Microbiology Molecular Biology

# Variaties in DNA Het opsporen van variaties in DNA is cruciaal in biomedisch onderzoek en diagnostiek, met toepassingen variërend van erfelijke aandoeningen en kanker tot de identificatie van micro-organismen. Deze variaties kunnen op verschillende niveaus optreden, van grote chromosomale veranderingen tot kleine mutaties in de DNA-sequentie, en hebben uiteenlopende gevolgen voor het fenotype [8](#page=8). ### 1.1. DNA-variaties op niveau van chromosomen #### 1.1.1. Polyploïdie en trisomie Polyploïdie verwijst naar cellen die meer dan twee exemplaren van elk chromosoom bezitten, in tegenstelling tot het normale diploïde aantal ($2n$). Bij mensen is $n=23$, dus $2n=46$. Triploïdie ($3n$) en tetraploïdie ($4n$) kunnen ontstaan door onregelmatigheden tijdens de celdeling, zoals non-disjunctie van chromosomen tijdens de meiose, wat kan leiden tot een diploïde eicel die bevrucht wordt door een haploïde zaadcel, resulterend in een triploïde zygote. Hoewel polyploïdie bij zoogdieren vaak niet levensvatbaar is, komt het bij planten en sommige andere dieren wel veelvuldig voor [8](#page=8). Trisomieën ontstaan door non-disjunctie tijdens de meiotische deling, wat resulteert in een extra chromosoom. Voorbeelden van autosomale trisomieën zijn trisomie 21 (Downsyndroom), trisomie 18 (Edwardsyndroom) en trisomie 13 (Patausyndroom). Geslachtsgebonden trisomieën omvatten het Klinefeltersyndroom (XXY) en Turner syndroom (X0) [9](#page=9). > **Voorbeeld:** Een karyogram van een patiënt met trisomie 21 toont drie exemplaren van chromosoom 21, wat leidt tot het Downsyndroom [9](#page=9). #### 1.1.2. Chromosomale translocaties Translocaties zijn veranderingen waarbij stukken van chromosomen van plaats verwisseld worden [9](#page=9). * **Reciproke translocaties:** Hierbij wisselen twee niet-homologe chromosomen DNA-segmenten uit. Dit kan leiden tot verstoring van genfuncties, verandering van genexpressie door een andere promotor, of de creatie van hybride fusie-eiwitten, zoals het bcr-abl gen op het Philadelphia chromosoom bij chronische myeloïde leukemie (CML) [10](#page=10) [9](#page=9). > **Voorbeeld:** De reciproke translocatie tussen chromosoom 8 en 14 is geassocieerd met het Burkitt lymfoom [9](#page=9). * **Niet-reciproke translocaties:** Hieronder vallen inversies binnen hetzelfde chromosoom of Robertsoniaanse translocaties, waarbij één chromosoom aan een ander vasthecht [10](#page=10). #### 1.1.3. Chromosomale deleties en inserties Bij deleties verdwijnen delen van een chromosoom, met als gevolg het verlies van genen. Grote deleties leiden vaak tot syndromen, zoals het Cri-du-chat syndroom door een deletie op 5p. Kleine deleties en inserties van enkele baseparen worden verder besproken als INDELs. Deleties kunnen ontstaan door ongelijke crossing-over tijdens de meiose [10](#page=10). #### 1.1.4. Chromosomale duplicaties Duplicaties ontstaan ook door ongelijke crossing-over tijdens de meiose, waarbij een chromosoom een bepaald DNA-fragment tweemaal bevat. De grootte van duplicaties kan variëren, van microscopisch detecteerbaar tot duplicaties van enkele tot duizenden baseparen [10](#page=10). > **Tip:** Ongelijke crossing-over tijdens de meiose kan zowel leiden tot deleties op het ene chromosoom als tot duplicaties op het andere [11](#page=11). #### 1.1.5. Chromosomale inversies Een inversie is een segment van een chromosoom dat 180° gedraaid is binnen hetzelfde chromosoom. Dit veroorzaakt geen verlies van genetische informatie, maar kan wel de gensequentie herschikken [11](#page=11). ### 1.2. DNA-variaties op niveau van DNA #### 1.2.1. SNPs en INDELs * **SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms):** Dit zijn substituties van één enkele nucleotidebase in de DNA-sequentie [11](#page=11). * **INDELs (Insertions/Deletions):** Dit zijn kleine deleties of inserties van één of enkele baseparen [11](#page=11). Deze variaties kunnen leiden tot verschillende gevolgen voor het eiwit en fenotype: * **Missense mutatie:** Een basensubstitutie resulteert in een ander aminozuur [12](#page=12). * **Nonsense mutatie:** Een codon wordt veranderd in een stopcodon (TAA, TAG, TGA), wat leidt tot vroegtijdige translatie-stop en een verkort, meestal niet-functioneel eiwit [12](#page=12). * **Anti-nonsense mutatie:** Een stopcodon muteert naar een codon voor een aminozuur, wat resulteert in een langer eiwit [12](#page=12). * **Silent mutatie:** Een basenpaarverandering leidt niet tot een aminozuurverandering [12](#page=12). * **Frameshift mutatie:** Een deletie of insertie van een aantal basenparen dat geen veelvoud is van drie, verstoort het leesraam van de mRNA-sequentie. Dit leidt vaak tot een vroegtijdig stopcodon en een niet-functioneel eiwit [12](#page=12). > **Voorbeeld:** Beta zero-thalassemieën kunnen veroorzaakt worden door frameshift mutaties [12](#page=12). * **Splice site mutaties:** Mutaties op de grens van een exon en intron beïnvloeden het splicingproces, waardoor intronen niet (volledig) verwijderd worden of exonen juist worden uitgesplitst [12](#page=12). * **Transcriptionele mutaties:** Mutaties in flankerende regio's (5' of 3') kunnen het transcriptieniveau van een gen veranderen [13](#page=13). > **Voorbeeld:** Bij bèta-thalassemie kan een verandering in de TATA-box leiden tot verminderde transcriptie [13](#page=13). * **Translationele mutaties:** Veranderingen in de efficiëntie van mRNA-binding aan het ribosoom kunnen optreden [13](#page=13). #### 1.2.2. Trinucleotide repeats Repeterende sequenties, met name trinucleotide (triplet) repeats, zijn gevoelig voor expansie tijdens DNA-replicatie of herstelmechanismen. Een abnormale expansie kan leiden tot een verstoorde genfunctie en genetische aandoeningen [13](#page=13). * Een trinucleotide herhaling (TNR) is een triplet van nucleotiden dat zich herhaalt [13](#page=13). * Bij abnormale expansie worden de herhalingen onstabieler en nemen toe in aantal over generaties [13](#page=13). * CAG, dat codeert voor glutamine, is een veelvoorkomend triplet in neurodegeneratieve stoornissen gerelateerd aan TNRs [13](#page=13). * Stoornissen door instabiele TNRs worden vaak dominant overgeërfd en vertonen **anticipatie** [14](#page=14). * **Genetische anticipatie** is de toenemende ernst, penetratie en/of afnemende leeftijd van aanvang van de ziekte in opeenvolgende generaties, door toename van het aantal herhalingen [14](#page=14). > **Voorbeelden van aandoeningen door trinucleotide expansies:** Fragiele X-syndroom, ziekte van Huntington, myotone dystrofie [13](#page=13). #### 1.2.3. Epigenetische variatie: DNA-methylatie Epigenetica bestudeert veranderingen in genexpressie die niet worden veroorzaakt door veranderingen in de DNA-sequentie zelf, maar door factoren zoals chromatine-structuur en biochemische markers [14](#page=14). * **DNA-methylatie:** Een belangrijk epigenetisch mechanisme waarbij cytosine (C) wordt omgezet in 5-methylcytosine. Sterk gemethyleerde regio's leiden tot 'uitzetten' van genen [14](#page=14). * DNA-methylatie is essentieel voor normale ontwikkeling en betrokken bij genomische imprinting, X-chromosoominactivatie, suppressie van repetitieve elementen en carcinogenese [14](#page=14). * Tussen 60-90% van alle CpGs in zoogdieren zijn gemethyleerd. Gemethyleerde C-residuen kunnen deamineren tot T, wat leidt tot CpG-dinucleotiden die gemuteerd worden naar TpG [14](#page=14). * Niet-gemethyleerde CpGs vormen vaak 'CpG-eilanden' nabij de 5'-regio's van genen. Hypermethylatie van deze CpG-eilanden in de regulatorische regio's van genen kan leiden tot transcriptionele inactivatie ('zwijgen') [15](#page=15). * DNA-methylatie beïnvloedt transcriptie door fysieke belemmering voor transcriptiefactoren of door binding van methyl-CpG-bindende domein (MBD) eiwitten, die vervolgens chromatine-remodeling eiwitten aantrekken die leiden tot compact, inactief chromatine (heterochromatine) [15](#page=15). > **Voorbeeld:** Sterke methylering van het glutathion S-transferase gen (GSTP1) komt voor in prostaatkanker, wat leidt tot het uitzetten van dit tumoronderdrukkende gen [14](#page=14). * **Histonmodificatie:** Epigenetische mechanismen omvatten ook chemische veranderingen (acetylatie, methylatie, fosforylering, ubiquitylatie) van aminozuren in histoneiwitten. Deze modificaties beïnvloeden de chromatine-structuur, waardoor genexpressie wordt gereguleerd door het creëren van meer open (actief) of gecondenseerd (inactief) chromatine [15](#page=15) [16](#page=16). > **Voorbeeld:** De vachtkleuring van lapjeskatten is een resultaat van X-inactivatie, een epigenetisch verschijnsel waarbij één van de X-chromosomen in elke cel willekeurig wordt uitgeschakeld, leidend tot een lappendeken van vachtkleuren als er verschillende genvarianten op de X-chromosomen aanwezig zijn [15](#page=15). --- # Moleculaire Diagnostische Technieken Moleculaire diagnostiek (MD) omvat een breed scala aan technieken die worden gebruikt om direct het genetisch materiaal (DNA en RNA) te onderzoeken, wat een hoge gevoeligheid en specificiteit biedt voor de diagnose van diverse aandoeningen. Deze technieken zijn essentieel geworden voor de analyse van zowel monogene erfelijke aandoeningen als somatische defecten in kankerweefsel, evenals voor de identificatie van micro-organismen en weefseltypering [17](#page=17) [19](#page=19). ### 2.1. Aandoeningen die bestudeerd worden in moleculaire diagnostiek Moleculaire diagnostiek richt zich op verschillende categorieën van aandoeningen: * **Erfelijke aandoeningen:** Deze kunnen op verschillende momenten in het leven worden gediagnosticeerd, waaronder: * **Pre-implantatie diagnostiek:** Voorafgaand aan de zwangerschap [17](#page=17). * **Prenatale diagnostiek:** Tijdens de zwangerschap [17](#page=17). * **Postnatale diagnostiek:** * Neonataal (direct na de geboorte) [17](#page=17). * Presymptomatisch (voordat symptomen optreden). Voorbeelden zijn de ziekte van Huntington [21](#page=21). * Dragerschapbepalingen (carrier detection) voor recessieve aandoeningen zoals Duchenne spierdystrofie, mucoviscidose, sikkelcelanemie [19](#page=19). * **Niet-erfelijke aandoeningen:** Deze ontstaan door genetische veranderingen in somatische cellen gedurende het leven en worden niet doorgegeven aan nakomelingen. Hieronder vallen veel vormen van kanker, zoals long- en darmkanker [19](#page=19). * **Infectieziekten:** Moleculaire diagnostiek speelt een cruciale rol bij het identificeren van virale, bacteriële en parasitaire aandoeningen door het direct detecteren van hun genetisch materiaal (RNA of DNA). Dit maakt snelle diagnose mogelijk bij acute infecties zoals COVID-19, influenza en RSV. Het is met name nuttig voor micro-organismen die langzaam groeien of moeilijk te kweken zijn, zoals *Mycobacterium tuberculosis* en *Chlamydia*. Moleculaire technieken kunnen ook verschillen tussen bacteriestammen of virustypes aantonen, wat belangrijk is voor epidemiologisch onderzoek [17](#page=17) [19](#page=19). * **Weefseltypering (HLA-typering):** Wordt veelvuldig met DNA-technieken uitgevoerd [17](#page=17). ### 2.2. Moleculaire diagnostiek en onderzoek Moleculair-biologische technieken worden ontwikkeld en getest in onderzoeks- en academische laboratoria voordat ze in diagnostische centra worden ingezet. Omgekeerd worden deze technieken in onderzoeksinstellingen ook veelvuldig gebruikt om DNA-variaties op te sporen [19](#page=19). ### 2.3. Uitvoerende centra voor medische moleculaire diagnostiek In België wordt moleculaire diagnostiek voor genetische aandoeningen en kanker voornamelijk uitgevoerd in acht genetische centra, in samenwerking met ziekenhuizen en onderzoeksgroepen [19](#page=19). ### 2.4. Overzicht van analysetechnieken De technieken voor moleculaire diagnostiek kunnen worden ingedeeld op basis van het type en aantal te detecteren variaties: #### 2.4.1. Technieken voor gekende 'grotere' mutaties (deleties, inserties, translocaties, trinucleotiden expansies) Deze technieken zijn gericht op het detecteren van specifieke, vooraf bekende grotere DNA-veranderingen. * **PCR en scheiding van amplicons volgens lengte:** De polymerase ketting reactie (PCR) wordt gebruikt om DNA-fragmenten te amplificeren. Deze fragmenten (amplicons) worden vervolgens gescheiden op basis van hun lengte, bijvoorbeeld via gelelektroforese op een agarosegel, en gevisualiseerd. Dit is nuttig voor het opsporen van inserties en deleties, zoals de detectie van Alu-inserties [22](#page=22). * **Multiplex PCR:** Hierbij worden meerdere targets in één enkele PCR-reactie geamplificeerd, door gelijktijdig gebruik te maken van verschillende primerparen. Dit verhoogt de efficiëntie en snelheid van de analyse [22](#page=22). * **Toepassing:** Opsporen van exondeleties bij Duchenne en Becker spierdystrofie, waarbij meerdere exonen van het grote dystrofinegen tegelijkertijd worden geamplificeerd [22](#page=22). * **Beperkingen:** Reactiecondities moeten geoptimaliseerd worden voor alle primer sets, en er mag geen interferentie optreden tussen de primers [23](#page=23). * **Southern blotting gecombineerd met PCR-fragmentanalyse:** Deze techniek wordt gebruikt voor het opsporen van triplet repeat expansies, waarbij een reeks van drie nucleotiden herhaald wordt. Expansie van deze repeats kan leiden tot genetische aandoeningen met anticipatie, waarbij symptomen in opeenvolgende generaties vroeger en/of ernstiger optreden [23](#page=23). * **Toepassing:** Opsporen en diagnosticeren van het Fragiele X syndroom en de ziekte van Huntington. Bij Fragiele X is ook de methylatiestatus van het gen van belang, wat de analyse complexer maakt en Southern blotting naast PCR vereist. De analyse van Southern blots omvat DNA-isolatie, restrictie-enzymdigestie, gelelektroforese, blotting op een membraan, en hybridisatie met een specifieke probe [24](#page=24) [25](#page=25) [28](#page=28). * **Diagnostische criteria Huntington:** Normale personen hebben maximaal 36 CAG-repeats, terwijl patiënten 37-100 repeats hebben [28](#page=28). * **Fluorescence in situ hybridisatie (FISH):** Een moderne techniek die gebaseerd is op hybridisatie en geen elektroforese vereist, waardoor deze gemakkelijk gerobotiseerd kan worden voor high-throughput screening [29](#page=29). * **Principe:** Fluorescent gemerkte DNA- of RNA-probes worden gehybridiseerd aan nucleïnezuren die op een vaste drager (bv. microscoopglaasje) zijn gefixeerd. De gehybridiseerde probes worden vervolgens gevisualiseerd met een fluorescentiemicroscoop [29](#page=29). * **Types probes:** Locus-specifieke probes, chromosome painting probes, centromeer- en telomeerprobes, en break-apart probes voor translocaties. Amplificatieprobes genereren meer signaal bij herhaalde DNA-fragmenten [30](#page=30). * **Toepassing:** Visualisatie van chromosomen en chromosomale afwijkingen (aantal, translocaties, herschikkingen, amplificaties), genexpressie (mRNA), detectie van micro-organismen, en tumordetectie met DNA-markers [29](#page=29). * **Toepassing:** Opsporen van translocaties, zoals t(14;18) bij folliculair lymfoom, waarbij FISH een hogere gevoeligheid heeft dan PCR vanwege de variëteit aan breekpunten [32](#page=32). * **Next-generation ISH assays (CISH en SISH):** Ontwikkeld om de uitdagingen van FISH te overwinnen, zoals de noodzaak van gespecialiseerde microscopen en photobleaching. CISH (chromogenic in situ hybridisation) en SISH (silver enhanced in situ hybridisation) gebruiken permanente signalen zichtbaar met standaard lichtmicroscopie [33](#page=33). * **Toepassing CISH:** Opsporen van Epstein-Barr virusinfectie en aantonen van kappa/lambda lichte ketens [34](#page=34). * **Toepassing SISH:** Opsporen van HER2-amplificatie bij borstkanker, vaak in combinatie met CISH voor een tweekleurige analyse [34](#page=34). #### 2.4.2. Technieken voor gekende SNPs en INDELs Deze technieken zijn gericht op het opsporen van kleine, specifieke DNA-variaties, zoals single nucleotide polymorphisms (SNPs) en kleine inserties of deleties (INDELs). * **Restrictie