12_Detectie_kweek_en_identificatie.pdf

# Algemene principes van diagnostiek in de medische microbiologie Dit onderwerp introduceert de fundamentele principes die ten grondslag liggen aan diagnostiek binnen de medische microbiologie, met een focus op het aantonen van pathogenen of immuniteit door middel van diverse laboratoriumtechnieken [1](#page=1). ### 1.1 Inleiding tot medische microbiologische diagnostiek #### 1.1.1 De taken van het medisch microbiologisch/virologisch laboratorium Het medisch microbiologisch laboratorium heeft als primaire taak het onderzoeken van monsters aangevraagd door een arts. De kernvragen die hierbij centraal staan zijn [4](#page=4): * Heeft de patiënt (nog) een infectie [4](#page=4)? * Wat is de verwekker van de infectie [4](#page=4)? * Welke antimicrobiële middelen zijn effectief tegen de verwekker [4](#page=4)? Daarnaast speelt het laboratorium een adviserende rol met betrekking tot de afname en bewaring van monsters. De gebruikte technieken omvatten microscopie, kweek met identificatie, antigendetectie, moleculaire detectietechnieken, serologie (het aantonen van antilichamen als bewijs van infectie) en het antibiogram. Het antibiogram is niet alleen van belang voor de individuele patiënt, maar ook voor de gemeenschap door het verzamelen van resistentiecijfers en epidemiologische gegevens. Routinematig worden technieken zoals 'fingerprinting' en viruskweek niet altijd uitgevoerd [4](#page=4). Het aanvraagformulier voor testen is een essentieel document voor het laboratoriumonderzoek [5](#page=5). #### 1.1.2 Microbiologische etiologie aantonen: met welke technieken? Vaak is een klinisch beeld niet dusdanig specifiek dat de diagnose en verwekker direct duidelijk zijn. Zelfs bij schijnbaar duidelijke beelden, zoals pyelonefritis, is de verwekker niet altijd meteen gekend. Om de microbiologische etiologie aan te tonen, worden diverse technieken ingezet [7](#page=7): * **Microscopie:** Kan specifieke beelden opleveren [7](#page=7). * **Kweek:** Op eenvoudige bodems voor bacteriën [7](#page=7). * **Celkweek:** Voor de kweek van virussen en chlamydiae [7](#page=7). * **Non-culture detection:** Dit omvat de detectie van antigenen en genomen [7](#page=7). * **Immuunantwoord:** Aangetoond via serologie of huidtesten [7](#page=7). > **Tip:** Klinische ervaring is cruciaal in de diagnostiek, vooral wanneer de resultaten van de testen (nog) niet definitief zijn. Het correct interpreteren van testresultaten vereist kennis van de natuurlijke flora en de kinetiek van de immuunreactie [1](#page=1). ### 1.2 Methoden voor detectie van pathogenen en immuniteit #### 1.2.1 Directe detectie Directe detectiemethoden richten zich op het aantonen van het agens zelf of delen daarvan. ##### 1.2.1.1 Microscopie Microscopische technieken kunnen direct visuele aanwijzingen geven over de aanwezigheid van micro-organismen. Een voorbeeld hiervan is de Gramkleuring, die onderscheid maakt tussen bacteriën op basis van hun celwandstructuur [1](#page=1) [4](#page=4) [7](#page=7). ##### 1.2.1.2 Niet-microscopische methoden Naast microscopie zijn er andere methoden voor directe detectie die niet afhankelijk zijn van visuele observatie onder een microscoop. Voorbeelden hiervan zijn antigendetectie en moleculaire detectietechnieken [4](#page=4). #### 1.2.2 Detectie na amplificatie Deze methoden maken gebruik van technieken die de hoeveelheid van een specifiek molecuul, zoals genetisch materiaal, verhogen om detectie mogelijk te maken. ##### 1.2.2.1 Basistechniek voor kweek van micro-organismen Kweek is een fundamentele techniek in de microbiologie om micro-organismen te vermeerderen en zo te kunnen identificeren [2](#page=2). ##### 1.2.2.2 Identificatie van de opgegroeide bacteriën Na kweek kunnen bacteriën geïdentificeerd worden met behulp van verschillende methoden. ###### 1.2.2.2.1 Enzymatische en serologische identificatie Identificatie kan plaatsvinden door middel van het aantonen van specifieke enzymatische activiteiten van de bacterie of via serologische reacties met specifieke antilichamen [2](#page=2). ###### 1.2.2.2.2 Identificatie met MaldiTOF massaspectrografie Een geavanceerdere methode voor identificatie is MaldiTOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) massaspectrometrie, die de eiwitprofielen van micro-organismen analyseert [2](#page=2). ##### 1.2.2.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen vereisen specifieke of aangepaste kweekcondities, omdat ze moeilijk te laten groeien zijn op standaard media [2](#page=2). ##### 1.2.2.