ilovepdf_merged.pdf

# Inleiding tot chromatografie en scheidingsmethoden Dit deel introduceert de noodzaak van scheidingsmethoden om interfererende stoffen te verwijderen, met specifieke aandacht voor vloeistof-vloeistofextractie (LLE) en de principes van chromatografie [2](#page=2). ### 1.1 Noodzaak van scheidingsmethoden Bij analytische technieken kan de selectiviteit van de analysetechniek onvoldoende zijn, waardoor interfererende of storende stoffen aanwezig zijn in het monster. Om deze interferenties te scheiden van het te analyseren component (het analyt), zijn scheidingsmethoden essentieel [3](#page=3). ### 1.2 Vloeistof-vloeistofextractie (LLE) Vloeistof-vloeistofextractie (LLE) is een methode om interferenties af te scheiden. Het principe berust op de verdeling van componenten tussen twee niet-mengbare vloeistoffen. Een voorbeeld is de extractie van trijodide-oplossing in water met c-hexaan. De mate waarin een component oplost in de ene of de andere vloeistof hangt af van de affiniteit van die component voor de betreffende fase. Eén extractiestap leidt doorgaans niet tot een goede scheiding, maar meerdere extractiestappen, waarbij zowel uit de bovenste als de onderste vloeistof wordt geëxtraheerd, kunnen leiden tot een volledige scheiding van het analyt en storende stoffen [4](#page=4) [5](#page=5). > **Tip:** LLE illustreert een fundamenteel principe dat ook ten grondslag ligt aan chromatografie: de verdeling van stoffen tussen twee fasen [5](#page=5). ### 1.3 Chromatografie Chromatografie omvat een reeks scheidingstechnieken waarbij componenten van een mengsel worden verdeeld tussen twee fasen. Eén van deze fasen is stationair, terwijl de andere fase (de mobiele fase) in een bepaalde richting beweegt. De componenten van het mengsel verplaatsen zich met verschillende snelheden, afhankelijk van hun interactie met de stationaire en de mobiele fase. Stoffen met een grotere affiniteit voor de mobiele fase zullen sneller worden geëlueerd (uitgespoeld) dan stoffen die sterker aan de stationaire fase binden [6](#page=6). > **Tip:** Het sleutelwoord in chromatografie is de differentiële verplaatsing van componenten, gedreven door hun interactie met de twee fasen [6](#page=6). De voortgang van de scheiding wordt gevolgd door een detector aan het einde van de kolom, die de eluerende stoffen registreert. Het resultaat van een chromatografische scheiding is een chromatogram [8](#page=8) [9](#page=9). ### 1.4 Indeling van chromatografie Chromatografie kan op verschillende manieren worden ingedeeld: #### 1.4.1 Op basis van de mobiele fase * **Gaschromatografie (GC):** De mobiele fase is een gas [10](#page=10). * **Vloeistofchromatografie (LC):** De mobiele fase is een vloeistof [10](#page=10). #### 1.4.2 Op basis van de configuratie van de stationaire fase * **Kolomchromatografie:** De stationaire fase bevindt zich in een glazen of metalen buis (kolom). De mobiele fase kan onder invloed van zwaartekracht, capillaire krachten of druk door de kolom bewegen [10](#page=10) [11](#page=11). * **Planaire chromatografie:** De stationaire fase bevindt zich op een plaat (bv. dunne laag chromatografie - TLC) of op papier (papierchromatografie - PC) [10](#page=10). #### 1.4.3 Op basis van het scheidingsmechanisme (relatie tot de stationaire fase) * **Verdelingschromatografie:** Scheiding gebaseerd op het verschil in oplosbaarheid (verdeling) van componenten tussen een stationaire vloeistoffase en een mobiele fase [12](#page=12). * **Adsorptiechromatografie:** Scheiding gebaseerd op het verschil in adsorptie van componenten aan een vaste, stationaire fase [12](#page=12). * **Ionuitwisselingschromatografie:** Scheiding gebaseerd op de interactie van geladen componenten met ionen uitwisselingsharsen [12](#page=12). * **Moleculaire zeef (Gelfiltratie/Gelpermeatie):** Scheiding gebaseerd op grootte, waarbij grotere moleculen sneller worden geëlueerd omdat ze de poriën van de stationaire fase niet kunnen betreden [12](#page=12). ### 1.5 Courante chromatografische technieken Hieronder een overzicht van veelgebruikte chromatografische technieken, ingedeeld naar mobiele fase, stationaire fase, configuratie en mechanisme [13](#page=13): | Technologie | Mobiele Fase | Stationaire Fase | Configuratie | Mechanisme | | :---------------------- | :----------- | :--------------------- | :----------- | :---------------- | | GC (Gas-Liquid) | Gas | Vloeistof | Kolom | Verdeling | | GC (Gas-Solid) | Gas | Vaste stof adsorbent | Kolom | Adsorptie | | LC (Liquid-Liquid) | Vloeistof | Vloeistof | Kolom | Verdeling | | LC (Liquid-Solid) | Vloeistof | Vaste stof adsorbent | Kolom | Adsorptie | | PC (Paper) | Vloeistof | Papier (met vloeistof) | Plaat | Verdeling | | TLC (Thin Layer) | Vloeistof | Dunne laag vaste stof | Plaat | Adsorptie/Verdeling | | IEC (Ion-Exchange) | Vloeistof | Ionen uitwisselingshars | Kolom | Ionenuitwisseling | ### 1.6 Toepassingen van chromatografie Chromatografie kent diverse toepassingen [14](#page=14): * **Eenvoudige scheidingen en opzuivering:** Verwijderen van stoffen die storend kunnen zijn voor een verdere analyse, of het opzuiveren van producten na synthese [14](#page=14). * **Controle van zuiverheid:** Vaststellen van de zuiverheid van een product, bijvoorbeeld na chemische synthese [14](#page=14). * **Analytische technieken:** Technieken zoals Gaschromatografie (GC) en High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van componenten in een mengsel na de scheiding [14](#page=14). --- # Chromatografische begrippen en theorie Dit gedeelte behandelt de theoretische fundamenten van chromatografie, met een focus op de factoren die de scheiding van componenten bepalen, zoals de verdelingscoëfficiënt, retentiefactor, selectiviteit, resolutie en kolom efficiëntie [16](#page=16). ### 2.1 Het verdelingsmechanisme Chromatografie is gebaseerd op het principe dat verschillende componenten op een variërende manier interageren met zowel de stationaire fase (SF) als de mobiele fase (MF). Deze interactie bepaalt hoe lang een component in de kolom verblijft [17](#page=17). ### 2.2 De verdelingscoëfficiënt ($K_D$) De verdelingscoëfficiënt ($K_D$) is een maat voor de affiniteit van een te scheiden component voor de stationaire fase ten opzichte van de mobiele fase. Het wordt gedefinieerd als de verhouding van de concentratie van de beschouwde stof in de stationaire fase ($C_s$) tot de concentratie in de mobiele fase ($C_m$) op het moment van evenwicht [18](#page=18): $$ K_D = \frac{C_s}{C_m} $$ [18](#page=18). De verdelingscoëfficiënt is temperatuurafhankelijk. Een continu evenwicht tussen de mobiele en stationaire fase is essentieel voor scheiding [18](#page=18). ### 2.3 Chromatogram: retentietijden en volumes Een chromatogram toont de respons van de detector als functie van de tijd. Belangrijke termen zijn: * **Retentietijd ($t_R$)**: De tijd die een component nodig heeft om de kolom te doorlopen vanaf de injectie tot het detectiepunt [19](#page=19). * **Retentievolume ($V_R$)**: Het volume van de mobiele fase dat nodig is om een component door de kolom te elueren, berekend als $V_R = t_R \times v$ (waarbij $v$ de flow rate in ml/min is) [19](#page=19). * **Dode tijd ($t_M$ of $t_0$)**: De tijd die de mobiele fase nodig heeft om de kolom te doorlopen; dit is ook de tijd die componenten die geen interactie hebben met de stationaire fase nodig hebben [19](#page=19). * **Gecorrigeerde retentietijd ($t'_R$)**: De retentietijd minus de dode tijd ($t'_R = t_R - t_M$). Dit is de tijd die een component daadwerkelijk in de stationaire fase doorbrengt [19](#page=19). * **Piekbreedte ($w$)**: De breedte van de piek aan de basislijn [19](#page=19). ### 2.4 Evaluatie van de scheiding: Resolutie ($R_s$) De resolutie ($R_s$) is een cruciale parameter die de kwaliteit van de scheiding tussen twee componenten kwantificeert. Een hogere resolutie betekent een betere scheiding [20](#page=20) [22](#page=22). De resolutie wordt berekend met de volgende formules: $$ R_s = \frac{\Delta t_R}{w} = \frac{t_{R2} - t_{R1}}{\frac{w_{b1} + w_{b2}}{2}} = \frac{2 \times (t_{R2} - t_{R1})}{w_{b1} + w_{b2}} $$ [21](#page=21) [22](#page=22). Hierbij is $\Delta t_R$ het verschil in retentietijden tussen twee componenten, en $w_{b1}$ en $w_{b2}$ zijn de piekbreedtes aan de basislijn van component 1 en 2, respectievelijk [21](#page=21). * Een resolutie van $R_s = 1$ resulteert in ongeveer 