fragment length polymorphisms (RFLP) analyse:** Oudere techniek die gebruik maakt van het feit dat een mutatie een restrictie-enzymknipplaats kan vernietigen of creëren. De resulterende fragmentlengteverschillen worden geanalyseerd [35](#page=35). * **Methoden:** Via Southern blotting en hybridisatie, of sneller via PCR-amplificatie [35](#page=35). * **Toepassing:** Opsporen van hemofilie B en Factor V Leiden mutaties. Ook gebruikt voor de typering van *Leishmania* soorten door analyse van PCR-producten na digestie met restrictie-enzymen [36](#page=36) [37](#page=37) [38](#page=38). * **Hybridisatie aan capture probe, gebonden op vaste drager (Allele Specific Oligonucleotide (ASO) techniek):** Deze techniek toont kleine, gekende mutaties (SNPs, INDELs) aan door middel van stringente hybridisatie. Synthetische oligonucleotiden (capture probes) worden op een vaste drager gefixeerd [38](#page=38). * **Workflow:** Ontwerp en synthese van ASO's, fixatie op drager, DNA-isolatie, PCR-amplificatie en labelling, denaturatie, hybridisatie, wassen, detectie en visualisatie [39](#page=39). * **Vaste dragers:** Membranen (nylon, nitrocellulose), magnetische bolletjes, microtiterplaten, glas (microarrays), flow-through systemen [39](#page=39). * **Toepassing:** Opsporen van gekende mutaties in mucoviscidose (bv. delF508). Typering van Humane Papillomavirussen (HPV) en Hepatitis C Virus (HCV) met line probe assays (LPA). Detectie van humane retrovirussen (bv. HIV) in wells [39](#page=39) [41](#page=41) [42](#page=42) [43](#page=43). * **Multiplex Allele-specifieke PCR test (ARMS of SSP-PCR):** Gebruikt allele-specifieke primers die verschillen aan het 3'-uiteinde om specifieke allelen of mutaties te amplificeren. De DNA-synthese door Taq-polymerase is afhankelijk van correcte basenparing aan het 3'-uiteinde [44](#page=44). * **Toepassing:** ARMS-test voor mucoviscidose om meerdere mutaties te detecteren [45](#page=45). * **qPCR (Real-time PCR):** Wordt gebruikt om DNA-variaties (SNP, INDELs) aan te tonen, heterozygoziteit/homozygoziteit te bepalen, en de aanwezigheid en hoeveelheid van specifieke micro-organismen te kwantificeren. Gebruikt probes zoals moleculaire beacons, lineaire probes en TaqMan probes voor detectie [45](#page=45) [46](#page=46). * **Moleculaire beacons:** Oligonucleotide probes met een stam-lusstructuur die fluoresceren wanneer ze aan hun doelsequentie binden. Ideaal voor genetische screening en SNP-detectie [46](#page=46) [47](#page=47). * **Lineaire probes:** Gehybridiseerd op het DNA, waarbij smeltcurves worden geanalyseerd om mutaties te detecteren [48](#page=48). * **TaqMan probes:** Gebruikt in de castPCR™-technologie voor de detectie van zeldzame somatische mutaties in kankerweefsel met hoge gevoeligheid (tot 0,1% mutant allel) [49](#page=49). * **Ligatie-assays (bv. MLPA):** Technieken waarbij ligase (plak-enzym) een cruciale rol speelt. * **Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA):** Detecteert deleties, duplicaties en puntmutaties door het amplificeren van MLPA-probes die hybrideren aan doelsequenties. Vereist slechts één primerpaar en analyse vindt plaats via capillaire elektroforese. Kan ook gebruikt worden voor methylatiestatusbepaling en relatieve kwantificatie van mRNA [51](#page=51) [52](#page=52) [53](#page=53). #### 2.4.3. Technieken voor ongekende SNPs en INDELs (mutatiescanningstechnieken) Deze technieken zijn bedoeld om te scannen naar mutaties in PCR-fragmenten, waarna sequentieanalyse de exacte mutatie bepaalt. Ze verminderen de hoeveelheid DNA die gesequenced moet worden [54](#page=54). * **Single Stranded Conformational Polymorphism (SSCP)-analyse:** Toont 'single base' mutaties aan door denaturatie van PCR-producten en scheiding van enkelstrengen op een niet-denaturerende polyacrylamidegel, gebaseerd op hun conformatie [54](#page=54). * **Heteroduplexanalyse:** Vormt heteroduplexen door het mengen van gemuteerd en niet-gemuteerd DNA (of van PCR-producten van heterozygote individuen), gevolgd door denaturatie en langzame renaturatie [55](#page=55). * **High Resolution Melting curve Analyse (HRMA):** Detecteert mutaties op basis van kleine verschillen in de DNA-uitsmelttemperatuur (Tm) van PCR-producten die heteroduplexen bevatten. Kan somatische mutaties in lage concentraties detecteren en de methylatiestatus bepalen na bisulfietbehandeling [56](#page=56) [57](#page=57). #### 2.4.4. Technieken voor gemethyleerde DNA-sequenties Deze technieken richten zich op de epigenetische modificatie van DNA door methylatie, wat een rol speelt bij diverse ziekten waaronder kanker [59](#page=59). * **Bisulfietmethode:** Ongemethyleerde cytosines worden door natriumbisulfiet omgezet naar uracil, terwijl gemethyleerde cytosines onaangetast blijven. Dit verschil kan vervolgens gevisualiseerd worden via methylatiespecifieke PCR of sequentiebepaling [59](#page=59) [60](#page=60) [61](#page=61). * **Restrictie-enzymdigesten:** Gebruik van methylatiegevoelige restrictie-enzymen om methylatie te detecteren [62](#page=62). * **Methylatie-specifieke MLPA (MS-MLPA):** Combineert MLPA met digestie door methylatiegevoelige restrictie-enzymen [62](#page=62). #### 2.4.5. High-throughput SNP-detectie Technieken die een groot aantal variaties tegelijkertijd kunnen analyseren. * **DNA-chips of microarrays:** Vaste dragers met miljoenen enkelstrengige DNA-fragmenten (capture probes) voor het analyseren van duizenden genen of allelen parallel [63](#page=63). * **SNP-chips (SNP-array):** Gebruikt voor het snel vaststellen van verschillen van één nucleotide of INDELs, belangrijk voor genetische paspoorten en farmacogenetica [64](#page=64) [65](#page=65). * **Comparative hybridization chips:** Vergelijken hoeveelheden genomisch DNA (CGH) of mRNA (genexpressie microarrays) tussen twee monsters met behulp van twee fluorescente labels [64](#page=64). * **Comparative genomic hybridization (CGH):** Scant het genoom op duplicaties, inserties en deleties, vooral in kankercellen [69](#page=69). * **Genexpressie microarray:** Bestudeert genexpressiepatronen door mRNA/cDNA te analyseren, veel gebruikt in onderzoek en diagnostiek van kanker [70](#page=70). * **Weefselmicroarrays (TMA):** Spots bestaan uit stukjes gefixeerd patiëntweefsel voor parallelle analyse van honderden weefsels [72](#page=72). * **Toepassing:** Bepaling van CYP450-enzymvariaties voor medicijndosering (farmacogenetica). Analyse van genexpressieprofielen voor risicostratificatie bij borstkanker (bv. MammaPrint) [66](#page=66) [71](#page=71). * **Next and third generation sequencing:** Geavanceerde technieken voor het snel en goedkoop bepalen van DNA-sequenties op grote schaal [81](#page=81). * **Next Generation Sequencing (NGS):** Omvat technologieën zoals Illumina, Roche 454, Ion Torrent en SOLiD [81](#page=81). * **Pyrosequencing:** Gebaseerd op het 'sequencing by synthesis'-principe met bioluminescentie [82](#page=82). * **Illumina sequencing:** Gebruikt 'reversible chain terminators' en sequencing-by-synthesis [86](#page=86). * **Whole Genome Sequencing (WGS):** Bepaalt de volledige genoomsequentie [89](#page=89). * **Whole Exome Sequencing (WES):** Sequentieert alle eiwitcoderende gebieden (exonen), efficiënter voor het opsporen van mutaties in kanker en erfelijke aandoeningen [90](#page=90). * **Niet-invasieve prenatale test (NIPT):** Analyseert celvrij (cf)DNA in bloed van zwangere vrouwen om trisomieën op te sporen [90](#page=90). * **Circulerend cfDNA als biomerker:** Kan gebruikt worden voor diagnose en opvolging van kanker via 'liquid biopsy' [91](#page=91). * **Single-cell sequencing:** Sequentieert individuele cellen, essentieel voor het analyseren van tumorheterogeniteit en forensisch onderzoek [93](#page=93). * **Third generation sequencing (Single-molecule sequencing):** Maakt directe sequentiebepaling van één DNA-molecule mogelijk zonder amplificatiestap (bv. Nanopore sequencing) [94](#page=94). * **Digital (droplet) PCR (ddPCR):** Biedt nauwkeurige, absolute