed-hersenbarrière zijn nog onvoldoende ontwikkeld. Hierdoor bestaan er specifieke wettelijke normen voor de voeding van baby's en peuters [14](#page=14). > **Voorbeeld:** Nitraat en nitriet. Baby's jonger dan 6 maanden hebben een lage maagzuurproductie, waardoor ze meer nitraat omzetten in nitriet. Nitriet bindt bij baby's beter aan eiwitten voor zuurstoftransport, wat kan leiden tot zuurstoftekort ("blauwe babysyndroom"). Daarom zijn geen additieven toegestaan in producten voor kinderen beneden 12 weken, en is het belangrijk om nitraatarm water te gebruiken voor flesvoeding [14](#page=14). ### 3.6 Wettelijke criteria met betrekking tot verontreinigingen Er bestaan wettelijke criteria en normen voor verontreinigingen in voeding en leefomgeving, waarvoor specifieke documentatie geraadpleegd kan worden [14](#page=14). ### 3.7 Accumulatie van toxische stoffen in de voedselpiramide Sommige toxische stoffen, zoals het insecticide DDT, worden langzaam gemetaboliseerd en hebben een lange biologische halveringstijd (geschat op 8 jaar). Deze stoffen kunnen zich ophopen in organismen, wat leidt tot biomagnificatie in de voedselketen [7](#page=7). De Bioconcentratiefactor (BCF) meet de mate waarin een stof in een organisme wordt geaccumuleerd [7](#page=7). > **Voorbeeld:** DDT concentreert zich van zoöplankton naar vissen, en vervolgens naar visarenden. Een beginconcentratie van 0,04 ppm kan leiden tot 1 ppm in vissen en wel 25 ppm in visarenden, wat een verrijking van 625 maal betekent. Hoge concentraties kunnen dodelijk zijn voor deze vogels, vooral als zij vermageren en opgeslagen vet, waarin DDT oplosbaar is, wordt verbruikt [7](#page=7). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Toxicologie | De wetenschap die onderzoek doet naar de schadelijke effecten op de gezondheid van mens en milieu van stoffen in onze voeding en in de leefomgeving. | | Toxine | Een gifstof of schadelijke substantie die schadelijke effecten kan veroorzaken op levende organismen. | | Antidotum | Een tegengif dat wordt gebruikt om de effecten van een toxine of vergiftiging op te heffen of te verminderen. | | Metabolisme | Het geheel van chemische processen die plaatsvinden in een levend organisme om leven in stand te houden, inclusief de omzetting van stoffen in het lichaam. | | Secretie | Het proces waarbij cellen of klieren stoffen afscheiden uit het lichaam, bijvoorbeeld via urine, zweet of gal. | | Synergetische effecten | Een effect dat optreedt wanneer de gecombineerde werking van twee of meer stoffen groter is dan de som van hun individuele effecten. | | Biochemische toxiciteit | Schadelijke effecten die zich manifesteren op het niveau van moleculen en cellulaire processen, zoals celbeschadiging. | | Fysiologische toxiciteit | Schadelijke effecten die de normale lichaamsfuncties beïnvloeden, zoals veranderingen in bloeddruk of ademhaling. | | Mutageen | Een stof die DNA kan beschadigen en daardoor erfelijke veranderingen kan veroorzaken. | | Carcinogeen | Een stof die kanker kan veroorzaken door ongecontroleerde celdeling en tumorgroei te stimuleren. | | Teratogeen | Een stof die afwijkingen kan veroorzaken bij een zich ontwikkelende foetus. | | Reprotoxisch | Een stof die negatieve effecten heeft op de vruchtbaarheid van een individu of schadelijk is voor een ongeboren kind. | | Lokale toxische respons | Een schadelijk effect dat optreedt op de plaats van direct contact met een toxische stof. | | Systemische toxische respons | Een schadelijk effect dat optreedt in een ander deel van het lichaam dan het punt van eerste contact met de toxische stof. | | Hepatotoxines | Stoffen die specifiek toxisch zijn voor de lever. | | Nefrotoxines | Stoffen die specifiek toxisch zijn voor de nieren. | | Neurotoxines | Stoffen die een schadelijk effect hebben op het zenuwstelsel. | | Voedselpiramide | Een hiërarchische weergave van de voedselketen, waarbij organismen aan het einde de hoogste concentraties van geaccumuleerde stoffen kunnen bevatten. | | Bioconcentratiefactor (BCF) | Een maat die aangeeft in welke mate een stof zich ophoopt in een organisme uit de omgeving, zoals water. | | Lipofiel | Een stof die goed oplost in vetten of vetachtige substanties, wat accumulatie in lichaamsweefsels kan bevorderen. | | Dosis-responsrelatie | De relatie tussen de hoeveelheid (dosis) van een blootgestelde stof en de ernst van het daaruit voortvloeiende effect. | | Acute toxiciteit | De schadelijke effecten die optreden op korte termijn na een enkele blootstelling aan een stof. | | LD50 (Letale Dosis 50%) | De dosis van een stof die naar verwachting 50% van een onderzochte populatie organismen zal doden. | | Chronische toxiciteit | De schadelijke effecten die optreden als gevolg van langdurige of herhaalde blootstelling aan een stof. | | NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) | Het hoogste niveau van blootstelling aan een stof waarbij geen nadelige effecten worden waargenomen. | | LOAEL (Lowest Observed Adverse Effect Level) | Het laagste niveau van blootstelling aan een stof waarbij een nadelig effect wordt waargenomen. | | Aanvaardbare Dagelijkse Dosis (ADI) | De maximale hoeveelheid van een stof die iemand levenslang dagelijks kan innemen zonder risico voor de gezondheid. | | Maximale Residu Limiet (MRL) | Het wettelijk toegestane maximale gehalte van een stof dat achterblijft in of op een levensmiddel. | | GRAS (Generally Recognized As Safe) | Een status toegekend aan substanties die door gekwalificeerde experts als veilig worden beschouwd voor beoogd gebruik in voeding, voornamelijk in de VS. | | Quantum Satis (QS) | Een Latijnse term die aangeeft dat een levensmiddelenadditief mag worden gebruikt in de hoeveelheid die nodig is om het gewenste effect te bereiken, zonder excessen. |

# Probehybridisatie en de basisprincipes ervan Probehybridisatie is een molebiologische techniek die berust op het principe van basencomplementariteit voor de specifieke detectie van een doelwitsequentie [5](#page=5). ### 1.1 Fundamenteel principe van probehybridisatie Het kerndoel van probehybridisatie is het identificeren en detecteren van een specifieke nucleïnezuursequentie (DNA of RNA) binnen een complex mengsel. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een complementaire, gemerkte enkelstrengs nucleïnezuurmolecule, de zogenaamde probe. De probe bindt specifiek aan zijn doelwitsequentie onder de juiste reactieomstandigheden [5](#page=5). #### 1.1.1 De probe Een probe is een enkelstrengs DNA- of RNA-molecule die specifiek ontworpen is om complementair te zijn aan de doelwitsequentie die gedetecteerd moet worden. Probes kunnen variëren in lengte en worden vaak chemisch gesynthetiseerd, hoewel enzymatische methoden ook mogelijk zijn [20](#page=20) [21](#page=21) [5](#page=5). > **Tip:** De keuze van de probe, inclusief lengte en GC-gehalte, beïnvloedt de bindingssterkte met het doelwit [20](#page=20). #### 1.1.2 Het doelwit Het doelwit van de hybridisatie is een enkelstrengs DNA- of RNA-sequentie. Als het doelwit dubbelstrengs DNA is, dient het eerst gedenatureerd te worden om het enkelstrengs te maken [11](#page=11) [5](#page=5). #### 1.1.3 Het hybridisatieproces Hybridisatie is het proces waarbij de gemerkte probe zich bindt aan de complementaire doelwitsequentie. Dit proces vindt plaats onder specifieke temperatuur- en zoutomstandigheden, die geoptimaliseerd zijn voor de specifieke probe-target combinatie [11](#page=11) [20](#page=20) [5](#page=5). ### 1.2 Methodes van hybridisatie Probehybridisatie kan worden uitgevoerd via verschillende methoden, afhankelijk van de toepassing en de aard van de dragers. #### 1.2.1 Hybridisatie in oplossing Hybridisatie in oplossing houdt in dat zowel de probes als de doelwitmoleculen vrij in de vloeibare fase aanwezig zijn. Dit kan worden toegepast in technieken zoals qPCR of bij target enrichment voorafgaand aan sequencing [5](#page=5). #### 1.2.2 Hybridisatie op een vaste drager Hybridisatie op een vaste drager is een veelgebruikte methode, waarbij het doelwit of de probes geïmmobiliseerd zijn op een vast oppervlak. Dit maakt het mogelijk om na de hybridisatie de niet-gebonden probes weg te wassen en het signaal van de gebonden probes te detecteren [5](#page=5) [9](#page=9). ##### 1.2.2.1 Membraan/Filterhybridisatie Bij membraanhybridisatie worden nucleïnezuren (meestal na denaturatie en transfer) op een membraan (zoals nylon of nitrocellulose) geblopt. Bekende voorbeelden zijn [12](#page=12) [9](#page=9): * **Southern blot:** Voor de detectie van DNA [10](#page=10) [9](#page=9). * **Northern blot:** Voor de detectie van RNA [12](#page=12). Het proces omvat doorgaans de volgende stappen: 1. **Denaturatie van het doelwit:** Om dubbelstrengs DNA om te zetten naar enkelstrengs [11](#page=11) [9](#page=9). 2. **Blotten:** Transfer van het enkelstrengs DNA of RNA naar een vast membraan. Methoden hiervoor zijn onder andere capillair, vacuüm, semi-droog en dot blotten [12](#page=12) [9](#page=9). 3. **Fixatie:** Het vastzetten van de geblotte nucleïnezuren op het membraan, vaak door verhitting (minimaal 80°C) of UV-belichting [17](#page=17). 4. **Prehybridisatie:** Het membraan wordt behandeld met niet-specifieke DNA-fragmenten (bv. salmon sperm DNA) om onbezette bindingsplaatsen op het membraan te bezetten en aspecifieke binding van de probe te voorkomen [18](#page=18). 5. **Hybridisatie:** Het membraan wordt geïncubeerd met de gemerkte probe onder geschikte omstandigheden [19](#page=19) [9](#page=9). 6. **Wassen:** Verwijderen van ongebonden en aspecifiek gebonden probe [9](#page=9). 7. **Detectie:** Visualisatie van de gebonden probe op basis van het gebruikte label [9](#page=9). > **Voorbeeld:** In een Southern blot wordt DNA uit een cellysate geëxtraheerd, gedenatureerd, geblot op een membraan, gehybridiseerd met een DNA-probe die specifiek is voor een bepaald gen, en vervolgens wordt de aanwezigheid van het gen gedetecteerd via het label van de probe [9](#page=9). ##### 1.2.2.2 Hybridisatie op een glazen drager Glazen dragers worden gebruikt in technieken waarbij de nucleïnezuren direct op het oppervlak worden geïmmobiliseerd, zoals bij in situ hybridisatie of microarrays [12](#page=12). * **In situ hybridisatie (ISH):** Hierbij wordt de hybridisatie uitgevoerd op weefselcoupes of cellen die zich nog op hun oorspronkelijke locatie bevinden. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) is een veelgebruikte variant [12](#page=12) [16](#page=16) [8](#page=8). ### 1.3 Merken en detectie van probes Probes moeten gemerkt zijn om detectie mogelijk te maken. De keuze van het label en de detectiemethode zijn cruciaal voor de gevoeligheid en specificiteit van de analyse [19](#page=19) [22](#page=22). #### 1.3.1 Types labels Er zijn verschillende soorten labels beschikbaar: * **Radioactieve labels:** Gebruiken radioactief gemerkte nucleotiden (bv. 35S, 33P). Detectie gebeurt via autoradiografie of phospho-imaging [23](#page=23) [36](#page=36) [37](#page=37). * **Fluorescente labels (fluorochromen):** Fluorescente gemerkte nucleotiden (bv. FITC, Cy3, Cy5). Detectie gebeurt met fluorescentiemicroscopen en CCD-camera's. Deze worden vaak gebruikt in FISH en microarrays [23](#page=23) [36](#page=36) [38](#page=38). * **Biotine-labels:** Biotine-16-dUTP wordt vaak gebruikt voor indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36) [39](#page=39). * **Digoxigenine-labels:** Digoxigenine-11-dUTP wordt ook gebruikt voor indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36) [39](#page=39). > **Tip:** Bij biotine- en digoxigenine-labels is een spacer nodig om sterische hinder te vermijden bij de herkenning van het label en de vorming van de dubbele helix [24](#page=24). #### 1.3.2 Methoden voor het inbouwen van labels Labels kunnen op verschillende manieren in probes worden ingebouwd: * **Chemische synthese:** Labels kunnen tijdens de synthese van oligonucleotiden worden ingebouwd [21](#page=21). * **Enzymatische synthese:** * **PCR met labeling:** Merking kan plaatsvinden met gemerkte primers (eindstandig) of gemerkte dNTP's (intern) [25](#page=25) [26](#page=26). * **Nick-translatie:** Gebruikt DNAse I en DNA-polymerase I om nieuwe, gemerkte nucleotiden in te bouwen in dsDNA [25](#page=25) [27](#page=27). * **Random primed labeling:** Het DNA wordt gedenatureerd en gehybridiseerd met random oligonucleotiden, gevolgd door in vitro verlenging met gemerkte dNTP's [25](#page=25) [28](#page=28) [29](#page=29). * **Eind labeling:** Met enzymen zoals T4 polynucleotide kinase (voor radioactieve labels) of terminaal transferase (voor het toevoegen van dNTP's aan het 3'-uiteinde) [25](#page=25) [30](#page=30) [31](#page=31). * **RNA probe bereiding:** Via in vitro transcriptie van gekloneerd DNA [25](#page=25) [33](#page=33) [34](#page=34). #### 1.3.3 Detectiemethoden De detectie van het label hangt af van het type label dat gebruikt is: * **Directe detectie:** Voor radioactieve en fluorescente labels [36](#page=36). * **Indirecte detectie:** Vaak gebruikt voor biotine en digoxigenine. Hierbij wordt een reporter molecule (bv. een enzym zoals HRP of AP, colloïdaal goud, of een fluorochroom) gebonden aan een antilichaam dat specifiek het label herkent [36](#page=36) [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41). ##### 1.3.3.1 Reporters en zichtbaar maken van het signaal Bij indirecte detectie worden reporters gebruikt om het signaal zichtbaar te maken. Gangbare reporters zijn [39](#page=39): * **Enzymen:** * **Horse radish peroxidase (HRP):** Kan reageren met chromogenen (bv. DAB, AEC, TMB) of chemiluminogenen (bv. luminol). De reactie kan ook versterkt worden met bijvoorbeeld diacylhydrazide [44](#page=44) [45](#page=45) [46](#page=46). * **Alkalische fosfatase (AP):** Reageert met chromogenen (bv. BCIP met NBT) of chemiluminogenen (bv. AMPPD, CSPD). De ECL (Enhanced Chemiluminescence) reactie kan de gevoeligheid aanzienlijk verhogen [44](#page=44) [47](#page=47) [48](#page=48). * **Colloïdaal goud:** Geeft een zichtbare kleur [39](#page=39). * **Fluorochromen:** Gebruikt met de juiste detectieapparatuur [39](#page=39). > **Tip:** Bij een laag aantal doelwitmoleculen kan signaalversterking essentieel zijn om detectie mogelijk te maken. Dit kan door het gebruik van meer labels of reporters per probe, signaalamplificatie met steptavidine-biotine-complexen, of (elektro)chemiluminescentie [43](#page=43). ### 1.4 Algemene overwegingen bij probehybridisatie Bij probehybridisatie is het essentieel om aandacht te besteden aan de reactieomstandigheden en het wasproces. * **Optimalisatie van reactieomstandigheden:** De binding van de probe aan het doelwit wordt beïnvloed door factoren zoals temperatuur, zoutconcentratie, lengte van de probe en GC-gehalte [20](#page=20). * **Wassen:** Grondig wassen na de hybridisatie is cruciaal om aspecifieke binding te verwijderen en een hoge signaal-ruisverhouding te verkrijgen [49](#page=49). * **Fixatie van DNA:** Zorg voor adequate fixatie van het DNA op de drager om verlies tijdens de procedure te voorkomen [17](#page=17). * **Blokkering:** Behandeling met een eiwitrijke oplossing kan nodig zijn om te voorkomen dat detectiereagenten (zoals streptavidine) direct op het membraan binden [43](#page=43). --- # Synthese, modificatie en detectie van probes en labels Dit deel behandelt de synthese, het aanbrengen van labels en de detectiemethoden van probes en primers, zowel via chemische als enzymatische routes [20](#page=20). ### 2.1 Principes van probes en primers Probes en primers worden onderscheiden door hun lengte en bereidingsmethode [20](#page=20). * **Primers:** * Lengte: typisch 19-25 nucleotiden [20](#page=20). * Bereiding: chemische synthese [20](#page=20). * Labeling: kunnen gemerkt worden met bijvoorbeeld fluorescente of biotine-labels [20](#page=20). * Interactie: hun interactie met het target kan versterkt worden door de inbouw van MGB (Minor Groove Binder) of LNA (Locked Nucleic Acid) [20](#page=20). * **Probes:** * Lengte: variabele grootte [20](#page=20). * Bereiding: chemische synthese of enzymatische bereiding (bijvoorbeeld via PCR of kloneren) [20](#page=20). * Labeling: kunnen gemerkt worden met fluorochroom, biotine of digoxigenine [20](#page=20). * Interactie: de interactie met het target kan versterkt worden met 3’MGB of LNA-inbouw [20](#page=20). Bindingsterkte van een probe aan zijn target is afhankelijk van de lengte van de probe en het GC-gehalte [20](#page=20). ### 2.2 Bereiding van probes #### 2.2.1 Chemische synthese van oligo's Chemische synthese maakt het mogelijk om oligo's te produceren met een lengte tot wel 100 nucleotiden, hoewel langere oligo's aanzienlijk duurder worden. De meest gebruikte methode is de fosforamidietmethode, waarbij nucleotiden één voor één worden opgebouwd [21](#page=21). Tijdens de synthese kunnen de oligo's worden gemerkt door de inbouw van gemerkte dNTP's, zoals FITC-dUTP, Cy3-dUTP, DIG-dUTP of biotine-dUTP. Dit brengt echter extra kosten met zich mee. Alternatieven voor de standaard dNTP's, zoals ddNTP (dideoxynucleotide) of LNA, kunnen ook worden ingebouwd. Deze oligo's kunnen zowel als primer als probe dienen en worden doorgaans door gespecialiseerde bedrijven vervaardigd [21](#page=21). #### 2.2.2 Enzymatische synthese van probes Enzymatische methoden voor de bereiding van probes omvatten verschillende technieken, waaronder PCR, nick-translatie, random priming, eindlabeling en RNA-probe synthese via transcriptie [25](#page=25). * **PCR met eindstandige labeling:** Hierbij wordt een gemerkte primer gebruikt [25](#page=25). * **PCR met interne labeling:** Hierbij worden gemerkte dNTP's gebruikt die in de PCR-producten worden ingebouwd [25](#page=25). * **Merking op dsDNA achteraf:** * **Nick-translatie:** Bij deze methode wordt dsDNA behandeld met DNAse I, wat leidt tot enkelstrengige breuken. Vervolgens katalyseert DNA polymerase I de 3'-verlenging en een 5'-overschrijving met gemerkte nucleotiden [27](#page=27). * **Random priming labeling:** Deze methode omvat de denaturatie van DNA-fragmenten, gevolgd door annealing met willekeurige oligonucleotiden (6 nt). Vervolgens vindt *in vitro* verlenging plaats door DNA polymerase, zoals Klenow fragment, met de toevoeging van gemerkte dNTP's/dUTP's [29](#page=29). * **Eind labeling met een PNK (fosforylatie):** Dit proces wordt uitgevoerd met T4 polynucleotide kinase na defosforylatie, wat resulteert in een 5'-fosfaatgroep. Deze methode wordt voornamelijk gebruikt voor radioactieve labeling [30](#page=30). * **Eind labeling met een terminaal transferase:** Dit enzym kan gemerkte dNTP's aan de 3'-uiteinden van DNA-strengen toevoegen. Een uitdaging hierbij kan zijn dat de sequentie van de probe niet direct wordt gemarkeerd. Dit kan worden opgelost door te werken met een dideoxy-NTP, waardoor de ketenstop wordt geïnduceerd na incorporatie van één gemerkte nucleotide [31](#page=31) [32](#page=32). * **Bereiding van RNA probes via transcriptie:** RNA probes kunnen worden gemaakt door transcriptie van gekloneerd DNA [25](#page=25). * **Run-off transcriptie:** Een plasmide met een SP6 promotor wordt gekloneerd en na insert gelineariseerd met een restrictie-enzym. Vervolgens vindt *in vitro* transcriptie plaats met SP6 polymerase, NTP's en gemerkte NTP's om een gemerkte RNA probe te produceren [34](#page=34). ### 2.3 Inbouw en detectie van labels in probes Verschillende soorten labels kunnen in probes worden ingebouwd voor detectiedoeleinden. De keuze van het label bepaalt mede de detectiemethode [23](#page=23). * **Radioactief gemerkte dNTP's:** Deze maken directe detectie mogelijk [23](#page=23) [36](#page=36). * **Fluorescent gemerkte dNTP's:** Deze kunnen zowel voor directe als indirecte detectie worden gebruikt [23](#page=23) [36](#page=36). * **Biotine-16-dUTP:** Dit label vereist indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36). * **Digoxigenine-11-dUTP:** Dit label vereist eveneens indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36). Bij het gebruik van biotine of digoxigenine is de inbouw van een spacer essentieel om sterische hinder te voorkomen. Dit is belangrijk voor de herkenning van het label en voor de vorming van de dubbele helix [24](#page=24). #### 2.3.1 Detectiemethoden De detectiemethoden zijn afhankelijk van het type label dat in de probe is ingebouwd [36](#page=36). * **Directe detectie:** * **Radioactiviteit:** * **Autoradiografie:** Maakt gebruik van röntgengevoelige films [37](#page=37). * **Phospho-imaging:** Een directere methode die herbruikbaar is [37](#page=37). * **Fluorochromen:** * Deze worden gedetecteerd met fluorescentiemicroscopen en CCD-camera's [38](#page=38). * Toepassingen omvatten FISH (fluorescente in situ hybridisatie) met labels zoals FITC, TRIT, AMCA [38](#page=38). * In microarrays worden labels als CY3 en CY5 gebruikt [38](#page=38). * Voor real-time PCR (qPCR) worden labels zoals JOE, FAM, HEX, TAMRA, CY3, CY5 ingezet [38](#page=38). * Fluorochromen worden over het algemeen niet toegepast in membraanhybridisaties [38](#page=38). * **Indirecte detectie:** * **Digoxigenine en biotine:** Deze labels worden altijd indirect gedetecteerd met behulp van reporters [39](#page=39). * **Reporters:** Dit kunnen enzymen (AP en HRP), colloïdaal goud of fluorochromen zijn [39](#page=39). * **Signaalamplificatie:** Om een detecteerbaar signaal te verkrijgen bij een laag aantal targets, kunnen methoden zoals signaalamplificatie met een streptavidine-biotine complex worden gebruikt. Ook (elektro)chemiluminescentie kan worden ingezet. Bij een laag aantal targets kan het ook helpen om meer labels of reporters per probe te gebruiken [42](#page=42) [43](#page=43). * **Blokkering:** Bij indirecte detectie is het cruciaal om te blokkeren met een eiwitrijke oplossing om te voorkomen dat antilichamen of streptavidine direct op het membraan binden [43](#page=43). * **Biotine detectie met antilichamen:** Biotine kan ook worden gedetecteerd met behulp van specifieke antilichamen [40](#page=40). #### 2.3.2 Reporters zichtbaar maken * **Enzymen:** * **HRP (Horse Radish Peroxidase):** * Kan een chromogene reactie geven met oplosbare of onoplosbare chromogenen (bv. DAB, AEC, TMB) [44](#page=44). * Kan ook chemiluminescentie produceren met een chemiluminogeen (bv. luminol) [44](#page=44). * HRP-ECL (Enhanced Chemiluminescence) met luminol is ongeveer 1000 keer gevoeliger in de aanwezigheid van diacylhydrazide [46](#page=46). * **AP (Alkalische Fosfatase):** * Geeft een kleurreactie met BCIP plus NBT (oplosbaar chromogeen) [44](#page=44) [47](#page=47). * Kan chemiluminescentie produceren met AMPPD, CSPD, of LuminoPhos. AP-ECL met AMPPD is ongeveer 400 keer gevoeliger in de aanwezigheid van CTAB en een fluoresceïnederivaat [44](#page=44) [48](#page=48). Bij de detectie van labels is de juiste hybridisatie-temperatuur (Th) en -tijd cruciaal, gevolgd door grondig wassen [49](#page=49). --- # Hybridisatiecondities en specificiteit Dit onderwerp verkent de optimale omstandigheden voor hybridisatie, inclusief factoren die de bindingssterkte beïnvloeden, het concept van stringentie en methoden om specificiteit te waarborgen tijdens de wasstappen. ### 3.1 Factoren die de hybridisatie beïnvloeden De hybridisatie van een probe met zijn target (DNA of RNA) wordt beïnvloed door diverse factoren die de stabiliteit en specificiteit van de hybride bepalen [50](#page=50). #### 3.1.1 Concentratie van probe en target De concentraties van de probe en het target zijn gecorreleerd. Bij een zeer laag aantal targets wordt een lage concentratie van de probe gebruikt, wat resulteert in een relatieve overmaat van de probe. De probe bindt aan lineair, enkelstrengs doelwit DNA of RNA [50](#page=50). #### 3.1.2 Eigenschappen van de probe en het target De binding van de probe wordt bepaald door: * **Grootte en GC-gehalte:** Grotere moleculen en een hoger percentage Guanine-Cytosine (GC) basenparen verhogen de bindingssterkte [50](#page=50). * **Basevolgorde:** De specifieke sequentie van de basen is cruciaal voor complementaire binding [50](#page=50). * **Type probe:** Het onderscheid tussen DNA/DNA, DNA/RNA en RNA/RNA hybriden heeft invloed op de hybridisatiecondities [57](#page=57). #### 3.1.3 Reactiecondities De omgevingsfactoren tijdens de reactie spelen een significante rol. Dit omvat [50](#page=50): * **Temperatuur:** Temperatuur is een sleutelfactor die de stabiliteit van de hybride beïnvloedt [50](#page=50). * **Stoffen in de omgeving:** Verschillende stoffen kunnen de helixvorming beïnvloeden [50](#page=50). * **Tijdsduur:** De duur van de hybridisatie is eveneens een belangrijke parameter [50](#page=50). ### 3.2 Hmax en kruishybridisatie * **Hmax** staat voor de maximale belading van het target met probe. De hoeveelheid probe wordt gekozen in het lineaire gebied van de verzadigingscurve om kruishybridisatie tegen te gaan [53](#page=53). * **Match:** Treedt op wanneer alle basen van de probe perfect hybridiseren met het target [53](#page=53). * **Kruishybridisatie:** Vindt plaats wanneer niet alle basen van de probe hybridiseren met het target, wat duidt op de aanwezigheid van één of meerdere mismatches [53](#page=53). > **Tip:** De probe concurreert met de oorspronkelijke complementaire streng voor renaturatie. De probe-target interactie is gemakkelijker dan target-target renaturatie vanwege de lengte en de overmaat van de probe [55](#page=55). ### 3.3 Stringentie en specificiteit Stringentie verwijst naar de reactiecondities waaronder de hybridisatie plaatsvindt. Het percentage mismatch en de stringentie bepalen samen de specificiteit van de probe-target binding [53](#page=53) [56](#page=56). #### 3.3.1 Hoge stringentie Bij hoge stringentie wordt alleen een stabiele hybride gevormd met 0% mismatch. De hybridisatietemperatuur ligt hierbij minimaal 5°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). #### 3.3.2 Lage stringentie Bij lage stringentie wordt ook een stabiele hybride gevormd in de aanwezigheid van mismatches. De hybridisatietemperatuur ligt hierbij 15°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). #### 3.3.3 De smelttemperatuur ($T_m$) De smelttemperatuur is de temperatuur waarbij 50% van de hybriden is gedissocieerd. Een empirische berekening voor DNA/DNA hybriden met probes $\ge$ 100 bp is: $$T_m = 81.5 + 0.41(\%GC) – 600/l – 1.5(\%mismatch) + 16.6 (\log_{10} Na^+) – 63(\%formamide) (°C)$$ Deze formule is niet geldig voor DNA/RNA of RNA/RNA hybriden, noch bij gebruik van LNA (Locked Nucleic Acid) of MGB (Minor Groove Binder) probes. De hybridisatietemperatuur kan verlaagd worden door aanpassing van de formamide- of zoutconcentratie. Voor *in situ* hybridisatie (ISH) wordt altijd een temperatuur van 37°C aangehouden. De stringentie tijdens de wasstappen is ook afhankelijk van de $T_m$ [57](#page=57). #### 3.3.4 Factoren die de stringentie verhogen De stringentie kan worden verhoogd door: * Verlaging van de zoutconcentratie [58](#page=58). * Verhoging van de pH [58](#page=58). * Verhoging van de formamideconcentratie [58](#page=58). * Verhoging van de temperatuur [58](#page=58). > **Tip:** Tijdens de hybridisatie kan gekozen worden voor hoge of matige stringentie (ongeveer $T_m - 25°C$). Achteraf worden kruishybriden (met mismatches) weggewassen bij hoge stringentie [58](#page=58). ### 3.4 Toepassingen en overwegingen * **Detectie van mutaties:** Bij de detectie van mutaties kan een percentage mismatch toegestaan worden, afhankelijk van de gekozen stringentie [56](#page=56). * **Detectie van verwante genotypen:** Bij de detectie van aan virussen verwante genotypen of families van virussen is het mogelijk dat een percentage mismatch ontstaat [56](#page=56). ### 3.5 Componenten van de hybridisatiebuffer De hybridisatiebuffer kan diverse componenten bevatten ter verbetering van de probe-target interactie en stabiliteit [59](#page=59): * **Citraatbuffer en Denhardt's reagentia:** Bevatten Ficoll 400, polyvinylpyrrolidon 40, en BSA (Bovine Serum Albumin) [59](#page=59). * **Volume exclusion:** Verbetert de probe interactie via dextraansulfaat, PEG 6000-8000, of PVP 40 [59](#page=59). * **DTT (Dithiothreitol):** Heeft reducerende eigenschappen [59](#page=59). * **DMSO (Dimethylsulfoxide):** Vermindert interne hairpin structuren in nucleïnezuren [59](#page=59). * **Triton X100, SDS, Tween-20:** Bevorderen de diffusie van componenten binnen cellen [59](#page=59). * **RNAse inhibitor:** Essentieel bij RNA hybridisaties [59](#page=59). ### 3.6 Hybridisatietijd en C0t½ De hybridisatietijd hangt af van de specifieke situatie, inclusief de stringentie, het percentage mismatch en de lengte van de probe. Een richtlijn is twee tot driemaal de C0t½ waarde. De incubatietijd kan variëren van enkele tientallen seconden tot overnachting, vooral bij lange probes [60](#page=60). De C0t½ (concentratie van het reagens maal tijd voor half-renaturatie) wordt empirisch berekend met de volgende formule: $$C0t_{\frac{1}{2}} (\text{uur}) = 2 \cdot (\frac{1}{x} \cdot \frac{y}{5} \cdot \frac{z}{10})$$ waarbij: * $x$ = gewicht van de toegevoegde probe in microgram [60](#page=60). * $y$ = complexiteit van de probe uitgedrukt in kilobasen (Kb) [60](#page=60). * $z$ = reactievolume in milliliters (ml) [60](#page=60). ### 3.7 Afwerking en hergebruik Na detectie worden signalen vastgelegd met scintillogrammen, luminometers of tegenwoordig voornamelijk digitale imager systemen. Bewaarcondities zijn koel en donker. Nylonmembranen zijn herbruikbaar voor nieuwe hybridisatierondes (reprobing) [61](#page=61). ### 3.8 Samenvatting van de hybridisatieprocedure 1. **Denaturatie:** Het doelwit en de probe moeten gedenatureerd worden om enkelstrengs structuren te verkrijgen [62](#page=62). 2. **Hybridisatie:** Hybridisatie vindt plaats met de gelabelde probe onder condities die aangepast zijn aan de probe en het doel [62](#page=62). 3. **Wassen:** Wassen is noodzakelijk om niet-specifieke bindingen en kruishybriden te verwijderen [62](#page=62). 4. **Wassen bij smelttemperatuur:** Wassen dicht bij de smelttemperatuur verhoogt de specificiteit door instabiele hybriden te verwijderen [62](#page=62). 5. **Detectie:** De detectie hangt af van het type label dat op de probe is aangebracht [62](#page=62). --- # Afgeleide hybridisatietechnieken en hun toepassingen Dit overzicht behandelt diverse afgeleide hybridisatietechnieken en hun toepassingen in diagnostiek en onderzoek, variërend van eenvoudige dot blots tot complexe in situ hybridisaties [64](#page=64). ### 4.1 Algemene principes van hybridisatietechnieken Hybridisatietechnieken maken gebruik van het principe van complementaire baseparing om specifieke nucleïsche zuursequenties te detecteren. Hierbij wordt een gelabelde enkelstrengs probe gebruikt die hybridiseert met een complementaire doelsequentie (DNA of RNA) op een membraan of binnen cellen/weefsels (#page=65, 80) [65](#page=65) [80](#page=80). ### 4.2 Dot blot De dot blot is een eenvoudige membraanhybridisatietechniek waarbij DNA- of RNA-monsters direct op een filter worden aangebracht in de vorm van "dots". Na denaturatie kan een gelabelde probe hybridiseren met de doelsequentie. Deze techniek wordt onder andere gebruikt voor detectie [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67). ### 4.3 Colony and Plaque Lift Colony lift en plaque lift zijn technieken die worden gebruikt om specifieke klonen te detecteren in een populatie van bacteriële kolonies of faag plaques (#page=67, 68). Het proces omvat de transfer van kolonies/plaques naar een filter, gevolgd door DNA-release, denaturatie, prehybridisatie, hybridisatie met een gelabelde probe, en detectie [67](#page=67) [68](#page=68). ### 4.4 Southern blot Southern blotting is een techniek voor de detectie van specifieke DNA-sequenties in een DNA-monster. Hierbij wordt DNA eerst gedenatureerd, op een gel geplaatst, en vervolgens overgebracht (geblot) naar een membraan. Een gelabelde probe hybridiseert vervolgens met de doel-DNA-sequentie [70](#page=70). #### 4.4.1 Toepassingen van Southern blot Southern blot heeft diverse klinische en genetische toepassingen: * **Repeat expansie:** Detectie van repetitieve DNA-sequenties die kunnen wijzen op bepaalde genetische aandoeningen [72](#page=72). * **Ziekte van Huntington:** Een voorbeeld van een genetische ziekte die met Southern blot kan worden gedetecteerd [73](#page=73). * **Genetische manipulatie:** Screening naar onbedoeld geïntroduceerd rDNA in genetisch gemodificeerde planten [74](#page=74). * **Typing/fingerprinting:** Identificatie van bacteriële stammen op basis van de verplaatsing van insertion sequences (transposons) en het bepalen van graden van verwantschap (#page=78, 79) [78](#page=78) [79](#page=79). ### 4.5 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) RFLP, in combinatie met Southern blot, wordt gebruikt voor de detectie van polymorfismen in DNA-sequenties [75](#page=75). #### 4.5.1 Toepassingen van RFLP * **Detecteren van SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms):** Dit gebeurt door het gebruik van restrictie-enzymen (RE) die gevoelig zijn voor specifieke nucleotidenvariaties (#page=75, 76) [75](#page=75) [76](#page=76). * **Detecteren van specifieke methylatie:** Dit vereist het gebruik van methylatie-gevoelige restrictie-enzymen [75](#page=75). * **Detecteren van andere mutaties:** RFLP kan ook worden ingezet voor de detectie van diverse andere DNA-mutaties [77](#page=77). ### 4.6 Northern blot Northern blotting is de tegenhanger van Southern blot voor de detectie van RNA-sequenties, met name messenger RNA (mRNA). Het wordt gebruikt om de relatieve aanwezigheid en expressie van genen te bestuderen, inclusief verschillende isovormen van een gen (#page=70, 71). Een voorbeeld is de vergelijking van genexpressie in pancreasweefsel en pancreas kanker, waarbij verschillende isovormen van EGFR detecteerbaar zijn [70](#page=70) [71](#page=71). ### 4.7 FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) en ISH (In Situ Hybridisation) FISH en ISH zijn technieken die hybridisatie toepassen binnen een morfologische context, zoals specifieke weefsels of celtypes. De doelwitmoleculen kunnen DNA of RNA zijn [80](#page=80). #### 4.7.1 Principes en voorbereiding * **Target:** DNA of RNA [80](#page=80). * **Merking probe:** Probes kunnen fluorescerend zijn (voor FISH, detectie met fluorescentiemicroscoop) of gemerkt met biotine (detectie via streptavidine- of enzymconjugaat) [80](#page=80). * **Preparaten:** Technieken zijn toepasbaar op metafase chromosomen, interfasepraeparaten, cytospins, weefselcoupes en biofilms [83](#page=83). * **Voorbehandeling:** Essentiële stappen omvatten fixatie van preparaten, target vrijmaken met proteasen, permeabilisatie van cellen met vetoplossende middelen, en DNAse/RNAse behandeling afhankelijk van het doelwit [89](#page=89). * **Hybridisatie en wassen:** Vereist het bereiken van de juiste stringentie bij een geschikte temperatuur [89](#page=89). * **Detectie:** Met fluorescentiemicroscopie voor FISH, of via enzymatische reacties voor biotine-gemerkte probes [80](#page=80). #### 4.7.2 Toepassingen van FISH en ISH * **Detectie van specifieke DNA-sequenties:** Opsporen van cellen met DNA-afwijkingen, zoals chromosomale afwijkingen (translocaties, amplificaties, deleties) in oncologie (#page=85, 94) [85](#page=85) [94](#page=94). * **Microbiële screening:** PNA-FISH screening op bloed of biofilms om specifieke bacteriën te identificeren op basis van rRNA-targets (#page=85, 86) [85](#page=85) [86](#page=86). * **Genexpressiebeeldvorming:** Visualisatie van genexpressiepatronen (locatie en celtype) in multicellulaire organismen en weefsels met mRNA-specifieke FISH (#page=85, 87) [85](#page=85) [87](#page=87). * **Diagnostiek in oncologie:** Bepaling van genamplificaties, zoals de HER2-genamplificatie bij borstkanker, door de verhouding HER2/CEN17 te meten (#page=96, 97) [96](#page=96) [97](#page=97). #### 4.7.3 Praktische overwegingen bij FISH * **Controles:** Zowel positieve (probe detecteert gewenst doel) als negatieve (zonder probe, om autofluorescentie te controleren) controles zijn essentieel [91](#page=91). * **Automatisering:** Hoewel vaak handmatig uitgevoerd, bestaan er gedeeltelijk en volledig geautomatiseerde systemen [91](#page=91). * **Probe types:** Gebruik van totale probes, centromeer-specifieke probes, of gen-specifieke probes is mogelijk [92](#page=92). * **Uitdagingen:** Balans is vereist tussen behoud van DNA/RNA-targets en snelle fixatie/processing. Problemen kunnen ontstaan door loslaten van coupes, diffusie, onvoldoende gevoeligheid van probes, uitspoeling, basenverlies (depurinering) en verlies van celmorfologie [98](#page=98). ### 4.8 LIPA (Line Probe Assay) LIPA is een reverse hybridisatietechniek die wordt toegepast als omgekeerde hybridisatie. Verdere details over LIPA zelf zijn niet gespecificeerd binnen de verstrekte pagina's [63](#page=63). ### 4.9 DNA micro-array DNA micro-array is eveneens een reverse hybridisatietechniek. Verdere details over DNA micro-arrays zelf zijn niet gespecificeerd binnen de verstrekte pagina's [63](#page=63). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Probehybridisatie | Een moleculair-biologisch techniek waarbij een gemerkte enkelstrengs nucleïnezuursequentie (de probe) bindt aan een complementaire doelwitsequentie (DNA of RNA) onder specifieke omstandigheden. Dit proces is de basis voor het detecteren van specifieke nucleïnezuursequenties. | | Enkelstrengs DNA (ssDNA) | Een DNA-molecuul dat bestaat uit slechts één polynucleotideketen, in tegenstelling tot dubbelstrengs DNA (dsDNA) dat uit twee complementaire ketens bestaat. | | Dubbelstrengs DNA (dsDNA) | Een DNA-molecuul dat bestaat uit twee complementaire polynucleotideketens die spiraalsgewijs om elkaar heen gewikkeld zijn, met basenparen verbonden door waterstofbruggen. | | Denaturatie | Het proces waarbij de dubbele helix van DNA wordt gesplitst in twee enkelstrengse ketens, meestal door verhitting of chemische middelen. Dit is essentieel om een probe te laten binden aan een DNA-doelwit. | | Blotten | Een techniek om nucleïnezuren (DNA of RNA) of eiwitten van een gel naar een vast membraan (zoals nitrocellulose of nylon) over te brengen voor verdere analyse, zoals hybridisatie. | | Nylonmembraan | Een veelgebruikt synthetisch polymeermembraan dat wordt gebruikt voor het vangen van nucleïnezuren tijdens blotting procedures, vanwege zijn stabiliteit en bindingscapaciteit. | | Prehybridisatie | Een stap in de blotting procedure die wordt uitgevoerd na het blotten en fixeren, en voor de hybridisatie met de gemerkte probe. Het doel is om onbezette bindingsplaatsen op het membraan te blokkeren met niet-specifiek DNA of RNA om aspecifieke binding van de probe te voorkomen. | | Hybridisatie | Het proces waarbij twee complementaire enkelstrengse nucleïnezuurmoleculen (zoals DNA met DNA, RNA met RNA, of DNA met RNA) aan elkaar binden onder specifieke zout- en temperatuurcondities om een dubbelstrengs structuur te vormen. | | Label | Een detecteerbaar molecuul dat aan een probe is gekoppeld, waardoor de probe na hybridisatie kan worden gedetecteerd. Voorbeelden zijn radioactieve isotopen, fluorescentie-kleurstoffen, biotine of digoxigenine. | | Probes | Korte, enkelstrengse nucleïnezuursequenties (DNA of RNA) die zijn ontworpen om complementair te zijn aan een specifieke doelwitsequentie. Ze zijn gemerkt met een label om detectie mogelijk te maken na hybridisatie. | | Chemische synthese | Een methode om oligo-nucleïden te produceren in een laboratorium door sequentiële toevoeging van nucleotiden, vaak gebruikt voor het maken van korte, specifieke probes en primers. | | Enzymatische synthese | Een methode om probes te produceren met behulp van enzymen, zoals DNA-polymerasen, reverse transcriptase of RNA-polymerasen, vaak gebruikmakend van een template of een gekloneerd gen. | | Radioactief label | Een label dat bestaat uit een radioactieve isotoop (bv. $^32$P, $^35$S) die aan een probe is gekoppeld. Detectie gebeurt meestal via autoradiografie of phospho-imaging. | | Fluorescent label | Een label dat bestaat uit een molecuul dat licht uitzendt wanneer het wordt aangeslagen met licht van een specifieke golflengte. Detectie gebeurt met fluorescentiemicroscopen of CCD-camera's. | | Biotine | Een vitamine die vaak als label wordt gebruikt. Biotine-gemerkte probes worden indirect gedetecteerd met behulp van streptavidine-enzymcomplexen of streptavidine-fluorescentieconjugaten. | | Digoxigenine | Een steroïde hormoon dat vaak als label wordt gebruikt. Digoxigenine-gemerkte probes worden indirect gedetecteerd met behulp van antilichamen tegen digoxigenine die gekoppeld zijn aan enzymen of fluorescentie-moleculen. | | Indirecte detectie | Een detectiemethode waarbij de probe niet direct detecteerbaar is, maar een tussenliggend molecuul (reporter) nodig is dat aan de probe is gekoppeld en dat vervolgens zichtbaar wordt gemaakt met een substraat of een ander detectiesysteem. | | Signaalamplificatie | Technieken die worden gebruikt om het signaal van een gedetecteerde probe te versterken, waardoor detectie van lage hoeveelheden doelwit mogelijk wordt. Voorbeelden zijn de streptavidine-biotine complex methode of chemiluminescentie. | | Reporterenzym | Een enzym dat wordt gekoppeld aan een detective molecule (zoals een antilichaam of streptavidine) om na binding aan de probe een detecteerbaar signaal te genereren, bijvoorbeeld door het omzetten van een chromogeen of chemiluminogeen substraat. | | Chromogeen | Een stof die een kleur produceert wanneer deze door een enzym wordt omgezet. | | Chemiluminogeen | Een stof die licht produceert wanneer deze door een enzym wordt omgezet, wat resulteert in een chemiluminescent signaal. | | Stringentie | De mate van specificiteit van de binding tijdens hybridisatie. Hoge stringentie vereist perfecte of bijna perfecte complementariteit tussen probe en doelwit, terwijl lage stringentie ook hybriden met enkele mismatches toestaat. | | Tm (Smeltemperatuur) | De temperatuur waarbij 50% van de dubbelstrengs DNA-moleculen is gedenatureerd tot enkelstrengse moleculen. Het is een belangrijke parameter voor het bepalen van de juiste hybridisatie- en wascondities. | | RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) | Een techniek die gebruik maakt van restrictie-enzymen om DNA te knippen en vervolgens de lengteverschillen tussen fragmenten te analyseren via Southern blot. Deze verschillen kunnen optreden door polymorfismen of mutaties in het DNA. | | Southern blot | Een techniek om specifieke DNA-sequenties te detecteren. DNA wordt opgelost, geëlektroforeerd, op een membraan geblott, en vervolgens gehybridiseerd met een complementaire, gelabelde probe. | | Northern blot | Een techniek om specifieke RNA-sequenties te detecteren. RNA wordt opgelost, geëlektroforeerd, op een membraan geblott, en vervolgens gehybridiseerd met een complementaire, gelabelde probe. Wordt gebruikt om genexpressie te bestuderen. | | FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) | Een techniek die fluorescent gelabelde probes gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties direct in hun natuurlijke omgeving te lokaliseren binnen cellen, weefsels of chromosomen. | | ISH (In Situ Hybridisation) | Een algemene term voor hybridisatietechnieken die worden uitgevoerd op intacte cellen of weefsels om de locatie van specifieke nucleïnezuursequenties te bepalen. FISH is een veelvoorkomende vorm van ISH die fluorescentie gebruikt. | | Metafase preparaat | Een preparaat dat metafase chromosomen bevat, de meest gecondenseerde vorm van chromosomen tijdens celdeling. Dit wordt vaak gebruikt voor FISH-analyse van chromosomale afwijkingen. | | Interfase preparaat | Een preparaat dat cellen in de interfase bevat, de fase van de celcyclus tussen mitoses. FISH op interfasecellen wordt gebruikt om chromosomale afwijkingen te detecteren zonder dat de cel zich deelt. | | Genexpressie | Het proces waarbij de informatie in een gen wordt gebruikt om een functioneel genproduct te synthetiseren, meestal een eiwit of RNA-molecuul. | | Microarray | Een glazen drager met duizenden DNA-probes die in een grid zijn geordend. Hiermee kunnen tegelijkertijd de expressie van duizenden genen worden gemeten of genetische variaties worden geanalyseerd. | | LIPA (Line Probe Assay) | Een techniek die reverse hybridisatie combineert met strips die specifieke probes bevatten om genetische varianten, zoals mutaties, snel te identificeren. | | Kloneren | Het proces van het maken van identieke kopieën van een DNA-fragment, een gen, of een heel organisme. Dit kan worden bereikt via verschillende moleculair-biologische technieken. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Een techniek om specifieke DNA-segmenten exponentieel te vermenigvuldigen in vitro. | | qPCR (Kwantitatieve Polymerase Chain Reaction) | Een variant van PCR die ook de hoeveelheid van het geamplificeerde DNA in real-time meet, wat kwantificering van het oorspronkelijke doelwit mogelijk maakt. | | Target enrichment | Een voorbereidende stap om de concentratie van een specifiek doelwitnucleïnezuur te verhogen alvorens verder te analyseren, bijvoorbeeld voor sequencing of hybridisatie. | | R-loop | Een structuur die ontstaat wanneer een DNA-duplex tijdelijk een van zijn strengen verliest ten gunste van een RNA-hybride. | | Dot blot | Een eenvoudige hybridisatietechniek waarbij DNA of RNA direct op een membraan wordt aangebracht in discrete "dots", gevolgd door hybridisatie met een gelabelde probe. | | Colony lift / Plaque lift | Technieken om kolonies van bacteriën of faagplaques van een cultuurmedium over te brengen naar een filter, zodat DNA uit deze kolonies of plaques kan worden geanalyseerd met hybridisatie. | | Specifieke celverdeling | De verspreiding van cellen met een bepaalde eigenschap of expressiepatroon binnen een organisme of weefsel. | | Genotypering | Het bepalen van het genotype van een individu, inclusief de aanwezigheid van specifieke allelen of mutaties. | | Typen/Fingerprinting | Technieken die worden gebruikt om individuele organismen of stammen te identificeren of te classificeren op basis van hun genetische profiel. | | HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) | Een eiwit dat een rol speelt bij celgroei en deling. Amplificatie van het HER2-gen, wat leidt tot overexpressie van het eiwit, is vaak geassocieerd met bepaalde vormen van kanker, met name borstkanker. | | CEN17 (Centromere van chromosoom 17) | Het centromeer van chromosoom 17, dat dient als referentiepunt bij genetische analyses, zoals de bepaling van genamplificatie van het HER2-gen op hetzelfde chromosoom. |

# De rol van micro-organismen in de menselijke gezondheid en hygiëne Micro-organismen spelen een essentiële en complexe rol in de menselijke gezondheid, variërend van hulp bij de spijsvertering en het vormen van een beschermende barrière, tot de noodzaak van hygiëne en de gevaren van overmatig antibioticagebruik. ### 1.1 Micro-organismen in en op het menselijk lichaam Het menselijk lichaam herbergt naar schatting 100.000 miljard bacteriën, wat overeenkomt met ongeveer 1 kilogram levend gewicht. Deze micro-organismen zijn niet alleen geconcentreerd in de darmen, met name in het colon, maar ook verspreid over andere delen van het lichaam zoals de mond en de huid. #### 1.1.1 De darmflora (microbiota) De verzameling micro-organismen in onze maag en darmen wordt de microbiota of het microbioom genoemd. De darmflora, met name in het colon, bestaat uit ongeveer 400 verschillende soorten bacteriën. Deze darmbewoners zijn cruciaal voor diverse lichaamsfuncties: * **Spijsvertering:** Ze helpen bij de afbraak van niet-verteerbare componenten uit de voeding. * **Kolonisatieresistentie:** De aanwezigheid van nuttige bacteriën vormt een natuurlijke barrière tegen de kolonisatie door pathogene micro-organismen. * **Invloed op het immuunsysteem:** De darmflora speelt een rol in de ontwikkeling en regulatie van het immuunsysteem. * **Verband met aandoeningen:** Er wordt onderzoek gedaan naar de link tussen de darmflora en diverse aandoeningen, waaronder de ziekte van Crohn en zelfs mentale gezondheidsproblemen zoals depressie. Bacteriën kunnen stoffen produceren die de mentale gesteldheid beïnvloeden. #### 1.1.2 Nuttige en schadelijke micro-organismen Hoewel veel micro-organismen nuttig zijn, kunnen bepaalde soorten ziekteverwekkend (pathogeen) zijn wanneer ze in grote aantallen aanwezig zijn of in specifieke omstandigheden. * **Voorbeelden van nuttige bacteriën:** Melkzuurbacteriën zoals *Lactobacillus bulgaricus* en *Streptococcus thermophilus* zijn essentieel voor de bereiding van yoghurt. *Saccharomyces cerevisiae* (gist) is onmisbaar voor de broodproductie. * **Voorbeelden van schadelijke bacteriën:** * ***Salmonella*:** Een staafvormige bacterie die voedselinfecties kan veroorzaken. Ze komen veel voor op eierschalen en in gevogelte. * ***Escherichia coli* (E. coli):** Hoewel de meeste stammen van E. coli deel uitmaken van de normale darmflora en helpen bij de vertering, kunnen specifieke stammen, zoals EHEC (enterohaemorhagische E. coli) of STEC (Shigatoxineproducerende E. coli), ernstige voedselinfecties veroorzaken, waaronder hemorragische colitis en het hemolytisch uremisch syndroom (HUS). Deze bacteriën kunnen voorkomen op groenten die faecaal besmet zijn. * **Coliforme bacteriën:** Een groep darmbacteriën die verwant is aan E. coli en gebruikt wordt als indicator voor faecale besmetting. Hun aanwezigheid in water duidt op een risico op pathogene darmbacteriën. * ***Staphylococcus aureus*:** Deze grampositieve coccen kunnen toxines produceren die voedselvergiftiging veroorzaken. De toxines zijn thermoresistent, wat betekent dat verhitting het risico niet altijd wegneemt. Methicilline-resistente *Staphylococcus aureus* (MRSA) is een bijzonder problematische variant die resistent is tegen meerdere antibiotica. * **Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae (CPE):** Deze bacteriën zijn bestand tegen de meeste antibiotica, waaronder carbapenems, wat ze zeer gevaarlijk maakt in ziekenhuisomgevingen. #### 1.1.3 De rol van hygiëne Hygiëne is essentieel om de verspreiding van schadelijke micro-organismen te voorkomen en zo bacteriële infecties te bestrijden. * **Essentiële hygiënemaatregelen:** * Handen wassen * Tanden poetsen * Nagels kort houden * Afgeschermd hoesten en niezen * **Voedselhygiëne:** Belangrijk om voedselinfecties en -intoxicaties te voorkomen. Een gebrek aan hygiëne kan leiden tot de aanwezigheid van schadelijke micro-organismen in voedsel. > **Tip:** YOPI-patiënten (Young, Old, Pregnant, Immunodepressed – jonge, oude, zwangere en immuungecompromitteerde personen) zijn het meest gevoelig voor voedselinfecties en -intoxicaties. > **Voorbeeld:** Het snijden van vlees kan leiden tot kruisbesmetting met *Staphylococcus aureus*. Als het vlees daarna niet tijdig en voldoende verhit wordt, kunnen geproduceerde toxines een voedselvergiftiging veroorzaken. Het marineren van vlees in de kelder gedurende een halve dag, waar temperaturen mogelijk in de gevarenzone (5-65°C) liggen, kan de groei van schadelijke bacteriën bevorderen. ### 1.2 Consequenties van overmatig antibioticagebruik Antibiotica zijn medicijnen die de stofwisseling van bacteriën verstoren en zo bacteriële infecties bestrijden. Echter, overmatig en onjuist gebruik leidt tot een ernstig probleem: antibioticaresistentie. * **Resistentie:** Bacteriën kunnen resistent worden tegen antibiotica, waardoor deze medicijnen minder effectief worden of zelfs helemaal niet meer werken. Dit vereist de constante ontwikkeling van nieuwe antibiotica. * **Verstoring van de darmflora:** Overmatig antibioticagebruik kan de natuurlijke balans van de darmflora ernstig verstoren. Dit kan leiden tot een verminderde weerstand en een verhoogd risico op infecties. > **Voorbeeld:** Bacteriën uit eigen stoelgang kunnen na een antibioticakuur helpen om de darmflora sneller te herstellen. Dit principe ligt aan de basis van fecale transplantatie, waarbij stoelgang van een gezonde donor wordt ingeplant om hardnekkige infecties te behandelen. > **Tip:** Een te steriele omgeving kan ook nefaste gevolgen hebben voor het immuunsysteem, omdat het immuunsysteem minder gestimuleerd wordt om te reageren op micro-organismen. ### 1.3 Het belang van hygiëne en microbiële processen Hygiëne is niet alleen cruciaal voor de menselijke gezondheid, maar ook voor de voedselproductie en milieuprocessen zoals waterzuivering. #### 1.3.1 Voedselproductie Veel voedingsmiddelen zijn afhankelijk van de activiteit van micro-organismen voor hun bereiding en conservering: * **Yoghurt:** Gist door *Lactobacillus bulgaricus* en *Streptococcus thermophilus* die lactose omzetten in melkzuur. * **Kaas:** Gebruik van diverse bacteriën, waaronder propionzuurbacteriën. * **Brood:** Alcoholische fermentatie door *Saccharomyces cerevisiae* (gist) die CO2 produceert voor het rijzen. * **Wijn en bier:** Alcoholische fermentatie van suikers door gisten (*Saccharomyces*) en soms bacteriën. * **Kuilvoer (conservering):** Melkzuurfermentatie van ruwvoeders om ze te conserveren, door vorming van melkzuur, azijnzuur en propionzuur in een anaeroob milieu. * **Pre- en probiotica:** Deze functionele voedingsmiddelen bevatten ingrediënten die een positief effect hebben op de darmflora. * **Prebiotica:** Niet-verteerbare suikers of voedingsvezels die de groei van gunstige darmbacteriën stimuleren. * **Probiotica:** Levende micro-organismen (vaak bacteriën zoals *Lactobacillus* en *Bifidobacterium*, of gisten) met een bewezen positief effect op de darmgezondheid. #### 1.3.2 Ecologie en waterzuivering Micro-organismen spelen een sleutelrol in diverse ecologische cycli en zijn essentieel voor de zuivering van afvalwater. * **Koolstofcyclus (C-cyclus):** Micro-organismen zijn verantwoordelijk voor de afbraak van organisch materiaal tot CO2. Dit proces, 'mineralisatie', zet organisch materiaal om in anorganisch materiaal. * **Stikstofcyclus (N-cyclus):** Diverse micro-organismen zijn betrokken bij de omzetting van stikstofverbindingen: * **N-fixatie:** Omzetting van atmosferische stikstof (N2) naar ammoniak (NH3/NH4+). * **Ammonificatie:** Mineralisatie van organisch gebonden stikstof tot ammoniak. * **Nitrificatie:** Omzetting van ammoniak naar nitriet (NO2-) en vervolgens naar nitraat (NO3-) in een aeroob milieu. * **N-opname door planten:** Planten nemen stikstof op in de vorm van ammoniak/ammonium en nitraat. * **Denitrificatie:** Omzetting van nitraat naar stikstofgas (N2) in een anaeroob milieu. * **Afvalwaterzuivering:** * **Secundaire zuivering:** Aerobe biologische zuivering met actief slib, waarbij micro-organismen organisch materiaal mineraliseren en organische stikstof omzetten naar ammonium. * **Tertiaire zuivering:** Verwijdering van stikstof- en fosforverbindingen door afwisselende beluchting (nitrificatie) en niet-beluchting (denitrificatie). * **Anammox bacterie:** Deze bacterie voert een anaerobe ammoniumoxidatie uit ($$NH_4^+ + NO_2^- \rightarrow N_2 + 2 H_2O$$), wat theoretisch de benodigde beluchting bij afvalwaterzuivering kan verminderen. #### 1.3.3 Plantenteelt Ondanks dat sommige bacteriën plantenziekten kunnen veroorzaken (bv. Erwinia), zijn de meeste bacteriën nuttig voor planten. Technieken zoals het beënten met nuttige bacteriën worden toegepast ter preventie van ziekten en ter bevordering van de plantengroei. ### 1.4 Virussen Virussen zijn geen levende organismen omdat ze een gastheercel nodig hebben om zich voort te planten. Ze bestaan uit genetisch materiaal (DNA of RNA) omhuld door een eiwitmantel. * **Vermenigvuldiging:** Virussen zijn obligaat parasieten. Ze vermenigvuldigen zich via cycli zoals de lytische cyclus (die leidt tot lyse van de gastheercel) of de lysogene cyclus (waarbij viraal DNA geïntegreerd wordt in het gastheer DNA). * **Antigenen:** Virussen hebben eiwitten aan hun buitenzijde die functioneren als antigenen. Deze antigenen wekken een immuunrespons op, waarbij het lichaam antistoffen produceert. Veranderingen in deze antigenen door mutatie kunnen leiden tot antige drift, waardoor het virus minder goed herkend wordt door het immuunsysteem (bv. bij influenza). * **Voorbeelden:** Influenza virus, coronavirus, plantenvirussen zoals het TMV virus. Bacteriofagen zijn virussen die bacteriën infecteren. --- # Microbiële processen in ecologie en waterzuivering Micro-organismen zijn overal aanwezig en spelen een cruciale rol in diverse cycli, zoals de koolstof- en stikstofcyclus, en worden toegepast in waterzuivering. ## 2. Microbiële diversiteit en hun rol in de leefwereld Micro-organismen, met name bacteriën, zijn alomtegenwoordig in diverse milieus, variërend van gematigde tot extreme omstandigheden. Ze vervullen essentiële functies in natuurlijke cycli en technologieën. ### 2.1 Microbiële ecologie en de koolstofcyclus De koolstofcyclus omvat de omzetting van koolstof onder verschillende vormen. Planten en bepaalde micro-organismen fixeren kooldioxide ($CO_2$) tot organische koolstof via fotosynthese. Vervolgens breken bacteriën deze organische koolstof weer af tot $CO_2$. * **Mineralisatie**: Dit proces verwijst naar de omzetting van organisch materiaal in anorganisch materiaal. ### 2.2 De stikstofcyclus en microbiële processen De stikstofcyclus is een complex proces waarbij stikstof in verschillende vormen wordt omgezet, mede dankzij de activiteit van bacteriën. * **Verschillende stikstofvormen**: * In de atmosfeer: $N_2$ en stikstofoxiden (N-oxiden). * In plantaardig en dierlijk materiaal: organisch gebonden stikstof in eiwitten en nucleïnezuren. * In de bodem: ammonium ($NH_4^+$) als afbraakproduct van organisch gebonden stikstof, en nitraat ($NO_3^-$). * **Stappen in de stikstofcyclus**: * **N-fixatie**: Hierbij wordt atmosferische stikstof ($N_2$) omgezet in een direct bruikbare vorm. Dit kan gebeuren door symbiotische bacteriën zoals *Rhizobium* (geassocieerd met plantenwortels) of vrijlevende bacteriën zoals *Azotobacter*. Het Haber-Bosch-procedé, gebruikt in de kunstmeststofindustrie, bootst dit proces na met hoge druk en temperatuur. * **Ammonificatie**: Dit is de mineralisatie van organisch gebonden stikstof door micro-organismen, wat resulteert in de vorming van ammoniak ($NH_3$) of ammonium ($NH_4^+$). * **Nitrificatie**: Dit proces vindt plaats in een aëroob milieu en omvat twee stappen: * Nitritatie: $NH_3$/$NH_4^+$ wordt door *Nitrosomonas* omgezet in nitriet ($NO_2^-$). * Nitratatie: $NO_2^-$ wordt door *Nitrobacter* omgezet in nitraat ($NO_3^-$). * **N-opname door planten**: Ammonium ($NH_4^+$) en nitraat ($NO_3^-$) zijn geschikte stikstofbronnen die door planten en andere organismen uit de bodem kunnen worden opgenomen. * **Denitrificatie**: In een anaëroob milieu wordt nitraat omgezet naar stikstofgas ($N_2$) en stikstofoxiden. Dit proces wordt uitgevoerd door bacteriën zoals *Pseudomonas*, *Micrococcus*, *Bacillus* en *Alcaligenes*. * **N-bacteriën**: Deze groep bacteriën, hoewel divers in vorm en genetische verwantschap, wordt geclassificeerd op basis van hun rol in de stikstofcyclus. Veel van deze bacteriën zijn chemolithotroof, wat betekent dat ze anorganische elektrondonoren gebruiken als energiebron. * **Anammox bacteriën**: Deze bacteriën voeren een anaërobe ammoniumoxidatie uit volgens de reactie: $$NH_4^+ + NO_2^- \rightarrow N_2 + 2 H_2O$$ De ontdekking van Anammox bacteriën heeft het potentieel om de benodigde beluchting bij afvalwaterzuivering te verminderen, wat leidt tot een efficiëntere zuivering. ### 2.3 Micro-organismen in waterzuivering Microbiële processen zijn essentieel voor de zuivering van afvalwater. * **Primaire zuivering**: Hierbij worden vaste stoffen verwijderd op basis van fysische eigenschappen, zoals het gebruik van roosters en zand- en vetvangers. * **Secundaire zuivering**: Dit is een aërobe biologische zuivering die plaatsvindt in beluchtingstanks met behulp van 'actief slib'. Hierbij vindt mineralisatie plaats en wordt organische stikstof omgezet naar ammonium. * **Tertiaire zuivering**: Dit stadium is gericht op de verdere verwijdering van nutriënten, met name stikstof- en fosforverbindingen. Het omvat afwisselend beluchting (voor nitrificatie) en niet-beluchting (voor denitrificatie). #### 2.3.1 Actief slib Actief slib is een biomassa van micro-organismen die de organische vervuiling in afvalwater afbreken. ### 2.4 Microbiële processen in voedselproductie Micro-organismen zijn onmisbaar voor de productie van diverse voedingsmiddelen. * **Melkzuurbacteriën**: Deze bacteriën, zoals *Lactobacillus bulgaricus* en *Streptococcus thermophilus*, worden gebruikt bij de bereiding van yoghurt. Ze zetten lactose om in melkzuur, wat leidt tot de verlaging van de pH, de coagulatie van melkeiwitten en de ontwikkeling van karakteristieke aroma's (melkzuurfermentatie). * **Broodbereiding**: Gist, zoals *Saccharomyces cerevisiae*, zet glucose uit zetmeel om in alcohol en kooldioxide ($CO_2$). De alcohol verdampt tijdens het bakken, terwijl de $CO_2$ het brood doet rijzen (alcoholische fermentatie). * **Wijn en bierbereiding**: Gisten (*Saccharomyces* soorten) en schimmels zetten suikers om in ethanol en kooldioxide in anaërobe omstandigheden (alcoholische fermentatie). * **Pre- en probiotica**: * **Prebiotica**: Dit zijn ingrediënten (suikers of voedingsvezels) die niet door de mens verteerd kunnen worden, maar wel de darmflora stimuleren en een positief effect hebben op de darmgezondheid. Ze verhogen de groei van gunstige bacteriën en verbeteren de stoelgang. * **Probiotica**: Dit zijn levende micro-organismen die een positief effect hebben op de darmflora. Ze ondersteunen de vertering en verhogen de natuurlijke weerstand. Voorbeelden zijn *Lactobacillus*, *Streptococcus* en *Bifidobacterium*. * **Voederconservering**: Melkzuurfermentatie wordt toegepast bij het conserveren van ruwvoeders zoals kuilvoer. Door het af te sluiten van zuurstof ontstaat een anaëroob milieu waarin melkzuur, azijnzuur en propionzuur worden gevormd, wat leidt tot conservering. > **Tip:** Yoghurt is een gefermenteerd zuivelproduct, maar thermisch behandeld gefermenteerd zuivelproduct heeft door de warmtebehandeling weinig tot geen levende micro-organismen meer. ### 2.5 Hygiëne en microbiële risico's Hygiëne is cruciaal om de verspreiding van schadelijke micro-organismen te voorkomen. * **Voedselinfectie**: Hierbij veroorzaakt de bacterie zelf de ziekte door groei in gevoelige weefsels (bv. *Salmonella*). * **Voedselintoxicatie**: Hierbij veroorzaakt een door de bacterie geproduceerd toxine de ziekte (bv. *S. aureus*, *C. botulinum*, *C. perfringens*). * **Hygiëne-indicatoren**: Coliforme bacteriën, die nauw verwant zijn aan *E. coli*, worden gebruikt als indicator voor fecale besmetting van water. De aanwezigheid ervan duidt op een risico op pathogene darmbacteriën. * **Resistentie**: Overmatig gebruik van antibiotica kan leiden tot resistentie bij bacteriën, wat een groeiend probleem vormt. *Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae* (CPE) zijn voorbeelden van multiresistente bacteriën. * **Staphylococcus aureus**: Bepaalde stammen produceren thermoresistente toxines die voedselvergiftiging kunnen veroorzaken, zelfs na verhitting. > **Voorbeeld**: Bij het snijden van vlees kan besmetting met *Staphylococcus aureus* optreden. Als het vlees niet binnen enkele uren wordt gebakken, kunnen de geproduceerde toxines bij keukentemperatuur al voldoende zijn voor voedselvergiftiging. ### 2.6 Microbiële processen bij planten Hoewel sommige bacteriën plantenziekten kunnen veroorzaken (bv. *Erwinia*, *Agrobacterium*), zijn de meeste bacteriën nuttig voor plantenteelt. Vruchtwisseling en het enten met nuttige bacteriën kunnen bijdragen aan een gezonde groei. ### 2.7 Virussen Virussen zijn geen levende organismen en vereisen een gastheercel voor voortplanting. Ze bestaan uit genetisch materiaal (DNA of RNA) omhuld door een eiwitmantel. * **Vermenigvuldiging**: * **Lytische cyclus**: Leidt tot lyse (afbraak) van de gastheercel. * **Lysogene cyclus**: Het virale DNA wordt geïntegreerd in het DNA van de gastheercel en vermeerdert mee. Het virus kan latent aanwezig zijn en later actief worden. * **Antigenen**: Virussen hebben antigenen aan hun buitenzijde (eiwitten) die een afweerreactie opwekken. Genetisch materiaal zoals DNA is geen antigeen op zich, maar de eiwitten die het codeert, kunnen als zodanig fungeren. Mutaties in antigenen kunnen leiden tot antigene drift. --- # Micro-organismen in voedselproductie en -conservering Dit onderwerp belicht de cruciale rol van micro-organismen bij de productie van diverse voedingsmiddelen, zoals zuivelproducten, brood, wijn en bier, evenals hun toepassing in pre- en probiotica en voedselconservering. ### 3.1 Voedselproductie met micro-organismen Micro-organismen zijn essentieel voor de productie van tal van voedingsmiddelen door middel van fermentatieprocessen. #### 3.1.1 Yoghurtproductie Yoghurt wordt geproduceerd door melkzuurbacteriën, met name *Lactobacillus bulgaricus* en *Streptococcus thermophilus*. Deze bacteriën zetten lactose (melksuiker) om in melkzuur. * **Proces:** Melkzuur verlaagt de pH van de melk, wat leidt tot de coagulatie van melkeiwitten en de karakteristieke textuur van yoghurt. * **Aromacomponenten:** De bacteriën dragen ook bij aan de typische aroma's van yoghurt door middel van melkzuurfermentatie. #### 3.1.2 Broodbereiding Bij de bereiding van brood speelt *Saccharomyces cerevisiae* (gist) een sleutelrol. * **Proces:** Gist gebruikt glucose uit zetmeel als energiebron en produceert alcohol en koolstofdioxide ($CO_2$). * **Rijzen:** De geproduceerde $CO_2$ zorgt ervoor dat het brood rijst. De alcohol verdampt tijdens het bakken. Dit proces wordt alcoholische fermentatie genoemd. #### 3.1.3 Wijn- en bierbereiding De productie van wijn en bier is eveneens afhankelijk van alcoholische fermentatie door gisten, voornamelijk *Saccharomyces* soorten. Soms worden ook verwante schimmels (Ascomycetes) en bacteriën ingezet. * **Proces:** In anaërobe omstandigheden zetten deze micro-organismen de suikers in druivensap (wijn) of mout (bier) om in ethanol en $CO_2$. #### 3.1.4 Voedselconservering van veevoeders Melkzuurfermentatie wordt toegepast bij de conservering van ruwvoeders zoals gras en maïs (kuilvoer). * **Proces:** Door het afsluiten van zuurstof ontstaat een anaëroob milieu waarin melkzuurbacteriën onder andere melkzuur, azijnzuur en propionzuur produceren. Deze zuren fungeren als conserveermiddel. ### 3.2 Pre- en probiotica Pre- en probiotica zijn ingrediënten die gericht worden toegevoegd aan voedingsmiddelen om de gezondheid, met name de darmgezondheid, te bevorderen. #### 3.2.1 Functionele voeding Functionele voeding omvat voedingsmiddelen die ingrediënten bevatten met een positief effect op de fysiologische functies van het lichaam, naast de normale nutritionele waarde. #### 3.2.2 Prebiotica * **Definitie:** Prebiotica zijn ingrediënten, vaak suikers of voedingsvezels, die niet door de mens verteerd kunnen worden, maar wel een positief effect hebben op de darmflora. * **Effecten:** Ze stimuleren de groei van gunstige bacteriën, kunnen de samenstelling van de darmflora veranderen, de weerstand tegen voedselinfecties verhogen en zorgen voor een betere stoelgang. Ze worden ook wel de bifidogene factor genoemd. #### 3.2.3 Probiotica * **Definitie:** Probiotica zijn levende micro-organismen (hoewel soms ook delen van dode cellen worden gebruikt) die een positief effect hebben op de darmflora. * **Eisen:** Producten die probiotica bevatten, moeten doorgaans meer dan $10^9$ micro-organismen per dosis bevatten, zuurbestendig zijn, in staat zijn tot groei onder anaërobe omstandigheden en geen nadelige eigenschappen hebben. * **Voorbeelden:** Veelvoorkomende probiotische micro-organismen zijn *Lactobacillus*, *Streptococcus*, *Bifidobacterium* soorten, en bepaalde gisten (met name in veevoeding). * **Toepassing in voeding:** Probiotica worden voornamelijk teruggevonden in gefermenteerde zuivelproducten. Om effect te hebben, moeten probiotica gedurende een aantal weken consequent ingenomen worden. * **Belangrijk onderscheid:** Yoghurt is een gefermenteerd zuivelproduct met specifieke bacteriën (*Lactobacillus bulgaricus* en *Streptococcus thermophilus*), terwijl een thermisch behandeld gefermenteerd zuivelproduct (zoals gepasteuriseerde yoghurt) een langere houdbaarheid heeft door de warmtebehandeling, maar daardoor weinig tot geen levende micro-organismen meer bevat. #### 3.2.4 Synbiotica Synbiotica zijn producten die een combinatie bevatten van zowel pre- als probiotica. #### 3.2.5 GRAS-status De term GRAS (Generally Recognized As Safe) duidt op ingrediënten die algemeen erkend worden als veilig voor consumptie. ### 3.3 Voedselconservering door micro-organismen Hoewel het hoofdfocus van dit deel op productie ligt, wordt de rol van micro-organismen bij conservering (bv. via fermentatie) reeds behandeld onder voedselproductie en veevoeders. Acidofiele bacteriën kunnen bijvoorbeeld een rol spelen bij de conservering van voedsel door hun vermogen om in zure omstandigheden te groeien en potentieel schadelijke micro-organismen te onderdrukken. Melkzuurbacteriën, die in staat zijn om melkzuur te produceren, dragen bij aan de conservering van gefermenteerde zuivelproducten en in het geval van ruwvoeders. --- # Inleiding tot virussen Virussen zijn obligate parasieten die geen levende organismen worden beschouwd vanwege hun afhankelijke voortplantingsmechanisme, maar ze zijn wel structureel en functioneel relevant binnen de microbiële biotechnologie. ## 4.1 Definitie en structuur van virussen Virussen worden niet beschouwd als levende organismen omdat ze geen eigen metabolisme hebben en afhankelijk zijn van een gastheercel voor hun replicatie. ### 4.1.1 Essentiële componenten De basale structuur van een virus, ook wel een virion genoemd, bestaat uit: * **Genetisch materiaal:** Dit kan DNA of RNA zijn, enkelstrengs (es) of dubbelstrengs (ds). * **Eiwitmantel (capside):** Een beschermende laag van eiwitten die het genetisch materiaal omringt. Deze mantel is opgebouwd uit kleinere eenheden, capsomeren. * **Eiwitten aan de buitenkant:** Soms zijn er specifieke eiwitten (stekels) aan de buitenkant van het virus die essentieel zijn voor de hechting aan receptoren van de gastheercel. * **Beschermende envelop:** Sommige virussen hebben een extra lipide dubbellaag die afkomstig is van de gastheercelmembraan. ### 4.1.2 Verschillen met bacteriën Het belangrijkste onderscheid tussen virussen en bacteriën is dat virussen geen zelfstandige levensvormen zijn. Bacteriën hebben een eigen celstructuur en metabolisme, terwijl virussen afhankelijk zijn van de machinerie van een gastheercel om zich te vermenigvuldigen. > **Tip:** Denk aan virussen als een genetische "instructie" die zichzelf niet kan uitvoeren zonder de "fabriek" van een levende cel. ### 4.1.3 Soorten virussen Virussen worden geclassificeerd op basis van hun gastheer: * **Bacteriofagen:** Virussen die bacteriën infecteren. Bacteriofagen hebben vaak een karakteristieke kop-en-staartstructuur. * **Dierpathogene virussen:** Virussen die dieren infecteren. * **Plantaardige virussen:** Virussen die planten infecteren. Deze zijn vaak RNA-virussen, zoals het tabaksmozaïekvirus (TMV). * **Menspathogene virussen:** Virussen die mensen infecteren. ## 4.2 Virale voortplanting Virussen vermenigvuldigen zich obligaat parasitair, wat betekent dat ze altijd een levende gastheercel nodig hebben. Er zijn twee belangrijke cycli van virale replicatie: de lytische cyclus en de lysogene cyclus. ### 4.2.1 De lytische cyclus Deze cyclus leidt direct tot de dood van de gastheercel door lyse (verbreking). De stappen omvatten: 1. **Hechting (Adsorptie):** Het virus bindt zich aan specifieke receptoren op het oppervlak van de gastheercel. 2. **Penetratie:** Het virus of zijn genetisch materiaal dringt de gastheercel binnen. Bij bacteriofagen wordt vaak alleen het genetisch materiaal geïnjecteerd. 3. **Replicatie en synthese:** De gastheercel wordt gedwongen om virale componenten (genetisch materiaal en eiwitten) te produceren. 4. **Assemblage:** De nieuwe virale componenten worden samengevoegd tot nieuwe virionen. 5. **Lyse:** De gastheercel barst open, waardoor de nieuw gevormde virussen vrijkomen en andere cellen kunnen infecteren. ### 4.2.2 De lysogene cyclus In deze cyclus wordt het virale DNA geïntegreerd in het DNA van de gastheercel en blijft het latent aanwezig als een provirus. 1. **Integratie:** Het virale DNA wordt opgenomen in het genoom van de gastheercel. 2. **Vermeerdering met gastheer:** Telkens wanneer de gastheercel zich deelt, wordt ook het virale DNA vermenigvuldigd. Dit leidt gedurende een periode niet tot de dood van de gastheercel. 3. **Inductie:** Onder bepaalde omstandigheden (bv. stress, mutaties) kan het virale DNA zich uit het gastheerdna losmaken en de lytische cyclus starten. > **Tip:** De lysogene cyclus kan de verspreiding van een virus in een populatie op lange termijn bevorderen, omdat het niet onmiddellijk detecteerbaar is en zich stilzwijgend vermeerdert. ### 4.2.3 Virionen en virussen in de omgeving In afwachting van een geschikte gastheercel kan een virus in een vrije, infectieuze toestand (virion) voorkomen in de omgeving, bijvoorbeeld in aerosolen of op stofdeeltjes. In deze toestand kan het virus overleven, maar zich niet vermenigvuldigen. ## 4.3 Virussen als pathogenen Virussen zijn belangrijke ziekteverwekkers (pathogenen) voor mens, dier en plant. ### 4.3.1 Virale antigenen en immuunrespons * **Antigenen:** Dit zijn eiwitten aan de buitenkant van het virus die het immuunsysteem van de gastheer kunnen activeren. Ze worden ook wel "antibody generators" genoemd. * **Antistoffen:** Het immuunsysteem produceert antistoffen als reactie op de virale antigenen, om de virussen te neutraliseren of te markeren voor vernietiging. * **Antigene drift:** Kleine veranderingen in de virale antigenen door mutaties kunnen ervoor zorgen dat het immuunsysteem de virussen niet meer herkent, wat leidt tot nieuwe infecties of pandemieën (bv. bij influenza). > **Tip:** Virale antigenen zijn cruciaal voor zowel de infectie als de immuunrespons en spelen een sleutelrol in de ontwikkeling van vaccins. ### 4.3.2 Voorbeelden van virale ziekten * **Influenza virus:** Veroorzaakt griep. De letter-cijfercodes (bv. H5 of H7 in H5N1) verwijzen naar specifieke antigenen op het virusoppervlak. * **Coronavirus:** Veroorzaakt diverse ziekten, waaronder COVID-19. * **Plantaardige virussen:** Zoals het tabaksmozaïekvirus (TMV), dat planten aantast en hun groei en ontwikkeling beïnvloedt. Het begrip "virale antigenen bestaan uit DNA dat een afweerreactie opwekt" is **fout**. Virale antigenen zijn primair **eiwitten** aan de buitenkant van het virus die het afweersysteem activeren om antistoffen te maken. Het genetisch materiaal van het virus is weliswaar DNA of RNA, maar dit is niet direct het antigeen dat de immuunrespons triggert. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Prokaryote cel | Een celtype dat geen kernmembraan heeft en waarvan het genetisch materiaal los in het cytoplasma ligt. Bacteriën en archaea zijn voorbeelden van prokaryoten. | | Eukaryote cel | Een celtype dat wel een kernmembraan bezit, waarin het genetisch materiaal is opgesloten. Cellen van dieren, planten, schimmels en protisten zijn eukaryoot. | | Biomining | Het gebruik van micro-organismen om metalen uit ertsen te winnen. Dit proces maakt gebruik van de metabole activiteit van bacteriën om metaalionen op te lossen. | | Bioremediatie | Het gebruik van levende organismen, met name micro-organismen, om milieuvervuiling af te breken en te verwijderen. Dit kan toegepast worden op bodem, water en lucht. | | Microbiota | De gemeenschap van micro-organismen (bacteriën, schimmels, virussen) die op of in een gastheer leven. De menselijke microbiota is een essentieel onderdeel van het immuunsysteem en de spijsvertering. | | Colonisatie-resistentie | Het vermogen van de normale microbiota om de vestiging en groei van pathogene micro-organismen te voorkomen door concurrentie voor voedingsstoffen en ruimte, of door de productie van antimicrobiële stoffen. | | Mineralisatie | Het proces waarbij organisch materiaal door micro-organismen wordt afgebroken tot anorganische verbindingen, zoals koolstofdioxide ($CO_2$) en mineralen. Dit is cruciaal voor de kringloop van voedingsstoffen in ecosystemen. | | N-cyclus (Stikstofcyclus) | Het biochemische proces waarbij stikstof wordt omgezet tussen verschillende chemische vormen, essentieel voor het leven. Belangrijke stappen zijn stikstoffixatie, ammonificatie, nitrificatie en denitrificatie, uitgevoerd door micro-organismen. | | N-fixatie | Het proces waarbij atmosferische stikstof ($N_2$) door bepaalde micro-organismen wordt omgezet in een voor planten opneembare vorm, zoals ammoniak ($NH_3$). | | Ammonificatie | De omzetting van organisch gebonden stikstof (in eiwitten en nucleïnezuren) door micro-organismen tot ammoniak ($NH_3$) of ammoniumionen ($NH_4^+$). | | Nitrificatie | Een tweeledig proces waarbij ammoniak ($NH_3$/$NH_4^+$) door bacteriën in het milieu wordt omgezet in nitriet ($NO_2^-$) en vervolgens in nitraat ($NO_3^-$). Dit vindt plaats in aerobe omstandigheden. | | Denitrificatie | Het proces waarbij nitraat ($NO_3^-$) door anaerobe bacteriën wordt gereduceerd tot stikstofgas ($N_2$) en stikstofoxiden. Dit vindt plaats in zuurstofarme milieus. | | Chemolithotroof | Een organisme dat energie verkrijgt uit de oxidatie van anorganische verbindingen en koolstof uit anorganische bronnen, zoals $CO_2$. Veel bacteriën in de stikstofcyclus zijn chemolithotroof. | | Endospore | Een inactieve, resistente structuur die door sommige bacteriën, zoals Bacillus en Clostridium, wordt gevormd onder ongunstige omstandigheden om te overleven. | | Saprofyt | Een organisme dat zich voedt met dood organisch materiaal. Veel bacteriën en schimmels zijn saprofieten en spelen een belangrijke rol bij de afbraak van biomassa. | | Anammox bacterie | Bacteriën die anaerobe ammoniumoxidatie uitvoeren, waarbij ammonium ($NH_4^+$) en nitriet ($NO_2^-$) direct worden omgezet in stikstofgas ($N_2$) en water ($H_2O$). Dit is een efficiënt proces in afvalwaterzuivering. | | Actief slib | Een mengsel van micro-organismen (voornamelijk bacteriën) en vaste deeltjes dat wordt gebruikt in biologische afvalwaterzuivering. Het slib verwijdert organische vervuiling uit het water. | | Voedselinfectie | Een ziekte die wordt veroorzaakt door het consumeren van voedsel dat besmet is met levende ziekteverwekkende micro-organismen, zoals bacteriën. De micro-organismen groeien in het lichaam en veroorzaken de symptomen. | | Voedselintoxicatie | Een ziekte die wordt veroorzaakt door het consumeren van voedsel dat besmette toxines bevat, geproduceerd door micro-organismen. De toxines zelf zijn verantwoordelijk voor de ziekteverschijnselen. | | Salmonella | Een geslacht van staafvormige bacteriën die tot de familie Enterobacteriaceae behoren en voedselinfecties kunnen veroorzaken. Ze komen vaak voor op eierschalen en bij gevogelte. | | Enterobacteriaceae | Een grote familie van Gram-negatieve, staafvormige bacteriën die veel voorkomende darmbewoners zijn bij mens en dier. Sommige leden, zoals Salmonella en Escherichia coli, kunnen pathogeen zijn. | | Escherichia coli (E. coli) | Een veelvoorkomende darmbacterie bij mens en dier, die meestal niet ziekteverwekkend is, maar waarvan bepaalde stammen (zoals EHEC) voedselinfecties kunnen veroorzaken. | | EHEC | Enterohemorragische Escherichia coli, een specifieke stam van E. coli die ernstige diarree, waaronder bloederige colitis, kan veroorzaken en kan leiden tot het hemolytisch uremisch syndroom (HUS). | | Coliforme bacteriën | Een groep van Gram-negatieve bacteriën die verwant zijn aan E. coli en vaak worden gebruikt als indicator voor fecale besmetting van water en voedsel. | | CPE bacteriën (Carbapenemase Producing Enterobacteriaceae) | Enterobacteriaceae die het enzym carbapenemase produceren, waardoor ze resistent zijn tegen carbapenem-antibiotica. Dit vormt een ernstig probleem in ziekenhuizen. | | Staphylococcus aureus | Een Gram-positieve bacterie die voorkomt op de huid en in de neus van mensen en dieren. Sommige stammen produceren toxines die voedselintoxicaties kunnen veroorzaken, en de MRSA-variant is multiresistent. | | MRSA (Methicilline Resistent Staphylococcus aureus) | Een variant van Staphylococcus aureus die resistent is tegen methicilline en vaak ook tegen andere antibiotica, wat behandeling van infecties bemoeilijkt. | | Kruiscontaminatie | De overdracht van micro-organismen van een besmet oppervlak of voedsel naar een ander, niet-besmet oppervlak of voedsel. Dit kan gebeuren tijdens voedselbereiding. | | Melkzuurbacteriën | Een groep bacteriën die melksuiker (lactose) omzetten in melkzuur. Ze zijn belangrijk bij de productie van gefermenteerde zuivelproducten zoals yoghurt en kaas, en bij de conservering van voeders. | | Saccharomyces cerevisiae | Een gistsoort die veelvuldig wordt gebruikt bij de bereiding van brood (alcoholische fermentatie voor rijzing) en bij de productie van alcoholische dranken zoals wijn en bier. | | Alcoholische fermentatie | Een anaeroob metabool proces waarbij suikers door micro-organismen (zoals gisten) worden omgezet in ethanol en koolstofdioxide ($CO_2$). | | Prebiotica | Niet-verteerbare voedingsbestanddelen, zoals bepaalde suikers en voedingsvezels, die selectief de groei en activiteit van gunstige bacteriën in de darm stimuleren. | | Probiotica | Levende micro-organismen, meestal bacteriën, die, wanneer in adequate hoeveelheden geconsumeerd, een gunstig effect hebben op de gezondheid van de gastheer, met name op de darmflora. | | Synbiotica | Combinaties van prebiotica en probiotica die synergetisch werken om de gezondheid van de darmflora te verbeteren. | | GRAS (Generally Recognized As Safe) | Een Amerikaanse regelgeving die aangeeft dat een stof of ingrediënt over het algemeen als veilig wordt beschouwd voor gebruik in voedsel. | | Voedingsclaim | Een boodschap die stelt of de indruk wekt dat een levensmiddel bepaalde nutritionele eigenschappen heeft, zoals een laag vetgehalte of een bron van vezels. | | Gezondheidsclaim | Een boodschap die stelt of de indruk wekt dat een ingrediënt in een levensmiddel of het levensmiddel zelf een gezondheidseffect kan hebben, zoals het verlagen van cholesterol. | | Bifidogene factor | Stoffen, vaak prebiotische vezels, die de groei van Bifidobacterium-soorten in de darm bevorderen. | | Facultatief anaeroob | Een organisme dat zowel in aanwezigheid van zuurstof (aerobe omstandigheden) als in afwezigheid van zuurstof (anaerobe omstandigheden) kan groeien. E. coli is een voorbeeld. | | Fimbriae | Korte, haarachtige uitsteeksels op het oppervlak van bacteriën die een rol spelen bij adhesie aan gastheercellen of oppervlakken. | | Flagellen | Zweepdraden die bacteriën helpen bij beweging. De aanwezigheid en plaatsing van flagellen kunnen taxonomische kenmerken zijn. | | Bacteriën | Eencellige micro-organismen zonder celkern (prokaryoten). Ze zijn alomtegenwoordig in diverse milieus en spelen cruciale rollen in ecologie, biotechnologie en gezondheid. | | Virussen | Micro-organismen die geen eigen metabolisme hebben en zich alleen kunnen vermenigvuldigen in levende gastheercellen. Ze bestaan uit genetisch materiaal (DNA of RNA) omhuld door een eiwitmantel. | | Bacteriofaag | Een virus dat specifiek bacteriën infecteert. Ze worden onderzocht voor therapeutische toepassingen zoals bacteriofaagtherapie. | | Lytische cyclus | Een cyclus van viraal vermenigvuldiging waarbij het virus de gastheercel infecteert, zich vermenigvuldigt en uiteindelijk de cel laat barsten (lyse) om nieuwe virionen vrij te geven. | | Lysogene cyclus | Een cyclus van viraal vermenigvuldiging waarbij het virale DNA wordt geïntegreerd in het DNA van de gastheercel en daar latent aanwezig is. Het virale DNA wordt mee vermenigvuldigd met het gastheerdna. | | Virion | Een volledig virusdeeltje, bestaande uit genetisch materiaal (DNA of RNA) omgeven door een eiwitmantel (capside), en soms een buitenste envelop. Het is de infectieuze, extracellulaire vorm van een virus. | | Antigeen | Een molecuul, meestal een eiwit, op het oppervlak van een virus of bacterie dat een immuunreactie kan opwekken en de productie van antistoffen stimuleert. | | Antigene drift | Kleine, geleidelijke veranderingen in de antigenen van een virus, meestal door mutaties in het genetisch materiaal. Hierdoor kunnen virussen aan de aandacht van het immuunsysteem ontsnappen. | | Serotype | Een groep micro-organismen die dezelfde oppervlakte-antigenen delen, waardoor ze door specifieke antistoffen kunnen worden geïdentificeerd. Het wordt vaak gebruikt om verschillende stammen van virussen of bacteriën te classificeren. |

# Bacterial gene expression and cloning This topic explores the design, implementation, and challenges of expressing proteins in bacterial systems, focusing on gene constructs, cloning, expression, and host selection. ## 1. Bacterial gene expression and cloning ### 1.1 Introduction to bacterial gene expression Bacterial gene expression refers to the process by which information from a gene is used in the synthesis of a functional gene product, often a protein. This is a fundamental process in molecular biology and biotechnology, enabling the production of recombinant proteins for research, therapeutic, and industrial purposes [2](#page=2). ### 1.2 Designing constructs for bacterial gene expression Designing an effective construct for bacterial gene expression involves selecting appropriate regulatory elements and the gene of interest (GoI) [27](#page=27). #### 1.2.1 Key components of expression plasmids Expression plasmids, such as those in the 'classic' pET system, contain several critical components: * **Origin of replication (ori):** Essential for plasmid replication and maintenance within the host cell [24](#page=24). * **Selection marker:** Typically an antibiotic resistance gene, used to select for cells that have taken up the plasmid [24](#page=24). * **Promoter:** Controls the initiation of transcription of the GoI. Promoters like T7 or lacUV5 are commonly used in inducible systems [27](#page=27) [7](#page=7). * **Multiple Cloning Site (MCS):** A region containing recognition sites for various restriction enzymes, facilitating the insertion of the GoI [6](#page=6). * **Ribosome Binding Site (RBS):** A sequence upstream of the start codon that facilitates ribosome binding for translation initiation [43](#page=43). * **Terminator:** Signals the termination of transcription [7](#page=7). * **Affinity tags:** Pre-cloned sequences (e.g., His-tags, GST) that facilitate protein purification [6](#page=6). #### 1.2.2 Inducible expression systems Inducible expression systems allow for controlled protein production, typically by using a promoter that is activated by a specific inducer molecule. The pET system, a widely used example, employs the T7 promoter, which is highly active but requires T7 RNA polymerase for transcription [7](#page=7). * **T7 RNA polymerase:** This polymerase is not naturally found in E. coli and is often introduced into the host strain via a lysogenic phage, such as DE3 (e.g., BL21(DE3)). The gene encoding T7 RNA polymerase is typically under the control of an inducible promoter, such as the lacUV5 promoter, which is regulated by IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) [24](#page=24) [27](#page=27) [28](#page=28). * **IPTG induction:** IPTG is a structural homologue of allolactose and serves to de-repress the lac operon. It has a dual function: it can induce the expression of T7 RNA polymerase and it binds to the LacI repressor, thereby preventing it from binding to the lacO operator sequence, which is often located near the T7 promoter on the expression plasmid [27](#page=27) [28](#page=28). #### 1.2.3 Regulation and metabolic burden The expression of recombinant proteins can impose a significant "metabolic burden" on the bacterial cell, as transcription and translation are energy-intensive processes. This burden arises from the consumption of cellular resources such as DNA, RNA polymerases, ribosomes, and energy. If the burden is too high, it can lead to [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41): * Slower cell growth and replication rates [23](#page=23). * Plasmid loss, as cells without the plasmid gain a growth advantage [23](#page=23) [35](#page=35). * Accumulation of metabolic intermediates or redox imbalances [41](#page=41). * Even "escape mutants" where mutations reduce protein production to alleviate the burden [44](#page=44). To mitigate this, strategies like using weaker promoters or Ribosome Binding Sites (RBS), or employing auto-inducing media can be beneficial, balancing construct output with cellular capacity [39](#page=39) [43](#page=43). ### 1.3 Cloning and expression of proteins in bacterial cells The process of cloning and expressing proteins in bacteria involves several key steps: #### 1.3.1 Plasmid construction 1. **Ligation:** The GoI is inserted into a linearized expression vector, often using restriction enzymes and DNA ligase. The vector typically contains an origin of replication and a selection marker [6](#page=6). 2. **Transformation:** The recombinant plasmid is introduced into competent bacterial cells (e.g., E. coli) using methods like heat shock or electroporation [24](#page=24). 3. **Selection:** Transformed cells are plated on agar containing the appropriate antibiotic to select for cells that have successfully taken up the plasmid. #### 1.3.2 Protein expression 1. **Culture growth:** Selected colonies are grown in liquid culture to a suitable optical density. 2. **Induction:** The inducer (e.g., IPTG) is added to the culture to initiate the expression of the GoI, provided the expression system is inducible [26](#page=26) [27](#page=27). 3. **Incubation:** The culture is incubated for a period to allow for protein synthesis. 4. **Cell harvesting:** Cells are collected, usually by centrifugation [32](#page=32). #### 1.3.3 Protein purification 1. **Cell lysis:** The bacterial cells are disrupted to release the intracellular proteins. This can be achieved through physical methods (sonication, French press) or chemical methods (detergents, enzymes) [32](#page=32). 2. **Clarification:** Cell debris is removed, often by centrifugation. 3. **Purification:** The target protein is isolated from other cellular proteins. Affinity tags, which are often fused to the GoI, are crucial for this step, allowing for specific binding to a chromatography resin. Common methods include affinity chromatography, ion-exchange chromatography, and size-exclusion chromatography [32](#page=32) [6](#page=6). #### 1.3.4 Protein localization Proteins can be expressed in different cellular compartments: * **Cytoplasm:** The most traditional location for expression [32](#page=32). * **Periplasm:** The space between the inner and outer membranes of Gram-negative bacteria. Proteins can be directed here using secretion signals [32](#page=32). * **Secretion:** Proteins can be exported out of the cell [32](#page=32). * **Membrane-anchored:** Proteins can be integrated into cellular membranes [32](#page=32). The compartment of expression can be genetically altered using specific protein tags that direct transport across membranes [32](#page=32). ### 1.4 Common expression difficulties and troubleshooting Troubleshooting protein expression involves a systematic approach to identify and resolve issues [37](#page=37). #### 1.4.1 Step 1: Sanity check * **Reagent integrity:** Ensure reagents are not expired or degraded. * **Dilution errors:** Verify correct preparation of media and inducer solutions. * **Plasmid/Host issues:** Check for mutations in the plasmid or the expression strain itself. * **Regulation control:** Confirm appropriate controls are used to assess expression (e.g., negative control without inducer). #### 1.4.2 Step 2: Protein not detected or not seen * **Low expression levels:** The protein might be produced at very low levels and thus be difficult to detect on a gel. This can be influenced by promoter strength, RBS efficiency, and codon usage. Additives to enhance expression or codon optimization might be necessary [38](#page=38) [53](#page=53). * **Complex mixture:** The target protein might be "hidden" among other proteins of similar size, especially if the expression is not very high. Loading optimization for SDS-PAGE is crucial [51](#page=51). * **Incorrect size:** The protein's apparent molecular weight on a gel might differ from the expected value due to amino acid composition biases, affecting migration [51](#page=51). #### 1.4.3 Step 3: Difficult to spot problems * **Rapid degradation:** The expressed protein may be unstable and quickly degraded by cellular proteases. Strategies include changing media, strains, localization signals, or using affinity tags [37](#page=37). * **Toxicity to host:** High-level expression of some proteins can be toxic to the bacterial cell, leading to a collapse in cell density upon induction, DNA errors, or colony morphology changes. Solutions include tighter expression regulation, compartmentalization, or zymogen expression [37](#page=37). * **Slow toxicity:** Protein levels might appear normal initially but decrease with repeated expression cycles. Fresh transformations and tight regulation are key [37](#page=37). * **Insoluble proteins:** Proteins may misfold and aggregate into inclusion bodies, making them difficult to extract and purify in their soluble form. Fusion partners (e.g., MBP, GST) that are highly soluble can sometimes improve the solubility of the protein of interest [54](#page=54). #### 1.4.4 Codon usage Different organisms have preferences for specific codons to translate amino acids. If a GoI contains codons that are rare in the expression host (e.g., E. coli), it can lead to slow translation and reduced protein expression. Optimizing the codon usage of the GoI to match the host's preferred codons can significantly enhance expression levels [53](#page=53) [54](#page=54). ### 1.5 Expression host platforms The choice of expression host significantly impacts protein expression, solubility, and post-translational modifications [78](#page=78). #### 1.5.1 E. coli * **Advantages:** Well-characterized genetics, rapid growth, inexpensive media, and a vast array of molecular tools and expression vectors (e.g., pET system). It is a traditional and widely used platform for cytoplasmic expression [22](#page=22) [23](#page=23) [32](#page=32). * **Disadvantages:** Lacks eukaryotic post-translational modification machinery like glycosylation, can struggle with folding of complex proteins, and may result in inclusion body formation [78](#page=78). #### 1.5.2 Other host platforms While E. coli is common, other hosts are used depending on the protein's requirements: * **Yeast (e.g., *S. cerevisiae*, *Pichia pastoris*):** Capable of some eukaryotic post-translational modifications, such as glycosylation. * **Insect cells (e.g., using baculovirus expression vectors):** Offer more complex eukaryotic post-translational modifications and are suitable for larger and more complex proteins. * **Mammalian cells:** Provide the most complete range of eukaryotic post-translational modifications, essential for many therapeutic proteins, but are more complex and expensive to culture. The selection of a host is influenced by factors such as biological constraints (e.g., requirement for specific modifications), technical feasibility (availability of molecular tools), application needs (yield, purity), regulatory aspects, and development costs [78](#page=78). #### 1.5.3 Considerations for host choice Key considerations when selecting an expression host include: * **Upstream factors:** Plasmid or genome integration, regulation mechanisms, expression levels, cell-to-cell variation, metabolic impact, and scalability [33](#page=33) [50](#page=50) [77](#page=77). * **Downstream factors:** Compartment of expression (intracellular, periplasmic, secretion), protein solubility, stability, purification methods, scale, and the need for affinity tags or additional sequences [33](#page=33) [50](#page=50) [77](#page=77). * **Constraining factors:** Biological requirements (e.g., glycosylation), technical development of molecular tools, application goals (yield, purity, contaminant impact), regulatory compliance (biocontainment), and development costs [78](#page=78). --- # Protein isolation and analysis techniques This section details the essential methodologies employed for isolating, purifying, and analyzing proteins, ranging from initial nucleic acid extraction to advanced biochemical assessments. ### 2.1 Nucleic acid extraction and manipulation for protein research The initial stages of protein isolation can involve working with nucleic acids, particularly RNA, to understand and potentially clone the gene of interest. #### 2.1.1 RNA extraction * **Purpose:** RNA extraction is a critical first step when the gene sequence of a target protein is unknown. RNA serves as the template for subsequent reverse transcription [10](#page=10). * **Methods:** Common methods involve chaotropic salts like 6 M Guanidinium chloride or acidified phenol:chloroform mixtures (e.g., TRIzol) [10](#page=10). * **mRNA Isolation:** While total RNA is extracted, messenger RNA (mRNA) is the primary target as it directly codes for proteins. mRNA constitutes only about 1% of cellular RNA, making its enrichment beneficial for downstream applications. Techniques like polyT capture, which leverages the natural polyA tail of eukaryotic mRNA, can be used to isolate mRNA [10](#page=10) [18](#page=18). #### 2.1.2 Reverse transcription (RT) * **Purpose:** Reverse transcription converts RNA into complementary DNA (cDNA). This process is typically a 1:1 conversion, meaning there is no inherent amplification of the nucleic acid [10](#page=10) [11](#page=11). * **Enzyme:** Reverse transcriptase (RT) is the enzyme used. Some RTs, like MMLV, possess terminal transferase activity and can template hop [17](#page=17) [18](#page=18). * **Primers:** A poly-dT primer is commonly used to bind to the polyA tail of mRNA for the synthesis of the first cDNA strand [12](#page=12) [18](#page=18). * **Establishing Known Ends for PCR:** To facilitate subsequent Polymerase Chain Reaction (PCR) and make cloning/sequencing more accessible, it's crucial to establish known DNA ends [11](#page=11). * **Poly-dT primer with overhang:** A poly-T primer can be designed with a specific overhang sequence that acts as a known upstream sequence. This overhang can contain recognition sites for restriction enzymes, such as BsaI, for downstream cloning strategies like Golden Gate assembly [17](#page=17) [20](#page=20) [21](#page=21). * **DNA/RNA hybrid oligo (SMART primer):** This primer is designed to facilitate template hopping of the reverse transcriptase. When the RT reaches the 5' end of the mRNA, it can "hop" onto the provided DNA/RNA hybrid oligo, extending it and creating a second known DNA end. This oligo is often made of DNA due to cost-effectiveness compared to RNA [17](#page=17) [18](#page=18) [20](#page=20). * **Double-stranded cDNA synthesis:** After the initial cDNA synthesis, cellular polymerases can synthesize the second strand. Alternatively, specific enzymatic treatments can be employed [13](#page=13). #### 2.1.