2,3% overlap tussen de pieken [22](#page=22). * Een resolutie van $R_s = 1,5$ resulteert in ongeveer 0,15% overlap, wat vaak als basislijnscheiding wordt beschouwd [22](#page=22). #### 2.4.1 Factoren die de resolutie beïnvloeden De resolutie kan verbeterd worden door: * De interactie van de stoffen met de stationaire fase te vergroten (hogere retentiefactor, $k'$) en/of de selectiviteit voor een van beide componenten te verhogen ($\alpha$) [25](#page=25). * Piekverbreding te verminderen, wat gerelateerd is aan de kinetiek. Dit kan door de kolom efficiëntie te verhogen ($N$ omhoog, $H$ omlaag) [25](#page=25). **Voorbeeld van resolutieberekening:** Voor limoneen en $\gamma$-terpineen, met de volgende data: * Limoneen: $t_R = 8,36$ min, $w_b = 0,64$ min * $\gamma$-Terpineen: $t_R = 9,54$ min, $w_b = 0,96$ min De resolutie wordt berekend als: $$ R_s = \frac{2 \times (9,54 - 8,36)}{(0,64 + 0,96)} = \frac{2 \times 1,18}{1,60} = 1,475 $$ [24](#page=24). Dit resultaat geeft aan dat de componenten goed gescheiden zijn, maar net geen volledige basislijnscheiding is bereikt [24](#page=24). ### 2.5 Interactie van componenten met de stationaire fase: Retentiefactor ($k'$) of Capaciteitsfactor De retentiefactor ($k'$) is een dimensieloze parameter die de sterkte waarmee een component wordt weerhouden door de stationaire fase aangeeft. Het is direct gerelateerd aan de verdelingscoëfficiënt ($K_D$), de volumes van de stationaire ($V_s$) en mobiele ($V_m$) fasen [26](#page=26): $$ k = K_D \frac{V_s}{V_m} = \frac{n_s}{n_m} $$ [26](#page=26). Het kan ook berekend worden uit de retentietijden: $$ k = \frac{t_R - t_m}{t_m} = \frac{t'_R}{t_m} $$ [26](#page=26). De retentiefactor representeert de tijd die een component in de stationaire fase doorbrengt ten opzichte van de tijd die het in de mobiele fase doorbrengt. Een voorkeurswaarde voor $k'$ ligt tussen 1 en 10 voor optimale scheiding [26](#page=26). **Invloed van temperatuur op $k'$:** Bij gaskromatografie (GC) kan een temperatuurverandering de retentiefactor significant beïnvloeden, met name bij lage $k'$-waarden, wat de resolutie sterk kan verbeteren [27](#page=27) [28](#page=28). ### 2.6 Selectiviteit ($\alpha$) Selectiviteit ($\alpha$), ook wel relatieve retentie genoemd, kwantificeert het onderscheidend vermogen tussen twee componenten. Het is de verhouding van de verdelingscoëfficiënten of retentiefactoren van twee componenten (met $t'_{R2} > t'_{R1}$) [29](#page=29): $$ \alpha = \frac{K_{D2}}{K_{D1}} = \frac{k'_2}{k'_1} = \frac{t'_{R2}}{t'_{R1}} $$ [29](#page=29). * Een grote $\alpha$-waarde resulteert in een grotere afstand tussen de pieken, wat echter ook kan betekenen dat de scheiding meer tijd in beslag neemt dan strikt noodzakelijk [29](#page=29). * Als $\alpha = 1$, is er geen selectiviteit en dus geen scheiding mogelijk op basis van deze fase-combinatie [29](#page=29). * De selectiviteit houdt geen rekening met de piekbreedte [29](#page=29). **Factoren die de selectiviteit beïnvloeden:** De selectiviteit kan worden aangepast door: * Het veranderen van de stationaire fase (bv. door een andere kolom te gebruiken) [29](#page=29). * Het aanpassen van de mobiele fase (bij LC) of de kolomtemperatuur (bij GC) [29](#page=29). ### 2.7 Kolom efficiëntie en piekverbreding Piekverbreding is een ongewenst fenomeen dat de scheiding negatief beïnvloedt. De belangrijkste oorzaken zijn: * **Eddy-diffusie (A*)**: Veroorzaakt door inconsistente paden die moleculen volgen door een niet-homogene pakking van de stationaire fase in de kolom [31](#page=31) [32](#page=32). * **Longitudinale diffusie (B*)**: Moleculen diffunderen in de mobiele fase langs de kolom, vooral merkbaar bij lage flow rates [31](#page=31) [33](#page=33). * **Snelheid van stoftransfer (C*)**: Ongunstige instelling van het evenwicht tussen de stationaire en mobiele fase, wat weerstand biedt aan massatransfer [31](#page=31) [34](#page=34). Deze coëfficiënten (A, B, C) zijn de termen in de Van Deempter vergelijking [31](#page=31). #### 2.7.1 De schoteltheorie en theoretische platen ($N$) De schoteltheorie beschouwt de kolom als een reeks van (schijnbare) evenwichtsplaatsen, 'schotels' genaamd. Een hogere aantal theoretische platen ($N$) duidt op een kolom met een groter scheidend vermogen [35](#page=35). * **Aantal theoretische platen ($N$)**: Kan worden berekend uit de retentietijd en piekbreedte: $$ N = 16 \left( \frac{t_R}{w_b} \right)^2 $$ [35](#page=35) [43](#page=43). * **Plaathoogte of HETP (Height Equivalent of a Theoretical Plate, $H$)**: Dit is de lengte van de kolom per theoretische plaat, en een kleinere $H$ geeft een efficiëntere kolom aan: $$ H = \frac{L}{N} $$ [35](#page=35) [43](#page=43). waarbij $L$ de lengte van de kolom is. Een kolom met weinig platen resulteert in bredere pieken, terwijl een kolom met veel platen scherpere pieken genereert [36](#page=36). ### 2.8 Optimalisatie van de scheiding Het optimaliseren van een chromatografische scheiding omvat het verbeteren van de resolutie ($R_s$). Dit kan bereikt worden door het manipuleren van de retentiefactor ($k'$), selectiviteit ($\alpha$) en kolom efficiëntie ($N$ of $H$) [37](#page=37) [39](#page=39) [40](#page=40). De volgende algemene formule voor resolutie, aannemende gelijke piekbreedtes, illustreert de onderlinge relatie van deze parameters: $$ R_s = \frac{1}{4} \sqrt{N} \left( \frac{\alpha - 1}{\alpha} \right) \left( \frac{k'}{1 + k'} \right) $$ [37](#page=37) [38](#page=38) [39](#page=39) [40](#page=40). **Strategieën voor optimalisatie:** * **Verhogen van $k'$**: * Temperatuurprogrammatie (GC) [39](#page=39). * Gradient-elutie (LC) [39](#page=39). * **Aanpassen van selectiviteit ($\alpha$)**: * Veranderen van de stationaire fase (GC/HPLC) [39](#page=39). * Veranderen van de mobiele fase (HPLC) [39](#page=39). * **Verhogen van kolom efficiëntie ($N$) of verlagen van $H$**: * Aanpassen van de snelheid van de mobiele fase, zoals beschreven door de Van Deempter vergelijking [40](#page=40) [41](#page=41) [42](#page=42). #### 2.8.1 De Van Deempter vergelijking De Van Deempter vergelijking beschrijft hoe de plaathoogte ($H$) afhangt van de snelheid van de mobiele fase ($u$). Het houdt rekening met de bijdragen van eddy-diffusie (A), longitudinale diffusie (B), en de snelheid van stoftransfer (C) [41](#page=41) [42](#page=42): $$ H = A + \frac{B}{u} + Cu $$ [41](#page=41) [42](#page=42). * De optimale snelheid van de mobiele fase wordt bereikt wanneer de termen $B/u$ en $Cu$ in balans zijn, wat resulteert in een minimale plaathoogte $H$. De invloed van de lengte van de kolom ($L$) op de resolutie en retentietijd is direct gerelateerd aan het aantal theoretische platen ($N$). Een langere kolom leidt tot meer platen en dus potentieel tot een betere resolutie, maar ook tot langere retentietijden [43](#page=43). ### 2.9 Oefening voorbeelden De volgende voorbeelden demonstreren de toepassing van de berekende begrippen [45](#page=45) [46](#page=46) [47](#page=47) [48](#page=48) [49](#page=49). **Voorbeeld 1 (LC kolom):** Gegeven chromatogramgegevens voor component A en B en een luchtpiek. * Dode tijd ($t_m$): 5 min [46](#page=46). * Gecorrigeerde retentietijd voor A ($t'_R,A$): 25 min [47](#page=47). * Gecorrigeerde retentietijd voor B ($t'_R,B$): 45 min [47](#page=47). * Piekbreedte voor A ($w_{b,A}$): 15 min [48](#page=48). * Piekbreedte voor B ($w_{b,B}$): 24 min [48](#page=48). Berekeningen: * Retentiefactor voor A ($k'_A$): $\frac{25}{5} = 5$ [47](#page=47). * Retentiefactor voor B ($k'_B$): $\frac{45}{5} = 9$ [47](#page=47). * Selectiviteit ($\alpha$): $\frac{45}{25} = 1,8$ [47](#page=47). * Resolutie ($R_s$): $\frac{2 \times (50 - 30)}{(15 + 24)} = \frac{40}{39} \approx 1,02$. De pieken overlappen nog gedeeltelijk [48](#page=48). * Aantal theoretische platen voor A ($N_A$): $16 \left( \frac{30}{15} \right)^2 = 64$ [48](#page=48). * Aantal theoretische platen voor B ($N_B$): $16 \left( \frac{50}{24} \right)^2 \approx 69,4$ [48](#page=48). * Gemiddeld aantal platen ($N_{gem}$): $\approx 67$ [48](#page=48). * Gemiddelde plaathoogte ($H$): $\frac{25 \text{ cm}}{67} \approx 0,37 \text{ cm}$ [48](#page=48). **Voorbeeld 2 (GC kolom):** Voor twee stoffen A en B op een capillaire GC kolom met retentietijden van 14,6 min (A) en 18,3 min (B), en piekbreedtes van 0,80 min (A) en 0,93 min (B). De luchtpiek verschijnt na 1,1 min. * Dode tijd ($t_m$): 1,1 min [49](#page=49). * Retentietijd