kwantificering van nucleïnezuren door het tellen van moleculen in discrete water-in-olie druppelpartities . * **Toepassingen:** Absolute kwantificering van DNA-hoeveelheden (virale lading, microbiële kwantificering), detectie van zeldzame sequenties/somatische mutaties, analyse van genomische veranderingen (CNV), genexpressie- en micro-RNA-analyse, en kwantificering van NGS-library preparaten . ### 2.5. Nieuwe tools en ontwikkelingen * **Lab-on-a-chip (LOC):** Integreert laboratoriumfuncties op een enkele chip, vereist zeer kleine vloeistofvolumes en maakt snelle analyses mogelijk (bv. GeneXpert) [96](#page=96). * **Nieuwe designer geneesmiddelen:** Gebaseerd op het rationeel ontwerp van medicijnen na identificatie van specifieke moleculaire doelwitten (bv. Gleevec voor chronische myeloïde leukemie) [97](#page=97). * **Nieuwe vormen van immuuntherapie:** Dendritische celvaccinatie (DC-Vac) en CAR T-celtherapie, die het immuunsysteem van de patiënt activeren tegen kankercellen [100](#page=100) [99](#page=99). ### 2.6. Bio-informatica en 'big data' analyse De grote hoeveelheden data die gegenereerd worden door high-throughput technieken vereisen geavanceerde softwarepakketten en statistische analyse. Databases zoals NCBI en Ensembl zijn cruciaal voor het opslaan en raadplegen van genetische informatie [77](#page=77) [78](#page=78) [80](#page=80). --- # Nieuwe Tools, Ontwikkelingen en Precisiegeneeskunde Dit onderdeel gaat over nieuwe ontwikkelingen in moleculaire diagnostiek, met een focus op precisiegeneeskunde, multi-omics, en innovatieve technieken zoals lab-on-a-chip en designer geneesmiddelen. ## 3. Nieuwe tools, ontwikkelingen en precisiegeneeskunde ### 3.1 Precisiegeneeskunde Precisiegeneeskunde, voorheen ook wel gepersonaliseerde geneeskunde genoemd, maakt gebruik van high-throughput technieken in de biomedische sector. In het post-genoom tijdperk wordt kennis van het menselijk genoom, transcriptoom en de variatie daartussen gebruikt om gevoeligheidsgenen en risicofactoren voor complexe aandoeningen te identificeren. De genotype-fenotype relatie wordt bepaald om vervolgens diagnoses, predisposities, risicofactoren en de meest geschikte behandelingswijzen te identificeren. Ook nieuwe geneesmiddelen kunnen ontworpen worden tegen eiwitproducten van ziektegerelateerde genen, wat nieuwe 'drug targets' oplevert [76](#page=76). ### 3.2 Multi-omics Multi-omics integreert gegevens uit verschillende bronnen, zoals het genoom, transcriptoom, fenoom, metaboloom, methyloom/epigenoom en nutrigenoom. Deze integratie leidt tot een beter inzicht in complexe biologische processen en maakt precisiegeneeskunde mogelijk [77](#page=77). ### 3.3 Variaties in het menselijk genoom: SNPs als biomerkers Het menselijk genoom verschilt slechts voor 0,1% tussen individuen. Deze minimale verschillen, genaamd Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), zijn plaatsen waar een enkele base van de genetische code afwijkt. Hoewel veel SNPs in niet-coderende gebieden voorkomen, kunnen SNP-patronen gebruikt worden om ziektes te voorspellen. Door genetische variatiepatronen tussen zieke en gezonde populaties te vergelijken, kunnen risicofactoren worden geïdentificeerd, zoals de rol van de E4-variant van apolipoproteïne bij de ziekte van Alzheimer. Farmaceutische bedrijven screenen patiënten voor genetische variaties om de effectiviteit en bijwerkingen van medicijnen te verklaren [77](#page=77). Grootschalige SNP-analyse vereist opschaling van laboratoriumtechnologie, zoals genoomwijde associatiestudies (GWAS) die tienduizenden variaties tegelijk testen. Historisch werden technieken zoals Sanger DNA sequencing, capillaire elektroforese, SSCP, denaturerende HPLC, gelelektroforese, RFLP en hybridisatieanalyse gebruikt. Tegenwoordig worden Next Generation Sequencing (NGS) methoden en DNA-SNP-chips ingezet voor high-throughput detectie van DNA-variaties [77](#page=77). > **Tip:** SNPs zijn cruciaal voor het begrijpen van individuele variaties die bijdragen aan ziektegevoeligheid en reacties op medicatie. ### 3.4 Genome-wide association studies (GWAS) Genome-wide association studies (GWAS) worden ingezet om SNPs te identificeren die geassocieerd zijn met complexe aandoeningen (zoals kanker, diabetes type II, ziekte van Alzheimer) of met de reactie op medicatie (farmacogenetica/genomica). Bij GWAS worden genetische variaties vergeleken tussen grote groepen patiënten en controlegroepen (tienduizenden personen) om te bepalen of bepaalde SNPs vaker voorkomen in de patiëntengroep. Dit resulteert in een 'genetisch paspoort' en een genotype-fenotype correlatie [78](#page=78). Onderzoek naar risicoloci vereist hoge doorvoertoepassingen, zoals NGS-Illumina systemen of SNP-chips. Bio-informatica speelt een sleutelrol bij het behandelen van deze 'big data'. Gevonden gevoeligheidsloci of varianten kunnen worden geïntegreerd in diagnostische tests voor ziektegevoeligheid en later worden gekoppeld aan gepersonaliseerde therapieën of preventieve maatregelen [78](#page=78). #### 3.4.1 Toepassing GWAS: opsporen genetische risicofactoren voor borst-, prostaat- en eierstokkanker Een internationaal consortium, met o.a. VIB en KU Leuven, heeft meer dan 80 DNA-regio's geïdentificeerd die het risico op borst-, prostaat- en eierstokkanker verhogen. Dit onderzoek vergeleek het DNA van 100.000 kankerpatiënten met dat van 100.000 gezonde personen. Er werden SNPs gevonden die vaker voorkwamen bij patiënten met deze kankersoorten, waarbij een combinatie van meerdere SNPs het risico significant kon verhogen. Veel van deze risico-SNPs bevinden zich in DNA-regio's die de genexpressie controleren en kunnen ontregeld raken, waardoor groeicontrolesignalen wegvallen [78](#page=78) [79](#page=79). Specifiek werden 49 SNPs voor borstkanker en 9 nieuwe SNPs voor eierstokkanker geïdentificeerd. Voor prostaatkanker werden 26 nieuwe SNPs gevonden, waarvan 20 geassocieerd zijn met agressieve vormen. Deze bevindingen maken gerichtere screenings op prostaat- en borstkanker mogelijk, met als doel het aantal sterfgevallen te verminderen. De resultaten zijn gepubliceerd in diverse toptijdschriften [79](#page=79). > **Tip:** GWAS-studies demonstreren hoe complex ziekten zoals kanker zijn en hoe genetische variaties het individuele risico beïnvloeden. ### 3.5 Farmacogenetica - farmacogenomica: niet iedereen reageert hetzelfde op een geneesmiddel of therapie Individuele reacties op medicatie variëren sterk door factoren zoals omgevingsinvloeden, eetgedrag, leeftijd, gewicht, geslacht en algemene gezondheid, maar vooral door erfelijke eigenschappen vastgelegd in genen. Farmacogenetica onderzoekt de wisselwerking tussen geneesmiddelen en genen. Genetische tests kunnen voorspellen hoe iemand op een middel zal reageren, wat bijwerkingen kan voorkomen en de dosering kan optimaliseren, aangezien gewicht niet altijd een accurate maatstaf is. Jaarlijks overlijden in de VS meer dan 100.000 mensen aan medicatiebijwerkingen; gepersonaliseerde geneeskunde kan dit aantal reduceren [79](#page=79) [80](#page=80). De effectiviteit van een geneesmiddel hangt af van hoe het gemetaboliseerd wordt door de lever en hoe het interageert met zijn doelwit. Leverenzymen beïnvloeden de snelheid van medicijnafbraak; trage afbraak kan leiden tot overdosering, snelle afbraak tot een tekort. Genetische tests, zoals met CYP-chips, kunnen de afbraaksnelheid bepalen en de benodigde dosering berekenen. Ook kunnen variaties in doelwiteiwitten (receptoren, transporters) ervoor zorgen dat een geneesmiddel bij de ene persoon beter bindt dan bij de andere [80](#page=80). ### 3.6 Bio-informatica en ‘big data’ analyse High-throughput screeningstechnieken genereren grote hoeveelheden data ('big data') die verwerkt worden met statistische softwarepakketten. Sequentie-informatie, zoals SNPs, wordt wereldwijd verzameld in elektronische databanken, waarvan NCBI (National Center for Biotechnology Information) en ENSEMBL de belangrijkste toegangspunten zijn [80](#page=80). NCBI