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) * **Purpose:** PCR is used to amplify the cDNA synthesized during reverse transcription. This amplification is essential because the amount of material after a single RT is often too small for efficient cloning or sequencing [11](#page=11) [21](#page=21). * **Requirements:** PCR requires two primers (forward and reverse) to enable logarithmic amplification. The known ends established during RT are used to design these primers [17](#page=17) [18](#page=18) [20](#page=20). * **Outcome:** Successful PCR yields enough double-stranded DNA material for subsequent cloning or sequencing [21](#page=21). #### 2.1.4 Cloning and Sequencing * **Cloning:** The amplified cDNA can be cloned into a suitable vector for further manipulation, storage, or expression. The original insulin cloning example utilized polyG and polyC overhangs on the plasmid and cDNA, respectively, to facilitate ligation [12](#page=12) [14](#page=14) [16](#page=16). * **Sequencing:** DNA sequencing is performed to determine the exact sequence of the isolated gene. Cloning first can be a "safer" approach for sequencing, especially when dealing with limited material or potential PCR failures, as DNA amounts are less likely to be limiting after cloning [10](#page=10) [12](#page=12). ### 2.2 Protein isolation and purification Once a protein of interest has been identified or engineered, it needs to be isolated and purified from the cellular milieu. #### 2.2.1 Cell lysis and protein solubilization * **Cell Isolation:** Cells are typically isolated using centrifugation [32](#page=32). * **Cell Disruption:** To release intracellular proteins, cells are disrupted using physical methods (e.g., sonication, French press) or chemical methods (e.g., detergents, enzymes) [32](#page=32). * **Solubility Considerations:** Proteins can be soluble or insoluble within the cell. Insoluble proteins may aggregate into inclusion bodies, often due to improper folding in a heterologous expression host lacking necessary chaperones. Detergents like SDS are crucial for denaturing and resuspending these aggregates for analysis [94](#page=94). #### 2.2.2 Electrophoretic separation techniques Electrophoresis is a cornerstone technique for separating proteins based on their physical properties. ##### 2.2.2.1 Agarose gel electrophoresis * **Matrix:** Agarose forms a large-pored matrix suitable for separating large molecules like DNA [87](#page=87). * **Principle:** An electric field drives DNA migration, primarily based on length due to its consistent charge-to-mass ratio [87](#page=87). * **Visualization:** DNA is visualized using intercalating dyes [87](#page=87). ##### 2.2.2.2 Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) * **Matrix:** Polyacrylamide forms a covalently cross-linked matrix with smaller pores than agarose, allowing for finer separation [88](#page=88). * **Applications:** PAGE can be used for both nucleic acid and protein separation [88](#page=88). ##### 2.2.2.3 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) * **Principle:** SDS-PAGE is specifically designed to separate proteins based primarily on their molecular weight [89](#page=89). * **Denaturation:** Sodium dodecyl sulfate (SDS) is an anionic detergent that denatures proteins by disrupting non-covalent bonds, unfolding them into linear polypeptide chains [89](#page=89). * **Charge Introduction:** SDS coats the protein backbone, imparting a negative charge approximately proportional to its length, with about one negative charge per three amino acids. This creates a relatively constant charge-to-mass ratio across different proteins [89](#page=89). * **Electrophoretic Migration:** In the electric field, proteins migrate towards the anode (positive electrode). Due to the constant charge-to-mass ratio, smaller proteins encounter less resistance and migrate faster than larger proteins, allowing for size-based separation [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91). * **Gel Composition:** * **Acrylamide and Bisacrylamide:** A mixture of acrylamide and bisacrylamide is used to form the gel matrix. A ratio of 19:1 (acrylamide:bisacrylamide) is typical for protein separation [89](#page=89). * **Cross-linking:** Ammonium persulfate (APS) and TEMED are used to catalyze the free radical polymerization and cross-linking of acrylamide monomers [89](#page=89). * **Reducing Agents:** Reducing agents like DTT, β-mercaptoethanol, or TCEP are often included to break disulfide bonds, ensuring complete linearization of proteins [89](#page=89). * **Discontinuous Gel System:** * **Top (Stacking) Gel:** A low-density (4-6%) gel with a lower pH. Its primary function is to stack proteins into narrow bands at the interface with the lower gel, thereby improving resolution. Glycine in the running buffer does not function as a good electrolyte at this pH [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92). * **Lower (Resolving) Gel:** A higher density gel at a pH where both electrolytes (e.g., Tris and glycine) are charged and function efficiently. This is where the actual separation by mass/charge occurs [90](#page=90) [92](#page=92). * **Troubleshooting with SDS-PAGE:** SDS-PAGE is used to assess protein expression, confirm the expected molecular weight, and can help identify issues like degradation or toxicity. However, limitations exist, such as overlapping mobilities with endogenous proteins, low detection limits, and deviations in migration for small proteins or glycosylated proteins [51](#page=51) [95](#page=95) [99](#page=99). * **Visualization:** After electrophoresis, gels are stained with dyes like Coomassie Blue or SYPRO Orange to visualize protein bands [93](#page=93). ##### 2.2.2.4 Western blotting * **Purpose:** Western blotting is a technique used to detect specific proteins in a complex mixture, confirming their presence and sequence [96](#page=96). * **Procedure:** 1. **SDS-PAGE:** Proteins are first separated by SDS-PAGE [96](#page=96). 2. **Transfer:** Proteins are transferred from the PAGE gel to a solid support membrane, typically nitrocellulose or PVDF. This immobilization is crucial because proteins are denatured and can diffuse from the gel over time [96](#page=96) [97](#page=97). 3. **Blocking:** The membrane is blocked with an inert protein solution (e.g., non-fat dry milk or BSA) to prevent non-specific binding of antibodies [97](#page=97). 4. **Antibody Detection:** Specific antibodies are used to bind to the target protein. A primary antibody recognizes the protein of interest, and a secondary antibody, often conjugated to an enzyme (e.g., HRP) or a fluorescent tag, binds to the primary antibody [97](#page=97) [98](#page=98). 5. **Detection:** A substrate is added that reacts with the enzyme conjugate to produce a detectable signal (e.g., colorimetric, chemiluminescent), allowing visualization of the specific protein band on the membrane [98](#page=98). * **Comparison to ELISA:** While both use antibody-based detection, Western blotting involves prior separation of proteins by electrophoresis, allowing for analysis of molecular weight and post-translational modifications, which ELISA does not [100](#page=100). * **Limitations:** Western blotting confirms the presence of a linear epitope and the approximate molecular weight but does not directly indicate if the protein is correctly folded or functional [99](#page=99). ### 2.3 Biochemical and physicochemical analyses Beyond separation techniques, various analytical methods are employed to characterize proteins. * **Physicochemical and biochemical analyses** are crucial for assessing protein purity, determining the active fraction, comparing different batches (lot-to-lot variation), and evaluating long-term stability during production, storage, and transport . * **Comparison to endogenous proteins** can be a valuable approach for validation . * **Functional assays** can supplement Western blots to assess protein activity and folding status [99](#page=99). > **Tip:** Troubleshooting protein expression and isolation is an iterative process. Always start with basic checks (reagents, mutations, controls) before moving to more complex analyses [51](#page=51). > **Example:** When isolating insulin, early methods involved extracting RNA from insulinomas, followed by RT-PCR and cloning using methods like creating polyG and polyC overhangs on plasmids and cDNA to facilitate ligation. Modern approaches would leverage similar principles but with potentially more efficient and specific reagents [12](#page=12) [13](#page=13) [14](#page=14) [15](#page=15) [16](#page=16) [17](#page=17). --- # Metabolic burden and expression optimization Metabolic burden refers to the cost imposed on a bacterial cell when it is forced to express foreign proteins, impacting cellular capacity and yield, and necessitates strategies for optimization, including managing cell-to-cell variation and tuning gene expression [39](#page=39) [4](#page=4). ### 3.1 Understanding metabolic burden Metabolic burden arises from the cellular processes required for heterologous protein expression, which consumes essential resources like DNA, RNA polymerases, ribosomes, and energy from a common cellular pool. This forces the cell to expend energy on producing a protein that offers no evolutionary advantage, leading to a decrease in its overall fitness and growth rate [39](#page=39) [43](#page=43). #### 3.1.1 The cost of heterologous expression Heterologous expression involves compelling a cell to produce a non-native protein, often in large quantities. This is an energy-intensive process. The demands of transcription and translation, along with the maintenance of foreign DNA (e.g., plasmids), divert cellular resources [40](#page=40) [41](#page=41) [43](#page=43). * **Resource consumption:** Key cellular components such as DNA, RNA polymerases, ribosomes, and energy are finite and shared among all cellular processes [39](#page=39) [43](#page=43) [45](#page=45). * **Energy budget:** Cells operate within a maximum energy budget determined by their growth media. Introducing a foreign gene and inducing its expression significantly increases the demand on this budget [41](#page=41). * **Imbalances:** When a large fraction of the cellular budget is allocated to producing a foreign protein, insufficient resources remain for essential cellular functions, leading to imbalances. These can manifest as accumulating metabolic intermediates or redox imbalances due to slow replenishment of key enzymes. Even energy-dependent processes like nutrient import can be affected [41](#page=41). #### 3.1.2 Consequences of metabolic burden The increased metabolic load can lead to reduced cell growth rates and potential cellular stress responses. In extreme cases, the cell may struggle to cope, leading to the "rebellion" or even loss of the foreign DNA [40](#page=40) [41](#page=41). * **Reduced growth rate:** High demand for protein production can slow down cell replication [40](#page=40). * **Cellular stress:** The cell activates "alarm" responses to rebalance its metabolic budget [41](#page=41). * **Plasmid loss:** Prolonged or severe burden can lead to mutations and host/plasmid adaptations that reduce protein production per cell, freeing up resources for growth, or in more severe cases, lead to the loss of the plasmid altogether [44](#page=44). > **Tip:** Think of metabolic burden as asking a single person to perform multiple demanding tasks simultaneously; at some point, their performance will degrade, and they may become overwhelmed. > **Example:** A walker tasked with simply walking to a train station takes an hour. If asked to move their arms while walking, it might take slightly longer or be more tiring but manageable. However, if they are also asked to carry a heavy backpack, walk backward, and wear a costume, their ability to reach the station will be severely impacted, highlighting the concept of cumulative burden [40](#page=40). ### 3.2 Cellular capacity monitor A "cellular capacity monitor" is a concept from engineering applied to biological systems to gauge the metabolic burden on a cell. It is typically a low-cost reporter gene, such as GFP, expressed under a weak promoter and ribosome binding site (RBS) [39](#page=39) [40](#page=40) [45](#page=45). * **Function:** This monitor acts as an early warning system. If the cell begins committing significant capacity to a particular process (like expressing a protein of interest, PoI), the expression of the reporter gene will be readily affected, often dropping [40](#page=40). * **Purpose:** It helps researchers understand if the cell is under stress from high expression levels, serving as a "canary in a mine" [40](#page=40). ### 3.3 Optimizing expression and yield Optimizing foreign protein expression involves balancing the output of the desired protein with the cell's capacity to support it. This requires careful consideration of genetic elements and cellular resources. #### 3.3.1 Balancing construct output and cell capacity The goal is to achieve a simultaneous maximization of both construct output (the desired protein) and cell capacity (the cell's ability to function and grow). This is not a simple linear relationship; often, as cellular capacity is compromised to increase construct output, the overall yield can decrease [39](#page=39). * **Efficiency:** Defined as a measure of simultaneously maximizing construct output and cell capacity [39](#page=39). * **Optimal balance:** There exists an optimal point where a substantial portion of the cellular budget can be dedicated to protein production without completely sacrificing the cell's ability to perform its essential functions. For researchers, this means finding a sweet spot where the construct output is high, but enough capacity remains for the cell to avoid severe stress and maintain functionality [39](#page=39). #### 3.3.2 Role of genetic elements in optimization The design of expression constructs plays a crucial role in managing metabolic burden. * **Weaker RBS:** Using a weaker RBS can be beneficial in preventing overburdening the cell, particularly when combined with a strong promoter on a high-copy-number plasmid. A strong promoter generates many transcripts, and a strong RBS would lead to most ribosomes being occupied with translating the foreign gene. This monopolization of ribosomes can lead to imbalances and slow down the cell. A weaker RBS can moderate the rate of translation, allowing ribosomes to also support essential cellular functions [43](#page=43). * **Leaky expression:** Some expression systems can exhibit "leakiness," where a small amount of protein is expressed even in the absence of an inducer. This can be a factor to consider when designing strains or troubleshooting expression issues [31](#page=31). > **Tip:** When designing a construct, consider that stronger promoters and RBSs don't always equate to higher overall functional yields due to the potential for overwhelming the cell's metabolic capacity. > **Example:** In a system with a high copy number plasmid, a strong promoter, and a strong RBS, a cell might dedicate almost all its ribosomes to translating the foreign gene. This leads to a lack of essential proteins (metabolic enzymes, membrane components) and can result in imbalances, slowing growth and even triggering plasmid loss. Using a weaker RBS in this scenario can lead to higher yields of the foreign protein with better cell growth [43](#page=43). #### 3.3.3 Induced vs. uninduced constructs Distinguishing between induced and uninduced constructs is vital for understanding the costs associated with expression [41](#page=41). * **Uninduced construct:** Represents the baseline cost of harboring the foreign DNA, including plasmid replication, regulatory mechanisms, and any basal or "leaky" expression [41](#page=41). * **Induced construct:** Includes the costs of the uninduced construct plus the significant resource expenditure required for active protein synthesis. Induction typically involves adding a specific chemical inducer (e.g., IPTG or arabinose) to activate gene expression from a regulated promoter [40](#page=40) [41](#page=41). ### 3.4 Cell-to-cell variation and expression tuning Gene expression in bacterial populations is not a uniform, continuous process but rather a stochastic and variable one, exhibiting cell-to-cell and temporal variations [46](#page=46). #### 3.4.1 Noise in gene expression "Noise" in gene expression refers to the inherent randomness in biological processes, especially when dealing with small numbers of molecules [46](#page=46). * **Stochasticity:** Events like transcription factor binding or the initiation of transcription involve discrete steps with associated probabilities. This means that even under the same conditions, individual cells can have different expression levels due to random fluctuations [46](#page=46). * **Analogy:** It's like flipping a coin; while an unbiased coin has a 50/50 chance of heads or tails, you cannot predict the exact number of throws needed to get a head, nor can you guarantee an equal number of heads and tails in a small series of throws [46](#page=46). #### 3.4.2 Tuning gene expression Tuning refers to the correlation between the amount of inducer present and the resulting level of gene expression. This can be observed at both the individual cell level and the population level [46](#page=46). * **Population tuning:** Involves increasing the overall amount of product produced across the entire population of cells, or by increasing the fraction of cells that are producing the protein [46](#page=46). * **Cell tuning:** Represents a scenario where some cells might become high producers while others remain non-producers, even with the same inducer concentration. This can have significant implications for metabolic burden, as non-expressing cells may outgrow strongly expressing ones [47](#page=47). > **Example:** Imagine a population of 10 cells. > * **Uninduced:** All 10 cells express zero reporter protein . > * **Scenario 1 (Cell tuning):** After induction, 5 cells express at a high level, and 5 remain at zero expression. The average expression is 1 . > * **Scenario 2 (Population tuning):** After induction, all 10 cells express at a moderate level. The average expression is also 1 . > While the population average is the same, the per-cell distribution of expression is very different, impacting the metabolic burden differently [47](#page=47). * **Tunable inducers:** Some inducers are described as 'tunable,' implying that their concentration can be adjusted to control the level of expression, offering a mechanism to manage metabolic burden [46](#page=46). --- # Expression hosts and host engineering This section explores the diverse range of expression hosts utilized for protein production and the advanced techniques of host engineering to enhance protein expression and functionality. ### 4.1 Overview of expression considerations When selecting an expression host, several factors influence the upstream and downstream processes of protein production [77](#page=77). * **Upstream considerations** include the nature of the plasmid or genome used, regulatory elements, expression levels, cell-to-cell variation, metabolic impact on the host, and the desired scale of production [77](#page=77). * **Downstream considerations** involve the protein's compartment (intracellular, periplasmic, or secretion), solubility, stability, the chosen purification method, scale, and the use of affinity tags or additional sequences [77](#page=77). These considerations are often constrained by biological, technical, application-specific, and regulatory factors. Biological constraints include essential post-translational modifications (PTMs) for proper protein folding. Technical constraints relate to the availability and development of molecular tools for a specific host. Application requirements focus on yield, purity, and the impact of potential contaminants. Regulatory aspects, such as biocontainment, and development costs are also critical [78](#page=78). ### 4.2 Complexity of expression hosts Expression hosts range in complexity from cell-free systems to single-celled organisms and multicellular organisms. The spectrum includes [80](#page=80): * **Cell-free systems:** These systems utilize cellular extracts to perform protein synthesis outside of living cells. * **Single-cell organisms:** * Bacteria (e.g., *Escherichia coli*, *Corynebacterium glutamicum*, *Lactobacillus* spp., *Pseudomonas putida*, *Vibrio natriegens*) [83](#page=83). * Yeasts (e.g., *Saccharomyces cerevisiae*, *Pichia pastoris*) [83](#page=83). * Algae [80](#page=80). * Archaea [80](#page=80). * **Multicellular organisms:** * Insect cells [80](#page=80). * Mammalian cells (e.g., Chinese hamster ovary (CHO), Human embryonic kidney (HEK)) (#page=80, 83) [80](#page=80) [83](#page=83). * Transgenic plants [80](#page=80). * Transgenic animals [80](#page=80). > **Tip:** *Escherichia coli* is known for issues with protease accumulation and acetate imbalance, which can lead to toxicity [83](#page=83). ### 4.3 Prokaryotic expression hosts Prokaryotes, such as *Escherichia coli*, offer significant advantages for large-scale protein expression: * **Strengths:** * Easy to manipulate genetically and develop [83](#page=83). * Capable of large-scale fermentation [83](#page=83). * Generally achieve high yields, with the desired protein sometimes constituting up to 20% of the culture's dry weight [83](#page=83). * Simple and inexpensive feedstock requirements [83](#page=83). * **Limitations:** * Exhibit minimal post-translational modifications (PTMs) [83](#page=83). * Provide the lowest support for proper protein folding [83](#page=83). * PTMs can differ significantly from human PTMs, which can be a limitation for therapeutic proteins where specific modifications are required for function or to minimize immunogenicity [83](#page=83). > **Example:** A "high yield" in bacterial and yeast systems means achieving grams per liter (g/L) scale in protein synthesis, which translates to a lower cost of production per mass of expressed protein [83](#page=83). ### 4.4 Yeast expression hosts Yeasts, including *Saccharomyces cerevisiae* and *Pichia pastoris*, are also widely used for protein expression: * **Strengths:** * Relatively easy to manipulate genetically [83](#page=83). * Can be grown in large-scale fermentations [83](#page=83). * Can achieve high yields [83](#page=83). * Are capable of performing PTMs, though these can differ from human PTMs [83](#page=83). * **Limitations:** * Can have slower growth rates compared to bacteria [83](#page=83). * Scaling up can be more challenging [83](#page=83). * Can be more expensive to culture [83](#page=83). ### 4.5 Mammalian cell expression hosts Mammalian cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) and human embryonic kidney (HEK) cells, are crucial for producing complex therapeutic proteins that require human-like PTMs: * **Strengths:** * Support all necessary PTMs, which are critical for protein function and immunogenicity [83](#page=83). * Can be grown in suspension, facilitating scale-up [83](#page=83). * **Limitations:** * Can be slow to grow [83](#page=83). * Scaling up can be difficult [83](#page=83). * Often require expensive, serum-supplemented media [83](#page=83). ### 4.6 Transgenic organisms for protein production Transgenic plants and animals can be engineered to produce proteins, particularly for large-scale applications. #### 4.6.1 Therapeutic production in transgenic milk The host genome can be engineered to introduce a gene of interest (GoI), which is the gene encoding the desired protein. Promoters can be used to restrict expression to specific tissues, such as the mammary gland for milk production [81](#page=81). > **Example:** In therapeutic production using transgenic milk, the GoI would be the gene coding for a therapeutic protein. For instance, spider silk genes could be introduced into a goat to produce spider silk in its milk [81](#page=81). However, proteins can sometimes leak into the organism's circulation, potentially affecting animal health [81](#page=81). #### 4.6.2 Case study: Human antithrombin III (hAT) in goat's milk The production of human antithrombin III (hAT) in goat's milk is a notable example [82](#page=82). * **Company Evolution:** The companies involved in its development have undergone several name changes, illustrating the dynamic nature of the biopharmaceutical industry (e.g., Genezyme Transgenics Corporation  GTC Biotherapeutics  rEVO  LFB Biotechnologies) [82](#page=82). * **Product:** Human antithrombin III (hAT) is a 52 kDa serpin (serine protease inhibitor) [82](#page=82). * **Characteristics of rhAT in Goat's Milk:** * Exhibits a modified glycosylation pattern compared to native hAT [82](#page=82). * Has a 7 to 10-fold lower serum half-life [82](#page=82). * Possesses a 4-fold higher heparin affinity [82](#page=82). * **Limitations:** Not suitable for patients allergic to goat albumins [82](#page=82). ### 4.7 Host engineering Host engineering involves modifying the host organism to improve protein production and introduce desired functionalities. This can include altering the host's genetic code or incorporating enzymes from different hosts [84](#page=84). * **Deeper host engineering** refers to modifying the host to access functionalities not typically present, going beyond the introduction of the gene of interest [84](#page=84). * **Examples of host engineering:** * **Yeast glycosylation:** Engineering yeast strains to exhibit a "humanized" glycosylation pattern, which is much closer to the human one, can address limitations in producing proteins like IgG [84](#page=84). * **Incorporation of unnatural amino acids:** Modifying the organism's genetic code to allow the incorporation of chemically modified or unnatural amino acids [84](#page=84). * **Cytoplasmic environment modification:** Alterations, such as those seen in CHO cell engineering, can address issues like the reducing environment in the cytoplasm, which can be detrimental for certain protein productions [85](#page=85). > **Tip:** Host engineering aims to overcome perceived limitations of a particular host. By combining engineered traits, it is possible to develop hosts that are significantly better suited for producing specific recombinant proteins (#page=84, 85 [84](#page=84) [85](#page=85). ### 4.8 Impact of host engineering on biopharmaceutical production The landscape of biopharmaceutical production is vast, with numerous approved and developing biologics. Deeper host engineering has the potential to significantly alter the balance of preferred expression systems. By enabling modifications that were previously considered limitations, such as achieving human-like PTMs or optimizing cellular environments, host engineering can lead to more efficient and effective production of complex protein therapeutics (#page=84, 85 [84](#page=84) [85](#page=85). --- ## Common mistakes to avoid - Review all topics thoroughly before exams - Pay attention to formulas and key definitions - Practice with examples provided in each section - Don't memorize without understanding the underlying concepts

| Term | Definition | |------|------------| | Construct | A designed DNA molecule, often a plasmid, engineered for a specific purpose such as bacterial gene expression. It contains regulatory elements and the gene of interest for manipulation and expression within a host cell. | | Cloning | The process of isolating a specific gene or DNA fragment and inserting it into a vector, which is then replicated within a host organism to produce multiple copies of the DNA. This is fundamental for gene expression and study. | | Gene of Interest (GoI) | The specific gene that a researcher wishes to express or study within a bacterial system. This gene encodes the protein of interest. | | Protein of Interest (PoI) | The protein encoded by the gene of interest (GoI) that a researcher aims to produce through bacterial expression and subsequent purification. | | Plasmid | A small, circular, double-stranded DNA molecule that is distinct from a cell's chromosomal DNA. Plasmids naturally exist in bacterial cells and are commonly used as vectors in molecular biology for gene cloning and expression. | | Multiple Cloning Sites (MCS) | A short region in a cloning vector that contains a sequence of DNA with several unique restriction enzyme recognition sites. This allows for the insertion of foreign DNA fragments into the vector at multiple positions. | | Affinity Tag | A short peptide sequence or protein fused to a protein of interest to facilitate its purification. These tags bind specifically to a particular ligand or matrix, enabling easy separation of the target protein from other cellular components. | | T7 RNA Polymerase | A highly efficient RNA polymerase from the bacteriophage T7. It is often used in bacterial expression systems to drive high levels of transcription from T7 promoters, leading to significant protein production. | | T7 Promoter | A DNA sequence recognized and bound by T7 RNA polymerase, initiating transcription. It is a strong promoter commonly used in expression vectors to achieve high levels of gene expression in bacteria. | | Lac Operon | A genetic unit in bacteria that encodes genes for the metabolism of lactose. It is a classic example of gene regulation, typically induced by lactose or its analog, IPTG. | | LacI (Lacl repressor) | A protein that acts as a repressor in the lac operon system. It binds to the operator region, blocking transcription unless an inducer molecule is present. | | LacO (Lac Operator) | A DNA sequence within the lac operon to which the LacI repressor protein binds. This binding prevents RNA polymerase from initiating transcription of the operon's genes. | | IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | A synthetic inducer molecule that mimics the natural inducer of the lac operon, allolactose. It binds to the LacI repressor, causing it to detach from the operator and allow transcription of genes under the control of the lac promoter. | | Induction | The process of activating gene expression, often by adding a specific inducer molecule (like IPTG) to the bacterial culture. This triggers the transcription and translation of the gene of interest. | | Expression Host | A specific strain of bacteria, such as E. coli, chosen for its ability to express foreign genes and produce proteins. Different host strains have various characteristics that can impact protein yield and quality. | | BL21(DE3) | A common E. coli expression strain that contains a copy of the T7 RNA polymerase gene integrated into its genome via a lambda DE3 lysogen. This strain is particularly well-suited for high-level protein expression using T7 promoter-based vectors. | | Plasmid Loss | The phenomenon where bacterial cells fail to retain a plasmid during growth. This can occur due to errors in replication and segregation or when cells without the plasmid have a growth advantage. | | Metabolic Burden | The physiological cost to a bacterial cell resulting from the expression of foreign genes or the maintenance of plasmids. This burden can divert cellular resources, impacting growth and overall fitness. | | Origin of Replication (ori) | A specific DNA sequence on a plasmid where DNA replication begins. It is essential for the plasmid to be replicated and maintained within the bacterial host cell. | | Selection Marker | A gene present on a plasmid that confers a selectable trait, such as antibiotic resistance. This allows for the identification and selection of bacterial cells that have successfully taken up the plasmid. | | Antibiotic Resistance Marker | A type of selection marker that confers resistance to a specific antibiotic. Bacteria containing the plasmid with this marker can survive and grow in the presence of the antibiotic, while those without it are killed. | | Cytoplasmic Expression | The production of a recombinant protein directly within the cytoplasm of a bacterial cell. This is a common method for protein expression, though the protein may need to be purified from the cell lysate. | | Periplasm | The compartment between the inner and outer membranes of Gram-negative bacteria. Proteins can be directed to the periplasm for expression and isolation, which can sometimes aid in folding or stability. | | Secretion | The process by which a protein is exported from the bacterial cell into the surrounding medium. This can facilitate purification and avoid issues related to intracellular accumulation or toxicity. | | Upstream Processing | All steps in bioprocessing that occur before the expression of the target protein. This includes gene cloning, construct design, and optimization of expression conditions. | | Downstream Processing | All steps in bioprocessing that occur after the expression of the target protein. This involves the isolation, purification, and formulation of the expressed protein. | | Codon Usage | The differential frequency of synonymous codons used to encode amino acids in different organisms. Optimizing codon usage can improve protein expression levels in a heterologous host. | | Ribosome Binding Site (RBS) | A sequence on messenger RNA (mRNA) that initiates the process of translation. The strength of the RBS influences the rate of translation and thus protein production. | | Leaky Expression | A low level of gene expression that occurs even in the absence of an inducer. This can be due to incomplete repression or spontaneous transcription. | | T7 Lysozyme | A protein co-expressed with T7 RNA polymerase in some systems, which can bind to and inhibit T7 RNA polymerase activity. It is used to reduce leaky expression by titrating out small amounts of T7 RNA polymerase. | | Cell-to-cell Variation | Differences in gene expression levels or cellular behavior observed among individual cells within a bacterial population, even under the same conditions. This is often due to stochastic events in gene regulation. | | Noise (in gene expression) | The random fluctuations in gene expression levels within a cell or population. This arises from the inherent probabilistic nature of molecular interactions in biological systems. | | Tuning | The process of adjusting the level of gene expression in response to specific stimuli or conditions. It can occur at the cell level or the population level. | | Logic Gates | Biological circuits designed to mimic the behavior of electronic logic gates, taking multiple inputs and producing an output based on predefined logical rules. These are used for complex gene regulation. | | Heterologous Expression | The expression of a gene or protein from one organism in a different host organism. For example, expressing a human gene in E. coli. | | Fusion Partner | A protein that is genetically fused to a protein of interest. Fusion partners can be used to improve solubility, facilitate purification, or aid in protein folding. | | Solubility | The ability of a protein to dissolve in a solvent, such as an aqueous buffer. In protein expression, achieving soluble protein is crucial for downstream applications. | | Codon Optimization | The process of altering the DNA sequence of a gene so that it uses codons that are frequently employed by the expression host organism. This can significantly enhance protein production. | | Ribosome Stalling | A temporary halt in the translation process by a ribosome, often caused by the presence of rare codons or issues with tRNA availability. This can sometimes be exploited to improve protein folding. | | RNA Extraction | The process of isolating RNA molecules from cells or tissues, serving as a template for subsequent molecular biology techniques. | | Reverse Transcription | A process where an enzyme, reverse transcriptase, synthesizes a complementary DNA (cDNA) strand from an RNA template. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | A laboratory technique used to amplify specific segments of DNA, creating millions of copies from a small initial amount. | | DNA/RNA Hybrid Oligo | A short, synthetic strand of nucleic acid composed of both DNA and RNA components, often used to facilitate specific molecular interactions or as a primer. | | Agarose Gel Electrophoresis | A technique used to separate DNA fragments based on their size and electrical charge by passing them through a gel matrix made of agarose. | | Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) | A technique used to separate proteins or nucleic acids based on their size and electrical charge by passing them through a gel matrix made of polyacrylamide. | | SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) | A widely used technique for separating proteins based on their molecular weight by denaturing them with SDS and separating them through a polyacrylamide gel. | | Western Blotting | A technique used to detect specific proteins in a sample by transferring them from a gel to a membrane and then using antibodies to identify and bind to the target protein. | | Biochemical Analyses | The study and measurement of the chemical properties and reactions of biological molecules, often used to characterize purified proteins. | | Reverse Transcriptase (RT) | An enzyme that synthesizes a DNA molecule from an RNA template through the process of reverse transcription. | | SMART oligo | A proprietary hybrid RNA/DNA primer designed for template hopping during reverse transcription, enabling 5'-end sequence generation. | | Terminal Transferase (TdT) | An enzyme that adds nucleotides to the 3' end of a DNA strand without the need for a template, often used to create overhangs for cloning. | | Poly-dT primer | A short oligonucleotide sequence consisting of thymine bases, used to initiate reverse transcription by binding to the poly-A tail of mRNA. | | Poly-G overhang | A sequence of guanine nucleotides added to the 3' end of a DNA strand, often created by terminal transferase, to facilitate ligation into a cloning vector. | | Poly-C overhang | A sequence of cytosine nucleotides added to the 3' end of a DNA strand, often created by terminal transferase, to facilitate ligation into a cloning vector. | | Electrophoresis | A laboratory technique that uses an electric field to separate molecules based on their size and electrical charge as they migrate through a medium. | | Denaturation | The process of disrupting the three-dimensional structure of a protein or nucleic acid, often through chemical or thermal means, leading to loss of function. | | Anode | The positive electrode in an electrochemical cell, towards which negatively charged ions (anions) migrate. | | Cathode | The negative electrode in an electrochemical cell, towards which positively charged ions (cations) migrate. | | Stacking Gel | The upper, less dense gel layer in a discontinuous gel electrophoresis system, designed to concentrate and compress protein samples before they enter the resolving gel. | | Resolving Gel | The lower, more dense gel layer in a discontinuous gel electrophoresis system, where the actual separation of proteins by size occurs. | | Coomassie Blue | A common stain used to visualize proteins in polyacrylamide gels, binding to the proteins and making them visible as colored bands. | | SYPRO Orange | A fluorescent dye used to stain proteins in gels, offering higher sensitivity than Coomassie Blue for visualization. | | Inclusion Body | Aggregates of misfolded or insoluble proteins that form within bacterial cells during recombinant protein expression. | | Nitrocellulose Membrane | A type of membrane material commonly used in Western blotting to immobilize proteins transferred from a gel for subsequent antibody detection. | | Blocking Step | A procedure in blotting techniques (like Western blotting) where unoccupied sites on the membrane are coated with blocking agents to prevent non-specific binding of antibodies. | | Antibody | A protein produced by the immune system that specifically binds to a particular antigen, used in blotting techniques to detect specific proteins. | | Physicochemical Analyses | Analyses that study the physical and chemical properties of substances, often used to characterize purified proteins. | | Lot-to-lot Variation | Differences observed in the quality or characteristics of a product manufactured in different production batches. | | Cellular Capacity Monitor | A reporter gene, such as GFP, used to gauge the metabolic burden on a cell. Expressed with a weak promoter and ribosome binding site (RBS), it is designed to be sensitive to changes in cellular resources. A drop in reporter expression indicates that the cell is committing its capacity to another process, like the expression of a protein of interest, and is under stress. | | Induced Cultures | Bacterial cultures that have undergone the process of activation for the expression of a gene of interest (GoI). This activation is typically triggered by the addition of an inducer molecule, after which the cultures are referred to as induced. | | Uninduced Cultures | Bacterial cultures prior to the addition of an inducer molecule. In this state, the expression of the gene of interest is not yet activated, providing a baseline measurement of cellular costs associated with harboring a plasmid and potentially leaky expression. | | Tuning (Gene Expression) | A phenomenon that describes a correlation between the amount of an inducer present and the level of gene expression achieved. This can manifest at the population level by increasing protein production in every cell or by increasing the proportion of cells within the population that are actively producing the protein. | | Noise (Gene Expression) | The inherent stochasticity and variability observed in biological processes, particularly at the molecular level where discrete events with probabilities of success occur. This can lead to spontaneous gene expression even without external regulatory signals, analogous to unpredictable coin tosses. | | Cell Tuning | A scenario where, in a population of cells, a specific inducer level results in some cells becoming high producers of a protein while others remain non-producers. This variation in response at the individual cell level is distinct from population tuning where expression levels are more uniformly distributed. | | Population Tuning | A scenario where, in response to an inducer, a population of cells exhibits a consistent increase in protein expression across all or most cells. This differs from cell tuning, where the response is more heterogeneous, with some cells showing high production and others little to none. | | Expression Hosts | Organisms or cellular systems utilized for the production of recombinant proteins, chosen based on factors like protein folding, post-translational modifications, ease of manipulation, scale-up potential, yield, and cost. | | Host Engineering | The process of modifying the genetic makeup or cellular machinery of an expression host to enhance protein production, improve protein functionality, or introduce novel characteristics for specific applications. | | Post-Translational Modification (PTM) | Biochemical modifications that occur to a protein after its synthesis on the ribosome, which can include glycosylation, phosphorylation, and disulfide bond formation, crucial for protein folding, function, and stability. | | Yield | The amount of purified protein obtained relative to the mass of cells or the volume of culture used; a higher yield translates to a more cost-effective production process per unit of expressed protein. | | Biocontainment | Measures and strategies employed to prevent the unintended release or spread of genetically modified organisms (GMOs) or biological agents from a laboratory or production facility into the environment. | | Glycosylation | A type of post-translational modification where carbohydrate chains (glycans) are covalently attached to a protein, significantly influencing its folding, stability, solubility, and biological activity. | | Intracellular Expression | The production of a recombinant protein within the cytoplasm or nucleus of a host cell, requiring subsequent extraction and purification from the cell lysate. | | Periplasmic Expression | The production of a recombinant protein in the periplasm, a compartment located between the inner and outer membranes of Gram-negative bacteria, offering advantages in terms of protein folding and disulfide bond formation. | | Transgenic Organisms | Organisms that have been genetically modified by the introduction of DNA from another organism, allowing them to express foreign genes and produce specific proteins, such as therapeutic proteins in milk. | | Prokaryotes | Single-celled microorganisms that lack a membrane-bound nucleus and other organelles, commonly used as expression hosts due to their rapid growth, ease of manipulation, and high protein yields; examples include *Escherichia coli* and *Corynebacterium glutamicum*. | | Eukaryotes | Organisms whose cells contain a nucleus and other membrane-bound organelles, including yeast, insect cells, and mammalian cells, which offer more complex post-translational modification capabilities than prokaryotes. | | Yeast | A type of eukaryotic microorganism widely used as an expression host, known for its ability to perform post-translational modifications and grow in large-scale fermentation; examples include *Saccharomyces cerevisiae* and *Pichia pastoris*. | | Insect Cells | Eukaryotic cells derived from insects, often used for the expression of complex recombinant proteins that require specific post-translational modifications, particularly glycosylation, which can be achieved using baculovirus expression systems. | | Mammalian Cells | Eukaryotic cells derived from mammals, such as Chinese Hamster Ovary (CHO) cells and Human Embryonic Kidney (HEK) cells, which are capable of performing human-like post-translational modifications, making them ideal for producing therapeutic proteins. | | Transgenic Plants | Plants that have been genetically modified to express foreign genes, allowing for the production of recombinant proteins in seeds, leaves, or other plant tissues, offering a scalable and potentially cost-effective production system. | | Transgenic Animals | Animals that have been genetically modified to express foreign genes, with potential applications for producing therapeutic proteins in their milk, blood, or eggs, though ethical and regulatory considerations are significant. | | Unnatural Amino Acids | Amino acids that are not among the standard 20 genetically encoded amino acids, which can be incorporated into proteins through host engineering to expand the functional diversity and chemical properties of recombinant proteins. |