A ($t_{R,A}$): 14,6 min [49](#page=49). * Retentietijd B ($t_{R,B}$): 18,3 min [49](#page=49). * Piekbreedte A ($w_{b,A}$): 0,80 min [49](#page=49). * Piekbreedte B ($w_{b,B}$): 0,93 min [49](#page=49). Berekeningen: * Gecorrigeerde retentietijd A ($t'_{R,A}$): $14,6 - 1,1 = 13,5$ min [49](#page=49). * Gecorrigeerde retentietijd B ($t'_{R,B}$): $18,3 - 1,1 = 17,2$ min [49](#page=49). * Retentiefactor A ($k'_A$): $\frac{13,5}{1,1} \approx 12,27$ [49](#page=49). * Retentiefactor B ($k'_B$): $\frac{17,2}{1,1} \approx 15,64$ [49](#page=49). * Selectiviteit ($\alpha$): $\frac{17,2}{13,5} \approx 1,27$ [49](#page=49). * Resolutie ($R_s$): $\frac{2 \times (18,3 - 14,6)}{(0,80 + 0,93)} = \frac{2 \times 3,7}{1,73} \approx 4,28$ [49](#page=49). * Aantal theoretische platen A ($N_A$): $16 \left( \frac{14,6}{0,80} \right)^2 \approx 5198$ [49](#page=49). * Aantal theoretische platen B ($N_B$): $16 \left( \frac{18,3}{0,93} \right)^2 \approx 6198$ [49](#page=49). * Gemiddeld aantal platen ($N_{gem}$): $\frac{5198 + 6198}{2} \approx 5698$ [49](#page=49). --- # Gaschromatografie (GC) Gaschromatografie (GC) is een techniek die wordt gebruikt voor de analyse van vluchtige verbindingen, gebaseerd op het principe van verdeling van componenten tussen een mobiele gasfase en een stationaire fase [51](#page=51) [52](#page=52). ### 3.1 Principes van GC #### 3.1.1 Scheidingsprincipe De scheiding in gaschromatografie berust op de verdeling van componenten tussen de stationaire fase (meestal een vloeistof op de binnenwand van een kolom of verdeeld over vaste deeltjes) en de mobiele fase (een inert gas, het draaggas). Componenten die sterker interageren met de stationaire fase of minder vluchtig zijn, zullen langer in de kolom verblijven en dus later elueren. De vluchtigheid van de componenten, gerelateerd aan hun verdampingswarmte, speelt hierbij een cruciale rol [56](#page=56) [57](#page=57). #### 3.1.2 Toepasbare verbindingen GC is toepasbaar voor alle stoffen die in dampvorm gebracht kunnen worden zonder te ontbinden. Indien stoffen niet vluchtig of thermisch stabiel genoeg zijn, kan derivatisatie worden toegepast om ze geschikt te maken voor GC-analyse [53](#page=53) [90](#page=90). ### 3.2 Apparatuur in GC Een typisch GC-apparaat bestaat uit de volgende onderdelen: gastoevoer, injector, kolom, kolomoven en detector [54](#page=54). #### 3.2.1 Gastoevoer De gastoevoer verzorgt de verschillende gassen die nodig zijn voor het systeem. Dit omvat [58](#page=58): * **Draaggas (carrier gas):** Een inert gas zoals helium (He), waterstof (H₂) of stikstof (N₂) dat de componenten door de kolom transporteert. H₂ en He worden verkozen vanwege hun hoge efficiëntie over een breed bereik aan flowsnelheden [58](#page=58) [59](#page=59). * **Make-up gas:** Vaak hetzelfde gas als het draaggas, gebruikt om de flow door de detector te optimaliseren [58](#page=58). * **Detector gas:** Gassen zoals H₂ en lucht voor de vlamionisatiedetector (FID), of Ar/CH₄ of Ar/N₂ afhankelijk van het detector type [58](#page=58). De regeling van de flow en druk is essentieel, vooral bij temperatuurprogrammatie [59](#page=59). #### 3.2.2 Kolommen Er zijn twee hoofdtypen kolommen: * **Gepakte kolommen:** Deze zijn 2 tot 6 meter lang met een diameter van 2 tot 4 mm en bevatten de stationaire fase op kleine bolletjes. Ze kunnen grotere injectievolumes (0,1 tot 10 µl) aan [60](#page=60) [61](#page=61). * **Capillaire kolommen:** Dit zijn zeer dunne kolommen (0,25 mm diameter) die 10 tot 100 meter lang kunnen zijn. De stationaire fase bevindt zich hier op de binnenwand. Ze bieden snellere analyses, betere scheidingen en vereisen kleine injectievolumes (<0,02 µl). De hoeveelheid stationaire fase is erg klein, wat overladen kan voorkomen en frontvorming van pieken kan vermijden [60](#page=60) [61](#page=61) [63](#page=63). De keuze van de stationaire fase (bv. polair of apolair) is afhankelijk van de te scheiden componenten [62](#page=62). #### 3.2.3 Injector De injector brengt het monster op de kolom als een nauw bandje zonder dat de componenten degraderen of dat er piekverbreding optreedt. De injectietemperatuur moet hoger zijn dan de kolomtemperatuur. Er zijn verschillende injectortypen [56](#page=56) [64](#page=64): * **Split/splitless injector:** * **Split-injectie:** Een klein deel van de geïnjecteerde hoeveelheid gaat naar de kolom, terwijl het grootste deel via een split-kanaal wordt afgevoerd. Dit is geschikt voor hogere concentraties en maakt snelle analyses mogelijk. Een purge flow voorkomt contaminatie door het septum en carry-over [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68). * **Splitless-injectie:** De splitklep is gesloten gedurende de injectie, waardoor het gehele monster naar de kolom gaat. Dit is voordelig voor lagere concentraties en reproduceerbare injecties door het creëren van een nauw bandje aan het begin van de kolom bij lage kolomtemperaturen. Na transfer van het monster wordt de splitklep geopend om de kolom te spoelen [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71). * **Programmed temperature vaporisation (PTV) injector:** De injector begint op een lage temperatuur met de splitpoort open, waardoor het solvent verdampt en hogere kokende componenten in de liner concentreren. Daarna wordt de injector snel verwarmd tot 200-300°C met de splitpoort gesloten [72](#page=72). * **Cool on column injectie (gepakte kolom):** Het monster wordt direct op de kolom geïnjecteerd bij een lage temperatuur, zodat minder vluchtige componenten condenseren aan het begin van de kolom. Daarna wordt de kolomtemperatuur snel verhoogd [72](#page=72). * **Headspace analyse:** Geschikt voor vluchtige componenten in evenwicht met een vloeibare of vaste fase. Het monster wordt in een afgesloten flesje geplaatst, eventueel verwarmd, en de bovenstaande gasfase (headspace) wordt geïnjecteerd. Voorbeelden zijn alcohol in bloed en drugs in haar [73](#page=73) [76](#page=76). * **Solid Phase Micro-Extraction (SPME):** Een techniek die geassocieerd kan worden met headspace analyse, waarbij vluchtige componenten adsorberen op een vezel [74](#page=74). #### 3.2.4 Kolomoven De kolomoven regelt de temperatuur van de kolom, wat cruciaal is voor de scheiding. Er zijn twee manieren van temperatuurregeling [56](#page=56): * **Constante temperatuur:** Gebruikt wanneer de componenten een vergelijkbare vluchtigheid hebben [77](#page=77). * **Temperatuurprogrammatie:** De temperatuur van de kolom wordt stapsgewijs of lineair verhoogd tijdens de analyse. Dit verbetert de scheiding van vroeg eluerende pieken en zorgt voor betere piekprofielen en hogere detectielimieten voor laat eluerende pieken. Tijdens temperatuurprogrammatie wordt de druk vaak aangepast om een constante lineaire snelheid van de mobiele fase te behouden [78](#page=78) [79](#page=79). #### 3.2.5 Detectoren Detectoren meten de componenten die de kolom verlaten door veranderingen in de samenstelling van het uitstromende gas te registreren. Deze veranderingen worden omgezet in een elektrisch signaal dat, in functie van de tijd, een chromatogram vormt. De piekoppervlakte in het chromatogram is evenredig met de concentratie van de component. Gangbare detectoren zijn [80](#page=80) [81](#page=81): * **Vlamionisatiedetector (FID):** Verbrandt organische componenten in een waterstof/lucht vlam, waardoor ionen ontstaan. Deze ionen genereren een stroom die evenredig is met de concentratie van de component, mits deze klein is. De FID is zeer gevoelig voor organische verbindingen met veel koolstofatomen, maar minder geschikt voor anorganische gassen zoals water, CO₂, SO₂ of NOₓ [83](#page=83) [84](#page=84). * **Thermische geleidbaarheidsdetector (TCD):** Meet de thermische geleidbaarheid van de gasstroom. De draaggas (bv. He of H₂) heeft een hoge geleidbaarheid. Wanneer een component wordt gedetecteerd, verandert de geleidbaarheid van de gasstroom, wat leidt tot een verandering in de elektrische weerstand van een filament. De TCD meet alle componenten, maar heeft een hogere detectielimiet dan de FID (ongeveer 100 keer hoger) [85](#page=85). * **Electron Capture Detector (ECD):** Gebruikt een β-straler om het draaggas (bv. N₂) te ioniseren, wat resulteert in een constante stroom tussen twee elektroden. Stoffen met een hoge elektronenaffiniteit (elektronenvangers), zoals die met halogenen of nitro-groepen, verminderen de stroomsterkte. De