biedt publieke databases voor moleculaire biologie, waaronder: * SNP-databank [80](#page=80). * Genbank (sequenties, SNPs) [80](#page=80). * Moleculaire databank (sequenties, structuren, taxonomie) [80](#page=80). * Genomische biologie databank (humaan genoom, kankerchromosomen) [80](#page=80). * Literatuurdatabanken: OMIM (erfelijke ziekten) en PubMed (medische literatuur) [80](#page=80). * Programma's voor specifieke analyses zoals ENTREZ en BLAST [80](#page=80). Studenten leren in de bio-informatica cursus omgaan met deze databanken en analyses [80](#page=80). ### 3.7 Next generation sequencing (NGS) In 2002 werd het menselijk genoom na 15 jaar werk en voor 1 miljard dollars gepubliceerd. Sindsdien zijn er snellere en goedkopere sequentietechnieken ontwikkeld, waardoor een genoom binnen 24 uur voor minder dan 1000 dollars in kaart kan worden gebracht. De klassieke Sanger-sequentietechniek heeft beperkingen qua parallelle reacties en leeslengte [81](#page=81). Nieuwe technieken zoals de Roche 454 pyrosequencer bieden verbeteringen, maar ook de SOLiD (ABI) en systemen van Illumina, die werken met miljarden DNA-fragmenten, maken het mogelijk om tientallen gigabases in één run te bepalen. Voor een wetenschappelijk verantwoorde sequentie van het menselijk genoom is een sequencing depth van 20 tot 30 kopijen nodig, wat binnen een week kan worden afgehandeld [81](#page=81). NGS is de overkoepelende term voor verschillende high-throughput sequencing technologieën, waaronder: * Illumina sequencing (het meest gebruikte platform) [81](#page=81). * Roche 454 sequencing (Pyrosequencing) [81](#page=81). * Ion torrent: Proton / PGM sequencing [81](#page=81). * SOLiD sequencing (ABI) [81](#page=81). De derde generatie sequencers, of single molecule sequencers, laten de amplificatiestap achterwege en omvatten bijvoorbeeld Oxford Nanopore met Nanopore sequencing. Deze derde generatie sequencers zijn echter nog minder accuraat voor SNPs en kleine indels. Resultaten van Illumina en dergelijke moeten momenteel nog bevestigd worden met Sanger sequencing. Foutmarges (1 op 10.000 tot 1 op 100.000 foute nucleotiden) en de kosten voor dataverwerking (bio-informatica) blijven aandachtspunten, met name voor klinisch onderzoek [81](#page=81). > **Tip:** NGS heeft de snelheid en kosteneffectiviteit van genoomonderzoek revolutionair veranderd, maar blijft continu in ontwikkeling wat betreft nauwkeurigheid en kosten. ### 3.8 Nieuwe tools en ontwikkelingen voor moleculaire diagnostiek #### 3.8.1 Lab-on-a-chip Een lab-on-a-chip (LOC) is een apparaat dat laboratoriumfuncties integreert op een enkele chip, variërend in grootte van enkele millimeters tot enkele vierkante centimeters. LOC's vereisen zeer kleine vloeistofvolumes voor analyse en worden gebruikt voor onder andere hybridisatietechnieken, SNP-analyse, PCR en sequencing. Op een LOC vinden alle analyses plaats die normaal op een werkbank worden uitgevoerd, en omvatten doorgaans drie basisstappen [96](#page=96). Een voorbeeld van een commercieel micro-device is de GeneXpert (Cepheid). Dit 'lab-in-a-box' voert PCR-analyses uit voor specifieke pathogenen zoals Norovirus, SARS-Cov2 en Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae in gemiddeld 45 minuten. De cartridge verzorgt DNA-extractie, PCR-amplificatie en detectie. Nieuwere ontwikkelingen voor LOC's richten zich op 'single cell analysis' en 'cell-free DNA'-analyses, en zijn geschikt voor Point Of Care (POCT) testen [96](#page=96) [97](#page=97). #### 3.8.2 Nieuwe designer geneesmiddelen Zodra een pathogenendoelwit is geïdentificeerd, kan rationeel drugsontwerp volgen [97](#page=97). ##### 3.8.2.1 Gleevec: doelgerichte behandeling van leukemiepatiënten Gleevec is een geneesmiddel dat specifiek de groei van bepaalde leukemische cellen onderdrukt. Bij chronische myeloïde leukemie (CML) ontstaat een foutief Bcr-abl eiwit door een fusie van de Bcr- en Abl-genen, wat leidt tot ongecontroleerde celdeling van witte bloedcellen. Gleevec blokkeert de groeistimulerende werking van dit foute eiwit. Hoewel Gleevec de kanker langdurig kan onderdrukken, is volledige genezing nog niet altijd mogelijk, aangezien het Bcr-abl gen opnieuw kan muteren waardoor Gleevec zijn effectiviteit verliest [97](#page=97) [98](#page=98). > **Example:** Gleevec illustreert hoe een diepgaand begrip van de moleculaire oorzaak van een ziekte (het Bcr-abl eiwit) kan leiden tot de ontwikkeling van een gerichte therapie. ##### 3.8.2.2 Nieuwe vormen van immuuntherapie Gentherapeutische benaderingen, zoals dendritische celvaccinatie en CAR T-therapie, worden ontwikkeld als nieuwe vormen van precisiegeneeskunde en immuuntherapie [99](#page=99). ###### 3.8.2.2.1 Dendritische celvaccinatie (DC-Vac) Dendritische cellen (DC's) zijn immuuncellen die vreemde stoffen en kankercellen presenteren aan T-cellen om een immuunrespons te activeren. Bij DC-Vac worden monocyten van de patiënt in het lab gedifferentieerd tot DC's. Deze DC's worden 'opgeladen' met een tumor-specifiek eiwit (bijvoorbeeld Wilms-tumor 1, WT1) en vervolgens teruggeïnjecteerd in de patiënt. De gemanipuleerde DC's presenteren het tumorantigeen aan T-killercellen, die vervolgens de tumorcellen met hetzelfde antigeen opsporen en vernietigen. DC-Vacs zijn op maat gemaakt en worden getest tegen diverse kankersoorten. Sipuleucel-T (Provenge) is een goedgekeurd celvaccin voor uitgezaaide prostaatkanker [99](#page=99). ###### 3.8.2.2.2 CAR T-cellen CAR T-cellen zijn witte bloedcellen (T-cellen) van de patiënt die in het laboratorium genetisch gemodificeerd worden met een gen voor een 'chimere antigenreceptor' (CAR). Deze CAR-receptoren kunnen specifieke moleculen op kankercellen herkennen. Na terugkeer in de patiënt vermenigvuldigen de genetisch gewijzigde T-cellen zich en doden ze kankercellen gestuurd door hun nieuwe receptor. In 2017 keurde de FDA de eerste twee CAR T-immuuntherapieën goed, gericht tegen specifieke leukemieën door herkenning van het B-cel antigen CD19. Dit markeert een belangrijke vooruitgang in de ontwikkeling van CAR T-therapie voor kankerbehandeling [100](#page=100). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |---|---| | DNA-variaties | Veranderingen in de volgorde of structuur van DNA, die kunnen variëren van enkele baseparen tot grote chromosomale afwijkingen. Deze variaties zijn de basis voor genetische diversiteit en kunnen leiden tot ziekten of fenotypische verschillen. | | Polyploïdie | Een genetische toestand waarbij een cel of organisme meer dan twee sets chromosomen heeft, bijvoorbeeld triploïde (3n) of tetraploïde (4n). Bij zoogdieren is dit meestal niet levensvatbaar. | | Trisomie | Een chromosomale afwijking waarbij een organisme een extra exemplaar van een specifiek chromosoom heeft, naast de normale twee exemplaren. Een bekend voorbeeld is trisomie 21 (Down syndroom). | | Chromosomale translocatie | Een gebeurtenis waarbij stukken van twee verschillende, niet-homologe chromosomen van plaats wisselen. Dit kan leiden tot genverstoringen of de vorming van fusiegenen, zoals bij het Philadelphia-chromosoom. | | Chromosomale deletie | Het verlies van een deel van een chromosoom, wat kan resulteren in het verdwijnen van genen en mogelijk leiden tot syndromen of ziekten. | | Chromosomale duplicatie | Het optreden van een extra kopie van een chromosoomsegment. Dit kan ontstaan door oneven crossing-over en kan variëren in grootte, met potentieel significante gevolgen voor het fenotype. | | Chromosomale inversie | Een herschikking binnen een chromosoom waarbij een segment 180° is gedraaid. Hierbij gaat geen genetische informatie verloren, maar de volgorde van genen kan veranderen. | | SNP (Single Nucleotide Polymorphism) | Een variatie in het DNA waarbij slechts één nucleotide verschilt tussen individuen op een specifieke positie in het genoom. SNPs zijn de meest voorkomende vorm van genetische variatie. | | INDEL (Insertion/Deletion) | Kleine inserties of deleties van één of enkele basenparen in het DNA. Wanneer