# Ontwikkeling van biotherapeutica en eiwitmodificatie Dit onderwerp behandelt de engineering van eiwitten voor de ontwikkeling van biotherapeutica, inclusief het ontwerpen van constructies, het gebruik van linkers en de modificatie van eiwitten middels mutaties, inserties en deleties, waarbij de focus ligt op hoe deze veranderingen de functie en eigenschappen van eiwitten beïnvloeden. ## 1.1 Inleiding tot biotherapeutische engineering Biotherapeutische engineering omvat verschillende strategieën om eiwitten te modificeren voor therapeutische doeleinden. Deze modificaties kunnen variëren van puntmutaties, inserties en deleties tot de chemische modificatie van eiwitten, het gebruik van onnatuurlijke aminozuren, het aanbrengen van tags voor zuivering of detectie, domeinwissels, en de fusie van functionele domeinen, wat leidt tot de creatie van nieuwe eiwitten [16](#page=16). ## 1.2 Belang van eiwitstructuur en modificaties De uiteindelijke toepassing van een eiwit stuurt de ontwerpstappen voor de ontwikkeling ervan. Eiwitstructuur is cruciaal voor functie en veiligheid van medicijnen, aangezien de meeste eiwitten een beperkt stabielheidsbereik hebben en misgevouwen eiwitten over het algemeen niet correct terugvouwen. Veranderingen in eiwitten, zoals post-translationele modificaties (PTM's) zoals glycosylering, acetylering, fosforylering en prenylering, kunnen de eigenschappen en functie van een eiwit significant beïnvloeden. De verwerking en zuivering van eiwitten, evenals de uiteindelijke formulering, bepalen mede de levensvatbaarheid van het product [17](#page=17) [18](#page=18) [4](#page=4). ## 1.3 Ontwerp van eiwitconstructies Het ontwerpproces van een eiwitconstructie begint met het identificeren van het gen van interesse (GoI) en de beoogde toepassing (Application), leidend tot het uiteindelijke eiwit van interesse (PoI). Dit proces omvat DNA-assemblage, eiwitexpressie en eiwitzuivering [4](#page=4). ### 1.3.1 DNA-assemblage en expressiekeuzes Bij de DNA-assemblage worden keuzes gemaakt met betrekking tot de bron van DNA en de methodologie voor DNA-assemblage. Voor expressie wordt het expressiesysteem, de subcloneringsstrategie, de keuze van zuiveringstags en de keuze van linkers bepaald [5](#page=5). ### 1.3.2 Voorbeeld: scFv constructie Een voorbeeld van een constructie is een single-chain variable fragment (scFv), dat bestaat uit de VH (variabele zware keten) en VL (variabele lichte keten) regio's van een antilichaam die de bindingsplaats vormen. Deze constructie is typisch klein, heeft weinig glycosylering en is niet-toxisch, waardoor expressie in *E. coli* mogelijk is met een IPTG-induceerbaar systeem, mits er een hoge zuiverheid vereist is [6](#page=6) [7](#page=7). #### 1.3.2.1 Rol van expressievectoren en linkers Expressievectoren, zoals pET28, bevatten regulatie van transcriptie en kunnen vaak standaard zuiveringstags bevatten, zoals een His-tag, die snelle, maar niet altijd zeer selectieve zuivering mogelijk maakt. Om individuele componenten van het eiwit van interesse (PoI) en tussen het PoI en de zuiveringstag te scheiden, zijn eiwitlinkers nodig. Linkers kunnen de oplosbaarheid, vouwing, expressieniveaus, bioactiviteit, labellering, farmacokinetiek en -dynamiek van eiwitten beïnvloeden. Ze kunnen variëren van enkele aminozuren tot hele fusiedomeinen [7](#page=7) [8](#page=8) [9](#page=9). #### 1.3.2.2 Revisie van componenten en DNA-assemblagemethoden Het ontwerpproces kan iteratief zijn, waarbij componenten herzien moeten worden. DNA-assemblagemethoden, zoals Type IIS restrictie-enzymen, maken "scarless" klonering mogelijk, waarbij overbodige sequenties aan het einde van het eiwit worden vermeden. PCR kan worden gebruikt om DNA te amplificeren met specifieke overhangen die nodig zijn voor klonering of om gewenste sequenties, zoals linkers, te introduceren [10](#page=10) [11](#page=11) [12](#page=12) [13](#page=13). ### 1.3.3 Eindsituatie van een constructie Een succesvol ontworpen constructie, zoals een scFv, kan een VH-domein bevatten, een flexibele linker, een VL-domein en een minimale linker gevolgd door een inteïn-tag, die uiteindelijk resulteert in een zuiver eiwit [13](#page=13) [14](#page=14). ## 1.4 Protein tags voor zuivering en functionaliteit Protein tags zijn genetisch gecodeerde sequenties die aan het eiwit van interesse worden gefuseerd en verschillende functies kunnen dienen. Hoewel ze vaak voor zuivering worden gebruikt door hun specifieke biofysische eigenschappen te benutten, kunnen ze ook andere rollen vervullen, zoals het beïnvloeden van farmacokinetiek of het faciliteren van detectie [18](#page=18) [19](#page=19). ### 1.4.1 His-tag De His-tag, traditioneel bestaande uit zes histidines, maakt zuivering mogelijk via de chelatie van metaalionen (zoals Cu²⁺, Ni²⁺, Co²⁺). Elutie gebeurt door competitie met imidazole, dat bindt aan het metaalion. De selectiviteit kan worden beïnvloed door het type metaalion; kobalt kan leiden tot hogere zuiverheid door minder binding van contaminanten, terwijl koper meer eiwitherstel kan bieden. De His-tag is niet erg selectief vanwege de lage affiniteit voor het Ni-NTA-medium, die niet significant verschilt van die van natuurlijke eiwitten zonder His-tag [20](#page=20) [21](#page=21). ### 1.4.2 Inteïne + Chitin Binding Protein (NEB IMPACT systeem) Het NEB IMPACT systeem maakt gebruik van een fusie van een inteïne met een chitin-bindend domein (CBD). Het CBD zorgt voor efficiënte opvang van het getagde eiwit op een chitin-kolom. Na activatie van de inteïne kan het gezuiverde eiwit selectief worden geëlueerd. Het voordeel hiervan is een lage achtergrondbinding aan de chitin, wat minder zuiveringsstappen vereist voor toepassingen zoals kristalografie of therapeutica. In tegenstelling tot een His-tag, blijft het eiwit na zuivering met het inteïn-CBD-systeem meestal tag-vrij [22](#page=22) [23](#page=23) [9](#page=9). ### 1.4.3 Myc tag De Myc tag is gebaseerd op het EQKLISEEDL epitope, waarvoor c-myc antilichamen beschikbaar zijn. Elutie kan plaatsvinden door competitie met een peptide, veranderingen in pH, of denaturatie met middelen zoals ureum of guanidine. Denaturerende elutie kan de opbrengst van het eiwit verminderen door de noodzaak van refolding, maar kan nuttig zijn voor kwantificering van expressie op kleine schaal [25](#page=25). ### 1.4.4 Tag verwijdering met endopeptidasen Voor het verwijderen van tags worden vaak endopeptidasen gebruikt. Veelgebruikte proteasen zijn Factor Xa, TEV protease en SUMO [26](#page=26) [27](#page=27) [29](#page=29). * **Factor Xa:** Is een serine protease betrokken bij bloedstolling. Het herkent de sequentie LVPR↓GS, maar is enigszins promiscu [26](#page=26). * **TEV protease:** Is een specifieke cysteïne protease die de sequentie ENLYFQ↓G herkent. Vaak wordt de tag aan de N-terminus geplaatst en het eiwit van interesse aan de C-terminus, waardoor na behandeling met TEV een enkele glycine aan de N-terminus van het eiwit achterblijft [27](#page=27) [28](#page=28). * **SUMO:** (Small ubiquitin-like modifier) is een fusiedomein dat de oplosbaarheid kan verbeteren en efficiënte expressie van peptiden en eiwitten kan ondersteunen. SUMO-protease is zeer specifiek en cleavet zonder linker, wat resulteert in het behoud van de oorspronkelijke eiwitsequentie. SUMO is efficiënter dan TEV, werkt bij lagere concentraties en lagere temperaturen, en kan de expressie van heterologe eiwitten verbeteren [29](#page=29) [31](#page=31). Bij het ontwerpen van constructies met proteolytische klieving is het belangrijk om te overwegen of er een linker nodig is en hoe deze de finale eiwitsequentie beïnvloedt [30](#page=30) [31](#page=31). ### 1.4.5 Tags voor functionaliteit buiten zuivering Sommige tags zijn ontworpen voor functies die verder gaan dan alleen zuivering [19](#page=19). * **Sortase-gemedieerde ligatie:** Sortase A is een transpeptidase die peptidebindingen kan vormen. Het vereist een LPXTG-motief op het "doelwit" en minimaal twee glycines op de "payload". Dit maakt het mogelijk om specifieke fusies te creëren, inclusief de aanhechting van niet-peptidische moleculen of de cyclisering van eiwitten. Het kan ook worden gebruikt voor site-specifieke labellering [33](#page=33) [34](#page=34) [37](#page=37). * **In vivo biotinylering (AviTag):** Het *E. coli* biotin ligase (BirA) kan selectief een korte peptide-sequentie (AviTag) labelen met biotine. Dit proces is site-specifiek en werkt in eukaryoten, prokaryoten en in vivo. Biotinylering is nuttig voor diagnostiek en screeningplatforms, omdat het de variabiliteit van chemische synthese minimaliseert [37](#page=37) [38](#page=38). * **AlbudAbs:** Dit zijn kleine antilichaamfragmenten (ongeveer 12 kDa) die een hoge affiniteit hebben voor humaan serum albumine (HSA). Ze binden aan een regio van HSA die niet gemoduleerd wordt door endogene liganden, waardoor ze de farmacokinetiek van biotherapeutica verlengen zonder de natuurlijke functie van HSA te belemmeren. Dit resulteert in een significant hogere serum halfwaardetijd vergeleken met ongemodificeerde eiwitten [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41). * **XTEN:** Dit is een ~864 aminozuur lang, ongestructureerd, semi-rationeel eiwit dat wordt gebruikt om de halfwaardetijd van biotherapeutica te verlengen. XTEN werkt door het eiwit een grotere structuur te geven, wat leidt tot een langzamere renale klaring. De lengte van de XTEN-tag kan worden aangepast om de gewenste halfwaardetijd te bereiken. Het toevoegen van een XTEN-tag kan echter de fysisch-chemische eigenschappen van het eiwit beïnvloeden, zoals de iso-elektrische punt (pI) en de grootte, wat gevolgen kan hebben voor de zuiveringsprocessen [42](#page=42) [43](#page=43). --- # Antilichamen: generatie en derivaten Dit gedeelte behandelt de methoden voor het genereren van antilichamen, inclusief immunisatie en het stabiliseren van de productie middels hybridoma's, alsook de verschillende antilichaamderivaten en hun productiemethoden [2](#page=2). ### 2.1 Generatie van antilichamen Antilichamen worden gegenereerd door B-cellen, waarbij elke antilichaam-producerende B-cel een uniek antilichaam produceert als resultaat van V(D)J recombinatie. De variabiliteit wordt bereikt door de combinatie van verschillende V (variabele), D (diversity) en J (joining) gen-segmenten, wat kan leiden tot meer dan $10^{10}$ mogelijke antilichaamvarianten [46](#page=46). #### 2.1.1 Immunisatie Immunisatie is het proces waarbij een dier wordt blootgesteld aan een antigeen met als doel een sterke immuunrespons op te wekken [47](#page=47). * **Dieren:** Veelgebruikte dieren voor immunisatie zijn konijnen, muizen, geiten en paarden [47](#page=47). * **Antigeen:** Dit kan variëren van cellulaire componenten, eiwitten tot nucleïna. * **Adjuvans:** Een stof die de immunogeniciteit van het antigeen niet-specifiek versterkt. Adjuvantia, zoals Complete Freund's Adjuvant (met mineralenolie voor langzame afgifte van antigeen en geïnactiveerde *M. tuberculosis* deeltjes om ontsteking te induceren), helpen het immuunsysteem te activeren en de afgifte van antigeen te verlengen, waardoor minder antigeen nodig is en kosten worden verlaagd [47](#page=47). * **Kwaliteit van antigeen:** De kwaliteit, zuiverheid en biologische activiteit van het antigeen zijn cruciaal. Een ‘vuil’ antigeen kan leiden tot een respons tegen contaminanten in plaats van tegen het gewenste antigeen [47](#page=47). * **Epitopie beschikbaarheid:** Bij immunisatie met een volledig gevouwen eiwit zijn niet alle aminozuren even toegankelijk. De eiwitkern is doorgaans niet toegankelijk, wat de kans op antilichamen tegen deze sequenties verkleint. Bij immunisatie met een gedenatureerd eiwit zijn alle sequenties toegankelijk, wat kan leiden tot een antilichaam dat alleen werkt tegen het gedenatureerde eiwit, wat minder nuttig is voor therapeutische toepassingen [47](#page=47). Een typisch protocol voor antilichaamgeneratie in muizen omvat de volgende stappen [48](#page=48): * Dag 1: Antigeen + adjuvans * Dag 10-15: Antigeen + adjuvans * Dag 20-30: Alleen antigeen * Dag 30-40: Testen van serum op activiteit * Dag 50-60: Finale ‘boost’ met alleen antigeen * Dag 55-65: Isoleren van de milt > **Tip:** Het genereren van antilichamen door immunisatie is een stochastisch proces; er is geen garantie dat twee dieren hetzelfde antilichaam zullen produceren. Bovendien genereren de meeste modelorganismen slechts kleine hoeveelheden antilichamen die niet volstaan voor therapie [49](#page=49). #### 2.1.2 Stabilisatie van antilichaamproductie: Hybridoma's Primaire cellen (zoals B-cellen) hebben een beperkte levensduur in cultuur en senescen (stoppen met delen) na 20-40 replicaties. Om een continue productie van specifieke antilichamen te garanderen, worden B-cellen gefuseerd met myeloomcellen om **hybridoma's** te vormen [51](#page=51). * **Cel fusie:** Polyethyleenglycol (PEG) faciliteert de cel fusie tussen B-cellen en myeloomcellen (bijvoorbeeld Sp2/0-Ag14) [51](#page=51). * **Selectie:** De gevormde hybridoma's worden geselecteerd met behulp van specifieke media. * **HAT-medium (Hypoxanthine + Aminopterine + Thymidine):** Aminopterine remt de *de novo* synthese van purine en pyrimidine nucleotiden en doodt hierdoor de myeloomcellen die geen salvage pathway hebben voor DNA-synthese (#page=51, 52) [51](#page=51) [52](#page=52). * **Hypoxanthine en Thymidine:** Deze fungeren als substraten voor de salvage pathway, die door zowel B-cellen als hybridoma's wordt gebruikt (#page=51, 52) [51](#page=51) [52](#page=52). * **Resultaat:** Alleen de immortale hybridoma's, die de genetische informatie van zowel de B-cel als de myeloomcel hebben geërfd en de salvage pathway kunnen gebruiken, overleven. De niet-immortaliseerbare B-cellen sterven vanzelf af in cultuur (#page=51, 52) [51](#page=51) [52](#page=52). De resulterende hybridoma's zijn stabiel en secreteren IgG-antilichamen. De antilichamen worden geoogst uit het kweek supernatant en geëvalueerd middels diverse biFysische methoden zoals flowcytometrie, immunohistologie, cytotoxiciteitstesten, ELISA en Surface Plasmon Resonance (SPR) [51](#page=51) [52](#page=52). #### 2.1.3 Productie en opslag van hybridoma's * **Productie:** De productie van antilichamen uit hybridoma's kan opgeschaald worden door serieuze cultuuramplificatie. Dit proces is echter complexer dan bij bacteriële culturen vanwege de fragiliteit van zoogdiercellen. Kweekcondities, zoals de behoefte aan complexe media, stabiele temperatuur, zuurstofvoorziening en soms een hechtingsondersteuning, maken het ontwerp van bioreactoren uitdagend. Mammaliaanse cellen groeien langzaam en zijn vatbaar voor contaminatie [54](#page=54). * **Opslag:** Hybridoma-cellen worden opgeslagen door ze te resuspenderen in vers medium met Fetal Calf Serum (FCS) voor optimale groeiomstandigheden, een cryoprotectant (zoals DMSO of glycerol) toe te voegen, en de cultuur vervolgens langzaam af te koelen naar -80°C voordat ze voor langdurige opslag in vloeibare stikstof worden geplaatst [53](#page=53). > **Tip:** Hoewel hybridoma's op schaal werken, hebben ze beperkingen: ze zijn langzamer en duurder in onderhoud, en er is variabiliteit in de opbrengst tussen verschillende antilichamen/hybridoma-cellen [55](#page=55). ### 2.2 Antilichaamderivaten Antilichaamderivaten zijn gemodificeerde vormen van antilichamen die zijn ontworpen om specifieke eigenschappen te verbeteren, zoals halfwaardetijd, stabiliteit of functionaliteit. #### 2.2.1 Derivaten ter verlenging van de halfwaardetijd Verschillende tags en structuren kunnen worden toegevoegd om de halfwaardetijd van een antilichaam in serum te verlengen, wat resulteert in een langere werkzaamheid en potentieel lagere doseringsfrequentie. * **AlbudAbs:** Dit zijn antilichamen tegen menselijk serumalbumine (HSA) die een ongeveer 12 kDa domein vormen. Ze binden aan een deel van HSA dat niet gemoduleerd wordt door endogene liganden, waardoor ze de halfwaardetijd van een biotherapeuticum in serum verhogen (#page=39, 40). Het voordeel van AlbudAbs is dat ze de natuurlijke functie van HSA behouden en dat de natuurlijke liganden niet concurreren voor binding. HSA-fusies kunnen minder stabiel zijn, mogelijk door interferentie met de HSA-functie [39](#page=39) [40](#page=40). * **XTEN:** Dit is een ~864 aminozuur lang ‘semi-rationeel’ ongestructureerd eiwit, bestaande uit repetitieve 36-meren met een specifieke samenstelling (8% A, 12% E, 18% G, 17% P, 28% S en 17% T). XTEN verlengt de plasma halfwaardetijd significant (bijvoorbeeld 12-voudig voor GFP, >53-voudig voor glucagon) op een manier die lengte-afhankelijk is en overdraagbaar is naar verschillende soorten. XTEN omzeilt interactie met albumine en verhoogt de halfwaardetijd door de grootte van de tag zelf, wat ook de renale klaring vertraagt (#page=42, 43). Het toevoegen van XTEN kan echter impact hebben op de upstream en downstream processen, zoals de pI en grootte van het eiwit, wat de zuivering kan beïnvloeden [42](#page=42) [43](#page=43). > **Tip:** Zowel AlbudAbs als XTEN zijn effectief voor het verlengen van de halfwaardetijd. AlbudAbs doen dit door binding aan albumine, terwijl XTEN dit doet door een grotere structuur aan het eiwit te geven [42](#page=42). #### 2.2.2 Derivaten voor specifieke modificatie en detectie * **Sortase-gemedieerde ligatie:** Dit is een enzymatische methode die het mogelijk maakt om een label op een eiwit aan te brengen op een sequentie-specifieke manier. De applicatie is vergelijkbaar met die van AviTag [37](#page=37). * **In vivo biotinylering (AviTag):** De AviTag is een korte, specifieke peptide-sequentie die herkend wordt door *E. coli* biotin ligase (BirA). BirA brengt selectief een biotine aan op een lysine-residu van het eiwit met bijna 100% efficiëntie. In tegenstelling tot chemische biotinylering, die minder selectief is en diverse reactieplaatsen kan targeten, biedt AviTag site-specifieke labelling en minimaliseert variabiliteit (#page=37, 38). Dit is voordelig voor diagnostica en screeningsplatforms. De zuivering en detectie maken gebruik van de sterke interactie tussen biotine en avidine-achtige eiwitten [37](#page=37) [38](#page=38). #### 2.2.3 Chimerische en gehumaniseerde antilichamen Deze derivaten worden gecreëerd door genetische engineering om de immunogeniciteit in mensen te verminderen. * **Chimerische antilichamen:** Hierbij worden de variabele domeinen van een antilichaam van een niet-menselijk dier (bv. muis) gecombineerd met de constante domeinen van een humaan antilichaam (#page=50, 58) [50](#page=50) [58](#page=58). * **Gehumaniseerde antilichamen:** Bij deze techniek worden alleen de complementaire Determinerende Regio's (CDR's), die de antigenbindende loops vormen, van een muizenantilichaam in het menselijke antilichaamframework geplaatst (#page=50, 59). De resterende delen van het antilichaam komen uit menselijke genen (#page=50, 59). Dit wordt bereikt door de DNA-sequenties van de CDR-loops van het muizenantilichaam te klonen in een humaan IgG-gen [50](#page=50) [59](#page=59). > **Tip:** De nomenclatuur voor chimerische en gehumaniseerde antilichamen is gebaseerd op de mate waarin het antilichaam is ‘gehumaniseerd’ [50](#page=50). #### 2.2.4 Andere antilichaamderivaten * **Nanobodies:** Dit zijn VhH domeinen uit kameelachtigen of VNAR domeinen uit haaien. Ze kunnen in bacteriële systemen geproduceerd worden (#page=51, 61, 62). Glycosylering is afhankelijk van het productiemodel en de sequenties [51](#page=51) [61](#page=61) [62](#page=62). * **Bicyclische peptiden:** Dit zijn peptiden die aan een chemische kern zijn gebonden, waardoor ze lussen vormen die geschikt zijn voor antigenbinding. De cysteïnes in de peptideketen fungeren als ankerpunten rond een hydrofobe kern (#page=51, 60, 61). De chemische kern kan worden gedeviatiseerd met toxines of andere functionaliteiten, waarbij de peptide zorgt voor de targeting [51](#page=51) [60](#page=60) [61](#page=61). * **Diabodies:** Dit zijn dubbele scFv (single-chain variable fragment) met linkers die de voorkeur geven aan een dimeer conformati [61](#page=61). #### 2.2.5 Antilichamen als farmaceutica Antilichamen (IgG's) zijn grote, complexe en heterogene moleculen bestaande uit vier peptiden die verbonden zijn door cysteïnebruggen (#page=57, 58). Ze hebben diverse glycosyleringstoestanden en functionele domeinen. Antilichamen zijn instabiel en gevoelig voor aggregatie, misvorming, degradatie en immunogeniciteit, wat ze extreem gevoelig maakt voor procesveranderingen [57](#page=57) [58](#page=58). **Zuivering:** Eiwitten zoals Proteïne A (uit *Staphylococcus*) en Proteïne G (uit *Streptococcus*) binden specifiek aan de Fc-regio van IgG, wat gebruikt kan worden voor zuivering. Elutie gebeurt door verandering van zoutconcentratie en pH [56](#page=56). **Productie van antilichamen:** * **Bicylces:** Chemische productie [62](#page=62). * **Nanobodies:** Bacteriële productie [62](#page=62). * **IgG:** Hybridoma's of CHO-cellen [62](#page=62). --- # Affiniteitsbepaling en massawerking modellen Dit thema behandelt de principes van affiniteitsbepaling met technieken zoals ELISA, BioLayer Interferometry (BLI) en Surface Plasmon Resonance (SPR), alsook het wiskundig beschrijven van moleculaire interacties via massawerking modellen. ### 3.1 Methoden voor affiniteitsbepaling Affiniteitsbepaling is cruciaal voor het begrijpen van moleculaire interacties, met name tussen antilichamen en hun doelwitten. Diverse technieken worden ingezet om deze interacties te kwantificeren en te karakteriseren [63](#page=63). #### 3.1.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA is een veelgebruikte assay in de biotechnologie die berust op het creëren van een koppeling tussen een oppervlak en een detectiemiddel via specifieke bindingsinteracties. Enzymen die aan het detectiemiddel zijn gekoppeld, versterken het signaal door middel van meerdere omzettingen (turnover). Gangbare enzymen in ELISA zijn Horseradish peroxidase (HRP), Alkaline phosphatase (AP) en luciferase [71](#page=71). De kernprincipes van ELISA omvatten: * **Discrimineren van specifiek en niet-specifiek binden:** Dit is essentieel voor betrouwbare resultaten [72](#page=72). * **Gebruik van blokkerende agentia:** Specifieke, maar niet-relevante targets, zoals caseïne of detergentia, worden gebruikt om niet-specifieke bindingsplaatsen op het oppervlak (bv. de plaat) te maskeren en om te concurreren in niet-specifieke interacties [72](#page=72). * **Afhankelijkheid van affiniteit en concentratie:** De assay werkt optimaal wanneer antilichamen specifiek en met hoge affiniteit binden. Zowel de concentratie van het antilichaam als de tijdsduur van de incubatie zijn significante factoren [73](#page=73). * **Achtergrondsignaal:** Een achtergrondsignaal, afkomstig van niet-specifieke binding, is een veelvoorkomende technische uitdaging [73](#page=73). * **Doel:** Het creëren van een experimentele topologie die het oppervlak verbindt met het signaalgenererende enzym [73](#page=73). Het principe van "multiple turnover" bij enzymen in ELISA betekent dat één enzymmolecuul duizenden keren een reactie kan katalyseren, wat resulteert in een sterk versterkt detectiesignaal en een zeer gevoelige assay [71](#page=71). > **Tip:** De optimale eiwitconcentratie voor binding is cruciaal. Te lage concentraties leiden tot onvoldoende binding, terwijl te hoge concentraties de specificiteit kunnen verminderen en de discriminatie bemoeilijken [70](#page=70) [73](#page=73). #### 3.1.2 BioLayer Interferometry (BLI) BioLayer Interferometry (BLI) is een biofysische methode die veranderingen in de optische dikte van een biolayer meet als gevolg van moleculaire interacties [74](#page=74) [78](#page=78). * **Werkingsprincipe:** Een vezeltip wordt voorzien van een speciale optische laag, waarop een capture molecuul (ligand) wordt bevestigd. Wanneer deze tip in een monster wordt gedipt dat het doelmolecuul (analyte) bevat, bindt de analyte aan de ligand. Deze binding verandert de dikte van de biolayer. Witte licht wordt door de vezel gestuurd; twee stralen worden gereflecteerd: één van de tip (referentie) en één van de moleculaire laag. Het interferentiepatroon van deze twee stralen wordt gemeten [74](#page=74) [75](#page=75) [78](#page=78). * **Meetbare grootheden:** De fase van de interferentie is een functie van de moleculaire laagdikten, wat direct verband houdt met het aantal gebonden moleculen op de tip. Veranderingen in de afstand tussen de reflecterende oppervlakken (die gerelateerd is aan de dikte van de moleculaire laag) veranderen het interferentiepatroon. Deze veranderingen kunnen worden gemonitord in de tijd om kinetische data te verkrijgen over moleculaire interacties [74](#page=74) [75](#page=75) [79](#page=79). * **Kinetische en affiniteitsbepaling:** BLI kan associatie- en dissociatiesnelheden meten, waaruit de affiniteit kan worden afgeleid. In een simpel 1:1 bindingsmodel worden de associatie- en dissociatiefasen beschreven door exponentiële functies [76](#page=76) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82). * **Associatie (Association):** In het begin domineert de associatie de sensorgram. De associatiesnelheidsconstante ($k_a$) beschrijft de snelheid van complexvorming en heeft typische waarden van $10^3$ tot $10^7$ M$^{-1}$s$^{-1}$ [81](#page=81) [83](#page=83). * **Evenwicht (Equilibrium):** Uiteindelijk wordt een evenwicht bereikt waarbij de associatie- en dissociatiesnelheden gelijk zijn [82](#page=82) [83](#page=83). * **Dissociatie (Dissociation):** Wanneer de analyte niet langer aanwezig is, treedt dissociatie op als een exponentiële afbraak over tijd. De dissociatiesnelheidsconstante ($k_d$) beschrijft de fractie van complexen die per seconde vervalt en heeft typische waarden van $10^{-2}$ tot $10^{-5}$ s$^{-1}$ [83](#page=83). * **Affiniteit (KD):** De affiniteit, uitgedrukt als de dissociatieconstante ($K_D$), is de verhouding van $k_d$ tot $k_a$ ($K_D = k_d/k_a$). Een lagere $K_D$ duidt op een hogere affiniteit [83](#page=83). * **Voordelen:** BLI kan interacties in complexe mengsels meten, wat een voordeel is ten opzichte van SPR. Het meet verschuivingen in lengte, wat het geschikt maakt voor analytes met een laag moleculair gewicht [85](#page=85). > **Tip:** De x-as van een sensogram in BLI vertegenwoordigt tijd. De respons op de y-as geeft de verandering in de dikte van de biolayer weer als gevolg van binding [64](#page=64) [80](#page=80). #### 3.1.3 Surface Plasmon Resonance (SPR) Surface Plasmon Resonance (SPR) is een andere biofysische techniek die wordt beschouwd als de industriële gouden standaard voor het meten van intermoleculaire interacties [84](#page=84) [85](#page=85). * **Werkingsprincipe:** SPR maakt gebruik van het principe van oppervlakteplasmonresonantie, een fenomeen dat optreedt bij de interactie van goud met licht. Bij een dunne goudfilm wordt een elektronresonantie-effect geïnduceerd afhankelijk van de invalshoek van het licht. De aanwezigheid van moleculen (liganden) aan de andere kant van de film verandert de hoek waarbij resonantie optreedt, wat gedetecteerd wordt [84](#page=84). * **Beperkingen:** In tegenstelling tot BLI, dat lengteveranderingen meet, is SPR beperkt door de massa van de analyte. Dit betekent dat SPR beter werkt voor grotere analytes, omdat deze grotere massaverschillen veroorzaken nabij de goudfilm, wat resulteert in hogere detectiesignalen. SPR vereist stabiele buffers en gezuiverd materiaal, terwijl BLI enigszins complexere oplossingen aankan [84](#page=84) [85](#page=85). > **Tip:** Hoewel SPR de gouden standaard is, heeft BLI voordelen op het gebied van kosten, complexiteit en snelheid [84](#page=84). ### 3.2 Massawerking modellen Massawerking modellen bieden een wiskundige beschrijving van moleculaire interacties en zijn fundamenteel in diverse wetenschappelijke velden [64](#page=64). #### 3.2.1 Principe van Massawerking Het massawerkingmodel stelt dat de snelheid van een chemische reactie evenredig is met de concentraties van de reagerende stoffen [64](#page=64) [66](#page=66). Voor een reversibele reactie waarbij stof A en stof B complex AB vormen met snelheidsconstanten $k_1$ (associatie) en $k_{-1}$ (dissociatie), geldt de volgende differentiaalvergelijking voor de verandering in de concentratie van het complex AB over tijd ($t$): $$ \frac{d[AB]}{dt} = k_1 [A][B - k_{-1} [AB $$ [64](#page=64) [80](#page=80). #### 3.2.2 Michaelis-Menten Systeem Een variant van het massawerkingmodel is het Michaelis-Menten systeem, dat vaak wordt toegepast in de enzymologie. Hierbij reageert een enzym (E) met een substraat (S) om een enzym-substraatcomplex (ES) te vormen, dat vervolgens kan terugvallen naar E en S, of kan reageren om een product (P) en het vrije enzym te vormen. $$ E + S \xrightleftharpoons[k_{-1}]{k_1} ES \xrightarrow{k_2} E + P $$ [64](#page=64). De verandering in de concentratie van het ES-complex wordt beschreven door: $$ \frac{d[ES]}{dt} = k_1 [E][S - k_{-1} [ES - k_2 [ES $$ [64](#page=64). Hierbij is $[E]_0$ de totale initiële enzymconcentratie, dus $[E]_0 = [E + [ES]$ [64](#page=64). Door de steady-state aanname te hanteren, waarbij $d[ES]/dt = 0$, kan de concentratie van het ES-complex worden uitgedrukt in termen van de initiële concentraties en de snelheidsconstanten. Dit leidt tot de bekende Michaelis-Menten vergelijking voor de productvormingssnelheid [64](#page=64): $$ \frac{d[P]}{dt} = \frac{v_{max}[S]}{S + K_M} $$ waarbij $v_{max} = k_2 [E]_0$ en $K_M = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}$. $K_M$ vertegenwoordigt de Michaelis-constante [64](#page=64). #### 3.2.3 Massawerking voor Binding Voor een simpele 1:1 bindingsinteractie tussen een proteïne (P) en een target (T) om een complex (PT) te vormen: $$ P + T \xrightleftharpoons[k_{-1}]{k_1} PT $$ [66](#page=66) [67](#page=67) [69](#page=69). De verandering in de concentratie van het PT-complex over tijd is: $$ \frac{d[PT]}{dt} = k_1 [P][T - k_{-1} [PT $$ [66](#page=66) [67](#page=67) [69](#page=69). Bij evenwicht, wanneer $d[PT]/dt = 0$, geldt: $$ \frac{k_{-1}}{k_1} = \frac{[P][T]}{[PT]} = K_D $$ [67](#page=67) [69](#page=69). Hier is $K_D$ de dissociatieconstante, die de affiniteit van de interactie weergeeft [83](#page=83). Fractionele binding ($\theta$) kan worden gedefinieerd als de fractie van het target die gebonden is aan het proteïne: $$ \theta = \frac{[PT]}{[T]_0} = \frac{[PT]}{[T + [PT]} $$ [67](#page=67). Door substitutie en herschikking kan dit worden uitgedrukt als: $$ \theta = \frac{[P]}{K_D + [P]} $$ [67](#page=67) [69](#page=69) [70](#page=70). #### 3.2.4 Kinetiek en Affiniteit uit Massawerking * **Tijdaspect van binding:** Binding is geen instant proces; het duurt tijd om evenwicht te bereiken. Dit tijdsverloop is zichtbaar in sensogrammen van technieken zoals BLI [69](#page=69). * **Verhouding tussen affiniteit en interactiesnelheden:** Twee liganden kunnen dezelfde affiniteit hebben, maar sterk verschillende associatie- en dissociatiesnelheden vertonen. Een lagere dissociatiesnelheid ($k_d$) leidt tot een hogere affiniteit *alleen* als de associatiesnelheid ($k_a$) gelijk is [68](#page=68) [69](#page=69). * **Verhoging van affiniteit:** Affiniteit kan worden verhoogd door hogere associatiesnelheden (sneller binden) en/of lagere dissociatiesnelheden (langzamer loskomen) [69](#page=69). * **Specificiteit:** Specificiteit ontstaat binnen een bepaald concentratiebereik waarbij de fractionele binding voor het doelwit significant verschilt van die voor off-targets. Bij zeer hoge concentraties kan een proteïne echter aan meer moleculen binden dan alleen zijn specifieke doelwit, zelfs als de inherente specificiteit en affiniteit behouden blijven [69](#page=69) [70](#page=70). #### 3.2.5 Beperkingen van Massawerking Modellen Massawerking modellen hebben inherente beperkingen: * **Homogeniteitsaannames:** Ze gaan ervan uit dat er geen tijd verstrijkt voor binding of diffusie, en dat er geen barrières zijn voor interactie [66](#page=66). * **Continue aard:** De modellen zijn continu, wat wiskundig betekent dat theoretisch zeer lage concentraties (bv. attomolair) kunnen worden bereikt. Biologische systemen zijn echter discreet en gebaseerd op populatiegedrag dat voortkomt uit stochasticiteit [66](#page=66). Deze beperkingen impliceren dat hoewel massawerking modellen een krachtig raamwerk bieden voor het begrijpen van moleculaire interacties, hun toepassing in de praktijk rekening moet houden met de discretie en complexiteit van biologische systemen [66](#page=66). --- # Flowcytometrie en enzymatische reacties Dit onderdeel bespreekt de principes van flowcytometrie voor data-analyse en de detectie van biologische deeltjes, evenals het gebruik van enzymen in assays en de expressie van actieve enzymen op celoppervlakken. ### 4.1 Flowcytometrie Flowcytometrie is een techniek die wordt gebruikt voor het detecteren en analyseren van biologische deeltjes, zoals cellen, terwijl ze door een lichtbron stromen. De kracht van deze methodologie ligt in de combinatie van verschillende aspecten [87](#page=87) [88](#page=88). #### 4.1.1 Basisprincipe #### 4.1.1.1 Principe van werking Het monster stroomt door een lichtbron, wat afhangt van het machinespecifieke vloeistofsysteem. Bij flowcytometrie is dit doorgaans een laminair stromingspatroon, terwijl bij FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) deeltjes in druppels worden verwerkt. Veranderingen in de lichtintensiteit door interactie met de stromende deeltjes genereren data. Elk datapunt is een computationeel geïntegreerde detectiegebeurtenis [87](#page=87). #### 4.1.1.2 Detectieparameters De detectie in flowcytometrie omvat verschillende aspecten: * **Forward scattering (FSC):** Dit geeft inzicht in de grootte van de deeltjes. FSC meet de mate van lichtverstrooiing naar voren, die correleert met de grootte van het deeltje [88](#page=88) [91](#page=91). * **Side scattering (SSC):** Dit geeft inzicht in de complexiteit of interne structuur van de deeltjes. SSC meet de lichtverstrooiing loodrecht op de lichtstraal, wat gevoelig is voor de interne structuur van de cel [88](#page=88). * **Fluorescentiekanalen:** Dit maakt het mogelijk om specifieke moleculen te detecteren met behulp van fluorescerende labels. Flowcytometers zijn ontworpen om meerdere fluorescentiesignalen van een enkele laser te isoleren met behulp van filters en dichroïsche spiegels die golflengtebereiken naar specifieke detectoren richten [88](#page=88). > **Tip:** Fluorescentie maakt het mogelijk om metingen in flowcytometrie te parallelliseren door gebruik te maken van reagentia die fluorescentie in specifieke kanalen geven, zoals DAPI voor blauwe fluorescentie, of fluorescerende eiwitten [88](#page=88). #### 4.1.2 Analyse van flowcytometriegegevens De analyse van flowcytometriegegevens omvat het selecteren van relevante data via gating en de visualisatie van de resultaten [89](#page=89). #### 4.1.2.1 Gating Gating is het proces van het selecteren van de relevante data voor analyse. Dit is cruciaal omdat een flowcytometer alle deeltjes meet, inclusief celaggregaten, dode cellen en celdebris, evenals elektronische ruis. Het doel van gating is om filters op het signaal toe te passen om de relevante data te selecteren [89](#page=89). Er zijn verschillende benaderingen voor gating: * **"Live" gating:** Dit wordt uitgevoerd tijdens de acquisitie om de kwaliteit van de data te maximaliseren. Hierbij worden deeltjes geselecteerd die voldoen aan vooraf gedefinieerde criteria, zodat de machine stopt met verzamelen zodra een bepaald aantal relevante gebeurtenissen is bereikt. Een typisch voorbeeld is het isoleren van enkele deeltjes met behulp van FSC en SSC, of het isoleren van cel-grote deeltjes met behulp van fluorescentie en FSC [89](#page=89) [90](#page=90). * **"Ad hoc" gating:** Dit wordt uitgevoerd tijdens de analyse van de data. Hierbij kunnen de gates worden aangepast op basis van nieuwe inzichten of waargenomen populaties die niet eerder waren voorzien. Bij ad hoc gating wordt echter het aantal beschikbare data-events beperkt door het aantal oorspronkelijk verzamelde events [89](#page=89) [90](#page=90). * **Forward en backward gating:** Deze termen beschrijven de richting van de gate ten opzichte van de data [90](#page=90). * **Forward gating:** Een subset van de data wordt geïsoleerd voordat de analyse wordt uitgevoerd [90](#page=90). * **Backward gating:** Gates worden ingesteld na de dataverzameling, waarbij waargenomen data worden verwijderd om de datakwaliteit te verbeteren. Dit is nuttig wanneer tijdens de analyse verschillen worden opgemerkt die de initiële gates niet hadden voorzien [92](#page=92). > **Tip:** De beste praktijk is om de gatingstrategie a priori te definiëren [92](#page=92). #### 4.1.2.2 Visualisatie De resultaten van flowcytometrie worden meestal gevisualiseerd met behulp van histogrammen en dot plots [92](#page=92). * **Histogrammen:** Tonen de distributie van één enkele variabele [90](#page=90). * **Dot plots:** Tonen de relatie tussen twee variabelen, waarbij elke stip een meting vertegenwoordigt [90](#page=90). #### 4.1.2.3 Data-analyse De analyse van de data is meestal gebaseerd op Gaussiaanse verdelingen [92](#page=92). > **Voorbeeld:** FITC (fluorescein isothiocyanaat) is een veelgebruikte fluorofoor die door de blauwe laser (488 nm) wordt geëxciteerd en gedetecteerd wordt met een groen filter (512/20 nm) [90](#page=90). ### 4.2 Enzymatische reacties in assays Enzymen spelen een cruciale rol in verschillende biologische assays, met name in ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). De functionele principes van enzymen, zoals hun activiteit op celoppervlakken, kunnen worden onderzocht [72](#page=72) [93](#page=93). #### 4.2.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ELISA is een veelgebruikte techniek om specifieke moleculen, zoals eiwitten, te detecteren en te kwantificeren [72](#page=72). ##### 4.2.1.1 Basisprincipe Alle varianten van ELISA werken op het principe van het discrimineren van specifieke van niet-specifieke binding [72](#page=72). * **Specifieke binding:** Het assay is gebaseerd op het vermogen van antilichamen om specifiek en met hoge affiniteit te binden aan hun doelwit [73](#page=73). * **Niet-specifieke binding:** Specifieke, maar niet-relevante doelwitten worden vaak gebruikt als blokkerende agentia (bijvoorbeeld caseïne, detergentia) om niet-specifieke bindingsplaatsen te maskeren of om te concurreren in niet-specifieke interacties [72](#page=72). * **Oppervlakte:** Een oppervlak (vaak een plaat) wordt gebruikt om immobilisatie mogelijk te maken [72](#page=72). * **Detector molecuul:** Een enzym wordt gekoppeld aan een detectiemolecuul (meestal een antilichaam) dat, na binding aan het doelwit, een detecteerbaar signaal genereert [72](#page=72). ##### 4.2.1.2 Cruciale factoren * **Antilichaamconcentraties:** Deze zijn cruciaal voor het succes van de techniek [73](#page=73). * **Tijd:** De incubatietijd voor antilichaambinding en de spoeltijden zijn significant [73](#page=73). * **Achtergrond:** Een veelvoorkomende technische hindernis is de achtergrondsignaal die afkomstig is van niet-specifieke binding [73](#page=73). * **Experimentele topologie:** Het doel is om een experimentele opstelling te creëren die het oppervlak verbindt met het signaalgenererende enzym [73](#page=73). > **Tip:** Te lage of te hoge eiwitconcentraties kunnen leiden tot slechte discriminatie tussen specifieke en niet-specifieke signalen [73](#page=73). #### 4.2.2 Expressie van actieve enzymen op celoppervlakken Het is mogelijk om enzymen op celoppervlakken te expresseren en hun functionaliteit te testen [93](#page=93). * **Voorbeeld:** Bacteriële cellen die een DNA-bindend eiwit op hun oppervlak tot expressie brengen, kunnen de insertie van cholesterol-gelabelde DNA-oligo's in het celmembraan katalyseren. T4 DNA-ligase (T4DL) kan op het celoppervlak worden uitgedrukt. Een T4DL K159D-mutant kan DNA binden maar niet ligateren [93](#page=93). * Als een eiwit dat tot expressie wordt gebracht een enzym is, kan de functie ervan worden getest [93](#page=93). ### 4.3 Verwante technieken (ter context) Hoewel niet het primaire focuspunt, worden andere technieken ter vergelijking genoemd: #### 4.3.1 BioLayer Interferometry (BLI) BLI meet veranderingen in de dikte van een biolayer als gevolg van moleculaire interacties, gebaseerd op interferentie van lichtgolven [74](#page=74). * **Principe:** Een witte lichtstraal wordt door een vezeltip gestuurd die is gecoat met een optische laag en een capture-molecuul. Wanneer een doelmolecuul (analyte) bindt aan het capture-molecuul, verandert de dikte van de laag, wat resulteert in een verandering in het interferentiepatroon van het gereflecteerde licht [74](#page=74) [79](#page=79). * **Data:** De afstand tussen de twee reflecterende oppervlakken bepaalt het interferentiepatroon. Veranderingen in dit patroon over tijd geven kinetische data over moleculaire interacties [75](#page=75) [79](#page=79). * **Kinetiek en Affiniteit:** In een simpel 1:1 bindingsmodel worden de associatie- en dissociatie-fasen beschreven door exponentiële functies [80](#page=80). * De **associatiesnelheidsconstante** ($k_a$) beschrijft de snelheid van complexvorming en heeft eenheden van M$^{-1}$s$^{-1}$. Typische waarden liggen tussen $10^3$ en $10^7$ M$^{-1}$s$^{-1}$ [81](#page=81) [83](#page=83). * De **dissociatiesnelheidsconstante** ($k_d$) beschrijft de stabiliteit van het complex en heeft eenheden van s$^{-1}$. Typische waarden liggen tussen $10^{-2}$ en $10^{-5}$ s$^{-1}$ [83](#page=83). * De **affiniteitsconstante** ($K_D$) is de verhouding $k_d/k_a$ en is omgekeerd evenredig met de evenwichtsconstante, waarbij de snelheid van associatie gelijk is aan de snelheid van dissociatie [83](#page=83). * **Toepassing:** BLI kan worden gebruikt voor het bepalen van bindingskinetiek en affiniteit, en kan omgaan met complexere mengsels dan SPR [74](#page=74) [85](#page=85). #### 4.3.2 Surface Plasmon Resonance (SPR) SPR is een andere techniek die wordt gebruikt voor het bepalen van bindingsaffiniteit en wordt beschouwd als de huidige industriële gouden standaard [84](#page=84) [85](#page=85). * **Principe:** SPR maakt gebruik van het fysieke effect van hoe goud interageert met licht. Een dunne goudfilm wordt gebruikt om een elektronresonantie-effect te induceren afhankelijk van de invalshoek van het licht. De aanwezigheid van moleculen aan de ligandzijde van de goudfilm verandert de hoek die nodig is voor resonantie, wat wordt gedetecteerd [84](#page=84). * **Gevoeligheid:** SPR is gevoelig voor de massa van het analyte en vereist stabiele buffers en gezuiverd materiaal. Het werkt beter voor grotere analieten omdat deze grotere massa-veranderingen veroorzaken [84](#page=84) [85](#page=85). > **Tip:** Hoewel beide technieken kinetiek en affiniteit kunnen meten, heeft BLI voordelen op het gebied van kosten, complexiteit en snelheid, terwijl SPR gevoeliger is voor buffercompositie en massa-veranderingen [85](#page=85). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Proteïne tags | Genetisch gecodeerde fusie-domeinen die aan een eiwit van interesse (PoI) worden gekoppeld om specifieke eigenschappen te verlenen, zoals vereenvoudigde zuivering, lokalisatie, etikettering of verbeterde bioactiviteit. | | Linkers | Moleculaire sequenties, variërend van enkele aminozuren tot grotere domeinen, die worden gebruikt om componenten van een eiwitconstruct te scheiden. Ze beïnvloeden de oplosbaarheid, vouwing, expressie en bioactiviteit van het uiteindelijke eiwit. | | V(D)J recombinatie | Een genetisch proces dat plaatsvindt tijdens de ontwikkeling van B-cellen, waarbij gensegmenten worden geherarrangeerd om een grote diversiteit aan immuunglobuline (antilichaam) variabele domeinen te creëren. | | Immunisatie | Het proces waarbij een organisme wordt blootgesteld aan een antigeen met als doel een immuunrespons op te wekken, resulterend in de productie van antilichamen tegen dat antigeen. | | Adjuvans | Een substantie die wordt toegediend samen met een antigeen om de immuunrespons te versterken en te verlengen, waardoor een effectievere antilichaamproductie wordt gestimuleerd. | | Hybridoma | Een hybride cel, gevormd door de fusie van een tumorcel (myeloomcel) en een antilichaam-producerende B-cel. Hybridoma's zijn zowel immortaal als in staat om specifieke antilichamen te produceren. | | ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) | Een veelgebruikte biochemische test om de aanwezigheid van een specifiek antigeen of antilichaam in een monster te detecteren. Het maakt gebruik van enzymconjugaten om een detecteerbaar signaal te genereren, vaak via een kleurreductie- of emissiereactie. | | Massawerking model | Een wiskundige beschrijving van de snelheid van chemische reacties, gebaseerd op de concentraties van reactanten en de snelheidsconstanten. Het wordt gebruikt om de dynamiek van moleculaire interacties, zoals enzym-substraatbinding, te modelleren. | | BioLayer Interferometry (BLI) | Een optische detectietechniek die veranderingen in de dikte van een biolayer meet, veroorzaakt door moleculaire interacties. Het is een non-invasieve methode die kinetische data levert over associatie- en dissociatiesnelheden. | | Surface Plasmon Resonance (SPR) | Een optische techniek die de resonantie van plasmonen op een goudfilm detecteert, wat verandert wanneer moleculen aan het oppervlak binden. SPR is een gevoelige methode voor het bepalen van affiniteiten en interactiekinetiek, en wordt beschouwd als de gouden standaard in de industrie. | | Flowcytometrie | Een techniek die de fysische en chemische eigenschappen van individuele cellen of deeltjes in een vloeiende stroom analyseert. Door interactie met licht en detectie van verstrooiing en fluorescentie, kunnen cellen worden geïdentificeerd, gekwantificeerd en gesorteerd. | | Gating | Een proces binnen de flowcytometrie waarbij specifieke populaties van cellen of deeltjes worden geselecteerd voor verdere analyse op basis van hun fysische en fluorescente eigenschappen. Dit helpt bij het isoleren van de relevante data uit een complex monstersignaal. | | Post-translationele modificatie (PTM) | Chemische veranderingen aan een eiwit na de synthese op het ribosoom. Voorbeelden zijn glycosylering, fosforylering, acetylering en prenylering, die de functie, stabiliteit en lokalisatie van het eiwit kunnen beïnvloeden. | | Epitope | Het specifieke deel van een antigeen waaraan een antilichaam (of een ander specifiek bindend molecuul) bindt. De toegankelijkheid en structuur van het epitopen zijn cruciaal voor de antilichaamherkenning. | | Affinity tag | Een korte eiwitsequentie die aan een eiwit van interesse wordt gekoppeld om de zuivering te vergemakkelijken. Deze tags binden selectief aan specifieke moleculen (bv. metalen, kralen) waardoor het eiwit uit een complexe mix kan worden geïsoleerd. | | Inteïne | Een eiwitsegment dat zichzelf uit kan knippen uit een precursor-eiwit, wat resulteert in de vorming van een nieuw eiwit met de resterende domeinen verbonden. Het kan gebruikt worden voor een "scarless" eiwitzuivering. | | Chitin binding domain (CBD) | Een eiwitdomein dat specifieke affiniteit heeft voor chitine, een polymeer van N-acetylglucosamine. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met andere tags voor eiwitzuivering. | | His-tag (polyhistidine-tag) | Een reeks van histidine-residuen (meestal 6 of meer) die aan een eiwit worden toegevoegd om de zuivering te vereenvoudigen door chelatiatie met metaalionen (zoals nikkel of kobalt) op een harskolom. | | Myc tag | Een korte peptide-epitope (~10 aminozuren) afgeleid van het c-Myc eiwit, dat wordt herkend door specifieke antilichamen. Het wordt gebruikt voor zowel zuivering als detectie van eiwitten. | | Factor Xa | Een serineprotease die betrokken is bij bloedstolling. Het wordt in biotechnologie gebruikt om specifieke knipsequenties te herkennen en te splitsen, vaak om eiwittags te verwijderen. | | TEV protease | Een specifiek cysteïneprotease, afkomstig van het Tobacco Etch Virus (TEV). Het wordt gebruikt voor selectieve knipplaatsen in eiwitconstructies, vooral om tags te verwijderen na zuivering. | | SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) | Een kleine fusiedomein die de oplosbaarheid van eiwitten kan verbeteren en als tag kan dienen. SUMO-protease kan de SUMO-tag specifiek verwijderen. | | Sortase | Een enzym uit Staphylococcus aureus dat eiwitten verankert aan de celwand. Het kan worden gebruikt voor het creëren van peptidefusies, waarbij een targetpeptide wordt gekoppeld aan een payload, vaak met behulp van specifieke herkenningsmotieven. | | AviTag | Een korte, geselecteerde peptide-sequentie die door het E. coli biotine ligase (BirA) selectief wordt gemerkt met biotine. Dit maakt site-specifieke biotineylering mogelijk voor detectie of zuivering. | | AlbudAbs | Kleine, antilichaam-achtige moleculen (~12 kDa) die een hoge affiniteit hebben voor humaan serum albumine (HSA). Ze worden gebruikt om de halfwaardetijd van biotherapeutica in het serum te verlengen door binding aan HSA. | | XTEN | Een groot (~864 aminozuren), semi-rationeel ontworpen ongestructureerd eiwit dat kan worden gefuseerd met biotherapeutica om hun halfwaardetijd in het serum te vergroten, voornamelijk door een grotere structuur te bieden die de renale klaring vertraagt. | | Fab (Fragment antigen-binding) | Een deel van een antilichaam dat de antigeenbindende capaciteit bevat. Het bestaat uit een lichte keten en een deel van de zware keten (CH1 en VL). | | Fc (Fragment crystallizable) | Het constante deel van een antilichaam, dat belangrijke functies heeft zoals binding aan immuuncellen en complementactivatie. | | Fv (Fragment variable) | Het variabele deel van een antilichaam, dat bestaat uit de VH en VL domeinen en verantwoordelijk is voor de specificiteit van de antigeenbinding. | | Chimeer antilichaam | Een antilichaam dat is samengesteld uit genetisch gemanipuleerde delen van verschillende soorten, meestal met variabele domeinen van een dierlijk antilichaam en constante domeinen van een humaan antilichaam. | | Gehumaniseerd antilichaam | Een antilichaam waarbij de variabele domeinen grotendeels humaan zijn, met alleen de CDR-loops (Complementarity Determining Regions) die van een dierlijk antilichaam afkomstig zijn om de antigeenbinding te behouden. | | Bicyclisch peptide | Een klein peptide dat is verankerd aan een chemische kern, waardoor peptide-loops worden gevormd die kunnen worden gemanipuleerd voor antigeenbinding. Het kan gemodificeerd worden met toxines of andere functionaliteiten. | | Nanobody | Een klein antilichaamfragment, afgeleid van de zware keten van antilichamen bij kameelachtigen (VHH) of haaien (VNAR). Ze zijn vaak stabieler en beter oplosbaar dan traditionele antilichamen. | | Receptor | Een molecuul (meestal een eiwit) aan het oppervlak van een cel of in het cytoplasma dat een specifieke chemische signaalstof bindt en daardoor een cellulaire respons initieert. | | Kinetische data | Informatie over de snelheid van moleculaire interacties, waaronder associatie- en dissociatiesnelheden. Deze data helpen bij het begrijpen van de dynamiek van binding tussen moleculen. | | Dissociatieconstante ($K_d$) | Een maat voor de affiniteit van een complex, gedefinieerd als de concentratie waarbij de helft van de bindingsplaatsen bezet is. Een lagere $K_d$ duidt op een hogere affiniteit. | | Associatiesnelheidsconstante ($k_a$) | De snelheid waarmee moleculen binden om een complex te vormen. Uitgedrukt in eenheden van M$^{-1}$s$^{-1}$. | | Dissociatiesnelheidsconstante ($k_d$) | De snelheid waarmee een complex dissocieert in zijn componenten. Uitgedrukt in eenheden van s$^{-1}$. | | Werkelijkheidsgetrouwheid (Specificity) | Het vermogen van een molecuul om specifiek te binden aan zijn beoogde doelwit en niet aan andere moleculen. | | Driehoekig (Triangulation) | Een concept dat wordt toegepast bij de analyse van gegevens, waarbij meerdere datasets of metingen worden gecombineerd om een meer omvattend beeld te krijgen. | | Heterogeen | Bestaande uit verschillende delen of bestanddelen, wat van toepassing kan zijn op complexe moleculen zoals eiwitten of antilichamen. | | Homogeen | Bestaande uit een uniforme samenstelling of structuur. In de context van massawerkingmodellen, wordt vaak uitgegaan van homogeniteit van de reactanten. | | Fluorescentie kanalen | Specifieke detectoren in een flowcytometer die golflengtebereiken detecteren die overeenkomen met de emissie van specifieke fluorescente markers. | | Fout door interferentie | Een verstoring van het signaal die wordt veroorzaakt door de interactie van verschillende golven, zoals bij biolayer interferometrie, waar reflecterende oppervlakken interferentiepatronen kunnen creëren. | | Fout door onvoorziene interferentie | De term "ad hoc gating" verwijst naar het aanpassen van gatingstrategieën na de initiële data-acquisitie, vaak om onverwachte resultaten of populaties in de data te isoleren of te verwijderen. | | Ritssluiting (Zipper) | Een metafoor voor het proces waarbij moleculen zich aan elkaar binden, wat een sequentieel proces kan impliceren dat vergelijkbaar is met het sluiten van een ritssluiting. |

# Afspraken en organisatie van het labo Deze sectie van de cursus geeft een gedetailleerd overzicht van de afspraken met betrekking tot lessen, practica en examens, inclusief de beschikbaarheid van docenten en lesmateriaal [3](#page=3) [7](#page=7). ### 1.1 Algemene afspraken voor lessen (HC) Tijdens de hoorcolleges (HC) is het cruciaal om notities te nemen. Het gebruik van laptops is toegestaan, maar het gebruik van telefoons dient vermeden te worden. Er wordt een strikte houding verwacht wat betreft stilte, orde en respect. Indien er vragen zijn, dient men de hand op te steken om deze te stellen. Tijdige aanwezigheid is vereist; wie te laat is, komt beter niet [4](#page=4). ### 1.2 Afspraken voor practica (labo) De praktische sessies (labo) worden georganiseerd per specifieke groep en docent: * 2FBTA: Tamariche Buyle-Huybrecht [5](#page=5). * 2FBTB: Ilse Beck [5](#page=5). * 2FBTC: Tamariche Buyle-Huybrecht [5](#page=5). * 2MLTA: Tine Bourgois [5](#page=5). * 2MLTB: Tine Bourgois [5](#page=5). * 2MLTC: Rita Verhelst [5](#page=5). Aanwezigheid bij de labosessies is noodzakelijk om te kunnen slagen voor het vak. De labosessies bieden unieke inhoud en oefenkansen. Verdere specifieke afspraken voor het labo worden toegelicht tijdens de eerste labosessie. Er wordt zowel directe als uitgestelde feedback voorzien [5](#page=5). ### 1.3 Afspraken voor werkcolleges (WC) Voor de werkcolleges (WC) wordt verwacht dat studenten de voorgaande lessen al hebben meegenomen om een maximale leerwinst te behalen. Actief oefeningen maken en de verwerking van het labowerk zijn centrale elementen van de werkcolleges. Aanwezigheid bij de werkcolleges is noodzakelijk om te kunnen slagen. Er wordt directe feedback gegeven tijdens de werkcolleges [6](#page=6). ### 1.4 Beschikbaarheid lesmateriaal en communicatie Alle tijden voor hoorcolleges, werkcolleges en labosessies worden in de basis besproken. Lesmateriaal, inclusief de cursus en slides, kan gedeeld worden via ingesproken slides of online leerpaden. Vragen kunnen na de les of via Padlet gesteld worden. Een link naar het Padlet wordt voorzien [3](#page=3) [7](#page=7). ### 1.5 Afspraken voor examens De examens voor Labo Biotechnologie II bestaan uit twee delen [13](#page=13) [14](#page=14): #### 1.5.1 Deel A: Schriftelijk examen Dit deel van het examen telt voor 13/20 van het eindresultaat [14](#page=14). #### 1.5.2 Deel B: Examen met behulp van computer (BYOD) Dit deel van het examen telt voor 7/20 van het eindresultaat. Het is een Bring Your Own Device (BYOD) examen, wat betekent dat studenten een werkende, volledig opgeladen laptop moeten meebrengen om het examen te kunnen afleggen [14](#page=14). #### 1.5.3 Toegelaten leermateriaal en taal * **Leermateriaal:** Een niet-grafische rekenmachine is toegestaan. Andere types rekenmachines zijn niet toegestaan [14](#page=14). * **Antwoordtaal:** De standaardtaal voor antwoorden is Nederlands, waarbij specifieke vakterminologie wordt gebruikt. Indien voorafgaande toestemming van de docent is verkregen, is het mogelijk om in het Engels te antwoorden [14](#page=14). #### 1.5.4 Inhoud en studietips voor examens Het examen dekt theorie, inzicht, technologie, onderzoeksstrategie, en technische en digitale skills (vooral in het BYOD examen). De cursus bouwt systematisch op, en inzicht is gebaseerd op kennis en begrip [15](#page=15). > **Tip:** Begrijp de materie voordat je begint met studeren [15](#page=15). > **Tip:** Studeer regelmatig om de kennis te consolideren [15](#page=15). #### 1.5.5 Typische examenvraagtypes Het examen kan bestaan uit multiple choice vragen, open vragen en vraagstukken. Typische vraagtypes omvatten [16](#page=16): * Het interpreteren of voorspellen van resultaten [16](#page=16). * Het voorstellen van een onderzoeksstrategie [16](#page=16). * Het herkennen van een techniek of het uitleggen van het principe van een techniek [16](#page=16). * Het vinden van fouten in een techniek [16](#page=16). * Het bepalen wanneer welke techniek het meest geschikt is om te gebruiken [16](#page=16). * Oefenvragen die de stof behandelen [16](#page=16). --- # Concepten van moleculaire biologie en genetische variatie Dit onderwerp verkent de fundamentele principes van het centrale dogma van de moleculaire biologie en de verschillende manieren waarop genetische informatie kan variëren. ### 2.1 Het centrale dogma van de moleculaire biologie Het centrale dogma van de moleculaire biologie beschrijft de stroom van genetische informatie binnen een biologisch systeem. Deze stroom verloopt primair van DNA naar RNA en vervolgens naar eiwit [20](#page=20). * **DNA-replicatie:** DNA produceert kopieën van zichzelf om genetische informatie door te geven [20](#page=20). * **Transcriptie:** DNA wordt omgezet in RNA. De promotoractiviteit reguleert dit proces [20](#page=20). * **Translatie:** RNA wordt gebruikt als sjabloon voor de synthese van polypeptiden, die vervolgens opvouwen tot functionele proteïnen [20](#page=20). In eukaryoten ondergaat RNA maturatie, een proces dat kan bestaan uit [20](#page=20): * Splitsing (splicing) * Cap-structuur aan de 5'-uiteinde * Polyadenylatie aan de 3'-uiteinde De afbraak van RNA wordt beïnvloed door de natuurlijke half-life, die kan worden beïnvloed door de verkorting van de poly(A)-staart tijdens het afsterven van cellen of ziekteprocessen. Daarnaast zijn er cel- en ziekte-specifieke regulerende RNA's in eukaryoten [20](#page=20). #### 2.1.1 Genen, transcripten en genexpressie Een **gen** is een basiseenheid van erfelijkheid die codeert voor een functioneel molecuul, meestal een eiwit of een RNA-molecuul. Een **transcript** is het RNA-molecuul dat wordt gesynthetiseerd vanuit een gen. **Transcriptie** is het proces waarbij een DNA-sequentie wordt gekopieerd naar een RNA-sequentie. **Translatie** is het proces waarbij de sequentie van een messenger-RNA (mRNA) wordt omgezet in een sequentie van aminozuren om een polypeptide te vormen. De **opvouwing** van een polypeptide leidt tot de vorming van een functioneel proteïne [20](#page=20) [21](#page=21). ### 2.2 DNA-gerelateerde begrippen Verschillende moleculen en structuren spelen een rol in het manipuleren en organiseren van DNA [23](#page=23): * **Restrictie-enzymen:** Enzymen die DNA knippen op specifieke herkenningssequenties [23](#page=23). * **DNase:** Een enzym dat DNA afbreekt [23](#page=23). * **Exonuclease:** Een enzym dat nucleotiden van het uiteinde van een DNA-streng verwijdert, hetzij vanaf het 5'-uiteinde of het 3'-uiteinde [23](#page=23). * **DNA-polymerase:** Enzymen die de synthese van nieuwe DNA-strengen katalyseren [23](#page=23). * **RNA-polymerase:** Enzymen die de synthese van RNA-moleculen uit een DNA-template katalyseren [23](#page=23). * **Nucleosoom:** De basiseenheid van chromatine, bestaande uit DNA dat is opgewonden rond een kern van histon-eiwitten [23](#page=23). * **Haploïd:** Een cel of organisme dat slechts één set chromosomen heeft [23](#page=23). * **Diploïd:** Een cel of organisme dat twee sets chromosomen heeft, één van elke ouder [23](#page=23). #### 2.2.1 Soorten DNA DNA kan in verschillende vormen voorkomen, elk met specifieke locaties en functies binnen een cel [24](#page=24): * **Genomisch DNA:** Het volledige DNA-gehalte van een organisme, gelegen in de celkern [24](#page=24). * **Plasmide DNA:** Kleine, circulaire DNA-moleculen die voorkomen in bacteriën en sommige eukaryoten, onafhankelijk van het chromosomale DNA kunnen repliceren [24](#page=24). * **Chloroplast DNA:** DNA dat zich in chloroplasten bevindt, die verantwoordelijk zijn voor fotosynthese in planten en algen [24](#page=24). * **Mitochondriaal DNA:** DNA dat zich in mitochondriën bevindt, die betrokken zijn bij celademhaling [24](#page=24). ### 2.3 Genetische variatie Genetische variatie verwijst naar de verschillen in DNA-sequenties tussen individuen binnen een populatie. Deze variatie kan optreden in zowel coderende als niet-coderende sequenties van het DNA [25](#page=25). #### 2.3.1 Genetische eenheden en manifestatie * **Gen:** Een segment DNA dat codeert voor een functioneel product [21](#page=21) [25](#page=25). * **Allel:** Een van de verschillende varianten van een gen [25](#page=25). * **Locus (meervoud: loci):** De specifieke locatie van een gen op een chromosoom [25](#page=25). * **Genotype:** De genetische samenstelling van een individu met betrekking tot een bepaald kenmerk of reeks kenmerken [25](#page=25). * **Fenotype:** De observeerbare fysieke of biochemische eigenschappen van een individu, die een gevolg zijn van de interactie tussen het genotype en de omgeving [25](#page=25). #### 2.3.2 Repeat sequenties Repeat sequenties zijn segmenten van DNA die zich meerdere keren herhalen in het genoom [26](#page=26). * Deze repeats kunnen tot 500 basenparen (bp) lang zijn [26](#page=26). * Ze bevinden zich op specifieke plaatsen en zijn verspreid over het genoom [26](#page=26). * Een voorbeeld is de 300 bp Alu-repeat die bij primaten voorkomt. SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) zijn een type repeat sequenties die in labo 1 en 2 worden besproken [26](#page=26). #### 2.3.3 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) SNPs zijn de meest voorkomende vorm van genetische variatie in het menselijk genoom [27](#page=27). * Ze kunnen variatie veroorzaken in zowel coderende als niet-coderende gebieden van het DNA [27](#page=27). * Een SNP is een variatie in slechts één nucleotide op een specifieke positie in het genoom [27](#page=27). * SNPs worden in labo 3 en 4 verder behandeld [27](#page=27). --- # Principe en toepassing van PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek die in vitro een exponentiële amplificatie van een specifieke DNA-sequentie mogelijk maakt. Deze methode is essentieel om een grote hoeveelheid van een welbepaald DNA-fragment te verkrijgen, mits de sequentie aan de uiteinden bekend is om de juiste primers te kunnen kiezen [31](#page=31) [32](#page=32). ### 3.1 De techniek van PCR PCR is een cyclisch en exponentieel proces dat in vitro plaatsvindt. Het doel is de amplificatie van DNA wat resulteert in een grote hoeveelheid van een specifiek DNA-fragment [31](#page=31) [32](#page=32). #### 3.1.1 Benodigdheden voor PCR Om PCR succesvol uit te voeren, zijn de volgende componenten absoluut noodzakelijk [33](#page=33): * **ss DNA-templates:** Het DNA dat geamplificeerd moet worden [33](#page=33). * **Primerkoppel:** Een equimolaire mix van twee korte DNA-sequenties die complementair zijn aan de uiteinden van het te amplificeren fragment. De specificiteit van de PCR is afhankelijk van deze primers [32](#page=32) [33](#page=33) [39](#page=39). * **dNTP's (deoxynucleotide trifosfaten):** De bouwstenen voor de nieuwe DNA-strengen, ook in equimolaire concentraties aangeleverd. Deze kunnen al dan niet gemerkt zijn [33](#page=33). * **Hittebestendig DNA-polymerase:** Een enzym dat DNA kan synthetiseren, bestand tegen de hoge temperaturen die tijdens de denaturatiestap worden gebruikt. Een voorbeeld hiervan is Taq-polymerase [33](#page=33). * **DNA polymerase buffer:** Een oplossing die de optimale omstandigheden voor het DNA-polymerase biedt, inclusief de aanwezigheid van Mg\(^{2+}\) ionen, die vaak als cofactor fungeren [33](#page=33). #### 3.1.2 Het cyclische proces van PCR Het PCR-proces bestaat uit een reeks cycli, waarbij elke cyclus drie stappen omvat. Tussen de 25 en 45 cycli worden doorlopen [36](#page=36). 1. **Denaturatie:** Het dubbelstrengs DNA wordt verhit tot ongeveer 94°C tot 96°C gedurende 30 seconden. Dit proces scheidt de twee DNA-strengen van elkaar [34](#page=34) [36](#page=36). 2. **Annealing (hybridisatie):** De temperatuur wordt verlaagd naar 55°C tot 72°C gedurende 30 seconden. Bij deze temperatuur kunnen de primers binden aan hun complementaire sequenties op de enkelstrengs DNA-templates [36](#page=36). 3. **Elongatie (extensie):** De temperatuur wordt ingesteld op 72°C. Het hittebestendige DNA-polymerase begint vanaf de primers met de synthese van een nieuwe DNA-streng, waarbij het de template als leidraad gebruikt. Deze stap duurt ongeveer 1 minuut [36](#page=36). Na de laatste cyclus volgt vaak een finale elongatiestap van 8 minuten bij 72°C om ervoor te zorgen dat alle DNA-strengen volledig worden voltooid [36](#page=36). #### 3.1.3 Exponentiële amplificatie De amplificatie van DNA tijdens PCR verloopt exponentieel. Na elke cyclus wordt het aantal kopieën van het doel-DNA verdubbeld, wat leidt tot een zeer snelle toename van het aantal DNA-moleculen. De formule die de exponentiële synthese van begrensd DNA benadert, is [35](#page=35) [40](#page=40): $$ \text{Aantal product} \approx (2^n - 2(n+1)) \times x $$ [40](#page=40). Waarin: * $n$ staat voor het aantal cycli [40](#page=40). * $2^n$ staat voor de onbegrensde reactieproducten [40](#page=40). * $x$ staat voor het aantal template moleculen [40](#page=40). > **Tip:** Begrijp dat de exponentiële groei de kracht van PCR verklaart, maar in de praktijk zijn er limieten door reactiecomponenten die opraken of productinhibitie. #### 3.1.4 Visualisatie van PCR-producten De geamplificeerde DNA-fragmenten, de zogenaamde amplicons, worden visueel gemaakt na afloop van de PCR. Een veelgebruikte methode is gelelektroforese, waarbij de grootte van de DNA-fragmenten wordt bepaald op basis van hun migratiesnelheid door een gel [37](#page=37) [38](#page=38) [41](#page=41). De informatie die uit de visualisatie gehaald kan worden, omvat: * **Migratie-afstand:** Dit correleert met de grootte van het DNA-fragment [38](#page=38). * **Relatieve bandintensiteit:** Dit kan een indicatie geven van de hoeveelheid van het specifieke DNA-fragment [38](#page=38). * **Specificiteit van de reactie:** Het waarnemen van een band op de verwachte grootte duidt op een specifieke amplificatie [38](#page=38). > **Tip:** Het interpreteren van een gel is cruciaal. Een enkele, scherpe band op de juiste positie duidt op een succesvolle en specifieke PCR. Meerdere banden of banden op onverwachte posities kunnen wijzen op niet-specifieke amplificatie of problemen met de primers. #### 3.1.5 Specificiteit van de PCR-reactie De specificiteit van de PCR-reactie wordt bepaald door de match of mismatch tussen de primers en de DNA-template. Correct gekozen primers zullen alleen binden aan de beoogde sequenties, wat leidt tot de amplificatie van het gewenste DNA-fragment [32](#page=32) [39](#page=39). ### 3.2 Klassieke PCR en toepassingen Klassieke PCR is een detectiemethode die op het einde van de reactie plaatsvindt en wordt beschouwd als eindpuntbepaling. Deze methode is voornamelijk kwalitatief en laat grote verschillen in hoeveelheden opvallen. Analyse gebeurt typisch via gelelektroforese [41](#page=41). #### 3.2.1 Toepassingen van klassieke PCR Klassieke PCR kan gebruikt worden om te achterhalen wat de eigenschappen van het template DNA zijn. Bovendien zijn er diverse toepassingen voor het PCR-product zelf [42](#page=42). Voorbeelden van toepassingen zijn onder andere: * **Diagnostiek:** Detectie van pathogenen (virussen, bacteriën) of genetische afwijkingen. * **Forensisch onderzoek:** DNA-fingerprinting voor identificatie. * **Moleculaire biologie onderzoek:** Kloneren van genen, sequentiebepaling, genexpressieanalyse (in combinatie met andere technieken). * **Genetische modificatie:** Amplificatie van DNA-fragmenten voor genetische manipulatie. ### 3.3 Belangrijke factoren in PCR Verschillende factoren kunnen de efficiëntie en succes van een PCR-reactie beïnvloeden. Optimalisatie van deze factoren is cruciaal voor betrouwbare resultaten [43](#page=43). 1. **Temperatuur- en tijdsprofiel:** Elke stap in de PCR-cyclus (denaturatie, annealing, elongatie) vereist specifieke temperaturen en tijden voor optimale resultaten [36](#page=36) [43](#page=43). 2. **Het DNA-polymerase:** De keuze van het polymerase is belangrijk, met name de hittebestendigheid en de specifieke eigenschappen zoals processiviteit en efficiëntie [33](#page=33) [43](#page=43). 3. **dNTP concentraties:** De concentratie van de vier dNTP's moet voldoende zijn om de synthese van het DNA-product te ondersteunen, maar te hoge concentraties kunnen inhibitie veroorzaken [33](#page=33) [43](#page=43). 4. **De primers:** De lengte, sequentie, concentratie en thermodynamische eigenschappen van de primers zijn van essentieel belang voor de specificiteit en efficiëntie van de amplificatie [32](#page=32) [33](#page=33) [43](#page=43). 5. **Reactievolume:** Het totale volume van de reactie kan invloed hebben op de efficiëntie van de interacties tussen de componenten [43](#page=43). 6. **Zuiverheid en hoeveelheid template DNA:** Hoogwaardig template DNA zonder inhibitoren is noodzakelijk. De hoeveelheid template moet ook geoptimaliseerd worden; te veel of te weinig kan problemen geven [43](#page=43). 7. **Grootte en structuur amplificatieproduct:** De lengte van het te amplificeren fragment kan de efficiëntie van de PCR beïnvloeden. Langere fragmenten vereisen doorgaans langere elongatietijden en specifiekere polymerases [43](#page=43). 8. **Algemene set-up:** De correcte mix van alle componenten en het volgen van de juiste procedure is fundamenteel [41](#page=41) [43](#page=43). 9. **Apparatuur en materialen:** Het gebruik van een betrouwbare thermocycler en hoogwaardige verbruiksartikelen is belangrijk [43](#page=43). 10. **PCR problemen - troubleshooting:** Het identificeren en oplossen van veelvoorkomende problemen (bv. geen product, niet-specifieke producten) is een belangrijk aspect van het werken met PCR [43](#page=43). 11. **PCR toepassingsgebieden:** Het selecteren van de juiste PCR-methode en parameters voor een specifiek doel is cruciaal [43](#page=43). --- # Factoren en optimalisatie van PCR PCR-reacties worden beïnvloed door een complex samenspel van factoren die geoptimaliseerd moeten worden voor succesvolle amplificatie van specifieke DNA-sequenties [44](#page=44). ### 4.1 Het temperatuur- en tijdsprofiel van de PCR-cyclus Elke PCR-cyclus bestaat uit drie hoofdfasen met specifieke temperatuur- en tijdsinstellingen die cruciaal zijn voor de efficiëntie en specificiteit [44](#page=44). #### 4.1.1 Denaturatie De denaturatiefase breekt de dubbelstrengs DNA-template in enkelstrengs DNA, waardoor primers kunnen binden. Dit gebeurt doorgaans bij een temperatuur van 94°C gedurende 3 tot 5 minuten voor de eerste cyclus en 20 tot 30 seconden voor volgende cycli [44](#page=44). #### 4.1.2 Annealing Tijdens de annealingfase binden de primers aan hun complementaire sequenties op de enkelstrengs DNA-template. De annealingtemperatuur (Ta) is cruciaal voor de specificiteit van de PCR [46](#page=46) [48](#page=48). * **Ta te hoog**: Leidt tot een te lage bindingsaffiniteit, waardoor primers niet specifiek of helemaal niet binden [48](#page=48). * **Ta te laag**: Leidt tot aspecifieke binding van primers aan niet-complementaire sequenties, wat resulteert in niet-specifieke producten [48](#page=48). De annealingtijd moet ook geoptimaliseerd worden; te lang kan leiden tot aspecifieke binding, terwijl te kort de bindingsvorming kan belemmeren [48](#page=48). #### 4.1.3 Elongatie De elongatiefase is waar het DNA-polymerase nieuwe DNA-strengen synthetiseert vanaf de primers. De optimale temperatuur is meestal 72°C. De duur is afhankelijk van de lengte van het te amplificeren fragment [44](#page=44): * Tot 400 bp: 20 seconden [44](#page=44). * 400-1200 bp: 40 seconden [44](#page=44). ### 4.2 Het DNA-polymerase Het DNA-polymerase is het enzym dat verantwoordelijk is voor de DNA-synthese tijdens PCR. Verschillende thermostabiele polymerasen zijn beschikbaar, elk met hun eigen eigenschappen die de PCR-uitkomst kunnen beïnvloeden [50](#page=50). #### 4.2.1 Belangrijke DNA-polymerasen * **Taq DNA-polymerase** (van *Thermus aquaticus*): Dit is een veelgebruikt polymerase met een goede verlengingssnelheid en 5' naar 3' exonuclease activiteit. Het produceert DNA-uiteinden met een 3' A-uiteinde [51](#page=51). * **Pfu DNA-polymerase** (van *Pyrococcus furiosus*): Dit polymerase heeft een hogere nauwkeurigheid (fidelity) vanwege de 3' naar 5' exonuclease (proofreading) activiteit en is thermostabieler. Het produceert DNA-uiteinden zonder A-uiteinde [51](#page=51). * Andere polymerasen zoals Vent, Tth, en Pfx worden ook gebruikt, vaak met aangepaste eigenschappen voor specifieke toepassingen [50](#page=50). #### 4.2.2 Eigenschappen van polymerasen | Eigenschap | Taq DNA Polymerase | Pfu DNA Polymerase | | :----------------------------- | :------------------------ | :------------------------ | | Thermostabiliteit (t½ bij 95°C) | ~40 min | >120 min | | 5’ → 3’ exonuclease activiteit | Ja | Nee | | 3’ → 5’ exonuclease activiteit | Nee | Ja | | Verlengingssnelheid (nt/sec) | 75 | 60 | | Resulterend DNA-uiteinde | 3’ A | - | | Moleculair gewicht (kDa) | 94 | 92 | | Prijs / 500 Units | 242 EUR (goedkoper) | 400 EUR (duurder) | | Fidelity | Lager | Hoger | #### 4.2.3 Effect van exonuclease-activiteit * **5' → 3' exonuclease activiteit**: Kan de primer van het 5'-uiteinde van de template verwijderen, wat de verlenging kan belemmeren [52](#page=52). * **3' → 5' exonuclease activiteit (proofreading)**: Corrigeert fouten die tijdens de DNA-synthese worden gemaakt, wat leidt tot een hogere nauwkeurigheid van het PCR-product [52](#page=52). ### 4.3 dNTP's (deoxynucleotide trifosfaten) De dNTP's (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) zijn de bouwstenen voor de nieuwe DNA-strengen [53](#page=53). * Ze moeten in **equimolaire hoeveelheden** aanwezig zijn in het reactiemengsel, bij een pH van ongeveer 7 [53](#page=53). * De **optimale concentratie** is belangrijk; "less is more" kan soms leiden tot betere resultaten [53](#page=53). * **Gemodificeerde dNTP's** kunnen worden gebruikt voor specifieke toepassingen zoals sequencing (bijv. ddNTP's) of voor labelling (bijv. fluorescente, radioactieve, digoxigenin, of biotin-gekoppelde dNTP's) [53](#page=53). ### 4.4 Oligonucleotide primers Primers zijn korte, enkelstrengs DNA-moleculen die specifiek binden aan de template en als startpunt dienen voor DNA-polymerase [56](#page=56). #### 4.4.1 Primer-DUO Primers werken in paren: upstream en downstream, of forward en reverse [57](#page=57). #### 4.4.2 Concentratie en amplificatie Primers moeten equimolair aanwezig zijn, typisch tussen 0,1 en 1 µM in het reactiemengsel. Een hogere primerconcentratie leidt tot meer product, maar kan de specificiteit verminderen [58](#page=58). #### 4.4.3 Primer design criteria Goed primer design is essentieel voor specifieke en efficiënte amplificatie [59](#page=59). * **Lengte**: 14 tot 40 nucleotiden, met 20 nucleotiden als gangbaar [59](#page=59). * **GC-gehalte**: 45% tot 60% [59](#page=59). * **Smelt-temperatuur (Tm)**: Tussen 50°C en 65°C. De Tm van de forward en reverse primer moet zo dicht mogelijk bij elkaar liggen, wat geholpen kan worden door een Tm-calculator [59](#page=59). * De benaderende formule voor Tm is: $Tm = 2 \cdot (\#A+\#T) + 4 \cdot (\#C+\#G)$ [60](#page=60). * **Minimalisering van complementariteit**: Zowel zelf-complementariteit (dimeren) als inter-complementariteit tussen primers moet geminimaliseerd worden, met name aan het 3'-uiteinde [59](#page=59). * **GC/AT-balans**: Een uitgebalanceerde distributie is wenselijk [59](#page=59). * **Vermijden van herhalingen**: Langere herhalingen van G of C (langer dan 3 basen) moeten vermeden worden [59](#page=59). * **3'-einde**: Idealiter eindigt een primer met een C of G nucleotide om de bindingsstabiliteit te verhogen [59](#page=59). * **Specificiteit verificatie**: Gebruik bio-informatica tools zoals BLAST om de specificiteit van de primers te verifiëren [59](#page=59). #### 4.4.4 Annealingstemperatuur (Ta) De annealingtemperatuur (Ta) ligt typisch ongeveer 5°C lager dan de Tm van de primers ($Ta \approx Tm - 5^\circ C$). Een gradiënt PCR kan worden gebruikt om de optimale Ta te vinden. Het is belangrijk te onthouden dat de Tm van de primer verschilt van die van het amplicon [60](#page=60). #### 4.4.5 Primer dimer vorming Primer dimer vorming treedt op wanneer primers met elkaar binden in plaats van met de template, wat resulteert in de amplificatie van aspecifieke, korte producten. Dit is een teken dat het primerdesign herzien moet worden of dat de PCR-condities geoptimaliseerd moeten worden [61](#page=61) [62](#page=62) [63](#page=63) [91](#page=91). #### 4.4.6 Primer design en validatie software Diverse tools zijn beschikbaar voor primer design en validatie, waaronder Primer3 (freeware) en PrimerBLAST op NCBI [64](#page=64). #### 4.4.7 Merkingsmogelijkheden van primers Primers kunnen aan hun 5'-uiteinde worden gemerkt met bijvoorbeeld fluorescente labels, radioactieve isotopen of digoxigenin/biotin, wat gebruikt kan worden voor detectie of hybridisatie [66](#page=66). #### 4.4.8 Gebruik van primers voor sequentie toevoeging Primers kunnen worden ontworpen om specifieke sequenties toe te voegen aan de uiteinden van het PCR-product, zoals markers, promotors, of herkenningsplaatsen voor restrictie-enzymen [69](#page=69). #### 4.4.9 Gebruik van primers voor mutaties Door primers te ontwerpen met gewenste mismatches, kunnen gerichte mutaties in het PCR-product worden geïntroduceerd [71](#page=71). ### 4.5 Reactievolume Het optimale reactievolume voor PCR ligt meestal tussen 15 en 50 µl [75](#page=75). ### 4.6 Zuiverheid en componenten De zuiverheid van het template-DNA en de aanwezigheid van bepaalde inhibitoren kunnen de PCR sterk beïnvloeden [76](#page=76). #### 4.6.1 Hoeveelheid template DNA De hoeveelheid template DNA ligt doorgaans tussen 100 en 500 ng [76](#page=76). #### 4.6.2 Inhibitoiren Verschillende stoffen kunnen PCR remmen, waaronder EDTA, heparine, hemoglobine, fosfaat, ionaire detergentia, fenolen en porfyrines [76](#page=76). #### 4.6.3 Positieve componenten Bepaalde componenten kunnen, in lage concentraties, de PCR positief beïnvloeden: * **BSA (Bovine Serum Albumin)**: Bindt inhibitoren en stabiliseert het polymerase [77](#page=77). * **DMSO (Dimethyl sulfoxide)**: Bevordert annealing [77](#page=77). * **Betaïne**: Bevordert annealing [77](#page=77). * **Glycerol en PEG6000**: Stabiliseren het Taq-polymerase [77](#page=77). * **SDS en Triton X100**: Voorkomen aggregatie van het polymerase [77](#page=77). ### 4.7 Grootte en structuur van het amplicon De grootte en secundaire structuur van het te amplificeren fragment kunnen de efficiëntie beïnvloeden [78](#page=78). * Secundaire structuren in het amplicon moeten worden geminimaliseerd [78](#page=78). * Te lange sequenties (>1000 bp) kunnen problematisch zijn; tot 1000 bp is optimaal [78](#page=78). * Het aantal cycli moet geoptimaliseerd worden om competitie tussen primers en renaturatie te voorkomen [78](#page=78). ### 4.8 Algemene set-up: Mastermix Een mastermix is een geconcentreerde oplossing die alle componenten van de PCR bevat (buffer, dNTP's, primers, polymerase), behalve het template DNA. Dit verhoogt de reproduceerbaarheid en efficiëntie, en minimaliseert pipetteerfouten en contaminatie [79](#page=79) [84](#page=84). #### 4.8.1 Oefening mastermix berekening Voor een reactie van 25 µl per staal voor 4 stalen, met de gegeven componenten, moet het volume van elke component worden berekend voor de mastermix en het definitieve reactiemengsel, rekening houdend met een extra volume voor pipetteren [85](#page=85). ### 4.9 Controles en betrouwbaarheid Verschillende controles zijn essentieel om de betrouwbaarheid van PCR-resultaten te waarborgen [80](#page=80). #### 4.9.1 Soorten controles * **Negatieve controle (watercontrole)**: Bevat alle PCR-componenten behalve het template DNA. Detecteert contaminatie [80](#page=80) [83](#page=83). * **Positieve controle**: Bevat template DNA waarvan bekend is dat het het doelgen bevat. Verifieert dat de PCR-reactie werkt [80](#page=80) [83](#page=83). * **Interne controle**: Een spike-in DNA of een tweede primerset die parallel amplificeert in elk monster. Detecteert inhibitie of falen van de reactie in specifieke monsters [80](#page=80) [83](#page=83). #### 4.9.2 Voorkomen van contaminatie * Scheid pre- en post-PCR werkzaamheden strikt [81](#page=81). * Gebruik aparte werkzones en/of PCR-LAF-kasten [81](#page=81). * Draag handschoenen en ververs ze regelmatig [81](#page=81). * Gebruik wegwerpmaterialen waar mogelijk [81](#page=81). * Gebruik verschillende pipetten voor reagentia en DNA-stalen [81](#page=81). * Gebruik tips met filters [81](#page=81). #### 4.9.3 Betrouwbaarheid en specificiteit van PCR De nauwkeurigheid (fidelity) van PCR kan worden verhoogd door hogere dNTP-concentraties, lagere annealingtemperaturen, hogere primerconcentraties en lagere enzymconcentraties. De specificiteit kan worden verhoogd met behulp van PCR-afgeleiden zoals nested PCR, touchdown PCR of hot-start PCR [89](#page=89) [90](#page=90). #### 4.9.4 Probleemoplossing bij PCR * **Band op verwachte hoogte of andere hoogte in waterstaal**: Wijst op contaminatie [91](#page=91). * **Band op primer-dimeer hoogte in waterstaal**: Bewijs van primer-dimeer vorming, wat een herziening van primerdesign of optimalisatie van PCR-condities vereist [91](#page=91). * **Geen enkele band op gelelektroforese (ook niet in waterstaal)**: Kan duiden op een mislukte PCR, controleer primerdesign, template-integriteit, optimalisatie van condities, of afwezigheid van template. Een positieve controle kan helpen bij de diagnose [92](#page=92). * **Beschadigd template-DNA (door shearing, endonucleasen, UV)**: Kan de PCR-opbrengst beïnvloeden [93](#page=93). ### 4.10 PCR-apparatuur PCR-apparatuur, zoals thermocyclers, moet accuraat, uniform en reproduceerbaar zijn, met snelle temperatuurwissels en een verwarmd deksel om verdamping te voorkomen [86](#page=86). --- # Toepassingsgebieden en problemen bij PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) kent diverse analytische en preparatieve toepassingen, waarbij het ook belangrijk is om veelvoorkomende problemen te herkennen en op te lossen [94](#page=94). ### 5.1 Analytische toepassingen van PCR Analytische toepassingen van PCR richten zich op het detecteren en kwantificeren van specifieke DNA-sequenties [94](#page=94). #### 5.1.1 Detectie van aanwezigheid/afwezigheid PCR kan worden ingezet om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifieke DNA-sequentie in een monster te bepalen. Dit is bijvoorbeeld relevant bij diagnostiek, zoals het aantonen van pathogenen of genetische afwijkingen [94](#page=94). #### 5.1.2 Kwantificatie van DNA Naast detectie kan PCR ook gebruikt worden om de hoeveelheid van een specifiek DNA-doelwit te bepalen. Dit wordt vaak gedaan met behulp van real-time PCR (qPCR), hoewel de basisprincipes van amplificatie van het doelwit gelden [94](#page=94). #### 5.1.3 Analyse van mutaties en verwantschappen PCR is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van genetische variaties, waaronder mutaties. Dit heeft toepassingen in diagnostiek, forensisch onderzoek (identificatie) en het vaststellen van verwantschappen [94](#page=94). ### 5.2 Preparatieve toepassingen van PCR Preparatieve PCR-toepassingen zijn gericht op het produceren van grotere hoeveelheden van een specifiek DNA-fragment voor verder gebruik [95](#page=95). #### 5.2.1 Isolatie van genomische en cDNA klonen PCR kan gebruikt worden om specifieke fragmenten van genomisch DNA of cDNA te amplificeren. Deze geamplificeerde fragmenten kunnen vervolgens worden gebruikt voor verdere moleculaire biologische technieken zoals klonering en sequencing [95](#page=95). #### 5.2.2 Modificatie en toevoeging van sequenties Door het ontwerpen van primers met specifieke sequenties, kunnen nieuwe genetische informatie of modificaties aan het PCR-product worden toegevoegd [95](#page=95). ##### 5.2.2.1 Inbouwen van mutaties Met PCR kunnen doelgerichte mutaties in een DNA-sequentie worden geïntroduceerd. Dit is waardevol voor functionele studies van genen of voor het creëren van gemodificeerde eiwitten [95](#page=95). ##### 5.2.2.2 Inbouwen van gemerkte dNTPs Het is mogelijk om gemerkte dNTPs (nucleotiden) in het PCR-product in te bouwen, zowel intern in de sequentie als aan de uiteinden. Deze labels kunnen radioactief, fluorescent of ander type zijn en worden gebruikt voor detectie of analyse [95](#page=95). ### 5.3 Veelvoorkomende problemen en troubleshooting Bij het uitvoeren van PCR kunnen diverse problemen optreden die de betrouwbaarheid en opbrengst van de reactie beïnvloeden. #### 5.3.1 Optimale reactiecondities Het succes van een PCR-reactie hangt af van verschillende factoren, waaronder de temperatuurcyclus, de concentratie van reagentia en het ontwerp van de primers [96](#page=96). ##### 5.3.1.1 De smelttemperatuur (Tm) en annealing temperatuur (Ta) De smelttemperatuur (Tm) van een primer is de temperatuur waarbij de helft van de primer-DNA-hybriden gedissocieerd is. De annealing temperatuur (Ta) van de PCR-reactie is cruciaal voor de specificiteit van de primerbinding. Een Ta die te laag is, kan leiden tot aspecifieke bindingen en meerdere banden in het PCR-product. Een Ta die te hoog is, kan de primerbinding verhinderen en resulteren in een zwak of afwezig PCR-product [97](#page=97) [98](#page=98). > **Tip:** De annealing temperatuur (Ta) wordt doorgaans ingesteld op ongeveer 5°C lager dan de laagste Tm van de gebruikte primers om een efficiënte en specifieke annealing te garanderen [97](#page=97). ##### 5.3.1.2 Gebruik van dNTP's dNTP's (deoxyribonucleotide trifosfaten) zijn de bouwstenen voor de nieuwe DNA-streng die tijdens de PCR wordt gesynthetiseerd. Een correcte concentratie is essentieel voor een efficiënte amplificatie [98](#page=98). > **Oefening:** Schets de algemene structuur van een dNTP [98](#page=98). #### 5.3.2 Contaminatie Contaminatie van PCR-reagentia met doelwit-DNA is een veelvoorkomend probleem dat kan leiden tot valspositieve resultaten [98](#page=98). > **Oefening:** Hoe zou je contaminatie van PCR-reagentia met doelwit-DNA controleren [98](#page=98)? #### 5.3.3 Interpretatie van resultaten Het interpreteren van PCR-resultaten vereist kennis van de verwachte uitkomst en mogelijke afwijkingen [98](#page=98). ##### 5.3.3.1 Meerdere banden Wanneer een PCR-reactie, waarbij één band wordt verwacht, resulteert in twee of meer zichtbare banden op een gel, kan dit duiden op aspecifieke amplificatie of de aanwezigheid van meerdere DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte in het monster. Dit kan worden veroorzaakt door een te lage annealing temperatuur of niet-specifieke primerbinding [98](#page=98). > **Oefening:** Hoe kan je dit interpreteren: je voert een PCR uit, verwacht 1 band, maar er zijn er 2 of meer te zien [98](#page=98)? #### 5.3.4 Verhogen van de betrouwbaarheid Verschillende strategieën kunnen worden toegepast om de betrouwbaarheid van een PCR-reactie te verhogen. Dit omvat het optimaliseren van de reactiecondities, het gebruik van hoogwaardige reagentia en het uitvoeren van controles [96](#page=96). > **Oefening:** Geef een manier om gemerkt PCR product te bekomen [98](#page=98). > **Oefening:** Bedenk 3 situaties waarin je PCR zou gebruiken [98](#page=98). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Polymerase chain reaction (PCR) | Een moleculaire techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-fragmenten exponentieel te amplificeren in vitro. Dit proces maakt het mogelijk om grote hoeveelheden van een bepaald DNA-stuk te verkrijgen voor analyse of manipulatie. | | Centraal dogma van de moleculaire biologie | Het principe dat genetische informatie stroomt van DNA naar RNA door transcriptie, en van RNA naar eiwitten door translatie. Dit is een fundamenteel concept in de moleculaire biologie. | | Gen | Een segment van DNA dat de instructies bevat voor de synthese van een functioneel product, zoals een eiwit of een functioneel RNA-molecuul. Genen zijn de basiseenheden van erfelijkheid. | | Genetische variatie | Verschillen in DNA-sequenties tussen individuen binnen een populatie. Dit kan leiden tot verschillen in fenotype en is cruciaal voor evolutie en diversiteit. | | DNA-replicatie | Het proces waarbij een DNA-molecuul wordt gekopieerd om twee identieke dochtermoleculen te produceren. Dit is essentieel voor celdeling en erfelijkheid. | | Semi-conservatief | Beschrijft het replicatiemechanisme van DNA, waarbij elke nieuwe dubbele helix bestaat uit één originele (ouderlijke) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng. | | Bidirectioneel | Verwijst naar de replicatievorken die zich in twee tegengestelde richtingen voortbewegen vanaf een oorsprong van replicatie (ori). | | Leading strand | De DNA-streng die continu wordt gesynthetiseerd in de 5’ naar 3’ richting tijdens de replicatie, omdat deze beweegt in de richting van de replicatievork. | | Lagging strand | De DNA-streng die discontinu wordt gesynthetiseerd in korte fragmenten, bekend als Okazaki-fragmenten, omdat de synthese tegengesteld is aan de beweging van de replicatievork. | | Primer | Een kort stukje enkelstrengs DNA of RNA dat dient als startpunt voor DNA-synthese door DNA-polymerase. In PCR is een primerpaar essentieel om de te amplificeren regio te definiëren. | | Denaturatie | Het proces waarbij de dubbele helixstructuur van DNA wordt verbroken door hitte (typisch rond 95°C), wat resulteert in twee enkelstrengs DNA-moleculen die kunnen dienen als template. | | Annealing | Het proces waarbij primers specifiek binden aan complementaire sequenties op de enkelstrengs DNA-templates tijdens de PCR. De temperatuur hiervoor (annealingstemperatuur, Ta) is cruciaal voor specificiteit. | | Elongatie | De fase van PCR waarin DNA-polymerase de primer verlengt door nucleotiden toe te voegen, een nieuw DNA-streng te synthetiseren die complementair is aan het template-DNA. | | Amplicon | Het DNA-fragment dat wordt gegenereerd tijdens de PCR-reactie. Dit is de geamplificeerde sequentie tussen de twee primers. | | Exponentiële amplificatie | Het principe van PCR waarbij het doel-DNA-fragment in elke cyclus verdubbelt, wat leidt tot een zeer snelle toename van het aantal kopieën. | | End-point determination | Een kwalitatieve analyse in PCR waarbij het product pas aan het einde van de reactie wordt gevisualiseerd, wat informatie geeft over de aanwezigheid van het amplicon maar niet over de hoeveelheid tijdens de reactie. | | Gelelektroforese | Een techniek die wordt gebruikt om DNA-fragmenten te scheiden op basis van grootte door een elektrisch veld toe te passen op een gelmatrix. | | Specificiteit van PCR | De mate waarin PCR een specifiek doel-DNA-fragment amplificeert zonder andere sequenties te produceren. Dit wordt sterk beïnvloed door primerontwerp en annealingstemperatuur. | | Primer dimeer | Onbedoelde producten gevormd door de interactie en amplificatie van primers met zichzelf of met elkaar, wat kan leiden tot aspecifieke banden in PCR. | | Tm (Melting temperature) | De temperatuur waarbij 50% van een dubbelstrengs DNA-molecuul gedissocieerd is tot enkelstrengs moleculen. Dit is een belangrijke parameter voor het ontwerpen van primers. | | Ta (Annealing temperature) | De optimale temperatuur voor het binden van primers aan de DNA-template tijdens de PCR. Deze temperatuur ligt doorgaans iets lager dan de Tm van de primers. | | DNA-polymerase | Een enzym dat verantwoordelijk is voor het synthetiseren van DNA-strengen. Verschillende thermostabiele DNA-polymerases worden gebruikt in PCR, zoals Taq-polymerase. | | dNTPs (Deoxyribonucleoside triphosphaten) | De bouwstenen (A, T, C, G) die door DNA-polymerase worden gebruikt om nieuwe DNA-strengen te synthetiseren tijdens replicatie en PCR. | | Mastermix | Een geconcentreerde oplossing die alle benodigde reagentia voor PCR (buffer, dNTPs, enzym, primers) bevat, behalve het template-DNA, om de voorbereiding van meerdere monsters te vereenvoudigen en te standaardiseren. | | Negatieve controle | Een controle in PCR die geen template-DNA bevat om contaminatie van reagentia te detecteren. Een band in de negatieve controle duidt op contaminatie. | | Positieve controle | Een controle in PCR die een bekend DNA-fragment bevat dat gegarandeerd zal worden geamplificeerd. Dit bevestigt dat de PCR-condities correct zijn en de componenten functioneren. | | Interne controle | Een controle die in hetzelfde monster wordt geamplificeerd als het doel-DNA, maar met een andere primer set. Het dient om variaties in monsterbehandeling of PCR-efficiëntie te monitoren. | | Contaminatie | De ongewenste aanwezigheid van vreemd DNA of reagentia die de PCR-resultaten kunnen beïnvloeden. Strikt laboratoriumprotocol is nodig om dit te voorkomen. | | FIDELITY (Trouw) | De nauwkeurigheid van een DNA-polymerase, d.w.z. hoe goed het nucleotiden correct inbouwt zonder fouten te maken. Polymerases met hoge fidelity hebben 3’→5’ exonuclease activiteit (proofreading). |

# PCR technieken en toepassingen ## 1. Basisprincipes van PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek om specifiek een DNA fragment exponentieel te amplificeren. Dit geamplificeerde fragment wordt een amplicon genoemd. De amplificatie gebeurt door middel van 30-45 cycli. In elke cyclus ondergaat het DNA een reeks temperatuurveranderingen: denaturatie (95°C), annealing, en elongatie [4](#page=4) [5](#page=5). ### 1.1 Toepassingen van PCR PCR heeft zowel analytische als preparatieve toepassingen. Preparatief kan PCR gebruikt worden om amplicons aan te maken voor klonering of als probe in hybridisatie-experimenten [6](#page=6). ### 1.2 Afgeleide PCR-technieken Er bestaan diverse afgeleide PCR-technieken die de specificiteit, efficiëntie, of toepassingsmogelijkheden van de standaard PCR uitbreiden. Enkele belangrijke zijn: direct PCR, hot start PCR, touch-down PCR, nested PCR, RT-PCR, en multiplex PCR [7](#page=7). #### 1.2.1 Direct PCR Direct PCR maakt gebruik van het DNA direct uit 'levend' materiaal, wat tijd en kosten bespaart doordat er geen DNA-isolatie nodig is. Een potentieel nadeel is de aanwezigheid van PCR-inhibitoren in het monstermateriaal, wat opgevangen kan worden met speciale PCR mastermixen. Voorbeelden van direct PCR zijn Colony PCR en Single Cell PCR [8](#page=8). ##### 1.2.1.1 Colony PCR Colony PCR wordt toegepast bij de controle van genetische manipulaties bij bacteriën en bij microbiologisch onderzoek, zoals het screenen op antibioticumresistentie [9](#page=9). ##### 1.2.1.2 Single Cell PCR Single Cell PCR wordt gebruikt in technieken als in vitro fertilisatie en bij single cell genotypering [10](#page=10). #### 1.2.2 Technieken om PCR-specificiteit te verhogen De specificiteit van PCR kan verhoogd worden door middel van nested PCR, hot start PCR, en touch-down PCR [11](#page=11). ##### 1.2.2.1 Nested PCR Nested PCR is een tweestapsmethode die de specificiteit van de PCR aanzienlijk verhoogt. Hierbij wordt eerst een amplificatie uitgevoerd met een eerste set primers (Primerset 1), gevolgd door een tweede amplificatie van het product van de eerste reactie met een tweede, intern gelegen set primers (Primerset 2) . Dit is essentieel wanneer een geconserveerde sequentie geamplificeerd moet worden uit verschillende individuen, organismen, of genen binnen een genfamilie [13](#page=13) [14](#page=14). ##### 1.2.2.2 Hot start PCR Bij hot start PCR wordt het DNA polymerase pas geactiveerd na een initiële hittebehandeling (meestal 95°C) . Dit voorkomt de vorming van aspecifieke fragmenten door inhibitie van de reactie bij lagere temperaturen. Deze inhibitie kan bereikt worden door bijvoorbeeld het gebruik van antilichamen tegen het polymerase, covalente modificaties van het polymerase, of eiwitten die binden aan de primers [16](#page=16). ##### 1.2.2.3 Touch down PCR Touch down PCR varieert de annealingtemperatuur gedurende de PCR-cycli. De annealingtemperatuur begint hoog (gelijk aan de Tm van de primer) en wordt geleidelijk verlaagd over de cycli heen. Dit vermijdt aspecifieke binding van primers en de vorming van ongewenste producten [18](#page=18). #### 1.2.3 RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) RT-PCR is een techniek die de omzetting van RNA naar cDNA combineert met PCR-amplificatie van dit cDNA. Het wordt voornamelijk gebruikt voor de studie van genexpressie, waarbij de aan- of afwezigheid en de hoeveelheid van een bepaald mRNA-molecuul wordt bepaald [23](#page=23) [24](#page=24). ##### 1.2.3.1 Concept Genexpressie Genexpressie omvat het proces van promotoractiviteit, transcriptie van DNA naar prematuur mRNA, maturatie van mRNA, stabiliteit van mRNA (halfwaardetijd, miRNA/siRNA targeting), translatie naar eiwit, opvouwing, en post-translationele modificaties [22](#page=22). ##### 1.2.3.2 RT-stap: RNA naar cDNA De eerste stap in RT-PCR is de reverse transcriptie, waarbij RNA (vaak mRNA) wordt omgezet in cDNA met behulp van het enzym reverse transcriptase. cDNA is stabieler dan RNA en kan daarom beter bewaard en verder verwerkt worden [25](#page=25) [29](#page=29). * **Template:** Zuiver totaal RNA of mRNA [30](#page=30). * **dNTPs:** dATP, dCTP, dGTP, dTTP [30](#page=30). * **Buffer:** Bevat onder andere Mg$^{2+}$ ] [30](#page=30). * **Primers:** Verschillende typen primers kunnen gebruikt worden: * Oligo (dT)$_N$: Bindt aan de poly-A-staart van mRNA [32](#page=32). * Anker Oligo (dT)$_N$: Vergelijkbaar met Oligo (dT)$_N$, bindt ook aan de poly-A-staart [32](#page=32). * Random primers (hexamers): Kunnen aan elk RNA binden [32](#page=32). * Sequentie-specifieke primers: Worden gebruikt in diagnostiek [32](#page=32). * **Enzyme:** Reverse transcriptase. Twee veelgebruikte enzymen zijn: * MMLV reverse transcriptase (Moloney Murine Leukemia Virus): Optimaal bij 37°C [31](#page=31). * AMV reverse transcriptase (Avian Myeloblastosis Virus): Optimaal bij 42°C [31](#page=31). Reverse transcriptase heeft RNA- en DNA-polymerase activiteit [31](#page=31). ##### 1.2.3.3 PCR-stap: cDNA amplificatie Het gevormde cDNA wordt vervolgens geamplificeerd met behulp van standaard PCR-technieken [25](#page=25). ##### 1.2.3.4 Methoden en Toepassingen * **One-step methode (2-primer methode):** Reverse transcriptie en PCR vinden plaats in één buisje . Geschikt voor het bepalen van virale titers van virussen met een RNA-genoom (bv. COVID RT-qPCR) ] [35](#page=35) [36](#page=36). * **Two-step methode (3-primer methode):** Reverse transcriptie en PCR zijn gescheiden stappen . Geschikt voor genexpressie-analyse. Hoewel de 2-primer methode kan worden toegepast met 3 primers en de 3-primer methode met 2 primers, wordt dit beperkt gebruikt [35](#page=35) [38](#page=38). ##### 1.2.3.5 Controle en Specificiteit Bij een two-step procedure zijn controles noodzakelijk, waaronder blanco reacties voor zowel de RT-stap als de PCR-stap. Om amplificatie van genomisch DNA te vermijden, worden bij de PCR-stap vaak exon-exon spanning primers gebruikt . Deze primers overspannen een sequentie die zowel in twee opeenvolgende exons ligt. Dit vermijdt ook de amplificatie van prematuur mRNA [39](#page=39) [41](#page=41) [42](#page=42). * **Oefening Vraag:** Bij gebruik van oligo(dT)$_N$ primers bestaat de mogelijkheid dat er cDNA afgeleid wordt van prematuur mRNA, omdat deze primers aan de poly-A-staart binden en prematuur mRNA ook een poly-A-staart heeft. Bij random hexamers is deze mogelijkheid nog groter, aangezien deze aan alle RNA binden [44](#page=44). ##### 1.2.3.6 Normalisatie bij RT-PCR Wijzigingen in de sterkte van de PCR-banden kunnen worden veroorzaakt door veranderingen in genexpressie, maar ook door artefacten zoals pipetteerfouten of solventinhibitie . Om deze artefacten te onderscheiden van werkelijke veranderingen in genexpressie, is normalisatie met referentiegenen noodzakelijk. Referentiegenen zijn genen die constitutief tot expressie komen en niet beïnvloed worden door de experimentele behandeling. Voorbeelden hiervan zijn GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) en -actin [45](#page=45) [46](#page=46) [48](#page=48). #### 1.2.4 Multiplex PCR Multiplex PCR maakt het mogelijk om in één enkele PCR-reactie meerdere primersets te gebruiken, gericht tegen verschillende DNA-templates . Dit kan worden toegepast om diverse deleties of duplicaties in een groot gen te detecteren, meerdere pathogenen tegelijk op te sporen, of een specifieke detectie met een interne controle te combineren. Belangrijk is dat de annealingtemperaturen, Mg$^{2+}$ en dNTP-concentraties optimaal zijn voor alle primers, en dat de primersets geen primerdimeren vormen en de amplicons voldoende verschillen in grootte [50](#page=50) [51](#page=51). * **Toepassingen:** * Detectie van 2 of meer targets in één RT-PCR (genexpressie en normalisatie) ] [52](#page=52). * PCR voor merkers, zoals de aan- of afwezigheid van micro-organismen of kanker-merkers [52](#page=52). * Opsporen van ziektekiemen [54](#page=54). #### 1.2.5 AFLP-PCR (Amplification Fragment Length Polymorphism PCR) AFLP-PCR is een techniek voor genotypering, bijvoorbeeld van een bacteriestam. Het proces omvat [60](#page=60): 1. Digestie van genomisch DNA met restrictie-enzymen [61](#page=61). 