ECD is selectief voor deze specifieke groepen [87](#page=87). * **Massaspectrometer (MS):** GC gekoppeld aan MS (GC-MS) wordt later behandeld [88](#page=88). ### 3.3 Voordelen en Nadelen van GC **Voordelen:** * Snelle analyse [89](#page=89). * Efficiënte scheiding [89](#page=89). * Lage detectielimieten [89](#page=89). * Hoge nauwkeurigheid (<1% RSD) [89](#page=89). * Vereist kleine hoeveelheden monster (<1 mL) [89](#page=89). * Gemakkelijk te koppelen aan MS [89](#page=89). * Brede toepassingsmogelijkheden [89](#page=89). **Nadelen:** * Beperkt tot gemakkelijk te vervluchtigen en thermisch stabiele stalen (ongeveer 10-20% van alle stoffen) [89](#page=89). * Meeste detectoren zijn destructief [89](#page=89). * De monstervoorbereiding kan complex zijn [89](#page=89). ### 3.4 Toepassingen van GC GC heeft een breed scala aan toepassingen, waaronder: * Analyse van organische polluenten in lucht, water en afvalwater (bv. VOC's, pesticiden, herbiciden) [90](#page=90). * Farmacie: analyse van geneesmiddelen en residuele solventen [90](#page=90). * Bloedalcoholanalyse [90](#page=90). * Screening van geneesmiddelen in urine [90](#page=90). * Analyse van aroma's en geurstoffen [90](#page=90) [93](#page=93). * Forensisch onderzoek (bv. brandversnellers, explosieven) [90](#page=90). * Analyse van allergenen in cosmetica [93](#page=93). ### 3.5 Kwantitatieve bepalingen Kwantitatieve bepalingen in GC kunnen worden uitgevoerd met behulp van externe kalibratie of interne standaardmethoden [94](#page=94). #### 3.5.1 Externe kalibratie Bij externe kalibratie wordt een kalibratierechte opgesteld met bekende concentraties van de analyt. De piekoppervlakte of piekhoogte wordt gemeten en afgezet tegen de concentratie. Deze methode is gevoelig voor variaties in injectievolume en monstervoorbereiding [94](#page=94) [95](#page=95). #### 3.5.2 Interne standaardmethode Bij de interne standaardmethode wordt aan alle stalen en standaarden een gekende hoeveelheid van een interne standaard (IS) toegevoegd. De IS mag niet in het oorspronkelijke monster aanwezig zijn, moet vergelijkbare chemische en fysische eigenschappen hebben als de analyt, en moet apart gemeten kunnen worden (gescheiden piek) [100](#page=100) [94](#page=94). **Voordelen van de interne standaardmethode:** * Compenseert voor variaties in injectievolume en monstervoorbereiding (zoals extractieverliezen). Dit leidt tot een hogere reproduceerbaarheid, zoals geïllustreerd door de lagere RSD bij het gebruik van een interne standaard vergeleken met externe standaardisatie [95](#page=95) [99](#page=99). * Geschikt voor handmatige injecties, autosamplers, headspace analyses en monsterbereidingen met extractie of derivatisatie [99](#page=99). **Keuze van de interne standaard:** De interne standaard moet niet aanwezig zijn in de stalen, een structuur en eigenschappen hebben die gelijkend zijn aan de analyt, bij voorkeur na de analyt elueren, en stabiel zijn met een gekende concentratie [100](#page=100). **Voorbeeld berekening met interne standaard:** Stel dat de verhouding van de piekoppervlaktes (analyt/IS) wordt afgezet tegen de concentratie van de analyt. Dit geeft een lineaire relatie, waardoor de concentratie van de analyt in een monster bepaald kan worden door de gemeten verhouding af te zetten op deze kalibratierechte [98](#page=98). **Voorbeeld uitwerking oefening:** Bij de bepaling van pesticide residu's (heptachloor-epoxide, HCE) in sinaasappels, wordt de verhouding van de piekoppervlaktes (HCE/IS) gemeten voor verschillende standaarden en het monster. Door deze verhoudingen af te zetten, kan de concentratie van HCE in het monster berekend worden . > **Tip:** Bij het oplossen van GC-oefeningen is het cruciaal om alle stappen van de monsterbereiding en analyse te visualiseren en de eenheden zorgvuldig bij te houden. Volg een systematische aanpak: noteer gegevens, bepaal de kalibratiemethode, stel de kalibratierechte op, bereken de concentratie in de gemeten oplossing, en reken vervolgens terug naar de oorspronkelijke vraag . --- # Vloeistofchromatografie (LC) en HPLC Vloeistofchromatografie, met een specifieke focus op High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), omvat technieken voor scheiding gebaseerd op interacties tussen een stationaire en een mobiele fase in een kolom . ### 4.1 Algemene principes van Vloeistofchromatografie (LC) LC is een scheidingsmethode die gebruik maakt van een vloeibare mobiele fase en een vaste of vloeibare stationaire fase. Het kan worden onderverdeeld in verschillende mechanismen, waaronder adsorptiechromatografie, verdelingschromatografie, ionenuitwisselingschromatografie, gelfiltratie en affiniteitschromatografie. LC kan worden uitgevoerd voor preparatieve doeleinden (scheiding van grotere hoeveelheden stof) of analytische doeleinden (kwantificering en identificatie van componenten) . ### 4.2 Klassieke Kolomchromatografie Klassieke kolomchromatografie maakt gebruik van stationaire fasen zoals ionenuitwisselingsharsen, affiniteitsmatrices of gels, met deeltjesdiameters van ongeveer 100-150 µm. Deze methode wordt voornamelijk gebruikt voor preparatieve doeleinden . ### 4.3 High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) HPLC is een geavanceerde vorm van kolomchromatografie die zich onderscheidt door het gebruik van hoge druk om de mobiele fase door de kolom te persen. Dit resulteert in een groter contactoppervlak met de stationaire fase en een snellere doorgang, wat leidt tot snellere en efficiëntere scheidingen vergeleken met klassieke kolomchromatografie . #### 4.3.1 Vergelijking HPLC en Klassieke Kolomchromatografie | Kenmerk | Klassieke Kolomchromatografie | HPLC | | :------------------ | :---------------------------- | :------------------- | | Kolommateriaal | Glas, plastic | Staal, PEEK | | Diameter kolom | > 1 cm | 0.2 – 0.8 cm | | Deeltjesgrootte (µm)| 100 – 150 | 3 – 10 | | Druk (bar) | 0.05 – 0.1 | > 200 (tot 1000-4000 psi) | | Duur | Uren | Minuten | | Toepassing | Preparatief | Analytisch | #### 4.3.2 Stationaire Fase in HPLC De stationaire fase (SF) in HPLC bestaat typisch uit amorfe silica deeltjes met een grootte van ongeveer 4 µm. Kleinere deeltjesgrootte van de stationaire fase leidt tot een vermindering van de eddy-diffusie (A-term in de Van Deempter vergelijking) en een kleinere diffusie-afstand binnen de deeltjes, wat resulteert in een snellere evenwichtsinstelling (C-term in de Van Deempter vergelijking) en dus een hogere efficiëntie van de kolom. Dit vereist echter wel een hogere druk om de mobiele fase door de kolom te persen . De stationaire fase kan vast zijn (zoals silica) of een vloeistof-film gecoat of chemisch verankerd op een drager (silica deeltjes). De polariteit van de stationaire fase kan polair of apolair zijn. Chemisch verankerde stationaire fasen kunnen ook onderworpen worden aan "end-capping" om de eigenschappen aan te passen, waarbij de invloed van de pH op de stabiliteit van de koppeling belangrijk is . ##### 4.3.2.1 Normale Fase (NP-HPLC) versus Omgekeerde Fase (RP-HPLC) * **Normale Fase (NP-HPLC):** De stationaire fase is polairder dan de mobiele fase. Voorbeelden van stationaire fasen zijn silica, of groepen zoals cyano- of amino- gebonden aan de drager. De mobiele fase is apolair, zoals hexaan, diethylether, chloroform of ethylacetaat. NP-HPLC wordt toegepast voor hydrofobe componenten, vooral wanneer RP niet geschikt is . * **Omgekeerde Fase (RP-HPLC):** De stationaire fase is apolairder dan de mobiele fase. Typische stationaire fasen zijn silica met lange koolwaterstofketens (bv. C8 of C18). De mobiele fase is een mengsel van water (vaak met een buffer tussen pH 3 en 7) en een organisch oplosmiddel zoals methanol, acetonitril of THF . RP-HPLC heeft de voorkeur boven NP-HPLC vanwege het gebruik van minder schadelijke en minder droge oplosmiddelen. De keuze tussen NP-HPLC en RP-HPLC hangt af van de aard van de te scheiden componenten, waarbij de interacties tussen analiet en mobiele fase, analiet en stationaire fase, en mobiele fase en stationaire fase een rol spelen . #### 4.3.3 Mobiele Fase in HPLC De mobiele fase (MF) speelt een cruciale rol in het scheidingsproces. De keuze is afhankelijk van de stationaire fase, mag niet reageren met de stationaire fase, en moet geschikt zijn voor de op te lossen componenten. De polariteit en selectiviteit van de mobiele fase zijn hierbij van belang . Bij RP-HPLC