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek De interpretatie van kweekresultaten vereist inzicht in verschillende factoren. ###### 1.2.2.4.1 Staaltypes Het type monster dat is afgenomen (bijvoorbeeld bloed, urine, sputum) is cruciaal voor de interpretatie [2](#page=2). ###### 1.2.2.4.2 Belang van aspect tijd (bij diagnose door kweek) De tijd die verstrijkt tussen staalafname en resultaat is van groot belang, aangezien de kinetiek van bacteriegroei en immuunreacties de interpretatie beïnvloedt [1](#page=1) [2](#page=2). ##### 1.2.2.5 Detectie na moleculaire amplificatie Moleculaire technieken, zoals PCR (Polymerase Chain Reaction), maken het mogelijk om pathogenen aan te tonen door hun genetisch materiaal te amplificeren [1](#page=1) [2](#page=2). #### 1.2.3 Serologie Serologie richt zich op het detecteren van de immuunreactie van de patiënt tegen een agens, door het aantonen van antilichamen in het bloed. Dit kan indirect bewijs leveren van een infectie [1](#page=1) [4](#page=4) [7](#page=7). > **Example:** Bij verdenking op een virale infectie kan serologie worden ingezet om te kijken of er antistoffen tegen het specifieke virus aanwezig zijn in het bloed van de patiënt. De aanwezigheid van deze antistoffen kan wijzen op een doorgemaakte of actieve infectie [4](#page=4). ### 1.3 Belang van correcte staalafname en -bewaring Hoewel niet expliciet uitgewerkt in de verstrekte pagina's, wordt het belang van een juiste staalafname en -bewaring benadrukt als een cruciaal element binnen de diagnostiek. Een onjuiste staalafname of -bewaring kan leiden tot fout-negatieve resultaten of een verkeerde interpretatie van de testresultaten, wat de diagnostische waarde van het onderzoek ondermijnt. De arts wordt geadviseerd over welke monsters afgenomen moeten worden en hoe dit correct dient te gebeuren [1](#page=1) [4](#page=4). ### 1.4 Interpretatie van testresultaten Het interpreteren van diagnostische testresultaten vereist een brede kennisbasis. De student moet in staat zijn de resultaten te duiden met gebruikmaking van kennis over de natuurlijke flora van de mens en de kinetiek van de immuunreactie. Dit omvat ook het begrijpen van de verschillende staaltypes en het belang van de tijdscomponent bij diagnoses gesteld op basis van kweek. Onzekerheid, verwachtingen en tijdsdruk zijn factoren die de interpretatie kunnen beïnvloeden, waarbij de diagnostiek houvast kan bieden [1](#page=1) [2](#page=2) [3](#page=3). --- # Directe detectiemethoden voor pathogenen Dit deel van de studiehandleiding behandelt directe methoden voor de detectie van pathogenen, waaronder diverse microscopische technieken en niet-microscopische benaderingen zoals antigeendetectie en nucleïnezuurhybridisatie. ### 2.1 Microscopie Microscopische methoden maken gebruik van vergroting om micro-organismen zichtbaar te maken [8](#page=8). #### 2.1.1 Lichtmicroscopie * **Principle:** Gewone lichtmicroscopie kan objecten tot ongeveer 1000x vergroting waarnemen, waardoor structuren kleiner dan 0.2 µm zichtbaar kunnen worden [8](#page=8). * **Toepassingen:** * **Zonder fixatie en kleuring:** Geschikt voor het aantonen van schimmels, parasieten en voor het opsporen van urineweginfecties. Ook nuttig als 'wet stain' voor bijvoorbeeld vaginale uitstrijkjes [8](#page=8). * **Met fixatie en kleuring:** Voor een duidelijk beeld van bacteriën is een vergroting van 1000x met een gefixeerd en gekleurd preparaat vereist. De gramkleuring is de meest gebruikte kleuring in de bacteriologie, terwijl voor mycobacteriën de zuurvaste kleuring wordt ingezet [8](#page=8). * **Beperkingen:** Virussen, mycoplasmata en chlamydiae zijn niet zichtbaar met deze technieken. Virussen kunnen indirect zichtbaar worden gemaakt door hun cytopathogeen effect op celculturen [8](#page=8). #### 2.1.2 Fluorescentiemicroscopie Met fluorescentiemicroscopie kunnen micro-organismen en weefsels worden opgespoord wanneer deze zijn aangekleurd met een antiserum of probe die een fluorescerende marker bevat, of via fluorescente in situ hybridisatie (FISH). Antigenen van bacteriën en vooral virussen kunnen hiermee worden gedetecteerd door binding met gemerkte antisera (immuno-fluorescentie) [8](#page=8). #### 2.1.3 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopie is noodzakelijk voor de detectie van virussen, maar wordt zelden gebruikt in de routine-diagnostiek [8](#page=8). #### 2.1.4 Specifieke Kleuringen ##### 2.1.4.1 Gramkleuring De gramkleuring is een fundamentele kleuringstechniek in de bacteriologie [8](#page=8). * **Principe:** Het materiaal wordt eerst gekleurd met kristalviolet en gefixeerd met lugol. Vervolgens wordt het preparaat ontkleurd. Grampositieve bacteriën behouden hun blauwe kleur omdat ze niet ontkleuren, terwijl gramnegatieve bacteriën en cellen zichtbaar worden gemaakt door een rode tegenkleuring. Dit kleurverschil is te wijten aan de verschillende celwandsamenstelling, met name de hoeveelheid peptidoglycaan [11](#page=11). * **Toepassingen en interpretatie:** * **Meningitis:** Bij vermoeden van meningitis kan een gramkleuring van lumbaalvocht zeer waardevol zijn. Grampositieve diplokokken wijzen op de pneumokok, wat leidt tot behandeling met ceftriaxon. Gramnegatieve diplokokken wijzen op de meningokok, wat naast behandeling ook preventieve maatregelen voor contactpersonen vereist. In de praktijk wordt bij meningitis vaak gestart met ceftriaxon, waarna de antibiotica aangepast kunnen worden op basis van verdere analyse [12](#page=12). * **Andere monsters:** In andere soorten monsters leidt microscopie met gramkleuring niet altijd tot eenduidige informatie [12](#page=12). * **Gramnegatieve staven:** De identificatie