deze in coderende regio's optreden, kunnen ze leiden tot frameshift-mutaties en ernstige fenotypische veranderingen. | | Frameshift-mutatie | Een mutatie die wordt veroorzaakt door de insertie of deletie van een aantal basenparen dat geen veelvoud van drie is. Dit verschuift het leesraam van het mRNA, wat leidt tot een totaal andere aminozuursequentie en vaak tot een vroegtijdige stopcodon. | | Splice site mutatie | Een verandering in het DNA op de grenzen tussen exons en introns, die de correcte splicing van pre-mRNA kan verstoren, met als gevolg dat introns niet of gedeeltelijk worden verwijderd, of exons worden overgeslagen. | | Trinucleotide repeat expansie | Een toename van het aantal herhalingen van een sequentie van drie nucleotiden in het DNA. Deze instabiliteit kan leiden tot genetische aandoeningen zoals Fragiele X syndroom en de ziekte van Huntington, vaak gepaard gaand met anticipatie. | | Epigenetica | Een tak van de biologie die zich bezighoudt met erfelijke veranderingen in genexpressie die niet worden veroorzaakt door veranderingen in de DNA-sequentie zelf, zoals DNA-methylatie en histonmodificaties. | | DNA-methylatie | Een epigenetisch mechanisme waarbij een methylgroep wordt toegevoegd aan cytosinebasen in het DNA, voornamelijk op CpG-dinucleotiden. Dit kan leiden tot genstilte en speelt een rol bij verschillende ziekten, waaronder kanker. | | Histonmodificatie | Chemische veranderingen aan histonproteïnen, zoals acetylering, methylatie of fosforylering, die de structuur van chromatine beïnvloeden en daarmee de toegankelijkheid van genen voor transcriptie reguleren. | | Moleculaire diagnostiek (MD) | Een vakgebied dat gespecialiseerde technieken gebruikt om direct het erfelijk materiaal (DNA en RNA) van organismen te onderzoeken voor diagnostische en onderzoeksdoeleinden. | | Polymerase Chain Reaction (PCR) | Een moleculair-biologische techniek die gebruikt wordt om specifieke DNA-fragmenten exponentieel te vermenigvuldigen, waardoor kleine hoeveelheden DNA detecteerbaar worden. | | Multiplex PCR | Een variant van PCR waarbij meerdere targets in één reactie worden geamplificeerd door het gebruik van verschillende primerparen tegelijkertijd. | | Southern blotting | Een techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-fragmenten te detecteren na restrictie-enzymdigestie en gelelektroforese, door hybridisatie met een gelabelde DNA-probe. | | Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) | Een techniek die gebruik maakt van fluorescerend gelabelde DNA-probes om specifieke DNA- of RNA-sequenties te visualiseren binnen cellen of weefsels op chromosomen of in de nucleus. | | CISH (Chromogenic In Situ Hybridisation) | Een ISH-techniek die fluorescente signalen vervangt door chromatogene reacties, waardoor de detectie zichtbaar wordt onder een standaard lichtmicroscoop en coupes langer bewaard kunnen worden. | | SISH (Silver Enhanced In Situ Hybridisation) | Een ISH-techniek die gebruik maakt van zilverneerslag om een permanente kleuring te verkrijgen die zichtbaar is onder een lichtmicroscoop. | | Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) | Een oudere techniek die genetische variaties detecteert door te kijken naar verschillen in de lengte van DNA-fragmenten na digestie met restrictie-enzymen, veroorzaakt door de aanwezigheid of afwezigheid van kniplocaties. | | Allele Specific Oligonucleotide (ASO) | Korte, synthetische DNA- of RNA-sequenties (probes) die specifiek hybridiseren aan één bepaald allel. Ze worden gebruikt om kleine genetische variaties zoals SNPs te detecteren. | | Dot blot / Slot blot | Technieken waarbij DNA- of RNA-monsters op een membraan worden aangebracht in discrete vlekken (dot blot) of sloten (slot blot), gevolgd door hybridisatie met probes voor detectie. | | Line probe assay (LPA) | Een techniek die gebruik maakt van strips met geïmmobiliseerde capture probes (ASO's) langs parallelle lijnen om specifieke DNA- of RNA-sequenties te typeren. | | qPCR (Quantitative PCR) | Een variant van PCR die de hoeveelheid DNA of RNA in real-time monitort door de fluorescentie te meten die wordt gegenereerd tijdens elke amplificatiecyclus. | | Moleculaire beacons | Enkelstrengige oligonucleotide probes met een stam-lusstructuur, die fluoresceren wanneer ze aan hun doelsequentie binden en gebruikt worden voor real-time detectie in qPCR. | | Lineaire probes | Oligonucleotide probes die hybrideren aan DNA, waarbij veranderingen in de smeltcurve (door FRET) gebruikt worden om mutaties te detecteren. | | TaqMan probes | Hydrolyse-probes die tijdens PCR-amplificatie worden afgebroken, waarbij een fluorescente reportervrijkomt en de amplificatie in real-time wordt gedetecteerd. | | castPCR (Competitive Allele-Specific TaqMan PCR) | Een competitieve PCR-techniek met TaqMan-probes en MGB-blokkers die zeer gevoelige detectie van zeldzame somatische mutaties mogelijk maakt. | | MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) | Een techniek die het aantal kopieën van specifieke DNA-sequenties kan detecteren door middel van ligatie en amplificatie van speciale probes. | | Mutatiescanningstechnieken | Methoden zoals SSCP en heteroduplexanalyse die gebruikt worden om te screenen op de aanwezigheid van mutaties in een DNA-fragment, waarna sequentieanalyse de specifieke mutatie identificeert. | | SSCP (Single Stranded Conformational Polymorphism) | Een techniek om mutaties te detecteren door het analyseren van de conformatie van enkelstrengige DNA-fragmenten na denaturatie en scheiding op een polyacrylamidegel. | | Heteroduplexanalyse | Een methode om mutaties op te sporen door het genereren van heteroduplexen (hybriden tussen gemuteerd en wild-type DNA) en deze te analyseren, bijvoorbeeld via HRMA. | | HRMA (High Resolution Melting curve Analyse) | Een techniek die kleine verschillen in de smelttemperatuur van dsDNA-producten detecteert om mutaties in PCR-fragmenten te identificeren. | | DNA-chips / Microarrays | Een vaste drager (bv. glasplaatje) waarop miljoenen enkelstrengige DNA-fragmenten (capture probes) zijn aangebracht, gebruikt voor parallelle analyse van duizenden genen of allelen. | | SNP-chips / SNP-array | Een type DNA-chip dat specifiek is ontworpen voor het detecteren van single nucleotide polymorphisms (SNPs) en kleine inserties/deleties. | | Comparatieve Hybridisatietechniek (CHT) | Een microarray-gebaseerde techniek die de hoeveelheid genomisch DNA of mRNA tussen twee monsters vergelijkt door middel van twee verschillende fluorescerende labels. | | Array-CGH (Comparative Genomic Hybridisation) | Een CGH-techniek die microarrays gebruikt om het gehele genoom te scannen op duplicaties, deleties en andere genomische veranderingen. | | Genexpressie microarray | Een microarray die wordt gebruikt om de expressieniveaus van duizenden genen te bestuderen door het analyseren van mRNA of cDNA. | | Tissue Microarray (TMA) | Een techniek waarbij kleine stukjes gefixeerd patiëntenweefsel worden samengebracht op een drager om parallelle analyses uit te voeren op honderden weefsels met een enkele probe. | | High Throughput Technieken | Methoden die in staat zijn om grote aantallen monsters of genetische varianten in korte tijd te analyseren, zoals NGS en microarrays. | | Precisiegeneeskunde (Precision Medicine) | Een benadering van gezondheidszorg die rekening houdt met individuele genetische, omgevings- en levensstijlvariaties om diagnoses, preventie en behandelingen te personaliseren. | | Multi-omics | De integratie van gegevens uit verschillende 'omics'-disciplines (genomica, transcriptomica, proteomica, metabolomica, etc.) om een completer beeld te krijgen van biologische systemen en ziekteprocessen. | | Genome-Wide Association Studies (GWAS) | Onderzoeksmethoden die grote populaties bestuderen om genetische variaties (SNPs) te identificeren die geassocieerd zijn met complexe aandoeningen of eigenschappen. | | Farmacogenetica / Farmacogenomica | Studie naar de invloed van genetische variaties op de reactie