is de mobiele fase meestal een mengsel van water (of buffer) en een organisch oplosmiddel. De viscositeit van de mobiele fase en de elutiersterkte zijn belangrijke eigenschappen . * **Sterk eluens:** Heeft een polariteit die vergelijkbaar is met de stationaire fase, wat leidt tot een sterke interactie tussen de mobiele fase en de stationaire fase. Dit zorgt voor een snellere en minder selectieve scheiding . * **Zwak eluens:** Heeft een polariteit die verschilt van de kolom. De mobiele fase concurreert met de analieten voor interacties met de kolom . Bij UV-detectie is de absorptie van de mobiele fase bij de gekozen golflengte ook van belang. Een iso-eluotrope mobiele fase heeft dezelfde elutiersterkte, wat kan leiden tot elutie binnen dezelfde tijd maar met potentieel verschillende selectiviteit. Een constante samenstelling van de mobiele fase kan nadelen hebben, met name bij zeer zwakke eluenten . #### 4.3.4 Gradiëntelutie Bij gradiëntelutie verandert de samenstelling van de mobiele fase tijdens de analyse, in tegenstelling tot isocratische elutie waarbij de samenstelling constant blijft. Meestal wordt de samenstelling van de mobiele fase aangepast van zwak naar sterk eluens. Na de analyse wordt de samenstelling van de mobiele fase teruggebracht naar de beginwaarde en wordt de kolom geëquilibreerd met de initiële eluenssamenstelling. De pH van de mobiele fase kan de selectiviteit van de scheiding beïnvloeden . #### 4.3.5 Apparatuur in HPLC Een typisch HPLC-systeem is modulair opgebouwd en bestaat uit de volgende componenten : * **Vloeistofreservoir:** Bevat de mobiele fase. Het is belangrijk dat de mobiele fase geen vaste deeltjes bevat en geen opgelost gas, wat bereikt kan worden door vacuümfiltratie of het gebruik van keramische filters . * **Ontgasser:** Verwijderd opgeloste gassen uit de mobiele fase, automatisch of handmatig (bv. via ultrasoonbad) . * **Pomp:** Moet hoge druk (tot 400-600 bar) kunnen leveren zonder pulsen, met een debiet van 0.1 tot 10 ml/min. Een dubbele pistonpomp is hiervoor gebruikelijk . * **Menger:** Kan op hoge druk (na de pomp) of lage druk (voor de pomp) plaatsvinden om solventen te mengen . * **Guard column (Pre-column):** Een korte kolom (ca. 2 cm) die voor de analytische kolom wordt geplaatst om componenten op te vangen die sterke retentie vertonen op de analytische kolom, ter bescherming ervan en om slechte piek vormen te voorkomen. Deze wordt regelmatig vervangen . * **Kolom:** Moet hoge drukken weerstaan en is gemaakt van roestvrij staal of PEEK. De lengte varieert van 5-25 cm en de interne diameter van 1-5 mm . * **Injector:** Gebruikt een klep met 6 uitgangen om de mobiele fase onder hoge druk te injecteren zonder het systeem te onderbreken. Een lus van een bepaald volume wordt gevuld met het monster, waarna de mobiele fase de lus passeert en het monster op de kolom brengt . * **Detector:** Detecteert de gescheiden componenten na passage door de kolom . #### 4.3.6 Detectoren in HPLC Verschillende typen detectoren kunnen worden gebruikt: * **UV-spectrofotometer:** Vergelijkbaar met klassieke UV/Vis-spectrofotometrie, maar met een kleine doorstroomcel (1-10 µl). De detector selecteert een vaste golflengte . * **UV-photodiode array (DAD) detector:** Kan het gehele UV-spectrum van de doorgelaten componenten scannen, wat helpt bij piekidentificatie en zuiverheidsonderzoek. De gevoeligheid is lager dan bij een vaste golflengte detector . * **Fluorescentiedetector:** Detecteert stoffen die fluoresceren. Dit is een specifieke detector voor moleculen met fluorescerende eigenschappen, zoals polycyclische aromatische verbindingen. Post-column derivatisatie kan worden toegepast om niet-fluorescerende moleculen detecteerbaar te maken . * **Conductometrische detector:** Meet de geleidbaarheid van de mobiele fase. Een toename in geleidbaarheid duidt op de aanwezigheid van ionen en is afhankelijk van hun concentratie, lading en specifieke geleidbaarheid. Dit type detector is geschikt voor ionenchromatografie (IEC) . * **Massaspectrometrie (MS):** Na de kolom worden componenten geïoniseerd en gescheiden op basis van hun massa/lading-verhouding . #### 4.3.7 Toepassingen van HPLC HPLC wordt breed toegepast in diverse gebieden, waaronder: * Analyse van de samenstelling en zuiverheid van geneesmiddelen . * Analyse van metabolieten in serum . * Scheiding en analyse van peptiden . * Detectie van pesticiden . * Analyse van water- en vetoplosbare vitaminen . * Bepaling van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) in bodem . * Analyse van fluoxetine in serum, vaak in combinatie met Solid Phase Extraction (SPE) en fluorescentie-detectie . ### 4.4 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) UHPLC, ook wel UPLC genoemd, is een verdere ontwikkeling van HPLC waarbij gebruik wordt gemaakt van nog kleinere deeltjes (< 2 µm) in de kolom en zeer hoge drukken (tot 1000 atm) . #### 4.4.1 Voordelen van UHPLC * Snellere analyses . * Hogere resolutie . * Verbeterde gevoeligheid . * Kleinere injectievolumes mogelijk . * Lager solventverbruik . #### 4.4.2 Nadelen van UHPLC * Snel dichtslibben door de kleine deeltjesgrootte en de zeer nauwe ruimte ertussen . * Verhoogde eisen aan staalvoorbereiding . * Vereist zeer hoge druk . * Kortere levensduur van de kolom . ### 4.5 Monolithische Kolommen in HPLC Monolithische kolommen maken gebruik van een continue poreuze silica structuur in plaats van individuele deeltjes als stationaire fase . #### 4.5.1 Voordelen van Monolithische Kolommen * Werking bij lage drukken . * Snelle analyse . * Lange levensduur . * Geen uitgebreide staalvoorbereiding vereist . --- # Massaspectrometrie (MS) Massaspectrometrie is een analytische techniek die wordt gebruikt om de massa-tot-ladingverhouding van geïoniseerde atomen en moleculen te bepalen, wat structurele informatie en kwantitatieve gegevens oplevert, vaak met zeer lage detectielimieten . ### 5.1 Principe van massaspectrometrie Het principe van massaspectrometrie berust op de ionisatie en fragmentatie van analieten, gevolgd door de scheiding van de resulterende ionen op basis van hun massa-tot-ladingverhouding (m/z) in een vacuüm . #### 5.1.1 Ionisatie en fragmentatie Moleculen in gasfase worden blootgesteld aan energie die groter is dan hun ionisatie-energie, wat resulteert in het verwijderen van een elektron en de vorming van een moleculair ion (radicaalkation). Dit moleculaire ion is vaak instabiel en ondergaat fragmentatie, waarbij kleinere ionen worden gevormd . * **Voorbeeld:** Propaan kan geïoniseerd en gefragmentiseerd worden, wat leidt tot een massaspectrum met pieken die overeenkomen met het moleculaire ion en zijn fragmenten . * **Voorbeeld:** Ethylbenzeen toont zowel een moleculair ion als een basispiek, die het meest abundante fragment vertegenwoordigt . * **Voorbeeld:** Dichlorvos, een insecticide, vertoont isotopische pieken door de aanwezigheid van chloor-isotopen (³⁵Cl en ³⁷Cl) . #### 5.1.2 Het massaspectrum Een massaspectrum visualiseert de relatieve abundantie van de gevormde ionen op de y-as, tegenover hun m/z-verhouding op de x-as (#page=159, 160) . > **Tip:** In tegenstelling tot UV-Vis spectrometrie, waarbij spectra meer algemene absorptiekenmerken tonen, levert een massaspectrum een 'fingerprint' op die specifiek is voor het geïoniseerde molecuul en zijn fragmenten, wat gedetailleerde structurele informatie kan geven. Massaspectrometrie is een destructieve techniek . ### 5.2 Opbouw van een massaspectrometer Een massaspectrometer bestaat in principe uit drie hoofdonderdelen: een ionenbron, een massa-analysator en een ionendetector, met een inlaat voor het monster en een datasysteem (#page=166, 168). Afhankelijk van de techniek (bv. GC-MS of LC-MS) kan de ionisatie plaatsvinden bij verlaagde druk of atmosferische druk (#page=166, 167) . #### 5.2.1 Ionisatiebronnen De keuze van de ionisatiebron is cruciaal en hangt af van factoren zoals de molaire massa, oplosbaarheid en polariteit van het monster . ##### 5.2.1.1 Elektronimpact (EI) Bij elektronimpact (EI) worden gasvormige monsterdeeltjes beschoten met energetische elektronen, wat leidt tot de vorming van moleculaire radicale kationen en fragmentatie (#page=169, 171) . * **Voordelen:** Geschikt voor relatief kleine, vluchtige organische moleculen . * **Nadelen:** De hoge energie van de elektronen veroorzaakt aanzienlijke fragmentatie, wat het detecteren van