van gramnegatieve staven (bv. *E. coli*, *Salmonella*, *Shigella*) kan nuttig zijn, hoewel ze niet specifiek zijn voor één genus. Er bestaan minder morfologische types dan er soorten zijn [13](#page=13). * **Feces en commensale flora:** In feces is het door de aanwezigheid van commensale flora vaak moeilijk pathogenen te ontdekken met gramkleuring, tenzij ze een zeer eigen morfologie hebben. De kleuring is dan meestal niet zinvol voor stoelgang, maar wel voor vaginale uitstrijkjes [13](#page=13). ##### 2.1.4.2 Zuurvaste kleuring Zuurvaste kleuringen worden gebruikt voor het opsporen van zuurvaste bacteriën, met name mycobacteriën zoals *M. tuberculosis* [14](#page=14). * **Principe:** Intracellulaire kleurstoffen kunnen niet worden verwijderd met een mengsel van zuur en alcohol, dankzij de mycolzuurmantel van de celwand [14](#page=14). * **Varianten:** * **Ziehl-Neelsen kleuring:** De klassieke methode [14](#page=14). * **Auramine kleuring:** Gebruikt auramine, een fluorescerende molecule, en wordt afgelezen met een fluorescentiemicroscoop. Deze methode is sneller en gevoeliger [14](#page=14). #### 2.1.5 Besluit Microscopie Microscopische methoden zijn snel (dezelfde dag, soms binnen 15 minuten), goedkoop en bieden goede aanwijzingen bij specifieke infecties zoals meningitis. Ze kunnen ook informatie geven over inflammatie (aanwezigheid van PMN) en staalkwaliteit (bv. plaveiselcellen in sputum duidt op slechte kwaliteit). Een 'wet stain' is toepasbaar in de eerstelijnszorg om bijvoorbeeld de drie belangrijkste verwekkers van vaginitis te detecteren. Echter, frequent is de informatie niet eenduidig door bijmenging van de normale flora of het gebrek aan specificiteit van geziene morfotypes [15](#page=15). ### 2.2 Niet-microscopische methoden Deze methoden worden gebruikt wanneer lichtmicroscopie niet volstaat omdat de kiem te klein, verborgen is of geen typisch voorkomen heeft. Ze zijn toepasbaar voor virussen, bacteriën, schimmels en protozoa. Meestal maken ze gebruik van antilichaam-gebaseerde methoden of nucleïnezuurhybridisatie (in situ) [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19). #### 2.2.1 Antigeendetectie Antigeendetectie richt zich op het aantonen van specifieke antigenen van pathogenen. * **Bacteriën:** * **Voorbeeld:** Detectie van pneumokokken- of *Legionella*-antigeen in urine bij verdenking op pneumonie. Detectie van *C. difficile*-toxine in feces bij typische diarree [16](#page=16). * **Virussen:** * **Voorbeeld:** Stoelgang: antigeentesten voor rotavirus bij diarree bij kinderen. Respiratoir aspiraat/staal: detectie van respiratoir syncytiaal virus (RSV) bij bronchiolitis bij kinderen en influenza (seizoensgriep). Bloed: detectie van HBV S Ag of HIV p24 Ag in acute infectie om de vensterperiode te verkleinen [17](#page=17). * **Schimmels:** * **Voorbeeld:** Detectie van galactomannan polysaccharide, een component van de celwand van *Aspergillus spp.*, in serum [18](#page=18). * **Protozoa:** * **Voorbeeld:** Sneltest voor *Plasmodium spp.*-antigeen in bloed bij verdenking op malaria [19](#page=19). ##### 2.2.1.1 Werkingsprincipes Antigeendetectie * **Sandwich ELISA:** Antigen wordt gevangen door een 'capture' antilichaam. Een tweede antilichaam, gebonden aan een enzym, bindt vervolgens aan het antigen. Detectie gebeurt via een enzymatische reactie die leidt tot de vorming van een gekleurd substraat, detecteerbaar door optische meting [18](#page=18). * **Immunochromatografie:** Patientenspecimen wordt aangebracht op een nitrocellulose strip en stroomt met behulp van buffer en een gelabeld detectieantilichaam richting detectielijntjes. Bij aanwezigheid van het antigen wordt het samen met het gelabelde antilichaam gevangen door een 'capture' antilichaam op een testlijn. Een controlelijn controleert de functionaliteit van de reagentia. Dit principe is vergelijkbaar met zwangerschapstests [19](#page=19). #### 2.2.2 Nucleïnezuurhybridisatie (in situ) * **Voorbeeld:** *High-risk* humaan papillomavirus (HPV) DNA *in situ* hybridisatie op cervicaal specimen bij CIN3 (cervicale intra-epitheliale neoplasie graad 3) [17](#page=17). #### 2.2.3 Besluit Niet-microscopische methoden Deze methoden zijn snel (dezelfde dag, soms binnen minuten) en eenvoudig te hanteren, waardoor weinig opleiding nodig is. Per individueel staal kunnen de kosten echter vrij hoog zijn, met veel afval. Ze zijn specifiek, wat betekent dat er gericht gezocht wordt en eventueel andere oorzaken gemist kunnen worden. De gevoeligheid kan beperkt zijn bij sommige tests [20](#page=20). --- # Detectie van pathogenen na amplificatie en kweek Dit hoofdstuk beschrijft de methoden voor detectie van pathogenen na initiële amplificatie, met een focus op kweektechnieken voor micro-organismen, hun identificatie en de interpretatie van resultaten. ### 3.1 Basistechniek voor kweek van micro-organismen De basistechniek voor kweek van micro-organismen berust op het bieden van optimale omstandigheden waarin deze zich kunnen vermenigvuldigen tot aantallen die detecteerbaar zijn. Deze optimale omstandigheden omvatten [21](#page=21): * **Optimale