2. Ligatie van adapters met een bekende sequentie [61](#page=61). 3. PCR met primers die complementair zijn aan de adapters, plus één of twee extra nucleotiden [61](#page=61). 4. Analyse van de resultaten via (capillaire) gelelektroforese . Een voordeel is dat de sequentie van het PCR-target niet gekend hoeft te zijn ] [61](#page=61) [66](#page=66). #### 1.2.6 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD is een techniek waarbij willekeurige, korte primers (8-12 nucleotiden lang) worden gebruikt om genomisch DNA te amplificeren . De sequentie van het target hoeft niet bekend te zijn . Omdat genomen die voldoende verschillen in sequentie een verschillend bandenpatroon opleveren, kan RAPD gebruikt worden voor genotypering, bijvoorbeeld van bacteriestammen of infectiehaarden, en voor moleculaire fylogenie. Het wordt ook ingezet om de epidemiologie van nosocomiale infecties op te sporen. Beperkingen zijn gerelateerd aan de willekeurigheid van de primerbinding en de fragmentlengte. AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) is een synoniem voor RAPD [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [73](#page=73). #### 1.2.7 VNTR-PCR (Variable Number of Tandem Repeats PCR) VNTR-PCR is een specifieke variant van multiplex PCR, gebruikt voor verwantschapsbepaling en forensische toepassingen. Het amplificeert VNTR-sequenties, die bestaan uit herhalingen van korte DNA-motieven (microsatellieten of STR's: <5 bp; minisatellieten of SSR: >5 bp) . Het aantal herhalingen verschilt sterk tussen individuen, waardoor een uniek DNA-profiel of fingerprint ontstaat . Wanneer multiplex PCR wordt toegepast op verschillende STR-loci, is de kans op een willekeurige match extreem klein (ongeveer $10^{-12}$ voor 15 loci gehanteerd door de FBI) . Interpretatie van resultaten omvat het berekenen van de frequentie van allelen en het omgaan met onvolledige of gemengde DNA-profielen ] [76](#page=76) [78](#page=78) [80](#page=80) [81](#page=81). #### 1.2.8 Methylation-Specific PCR (MSP) MSP is een PCR-reactie die afhankelijk is van DNA-methylatie. DNA-methylatie op CpG-eilanden is een epigenetische merker. MSP peilt naar de aanwezigheid van deze methylaties in een specifieke regio. Ongemethyleerde cytosines worden door bisulfietconversie omgezet in uracil, terwijl gemethyleerde 5-methylcytosines hier resistent tegen zijn [84](#page=84) [85](#page=85). ## 2. Overzicht van PCR-technieken Een uitgebreide lijst van PCR-technieken omvat onder andere: High-fidelity PCR, Direct PCR, Colony PCR, Single-cell PCR, Nested PCR, Hot start PCR, Touch down PCR, AFLP-PCR, RAPD, VNTR PCR, RFLP-PCR, AS-PCR, Real-time PCR (qPCR), Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR), Reverse transcriptase real time PCR (RT-qPCR), Droplet digital PCR, Multiplex PCR, Methylation-specific PCR (MSP), Long-range PCR, Solid phase PCR, In situ PCR, Fast-cycling PCR, Asymmetric PCR, Repetitive sequence-based PCR, Overlap extension PCR, Assemble PCR, Inter Sequence-specific PCR (ISSR), Ligation-mediated PCR, Miniprimer PCR, TAIL-PCR, Touch up PCR, NASBA, LAMP-PCR, 5’RACE, triplet primed- PCR (TP-PCR) ] [88](#page=88). --- # RT-PCR voor genexpressieanalyse en normalisatie Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) is een krachtige methode om de expressie van genen te bestuderen door de hoeveelheid messenger RNA (mRNA) te kwantificeren, waarbij normalisatie met referentiegenen cruciaal is voor betrouwbare resultaten [24](#page=24) [45](#page=45). ### 2.1 Concept genexpressie Genexpressie omvat een reeks stappen die leiden tot een functioneel eiwit, beginnend bij promotoractiviteit en transcriptie van DNA naar prematuur mRNA. Dit prematuur mRNA ondergaat maturatie tot matuur mRNA, waarbij intronen worden verwijderd. De stabiliteit van het mRNA, beïnvloed door factoren zoals microRNA's (miRNA's) en small interfering RNA's (siRNA's), is ook een kritische stap. Vervolgens wordt het matuur mRNA vertaald naar een eiwit, dat post-translationele modificaties kan ondergaan, waarna de eiwitstabiliteit en activiteit worden bepaald [22](#page=22) [40](#page=40). ### 2.2 RT-PCR principe RT-PCR staat voor Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction. Het proces bestaat uit twee hoofdfasen [23](#page=23) [25](#page=25): 1. **Reverse Transcriptie (RT):** RNA, doorgaans matuur mRNA, wordt omgezet in complementair DNA (cDNA) met behulp van het enzym reverse transcriptase. Dit is een cruciale stap omdat cDNA stabieler is dan RNA en beter geschikt voor opslag en verdere analyse [25](#page=25) [26](#page=26) [29](#page=29). 2. **Polymerase Chain Reaction (PCR):** Het gevormde cDNA dient als template voor de PCR, waarbij specifieke DNA-sequenties worden geamplificeerd tot detecteerbare hoeveelheden [25](#page=25). #### 2.2.1 Materialen voor de RT-stap De reverse transcriptie vereist de volgende componenten [30](#page=30): * **Template:** Zuiver totaal RNA of mRNA [30](#page=30). * **dNTPs:** Een mengsel van dATP, dCTP, dGTP en dTTP [30](#page=30). * **Buffer:** Een bufferoplossing die essentiële ionen, zoals $\text{Mg}^{2+}$, bevat [30](#page=30). * **Primer:** Een primer die de reverse transcriptase initieert [30](#page=30). * **Enzyme:** Reverse transcriptase [30](#page=30). * **dH2O:** Vrij van contaminanten [30](#page=30). #### 2.2.2 Enzymen voor reverse transcriptase Er zijn verschillende reverse transcriptase-enzymen beschikbaar, waaronder: * **MMLV reverse transcriptase (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase):** Optimaal bij $37^{\circ}\text{C}$ voor 1 uur [31](#page=31). * **AMV reverse transcriptase (Avian Myeloblastosis Virus):** Optimaal bij $42^{\circ}\text{C}$ voor 1 uur [31](#page=31). Reverse transcriptase bezit zowel RNA-polymerase- als DNA-polymerase-activiteit [31](#page=31). #### 2.2.3 Primers voor de RT-stap De keuze van de primer in de RT-stap is cruciaal en kan variëren [32](#page=32): * **Oligo (dT)N:** Bindt aan de poly-A-staart van matuur mRNA [32](#page=32). * **Anker Oligo (dT)N:** Bindt eveneens aan de poly-A-staart [32](#page=32). * **Random priming (hexamers):** Primers van zes nucleotiden die willekeurig op al het RNA kunnen binden [32](#page=32). * **Sequentie-specifieke primers:** Worden gebruikt voor diagnostische toepassingen [32](#page=32). #### 2.2.4 Methoden van RT-PCR RT-PCR kan worden uitgevoerd met verschillende methoden wat betreft het aantal primers en de stappen: * **2-primer methode (One-step methode):** Alle reactanten (RNA, reverse transcriptase, PCR-enzymen en primers) worden in één buisje gemengd. Deze methode is nuttig voor het bepalen van virale titers van virussen met een RNA-genoom, zoals bij COVID RT-qPCR [35](#page=35) [36](#page=36) [37](#page=37). * **3-primer methode (Two-step methode):** De reverse transcriptie en PCR worden in aparte stappen uitgevoerd. Eerst wordt cDNA gesynthetiseerd, waarna een deel van dit cDNA wordt gebruikt voor de PCR. Deze methode wordt voornamelijk toegepast voor genexpressieanalyse. Hoewel beide methoden kunnen worden gebruikt, kan de one-step methode een hogere kans op aspecifieke amplicons met zich meebrengen [35](#page=35) [38](#page=38). #### 2.2.5 Controle in de two-step procedure Bij de two-step procedure zijn controles essentieel om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen [39](#page=39): * **RT-stap controle:** Inclusief stalen en een blanco (zonder RNA) [39](#page=39). * **PCR-stap controle:** Inclusief stalen, de blanco van de RT-stap, en een blanco PCR (zonder cDNA) [39](#page=39). #### 2.2.6 Keuze van primers voor de PCR-stap Voor een specifieke RT-PCR van matuur mRNA zijn de primers voor de PCR-stap van belang [40](#page=40): * **Exon-exon spanning primers:** Deze primers worden ontworpen om over de grens van twee aangrenzende exons te springen. Dit heeft twee belangrijke voordelen [41](#page=41) [42](#page=42): * **Vermijden van amplificatie van genomisch DNA:** Genomisch DNA bevat intronen, terwijl matuur mRNA deze mist. Primers die een exon-exon overspanning vereisen, zullen geen genomisch DNA amplificeren. * **Vermijden van amplificatie van prematuur mRNA:** Prematuur mRNA bevat nog intronen, en primers ontworpen om over een exon-exon grens te springen, zullen dit niet efficiënt amplificeren. #### 2.2.7 Oefening met primerkeuze * Bij het werken met oligo(dT)N primers is er een mogelijkheid op de aanwezigheid van cDNA afgeleid van prematuur mRNA, aangezien de poly-A-staart ook in prematuur mRNA aanwezig kan zijn [44](#page=44). * Bij het werken met random hexamers is er eveneens een mogelijkheid op de aanwezigheid van cDNA afgeleid van prematuur mRNA, omdat deze primers op alle RNA-moleculen kunnen binden, inclusief prematuur mRNA [44](#page=44). ### 2.3 Noodzaak van normalisatie in RT-PCR De analyse van RT-PCR resultaten, vaak uitgevoerd via gelelektroforese, waarbij de sterkte van een band de hoeveelheid amplicon weergeeft, kan worden beïnvloed door factoren buiten de genexpressie zelf. Veranderingen in bandsterkte kunnen duiden op een werkelijke stijging of daling van mRNA door beïnvloeding van genexpressie, maar ook op artefacten veroorzaakt door menselijke fouten, zoals het morsen van een deel van het monster of inhibitie van de PCR door oplosmiddelen [45](#page=45) [46](#page=46). #### 2.3.1 Referentiegenen voor normalisatie Om deze artefacten te corrigeren en de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen, is normalisatie met behulp van referentiegenen noodzakelijk. Een referentiegen is een gen dat constitutief (standvastig) tot expressie komt en niet wordt beïnvloed door de experimentele behandeling. Deze genen coderen vaak voor structurele elementen of essentiële basale celmechanismen [46](#page=46). > **Tip:** Het correct identificeren en valideren van geschikte referentiegenen is cruciaal voor een betrouwbare genexpressieanalyse. #### 2.3.2 Voorbeelden van referentiegenen Veelgebruikte referentiegenen zijn onder andere [48](#page=48): * **Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH):** Een enzym dat een rol speelt in de glycolyse [48](#page=48). * **Beta-actine ($\beta$-actin):** Een cytoskeletproteïne betrokken bij celmotiliteit en celstructuur [48](#page=48). #### 2.3.3 Invloed van artefacten op referentiegenen Een pipetteerfout die leidt tot minder staal in de PCR-reactie zal de signaalsterkte van zowel het doelwitgen als het referentiegen beïnvloeden. Door de hoeveelheid van het doelwitgen te normaliseren ten opzichte van de hoeveelheid van het referentiegen, kunnen deze artefacten worden gecorrigeerd [49](#page=49). ### 2.4 Toepassingen van RT-PCR #### 2.4.1 Multiplex RT-PCR Multiplex RT-PCR maakt de analyse van meerdere genen tegelijkertijd mogelijk. Vroeger werd banddensitometrie gebruikt om genexpressie te berekenen met de formule: Genexpressie = BD Doelwit / (BD Ref1 * BD Ref2), waarbij BD staat voor banddensiteit. Tegenwoordig wordt kwantitatieve PCR (qPCR) veelvuldig toegepast voor een nauwkeurigere analyse [55](#page=55). #### 2.4.2 RNA-stabiliteitsbepaling RT-PCR kan ook worden gebruikt om de stabiliteit van RNA te bepalen. Dit omvat het meten van de transcriptie en degradatie van RNA, hetzij natuurlijk, hetzij geïnduceerd door factoren zoals miRNA's. Door enzymen die de aanmaak van mRNA regelen te stoppen, kan de afbraaksnelheid van mRNA worden gevolgd [56](#page=56). ##### 2.4.2.1 RNA-polymerase inhibitoren Verschillende inhibitoren kunnen worden gebruikt om de transcriptie te stoppen, zoals alpha-aminitine (traag), Actinomycin D (snel maar niet specifiek genoeg), CDK9 inhibitoren, en Triptolide (snelle en specifieke degradatie van RNA-Pol II) ] [57](#page=57). ##### 2.4.2.2 Experimenteel ontwerp voor RNA-stabiliteitsanalyse Een onderzoeker die de halfwaardetijd van een mRNA wil bepalen onder invloed van een drug X, kan het volgende experiment opzetten [58](#page=58): * Behandeling van cellen met drug X of een controlebehandeling. * Stoppen van de transcriptie met een transcriptie-inhibitor na een bepaalde tijd (bijvoorbeeld 1 uur), of geen inhibitor toevoegen (controle). * Afname van monsters op verschillende tijdstippen gedurende 48 uur (bv. 15 min, 30 min, 1 uur, 2 uur, 4 uur, 8 uur, 24 uur, 48 uur). * Analyse van de mRNA-hoeveelheden via RT-PCR. * Het wordt aangeraden om in dit soort experimenten een RT-qPCR te gebruiken voor een hogere gevoeligheid en kwantificatie [58](#page=58). --- # VNTR-PCR en forensische toepassingen Dit onderwerp behandelt de techniek van VNTR-PCR, inclusief de verschillende types herhaalsequenties zoals micro- en minisatellieten, en de essentiële rol ervan in forensisch onderzoek en verwantschapsbepaling door middel van DNA-profilering. ### 3.1 Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs), ook wel minisatellieten genoemd, zijn niet-coderende DNA-sequenties die bestaan uit herhalingen van een korte DNA-sequentie, typisch langer dan 5 basenparen en 10 tot 60 basenparen lang. Deze sequenties kunnen meer dan duizend keer verspreid over het genoom voorkomen. Naast VNTRs worden ook microsatellieten, ook wel Short Tandem Repeats (STRs) of Short Sequence Repeats (SSRs) genoemd, onderscheiden. Deze bestaan uit kortere herhalingen, minder dan 5 basenparen (vaak 1-4 basenparen) en worden 10 tot 100 keer herhaald [59](#page=59). #### 3.1.1 Toepassingen van VNTRs VNTRs zijn cruciaal voor toepassingen zoals vaderschapsonderzoek en forensisch onderzoek. Wanneer een multiplex PCR wordt uitgevoerd voor verschillende STR-loci, wordt de kans dat twee individuen hetzelfde bandenpatroon vertonen extreem klein, wat effectieve identificatie van individuen mogelijk maakt [59](#page=59) [76](#page=76). ### 3.2 VNTR-PCR VNTR-PCR is een specifieke variant van multiplex PCR gevolgd door capillaire elektroforese. Het principe berust op de amplificatie van VNTR-sequenties, wat resulteert in PCR-producten van verschillende lengtes. Dit maakt de techniek geschikt voor verwantschapsbepaling en forensische toepassingen [76](#page=76). #### 3.2.1 DNA-profielen en fingerprinting VNTR-loci, zoals gehanteerd door het FBI, vormen de basis voor een DNA-profiel of fingerprint. De gemiddelde kans op een willekeurige match voor dergelijke profielen is ongeveer $10^{-12}$ [78](#page=78). #### 3.2.2 Interpretatie van VNTR-PCR resultaten De interpretatie van VNTR-PCR resultaten omvat verschillende aspecten: * **Manier van noteren:** Loci worden genoteerd met een notatie zoals (A1/A2), bijvoorbeeld vWA (17/18) [79](#page=79). * **Analytische en stochastische drempelwaarden:** Deze waarden zijn belangrijk voor het correct interpreteren van de resultaten, met name bij zwakke signalen of stotterende patronen. De stochastische drempelwaarde is cruciaal voor het betrouwbaar interpreteren van lage hoeveelheden DNA [79](#page=79). * **Berekende frequentie (voorkomenskans):** Deze wordt berekend op basis van bekende populatiegenetica door de voorkomen van verschillende allelen te vermenigvuldigen [80](#page=80). * **Onvolledige enkelvoudige DNA profielen:** Deze kunnen ontstaan door slechte DNA-kwaliteit, wat leidt tot geen reactie op alle loci. De bewijskracht van dergelijke profielen hangt af van de zeldzaamheid van de gevonden allelen [80](#page=80). * **DNA mengprofielen:** Deze ontstaan wanneer DNA afkomstig is van meerdere individuen [80](#page=80). * **Piekhoogteratio (Major/minor ratio):** Dit is een belangrijke parameter bij de interpretatie van mengprofielen, waarbij de relatieve hoogtes van de pieken inzicht geven in de bijdrage van elk individu [81](#page=81). #### 3.2.3 Geavanceerde systemen Moderne systemen, zoals het AmpFISTR NGM DNA-data analyse systeem, gebruiken tot wel 15 loci voor analyse [81](#page=81). > **Tip:** Begrijpen van de analytische, stotter- en stochastische drempelwaarden is essentieel voor het nauwkeurig interpreteren van DNA-profielen, vooral bij lage DNA-hoeveelheden of complexe mengprofielen. ### 3.3 Forensische toepassingen en vaderschapsbepaling VNTR-PCR heeft significante toepassingen in forensisch onderzoek en vaderschapsbepaling [76](#page=76). #### 3.3.1 Voorbeelden van toepassingen * **Forensische toepassing:** VNTR-PCR kan worden gebruikt om sporenmateriaal (zoals bloed, speeksel, haar) te analyseren en te vergelijken met bekende profielen, wat kan leiden tot identificatie van verdachten of uitsluiting [82](#page=82). * **Vaderschapsbepaling:** Door het vergelijken van DNA-profielen van een kind met potentiële vaders, kan met hoge waarschijnlijkheid een biologische vader worden geïdentificeerd of uitgesloten [83](#page=83). > **Example:** Bij een misdaadscène wordt DNA-materiaal aangetroffen. Door middel van VNTR-PCR kan een uniek DNA-profiel worden gegenereerd. Dit profiel kan vervolgens worden vergeleken met DNA-profielen van verdachten, waardoor een koppeling kan worden gelegd of juist kan worden uitgesloten. Op dezelfde manier kan bij een vaderschapstest het DNA-profiel van een kind worden vergeleken met dat van de moeder en de vermeende vader om de biologische relatie te bevestigen [82](#page=82) [83](#page=83). --- # DNA-methylatie en Methylspecifieke PCR Dit onderwerp introduceert DNA-methylatie als een epigenetische merker en de detectie ervan middels methylspecifieke PCR [84](#page=84). ### 4.1 DNA-methylatie als epigenetische merker DNA-methylatie, specifiek op CpG-eilanden, functioneert als een belangrijke epigenetische merker. Deze merkers hebben de eigenschap om overerfbaar te zijn [84](#page=84). ### 4.2 Methylspecifieke pcr (msp) Methylspecifieke PCR (MSP) is een PCR-reactie die specifiek afhangt van de aanwezigheid van DNA-methylatie. Het primaire doel van MSP is om de locatie van deze methylaties binnen een specifieke DNA-regio te achterhalen, waarbij de omringende sequentie reeds bekend is [84](#page=84). #### 4.2.1 Principe van bisulfietconversie in msp Het succes van MSP is gebaseerd op de chemische behandeling van DNA met natriumbisulfiet [85](#page=85). * **Ongemethyleerde cytosines:** Deze worden tijdens de bisulfietconversie omgezet in uracils [85](#page=85). * **Gemethyleerde cytosines (5-methylcytosines):** Deze zijn resistent tegen de bisulfietconversie en blijven intact als cytosines [85](#page=85). Deze selectieve conversie creëert sequentieverschillen tussen gemethyleerd en ongemethyleerd DNA, die vervolgens kunnen worden gedetecteerd door PCR. #### 4.2.2 Toepassing van msp Door gebruik te maken van primers die specifiek ontworpen zijn om te binden aan de sequentie na bisulfietbehandeling, kan worden bepaald of een bepaald DNA-fragment gemethyleerd is. Er worden doorgaans twee sets primers gebruikt: een set die specifiek is voor de gemethyleerde sequentie en een set die specifiek is voor de ongemethyleerde sequentie [86](#page=86). > **Tip:** De gevoeligheid van MSP kan geoptimaliseerd worden door de juiste primerontwerpstrategieën toe te passen, rekening houdend met de specifieke sequentie na bisulfietconversie. > **Voorbeeld:** Een bedrijf wil de methylatiestatus van een tumor-suppressorgen in tumorweefsel onderzoeken. Met behulp van MSP kan bepaald worden of de promotorregio van dit gen hypergemethyleerd is, wat kan leiden tot genstilte. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Amplicon | Het fragment DNA dat cyclisch en exponentieel wordt geproduceerd tijdens een Polymerase Chain Reaction (PCR). | | PCR | Polymerase Chain Reaction, een moleculair-biologische techniek om specifieke DNA-fragmenten exponentieel te vermenigvuldigen. | | Direct PCR | Een PCR-techniek die direct op "levend" biologisch materiaal wordt uitgevoerd, zonder voorafgaande DNA-isolatie, wat tijd en kosten bespaart. | | Colony PCR | Een type direct PCR dat wordt toegepast bij de controle van genetische manipulatie van bacteriën of voor microbiologische screening, zoals op antibioticumresistentie. | | Single Cell PCR | Een direct PCR-techniek die gebruikt wordt in technieken zoals in vitro fertilisatie en voor single-cell genotypering, waarbij PCR op een individuele cel wordt uitgevoerd. | | Nested PCR | Een PCR-techniek die bestaat uit twee opeenvolgende PCR-stappen met verschillende sets primers om de specificiteit van de amplificatie te verhogen. | | Hot Start PCR | Een PCR-methode waarbij het DNA-polymerase-enzym pas geactiveerd wordt na een hittebehandeling, wat de vorming van aspecifieke fragmenten bij lagere temperaturen voorkomt. | | Touch Down PCR | Een PCR-techniek waarbij de annealingtemperatuur door de cycli heen geleidelijk wordt verlaagd, beginnend bij een hoge temperatuur, om de specificiteit van primerbinding te verhogen. | | RT-PCR | Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, een techniek die begint met RNA en dit omzet in cDNA met reverse transcriptase, gevolgd door PCR om het cDNA te amplificeren. | | Genexpressie | Het proces waarbij de informatie in een gen wordt gebruikt om een functioneel product, meestal een eiwit, te synthetiseren. | | mRNA | Messenger RNA, een molecuul dat de genetische code van DNA naar het ribosoom transporteert voor eiwitsynthese. | | cDNA | Complementair DNA, een DNA-molecuul dat gesynthetiseerd wordt op basis van een RNA-mal met behulp van reverse transcriptase. | | Transcriptomics | Het vakgebied dat zich bezighoudt met de studie van transcriptomen, de volledige sets van RNA-moleculen die door een cel of populatie van cellen worden geproduceerd onder specifieke omstandigheden. | | Normalisatie (in RT-PCR) | Een procedure in RT-PCR waarbij de gemeten genexpressieniveaus worden gecorrigeerd met behulp van de expressieniveaus van één of meerdere referentiegenen om artefacten te minimaliseren. | | Referentiegen | Een gen dat constitutief tot expressie komt en waarvan de expressie niet wordt beïnvloed door de experimentele condities, gebruikt voor normalisatiedoeleinden in genexpressie-analyses. | | Multiplex PCR | Een PCR-reactie die meerdere sets primers bevat in één reactiebuisje, waardoor meerdere DNA-templates tegelijkertijd kunnen worden geamplificeerd. | | AFLP-PCR | Amplification Fragment Length Polymorphism-PCR, een techniek voor genotypering die genetische variatie detecteert door fragmentlengteverschillen na restrictie-digest en PCR. | | RAPD | Random Amplified Polymorphic DNA, een PCR-gebaseerde techniek die willekeurige primers gebruikt om polymorfismen in het DNA te detecteren, vaak gebruikt voor genotypering van bacteriën. | | VNTR-PCR | Variable Number of Tandem Repeats PCR, een methode die gebruikmaakt van repetitieve DNA-sequenties waarvan het aantal herhalingen varieert tussen individuen, veelal toegepast in forensisch onderzoek en vaderschapsbepaling. | | Microsatelliet (STR) | Een korte tandem repeat (STR) is een sequentie van DNA, bestaande uit 1 tot 6 basenparen, die meer dan eens herhaald wordt. | | Minisatelliet (SSR) | Een minisatelliet (SSR) is een sequentie van DNA, bestaande uit meer dan 6 basenparen, die meer dan eens herhaald wordt. | | DNA-methylatie | Een epigenetische modificatie waarbij een methylgroep wordt toegevoegd aan een DNA-molecuul, wat de genexpressie kan beïnvloeden zonder de DNA-sequentie te veranderen. | | Methylspecifieke PCR (MSP) | Een PCR-techniek die afhangt van DNA-methylatie en wordt gebruikt om de aanwezigheid of afwezigheid van methylaties op specifieke locaties in het genoom te detecteren. | | Epigenetische merker | Een chemische modificatie aan DNA of bijbehorende eiwitten die de genexpressie beïnvloedt, maar niet de onderliggende DNA-sequentie verandert. | | Elektroforese | Een techniek die wordt gebruikt om biomoleculen, zoals DNA, RNA en eiwitten, te scheiden op basis van hun grootte en lading door een elektrisch veld toe te passen. | | Capillaire gelelektroforese | Een methode van elektroforese die gebruikmaakt van dunne capillairen gevuld met een scheidingsmedium om biomoleculen te scheiden, wat leidt tot elektroferogrammen. | | Elektroferogram | Een grafische weergave van de resultaten van elektroforese, waarbij de gescheiden componenten worden gedetecteerd en weergegeven als pieken. |

# Het principe en verloop van kwantitatieve PCR (qPCR) Kwantitatieve PCR (qPCR) maakt continue detectie van DNA-amplificatie over tijd mogelijk, wat essentieel is voor kwantificering, in tegenstelling tot klassieke PCR [9](#page=9). ### 1.1 Principe van qPCR Klassieke PCR is niet geschikt voor het kwantificeren van doelwit-DNA in een monster, omdat de amplificatie pas achteraf wordt gevisualiseerd, bijvoorbeeld door gelelektroforese. qPCR, ook wel real-time PCR genoemd, stelt echter in staat de PCR-reactie continu te volgen en de DNA-toename cyclus per cyclus waar te nemen. Dit wordt bereikt door het gebruik van een fluorescente detectormolecule die bindt aan het PCR-product, waardoor de fluorescentie tijdens de reactie gemeten kan worden [7](#page=7) [9](#page=9). #### 1.1.1 Verschil met klassieke PCR Het kernverschil ligt in de detectiemethode: klassieke PCR is een "end-point" analyse, terwijl qPCR een "real-time" analyse is. Kleine variaties in PCR-efficiëntie kunnen bij klassieke PCR leiden tot grote verschillen in het eindproduct, wat kwantificering onbetrouwbaar maakt. qPCR daarentegen meet de fluorescentie tijdens de amplificatie, wat veel gevoeliger is voor variaties [14](#page=14) [15](#page=15) [9](#page=9). #### 1.1.2 Vereisten voor het amplicon De algemene regels voor PCR-producten (amplicons) blijven gelden voor qPCR [10](#page=10): * Het amplicon dient maximaal 100 bp te zijn [10](#page=10). * Secundaire structuren in het amplicon moeten laag gehouden worden [10](#page=10). * Vermijd 3'-self-complementariteit [10](#page=10). * Het aantal cycli moet zorgvuldig gekozen worden om competitie tussen primers en amplicon voor binding aan de template te minimaliseren en 5'-3' exonuclease afbraak van het amplicon te voorkomen [10](#page=10). ### 1.2 Verloop van qPCR Een typisch qPCR-experiment wordt in de praktijk minimaal in duplo, maar meestal in triplo uitgevoerd, met de mogelijkheid tot schaalvergroting van het experiment [11](#page=11). #### 1.2.1 Thermische cycli en detectie De thermische cycli omvatten doorgaans de volgende stappen: * **Initiële denaturatie:** Vaak 95°C gedurende 2 tot 5 minuten [12](#page=12) [13](#page=13). * **Denaturatie:** 95°C gedurende 15 tot 30 seconden [12](#page=12) [13](#page=13). * **Annealing:** 60°C gedurende 30 seconden of 45 seconden [12](#page=12) [13](#page=13). * **Elongatie:** 72°C gedurende 30 seconden, waarbij detectie plaatsvindt. De eindelongatie is niet van tel voor de kwantificering in qPCR [12](#page=12) [13](#page=13). Na de amplificatiecycli volgt een smeltpuntbepaling, waarbij de detectie plaatsvindt bij stijgingen van 0.5°C of minder. Het aantal cycli is doorgaans rond de 40 [11](#page=11) [12](#page=12) [13](#page=13). ### 1.3 Visualisatie en analyse van qPCR data De resultaten van qPCR worden weergegeven in een amplificatieplot, die de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit uitzet tegen het cyclusnummer [16](#page=16) [8](#page=8). #### 1.3.1 Normalisering van het fluorescent signaal Het fluorescente signaal (Rn) wordt genormaliseerd ten opzichte van een passieve interne referentie, zoals ROX (ROX = een fluorochroom dat niet deelneemt aan de amplificatie). Deze normalisatie corrigeert voor variatie tussen de verschillende wells van het experiment, zoals pipetteerfouten en variaties in fluorescentiedetectie van het apparaat. ROX is vaak aanwezig in qPCR ready mixes of buffers [18](#page=18). #### 1.3.2 Fasen van de amplificatieplot Een amplificatieplot kan worden onderverdeeld in vier fasen [19](#page=19) [20](#page=20) [21](#page=21) [22](#page=22): 1. **Basislijn of ruis:** De fase waarin het fluorescent signaal significant lager is dan de detectielimiet [22](#page=22). 2. **Vroege exponentiële fase:** Hier begint de verdaderoedubbeling van het PCR-product per cyclus (in theorie). Dit is de meest betrouwbare fase voor kwantificering en waar de drempel (threshold) wordt ingesteld [22](#page=22) [23](#page=23). 3. **Late exponentiële fase (Log-lineair):** De amplificatie vertraagt doordat de bouwstenen schaarser worden [22](#page=22). 4. **Plateaufase:** De reactie stopt en er wordt geen nieuw PCR-product meer gevormd [22](#page=22). #### 1.3.3 Bepaling van de Cq-waarde De **Ct-waarde** of **Cq-waarde** (threshold cycle) is het cyclusnummer waarbij de fluorescentie de ingestelde drempel overschrijdt. De drempellijn wordt geplaatst in een stabiele zone van de vroege exponentiële fase. De Cq-waarde wordt automatisch berekend, maar kan ook handmatig bepaald worden door een rechte lijn parallel aan de X-as te tekenen op de best passende plaats [23](#page=23). > **Tip:** Het correct plaatsen van de drempellijn is cruciaal voor accurate kwantificering. Zorg dat deze in de exponentiële fase ligt [23](#page=23). ### 1.4 Relatie tussen templatehoeveelheid en Cq-waarde Er bestaat een omgekeerd evenredig verband tussen de Cq-waarde en de logaritme van het aantal doelwit-DNA (of RNA) moleculen aan het begin van de reactie [27](#page=27). * Een hogere hoeveelheid template aan het begin van de reactie leidt tot een snellere overschrijding van de detectiedrempel [25](#page=25). * Dit resulteert in een vroegere start van de exponentiële fase en dus een lagere Cq-waarde [25](#page=25). * Een hogere hoeveelheid template leidt ook tot het sneller bereiken van de plateaufase [25](#page=25). > **Tip:** Cq-waarden boven 35-38 worden als onbetrouwbaar beschouwd. Een minimaal verschil in Cq-waarden kan duiden op een significant verschil in templatehoeveelheid [25](#page=25). #### 1.4.1 Interpretatie van Cq-waarden * Als de exponentiële fase in slechts één staal niet wordt bereikt, kan dit duiden op een probleem met dat specifieke staal [28](#page=28). * Als de exponentiële fase in alle stalen niet wordt bereikt, kan dit wijzen op een probleem met de PCR-reactie zelf, zoals de primers, de mastermix, of de thermocycler [28](#page=28). > **Example:** Een staal met een Cq-waarde van 22 bevat bij de start van de qPCR meer DNA-moleculen dan een staal met een Cq-waarde van 26. De amplificatiecurve voor staal A zal steiler en vroeger de drempel overschrijden dan die van staal B [26](#page=26) [29](#page=29). --- # Berekeningsmethoden voor qPCR resultaten Dit deel behandelt de verschillende methoden voor de kwantificering van qPCR-resultaten, inclusief de Delta-delta-Cq methode en de standaardcurve methode, evenals de berekening van PCR-efficiëntie. ### 2.1 Principes van qPCR resultaatberekening De berekening van qPCR-resultaten is afhankelijk van de toepassing. Resultaten kunnen op verschillende manieren worden weergegeven [30](#page=30): * **Cq waarde:** Een eenvoudig 'ja/nee' indicatie van de aanwezigheid van de target [30](#page=30). * **Cq waarde voor 'fold change'**: Dit wordt gebruikt voor relatieve kwantificering, waarbij de verandering ten opzichte van een referentie wordt uitgedrukt [30](#page=30). * **Cq waarde voor absolute waarde**: Dit wordt gebruikt voor absolute kwantificering, waarbij een specifieke hoeveelheid template DNA (bijvoorbeeld 5 picogram) aan het begin van het experiment wordt bepaald [30](#page=30). De methoden voor berekening omvatten de Delta-delta-Cq methode voor relatieve kwantificering en de standaardcurve methode die zowel voor absolute als relatieve kwantificering kan worden ingezet. Gespecialiseerde software wordt vaak gebruikt voor deze analyses [31](#page=31). ### 2.2 De delta-delta-Cq methode De Delta-delta-Cq methode, ook wel de vergelijkende Ct methode genoemd, is een methode voor relatieve kwantificering. Deze methode wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheid DNA template aan het begin van een experiment te bepalen, in vergelijking met een controlestaal, om zo de 'fold change' te berekenen [33](#page=33). De berekening verloopt in twee stappen: 1. **Berekening van de Delta Cq (ΔCq)**: De ΔCq waarde voor een staal wordt berekend door de Cq waarde van de referentie af te trekken van de Cq waarde van het staal van interesse. $$ \Delta Cq_{\text{staal}} = Cq_{\text{staal}} - Cq_{\text{referentie}} $$ [34](#page=34). 2. **Berekening van de Delta Delta Cq (ΔΔCq)**: De ΔΔCq waarde wordt berekend door de ΔCq waarde van de referentie af te trekken van de ΔCq waarde van het staal. $$ \Delta\Delta Cq = \Delta Cq_{\text{staal}} - \Delta Cq_{\text{referentie}} $$ [34](#page=34) [38](#page=38). 3. **Berekening van de Fold Change**: De fold change, die aangeeft hoeveel maal de hoeveelheid target is veranderd, wordt berekend met de volgende formule: $$ \text{Fold change} = 2^{-\Delta\Delta Cq} $$ [34](#page=34) [38](#page=38). > **Tip:** De delta-delta-Cq methode gaat uit van een PCR-efficiëntie van 100% [42](#page=42). #### 2.2.1 Toepassing van de delta-delta-Cq methode **Voorbeeld 1: Oppvolging besmetting met Groep A-streptokokken** [35](#page=35). * Staal A (controle/referentie): Cq = 32 * Staal B (onbehandeld): Cq = 25 * ΔCq (staal B) = $Cq_{\text{staal B}} - Cq_{\text{staal A}} = 25 - 32 = -7$ [35](#page=35). * Fold change = $2^{-\Delta Cq_{\text{staal B}}} = 2^{-(-7)} = 2^7 = 128$ [35](#page=35). * **Conclusie:** Er is 128 keer meer Streptokokken aanwezig in staal B ten opzichte van staal A [35](#page=35). **Voorbeeld 2: Start behandeling met medicijn (testfase) voor Groep A-streptokokken** [36](#page=36). * Staal C (controle/referentie): Cq = 25 * Staal D (behandeld na 2 weken): Cq = 34,5 * ΔCq (staal D) = $Cq_{\text{staal D}} - Cq_{\text{staal C}} = 34,5 - 25 = 9,5$ [36](#page=36). * Fold change = $2^{-\Delta Cq_{\text{staal D}}} = 2^{-9,5} \approx 0,00138$ [36](#page=36). * **Conclusie:** Er is 0,00138 keer meer Streptokokken aanwezig in staal D ten opzichte van staal C, wat betekent dat er 724 keer minder Streptokokken aanwezig zijn in staal D vergeleken met staal C ($1 / 0,00138 \approx 724$) [36](#page=36). #### 2.2.2 Delta-delta-Cq methode bij RT-qPCR of met interne controle Bij RT-qPCR of bij het gebruik van een interne controle, wordt de expressie van een gen van interesse vergeleken met de expressie van een huishoudgen (een stabiel en constitutief tot expressie komend gen). De interne controle kan endogeen zijn of 'gespike' worden [37](#page=37) [38](#page=38). De formule voor de fold change blijft hetzelfde: $$ \text{Fold change} = 2^{-\Delta\Delta Cq} $$ [38](#page=38). Waar: $$ \Delta Cq_{\text{staal}} = Cq_{\text{gen van interesse}} - Cq_{\text{huishoudgen}} $$ [40](#page=40). $$ \Delta\Delta Cq = \Delta Cq_{\text{staal}} - \Delta Cq_{\text{referentie}} $$ [40](#page=40). **Voorbeeld: Analyse van IL-6 genexpressie na behandeling (farmaceutische studie)** [39](#page=39) [40](#page=40). * **Condities:** * Solvent (referentie): Cq (IL-6) = 25, Cq (beta-actine) = 18 * Pomalidomide: Cq (IL-6) = 29, Cq (beta-actine) = 17 * Lenalidomide: Cq (IL-6) = 28, Cq (beta-actine) = 17,5 * **Berekening voor Pomalidomide:** * ΔCq (IL-6, Pomalidomide) = $29 - 17 = 12$ * ΔCq (IL-6, Solvent) = $25 - 18 = 7$ * ΔΔCq (Pomalidomide) = $12 - 7 = 5$ [40](#page=40). * Fold change (Pomalidomide) = $2^{-5} = 0,031$ [40](#page=40). * **Berekening voor Lenalidomide:** * ΔCq (IL-6, Lenalidomide) = $28 - 17,5 = 10,5$ * ΔCq (IL-6, Solvent) = $25 - 18 = 7$ * ΔΔCq (Lenalidomide) = $10,5 - 7 = 3,5$ [40](#page=40). * Fold change (Lenalidomide) = $2^{-3,5} \approx 0,088$ [40](#page=40). * **Conclusie:** Behandeling met Pomalidomide leidt tot een daling van de IL-6 genexpressie met een factor 1/0,031 ≈ 32 ten opzichte van het referentiegen beta-actine. Behandeling met Lenalidomide leidt tot een daling met een factor 1/0,088 ≈ 11,4. Dit suggereert dat Pomalidomide effectiever is in het onderdrukken van IL-6 expressie [40](#page=40). #### 2.2.3 Beperkingen van de delta-delta-Cq methode * De methode is complexer bij het gebruik van meerdere referentiegenen. Tegenwoordig worden er normaal gesproken 3 referentiegenen gebruikt bij RT-qPCR [42](#page=42). * De methode gaat uit van 100% PCR-efficiëntie, wat in de praktijk niet altijd het geval is. Variaties in PCR-efficiëntie kunnen leiden tot onnauwkeurigheden [42](#page=42) [45](#page=45). * Grote artefacten in de huishoudgenen kunnen grote gevolgen hebben voor de resultaten [42](#page=42). > **Tip:** Het perfecte huishoudgen bestaat niet. Een oplossing hiervoor is het middelen over meerdere huishoudgenen, wat een andere berekeningsmethode vereist [43](#page=43). ### 2.3 De standaardcurve methode De standaardcurve methode maakt absolute kwantificering mogelijk, wat betekent dat de exacte hoeveelheid DNA template aan het begin van het experiment kan worden bepaald. Dit is mogelijk mits de hoeveelheid van het target DNA in de standaard bekend is. De methode kan ook gebruikt worden voor relatieve kwantificering [47](#page=47). #### 2.3.1 Benodigdheden voor de standaardcurve methode * **Template met gekende concentratie:** Dit vormt de basis voor de standaardcurve [48](#page=48). * **Verdunningsreeks:** Een serie van bekende concentraties, bijvoorbeeld seriële verdunningen van 1/5 of 1/10, wordt aangemaakt [48](#page=48). * **Standaardcurve:** * De Y-as van de curve vertegenwoordigt de Cq-waarden [48](#page=48) [51](#page=51). * De X-as van de curve vertegenwoordigt de logaritme van de concentratie van de template. Dit kan een absolute eenheid zijn (zoals kopie-aantal, nanogram) of een relatief getal (bijvoorbeeld de plaats in de verdunningsreeks) [48](#page=48) [51](#page=51). * De standaardcurve wordt vaak beschreven door een lineaire vergelijking: $$ Y = ax + b $$ [50](#page=50). Hierbij is $Y$ de Cq waarde, $x$ de logaritme van de concentratie, $a$ de helling (slope) en $b$ het y-intercept [50](#page=50). #### 2.3.2 Bepalen van de PCR efficiëntie met de standaardcurve De PCR-efficiëntie ($E$) is cruciaal voor nauwkeurige kwantificering. Idealiter is deze 100%, maar acceptabele waarden liggen tussen 90% en 110% [52](#page=52). De PCR-efficiëntie kan worden berekend uit de helling ($m$) van de standaardcurve [53](#page=53): $$ E = (10^{-1/m} - 1) \times 100\% $$ [55](#page=55). * Bij een efficiëntie van 100% is de helling $m = -1 / \log_2 \approx -3,32$ [53](#page=53). * Grotere negatieve waarden voor de helling duiden op een minder efficiënte reactie [53](#page=53). > **Tip:** De PCR-efficiëntie moet altijd gecontroleerd worden om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen [57](#page=57). #### 2.3.3 Proces van qPCR berekening obv standaardcurve 1. **Standaardcurve maken:** Teken een grafiek met de Cq-waarden (Y-as) tegen de logaritme van de concentraties (X-as) van de verdunningsreeks [48](#page=48) [56](#page=56). 2. **PCR efficiëntie berekenen:** Bepaal de helling van de standaardcurve en bereken de PCR-efficiëntie met de formule. Beoordeel of deze binnen de acceptabele marge van 90-110% valt [52](#page=52) [53](#page=53) [55](#page=55) [56](#page=56). 3. **Staalanalyse:** Gebruik de standaardvergelijking ($Y = ax + b$) om de Cq-waarden van de onbekende stalen om te zetten in een relatief getal of absolute hoeveelheid [56](#page=56). 4. **Relatieve kwantificering (met standaardcurve):** * Bereken de gemiddelde Cq-waarden voor het gen van interesse en voor het referentiegen per staal [58](#page=58). * Deel het gemiddelde van het gen van interesse door het gemiddelde van het referentiegen [58](#page=58). * Vergelijk de waarden van de behandelde stalen met de solventcontrole [58](#page=58). 5. **Besluitvorming:** Interpreteer de resultaten en vorm een conclusie [57](#page=57) [58](#page=58). #### 2.3.4 Omgaan met meerdere referentiegenen bij standaardcurve methode Wanneer meerdere referentiegenen worden gebruikt, wordt de gemiddelde waarde van deze referentiegenen gebruikt om mee te delen. Het is echter essentieel dat de referentiegenen een verband hebben met elkaar en vergelijkbaar gedrag vertonen [59](#page=59). > **Tip:** Analyseer de amplificatiecurve, smeltcurve (indien mogelijk) en de PCR-efficiëntie kritisch voordat u de staalanalyse uitvoert. Grote artefacten in huishoudgenen kunnen grote gevolgen hebben [42](#page=42) [57](#page=57). ### 2.4 Overige overwegingen * **PCR inhibitoren:** PCR-inhibitoren kunnen de PCR-efficiëntie negatief beïnvloeden. Het analyseren van de amplificatiecurve kan hier inzicht in geven [45](#page=45) [57](#page=57). * **NTC (No Template Control):** Controleer op contaminatie door het analyseren van NTCs in de amplificatiecurve [57](#page=57). * **Software:** Gespecialiseerde software zoals qBASE, LightCycler 480, of andere platforms (bv. FBT-Qiaquant, MLT-Cobas, Lightcycler) kan gebruikt worden voor de analyse [31](#page=31) [56](#page=56). --- # DNA-detectiemoleculen en melt curve analyse Dit onderwerp behandelt de verschillende soorten DNA-detectiemoleculen die gebruikt worden in qPCR, waaronder SYBR Green en probes, en de techniek van smeltcurve analyse. Real-time PCR is enkel mogelijk door het gebruik van een detectiemolecule die fluoresceert nadat deze aan het amplicon gebonden heeft. De hoeveelheid fluorescentie die in elke cyclus gemeten wordt, is proportioneel aan de hoeveelheid PCR-product die gevormd werd [60](#page=60) [61](#page=61). ### 3.1 Soorten DNA-detectiemoleculen Er zijn grofweg twee hoofdtypes DNA-detectiemoleculen: fluorescente kleurstoffen voor DNA en probes [61](#page=61). #### 3.1.1 SYBR Green en andere fluorescente kleurstoffen voor DNA SYBR Green intercaleert tussen de basenparen van dubbelstrengs DNA (dsDNA) en fluoresceert groen (emissiemax 520 nm) bij bestraling met blauw licht (excitatiemax 497 nm). Hoe meer PCR-product er is, hoe meer SYBR Green kan binden, en hoe sterker de fluorescentie [62](#page=62). **Voordelen:** * Eenvoudig in gebruik [63](#page=63). **Nadelen:** * Kan aan al het DNA binden, wat het minder ideaal maakt voor toepassingen die primair gericht zijn op kwantificering [63](#page=63). Een voorbeeld van een kit gebaseerd op SYBR Green is de PRIMEPCR SYBR® GREEN ASSAY: APOBEC3D, HUMAN kit van Bio-rad [63](#page=63). SYBR Green is heel geschikt voor melt(ing) curve analyse. Wanneer een PCR goed ontworpen is, kan een single nucleotide polymorphism (SNP) al leiden tot een afwijkende smelttemperatuur ($T_m$) waarde van het PCR-product. Door na qPCR de smeltcurve van de bekomen reactieproducten te bepalen en via de software de $T_m$ hieruit af te leiden, kan men onderscheid maken tussen allelen die in sequentie verschillen [65](#page=65). > **Tip:** Hoewel SYBR Green bindt aan al het dsDNA, kan dit in bepaalde gevallen juist nuttig zijn voor de analyse, met name voor het monitoren van de amplificatie en het uitvoeren van smeltcurve analyses [65](#page=65). In geval van twijfel kan een met SYBR Green gedetecteerde qPCR nog op een agarosegel gezet worden voor verdere verificatie van de PCR-producten [70](#page=70). #### 3.1.2 Probes Om specifieke detectie mogelijk te maken, zijn er detectorprobes ontwikkeld die enkel aan het beoogde PCR-product binden. Verschillende soorten probes bestaan, waaronder Taqman probes, molecular beacons, dual hybridisation probes en scorpion probes [75](#page=75) [76](#page=76). ##### 3.1.2.1 Taqman probe Een Taqman probe is een korte DNA-sequentie die specifiek bindt aan het PCR-product. Tijdens de extensie fase van de PCR, knipt een polymerase met 5' naar 3' exonuclease activiteit de probe, wat leidt tot de vrijgave van een fluorofoor en een quencher. Hoe meer probe er geknipt wordt, hoe meer amplicons er zijn, en dus hoe meer template er oorspronkelijk in de qPCR-reactie aanwezig was [77](#page=77) [78](#page=78). **Voordelen:** * Hoge specificiteit [79](#page=79). * Mogelijkheid tot multiplex PCR mits gebruik van een verschillende fluorescente groep voor elke probe [79](#page=79). **Nadelen:** * Hogere kosten van de probe [79](#page=79). * Complexiteit van het assay design [79](#page=79). * Vereist DNA-polymerasen met 5' naar 3' exonuclease activiteit [79](#page=79). * Kan niet gebruikt worden voor een smeltcurve analyse [79](#page=79). ##### 3.1.2.2 Molecular beacon Een molecular beacon is een hairpin-structuur probe met aan de uiteinden een fluorofoor en een quencher. In de open, lineaire vorm (wanneer gebonden aan het doel-DNA) zijn de fluorofoor en de quencher van elkaar gescheiden, waardoor fluorescentie wordt waargenomen. De probe mag bij een lagere temperatuur binden dan de extensietemperatuur, waardoor de probe hybridisatiestap en afleesstap losgekoppeld kunnen worden van de synthesestap. Beacon DesignerTM is een softwarepakket speciaal ontworpen voor het design van molecular beacons [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82). ##### 3.1.2.3 Dual hybridisation probe Dual hybridisation probes maken gebruik van fluorescentie resonance energy transfer (FRET). Dit principe houdt in dat de emissiegolflengte van de ene fluorescente groep (de donor, D) overeenkomt met de excitatiegolflengte van de andere fluorescente groep (de reporter, R). FRET treedt enkel op wanneer de afstand tussen de donor en de reporter niet te groot is, bijvoorbeeld tussen een fluoresceïne-rhodaminekoppel wanneer de tussenliggende afstand 4 tot 5 nucleotiden bedraagt. Deze probes binden aan het DNA tijdens de annealing stap, en de detectie gebeurt VOOR de elongatie [84](#page=84) [86](#page=86) [87](#page=87). ##### 3.1.2.4 Scorpion probe Scorpion probes combineren de primer en de probe in één molecuul. Na amplificatie vouwt de probe zich om te hybridiseren met het amplicon, wat leidt tot een fluorescente signaal [88](#page=88). ### 3.2 Melting curve analyse Melting curve analyse is een techniek die wordt uitgevoerd na de qPCR-cyclus. Hierbij wordt de fluorescentie gemeten terwijl de temperatuur geleidelijk wordt verhoogd. De analyse focust op de afgeleide van de fluorescentie ten opzichte van de temperatuur ($-dF/dT$) versus de temperatuur ($T$) [66](#page=66). * **Eén product:** Resulteert in één piek in de smeltcurve [67](#page=67). * **Meerdere producten:** Meerdere pieken worden gedetecteerd [73](#page=73). * **Primer dimeer analyse:** Smeltcurve analyse kan gebruikt worden om de aanwezigheid van primer dimeren te detecteren, die doorgaans een lagere smelttemperatuur hebben dan het beoogde amplicon [68](#page=68) [69](#page=69). > **Tip:** De smelttemperatuur ($T_m$) van een amplicon kan worden afgeleid uit de smeltcurve door het punt te bepalen waar de fluorescentie het snelst afneemt (het midden van de piek) [73](#page=73). qPCR, naast kwantificering, biedt ook veel mogelijkheden voor het opsporen en identificeren van allelen en voor het automatiseren van detectieprocessen. Smeltcurve analyse, bijvoorbeeld, kan toegepast worden voor de amplificatie van genomisch DNA van verwante bacteriën om onderscheid te maken op basis van genetische verschillen [71](#page=71) [72](#page=72). --- # Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) is een geavanceerde kwantificatiemethode die absolute concentraties van nucleïnezuren met hoge precisie kan bepalen [94](#page=94). ### 4.1 Concept en workflow van ddPCR ddPCR is gebaseerd op het principe van het verdelen van een PCR-reactiemix in tienduizenden tot honderdduizenden minuscule druppels, ook wel 'droplets' genoemd. Elke druppel fungeert als een individuele reactie-eenheid waarin een PCR-reactie plaatsvindt. Na afloop van de PCR wordt de fluorescentie van elke druppel gemeten. De gegevens van alle druppels worden vervolgens geanalyseerd met behulp van Poisson-statistieken om de absolute concentratie van het doelmolecuul in het oorspronkelijke monster te bepalen [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). #### 4.1.1 De droplet generator De workflow van ddPCR begint met het genereren van een water-in-olie-emulsie van minuscule druppels. Een enkel monster van bijvoorbeeld 20 microliter wordt verdeeld over tienduizenden droplets [96](#page=96) [98](#page=98). #### 4.1.2 De PCR-reactie in droplets Elke druppel bevat een enkele qPCR-reactie die een Taqman probe gebruikt. De Taqman probe fungeert als een limiterend agens in de reactie. Na de PCR-cyclus wordt de fluorescentie van elke druppel gemeten met behulp van een flowcytometer [97](#page=97). #### 4.1.3 Reactiemix De ddPCR reactiemix bevat de volgende componenten: * Primers [100](#page=100). * Probes, waaronder Taqman Probe 1 (met FAM voor kleur 1) en Taqman Probe 2 (met HEX of VIC voor kleur 2) [100](#page=100). * ddPCR Supermix (met dNTP's, polymerase, buffer en MgCl2) [100](#page=100). * DNA template [100](#page=100). #### 4.1.4 Resultaatverwerking Een positieve druppel wordt gedefinieerd als een druppel met een fluorescentie-intensiteit boven een bepaalde detectielimiet, wat overeenkomt met de aanwezigheid van het doelmolecuul. Een negatieve druppel heeft een fluorescentie-intensiteit onder de detectielimiet. Op basis van het aantal positieve en negatieve druppels kan de oorspronkelijke DNA-concentratie in het hele monster worden afgeleid . > **Tip:** ddPCR maakt multiplexing mogelijk, waarbij meestal twee detectiekanalen worden gebruikt om verschillende doelmoleculen tegelijk te detecteren. Elke stip op een grafiek vertegenwoordigt één gemeten druppel voor een specifieke kleur . ### 4.2 Detectiemethoden De detectie in ddPCR vindt plaats na de PCR-reactie en maakt gebruik van een flowcytometer. Hierbij wordt de fluorescentie-intensiteit van elke individuele druppel gemeten. Het principe van multiplexing maakt de detectie van meerdere targets in hetzelfde monster mogelijk, meestal via twee verschillende fluorescentiekanalen [97](#page=97). ### 4.3 Voordelen en nadelen van ddPCR #### 4.3.1 Voordelen ddPCR biedt verschillende belangrijke voordelen: * **High throughput:** Maakt de analyse van een groot aantal monsters mogelijk . * **Absolute kwantificering zonder standaard:** Bepaalt de absolute hoeveelheid doel-DNA zonder dat er referentiestandaarden nodig zijn . * **Vereist zeer kleine hoeveelheden monster:** Ideaal voor zeldzame monsters zoals biopsieën of forensisch materiaal . * **Laag reactievolume:** Minimaliseert het gebruik van kostbare reagentia (consumables) . * **Hoge accuraatheid:** Bereikt hoge precisie door het grote aantal replicaten per monster . * **Hoge resolutie:** Maakt de detectie van kleine verschillen mogelijk, zoals veranderingen in kopieaantallen van genen . > **Tip:** De hoge resolutie van ddPCR is bijzonder nuttig voor het detecteren van subtiele genetische variaties, zoals copy-number variaties (CNV's). #### 4.3.2 Nadelen De belangrijkste nadelen van ddPCR zijn gerelateerd aan de benodigde apparatuur: * **Dure apparatuur:** Vereist de aanschaf van drie verschillende apparaten: een Droplet Generator, een klassiek PCR-apparaat en een Droplet Reader (die fungeert als een flowcytometer) . ### 4.4 Toepassingen van ddPCR ddPCR heeft een breed scala aan toepassingen in moleculaire diagnostiek en onderzoek: * **Analyse van copy number variation (CNV):** Kwantificeert variaties in het aantal kopieën van genen, zoals duplicaties van genen die betrokken zijn bij het tegengaan van celdood, wat relevant is voor kankeronderzoek . * **Detectie van zeldzame sequenties:** Efficiënt in het detecteren van minimale resterende ziekte na kankerbehandeling, bijvoorbeeld de detectie van kankercellen in het bloed . * **Niet-invasieve prenatale testen (NIPT):** Wordt gebruikt voor de detectie van aneuploïdieën (zoals trisomie 21, 18, 13) door het kwantificeren van foetaal DNA in het bloedplasma van de moeder. Bij zwangere vrouwen is 3 tot 13 procent van het celvrije DNA afkomstig van de foetus . * **Analyse van genexpressie:** Meet de aanwezigheid van zeldzame mRNA's en miRNA's die geassocieerd zijn met ziekten, vaak in combinatie met reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Veranderingen in miRNA-niveaus kunnen wijzen op verschillende aandoeningen, waaronder kanker . * **Single cell PCR analyse:** Maakt de analyse van genetisch materiaal op het niveau van individuele cellen mogelijk . * **Detectie van pathogenen:** Bepaalt de virale load . * **Microbioomanalyse:** Onderzoekt veranderingen in de samenstelling van microbioom, bijvoorbeeld in de oksel of darm . > **Voorbeeld:** Een klassiek voorbeeld van een ddPCR-toepassing is het nauwkeurig bepalen van de virale load van HIV in patiënten. Door het aantal virale genoomkopieën per volume bloed te kwantificeren, kan de effectiviteit van antiretrovirale therapie worden gemonitord . ### 4.5 Probe dynamics en eindpuntsbepaling ddPCR is gebaseerd op een eindpuntsbepaling van de fluorescentie na de PCR-cyclus. Dit is mogelijk en geen probleem bij ddPCR omdat er vele metingen per staal worden gedaan. De probe fungeert als limiterend agens, en de PCR bevindt zich in de exponentiële fase, waarbij dNTP's en primers niet limiterend zijn. Dit in tegenstelling tot klassieke PCR, waar limiterende factoren zoals dNTP's of primers ervoor kunnen zorgen dat de PCR in de plateaufase terechtkomt, waardoor meestal slechts één meting per staal wordt gedaan . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Kwantitatieve PCR (qPCR) | Ook bekend als Real-time PCR, is een techniek die het mogelijk maakt om de hoeveelheid doelwit-DNA of RNA in een monster te kwantificeren door de PCR-amplificatie continu te volgen in de tijd met behulp van fluorescente detectiemoleculen. | | Amplificatiecurve | Een grafiek die de toename van het fluorescente signaal weergeeft in de loop van de PCR-cycli, wat aangeeft hoeveel PCR-product er per cyclus wordt gevormd. | | Smeltcurve | Een grafiek die de afbraak van dubbelstrengs DNA weergeeft als functie van de temperatuur, waarbij de smeltcurve analyse helpt bij het identificeren van het aantal PCR-producten en mogelijke afwijkingen zoals primerdimeren. | | Cq-waarde (Ct-waarde) | De cyclusnummer waarbij het fluorescente signaal van een PCR-reactie een vooraf gedefinieerde drempelwaarde overschrijdt, wat een indicatie geeft van de initiële hoeveelheid doelwit-DNA. Een lagere Cq-waarde duidt op een hogere initiële hoeveelheid DNA. | | Delta delta Cq methode | Een veelgebruikte methode voor relatieve kwantificering in qPCR die de relatieve verandering in genexpressie of DNA-hoeveelheid tussen twee condities (bijvoorbeeld behandeling versus controle) berekent aan de hand van Cq-waarden en een referentiegen. | | Standaardcurve methode | Een methode voor kwantificering in qPCR waarbij een curve wordt geconstrueerd uit bekende concentraties van een standaard, waardoor de absolute hoeveelheid doelwit-DNA in onbekende monsters kan worden bepaald aan de hand van hun Cq-waarden. | | PCR efficiëntie | De mate waarin het PCR-proces het doelwit-DNA verdubbelt per cyclus. Een ideale efficiëntie is 100%, wat betekent dat het aantal amplicons per cyclus verdubbelt. Acceptabele waarden liggen meestal tussen 90% en 110%. | | SYBR Green | Een fluorescente kleurstof die zich intercaleert in dubbelstrengs DNA en groen fluoresceert wanneer deze wordt geëxciteerd. Het wordt gebruikt als reporter in qPCR om de accumulatie van PCR-producten te detecteren. | | Probe (Taqman, Molecular Beacon, etc.) | Een kort, enkelstrengs DNA- of RNA-molecuul dat specifiek bindt aan het doelwit-DNA-sequentie en een fluorescente signaal afgeeft. Probes bieden hogere specificiteit dan SYBR Green. | | Multiplex PCR | Een PCR-techniek waarbij meerdere doelwitsequenties tegelijkertijd in één reactie worden geamplificeerd en gedetecteerd, meestal door het gebruik van verschillende primerparen en/of probes met unieke fluorescente labels. | | Droplet Digital PCR (ddPCR) | Een techniek die de PCR-reactie opsplitst in duizenden tot miljoenen kleine druppeltjes. Elk druppeltje fungeert als een individuele PCR-reactie, wat zeer nauwkeurige absolute kwantificering mogelijk maakt zonder de noodzaak van een standaardcurve. | | Water-olie-emulsie | Een dispersie van waterdruppels in een continu medium van olie. In ddPCR wordt dit gebruikt om de PCR-reactiemengsels te verdelen in afzonderlijke, geïsoleerde micro-reactoren. | | Poisson statistiek | Een wiskundige verdeling die de waarschijnlijkheid van het optreden van een bepaald aantal gebeurtenissen beschrijft in een vaste interval van tijd of ruimte, en die in ddPCR wordt gebruikt om de initiële hoeveelheid doelwit-DNA te berekenen op basis van het aantal positieve druppeltjes. | | Genexpressie | Het proces waarbij de informatie in een gen wordt gebruikt om een functioneel product te maken, meestal een eiwit. Kwantificering van genexpressie wordt vaak gedaan met behulp van RT-qPCR. | | Huishoudgen | Een gen dat constitutief (constant) wordt uitgedrukt in de meeste cellen, ongeacht hun toestand of stimulus. Huishoudgenen worden vaak gebruikt als interne controlegen in qPCR om de variabiliteit in RNA-isolatie of reverse transcriptie te normaliseren. | | Referentiegen | Een gen waarvan de expressie stabiel wordt verondersteld te zijn onder de experimentele condities. Het wordt gebruikt als interne standaard voor relatieve kwantificering in qPCR. | | Smeltpuntbepaling (Tm) | De temperatuur waarbij de helft van het dubbelstrengs DNA is gedissocieerd tot enkelstrengs DNA. De Tm is afhankelijk van de DNA-sequentie en wordt gebruikt in smeltcurve analyse om de specificiteit van PCR-producten te beoordelen. | | Primer dimeer | Ongewenste PCR-producten die ontstaan wanneer primers met elkaar hybridiseren in plaats van met de template DNA. Ze kunnen de resultaten van qPCR beïnvloeden en worden vaak gedetecteerd tijdens smeltcurve analyse. | | Exponentiële fase | De fase in een PCR-reactie waarin het aantal kopieën van het doelwit-DNA theoretisch verdubbelt per cyclus, wat resulteert in een steile stijging van het fluorescente signaal in de amplificatiecurve. | | Plateaufase | De fase in een PCR-reactie waarin de amplificatie vertraagt of stopt. Dit kan gebeuren door uitputting van reactanten, ophoping van PCR-producten, of enzyminactivatie. | | Basislijn | Het initiële, lage fluorescente signaal in een qPCR-amplificatiecurve dat wordt gemeten voordat significante amplificatie plaatsvindt. | | Drempelwaarde (Threshold) | Een vooraf ingestelde fluorescentie-intensiteit die wordt gebruikt om de Cq-waarde te bepalen. Het wordt doorgaans ingesteld in de exponentiële fase van de amplificatiecurve. | | Absoluut kwantitatief | Het bepalen van de exacte hoeveelheid van een specifieke DNA- of RNA-sequentie in een monster, vaak uitgedrukt in kopieën per microliter, nanogram, etc. | | Relatief kwantitatief | Het vergelijken van de hoeveelheid van een specifieke DNA- of RNA-sequentie tussen verschillende monsters, vaak uitgedrukt als een 'fold change' (veranderingsfactor). | | FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) | Een mechanisme waarbij energie wordt overgedragen van een donor-fluorescente molecule naar een acceptor-fluorescente molecule wanneer ze zich dicht bij elkaar bevinden. Gebruikt in sommige probe-designs. | | Single cell PCR | PCR toegepast op individuele cellen om genetische analyse uit te voeren, zoals genexpressie of genotypering. | | Genoom | De volledige set van genetisch materiaal van een organisme. | | RNA-isolatie | Het proces van het extraheren van RNA uit biologische monsters. Cruciaal voor downstream toepassingen zoals RT-qPCR. | | Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) | Een techniek die RNA omzet in complementair DNA (cDNA) met behulp van reverse transcriptase, gevolgd door PCR om het cDNA te amplificeren. Wordt gebruikt om RNA-moleculen te detecteren en te kwantificeren. | | Copy Number Variation (CNV) | Variaties in het aantal kopieën van specifieke DNA-segmenten binnen het genoom. Kan worden geanalyseerd met behulp van technieken zoals ddPCR. | | Niet-invasieve prenatale testen (NIPT) | Tests die foetaal DNA uit het bloed van de moeder analyseren om chromosomale aneuploïdieën op te sporen zonder de noodzaak van invasieve procedures. | | Microbioomanalyse | De studie van de microbiële gemeenschappen die in een bepaald milieu leven, zoals de darm of de huid. Kan worden gedaan met behulp van PCR-gebaseerde methoden. | | Viral load | De hoeveelheid virusdeeltjes in een biologisch monster, zoals bloed of plasma. Wordt vaak gemeten met behulp van qPCR. |

# PCR en sequencing methoden Dit document behandelt de evolutie en de principes van PCR- en sequentietechnieken, van de klassieke Sanger-sequencing tot diverse Next Generation Sequencing (NGS) methoden zoals Illumina en Nanopore. ## 1. PCR en sequencing methoden ### 1.1 Inleiding tot sequencing Sequencingmethoden zijn essentieel voor het bepalen van de volgorde van nucleotiden in DNA of RNA. Dit proces vormt de basis voor vele moleculair biologische toepassingen. ### 1.2 Sanger sequencing Sanger sequencing, ook wel de dideoxymethode genoemd, was de eerste grootschalige sequencingtechniek en is nog steeds relevant voor specifieke toepassingen [7](#page=7). #### 1.2.1 Principe van Sanger sequencing Het principe berust op de inbouw van dideoxynucleotiden (ddNTP's) tijdens de DNA-synthese. Deze ddNTP's hebben geen 3'-hydroxylgroep, waardoor de ketenextensie stopt. De concentratie van ddNTP's ten opzichte van dNTP's is cruciaal; er is significant meer dATP aanwezig dan ddATP in de reactie [9](#page=9). #### 1.2.2 Vereisten voor Sanger sequencing Een belangrijke voorwaarde voor Sanger sequencing is dat de aangrenzende basen aan ten minste één zijde van de onbekende sequentie bekend moeten zijn om een primer te kunnen ontwerpen [6](#page=6). #### 1.2.3 Geautomatiseerde Sanger sequencing Moderne Sanger sequencing is geautomatiseerd. Dit omvat het gebruik van fluorescente labels op primers of ddNTP's, waardoor detectie via laser en capillaire elektroforese mogelijk is. Dit resulteert in een chromatogram dat automatisch wordt afgelezen en geïnterpreteerd [12](#page=12). #### 1.2.4 Problemen en oplossingen bij Sanger sequencing Enkele uitdagingen bij Sanger sequencing zijn: * Sequenties met opeenvolgende identieke nucleotiden [16](#page=16). * Hoog GC-gehalte, wat leidt tot hoge smelttemperaturen [16](#page=16). * Secundaire structuren in het DNA-template [16](#page=16). Oplossingen omvatten het optimaliseren van reactiecondities en het sequencen van complementaire en overlappende sequenties. Sanger sequencing is doorgaans geschikt voor sequenties tot ongeveer 1000 basenparen (bp) [16](#page=16) [17](#page=17). ### 1.3 Shotgun sequencing en assembly Voor het sequencen van langere fragmenten (bijvoorbeeld 20 kb) wordt shotgun sequencing toegepast, waarbij het DNA in kleinere fragmenten wordt verdeeld, geëmbleerd, en vervolgens de aangrenzende fragmenten worden geïdentificeerd om een grotere sequentie op te bouwen [18](#page=18) [19](#page=19). ### 1.4 Sequentieanalyse en toepassingen Sequentiegegevens kunnen worden opgeslagen en geanalyseerd met behulp van diverse databases zoals NCBI, EMBL, UniProt en OMIM, en tools zoals BLAST [21](#page=21). Toepassingen van sequentieanalyse omvatten: * **Klonering:** Controle van de correcte opname van DNA-fragmenten en het aantal kopieën [23](#page=23). * **Identificatie van coderende gebieden (ORF's):** Zoeken naar expressiesignalen, promotors, en translatie-initiatieplaatsen [24](#page=24). * **DNA-sequentievergelijking:** Identificatie van mutaties en genetische variatie [26](#page=26). ### 1.5 Next Generation Sequencing (NGS) NGS, ook wel massaal parallel sequencing genoemd, is een high-throughput methode die sneller en goedkoper is per staal dan traditionele methoden, omdat het geen klonering in een vector vereist en geen noodzaak voor gekende aangrenzende sequenties [29](#page=29). #### 1.5.1 Technieken binnen NGS Verschillende NGS-technieken bestaan, waaronder: * Bridge amplification (Solexa/Illumina) [29](#page=29) [30](#page=30). * Nanopore sequencing [29](#page=29) [30](#page=30). * Pyrosequencing (454 Life Sciences, Roche) [30](#page=30). * SOLiD sequencing (Applied Biosystems) [30](#page=30). * IonTorrent Sequencing [30](#page=30). * PacBio Sequencing [30](#page=30). #### 1.5.2 Algemene kenmerken van NGS NGS maakt sequencing mogelijk van meerdere genen tegelijk, gerichte sequencing van specifieke regio's na PCR, of zelfs volledige genomen (Whole Genome Sequencing, WGS). Toepassingen omvatten onder andere kankerdiagnostiek, het voorspellen van fenotypes (ziektes, resistentie), en het bepalen van de ontvankelijkheid voor individuele behandelingsstrategieën [32](#page=32) [33](#page=33). #### 1.5.3 Illumina (Solexa) sequencing (Bridge amplification) Deze methode werkt met 'short reads' (maximaal 150 bp per read) en maakt gebruik van 'sequencing by synthesis' [31](#page=31) [46](#page=46). Het proces omvat: 1. Maken van een bibliotheek van 'sheared' DNA-fragmenten [34](#page=34). 2. Ligatie van adaptors aan beide zijden, inclusief een index voor identificatie [34](#page=34) [52](#page=52) [53](#page=53). 3. Denaturatie en binding van de fragmenten aan een flow cell via complementaire adaptors [34](#page=34). 4. DNA-polymerase synthetiseert de eerste complementaire streng [34](#page=34). 5. Bridge amplification in situ creëert clusters van identieke ssDNA-moleculen met dezelfde oriëntatie [34](#page=34) [51](#page=51). 6. De 'reverse' streng wordt doorgeknipt [34](#page=34). 7. Een sequencing primer bindt, waarna DNA-polymerase dNTP's met fluorescente labels inbouwt. Dit gebeurt cyclisch, een proces dat bekend staat als 'cyclic reversible termination' [34](#page=34) [49](#page=49) [50](#page=50). 8. Een flow cell kan miljoenen clusters bevatten [46](#page=46). #### 1.5.4 Nanopore sequencing Nanopore sequencing staat bekend om het genereren van 'long reads' (tot wel 4000 kb) [31](#page=31) [66](#page=66). Het principe omvat: 1. Maken van een bibliotheek van gedeeltelijk verknipte DNA-fragmenten met ligatie van adaptors en indices [63](#page=63). 2. DNA-moleculen worden door een synthetisch membraan met nanometer-grote poriën geleid door een elektrische stroom (elektroforese) [63](#page=63). 3. Een helicase splitst dubbelstrengs DNA naar enkelstrengs DNA [64](#page=64). 4. Verschillende nucleotiden veroorzaken variaties in de doorlaatbaarheid van de porie door hun verschillende vormen, wat leidt tot verstoringen in de ionenstroom [64](#page=64). 5. Deze methode maakt ook epigenetische detectie mogelijk, zoals methylaties [64](#page=64). #### 1.5.5 Vergelijking van Illumina en Nanopore * **Leeslengte:** Illumina produceert short reads (ca. 150 bp), terwijl Nanopore long reads (tot 4000 kb) genereert [66](#page=66). * **Accuraatheid:** Illumina heeft een foutenmarge van ongeveer 0,1%, terwijl Nanopore een foutenmarge van 5-10% heeft. De hogere accuraatheid van Illumina is mede te danken aan de gelijktijdige passage van meerdere nucleotiden in de porie [66](#page=66). #### 1.5.6 Target enrichment Wanneer niet het hele genoom wordt afgelezen, kan 'target enrichment' worden toegepast. Dit kan via gerichte PCR van specifieke regio's of via random PCR gevolgd door selectie met 'capturing' [54](#page=54) [57](#page=57). #### 1.5.7 NGS data-analyse Na sequencing kan de data worden geanalyseerd via: * **Mapping to a reference genome:** Het mappen van de sequentie reads naar een bestaand referentiegenoom [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69). * **De novo sequence assembly:** Het combineren van alle sequentiefragmenten om een nieuw genoom op te bouwen, waarbij gaten opgevuld kunnen worden [67](#page=67). * **Annotatie:** Identificatie en verdere acties gebaseerd op gekende consensus sequenties [67](#page=67). #### 1.5.8 Probleemzones bij NGS Specifieke uitdagingen bij NGS, vooral bij eukaryoten, zijn herhalingen zoals verspreide herhalingen en tandem repeats [70](#page=70). --- # Transcriptomics en metagenomics Dit deel van de cursus behandelt transcriptomics, de studie van het volledige RNA-molecuul dat door een cel wordt geproduceerd, en metagenomics, de studie van genetisch materiaal van een gemengde populatie van organismen uit een omgevingsstaal [73](#page=73). ### 2.1 Transcriptomics Transcriptomics, ook bekend als transcriptome sequencing, RNAseq, of whole transcriptome shotgun sequencing (WTSS), is de studie van het volledige RNA-molecuul dat door een cel wordt geproduceerd. Het biedt zowel kwalitatieve als kwantitatieve informatie over het transcriptome [73](#page=73) [74](#page=74). #### 2.1.1 Transcriptomics in Eukaryoten Bij eukaryoten begint het proces met RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) met oligo(dT) primers, wat resulteert in een cDNA-bibliotheek die vervolgens wordt gesequenced met Next-Generation Sequencing (NGS). De verkregen sequenties worden vergeleken met het genoom. Een uitdaging hierbij is het intron-probleem, dat wordt opgelost door de sequenties in silico naar het exoom (het deel van het genoom dat uit exonen bestaat) te mappen [74](#page=74). Het RNA in een eukaryote cel bestaat voor een groot deel uit: * rRNA: 70-80% * tRNA: 15% * mRNA: 3-4% * Andere RNA's [75](#page=75). #### 2.1.2 Kwalitatieve en Kwantitatieve Informatie uit mRNAseq * **Kwalitatieve informatie** uit mRNAseq betreft de identificatie van welke genen tot expressie komen [75](#page=75). * **Kwantitatieve informatie** uit mRNAseq geeft inzicht in de mate van expressie van deze genen, dus hoeveel van elk transcript aanwezig is [75](#page=75). Om de analyse te focussen op de mRNA-moleculen, wordt vaak een **enrichment voor mRNA** uitgevoerd [76](#page=76). #### 2.1.3 Technieken binnen Transcriptomics Diverse technieken worden gebruikt voor transcriptomics analyses, waaronder: * Serial analysis of gene expression (SAGE) [77](#page=77). * Cap analysis gene expression (CAGE) [77](#page=77). * Single cell RNA seq [77](#page=77). #### 2.1.4 Toepassingen van Transcriptomics Transcriptomics kent verschillende specifieke toepassingen: * **miRNA seq:** Deze techniek vindt plaats na selectie op grootte van RNA (17-25 nucleotiden) [79](#page=79). * **Prokaryotic rRNA seq:** Voor prokaryoten worden sequence-specifieke primers gebruikt die zich richten op geconserveerde gebieden van het rRNA [79](#page=79). > **Tip:** Het gebruik van random primers voor RT-PCR in plaats van oligo(dT) primers kan leiden tot een bredere detectie van RNA-moleculen, inclusief niet-polyadenylerende RNA's, maar kan ook de bias in de representatie van verschillende transcripten veranderen [74](#page=74). ### 2.2 Metagenomics Metagenomics richt zich op de studie van genetisch materiaal afkomstig van een gemengde populatie van organismen uit een omgevingsstaal [73](#page=73) [80](#page=80). #### 2.2.1 Informatie Verkregen uit Metagenomics Door het sequencen van een multi-organisme staal kunnen verschillende soorten informatie worden verkregen: * Identificatie van de aanwezige soorten, inclusief de ontdekking van nieuwe soorten [80](#page=80). * Het vaststellen van taxonomische relaties tussen de gedetecteerde organismen [80](#page=80). * Inzicht in de eigenschappen van de soorten, zoals de aanwezigheid van antibioticum-resistentie genen [80](#page=80). --- # Sequentie-analyse en toepassingen Dit onderwerp richt zich op de methoden en toepassingen van het analyseren van DNA-sequenties, met name door het gebruik van databanken en gereedschappen zoals BLAST, om biologische informatie te ontcijferen en toe te passen [21](#page=21) [23](#page=23). ### 3.1 Databanken en analyse tools Er zijn verschillende publiek toegankelijke databanken die DNA-sequenties en bijbehorende annotaties bevatten. Belangrijke voorbeelden hiervan zijn NCBI, EMBL, UniProt en OMIM. Voor het analyseren van deze sequenties zijn diverse tools beschikbaar, waarvan BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) een cruciaal instrument is [21](#page=21). ### 3.2 Toepassingen van sequentie-analyse De analyse van DNA-sequenties kent een breed scala aan toepassingen in moleculair biologisch onderzoek en biotechnologie [23](#page=23). #### 3.2.1 Kloneringscontrole Een fundamentele toepassing is de controle na klonering. Sequentie-analyse kan bevestigen of een DNA-fragment correct is opgenomen in een vector. Dit omvat het verifiëren van het aantal keren dat het fragment is opgenomen en of het in de juiste oriëntatie is ingebracht [23](#page=23). #### 3.2.2 Identificatie van coderende gebieden Sequentie-analyse is essentieel voor het identificeren van coderende regio's binnen een genoom. Dit proces omvat het zoeken naar verschillende expressiesignalen [24](#page=24). * **Promotorregio:** Identificatie van bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren, waaronder enhancers en repressors, die de genexpressie reguleren [24](#page=24) [71](#page=71). * **Transcriptie-initiatieplaats:** Het bepalen van het startpunt van de RNA-synthese [24](#page=24). * **Translatie-initiatieplaats:** Het lokaliseren van de startcodon (meestal AUG) waar de eiwitsynthese begint [24](#page=24). * **Open Reading Frame (ORF):** Het identificeren van de specifieke sequentie die codeert voor een eiwit, van start- tot stopcodon [24](#page=24). #### 3.2.3 Detecteren van mutaties en genetische variatie DNA-sequentievergelijking stelt onderzoekers in staat om mutaties te detecteren en de genetische variatie binnen populaties of tussen individuen te bestuderen [26](#page=26). #### 3.2.4 Verdere toepassingen Naast de bovengenoemde toepassingen, leidt sequentie-analyse tot: * **Voorspelling van producten of afwijkende producten:** Het identificeren van potentiële eiwitproducten en het voorspellen van afwijkende eiwitstructuren als gevolg van mutaties, wat relevant is voor medicijngevoeligheid en gentherapieontwikkeling [71](#page=71). * **Begrip van genexpressieregulatie:** Door het analyseren van transcriptiefactor responselementen in regulatorische regio's, verkrijgt men een beter inzicht in genexpressie. Dit is cruciaal voor gepersonaliseerde geneeskunde en gentherapie [71](#page=71). * **Bestuderen van genetische verwantschappen:** Het bepalen van evolutionaire verwantschappen tussen individuen en soorten [71](#page=71). > **Tip:** De nauwkeurigheid van sequentie-analyse is direct afhankelijk van de kwaliteit van de gebruikte databanken en de juiste interpretatie van de resultaten van analyse-tools zoals BLAST. Zorg ervoor dat u de parameters van deze tools correct instelt voor uw specifieke onderzoeksvraag. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Polymerase Chain Reaction (PCR) | Een moleculair-biologische techniek die gebruikt wordt om exponentieel specifieke DNA-fragmenten te amplificeren, wat essentieel is voor diverse toepassingen zoals sequencing en diagnostiek. | | Sanger Sequencing | Een methode voor DNA-sequencing die gebaseerd is op de ketenterminatie door dideoxynucleotiden (ddNTPs) en elektroforese om de sequentie te bepalen, oorspronkelijk ontwikkeld door Frederick Sanger. | | Next Generation Sequencing (NGS) | Een verzamelnaam voor moderne high-throughput sequencingtechnologieën die parallel duizenden tot miljoenen DNA-fragmenten kunnen sequencen, wat aanzienlijk sneller en goedkoper is dan Sanger sequencing voor grootschalige projecten. | | Bridge Amplification | Een techniek die gebruikt wordt in Illumina sequencing om clusters van identieke DNA-moleculen te genereren op een flowcel, wat essentieel is voor het produceren van een sterk signaal tijdens sequencing by synthesis. | | Sequencing by Synthesis | Een veelgebruikte NGS-methode waarbij DNA-fragmenten worden gesequenced terwijl ze worden gesynthetiseerd, waarbij bij elke stap de ingebouwde nucleotide wordt gedetecteerd, vaak via fluorescentie. | | Nanopore Sequencing | Een single-molecule sequencingtechniek die gebruikmaakt van nanoporiën om DNA-moleculen te geleiden en de reeks van doorgelaten nucleotiden te detecteren aan de hand van veranderingen in elektrische stroom. | | Transcriptomics | Het onderzoek naar de volledige set van RNA-transcripten die door een cel of organisme op een bepaald moment worden geproduceerd, wat inzicht geeft in genexpressie en cellulaire processen. | | Metagenomics | De studie van genetisch materiaal dat rechtstreeks uit omgevingsmonsters is geïsoleerd, waardoor de analyse van de genetische diversiteit en functionele capaciteiten van gemeenschappen van micro-organismen mogelijk wordt. | | Shotgun Sequencing | Een DNA-sequencingstrategie waarbij het gehele genoom willekeurig wordt gefragmenteerd, de fragmenten worden gesequenced en vervolgens geassembleerd tot een volledige sequentie door middel van bio-informatische methoden. | | Contig Assembly | Het proces waarbij overlappende DNA-sequenties van individuele fragmenten worden samengevoegd tot langere, aaneengesloten stukken DNA, genaamd contigs, als onderdeel van de reconstructie van een volledig genoom. | | BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) | Een bio-informatica-algoritme dat gebruikt wordt om DNA- of aminozuursequenties te vergelijken met databases om homologieën te vinden en de functie van onbekende sequenties te voorspellen. | | Open Reading Frame (ORF) | Een continue reeks van codons in een DNA- of RNA-sequentie die begint met een startcodon en eindigt met een stopcodon, wat een potentiële eiwitcoderende regio aangeeft. | | Whole Genome Sequencing (WGS) | De bepaling van de volledige DNA-sequentie van het genoom van een organisme, wat alle genen en niet-coderende regio's omvat en gedetailleerde informatie verschaft over de genetische samenstelling. | | Cyclic Reversible Termination | Een technologie die gebruikt wordt in sommige sequencing-by-synthesis methoden, waarbij de sequentiecyclus wordt beëindigd met een omkeerbaar cap en fluorescent label, wat cyclische detectie van nucleotiden mogelijk maakt. | | Target Enrichment | Een strategie om specifieke DNA- of RNA-regio's te selecteren en te concentreren uit een complexe mix, om zo de efficiëntie en gevoeligheid van downstream analyses, zoals sequencing, te verbeteren. | | SMRT Sequencing (Single Molecule, Real-Time) | Een long-read sequencingtechnologie ontwikkeld door PacBio die de DNA-synthese van enkele moleculen in real-time volgt, waardoor lange reads met hoge nauwkeurigheid mogelijk zijn. | | Epigenetische Detectie | De mogelijkheid om chemische modificaties aan DNA of histonen te detecteren, zoals methylatie, die de genexpressie beïnvloeden zonder de onderliggende DNA-sequentie te veranderen, wat mogelijk is met bepaalde nanopore sequencing technologieën. | | De Novo Sequence Assembly | Het proces van het construeren van een sequentie van een genoom of DNA-fragment zonder gebruik te maken van een bestaande referentie-sequentie, wat essentieel is voor het sequencen van nieuwe of nog niet gekarakteriseerde organismen. | | RNA-Seq (RNA Sequencing) | Een transcriptomics-techniek die next-generation sequencing gebruikt om de aanwezigheid en kwantiteit van RNA-moleculen in een biologisch monster te meten, wat inzicht geeft in genexpressieprofielen. | | Oligo(dT) primers | Korte stukjes enkelstrengs DNA die sequentie-specifiek binden aan de poly(A)-staart van messenger-RNA (mRNA) moleculen, gebruikt als startpunt voor de synthese van complementair DNA (cDNA) in transcriptomics-experimenten. | | Exoom | Het deel van het genoom dat bestaat uit exonen, welke coderen voor eiwitten. Exome sequencing richt zich op deze coderende regio's, wat kosteneffectiever kan zijn dan whole genome sequencing. | | rRNA (ribosomaal RNA) | RNA-moleculen die een structureel en katalytisch onderdeel vormen van ribosomen, essentieel voor eiwitsynthese. | | tRNA (transfer RNA) | RNA-moleculen die aminozuren transporteren naar het ribosoom tijdens de eiwitsynthese, waarbij elk tRNA-molecuul een specifiek aminozuur bindt en correspondeert met een anticodon dat past bij een mRNA-codon. | | mRNA (messenger RNA) | RNA-moleculen die de genetische code van DNA kopiëren en naar de ribosomen transporteren om als sjabloon te dienen voor eiwitsynthese. | | miRNA (microRNA) | Kleine, niet-coderende RNA-moleculen die een rol spelen bij genregulatie door de expressie van doel-mRNA's te onderdrukken, voornamelijk na transcriptie. |

# Probehybridisatie principes en methoden Probehybridisatie is een techniek die wordt gebruikt om een specifieke doelwitsequentie van DNA of RNA te detecteren op basis van basencomplementariteit [5](#page=5). ### 1.1 Basisprincipes van probehybridisatie Het fundamentele principe van probehybridisatie berust op de specifieke interactie tussen twee complementaire enkelstrengs nucleïnezuurmoleculen, waarbij één van de moleculen fungeert als een "probe" en de andere als het "doelwit" (target) [5](#page=5). * **Probe:** Een gemerkte enkelstrengs DNA (ssDNA) of RNA molecule die ontworpen is om complementair te zijn aan de doelwitsequentie [5](#page=5). * **Doelwit (Target):** Een enkelstrengs DNA (ssDNA) of RNA molecule dat gedetecteerd moet worden [5](#page=5). * **Hybridisatie:** Het proces waarbij de probe zich bindt aan de complementaire doelwitsequentie. Dit proces vereist specifieke omstandigheden om unieke detectie te garanderen [5](#page=5). Een gesynthetiseerde probe kan specifiek ontworpen worden om complementair te zijn aan een gen van interesse. Bijvoorbeeld, als het gewenste gen de sequentie `...GGC CCT TAA...` heeft, kan een probe ontworpen worden met de complementaire sequentie `...CCG GGA ATT...`, die vervolgens gemerkt wordt [6](#page=6). Dubbelstrengs DNA (dsDNA) moet eerst gedenatureerd worden tot enkelstrengs DNA (ssDNA) alvorens hybridisatie kan plaatsvinden [11](#page=11). De sterkte van de binding tussen de probe en het doelwit wordt beïnvloed door de lengte van de sequentie en het GC-gehalte. Langere sequenties en een hoger GC-gehalte leiden over het algemeen tot sterkere binding [20](#page=20). ### 1.2 Methoden van hybridisatie Probehybridisatie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, afhankelijk van het toepassingsgebied en de gewenste detectiemethode. De belangrijkste methoden zijn [5](#page=5): #### 1.2.1 In oplossing Hybridisatie in oplossing vindt plaats zonder een vaste drager. Dit wordt onder andere toegepast in qPCR en bij target enrichment voor sequencing [5](#page=5). #### 1.2.2 Op vaste drager Hybridisatie op een vaste drager omvat technieken waarbij het doelwit of de probe wordt vastgezet op een oppervlak, wat verdere zuivering en detectie vereenvoudigt. Dit kan op diverse materialen gebeuren [12](#page=12) [5](#page=5): * **Membraan/Filterhybridisatie:** Dit omvat technieken zoals Dot blot, Southern blot en Northern blot, waarbij het DNA of RNA op een membraan wordt aangebracht [12](#page=12). * **Southern blot:** Een klassieke methode waarbij doelwit ssDNA wordt geblott op een membraan (zoals nylon of nitrocellulose), gevolgd door hybridisatie met een gemerkte ssDNA probe. Het proces omvat denaturatie van het doelwit DNA, blotten, prehybridisatie, hybridisatie, het wegwassen van ongebonden probes en detectie [10](#page=10) [9](#page=9). * **Northern blot:** Vergelijkbaar met Southern blot, maar wordt gebruikt voor de detectie van RNA [12](#page=12). * **Dot blot:** Een eenvoudigere methode waarbij het DNA of RNA direct op het membraan wordt aangebracht zonder voorafgaande elektroforese, om de aanwezigheid van een specifieke sequentie te detecteren [12](#page=12). * **Glazen drager:** Materialen zoals glasplaten worden gebruikt voor In situ hybridisatie en microarrays [12](#page=12). * **In situ hybridisatie (ISH) / Fluorescentie In situ hybridisatie (FISH):** Hierbij vindt de hybridisatie direct plaats op de cel- of weefselstructuur, vaak op een glazen drager. Dit maakt het mogelijk om de locatie van specifieke nucleïnezuursequenties binnen cellen of weefsels te visualiseren [16](#page=16) [8](#page=8). * **Microarray:** Een techniek waarbij honderden tot duizenden probes vastgezet zijn op een glazen drager, waardoor de gelijktijdige analyse van vele doelwitsequenties mogelijk is [12](#page=12). #### 1.2.3 Blotten (transfer naar een vaste drager) Blotten is het proces van het overbrengen van DNA (of RNA) van een gel naar een vaste drager, meestal een membraan. Er zijn verschillende methoden voor blotten [12](#page=12): * **Capillair blotten:** Maakt gebruik van capillaire werking om de vloeistof en de nucleïnezuren door het membraan te trekken [13](#page=13). * **Vacuüm blotten:** Gebruikt vacuüm om de transfer te versnellen [14](#page=14). * **Semi-droog blotten:** Een snellere methode die minder buffervloeistof vereist [15](#page=15). * **Dot blotten:** Hierbij wordt het nucleïnezuur direct op het membraan aangebracht zonder eerdere scheiding in een gel [12](#page=12). #### 1.2.4 Fixatie Na het blotten moet het vastgezette DNA gefixeerd worden op het membraan. Dit kan gebeuren door verhitting (bakken, minimaal 80°C onder vacuüm voor nitrocellulose) of door UV-bestraling [17](#page=17). #### 1.2.5 Prehybridisatie Voordat de gemerkte probe wordt toegevoegd, wordt het membraan vaak geprehybridiseerd. Dit betekent dat de resterende, onbezette bindingsplaatsen op het membraan worden geblokkeerd met niet-specifiek DNA (zoals Herpes simplex zeehonden virus DNA of zalmsperma DNA). Zonder prehybridisatie zouden de probes zich aspecifiek kunnen binden aan deze vrije plaatsen, wat zou leiden tot een hoog achtergrondsignaal en valse positieven [18](#page=18) [9](#page=9). ### 1.3 Probes: Aanmaak, Merken en Detectie #### 1.3.1 Aanmaak van probes Probes kunnen op twee hoofdmanieren worden bereid: * **Chemische synthese van oligonucleotiden:** * Oligonucleotiden tot ongeveer 100 nucleotiden kunnen via chemische synthese worden geproduceerd [21](#page=21). * De meest gebruikte methode is de fosfoforamidietmethode, waarbij nucleotiden één voor één worden opgebouwd [21](#page=21). * Gespecialiseerde bedrijven produceren deze probes [21](#page=21). * Tijdens de synthese kunnen probes gemerkt worden door de inbouw van gemerkte nucleotiden (bijv. FITC-dUTP, Cy3-dUTP, DIG-dUTP, biotine-dUTP), hoewel dit kostbaar is [21](#page=21). * Alternatieven voor inbouw zijn ddNTP's of LNA (Locked Nucleic Acids) [21](#page=21). * **Enzymatische synthese van probes:** * **PCR met eindstandige labeling:** Gebruikmakend van een gemerkte primer [25](#page=25). * **PCR met interne labeling:** Inbouw van gemerkte dNTP's tijdens de PCR-reactie [25](#page=25). * **Merking op dsDNA achteraf:** * **Nick-translatie:** DNAse I creëert enkelstrengse breuken in dsDNA. DNA polymerase I verlengt de 3'-uiteinden en 'overschrijft' de 5'-uiteinden, waarbij gemerkte nucleotiden worden ingebouwd [27](#page=27). * **Random priming labeling:** DNA wordt gedenatureerd en geannealed met korte, willekeurige oligonucleotiden (6 nt). Vervolgens vindt in vitro verlenging plaats met een DNA polymerase (zoals Klenow) en gemerkte dNTP's [29](#page=29). * **Eind-labeling met PNK (T4 polynucleotide kinase):** Voegt een 5'-fosfaatgroep toe, voornamelijk gebruikt voor radioactieve labeling [30](#page=30). * **Eind-labeling met terminaal transferase:** Voegt dNTP's toe aan het 3'-uiteinde van een DNA-streng [31](#page=31). * **RNA-probe bereiding via transcriptie van gekloneerd DNA:** * Dit proces, ook wel "run-off transcriptie" genoemd, maakt gebruik van een plasmide met een specifieke promotor (bijv. SP6). * Het plasmide-DNA wordt gelineariseerd met restrictie-enzymen [34](#page=34). * SP6 polymerase wordt gebruikt in aanwezigheid van NTP's om een gemerkte RNA probe te synthetiseren in vitro [34](#page=34). #### 1.3.2 Merken (Labels) van probes Probes kunnen op verschillende manieren gemerkt worden om hun detectie mogelijk te maken [22](#page=22): * **Radioactief gemerkte dNTPs:** Bieden directe detectie [23](#page=23) [36](#page=36). * **Fluorescent gemerkte dNTPs:** Zorgen voor directe of indirecte detectie. Voorbeelden zijn FITC, TRIT, AMCA, Cy3, Cy5, JOE, FAM, HEX, TAMRA [23](#page=23) [36](#page=36) [38](#page=38). * **Biotine-16-dUTP:** Wordt indirect gedetecteerd [23](#page=23) [36](#page=36). * **Digoxigenine-11-dUTP:** Wordt eveneens indirect gedetecteerd [23](#page=23) [36](#page=36). Bij het gebruik van biotine of digoxigenine kan een "spacer" nodig zijn om sterische hinder te vermijden bij de herkenning van het label of de vorming van de dubbele helix [24](#page=24). #### 1.3.3 Detectie van labels De detectiemethode hangt af van het type label dat in de probe is ingebouwd [36](#page=36). * **Directe detectie:** * **Radioactiviteit:** Gedetecteerd via autoradio­grafie (met röntgengevoelige films) of phospho-imaging. Phospho-imaging is directer en herbruikbaar [37](#page=37). * **Fluorochromen:** Gedetecteerd met fluorescentiemicroscopen en CCD-camera's. Deze worden veel gebruikt in FISH en microarrays, maar minder in membraanhybridisaties [38](#page=38). * **Indirecte detectie:** * Wordt gebruikt voor labels zoals digoxigenine en biotine [39](#page=39). * Vereist "reporters" die zich binden aan het label. Dit kunnen enzymen (Alkalische Fosfatase - AP, Horse Radish Peroxidase - HRP), colloïdaal goud, of fluorochromen zijn [39](#page=39). * **Enzymatische reporters (AP en HRP):** * Deze enzymen katalyseren reacties met chromogene of chemiluminogene substraten, wat resulteert in een detecteerbaar signaal [44](#page=44). * **HRP:** Kan een kleurstof produceren met DAB of AEC, of chemiluminescentie met luminol [44](#page=44) [46](#page=46). * **AP:** Kan een oplosbare kleurstof produceren met TMB, of chemiluminescentie met BCIP plus NBT, AMPPD, of CSPD. Chemiluminescentie is vaak duizenden keren gevoeliger dan chromogene detectie [44](#page=44) [46](#page=46) [47](#page=47) [48](#page=48). * **Signaalamplificatie:** Om het signaal te versterken, vooral bij een laag aantal doelwitten, kunnen technieken zoals het steptavidine-biotine-complex worden gebruikt, wat leidt tot een verhoogd aantal reporters per probe [43](#page=43) [46](#page=46). #### 1.3.4 Gebruik van de probe en wassen Na de hybridisatie is het cruciaal om overtollige, aspecifiek gebonden probe te verwijderen door grondig te wassen. Dit minimaliseert achtergrondsignalen en verbetert de specificiteit van de detectie [49](#page=49) [9](#page=9). > **Tip:** Bij het ontwerpen van probes moet rekening gehouden worden met de reactieomstandigheden, de verwachte lengte van de targetsequentie, en het gewenste sensitiviteitsniveau. > > **Tip:** Zorg ervoor dat de gebruikte bufferomstandigheden en temperatuur (Th) optimaal zijn voor de specifieke probe-target combinatie om een efficiënte en specifieke hybridisatie te garanderen [11](#page=11) [19](#page=19). --- # Hybridisatiecondities en specificiteit Dit deel behandelt de factoren die de hybridisatie beïnvloeden, met de nadruk op het bereiken van specificiteit en het beheersen van kruishybridisatie [50](#page=50) [56](#page=56). ### 2.1 Factoren die hybridevorming beïnvloeden De binding van een probe aan een target (DNA of RNA) wordt bepaald door verschillende factoren [50](#page=50): * **Grootte van de probe en target:** De lengte van de sequentie speelt een rol bij de stabiliteit van het hybride [50](#page=50) [55](#page=55). * **GC-gehalte:** Een hoger percentage GC (guanine-cytosine) basenparen leidt tot een stabielere helix, omdat GC-paren drie waterstofbruggen vormen, in tegenstelling tot de twee waterstofbruggen bij AT-paren [50](#page=50). * **Basevolgorde:** De specifieke sequentie van de basen bepaalt de complementaire binding [50](#page=50). * **Type probe:** Of de probe DNA of RNA is, beïnvloedt de hybridisatie [50](#page=50). * **Reactiecondities:** Deze omvatten temperatuur en de aanwezigheid van stoffen in de omgeving die de helixvorming kunnen beïnvloeden [50](#page=50). * **Tijdsduur van de hybridisatie:** Voldoende tijd is nodig voor de interactie tussen probe en target om plaats te vinden [50](#page=50). #### 2.1.1 Probe- en targetconcentratie De concentraties van de probe en het target zijn gecorreleerd. Bij een zeer laag aantal targets wordt een relatieve overmaat aan probe gebruikt om de kans op binding te vergroten. De probe bindt aan lineair, enkelstrengs doelwit DNA of RNA [50](#page=50). #### 2.1.2 Maximale belading (Hmax) $H_{max}$ vertegenwoordigt de maximale belading van het target met de probe. De hoeveelheid probe wordt gekozen in het lineaire gebied van de verzadigingscurve om kruishybridisatie tegen te gaan [53](#page=53). > **Tip:** Begrijp de relatie tussen probeconcentratie, targetconcentratie en de verzadigingscurve om optimale hybridisatiecondities te bepalen en ongewenste binding te minimaliseren [53](#page=53). #### 2.1.3 Mismatches en kruishybridisatie * **Match:** Alle basen van de probe hybridiseren volledig met het target [53](#page=53). * **Kruishybridisatie:** Niet alle basen van de probe hybridiseren met het target, wat duidt op de aanwezigheid van één of meerdere mismatches. Dit kan optreden wanneer een probe bindt aan sequenties die gedeeltelijk complementair zijn [53](#page=53) [56](#page=56). ### 2.2 Specificiteit van probe-target binding Specificiteit is cruciaal voor nauwkeurige detectie en wordt bepaald door de hybridecondities, met name de stringentie [56](#page=56). #### 2.2.1 Stringentie Stringentie verwijst naar de reactiecondities waaronder de hybridisatie plaatsvindt. Het beïnvloedt de stabiliteit van het gevormde hybride [53](#page=53) [56](#page=56). * **Hoge stringentie:** Alleen stabiele hybriden met 0% mismatch worden toegestaan. De hybride temperatuur ($T_h$) ligt minimaal 5°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). * **Lage stringentie:** Stabiele hybriden worden ook gevormd in aanwezigheid van mismatches. De hybride temperatuur ($T_h$) ligt tot 15°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). De stringentie, en dus de specificiteit, hangt af van: * **Temperatuur:** Hogere temperaturen verhogen de stringentie [58](#page=58). * **Zoutconcentratie:** Een lagere zoutconcentratie verhoogt de stringentie. Zouten stabiliseren de negatief geladen fosfaatruggengraten van de nucleïnezuren, waardoor hogere zoutconcentraties de stabiliteit van de dubbele helix verhogen [57](#page=57) [58](#page=58). * **pH:** Een hogere pH verhoogt de stringentie [58](#page=58). * **Formamideconcentratie:** Een hogere formamideconcentratie verhoogt de stringentie. Formamide denatureert de dubbele helix door waterstofbruggen te verstoren [57](#page=57) [58](#page=58). #### 2.2.2 Berekening van de smelttemperatuur (Tm) De smelttemperatuur ($T_m$) voor DNA/DNA hybriden van probes ≥ 100 bp kan empirisch worden berekend met de volgende formule [57](#page=57): $$T_m = 81.5 + 0.41(\%GC) – \frac{600}{l} – 1.5(\%mismatch) + 16.6 (\log_{10} [\text{Na}^+]) – 63(\%\text{formamide}) \quad (°C)$$ Waar: * $\%GC$ is het percentage guanine-cytosine basenparen [57](#page=57). * $l$ is de lengte van de probe in basenparen [57](#page=57). * $\%mismatch$ is het percentage mismatches tussen de probe en de targetsequentie [57](#page=57). * $[\text{Na}^+]$ is de natriumionenconcentratie [57](#page=57). * $\%\text{formamide}$ is de concentratie formamide [57](#page=57). > **Tip:** De hybride temperatuur kan verlaagd worden door aanpassingen in de formamide- of zoutconcentratie. Voor in situ hybridisatie (ISH) wordt standaard 37°C gebruikt. De formule voor $T_m$ is niet geldig voor DNA/RNA of RNA/RNA hybriden, en bij gebruik van LNA (Locked Nucleic Acid) of MGB (Minor Groove Binder) probes [57](#page=57). #### 2.2.3 Rol van de wasstap De stringentie van de wasstap is ook van belang voor de specificiteit. Na de hybridisatie worden kruishybriden (met mismatches) weggewassen, vooral bij hoge stringentie. Wassen dicht bij de smelttemperatuur helpt bij het verwijderen van zwak gebonden, minder specifieke hybriden [58](#page=58) [62](#page=62). > **Belangrijk:** Klassieke Southern blots vereisen een specifiek doelwit, wat bereikt wordt door zorgvuldige controle van stringentie tijdens de hybridisatie en de wasstap [58](#page=58). #### 2.2.4 Toepassingen en detectie van mutaties/verwante genotypen * **Detectie van mutaties:** Bij de detectie van mutaties is het essentieel om nauwkeurig de mogelijkheid van mismatches te controleren, wat specifieke stringentiecondities vereist [56](#page=56). * **Detectie van virale genotypen:** Bij het detecteren van virussen die tot een familie behoren, kan er enige mate van mismatch in de sequentie voorkomen, wat een lagere stringentie kan vereisen [56](#page=56). ### 2.3 Andere componenten in de hybridisatiebuffer Naast de primaire componenten zijn er diverse stoffen die de efficiëntie en specificiteit van de hybridisatie kunnen verbeteren [59](#page=59): * **Citraatbuffer en Denhardt's oplossing:** Deze buffers stabiliseren de nucleïnezuren en verminderen achtergrondondersteuning. Denhardt's oplossing bevat ficoll 400, polyvinylpyrrolidon 40 en BSA (Bovine Serum Albumin) [59](#page=59). * **Volume exclusion agentia:** Dextrane sulfaat, PEG 6000-8000 of PVP 40 verhogen de concentratie van de probe in de buurt van het target, wat de kans op interactie vergroot [59](#page=59). * **DTT (Dithiothreitol):** Heeft reducerende eigenschappen [59](#page=59). * **DMSO (Dimethylsulfoxide):** Vermindert de vorming van interne haarspeldstructuren in de nucleïnezuren [59](#page=59). * **Detergentia (Triton X100, SDS, Tween-20):** Bevorderen de diffusie van probes binnen cellen, wat met name nuttig is bij in situ hybridisatie [59](#page=59). * **RNAse inhibitor:** Noodzakelijk bij RNA-hybridisaties om afbraak van het RNA-target of de RNA-probe door ribonuclease-enzymen te voorkomen [59](#page=59). ### 2.4 Hybridisatietijd en C0t ½ De duur van de hybridisatie hangt af van de stringentie, het percentage mismatches, en de lengte van de probe. De ideale hybride-tijd wordt vaak gerelateerd aan de $C_{0}t_{1/2}$, de tijd die nodig is voor de halfwaardereactie van renaturatie van de targetsequentie [60](#page=60). De formule voor $C_{0}t_{1/2}$ (in uren) is: $$C_{0}t_{1/2} = 2 \cdot (\frac{1}{x} \cdot \frac{y}{5} \cdot \frac{z}{10})$$ Waar: * $x$ is het gewicht van de toegevoegde probe in microgram ($\mu$g) [60](#page=60). * $y$ is de complexiteit van de probe, uitgedrukt in kilobasen (Kb) [60](#page=60). * $z$ is het reactievolume in milliliters (ml) [60](#page=60). De incubatietijd kan variëren van enkele tientallen seconden tot een hele nacht, afhankelijk van de specifieke omstandigheden [60](#page=60). ### 2.5 Samenvatting van de hybridisatieprocedure 1. **Denaturatie:** Het doelwit (DNA/RNA) en de probe worden gedenatureerd om enkelstrengs structuren te verkrijgen [62](#page=62). 