het moleculaire ion bemoeilijkt. Het monster moet thermisch stabiel zijn. EI is een "harde" ionisatiemethode . ##### 5.2.1.2 Chemische ionisatie (CI) Chemische ionisatie (CI) gebruikt een reagensgas (zoals methaan of ammoniak) dat eerst wordt geïoniseerd door elektronimpact. Vervolgens botsen de analietmoleculen met deze reagensionen, wat resulteert in de ionisatie van het analiet (#page=172, 173) . * **Voordelen:** Een "zachte" ionisatiemethode die leidt tot minder fragmentatie en een hogere abundantie van moleculaire ionen, wat nuttig is voor het bepalen van de molaire massa. Geschikt voor kleinere organische moleculen die als Lewis-zuur of -base kunnen optreden . * **Nadelen:** Minder structurele informatie dan bij EI. Adduct-ionen kunnen gevormd worden . * **Toepassing:** Een van de meest toegepaste ionisatiebronnen bij GC-MS, samen met EI. MW-bereik tot ongeveer 1000 Dalton . ##### 5.2.1.3 Elektrospray-ionisatie (ESI) Elektrospray-ionisatie (ESI) is geschikt voor thermisch gevoelige, niet-vluchtige of grote (bio)moleculen die niet met EI of CI kunnen worden geïoniseerd. Het is een atmosferische druk ionisatiemethode die vaak wordt toegepast bij (HP)LC-MS . * **Proces:** Het HPLC-eluaat wordt door een capillair onder hoge spanning geleid, waardoor geladen druppels ontstaan (#page=176, 177). Solventverdamping en Coulomb-explosies leiden tot kleinere druppels, waaruit uiteindelijk gasvormige ionen vrijkomen (#page=178, 179) . * **Toepassing:** Analyse van proteïnen en DNA . ##### 5.2.1.4 Atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) APCI is geschikt voor moleculen die thermisch stabiel zijn en een relatief lage molaire massa hebben. Het eluaat wordt verneveld, het oplosmiddel verdampt, en de analieten in gasfase worden geïoniseerd via een corona-ontlading, waarbij solventionen de lading overdragen aan de analietmoleculen (#page=181, 182) . ##### 5.2.1.5 Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MALDI wordt gebruikt voor de niet-destructieve verdamping en ionisatie van zowel kleine als grote biomoleculen. Het analiet wordt gemengd met een grote overmaat aan matrixmoleculen die laserstraling absorberen. De laserpuls zorgt voor snelle opwarming en sublimatie van de matrix, waarbij de analietmoleculen worden meegesleept en geïoniseerd door protonoverdracht van de matrix (#page=183, 184) . * **Combinatie:** MALDI wordt typisch gecombineerd met een Time-of-Flight (TOF) analysator . #### 5.2.2 Massa-analysatoren Massa-analysatoren scheiden ionen op basis van hun m/z-verhouding. Belangrijke kenmerken zijn massa resolutie ($m/\Delta m$), massa nauwkeurigheid en massabereik . ##### 5.2.2.1 Magnetische sector analysator In een magnetische sector analysator worden ionen versneld en vervolgens afgebogen door een magnetisch veld. De afbuiging hangt af van de m/z-verhouding, snelheid en de sterkte van het magnetisch veld. Door variatie van het elektrische of magnetische veld kunnen ionen met verschillende m/z-verhoudingen de detector bereiken. Vaak gecombineerd met een elektrostatische sector voor dubbele focussering . ##### 5.2.2.2 Quadrupool analysator Een quadrupool analysator bestaat uit vier parallelle metalen staven waarop wisselende spanningen worden aangelegd. Hierdoor maken ionen een oscillerende beweging; alleen ionen met een specifieke m/z-verhouding volgen een stabiel traject en bereiken de detector (#page=193, 194). Door de spanning te variëren, kunnen ionen van verschillende m/z-verhoudingen sequentieel worden gedetecteerd (m/z scanning) . ##### 5.2.2.3 Time-of-Flight (TOF) analysator Bij een Time-of-Flight (TOF) analysator wordt een puls van ionen versneld en vervolgens door een vacuümbuis geleid. De tijd die ionen nodig hebben om een detector aan het einde van de buis te bereiken (de "time of flight") is afhankelijk van hun snelheid, welke bepaald wordt door hun m/z-verhouding . * **Toepassing:** Wordt meestal gecombineerd met zachte ionisatietechnieken zoals MALDI, waarbij voornamelijk éénwaardige ionen worden gevormd, zodat de scheiding primair door massa wordt bepaald . * **Verbetering:** Het gebruik van een 'ion reflectron' kan de resolutie verhogen door correctie voor kleine verschillen in kinetische energie . ##### 5.2.2.4 Tandem MS (MS/MS of MS²) Tandem massaspectrometrie maakt gebruik van twee (of meer) massa-analysatoren gescheiden door een 'collision cell'. In de eerste analysator wordt een specifiek precursor-ion geselecteerd. Dit ion wordt vervolgens in de botsingscel gefragmenteerd door botsing met een inert gas (bv. argon of xenon) (#page=199, 200). De fragmenten worden vervolgens door de tweede massa-analysator gescheiden (#page=199, 200) . * **Toepassing:** Zeer nuttig voor het verkrijgen van gedetailleerde structurele informatie en voor proteïne sequencing . #### 5.2.3 Detectoren Detectoren registreren de ionen die door de massa-analysator worden gescheiden . * **Elektronenvermenigvuldiger (Electron Multiplier):** Dit type detector registreeert de lading die geïnduceerd wordt wanneer een ion botst met het oppervlak. Door een reeks opeenvolgende dynodes met oplopende potentialen wordt een cascade van elektronen opgewekt, wat leidt tot een versterkt signaal . ### 5.3 Toepassingen Massaspectrometrie wordt vaak gekoppeld aan chromatografische technieken zoals Gaschromatografie-Massaspectrometrie (GC-MS) en Vloeistofchromatografie-Massaspectrometrie ((HP)LC-MS) (#page=157, 203) . #### 5.3.1 Scanmethoden en output Verschillende scanmethoden bieden diverse mogelijkheden voor data-acquisitie en -interpretatie: * **Total Ion Current (TIC):** Registreert de totale ionenstroom van een volledig massabereik op elk tijdstip tijdens de chromatografische scheiding. De totale ionenstroom per scan wordt weergegeven als functie van de tijd . * **Single/Selected Ion Monitoring (SIM):** Een zeer smal massabereik (bv. $\Delta m/z = 1$) wordt doorgelaten naar de detector, wat leidt tot een aanzienlijke verhoging van de gevoeligheid en verlaging van de LOD . * **Selected Reaction Monitoring (SRM) op QQQ/MS²:** Een specifiek precursor-ion wordt geselecteerd, gefragmenteerd, en vervolgens wordt een specifiek fragment geïonitord. Deze methode is optimaal voor complexe matrices omdat interferenties kunnen worden uitgeschakeld, hoewel dit gepaard kan gaan met enig verlies aan gevoeligheid . > **Voorbeeld:** De detectie van een bepaald pesticide (5 $\mu$g/kg) in komkommer met GC/MS in SIM-modus, waarbij specifieke m/z-waarden (290, 276, 305) worden gemonitord . --- # Capillaire elektroforese (CE) Capillaire elektroforese (CE) is een krachtige scheidingstechniek die gebruikmaakt van een aangelegd elektrisch veld om geladen analytische componenten te scheiden binnen een dun capillair buisje gevuld met een bufferoplossing . ### 6.1 Werking en principes van elektroforese Elektroforese is gebaseerd op de beweging van analieten in een geleidend medium onder invloed van een aangelegd elektrisch veld. Kationen (positief geladen deeltjes) bewegen naar de kathode (negatieve elektrode), terwijl anionen (negatief geladen deeltjes) naar de anode (positieve elektrode) bewegen. De snelheid van deze beweging is afhankelijk van verschillende factoren . #### 6.1.1 Vergelijking met gelelektroforese Traditionele gelelektroforese maakt gebruik van een gelmatrix en een bufferoplossing, maar kent nadelen zoals lange analysetijden, lage efficiëntie en het ontbreken van automatisatie, waardoor CE een aantrekkelijker alternatief is geworden . #### 6.1.2 Capillaire elektroforese (CE) Bij CE wordt een capillair buisje met een interne diameter van 25 tot 75 µm gevuld met een bufferoplossing. Na injectie van een monster en het aanleggen van een hoogspanning, bewegen de componenten door het capillair waarna detectie plaatsvindt, resulterend in een elektroferogram dat zowel kwalitatieve als kwantitatieve informatie kan verschaffen . ### 6.2 Scheidingsmechanismen De scheiding in CE is gebaseerd op de netto bewegelijkheid van de analieten, die een combinatie is van elektroforetische mobiliteit en de elektro-osmotische flow . #### 6.2.1 Elektroforetische flow (EF) De elektroforetische snelheid of mobiliteit ($\mu_{ef}$) van een deeltje wordt bepaald door de lading van het deeltje ($q$), de veldsterkte ($E$) van het aangelegde elektrische veld, de viscositeit van het medium ($\eta$) en de straal van het deeltje ($r$). De formule hiervoor is : $$v = \mu_{ef} E$$ waarbij $$\mu_{ef} = \frac{q}{6\pi\eta r}$$ #### 6.2.2 Elektro-osmotische flow (EOF) De elektro-osmotische flow ontstaat door de aanwezigheid van geladen groepen op de wand van het capillair, met name silicaatgroepen (SiO⁻) bij een pH > 3. Deze geladen wand trekt tegengestelde ionen aan, waardoor een elektrische dubbellaag ontstaat. Bij toepassing van een elektrisch veld bewegen deze geladen ionen in de dubbellaag naar de kathode, waarbij ze de gehele bufferoplossing meeslepen, wat effectief werkt als een pomp. De grootte van de EOF is afhankelijk van de lading van de capillaire wand (sterk pH-afhankelijk) en de ionensterkte van de buffer. Een hogere lading van de wand of een lagere ionensterkte leiden tot een hogere EOF-mobiliteit ($\mu_{eof}$) . #### 6.2.3 Combinatie van flows De netto snelheid van een deeltje wordt bepaald door de som van de elektroforetische snelheid en de elektro-osmotische flow, wat leidt tot de scheiding van de componenten. De volgorde waarin deeltjes de detector bereiken, is afhankelijk van deze gecombineerde beweging . ### 6.3 Efficiëntie van scheiding De efficiëntie van een CE-scheiding wordt uitgedrukt in het aantal theoretische platen ($N$), wat kan oplopen tot 100.000 - 200.000. De formule voor $N$ is : $$N = \frac{(\mu_{ef} + \mu_{eof})V}{2D}$$ Hierbij is $V$ de aangelegde spanning en $D$ de diffusiecoëfficiënt van de opgeloste stof. De Van Deempter-vergelijking in zijn basisvorm beschrijft hierbij alleen de verbreding door longitudinale diffusie . #### 6.3.1 Invloed van spanning Het verhogen van de aangelegde spanning ($V$) leidt tot een hogere resolutie en een snellere, efficiëntere scheiding. Echter, hogere spanningen kunnen ook leiden tot temperatuursgradiënten binnen het capillair, wat piekverbreding kan veroorzaken . ### 6.4 Apparatuur #### 6.4.1 Capillair De gebruikte capillairen variëren in lengte van 30 cm tot meer dan 1 meter . #### 6.4.2 Injectie van monster De injectie van het monster in het capillair kan op twee manieren plaatsvinden: * **Hydrodynamische injectie:** Gebaseerd op een drukverschil . * **Elektrokinetische injectie:** Gebaseerd op het aangelegde elektrische veld, waarbij injectievolumes typisch tussen 5 en 50 nL liggen . #### 6.4.3 Hoogspanningsbron Een hoogspanningsbron is essentieel voor het genereren van het elektrische veld dat de scheiding aandrijft . #### 6.4.4 Detectoren Verschillende detectiemethoden kunnen worden toegepast, vergelijkbaar met die in vloeistofchromatografie (LC) : * **UV-Vis detector:** Vaak gebruikt, waarbij de geringe weglengte van het capillair een voordeel is . * **Laser Induced Fluorescence (LIF):** Een gevoelige detectiemethode . * **Elektrospray (in combinatie met Massaspectrometrie - MS):** Voor koppeling met MS . * **Indirecte A-meting:** Mogelijk door toevoeging van een absorberende stof aan het buffer medium . ### 6.5 Elektroferogram Het elektroferogram visualiseert de scheiding en toont de gedetecteerde signalen als functie van de tijd of detectorrespons . ### 6.6 Toepassingen CE kent diverse toepassingen : * Scheiding van inkten . * Scheiding van eiwitten . #### 6.6.1 Samenvatting van de scheiding CE scheidt moleculen op basis van hun grootte en lading. Alle opgeloste stoffen bewegen in de richting van de EOF. De snelheid van de EOF kan worden aangepast door de pH en de concentratie van de buffer. CE biedt zeer efficiënte scheidingen met minimale piekverbreding, hoewel alle neutrale stoffen gelijktijdig elueren. CE kan dienen als een alternatief voor LC . > **Tip:** Bij het interpreteren van elektroferogrammen is het belangrijk om rekening te houden met de gecombineerde effecten van elektroforetische mobiliteit en elektro-osmotische flow, aangezien deze de retentietijd en resolutie van de analytes bepalen. --- # Dunnelaagchromatografie (TLC) Dunnelaagchromatografie (TLC) en hogedrukdunnelaagchromatografie (HPTLC) zijn planar chromatografietechnieken die gebruikt worden voor de scheiding en analyse van mengsels [228-229, 230](#page=230). ### 7.1 Principe van dunnelaagchromatografie TLC is een vorm van planaire vloeistofchromatografie waarbij een dunne laag van een adsorberend materiaal, de stationaire fase (SF), op een substraat zoals glas, metaal of kunststof wordt aangebracht. Monsters worden als spot of band op deze laag aangebracht (spotten). De mobiele fase (MF) wordt in contact gebracht met de plaat en migreert over de SF door capillaire krachten, wat het ontwikkelingsproces wordt genoemd. Tijdens de ontwikkeling zullen stoffen die goed oplossen in de MF sneller stijgen, terwijl stoffen die sterker interageren met de SF langzamer migreren, wat leidt tot de scheiding van de componenten . ### 7.2 Praktische uitvoering van TLC De praktische uitvoering van TLC omvat verschillende stappen : * **Ontwikkelkamer:** Een ontwikkelkamer (OK) of tank wordt gebruikt, waarvan de binnenwanden vaak bekleed zijn met filtreerpapier om een verzadigde atmosfeer te creëren. De eluens (mobiele fase) wordt in de OK geplaatst . * **Spotten:** De stationaire fase wordt gespoten met het monster. De grootte van de initiële spot moet minimaal zijn om scherpe banden te verkrijgen. Voor evaluatie met een TLC-scanner moet de afstand tussen de spots constant zijn. Het is belangrijk om voldoende afstand van de randen te houden . * **Ontwikkeling:** De gespoten plaat wordt in de tank gebracht. Het eluens wordt door capillaire kracht omhoog gezogen. Na de elutie wordt de positie van het eluens gemarkeerd . * **Detectie:** Na ontwikkeling wordt de mobiele fase laten verdampen. De componenten kunnen zichtbaar worden gemaakt met behulp van kleurreagentia (universeel of specifiek) of onder UV-licht . #### 7.2.1 Spotten Het spotten vereist dat de initiële spot zo klein mogelijk is, wat mede afhangt van de keuze van het oplosmiddel van het monster . #### 7.2.2 Stationaire fase De stationaire fase is een dunne laag adsorberend materiaal . * **Silica gel:** Dit is een veelgebruikte stationaire fase. De polariteit en zuur/base-eigenschappen zijn belangrijk voor de interactie met de mobiele fase en de te scheiden stoffen . * **Partikelgrootte:** * Voor TLC ligt de partikelgrootte tussen 10 en 30 µm . * Voor HPTLC is de partikelgrootte kleiner dan 10 µm. Dit resulteert in scherpere banden/spots, een lagere detectielimiet, snellere scheiding en vereist minder staal . * **Fluorescentie-indicator:** Vaak wordt een fluorescentie-indicator toegevoegd aan de stationaire fase, waardoor de vlekken zichtbaar worden na bestraling met UV-licht (bijvoorbeeld Silicagel GF 254) . #### 7.2.3 Ontwikkeling van de plaat De ontwikkelkamer moet worden verzadigd met de mobiele fase voordat de plaat wordt ontwikkeld . ### 7.3 Kwalitatieve en kwantitatieve bepaling #### 7.3.1 Kwalitatieve bepaling Voor kwalitatieve analyse wordt de retentiefactor ($R_f$) bepaald. De $R_f$-waarde is de ratio van de afgelegde afstand door de stof tot de afgelegde afstand door het oplosmiddel : $$R_f = \frac{\text{afstand afgelegd door stof}}{\text{afstand afgelegd door oplosmiddel}}$$ Door $R_f$-waarden van standaarden en het monster te vergelijken, kan worden vastgesteld of componenten identiek zijn (zelfde $R_f$ betekent waarschijnlijk dezelfde stof) . #### 7.3.2 Kwantitatieve bepaling Voor kwantitatieve analyse worden standaardoplossingen met verschillende concentraties gebruikt. Na het spotten van standaarden en het monster, en het ontwikkelen van de plaat, kan een densitometer-scan worden uitgevoerd . ##### 7.3.2.1 Densitometer-scan Een densitometer meet de absorptie of fluorescentie van de stoffen op de plaat . * **Kalibratiecurve:** De piekoppervlakte wordt uitgezet tegen de concentratie om een kalibratiecurve te verkrijgen . * **Concentratiebepaling:** De concentratie van de componenten in de stalen wordt bepaald aan de hand van de vergelijking met de kalibratierechte . ### 7.4 Voordelen van TLC TLC biedt verschillende voordelen : * Snelle analyse van meerdere stalen, geschikt voor procescontrole en screening testen . * De TLC-plaat kan na scheiding bewaard worden voor latere evaluatie . * Snelle optimalisatie van de analyse door het gemakkelijk veranderen van de stationaire en mobiele fase . * HPTLC biedt kwantitatieve analyse met goede precisie en juistheid . **Voorbeelden van toepassingen:** * Fytotherapeutica (medicinale kruidenextracten) . * Metabolische studies in de klinische chemie . * Analyse van cosmetische producten . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Chromatografie | Een scheidingstechniek waarbij componenten van een mengsel worden verdeeld tussen een stationaire fase en een mobiele fase die zich in een bepaalde richting beweegt. De componenten verplaatsen zich met verschillende snelheden, afhankelijk van hun interactie met de fasen. | | Vloeistof-vloeistofextractie (LLE) | Een scheidingsmethode die berust op de verdeling van componenten tussen twee niet-mengbare vloeistoffen, gebaseerd op hun verschillende affiniteiten voor deze fasen. | | Stationaire fase | De fase in een chromatografische scheiding die stilstaat of beweegt met een verwaarloosbare snelheid. Dit kan een vaste stof, een vloeistof gefixeerd op een vaste drager, of een gas zijn. | | Mobiele fase | De fase die zich verplaatst in een chromatografische scheiding en de componenten van het mengsel meevoert. Dit kan een vloeistof of een gas zijn. | | Interferenties | Stoffen die de selectiviteit van een analysetechniek verstoren en verwijderd moeten worden, vaak met behulp van een scheidingsmethode. | | Elutie | Het proces van het uitspoelen van componenten uit een chromatografische kolom met behulp van de mobiele fase. | | Chromatogram | Een grafische weergave van het signaal van een detector in functie van de tijd of het volume van de mobiele fase, die de gescheiden componenten van een mengsel weergeeft. | | Retentietijd (tR) | De tijd die een component nodig heeft om de chromatografische kolom te doorlopen vanaf de injectie tot aan de detectie van de piek. | | Retentievolume (VR) | Het volume van de mobiele fase dat de kolom passeert gedurende de retentietijd van een component. Het wordt berekend als $VR = t_R \times v$, waarbij $v$ de flow rate van de mobiele fase is. | | Dode tijd (tM) of t0 | De tijd die de mobiele fase nodig heeft om de chromatografische kolom te doorlopen. Dit is de retentietijd van een component die geen interactie heeft met de stationaire fase. | | Piekbreedte (w) | De breedte van een chromatografische piek, meestal gemeten aan de basislijn. | | Resolutie (Rs) | Een maat voor de kwaliteit van de scheiding tussen twee naburige pieken in een chromatogram. Een hogere resolutie duidt op een betere scheiding. | | Verdelingscoëfficiënt (KD) | Een constante die de verhouding weergeeft van de concentratie van een stof in de stationaire fase tot de concentratie van dezelfde stof in de mobiele fase bij evenwicht. $K_D = C_s / C_m$. | | Retentiefactor (k) of Capaciteitsfactor (k') | Een dimensieloze parameter die de verhouding weergeeft van de tijd die een component in de stationaire fase doorbrengt tot de tijd die het in de mobiele fase doorbrengt. $k = (t_R - t_M) / t_M$. | | Selectiviteit (α) | De relatieve retentie van twee componenten in een chromatografische scheiding. Het is de verhouding van de verdelingscoëfficiënten of retentiefactoren van de twee componenten. $\alpha = K_{D,2} / K_{D,1} = k'_2 / k'_1$. | | Kolomefficiëntie (N) | Een maat voor de scherpte van de pieken die door een kolom worden geproduceerd. Hogere efficiëntie resulteert in smallere pieken. Het wordt vaak uitgedrukt in het aantal theoretische platen. | | Theoretische plaat | Een concept uit de schoteltheorie dat een hypothetische schijf in de kolom voorstelt waarin evenwicht wordt bereikt tussen de mobiele en stationaire fase. Het aantal theoretische platen (N) is een maat voor de efficiëntie van de kolom. | | HETP (Height Equivalent of a Theoretical Plate) | De hoogte van een theoretische plaat, die een maat is voor de efficiëntie van de kolom. Een lage HETP duidt op een efficiënte kolom. $H = L / N$, waarbij L de lengte van de kolom is. | | Van Deempter vergelijking | Een vergelijking die de relatie beschrijft tussen de kolomhoogte-equivalent van een theoretische plaat (H) en de lineaire snelheid van de mobiele fase (u). Het model houdt rekening met eddy-diffusie (A), longitudinale diffusie (B) en massatransfer (C). $H = A + B/u + Cu$. | | Gaschromatografie (GC) | Een chromatografische techniek waarbij de mobiele fase een gas is. Deze techniek wordt voornamelijk gebruikt voor de analyse van vluchtige en thermisch stabiele verbindingen. | | Vlamionisatiedetector (FID) | Een veelgebruikte detector in gaschromatografie die organische componenten detecteert door hun verbranding in een waterstof/lucht vlam, wat resulteert in een ionenstroom die wordt gemeten. | | Thermische geleidbaarheidsdetector (TCD) | Een universele detector in gaschromatografie die veranderingen in de thermische geleidbaarheid van het gasmengsel meet wanneer componenten de kolom verlaten. Alle stoffen die een andere thermische geleidbaarheid hebben dan het draaggas kunnen worden gedetecteerd. | | Elektronengecapture-detector (ECD) | Een selectieve detector in gaschromatografie die stoffen met een hoge elektronenaffiniteit detecteert, zoals gehalogeneerde verbindingen en nitro-groepen. | | Vloeistofchromatografie (LC) | Een chromatografische techniek waarbij de mobiele fase een vloeistof is. Dit omvat technieken zoals HPLC en HPTLC. | | High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) | Een geavanceerde vorm van vloeistofchromatografie die hoge druk gebruikt om de mobiele fase door een kolom met kleine deeltjes te persen, wat resulteert in snelle en efficiënte scheidingen. | | Normale fase chromatografie (NP-HPLC) | Een chromatografische techniek waarbij de stationaire fase polair is en de mobiele fase apolair. De scheiding is gebaseerd op polariteitsverschillen. | | Omgekeerde fase chromatografie (RP-HPLC) | Een chromatografische techniek waarbij de stationaire fase apolair is en de mobiele fase polair. Dit is de meest gebruikte modus in HPLC. | | Isocratische elutie | Een chromatografische scheiding waarbij de samenstelling van de mobiele fase constant blijft gedurende de analyse. | | Gradiëntelutie | Een chromatografische scheiding waarbij de samenstelling van de mobiele fase gedurende de analyse verandert, meestal van zwak naar sterk eluens, om de scheiding van componenten met sterk uiteenlopende retenties te verbeteren. | | Massaspectrometrie (MS) | Een analytische techniek die moleculen ioniseert en vervolgens scheidt op basis van hun massa-ladingverhouding (m/z). Het levert informatie over de molaire massa en structuur van een stof. | | Ionisatiebron | Het onderdeel van een massaspectrometer dat de atomen of moleculen ioniseert. Verschillende methoden omvatten Elektronenimpact (EI), Chemische ionisatie (CI), Elektrospray (ESI) en MALDI. | | Massa-analysator | Het onderdeel van een massaspectrometer dat de gevormde ionen scheidt op basis van hun massa-ladingverhouding (m/z). Voorbeelden zijn magnetische sector, quadrupool en time-of-flight (TOF). | | Tandem MS (MS-MS of MS²) | Een techniek waarbij een geselecteerd ion in een eerste massa-analysator wordt gefragmenteerd en de fragmentionen vervolgens worden geanalyseerd door een tweede massa-analysator. Dit verhoogt de specificiteit en selectiviteit. | | Capillaire elektroforese (CE) | Een scheidingstechniek die een hoge spanning gebruikt om geladen moleculen door een dunne capillaire buis te bewegen, gescheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit en de elektro-osmotische flow. | | Elektroforetische mobiliteit (μef) | De snelheid van een geladen deeltje in een elektrisch veld, exclusief de invloed van de elektro-osmotische flow. | | Elektro-osmotische flow (EOF) | De netto beweging van de gehele bufferoplossing in een capillaire elektroforese buis, veroorzaakt door de lading op de wand van de capillair en het aangelegde elektrische veld. | | Elektroferogram | De grafische weergave van het signaal van de detector in functie van de tijd in een capillaire elektroforese analyse, vergelijkbaar met een chromatogram. | | Dunnelaagchromatografie (TLC) | Een planaire chromatografische techniek waarbij de stationaire fase een dunne laag adsorberend materiaal is op een plat substraat. De mobiele fase migreert door capillaire krachten, wat leidt tot scheiding. | | Retentiefactor (Rf) | De verhouding van de afstand die een stof aflegt tot de afstand die de mobiele fase aflegt op een TLC-plaat. $R_f = afstand_{stof} / afstand_{mobiele\_fase}$. | | Densitometer | Een apparaat dat wordt gebruikt voor kwantitatieve analyse in TLC door de absorptie of fluorescentie van de gescheiden componenten (vlekken) op de plaat te meten. |