voedingsbron:** Dit bevat suikers, een stikstofbron (zoals vlees- of plantendigest), een buffer en mineralen [21](#page=21). * **Optimale temperatuur:** Meestal rond de 36 °C [21](#page=21). * **Optimale atmosferische condities:** Dit kan aeroob, anaeroob of capnofiel (verhoogde CO2-concentratie) zijn, afhankelijk van het micro-organisme [21](#page=21). Na een aanpassingsperiode start een logaritmische toename van het aantal micro-organismen [21](#page=21). #### 3.1.1 Soorten kweekbodems Er zijn twee hoofdtypes kweekbodems: * **Vloeibare kweekbodems:** Deze worden voornamelijk gebruikt voor verder onderzoek naar de kenmerken van bacteriën, waarbij de groei wordt aangegeven door troebelheid (positief) of afwezigheid daarvan (negatief) [22](#page=22). * **Agarbodems:** Hierop ontstaan zichtbare kolonies, waarbij één bacterie één kolonie vormt. Dit maakt het mogelijk om het aantal soorten in een monster te beoordelen en geeft soms al een indicatie van de soort of groep. De resultaten kunnen semikwantitatief worden gerapporteerd (bv. groei in zone 1, 2, etc.) of kwantitatief als aantal kolonies per volume-eenheid (KVE of CFU) [22](#page=22). #### 3.1.2 Selectieve en differentiële kweekbodems Naast basale voedingsstoffen kunnen kweekbodems worden aangepast om specifieke doelen te bereiken [23](#page=23): * **Verrijking:** Stoffen kunnen worden toegevoegd om de groei van moeilijke soorten te bevorderen [23](#page=23). * **Bloedtoevoeging:** Verbetering van de groei van bepaalde soorten en detectie van hemolyse [23](#page=23) [24](#page=24). * **Selectiviteit:** Onderdrukking van specifieke soorten om klinisch relevante soorten beter zichtbaar te maken. Dit is essentieel voor het isoleren van specifieke soorten uit mengflora [23](#page=23). * **Differentiatie:** Gebruik van pH-indicatoren of chromogene stoffen die resulteren in kolonies met verschillende kleuren en uitzichten [23](#page=23). * **Antibiotica:** Integratie van antibiotica om alleen resistente soorten op te sporen, zoals screening op MRSA [23](#page=23). **Hemolyse van rode bloedcellen** is een belangrijk kenmerk, vooral bij streptokokken, dat helpt bij de eerste identificatie van groep of soort. Er zijn verschillende soorten hemolyse: β-hemolyse (volledige afbraak), α-hemolyse (vergroening) en niet-hemolytisch (γ-hemolyse) [24](#page=24). ### 3.2 Identificatie van de opgegroeide bacteriën Nadat bacteriën zijn opgegroeid, wordt hun identificatie gebaseerd op een combinatie van eigenschappen [25](#page=25): * **Morfologie:** Gramkleuring en celvorm [25](#page=25). * **Uitzicht van kolonies:** Grootte, randen, kleur (pigment, indicator) en geur [25](#page=25). * **Fysiologische en biologische kenmerken:** * Afbraak en/of assimilatie van suikers en aminozuren [25](#page=25). * Groei onder specifieke omstandigheden van temperatuur, pH, zoutconcentratie [25](#page=25). * Profiel van kenmerkende metabolieten [25](#page=25). * Celwandsamenstelling [25](#page=25). * **Genetisch profiel:** Totale DNA of ribosomaal RNA [25](#page=25). * **Serologische methoden:** Gebruik van specifieke antilichamen tegen typische antigenen [25](#page=25). #### 3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie **Enzymatische tests** evalueren de metabolische capaciteiten van bacteriën, zoals de ureasetest die de splitsing van ureum detecteert door alkalinisatie en een kleuromslag van de indicator. Deze tests worden vaak gegroepeerd in geautomatiseerde "batterijen" [26](#page=26). **Serologische methoden** maken gebruik van specifieke antilichamen voor snelle identificatie of typering. Een veelgebruikte techniek is agglutinatie met specifieke antilichamen gebonden aan latexdeeltjes, wat resulteert in klontering bij aanwezigheid van het corresponderende antigeen. Een voorbeeld is de detectie van *S. aureus* [26](#page=26). #### 3.2.2 Identificatie met MALDI-TOF massaspectrografie Matrix-assisted laser desorption/ionization Time-of-flight (MALDI-TOF) massaspectrografie is een relatief nieuwe techniek die in de diagnostische laboratoria wordt gebruikt voor de identificatie van micro-organismen. De voordelen zijn [27](#page=27): * **Universaliteit:** Identificatie mogelijk zonder voorkennis van de te verwachten groep [27](#page=27). * **Snelheid:** Resultaten zijn vaak binnen 24 uur beschikbaar, wat een aanzienlijke tijdwinst oplevert ten opzichte van klassieke methoden (die 48 uur kunnen duren) [27](#page=27). **Principe van MALDI-TOF MS:** 1. Een kleine hoeveelheid gekweekte bacterie wordt gefixeerd op een drager (matrix) [28](#page=28). 2. Onder vacuüm wordt het monster met een laser gefragmenteerd, waarbij eiwitten uiteenvallen in deeltjes [28](#page=28). 3. Deze deeltjes worden gescheiden op basis van hun massa-ladingverhouding in een Time-of-Flight (TOF) buis: zwaardere fragmenten bewegen langzamer, lichtere sneller [28](#page=28). 