van een individu op geneesmiddelen, met als doel gepersonaliseerde medicatie en dosering te optimaliseren. | | Next Generation Sequencing (NGS) | Een verzamelnaam voor diverse high-throughput DNA-sequencing technologieën die het mogelijk maken om grote hoeveelheden DNA snel en kosteneffectief te sequencen. | | Pyrosequencing (454-sequencing) | Een NGS-techniek gebaseerd op het 'sequencing-by-synthesis' principe, waarbij de incorporatie van nucleotiden wordt gedetecteerd via bioluminescentie. | | Illumina sequencing | Een veelgebruikte NGS-techniek die gebruik maakt van 'sequencing-by-synthesis' met reversibele ketenterminators en fluorescente detectie per cyclus. | | Whole Genome Sequencing (WGS) | Het sequencen van de volledige genetische code van een organisme. | | Whole Exome Sequencing (WES) | Het sequencen van alle exonen, de eiwitcoderende delen van het genoom, wat een gerichte aanpak is voor het identificeren van mutaties. | | Cell-free (cf)DNA | DNA dat circuleert in lichaamsvloeistoffen zoals bloed, afkomstig van zowel gezonde als tumorcellen. Het wordt gebruikt als biomerker voor diagnostiek en monitoring. | | Single-cell sequencing | Technieken die de sequentie van individuele cellen bepalen, wat essentieel is voor het analyseren van heterogene celpopulaties zoals in tumoren. | | Third Generation Sequencing | Sequencing-technieken die het mogelijk maken om één DNA-molecule rechtstreeks te sequencen zonder voorafgaande amplificatie, zoals Nanopore sequencing. | | Nanopore sequencing | Een single-molecule sequencing technologie waarbij DNA-moleculen door een nanoporie gaan en dit verandert de ionenstroom, wat wordt gedetecteerd en geanalyseerd. | | Lab-on-a-chip (LOC) | Een apparaat dat verschillende laboratoriumfuncties integreert op een kleine chip, waardoor analyses met zeer kleine vloeistofvolumes mogelijk worden. | | GeneXpert (Cepheid) | Een voorbeeld van een lab-on-a-chip apparaat dat snelle PCR-gebaseerde detectie van pathogenen mogelijk maakt in een handige cartridge. | | Designer geneesmiddelen | Geneesmiddelen die rationeel zijn ontworpen om specifiek in te werken op moleculaire doelen, zoals Gleevec voor de behandeling van chronische myeloïde leukemie. | | Immuuntherapie | Behandelingen die het immuunsysteem van de patiënt stimuleren om kankercellen aan te vallen, zoals dendritische celvaccinatie (DC-Vac) en CAR T-celtherapie. | | Dendritische celvaccinatie (DC-Vac) | Een vorm van immuuntherapie waarbij dendritische cellen van de patiënt worden 'opgeladen' met tumor-specifieke antigenen en vervolgens worden teruggegeven om een immuunrespons op te wekken. | | CAR T-cellen (Chimeric Antigen Receptor T-cells) | T-cellen van de patiënt die genetisch zijn gemodificeerd om receptoren te produceren die specifiek kankercellen herkennen en vernietigen. | | Digital (droplet) PCR (ddPCR) | Een zeer nauwkeurige methode voor absolute kwantificering van nucleïnezuren door het monster op te delen in duizenden discrete druppeltjes, waarbij de templates worden geteld. | | Poisson distributie/algoritme | Een statistisch model dat wordt gebruikt in digitale PCR om de oorspronkelijke concentratie van de target DNA-sequentie te schatten op basis van het aantal positieve en negatieve druppels, rekening houdend met de willekeurige verdeling van templates. |

# Gene transfer methods in eukaryotic cells Gene transfer methods in eukaryotic cells provide crucial tools for molecular biology research and biotechnology, enabling the introduction of foreign genetic material into these complex cellular systems for various applications. ## 1. Gene transfer methods in eukaryotic cells ### 1.1 Introduction to gene transfer Gene transfer encompasses techniques used to introduce foreign DNA or RNA into eukaryotic cells. This process is fundamental for studying gene function, developing therapeutic strategies, and engineering organisms. The primary methods include transfection, transduction, and transformation, each with distinct mechanisms, applications, and outcomes. ### 1.2 Transfection Transfection is the process of introducing nucleic acids (DNA or RNA) into eukaryotic cells by non-viral methods. It can result in either transient or stable expression of the introduced genetic material. #### 1.2.1 Transient transfection Transient transfection leads to the temporary expression of the foreign genetic material, typically lasting for 24 to 72 hours. The introduced DNA does not integrate into the host cell's genome and is eventually lost during cell division. This method is useful for short-term gene expression studies. * **Process:** A vector containing the gene of interest is introduced into actively dividing cells using methods like electroporation or lipofection. * **Outcome:** The foreign DNA exists episomally (extrachromosomally) within the cell, leading to temporary protein production. * **Limitations:** Approximately 50% of cells may not be successfully transfected, and there is no permanent genetic modification or selection for transfected cells. #### 1.2.2 Stable transfection Stable transfection results in the permanent integration of the foreign genetic material into the host cell's genome. This allows for long-term, heritable expression of the introduced genes, which is essential for creating stable cell lines. * **Process:** Similar to transient transfection, a vector is introduced into cells. However, this is followed by a selection step to isolate cells that have successfully integrated the foreign DNA. * **Outcome:** The foreign DNA integrates randomly into the host genome, potentially leading to overexpression if multiple copies concatenate. This stable integration results in permanent expression of the introduced gene. * **Selection:** Selection systems are crucial for identifying and isolating stably transfected cells. #### 1.2.3 Transfection techniques A variety of methods are employed for transfection, leveraging physical or chemical means to facilitate nucleic acid entry into cells. * **Calcium-phosphate/CaCl$_2$ precipitation:** * This method involves precipitating DNA with calcium chloride in a phosphate buffer. The precipitated DNA is then added to actively dividing cells and incubated. * It can be used for both transient and stable expression. * The process involves incubating DNA with calcium phosphate to form precipitates that cells can take up. * **Lipofection:** * This technique uses cationic lipids to form liposomes that encapsulate the negatively charged DNA. These liposomes interact with the negatively charged cell membrane, facilitating DNA entry into the cell. * It is a widely used method for both transient and stable transfections. * **Electroporation:** * Cells and DNA are mixed in a special cuvette and subjected to a brief electrical pulse. This pulse creates temporary pores in the cell membrane, allowing DNA to enter. * Can be used for transient or stable expression. * It is a physical method that does not modify the incorporated genome. * **Receptor-mediated endocytosis:** * DNA is complexed with cationic molecules, such as polylysine and transferrin. These complexes bind to specific receptors (e.g., transferrin receptor) on the cell surface and are internalized via endocytosis. * The complexes are then either delivered to lysosomes or the nucleus. * Polyethylenimine (PEI) can also be used as a cationic polymer in this approach. * **Magnetofection:** * DNA is complexed with magnetic nanoparticles. An external magnetic field is used to attract these nanoparticles to the cell surface, accelerating uptake via endocytosis. * A disadvantage is that it can sometimes damage cells. * **Nucleofection:** * A variant of electroporation where an electrical pulse opens temporary pores in the cell membrane, directly transporting DNA or RNA into the nucleus. * **Nanoblades:** * These are microscopic structures used to deliver large genetic constructs into cells. They function by physically piercing the cell membrane. ### 1.3 Transduction