2. **Hybridisatie:** De gelabelde probe wordt geïncubeerd met het gedenatureerde doelwit onder gecontroleerde condities die afhangen van de probe en het doelwit [62](#page=62). 3. **Wassen:** Stappen om ongebonden probe en kruishybriden te verwijderen [62](#page=62). 4. **Wassen nabij smelttemperatuur:** Helpt bij het verwijderen van zwakke, minder specifieke hybriden [62](#page=62). 5. **Detectie:** Afhankelijk van het type label op de probe (bijv. luminescentie, radioactiviteit, fluorescentie). Moderne methoden maken vaak gebruik van digitale vastlegging via Imagers [61](#page=61) [62](#page=62). Membranen, zoals nylonmembranen, kunnen vaak hergebruikt worden voor meerdere hybridisatierondes (reprobing). Bewaarcondities zijn koel en donker [61](#page=61). --- # Afgeleide hybridisatietechnieken en toepassingen Dit onderwerp bespreekt diverse afgeleide hybridisatietechnieken zoals Southern blot, Northern blot, FISH en DNA micro-arrays, en hun praktische toepassingen in de biotechnologie en klinische diagnostiek [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.1 Introductie tot afgeleide hybridisatietechnieken Afgeleide hybridisatietechnieken maken gebruik van het principe van complementaire baseparing tussen een gelabelde probe en een doelwit-nucleïnezuursequentie. Deze technieken zijn veelzijdig en worden toegepast voor het detecteren van specifieke DNA- of RNA-sequenties. Ze omvatten technieken zoals dot blot, colony lift, Southern blot, Northern blot, FISH en DNA micro-arrays. Sommige van deze technieken, zoals line probe assay en micro-array, worden beschouwd als reverse hybridisatietechnieken [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65). ### 3.2 Dot blot De dot blot techniek is een methode voor membraan- of filterhybridisatie. Hoewel niet gedetailleerd beschreven in dit gedeelte, wordt het vermeld als een toepassing van probe hybridisatie [65](#page=65) [66](#page=66). ### 3.3 Colony and Plaque Lift Colony en plaque lift zijn typische toepassingen in de biotechnologie voor het detecteren van specifieke klonen. Het proces omvat de transfer van kolonies of plaques op een filter, waarna DNA wordt vrijgemaakt uit de bacteriën en gebonden aan het filter. Vervolgens wordt het DNA gedenatureerd, het membraan geprehybridiseerd en een gelabelde enkelstrengs DNA (ssDNA) probe toegevoegd. Na het wegwassen van ongebonden en mismatchende probes kan de detectie plaatsvinden. Dit wordt gebruikt voor de detectie van specifieke klonen [67](#page=67) [68](#page=68). ### 3.4 Southern blot De Southern blot techniek wordt gebruikt voor de analyse van DNA. Het is een membraanhybridisatietechniek [66](#page=66) [70](#page=70). #### 3.4.1 Toepassingen van Southern blot De Southern blot heeft diverse klinische en genetische manipulatietoepassingen [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74). * **Klinische toepassingen:** * Detectie van repeat expansies, zoals bij de ziekte van Huntington [72](#page=72) [73](#page=73). * **Genetische manipulatie toepassingen:** * Screeningstrategieën om onbedoeld geïntroduceerd recombinant DNA (rDNA) te detecteren bij genetisch gemodificeerde planten [74](#page=74). #### 3.4.2 RFLP – Southern blot Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), in combinatie met detectie via Southern blot, wordt gebruikt voor verschillende doeleinden [75](#page=75). * **Detectie van Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs):** Dit wordt gedaan met behulp van restrictie-enzymen (RE) [75](#page=75). * **Detectie van specifieke methylatie:** Dit gebeurt met behulp van methylatie-gevoelige restrictie-enzymen [75](#page=75). * **Detectie van andere mutaties:** RFLP kan gebruikt worden om verschillende soorten mutaties te detecteren [77](#page=77). * **Typing/fingerprinting:** * Het detecteren van verplaatsingen van insertion sequences (transposons) is kenmerkend voor bacteriële stammen, wat kan worden gebruikt om de graad van verwantschap te bepalen of bacteriën te genotyperen. Het proces omvat een restrictiedigest, het laden van DNA op een gel, een blot en een probe tegen het IS-element [78](#page=78) [79](#page=79). ### 3.5 Northern blot De Northern blot wordt gebruikt voor de analyse van (messenger) RNA ((m)RNA). Het is een membraanhybridisatietechniek [66](#page=66) [70](#page=70). * **Toepassingen:** * Het bepalen van de relatieve aanwezigheid van genexpressie [70](#page=70). * Het identificeren van de relatieve aanwezigheid van isovormen [70](#page=70). * Voorbeeld: Verschillende isovormen van EGFR kunnen detecteerbaar zijn in pancreas vs. pancreas kanker [71](#page=71). ### 3.6 FISH en ISH ((Fluorescent) In Situ Hybridisation) In situ hybridisatie (ISH) en Fluorescent In Situ Hybridisatie (FISH) houden in dat hybridisatie plaatsvindt in een morfologische context, zoals specifieke weefsels, celtypes of chromosomen. Het doelwit kan DNA of RNA zijn [80](#page=80). * **Merking van de probe:** * **Fluorescent:** Dit leidt tot FISH en detectie met een fluorescentiemicroscoop [80](#page=80). * **Biotine:** Detectie gebeurt via een streptavidine- of enzymconjugaat en een microscoop [80](#page=80). #### 3.6.1 Preparaten voor FISH en ISH Diverse preparaten kunnen worden gebruikt voor FISH en ISH [83](#page=83): * Metafase preparaten van chromosomen [83](#page=83) [97](#page=97). * (Interfase) preparaten [83](#page=83). * Cytospins [83](#page=83). * Weefselcoupes [83](#page=83). * Biofilm [83](#page=83). #### 3.6.2 Preparatie en hybridisatie stappen Voorafgaande behandelingen omvatten fixatie van preparaten, het vrijmaken van het doelwit met proteasen, permeabilisatie van cellen met vetoplossende middelen, DNAse behandeling bij hybridisatie met RNA, en RNAse behandeling bij hybridisatie met DNA. Tijdens de hybridisatie en het wassen moet de stringëntie bereikt worden zonder een te hoge temperatuur [89](#page=89). #### 3.6.3 Praktische benaderingen en controles Het is essentieel om zowel positieve als negatieve controles te gebruiken [91](#page=91). * **Positieve controle:** Om te verifiëren of de probe en het experiment de gewenste detectie uitvoeren [91](#page=91). * **Negatieve controle (zonder probe):** Om auto-fluorescentie te controleren [91](#page=91). Hoewel het proces vaak manueel wordt uitgevoerd, zijn er ook geautomatiseerde ISH-systemen beschikbaar, variërend van gedeeltelijk geautomatiseerd tot volledig geautomatiseerd [91](#page=91). #### 3.6.4 Toepassingen van FISH en ISH FISH en ISH hebben een breed scala aan toepassingen [85](#page=85): 1. **Detectie van specifieke sequenties in een cellulair genoom:** Dit wordt gebruikt om cellen met DNA-afwijkingen op te sporen [85](#page=85). * **Voorbeeld:** * FISH op metafase preparaten kan telomeer-specifieke sequenties en dystrofine (allel)-specifieke sequenties (gen op chromosoom X) detecteren, samen met X-centromeer specifieke probes [93](#page=93). * Het opsporen van chromosomale afwijkingen zoals translocaties, amplificaties en deleties in kwaadaardige gezwellen, wat veel toepassingen heeft in de oncologie. Een bekend voorbeeld is de detectie van de bcr/abl herschikking geassocieerd met chronische myogene leukemie [94](#page=94). * FISH testen, zoals de Vysis PathVision van Abbott Molecular, worden gebruikt voor de analyse van de humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) en de chromosoom 17 centromeersequentie (CEN17) bij borstkanker om genamplificatie te detecteren [96](#page=96) [97](#page=97). 2. **PNA-FISH screening op microbiële preparaten (bloed/biofilms):** Hierbij worden rRNA-targets gebruikt die specifiek zijn voor bepaalde bacteriën [85](#page=85) [86](#page=86). 3. **Genexpressie beeldvorming:** Het visualiseren van genexpressie in multicellulaire organismen/weefsels, typisch voor FBT-toepassingen. Dit gebeurt met mRNA-specifieke FISH [85](#page=85). * **Voorbeeld:** In situ hybridisatie van *Drosophila* embryo’s op verschillende ontwikkelingsstadia voor het mRNA van het gen "hunchback", wat de specifieke cel- of locatiedistributie van genexpressie aantoont [87](#page=87). #### 3.6.5 Problemen bij FISH en ISH Er zijn diverse problemen die de balans tussen het behoud van DNA/RNA-targets en de hybridisatie kunnen beïnvloeden, waaronder problemen met loslaten van coupes, diffusie, gevoeligheid van probes en detectiesystemen, uitspoeling, basenverlies (depurinering) en verlies van celmorfologie [98](#page=98). ### 3.7 DNA micro-array DNA micro-arrays worden vermeld als een reverse hybridisatietechniek. Verdere details over de werking of toepassingen zijn niet opgenomen in de verstrekte tekst [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.8 Target enrichment Target enrichment, een voorbereidende stap voor sequencing, wordt genoemd als een toepassing van probe hybridisatie. Verdere details zijn niet beschikbaar in de verstrekte tekst [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.9 qPCR (real time) Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) wordt genoemd als een toepassing die gebruikmaakt van probe hybridisatie. Verdere details zijn niet opgenomen in de verstrekte tekst [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.10 Bevestiging van identiteit en kwantificering Probe hybridisatie kan worden gebruikt voor de bevestiging van de identiteit van gedetecteerde sequenties, vaak in combinatie met een primerset en probe. Tevens biedt het de mogelijkheid tot kwantificering [65](#page=65). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Probe | Een gemerkte enkelstrengs DNA- of RNA-molecuul die specifiek bindt aan een complementaire doelsequentie door middel van hybridisatie. | | Doelwit (Target) | Het enkelstrengs DNA- of RNA-molecuul dat wordt gedetecteerd met behulp van een complementaire, gemerkte probe. | | Hybridisatie | Het proces waarbij twee complementaire enkelstrengs nucleïnezuurstrengen, zoals een probe en een doelwit, met elkaar binden om een dubbelstrengs structuur te vormen. | | Denaturatie | Het proces waarbij dubbelstrengs DNA wordt omgezet in enkelstrengs DNA, meestal door verhitting of chemische middelen, om hybridisatie mogelijk te maken. | | Blotten | De techniek waarbij DNA, RNA of eiwitten van een gel worden overgebracht naar een vast medium, zoals een membraan, om verdere analyse mogelijk te maken. | | Southern blot | Een techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-sequenties in een mengsel van DNA te identificeren door middel van hybridisatie met een complementaire probe na een restrictie-enzymdigest en elektroforese. | | Northern blot | Een techniek die wordt gebruikt om specifieke RNA-sequenties in een mengsel van RNA te identificeren door middel van hybridisatie met een complementaire probe na elektroforese. | | FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) | Een techniek die fluorescent gelabelde probes gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties direct te visualiseren in cellen of weefsels, vaak op chromosomen. | | Prehybridisatie | Een stap voorafgaand aan de hybridisatie waarbij onbezette bindingsplaatsen op het membraan worden geblokkeerd met niet-specifiek DNA om aspecifieke binding van de probe te voorkomen. | | Stringentie | De reactieomstandigheden (temperatuur, zoutconcentratie, pH) waaronder een hybridisatie plaatsvindt, die de specificiteit van de probe-target binding bepalen. Hoge stringentie vereist perfecte complementariteit. | | Tm (Smelttemperatuur) | De temperatuur waarbij de helft van de dubbelstrengs DNA-moleculen is gedissocieerd tot enkelstrengs moleculen. Dit is een belangrijke parameter bij het bepalen van hybridisatiecondities. | | Kruishybridisatie | Het ongewenste fenomeen waarbij een probe bindt aan een niet-doelwitsequentie die slechts gedeeltelijk complementair is. Dit wordt geminimaliseerd door geschikte stringentiecondities. | | Reporter | Een molecuul (bijvoorbeeld een enzym of een fluorochroom) dat gekoppeld is aan een probe en wordt gebruikt voor de detectie van de hybridisatie. | | Chemiluminescentie | Een detectiemethode waarbij licht wordt geproduceerd door een chemische reactie, vaak gebruikt in combinatie met enzymatische reporters om signalen van hybridisatie te versterken. | | Enzymatische synthese | De productie van probes door middel van enzymen, zoals reverse transcriptase of DNA-polymerase, vaak in combinatie met gemerkte nucleotiden. | | Radioactieve labeling | Het proces waarbij probes worden gemerkt met radioactieve isotopen, zoals $^32$P of $^35$S, voor detectie via autoradiografie of phospho-imaging. | | Fluorescente labeling | Het proces waarbij probes worden gemerkt met fluorescerende moleculen (fluorochromen) die licht uitzenden wanneer ze worden geëxciteerd, voor detectie met een fluorescentiemicroscoop. | | Biotine-labeling | Een methode waarbij probes worden gemerkt met biotine, dat vervolgens wordt gedetecteerd via interactie met streptavidine-conjugaat dat is gekoppeld aan een reporter. | | Digoxigenine-labeling | Een methode waarbij probes worden gemerkt met digoxigenine, dat vervolgens wordt gedetecteerd via interactie met een antilichaam tegen digoxigenine, dat is gekoppeld aan een reporter. | | RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) | Variaties in DNA-sequenties die leiden tot verschillende fragmentlengtes na restrictie-enzymdigest, gedetecteerd met Southern blotting. | | DNA micro-array | Een techniek waarbij duizenden DNA-probes op een vast oppervlak (meestal een glazen drager) worden bevestigd om tegelijkertijd de expressie van vele genen of de aanwezigheid van vele sequenties te analyseren. |

# Introductie en definitie van HACCP Hier is de studiehandleiding voor "Introductie en definitie van HACCP", gebaseerd op de verstrekte documentatie en met inachtneming van alle opmaak- en inhoudelijke instructies. ## 1. Introductie en definitie van HACCP Dit gedeelte introduceert het Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP)-systeem, een internationaal aanvaarde, preventieve methodiek gericht op het waarborgen van voedselveiligheid. ### 1.1 Wat is HACCP? HACCP is een systematische, wetenschappelijk onderbouwde aanpak die specifiek is ontwikkeld voor de voedingsindustrie, maar ook in andere sectoren zoals de farmaceutische industrie wordt toegepast. Het systeem is gericht op het voorkomen van incidenten en garandeert 100% zekerheid met betrekking tot voedselveiligheid. Andere kwaliteitsaspecten vallen buiten het bestek van HACCP. Het acroniem HACCP staat voor: * **H**: Hazard (Gevaren) * **A**: Analysis (Analyse) * **C**: Critical (Kritische) * **C**: Control (Beheersing) * **P**: Points (Punten) Het principe "voorkomen is beter dan genezen" vormt de kern van deze methodiek. ### 1.2 Historiek van HACCP De oorsprong van HACCP ligt in de late jaren '60, toen de Pillsbury Company het systeem ontwikkelde voor de NASA met het doel "veilig voedsel in de ruimte" te produceren. Het falen van een ruimtevlucht door problemen met voedselkwaliteit was onaanvaardbaar. Voor de ontwikkeling van HACCP werden traditionele kwaliteitscontrolemethoden gehanteerd, zoals steekproefsgewijze eindproductcontrole. Deze methoden waren echter: * **Niet betrouwbaar en niet geborgd**: Ze gaven geen 100% zekerheid. * **Niet economisch**: Vaak destructieve testen vereist en grote steekproeven nodig. * **Niet effectief**: Analyses, met name microbiologische, duurden te lang om op de resultaten te wachten. * **Retrospectief (niet preventief)**: Er werd gecontroleerd na de productie, wat betekende dat men achter de feiten aanliep. Het concept van HACCP werd officieel gepresenteerd op de U.S. National Conference on Food Protection in 1971 en later overgenomen door de US-FDA in hun "low acid canned food regulations" in 1973. In de jaren '70 werd het systeem ook door grote voedingsproducenten aangenomen en gepromoot door de Codex Alimentarius. In Europa werden elementen van de HACCP-methodiek opgenomen in diverse richtlijnen (o.a. voor zuivel, vlees, visserij en eiproducten). Een belangrijke doorbraak was de Europese hygiëne-richtlijn 93/43/EEG (1993), die in nationale wetgeving moest worden omgezet. In België werd dit een officiële verplichting sinds oktober 1997. Deze richtlijn is per 1 januari 2006 vervangen door de verordening (EG) nr. 852/2004 betreffende levensmiddelenhygiëne, waarin HACCP nog steeds centraal staat. ### 1.3 Definitie en Toelichting HACCP is een **methodiek** die systematisch is ontworpen voor de voedingsindustrie en gericht is op het voorkomen van incidenten. De studie die aan HACCP ten grondslag ligt, moet gebaseerd zijn op een wetenschappelijke basis. Het systeem garandeert dat het product veilig is om te consumeren. > **Tip:** Het is belangrijk om het onderscheid te begrijpen tussen preventieve maatregelen (PRP's) en kritische beheersingspunten (CCP's). PRP's zorgen voor een hygiënische basis, terwijl CCP's specifieke kritische punten in het proces zijn waar beheersing essentieel is voor voedselveiligheid. ### 1.4 HACCP-certificaten en HACCP-producten Er bestaan commerciële organisaties die HACCP-certificaten uitgeven voor producten, ook voor non-foodproducten, gebaseerd op een reeks criteria. Dit omvat bijvoorbeeld materialen, toxiciteit, contaminatierisico's, reinigbaarheid, verpakking en labelling. Voorbeelden hiervan zijn Dyson Airblade Tap en organisaties zoals EHEDG. Het is echter cruciaal te beseffen dat de *HACCP-methodiek* waar deze studie over gaat, niet primair over dergelijke productcertificaten gaat, maar over een systematisch beheersingssysteem voor voedselveiligheid. ### 1.5 Het HACCP-plan: Basisvoorwaarden en het Proces Een effectieve implementatie van een HACCP-studie vereist dat deze is ingebed in een breder kwaliteitssysteem, zoals een Food Safety Management System (FSMS). Het HACCP-systeem wordt ondersteund door een reeks basisvoorwaarden, ook wel **Prerequisite Programmes (PRP's)** genoemd. * **PRP's**: Dit zijn algemene maatregelen die minimaal in elk voedingsbedrijf geïmplementeerd moeten zijn. Ze omvatten activiteiten die nodig zijn om een hygiënische omgeving te handhaven en zijn essentieel voor de productie, behandeling en levering van voedselproducten die veilig zijn voor menselijke consumptie. PRP's stellen bedrijven in staat om de HACCP-plannen eenvoudiger te beheren zonder dat de effectiviteit ervan afneemt. * **HACCP-plan**: Dit is de uitwerking van de 7 principes van HACCP, toegepast op een specifiek product en proces. **Uitgangspunten voor een HACCP-plan:** * PRP's zijn geïmplementeerd. * Voedselfraude wordt buiten beschouwing gelaten, aangezien dit een andere aanpak vereist. ### 1.6 De Vijf Voorafgaande Stappen van een HACCP-studie Voordat de 7 principes van HACCP worden toegepast, moeten vijf voorafgaande stappen worden doorlopen om de basis te leggen voor de HACCP-studie: 1. **HACCP-team samenstellen**: Een multidisciplinair team wordt geformeerd, bestaande uit vertegenwoordigers van alle betrokken onderdelen van het bedrijf (productie, kwaliteit, reiniging, opslag, distributie, eindgebruik). Operators en externe specialisten kunnen worden betrokken. Het team is verantwoordelijk voor het HACCP-plan en moet kennis en ervaring hebben van het bedrijf, het product, potentiële gevaren en relevante expertisegebieden zoals microbiologie, hygiëne of levensmiddelentechnologie. 2. **Beschrijf het voedsel en zijn distributie**: Het eindproduct moet volledig worden beschreven, inclusief wettelijke criteria, houdbaarheidsperiode en -type (THT/TGT), en kenmerken die het groeipotentieel van micro-organismen beïnvloeden. Dit omvat: * **Intrinsieke factoren**: Kenmerken van het levensmiddel zelf, zoals de wateractiviteit ($a_w$), pH, redoxpotentiaal en antimicrobiële stoffen. Cruciale grenswaarden voor de groei van pathogenen zijn hierbij van belang. * **Extrinsieke of omgevingsfactoren**: Factoren zoals proces- en verpakkingsparameters, opslag- en distributieomstandigheden (temperatuur, relatieve luchtvochtigheid, gassamenstelling verpakking). * **Impliciete factoren**: Verbanden met micro-organismen zelf, zoals interacties tussen micro-organismen of tussen micro-organismen en het levensmiddel. Deze kunnen intrinsieke factoren wijzigen, wat weer invloed heeft op de microbiële groei. Synergisme en antagonisme tussen micro-organismen spelen hierbij een rol. 3. **Beschrijf het normale (bedoelde) gebruik**: Dit omvat het verwachte gebruik van het product, of het ready-to-eat is of een verdere bereidingsstap vereist. Ook de normale gebruikersgroep (thuisverbruik, grootverbruik, risicogroepen zoals YOPI's - Young, Old, Pregnant, Immunocompromised) en potentieel misbruik (bv. onvoldoende koude, consument respecteert baktijden niet) worden in kaart gebracht. 4. **Beschrijf het proces in een flowdiagram**: Een gedetailleerd flowdiagram wordt opgesteld dat alle processtappen omvat, inclusief tussentijdse opslag, wachttijden, ontdooistappen, gebruikte ingrediënten, verpakkingsmaterialen, technologische hulpstoffen en nutsvoorzieningen. Er wordt aandacht besteed aan de lineaire flow, productcrossings, uitvalstromen en eventuele herverwerking, evenals high- en low-risk gebieden. Het is hierbij essentieel om een processtap te onderscheiden van een maatregel. Een maatregel is louter toegevoegd om risico's te beperken en is niet noodzakelijk voor de productie van het levensmiddel zelf. 5. **Verifieer het flowdiagram**: De correctheid en volledigheid van het flowdiagram worden geverifieerd op de werkvloer, op verschillende tijdstippen en onder diverse omstandigheden (bv. weekend, nacht, opstart, einde productie, reiniging). ### 1.7 De Zeven Principes van HACCP Na het doorlopen van de vijf voorafgaande stappen, worden de zeven principes van HACCP toegepast: 1. Voer een gevarenanalyse uit. 2. Bepaal de kritische beheersingspunten (CCP's). 3. Stel grenswaarden vast per CCP. 4. Ontwikkel een monitoringsysteem voor de CCP's. 5. Definieer de regels voor bijsturing bij afwijkingen. 6. Implementeer verificatieprocedures. 7. Zorg voor documentatie en registratie. Deze principes vormen de basis voor het opstellen van een HACCP-plan, dat een essentieel onderdeel is van een effectief Food Safety Management System. --- # Het HACCP-plan en basisvoorwaarden Dit onderdeel legt de noodzaak uit van een kwaliteitsmanagementsysteem en de rol van basisvoorwaarden (PRP's) in relatie tot het HACCP-plan, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen operationele en basisvoorwaarden. ### 2.1 De noodzaak van een kwaliteitsmanagementsysteem Een HACCP-systeem is een verplicht, internationaal aanvaard, preventief systeem gericht op voedselveiligheid. Het staat voor Hazard Analysis Critical Control Points (Gevarenanalyse Kritische Beheersingspunten). Het doel is om incidenten te voorkomen en een 100% zekere voedselveiligheid te waarborgen. Traditionele kwaliteitscontrole, gebaseerd op steekproefsgewijze eindproductcontrole, is niet betrouwbaar, economisch of effectief, en werkt retrospectief in plaats van preventief. ### 2.2 De rol van basisvoorwaarden (PRP's) Een effectief HACCP-plan kan enkel geïmplementeerd worden binnen een breder kwaliteitssysteem, waarin HACCP een wezenlijk onderdeel vormt van een Food Safety Management System (FSMS). Dit FSMS wordt ondersteund door een reeks basisvoorwaarden, ook wel Prerequisite Programmes (PRP's) genoemd. * **Definitie PRP's:** PRP's zijn algemene maatregelen die minimaal in elk voedingsbedrijf geïmplementeerd moeten zijn. Het zijn activiteiten die nodig zijn om een hygiënische omgeving te handhaven, geschikt voor de productie, behandeling en levering van eindproducten en voedingsmiddelen die veilig zijn voor menselijke consumptie. Ze vormen de minimale eisen om te mogen produceren. * **Onderscheid tussen operationele en basisvoorwaarden:** * **Basisvoorwaarden (PRP's):** Deze zijn voorafgaand aan het productieproces en zorgen voor een algemeen hygiënische en veilige werkomgeving. Voorbeelden hiervan zijn: * Infrastructuur die in orde is. * Maatregelen ter voorkoming van kruisbesmettingen. * Food defense maatregelen. * Effectieve reiniging. * Professionele ongediertebestrijding. * Correcte persoonlijke hygiëne. * **Operationele voorwaarden (gelinkt aan het proces):** Deze zijn specifiek gekoppeld aan het productieproces zelf en worden gedefinieerd binnen het HACCP-plan. * **Voordelen van PRP's:** PRP's zorgen ervoor dat HACCP-plannen zelf eenvoudiger te beheren zijn zonder dat ze minder effectief worden. Ze vormen de uitgangspunten voor het HACCP-plan; het is essentieel dat deze PRP's geïmplementeerd zijn voordat het HACCP-plan wordt opgesteld. > **Tip:** Het is cruciaal om het verschil te begrijpen tussen een basisvoorwaarde (PRP) en een HACCP-voorwaarde (vaak een Kritisch Controlepunt of CCP). PRP's creëren de veilige basis, terwijl HACCP specifieke gevaren in het proces identificeert en beheerst. ### 2.3 Het opstellen van een HACCP-plan Het opstellen van een HACCP-plan omvat doorgaans vijf voorafgaande stappen, gevolgd door de zeven principes van HACCP. #### 2.3.1 De vijf voorafgaande stappen 1. **HACCP-team samenstellen:** * Een multidisciplinair team is vereist, waarin alle bij het product betrokken onderdelen van het bedrijf vertegenwoordigd zijn (productie, kwaliteit, reiniging, opslag, distributie, eindgebruik). Operators en eventueel externe specialisten dienen betrokken te worden. Hoger management moet ook deelnemen. * Het team is "eigenaar" van het HACCP-plan en moet kennis en ervaring beschikken met HACCP, de onderneming, het product en potentiële gevaren, evenals specifieke kennis op het gebied van microbiologie, hygiëne of levensmiddelentechnologie. 2. **Beschrijf het voedsel en zijn distributie:** * Het eindproduct moet volledig beschreven worden, inclusief wettelijk bepaalde criteria, houdbaarheidsperiode/type houdbaarheidsdatum (THT/TGT), en kenmerken die bepalend zijn voor het groeipotentieel van pathogene micro-organismen. * Hierbij wordt onderscheid gemaakt tussen: * **Intrinsieke factoren:** Kenmerken van het levensmiddel zelf (bv. wateractiviteit $a_w$, pH, redoxpotentiaal, antimicrobiële stoffen). De belangrijkste zijn pH en $a_w$. Specifieke grenswaarden voor de groei of toxineproductie van pathogenen zijn gedefinieerd, bv. $a_w \le 0.88$ of $pH \le 3.9$ om groei algemeen onmogelijk te maken. * **Extrinsieke of omgevingsfactoren:** Factoren zoals proces- en verpakkingsparameters, opslag- en distributieomstandigheden (bv. temperatuur, relatieve luchtvochtigheid, gassamenstelling van de verpakking). * **Impliciete factoren:** Verbanden met micro-organismen zelf, inclusief interacties tussen micro-organismen en met het levensmiddel. De microbiële groei kan intrinsieke factoren wijzigen (bv. door metabolisme), wat de groei van andere microbiële groepen kan beïnvloeden (synergisme en antagonisme). > **Example:** Bij de bereiding van yoghurt door de mengcultuur van *Lactobacillus bulgaricus* en *Streptococcus thermophilus*, verbruiken beide lactose met melkzuurvorming (pH-verlaging), wat de groei van beide selectief stimuleert. 3. **Beschrijf het normale (bedoelde) gebruik:** * Dit omvat het verwachte gebruik (bv. ready-to-eat, verdere bereidingsstap, ingrediënt) en de beoogde gebruikersgroep (bv. thuisverbruik, grootverbruik, risicogroepen zoals baby's, bejaarden, zwangere vrouwen, immunodepressieven - YOPI's). * Ook aandacht voor mogelijk of gekend misbruik (bv. huishoudfrigo's die onvoldoende koud zijn, consument die product toch rauw eet). 4. **Beschrijf het proces in een flowdiagram:** * Een gedetailleerde flowchart moet alle processtappen omvatten, inclusief tussentijdse opslag, wachttijden, ontdooistappen, ingrediënten, verpakkingsmaterialen, technologische hulpstoffen en nutsvoorzieningen. * Er moet aandacht zijn voor lineaire flow, productcrossings, uitvalstromen, eventuele herverwerking, en high & low risk areas. * **Belangrijk:** Er moet een duidelijk onderscheid gemaakt worden tussen een processtap (nodig om het product te maken) en een maatregel (toegevoegd om risico's te beperken, bv. een metaaldetector). Een metaaldetector die niet nodig is om de soep te produceren, is een maatregel. Als deze ten onrechte als processtap wordt beschouwd, kan het gevaar dat het risico op metaal te laag wordt ingeschat, omdat er een "processtap" aanwezig is die dit zou moeten ondervangen. 5. **Verifieer het flow-chart:** * Dit houdt in een controle van de overeenstemming van de flowchart met de praktijk op de werkvloer, met aandacht voor correctheid en volledigheid. Dit dient te gebeuren op verschillende tijdstippen (bv. weekend, nacht, bij opstart en einde van productie, tijdens reiniging) en voor alle individuele producten die binnen de scope van de studie vallen. #### 2.3.2 De zeven principes van HACCP Na de vijf voorafgaande stappen volgen de zeven principes van HACCP: 1. **Gevarenanalyse (Hazard analysis):** Identificeren van potentiële gevaren (biologisch, chemisch, fysisch). 2. **Bepalen van Kritische Controlepunten (CCP's):** Identificeren van de punten in het proces waar beheersing essentieel is om een gevaar te voorkomen, elimineren of tot een acceptabel niveau te reduceren. 3. **Vastleggen van grenswaarden per CCP:** Definieëren van de acceptabele limieten voor elk CCP. 4. **Monitoringsysteem:** Vaststellen van procedures om de CCP's te monitoren. 5. **Regels voor bijsturing (correctieve acties):** Definiëren welke acties ondernomen moeten worden wanneer monitoring aangeeft dat een CCP niet onder controle is. 6. **Verificatie:** Procedures om te verifiëren of het HACCP-systeem effectief werkt. 7. **Documentatie:** Procedures voor documentatie en registratie om de effectiviteit van het systeem te bewijzen. --- # De vijf voorbereidende stappen van HACCP Dit deel van de studie behandelt de cruciale eerste vijf voorbereidende stappen die nodig zijn voor het opstellen van een HACCP-plan. ## 3. De vijf voorbereidende stappen van HACCP De implementatie van een HACCP-studie vereist een grondige voorbereiding. De eerste vijf stappen zijn essentieel om een solide basis te leggen voor de daaropvolgende analyse van gevaren en het identificeren van kritische beheersingspunten. Deze voorbereidende stappen zorgen voor een gestructureerde en volledige aanpak van het voedselveiligheidssysteem. ### 3.1 Stap 1: Het HACCP-team samenstellen Het succes van een HACCP-plan is mede afhankelijk van de samenstelling van het team dat verantwoordelijk is voor de studie en de implementatie ervan. * **Doel:** Een multidisciplinair team samenstellen dat over de nodige kennis en ervaring beschikt om de HACCP-studie uit te voeren. * **Samenstelling van het team:** * Het team dient alle bij een product betrokken onderdelen van het bedrijf te vertegenwoordigen, waaronder productie, kwaliteit, reiniging, opslag, distributie en eindgebruik. * Operators dienen, indien mogelijk, betrokken te worden. * Externe specialisten kunnen, afhankelijk van de complexiteit, ook deel uitmaken van het team. * Hoger management moet betrokken zijn om het belang van het plan te onderstrepen. * **Vereiste kennis en ervaring:** * Kennis van en ervaring met HACCP-principes. * Diepgaande kennis van de onderneming, het product en de potentiële gevaren die aan het product en het proces verbonden zijn. * Specifieke expertise op het gebied van microbiologie, hygiëne of levensmiddelentechnologie. * **Belangrijk:** Eén persoon kan meerdere rollen binnen het team vervullen. Het team is gezamenlijk eigenaar van het uiteindelijke HACCP-plan. ### 3.2 Stap 2: Beschrijf het voedsel en zijn distributie In deze stap wordt het eindproduct en alle bijbehorende aspecten die relevant zijn voor voedselveiligheid gedetailleerd beschreven. * **Beschrijving van het eindproduct:** * Wettelijk bepaalde criteria die van toepassing zijn op het product. * Houdbaarheidsperiode en het type houdbaarheidsdatum (THT - Ten minste Houdbaar Tot, of TGT - Te Gebruiken Tot). * Kenmerken van het eindproduct die bepalend zijn voor het groeipotentieel van eventueel aanwezige pathogene micro-organismen. * **Factoren die de microbiële groei beïnvloeden:** * **Intrinsieke factoren:** Kenmerken van het levensmiddel zelf, natuurlijk aanwezig of toegevoegd tijdens de verwerking. * **Wateractiviteit ($a_w$):** De hoeveelheid vrij water beschikbaar voor microbiële groei. * **pH:** De zuurgraad van het product. * **Redoxpotentiaal ($E_h$):** De mate van oxidatie-reductie in het product. * **Antimicrobiële stoffen:** Natuurlijke of toegevoegde stoffen die groei remmen. * **Algemene criteria voor het onmogelijk maken van groei/toxineproductie van pathogenen:** * $a_w \leq 0.88$ of $pH \leq 3.9$ * $a_w \leq 0.96$ en $pH \leq 4.2$ * $a_w \leq 0.92$ en $pH \leq 4.6$ * $a_w \leq 0.90$ en $pH \leq 5.0$ Deze criteria gelden ongeacht opslagomstandigheden. * **Criteria voor gepasteuriseerde levensmiddelen (vegetatieve pathogenen geëlimineerd):** * Remming van pathogene sporenvormende bacteriën en/of toxineproductie bij $pH \leq 4.6$ en $a_w \leq 0.92$. * Remming bij $a_w \leq 0.95$ en $pH \leq 5.6$. * Voor waarden die boven deze grenzen vallen, zijn additionele beheersmaatregelen (zoals controle van tijd en temperatuur) vereist. * **Extrinsieke factoren (omgevingsfactoren):** Factoren die verband houden met de omgeving waarin het product wordt verwerkt, opgeslagen of gedistribueerd. * **Proces- en verpakkingsparameters:** Bijvoorbeeld pasteurisatie- of sterilisatietemperatuur. * **Opslag- en distributieomstandigheden:** * Temperatuur: Lagere temperaturen remmen microbiële groei. Geen groei onder $-6$ tot $-10$ °C. * Relatieve luchtvochtigheid. * Gassamenstelling van de verpakkingsatmosfeer (bv. hermetisch, vacuüm, gemodificeerde atmosfeer). * **Impliciete factoren (microbiële interacties):** * Interacties tussen micro-organismen onderling en tussen micro-organismen en het levensmiddel. * Natuurlijk aanwezige micro-organismen of bewust toegevoegde micro-organismen (bv. voor fermentatie). * Contaminanten. * **Wijziging van intrinsieke factoren:** Microbiële groei kan intrinsieke factoren aanpassen door metabolische activiteit, wat de groei van andere micro-organismen kan beïnvloeden. * **Synergisme:** Productie van groeibevorderende stoffen of wijziging van pH/redoxpotentiaal naar gunstigere niveaus voor andere organismen. * **Antagonisme:** Concurrentie om voedingsstoffen of productie van remmende metabolieten (bv. organische zuren, bacteriocines). > **Tip:** Het duidelijk referentiekader, gecreëerd door de productbeschrijving, is ook essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe producten. > **Voorbeeld:** Bij de bereiding van yoghurt werken *Lactobacillus bulgaricus* en *Streptococcus thermophilus* samen. Beide verbruiken lactose en produceren melkzuur, wat de pH verlaagt. Ze produceren ook specifieke metabolieten die elkaar selectief stimuleren. ### 3.3 Stap 3: Beschrijf het normale (bedoelde) gebruik Deze stap richt zich op hoe het product door de consument of in verdere processen gebruikt zal worden, inclusief potentiële risico's die hieruit voortvloeien. * **Verwacht gebruik:** * Is het product "ready-to-eat" (direct consumeerbaar) of vereist het een verdere bereidingsstap (bv. verhitten)? * Wordt het product als ingrediënt gebruikt in een verdere verwerking? * Hoe worden consumenten geïnformeerd via etikettering en instructies? * **Normale gebruikersgroep:** * Thuisverbruik of grootverbruik? * De ganse bevolking of specifieke risicogroepen? * **Risicogroepen (YOPI - Young, Old, Pregnant, Immunocompromised):** Jonge kinderen, ouderen, zwangere vrouwen en personen met een verzwakt immuunsysteem (door ziekte of medicatie) zijn gevoeliger voor voedselgerelateerde ziekten. * **Mogelijk of gekend misbruik:** * Gebruik van huishoudkoelkasten die niet koud genoeg zijn. * Producten die gebakken moeten worden, worden soms rauw gegeten. * Consumenten die baktijden niet altijd respecteren. > **Tip:** Houd rekening met de specifieke kwetsbaarheden van risicogroepen bij het beoordelen van potentiële gevaren. ### 3.4 Stap 4: Beschrijf het proces in een flowdiagram Een gedetailleerd flowdiagram is cruciaal om alle stappen in het productieproces visueel weer te geven en potentieel kritische punten te identificeren. * **Inhoud van het flowdiagram:** * Alle processtappen, inclusief tussentijdse opslag, wachttijden, ontdooistappen, etc. * Alle ingrediënten, verpakkingsmaterialen, technologische hulpstoffen. * Nutsvoorzieningen die in contact komen met levensmiddelen, zoals proceswater, perslucht, ijs. * Distributie stappen. * Aandacht voor lineaire flow en potentiële productkruisbesmettingen. * Uitvalstromen en eventuele herverwerking. * Identificatie van high-risk en low-risk gebieden. * **Belangrijk onderscheid:** * **Processtap:** Een stap die nodig is om het product te maken. Zonder deze stap zou het product niet of niet op de gewenste manier geproduceerd kunnen worden. * **Maatregel:** Een stap die louter is toegevoegd om risico's te beperken en is niet essentieel voor de productie van het levensmiddel zelf. * **Voorbeeld:** Een metaaldetector is een maatregel, geen processtap, omdat het niet nodig is om soep te maken. * **Gevaar van misclassificatie:** * Als een maatregel ten onrechte als processtap wordt beschouwd, kan het gevaar van het betreffende risico (bv. metaalcontaminatie) te laag worden ingeschat, omdat men ervan uitgaat dat de "processtap" (de metaaldetector) het risico al beheerst. Dit kan leiden tot een gevaarlijke cirkelredenering. > **Tip:** Wees zeer kritisch in het onderscheid tussen een noodzakelijke processtap en een toegevoegde veiligheidsmaatregel. ### 3.5 Stap 5: Verifieer het flowdiagram De laatste voorbereidende stap is het verifiëren van het opgestelde flowdiagram op de werkvloer. * **Doel:** Controleren of het flowdiagram de praktijk correct en volledig weerspiegelt. * **Methoden van verificatie:** * **Correctheid en volledigheid:** Nagaan of alle daadwerkelijke stappen, ingrediënten, materialen en omstandigheden zijn opgenomen. * **Verschillende tijdstippen:** Controleer tijdens verschillende diensten (bv. week, nacht) om variaties in de praktijk bloot te leggen. * **Bij opstart en einde productie:** Verifieer de stappen rondom het starten en stoppen van de productielijn. * **Tijdens reiniging:** Controleer of reinigingsprocedures correct zijn geïntegreerd en of er geen risico's ontstaan tijdens dit proces. * **Alle individuele producten:** Zorg ervoor dat het flowdiagram alle producten omvat die binnen de scope van de HACCP-studie vallen. > **Tip:** Een visuele inspectie op de werkvloer, met een checklist gebaseerd op het flowdiagram, is de meest effectieve manier om dit te doen. Deze vijf voorbereidende stappen vormen de basis voor de daaropvolgende toepassing van de zeven HACCP-principes. --- # De zeven principes van HACCP en opdracht Dit onderdeel behandelt de zeven kernprincipes van de HACCP-methodiek en introduceert een opdracht voor het uitvoeren van een eigen HACCP-studie. ## 4.1 De HACCP-methodiek: principes en toepassing HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) is een internationaal erkende, preventieve methodiek gericht op het waarborgen van voedselveiligheid door potentiële gevaren te identificeren en te beheersen. Het is een systematische aanpak die wetenschappelijk onderbouwd is en primair gericht is op het voorkomen van incidenten, waarbij "geborgd" betekent dat iets 100% zeker is. HACCP richt zich specifiek op voedselveiligheid; andere kwaliteitsaspecten vallen hier buiten. De methode wordt vaak ingebed in een breder kwaliteitssysteem, een Food Safety Management System (FSMS), dat ondersteund wordt door basisvoorwaarden, ook wel Prerequisite Programmes (PRP's) genoemd. PRP's zijn algemene maatregelen die nodig zijn om een hygiënische omgeving te handhaven en zijn minimale eisen om te mogen produceren. Ze maken HACCP-plannen eenvoudiger te beheren zonder dat de effectiviteit vermindert. ### 4.1.1 De vijf voorafgaande stappen van een HACCP-studie Voordat de zeven principes van HACCP worden toegepast, moeten vijf voorbereidende stappen worden doorlopen: 1. **Het HACCP-team samenstellen:** Dit team moet multidisciplinair zijn en vertegenwoordigers bevatten van alle bij het product betrokken onderdelen van het bedrijf (productie, kwaliteit, reiniging, opslag, distributie, eindgebruik). Operators en eventuele externe specialisten kunnen ook deel uitmaken van het team. Het team is gezamenlijk eigenaar van het HACCP-plan en moet kennis en ervaring hebben van het bedrijf, het product, potentiële gevaren, microbiologie, hygiëne en levensmiddelentechnologie. 2. **Het voedsel en zijn distributie beschrijven:** Het eindproduct dient volledig te worden beschreven, inclusief wettelijk bepaalde criteria, houdbaarheidsperiode en het type houdbaarheidsdatum (THT/TGT). Kenmerken van het eindproduct die relevant zijn voor het groeipotentieel van micro-organismen moeten worden gespecificeerd. Hierbij wordt onderscheid gemaakt tussen: * **Intrinsieke factoren:** Kenmerken van het levensmiddel zelf, zoals de wateractiviteit ($a_w$), de pH, de redoxpotentiaal en antimicrobiële stoffen. Belangrijk hierbij is dat groei of toxineproductie van pathogenen vaak wordt voorkomen bij bepaalde $a_w$ en pH-waarden, ongeacht opslagomstandigheden. In gepasteuriseerde levensmiddelen kan de uitgroei van pathogene sporenvormende bacteriën en toxineproductie bij specifieke pH- en $a_w$-waarden worden voorkomen, waarvoor mogelijk andere "horden" zoals tijd- en temperatuurcontrole nodig zijn. * **Extrinsieke of omgevingsfactoren:** Factoren die verband houden met het proces en de verpakking, zoals pasteurisatie of sterilisatie, temperatuur tijdens opslag en distributie (hoe lager de temperatuur, hoe lager de microbiële groei), relatieve luchtvochtigheid en de gassamenstelling van de verpakkingsatmosfeer. * **Impliciete factoren:** Factoren die verband houden met micro-organismen zelf, inclusief interacties tussen micro-organismen en met het levensmiddel. De groei van micro-organismen kan intrinsieke factoren wijzigen door hun metabolische werking, wat de groei van andere microben beïnvloedt. Dit kan leiden tot synergisme (productie van groeibevorderaars) of antagonisme (concurrentie om voedingsstoffen, productie van remmende metabolieten). 3. **Het normale (bedoelde) gebruik beschrijven:** Dit omvat de verwachte toepassing van het product (ready-to-eat of verdere bereidingsstap), de normale gebruikersgroep (thuisverbruik, grootverbruik, risicogroepen zoals baby's, ouderen, zwangere vrouwen, immunodepressieven - YOPI's) en aandacht voor mogelijk misbruik (bv. onvoldoende koude huishoudfrigo's). 4. **Het proces beschrijven in een flowdiagram:** Een gedetailleerd flowdiagram moet alle processtappen bevatten, inclusief tussentijdse opslag, wachttijden, ontdooistappen, en alle ingrediënten, verpakkingsmaterialen, technologische hulpstoffen en nutsvoorzieningen (zoals proceswater, perslucht, ijs) die in contact komen met het levensmiddel. Ook distributie, productcrossings, uitvalstromen en eventuele herverwerking moeten worden opgenomen. Hierbij is het belangrijk een onderscheid te maken tussen een processtap (noodzakelijk om het product te maken) en een maatregel (toegevoegd om risico's te beperken). 5. **Het flowdiagram verifiëren:** Dit is een controle van de overeenstemming van het flowdiagram met de praktijk op de werkvloer, waarbij de correctheid en volledigheid op verschillende tijdstippen (week, nacht, bij opstart en einde productie) en tijdens reiniging wordt getoetst. Alle individuele producten die onder de scope van de studie vallen, moeten hierbij betrokken worden. ### 4.1.2 De zeven principes van HACCP Nadat de voorbereidende stappen zijn voltooid, worden de volgende zeven principes toegepast: 1. **Gevarenanalyse (Hazard Analysis):** Identificeren van alle potentiële biologische, chemische en fysische gevaren die geassocieerd kunnen worden met het product of het proces. 2. **Bepalen van kritische beheersingspunten (Critical Control Points - CCP's):** Identificeren van de punten, stappen of procedures in het proces waar beheersing essentieel is om een gevaar te elimineren of tot een aanvaardbaar niveau te reduceren. 3. **Vastleggen van grenswaarden per CCP (Establish Critical Limits):** Bepalen van de acceptabele limieten voor elke CCP. Deze limieten moeten voldoen aan wettelijke eisen, wetenschappelijke inzichten en/of specifieke productnormen. 4. **Opzetten van een monitoringsysteem (Establish a Monitoring System):** Ontwikkelen van een systeem om de CCP's te bewaken en de kritische grenswaarden te controleren. Dit omvat de frequentie en methode van bewaking. 5. **Vastleggen van corrigerende maatregelen (Establish Corrective Actions):** Definiëren van de acties die moeten worden ondernomen wanneer monitoring aangeeft dat een kritische grenswaarde niet is gehaald of dat het proces niet onder controle is. 6. **Verificatie (Establish Verification Procedures):** Vaststellen van procedures om te bevestigen dat het HACCP-systeem naar behoren functioneert. Dit omvat periodieke controles, audits en testen. 7. **Documentatie (Establish Documentation and Record-keeping):** Opzetten van een systeem voor het vastleggen en bewaren van alle documenten en gegevens die verband houden met de HACCP-studie en de implementatie ervan, waaronder analyses, beslissingen, monitoringsresultaten en corrigerende maatregelen. ### 4.1.3 Opdracht: HACCP-studie uitvoeren Als onderdeel van de studie dient een eigen HACCP-studie te worden uitgevoerd in groepen van maximaal vier studenten. **Te volgen stappen:** * **Kies een product en de bijbehorende verpakking.** * **Beschrijf het productieproces gedetailleerd.** * **Identificeer potentiële besmettingen voor de grondstoffen van het gekozen product.** * **Definieer preventieve maatregelen voor deze besmettingen.** * **Onderzoek de wettelijke aspecten en mogelijke contaminanten van de grondstoffen.** * **Volg rigoureus de HACCP-methode, inclusief de vijf voorafgaande stappen en de zeven principes.** De presentatie van de HACCP-studie vindt plaats in week 14. Tegen de volgende sessie dienen de keuze van het onderwerp, de uitwerking van het productieproces, de identificatie van producteigen besmettingen en de bijbehorende preventieve maatregelen, en de wettelijke aspecten en contaminanten van de grondstoffen gereed te zijn. Het doel van de opdracht is de correcte toepassing van de HACCP-methode. > **Tip:** Het is cruciaal om het verschil te begrijpen tussen een processtap en een maatregel binnen het flowdiagram. Een metaaldetector bijvoorbeeld, is een maatregel en geen processtap, omdat het niet noodzakelijk is voor de productie van het levensmiddel zelf. Als een maatregel ten onrechte als processtap wordt beschouwd, kan dit leiden tot een onderschatting van het risico. > **Tip:** Voedselfraude wordt buiten beschouwing gelaten in de standaard HACCP-aanpak, omdat dit een deterministisch proces betreft dat een andere aanpak vereist. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | HACCP | Hazard Analysis Critical Control Points; een internationaal aanvaarde methodiek en preventief systeem voor voedselveiligheid dat bedrijven helpt bij het identificeren, evalueren en beheersen van gevaren. | | Gevaar (Hazard) | Een biologische, chemische of fysische stof in het voedsel of de toestand van het voedsel die een potentieel nadelig effect kan hebben op de gezondheid van de consument. | | Analyse (Analysis) | Het proces van het identificeren en evalueren van gevaren en de waarschijnlijkheid dat deze voorkomen in een bepaald voedselproduct of productieproces. | | Kritische beheersingspunten (Critical Control Points - CCP) | Een stap in het proces waar beheersing essentieel is om een gevaar voor de voedselveiligheid te voorkomen, te elimineren of te reduceren tot een acceptabel niveau. | | Beheersing (Control) | Het nemen van maatregelen om de mate van optreden van een gevaar te minimaliseren. | | Punten (Points) | De specifieke locaties in het proces waar kritische beheersingsmaatregelen worden toegepast. | | PRP (Pre-requisite Program) | Een basisvoorwaarde of operationeel programma dat nodig is om een hygiënische omgeving te handhaven voor de productie, behandeling en levering van veilige voedingsmiddelen. | | Operationeel PRP (oPRP) | Een maatregel die wordt genomen om de waarschijnlijkheid van het optreden van een gevaar te elimineren of tot een acceptabel niveau te reduceren, en die van toepassing is vóór het product de CCP-fase bereikt. | | Flowdiagram | Een visuele weergave van alle stappen in een productieproces, inclusief tussentijdse opslag, wachttijden en ontdooistappen, gebruikt om het proces grondig te analyseren. | | Intrinsieke factoren | Kenmerken van het levensmiddel zelf, zoals wateractiviteit (a_w), pH, redoxpotentiaal en antimicrobiële stoffen, die de groei van micro-organismen beïnvloeden. | | Extrinsieke factoren | Omgevingsfactoren zoals proces- en verpakkingsparameters, opslag- en distributieomstandigheden, die de microbiële groei en voedselveiligheid beïnvloeden. | | Impliciete factoren | Factoren die verband houden met micro-organismen zelf en hun interacties, inclusief synergetische en antagonistische effecten tussen verschillende micro-organismen. | | Wateractiviteit (a_w) | De hoeveelheid "vrij" water in een levensmiddel dat beschikbaar is voor microbiële groei en chemische reacties; een cruciale factor in voedselveiligheid. | | pH | Een maat voor de zuurgraad van een stof, die ook een belangrijke rol speelt in de controle van microbiële groei in voedingsmiddelen. | | THT/TGT | Houdbaarheidsdatum (Ten minste Houdbaar Tot) en Te Gebruiken Tot datum; aanduidingen op de verpakking die de versheid en veiligheid van het product aangeven. |