4. De gescheiden deeltjes worden geregistreerd, wat resulteert in een "piekenpatroon". Dit spectrum wordt vergeleken met een database van referentiemassa-spectra om een identificatie te verkrijgen [28](#page=28) [29](#page=29). > **Tip:** MALDI-TOF MS biedt een universele en snelle identificatiemethode voor micro-organismen, wat de diagnostische workflow aanzienlijk versnelt. ### 3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Niet alle micro-organismen zijn gemakkelijk te kweken met standaardmethoden. Enkele uitdagingen en specifieke kweekvereisten zijn: * **Anaeroben:** Vereisen kweekomstandigheden zonder zuurstof, inclusief tijdens transport [31](#page=31) [32](#page=32). * **Trage groeiers of niet op klassieke bodems:** * **Mycobacteriën:** Groei kan weken duren [31](#page=31). * **Mycoplasmata:** Produceren microscopische kolonies op speciale media [31](#page=31). * **Chlamydia:** Vereisen speciale cellijnen voor kweek. De aanwezigheid kan worden aangetoond met lugolkleuring die glycogeenbevattende inclusies kleurt [31](#page=31) [33](#page=33). * **(Bijna) onkweekbare bacteriën:** Sommige groeien wel in levende dieren (bv. *Mycobacterium leprae* in gordeldieren, *Treponema pallidum* in konijnen) maar niet in vitro [31](#page=31). * **Schimmels en gisten:** Kunnen groeien op bacteriële media of specifieke selectieve media vereisen. Groei kan langzamer zijn dan bij bacteriën [31](#page=31). * **Virussen:** Zijn obligaat intracellulaire organismen en vereisen kweek op specifieke cellijnen. Detectie kan via cytopathogeen effect of immuunmethoden. Moleculaire methoden vervangen kweek steeds vaker [31](#page=31). * **Protozoa:** Worden niet routinematig gekweekt in de diagnostiek [31](#page=31). > **Tip:** Voor organismen die moeilijk te kweken zijn, is het belangrijk om op de hoogte te zijn van specifieke kweekvereisten en, indien mogelijk, snellere non-culture technieken te overwegen [39](#page=39). ### 3.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek De interpretatie van kweekresultaten in de routine diagnostiek is cruciaal en vereist een strategische aanpak [34](#page=34). #### 3.4.1 Strategie en staaltypes De strategie is **niet** om alle bacteriën in een monster te identificeren, maar om de kweek- en identificatietechnieken af te stemmen op de klinische vraag. Commensale bacteriën zijn vaak aanwezig en vormen geen pathologie op zich [34](#page=34). De interpretatie is afhankelijk van het type staal: * **Type 1:** Staal afkomstig van een plaats zonder normale flora (bv. bloed, gewrichtsvocht). Gevonden bacteriën zijn hoogstwaarschijnlijk pathogenen. Voorzorgsmaatregelen bij afname (aseptisch, desinfectie) zijn essentieel om contaminatie te minimaliseren. Huidbewoners die in kleine aantallen worden gevonden, worden meestal als contaminanten beschouwd, tenzij de patiënt immuungecompromitteerd is of prothesen heeft. Een bijzondere vorm is de **hemocultuur (bloedkweek)**, waarbij een groot volume rijke vloeibare bodem wordt gebruikt om zowel pathogenen als contaminanten te ondersteunen [36](#page=36). * **Type 2:** Staal afkomstig van een plaats zonder normale flora, maar dat een zone met normale flora passeert (bv. sputum, urine). Maatregelen bij afname, transport en verwerking zijn gericht op het maximaliseren van de detectie van pathogenen ('witte bollen') en het minimaliseren van contaminatie ('zwarte bollen') [37](#page=37). * **Afname:** Diepe sputummonsters en midstream urine worden geprefereerd [37](#page=37). * **Transport:** Snel transport is cruciaal om bacteriegroei of afsterving te voorkomen en de kwaliteit van het monster te behouden. Urine moet koel bewaard worden [37](#page=37). * **Laboratorium:** Kwantitatieve kweken zijn belangrijk, waarbij kleine aantallen waarschijnlijk niet de verwekkers zijn. Alleen bekende verwekkers worden gerapporteerd. Veel plaveiselcellen in sputum duiden op speekselcontaminatie, terwijl veel neutrofielen op infectie kunnen wijzen [37](#page=37). * **Type 3:** Monsters met pathogenen gemengd met bestaande commensale flora (bv. feces, keeluitstrijkje, fistel). Hierbij is kennis van de potentiële verwekkers essentieel. Selectieve media worden gebruikt om potentiële pathogenen op te sporen. De kwantiteit kan belangrijk zijn, bijvoorbeeld bij *Candida*-infecties. Screening op multiresistente stammen (bv. MRSA) is ook een belangrijk aspect [38](#page=38). #### 3.4.2 Communicatie en pre-analytische kwaliteit * **Communicatie:** Essentieel is de communicatie met de microbioloog, vooral als er afwijkingen van de standaardverwachtingen zijn (bv. door reizen, specifieke blootstellingen, immunosuppressie). Bij urineweginfecties kan de kwantitatieve drempel verschillen tussen patiënten met symptomen en screening [38](#page=38). * **Pre-analytische kwaliteit:** Goede staalkwaliteit (bv. diep sputum, geen speeksel) is fundamenteel voor betrouwbare resultaten [38](#page=38). #### 3.4.3 Belang van tijd bij diagnose door kweek De analysetijd van microbiologische onderzoeken op basis van kweek is aanzienlijk vergeleken met bijvoorbeeld chemische bepalingen [39](#page=39). * **Bacteriologie (gewone soorten):** * Microscopie: enkele minuten tot dezelfde dag [39](#page=39). * Kweek + identificatie: 24-48 uur (overnacht incubatie gevolgd door identificatie). Met MALDI-TOF kan dit sneller [27](#page=27) [39](#page=39). * Antibiogram: 48 uur (vereist eerst groei) [39](#page=39). * **Virussen, mycobacteriën, mycoplasmata, anaeroben:** Vereisen vaak langere groeitijden en complexere procedures [39](#page=39). > **Tip:** Houd rekening met de benodigde tijd voor kweek en identificatie, en informeer naar tussentijdse resultaten die al nuttige informatie kunnen verschaffen. Voor specifieke, langzaam groeiende of moeilijk te kweken micro-organismen kunnen snellere methoden noodzakelijk zijn [39](#page=39). --- # Moleculaire diagnostiek en serologie Dit deel behandelt moleculaire detectietechnieken, voornamelijk gebaseerd op PCR, voor de detectie en kwantificering van diverse pathogenen, en bespreekt de serologie, waarbij antilichamen in serum worden opgespoord om contact met een pathogeen aan te tonen. ### 4.1 Moleculaire detectietechnieken Moleculaire detectietechnieken worden voornamelijk gebruikt voor de detectie en kwantificering van diverse pathogenen. Deze methoden zijn vaak gebaseerd op (reverse transcriptie-) PCR en zijn doorgaans kwantitatief. Ze vereisen een specifieke staalvoorbereiding en strikte voorzorgsmaatregelen om moleculaire contaminatie op het laboratorium te voorkomen, aangezien het eindproduct na gigantische amplificatie andere stalen niet mag 'besmetten' om valse positieve resultaten te vermijden. Er is een evolutie naar automatisatie en de beschikbaarheid voor individuele stalen, wat urgente analyses mogelijk maakt [40](#page=40). #### 4.1.1 Toepassingsgebied van moleculaire detectietechnieken Moleculaire detectietechnieken hebben een zeer breed toepassingsgebied voor alle pathogenen en zijn zeer specifiek en gevoelig, wat zowel een voor- als een nadeel kan zijn. Ze kunnen eventueel gecombineerd worden met sequencing (Sanger of deep sequencing) [40](#page=40). ##### 4.1.1.1 Bacteriën Bij bacteriën kunnen moleculaire technieken worden toegepast direct op het staal of in combinatie met kweek. Ze worden gebruikt voor [41](#page=41): * Aantonen van de aanwezigheid (16S RNA gen PCR) [41](#page=41). * Aantonen van moeilijk kweekbare organismen, zoals mycobacteriën [41](#page=41). * Detectie van resistentiegenen na kweek van het staal [41](#page=41). * Typeren en vergelijken van stammen, bijvoorbeeld in ziekenhuishygiëne [41](#page=41). * Onderzoeken van de diversiteit van flora, zoals het microbioom van de darm [41](#page=41). ##### 4.1.1.2 Virussen Bij virussen worden moleculaire technieken direct op het staal toegepast voor: * Aantonen van de aanwezigheid en kwantificeren (soortspecifiek, bv. HIV, CMV, HSV, HBV) [41](#page=41). * Typeren van virale varianten (genotypes) of bepaling van antivirale resistentie op genetisch niveau [41](#page=41). ##### 4.1.1.3 Schimmels Bij schimmels worden moleculaire technieken direct op het staal toegepast, met name voor respiratoire stalen, om de aanwezigheid aan te tonen (soortspecifiek, bv. Aspergillus fumigatus) [41](#page=41). ##### 4.1.1.4 Protozoa Moleculaire technieken worden direct op het staal (biopten, stoelgang, bloed) toegepast om de aanwezigheid van protozoa aan te tonen, zoals bij toxoplasmose, amoebiase en Plasmodium falciparum [41](#page=41). ##### 4.1.1.5 Wormen Direct op het staal (stoelgang, serum) kunnen moleculaire technieken de aanwezigheid van wormen aantonen, zoals bij nematoden, filariasen en schistosomiase [41](#page=41). ### 4.2 Serologie Serologie omvat het opsporen van antilichamen in serum, eventueel in lumbaal vocht simultaan met serum. Deze methoden zijn meestal gebaseerd op het ELISA-principe en kunnen binnen enkele uren worden afgewerkt [42](#page=42). #### 4.2.1 Principe van serologische detectie Serologisch onderzoek toont indirect een voorgaand contact met een pathogeen aan; het geeft op zichzelf geen informatie of het pathogeen nog aanwezig is in het lichaam. Een functioneel immuunsysteem is nodig voor antistofproductie, wat niet het geval is bij bijvoorbeeld SCID-patiënten. Antilichamen zijn stabiel in vitro: een in de koelkast bewaard serumstaal is weken bruikbaar, en ingevroren zelfs jaren voor serologische testing [42](#page=42). > **Voorbeeld:** Een antilichaam detectietest volgens de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Hierbij wordt een antigeen (rode bol) op de bodem van een plastic drager gecoat. Patiëntserum (gele antilichamen) wordt toegevoegd, en detectie gebeurt door een enzymgebonden anti-immuunglobuline (blauw, bv. anti-IgM of anti-IgG). Na toevoeging van een substraat ontstaat een kleurreactie in de well, die optisch gedetecteerd kan worden [42](#page=42). #### 4.2.2 Interpretatie van serologische profielen ##### 4.2.2.1 IgM antistoffen IgM-antilichamen wijzen meestal op een recente infectie. Ze worden positief binnen één week, pieken binnen twee weken, en worden vaak na enkele maanden weer negatief. Vóórdat diagnostische testen positief worden, kan de infectie wel degelijk zijn opgetreden en is de patiënt mogelijk infectieus voor anderen; dit wordt de vensterperiode of window phase genoemd. Pogingen om deze periode te verkorten omvatten het uitvoeren van PCR-detectie naast serologie, hoewel er altijd een vensterperiode blijft. Voor HIV is de PCR bijvoorbeeld binnen een tiental dagen positief na infectie, terwijl serologie gemiddeld pas na drie weken positief wordt [43](#page=43). ##### 4.2.2.2 IgG antistoffen Specifieke IgG's zijn meestal pas na meer dan één week detecteerbaar en vaak levenslang detecteerbaar, hoewel dit niet altijd het geval is. Er is variatie afhankelijk van de infectie die aan de basis ligt van de immuunrespons [43](#page=43). ##### 4.2.2.3 Titerbepaling Serologisch onderzoek kan kwalitatief (positief of negatief) of kwantitatief gebeuren via een 'titer'. Vooral voor IgG kan een titerbepaling nuttig zijn. Een viervoudige toename in antilichaamconcentratie in twee opeenvolgende stalen met minstens twee weken ertussen kan duiden op een recente infectie. IgG en eventueel IgM titers kunnen ook stijgen bij reactivatie van een latente infectie (virus) [43](#page=43). > **Voorbeeld:** Een serologisch profiel met een 'boost' bij herinfectie, eventueel na jaren, vergelijkbaar met vaccinatie. De affiniteit van latere golven IgG zal hoger zijn dan de eerste [43](#page=43). #### 4.2.3 Speciale gevallen en beperkingen IgM-titers tegen allerlei antigenen kunnen stijgen bij infectie met EBV door polyklonale activatie, waarbij het virus de B-cel infecteert. De patiënt kan dan in verschillende IgM-testen positief worden, bijvoorbeeld tegen virussen waarmee de patiënt in het verleden contact heeft gehad. Soms wordt de affiniteit van de aanwezige IgG's bepaald, bijvoorbeeld bij CMV-seropositiviteit bij een zwangere vrouw [44](#page=44). Er kunnen vals negatieve resultaten optreden bij patiëntengroepen die moeilijker antilichamen vormen, zoals neonaten, hoogbejaarden en immuungedeprimeerden. Vals positieve resultaten kunnen voorkomen bij patiëntengroepen die antilichamen 'passief' hebben gekregen, zoals neonaten (transplacentair en via moedermelk, detecteerbaar tot zes maanden na geboorte) of na transfusie met plasmahoudende producten (plaatjes, virusgeïnactiveerd plasma) of immuunglobulines [44](#page=44). > **Voorbeeld:** Serologisch verloop bij een hepatitis B virusinfectie met spontane genezing. Er zijn verschillen tussen antigen- en antilichaamtiters over tijd, met aandacht voor IgM en IgG. De infectieuze periode (HBsAg+) gaat vooraf aan de symptomen (geelzucht). Met DNA-PCR kan het virus in serum 1-2 weken vóór HBsAg gevonden worden [44](#page=44). #### 4.2.4 Toepassingsgebied van serologie Het toepassingsgebied van serologie omvat: 1. Voornamelijk voor virussen, gezien hun chroniciteit en directe link tussen aanwezigheid van het kiem en ziekte. Bij bacteriën is het nut beperkter, maar het wordt gebruikt bij de diagnostiek van syfilis, de ziekte van Lyme (Borrelia burgdorferi) of in het lab voor serotypering van bacteriële stammen. Voor andere pathogenen is het meer gespecialiseerd [45](#page=45). 2. Nut voor het screenen naar dragers van infectieziekten (HIV, HBV, HCV) en het opvolgen van vaccinatiestatus (HBV) [45](#page=45). 3. Voor individuele diagnostiek van doorgemaakte infecties, eventueel intracerebraal met lumbaal vocht: hoge lokale titers wijzen op lokale productie [45](#page=45). 4. Voor preventie, bijvoorbeeld CMV-serologie of Toxoplasma-serologie voor zwangerschap [45](#page=45). #### 4.2.5 Besluit over serologie Serologie is snel en goedkoop. Voor de belangrijkste pathogenen is het vrij specifiek en gevoelig en stabiel in vitro. Voor elke infectie of vraagstelling is er een eigen strategie van serologische testen; soms is een combinatie van testen nodig, bijvoorbeeld samen met detectie van het agens of een deel ervan. De belangrijkste beperking is dat het een indirect aantonen is van vroeger contact met een pathogeen, wat geen informatie geeft of het pathogeen nog aanwezig is. Dit is uiteraard geen probleem als het kiem per definitie nagenoeg nooit wordt geëlimineerd, zoals bij HIV [45](#page=45). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Diagnostiek | Het proces van het identificeren van de aard en oorzaak van een ziekte of aandoening, vaak door middel van laboratoriumonderzoek en klinische evaluatie. | | Staalafname | Het proces van het verzamelen van biologisch materiaal, zoals bloed, urine of weefsel, voor diagnostisch onderzoek. | | Staalbewaring | De correcte opslag en behandeling van verzameld biologisch materiaal om de integriteit en betrouwbaarheid van diagnostische tests te waarborgen. | | Pathogeen | Een micro-organisme, zoals een bacterie, virus, schimmel of parasiet, dat ziekte kan veroorzaken. | | Immuniteit | De staat van bescherming tegen een ziekte, verkregen door eerdere blootstelling of vaccinatie, die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van specifieke antilichamen of cel-gemedieerde afweermechanismen. | | Microscopie | De techniek om objecten of structuren te bestuderen die te klein zijn om met het blote oog zichtbaar te zijn, met behulp van een microscoop. | | Gramkleuring | Een differentiële kleuringstechniek die bacteriën in twee hoofdgroepen verdeelt: grampositief (kleurt blauw/paars) en gramnegatief (kleurt rood/roze), gebaseerd op de structuur van hun celwand. | | Kweek | Een laboratoriumtechniek waarbij micro-organismen worden gekweekt op een voedingsbodem om hun groei en identificatie mogelijk te maken. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Een moleculaire techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-sequenties exponentieel te vermenigvuldigen, wat detectie van zelfs kleine hoeveelheden genetisch materiaal mogelijk maakt. | | ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) | Een veelgebruikte serologische test die antilichamen of antigenen detecteert door middel van een enzymatische reactie, vaak resulterend in een kleurverandering. | | Serologie | De studie van serum en de antilichamen daarin, voornamelijk gebruikt voor de diagnose van infectieziekten door de aanwezigheid van specifieke antilichamen tegen pathogenen aan te tonen. | | Natuurlijke flora | De gemeenschap van micro-organismen die van nature op of in het lichaam leven zonder ziekte te veroorzaken, en vaak een beschermende rol spelen. | | Kinetiek van de immuunreactie | De tijdsverloop van de immuunrespons, inclusief de snelheid waarmee antilichamen of immuunmoleculen worden geproduceerd en gedetecteerd. | | Antigeendetectie | Een methode om specifieke moleculen (antigenen) van een pathogeen direct in een biologisch monster aan te tonen. | | Moleculaire detectietechnieken | Een breed scala aan technieken die zich richten op het detecteren van genetisch materiaal (DNA of RNA) van pathogenen. | | Antibiogram | Een laboratoriumtest die de gevoeligheid van een bacterie voor verschillende antibiotica bepaalt, essentieel voor het kiezen van de juiste behandeling. | | Cytopathogeen effect | Veranderingen in cellen die veroorzaakt worden door een virusinfectie, zichtbaar onder de microscoop, zoals celvervorming of vernietiging. | | Fluorescentiemicroscoop | Een microscoop die fluorescentie gebruikt om specifieke structuren of moleculen zichtbaar te maken, vaak met behulp van fluorescerende kleurstoffen of probes. | | FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) | Een moleculaire techniek die gebruikmaakt van fluorescerende probes om specifieke DNA- of RNA-sequenties direct in cellen of weefsels te visualiseren. | | Zuurvaste kleuring | Een speciale kleuringstechniek, zoals de Ziehl-Neelsen of auramine kleuring, die wordt gebruikt om zuurvaste bacteriën, met name mycobacteriën, te identificeren vanwege hun unieke celwandstructuur. | | MaldiTOF massaspectrografie | Een techniek die wordt gebruikt voor de snelle en universele identificatie van micro-organismen door de massa-tot-ladingverhouding van hun eiwitfragmenten te meten. | | Kweekbodem | Een voedingsmedium dat wordt gebruikt om de groei van micro-organismen in een laboratoriumomgeving te ondersteunen. | | Selectieve bodems | Kweekbodems die stoffen bevatten die de groei van bepaalde soorten micro-organismen bevorderen of remmen, waardoor specifieke pathogenen gemakkelijker te isoleren zijn. | | Differentiële bodems | Kweekbodems die indicatorstoffen bevatten, zoals pH-indicatoren of chromogene stoffen, waardoor kolonies van verschillende micro-organismen visueel te onderscheiden zijn door kleurverschillen. | | Hemolyse | Het afbreken van rode bloedcellen, wat een kenmerk kan zijn dat wordt waargenomen op bloedagarplaten en helpt bij de identificatie van bepaalde bacteriën, zoals streptokokken. | | Commensale flora | Micro-organismen die normaal gesproken in een bepaald lichaamsdeel voorkomen en daar geen schade aanrichten. | | Moleculaire amplificatie | Technieken zoals PCR die de hoeveelheid genetisch materiaal van een pathogeen verhogen om detectie te vergemakkelijken. | | Obligate parasiet | Een organisme dat niet buiten een levende gastheercel kan overleven of zich voortplanten. | | Vensterperiode (window phase) | De tijdsperiode tussen de initiële infectie met een pathogeen en het moment waarop diagnostische tests (zoals serologie) positief worden. | | Titer | Een kwantitatieve maat voor de concentratie van een stof, zoals antilichamen, in een monster; een stijgende titer duidt vaak op een recente infectie. | | IgM antistoffen | Antilichamen die de eerste immuunrespons op een infectie vertegenwoordigen en wijzen op een recente blootstelling aan een pathogeen. | | IgG antistoffen | Antilichamen die aanwezig zijn bij langdurige of eerdere infecties, en vaak levenslang detecteerbaar blijven na blootstelling. | | Polyklonale activatie | Een proces waarbij B-cellen worden gestimuleerd om verschillende antistoffen te produceren, zelfs tegen antigenen waarmee de patiënt niet eerder in contact is gekomen, vaak veroorzaakt door virale infecties. | | Automaatisering | Het gebruik van geautomatiseerde systemen om laboratoriumprocessen uit te voeren, wat kan leiden tot verhoogde efficiëntie, reproduceerbaarheid en snelheid. | | Genoom | De volledige set van genetisch materiaal van een organisme. | | Sequencen | Het bepalen van de nucleotidische volgorde van DNA of RNA. | | Microbioom | De verzameling van alle micro-organismen die op of in een bepaald organisme leven, inclusief hun genen. |