Transduction is a method of gene transfer mediated by viruses. Viruses act as vectors, delivering genetic material into host cells. This approach often leads to stable integration of the foreign DNA into the host genome. #### 1.3.1 Viral vectors Viral vectors are engineered viruses that have been modified to carry therapeutic genes or genes for research purposes. * **Adenovirus vectors:** * These are DNA viruses that can infect both dividing and non-dividing cells. * **Constructs:** Viral DNA is modified by excising non-essential regions ("stuffer regions") to create space for the gene of interest. Co-transfection of modified viral DNA and helper DNA can produce infectious virus particles. * **Application:** Used for transient expression and can be engineered to produce virus particles. * **SV40 (Simian virus 40) vectors:** * This DNA virus can lead to permanent constructs and transient expression. * **Application:** COS and HEK cells are used, which express the SV40 T antigen, facilitating high-copy replication of SV40-based plasmids (cos-vectors) containing the gene of interest. High copy numbers can lead to cell death due to aggregation. * **Retroviral vectors:** * These are RNA viruses that integrate their genetic material into the host cell's genome. They are effective for gene transfer into dividing cells. * **Structure:** The viral genome contains Long Terminal Repeats (LTRs), gag, pol, and env genes. For vector construction, these essential genes are removed and placed on separate packaging vectors to ensure safety (the produced virus particles cannot replicate independently). * **Process:** A transfer vector containing the gene of interest, a packaging signal ($\psi$), and LTRs is co-transfected with packaging vectors into a cell line. This produces replication-incompetent viral particles that can infect target cells. * **Integration:** Upon infection, the RNA genome is reverse transcribed into DNA, circularized, and integrated randomly into the host genome. * **Limitations:** Do not efficiently infect non-dividing cells. * **Lentiviral vectors:** * These are a subclass of retroviral vectors, based on Human Immunodeficiency Virus (HIV-1). They are highly efficient at transducing both dividing and non-dividing cells, leading to stable integration. * **Mechanism:** Similar to retroviral vectors, lentiviral vectors are produced by co-transfecting multiple plasmids encoding viral proteins and the transfer vector containing the gene of interest. The resulting viral particles infect target cells, where the RNA genome is reverse transcribed and integrated into the host genome. * **Features:** Lentiviral vectors often include elements like CMV or SV40 promoters, SV40 origin of replication (ORI), splice sites, and various tags for detection. * **SEND (Selective endogenous encapsulation for cellular delivery):** * This RNA-based system uses three plasmids to produce virus-like particles (VLPs). * **Components:** A PEG10-expressing plasmid (encodes a retrovirus-like protein for capsid formation), a cargo RNA plasmid (containing the gene of interest and PEG10 UTRs), and a fusogenic plasmid (encodes a fusion protein for cellular entry). * **Process:** Transfection into a suitable cell leads to VLP assembly and release. These VLPs then transduce target cells. * **Advantage:** RNA-based, meaning no integration into the host genome. #### 1.3.2 Determining viral titer: Multiplicity of Infection (MOI) The Multiplicity of Infection (MOI) is a critical parameter in viral transduction experiments. It is defined as the ratio of the number of infectious virus particles to the number of target cells. * **Formula:** $$ \text{MOI} = \frac{\text{# virus particles}}{\text{# cells}} $$ * **Significance:** MOI influences the efficiency of transduction and the number of integrated copies of the transgene per cell. ### 1.4 Transformation Transformation primarily refers to the process of introducing foreign DNA into bacterial cells. While the term is also sometimes used in a broader context for other organisms, its classical definition is bacterial. ### 1.5 Plant gene transfer Introducing foreign genes into plant cells requires specialized methods due to the presence of a rigid cell wall. #### 1.5.1 Plant vectors * **Ti-plasmid (Tumor-inducing plasmid):** * Used by *Agrobacterium tumefaciens* to transfer a segment of its DNA (T-DNA) into the plant genome, causing tumor formation. * **Mechanism:** *Agrobacterium* detects plant wound signals (phenols), which activate virulence (vir) genes. These genes enable the bacterium to excise a single strand of T-DNA, which then migrates into the plant cell and integrates into its genome. * **Components:** The T-DNA is flanked by Left Border (LB) and Right Border (RB) sequences. Vir genes are also essential for this process. * **Application:** Modified Ti-plasmids are used as vectors to deliver desired genes into plants. For example, genes to reduce polygalacturonase expression can lead to firmer fruit. * **Binary vector system:** * This system utilizes two plasmids: one containing the gene of interest and another that is a helper Ti-plasmid providing the necessary vir genes. This offers more flexibility and ease of manipulation. #### 1.5.2 Plant transformation techniques * **Protoplast regeneration:** * Plant cell walls are enzymatically removed to create protoplasts. * DNA can then be introduced into protoplasts via methods like polyethylene glycol (PEG) treatment or electroporation. * The modified protoplasts are then cultured to regenerate whole plants. * **Biolistics (Gene gun):** * This method uses physical force to deliver DNA-coated particles (e.g., gold or tungsten) into plant cells or tissues. ### 1.6 Selection systems for gene transfer Selection systems are essential for identifying and isolating cells that have successfully incorporated the foreign genetic material, especially in stable transfection and transduction. #### 1.6.1 Complementary selection * **Mechanism:** This method relies on restoring a lost genetic function in the recipient cell by introducing a functional copy of the gene. * **Example: Thymidine kinase (TK) deficiency:** * TK-deficient cells are used. A vector carrying a functional TK gene and another gene of interest is co-transfected. * Cells are then cultured in HAT medium (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). Only cells that have taken up and express the functional TK gene can survive and proliferate in this medium. #### 1.6.2 Dominant selectable markers * **Mechanism:** These are genes that confer resistance to an antibiotic or toxic substance. They work independently of the recipient cell's genotype. * **Example: Neomycin resistance (NeoR):** * The neomycin resistance gene encodes an enzyme (aminoglycoside phosphotransferase, APH) that inactivates the antibiotic G418 (a neomycin analog). * Cells successfully transfected with a vector containing the NeoR gene will be resistant to G418 and can be selected for in culture medium containing G418. #### 1.6.3 Selection pressure * **Concept:** Applying a selective agent (e.g., an inhibitor like methotrexate, MTX) that targets a specific cellular pathway. If the introduced gene confers resistance or overcomes the inhibition (e.g., by overexpressing dihydrofolate reductase, DHFR), cells expressing the transgene will survive. ### 1.7 Media for cell cultures Various specialized cell culture media are used to support the growth and maintenance of eukaryotic cells during gene transfer experiments. Common examples include RPMI, Opti-MEM, EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium), and DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium). ### 1.8 RNA interference (RNAi) and post-transcriptional gene silencing RNA interference (RNAi) is a natural biological process that regulates gene expression at the post-transcriptional level, primarily by degrading specific messenger RNA (mRNA) molecules. Exogenous application of RNAi components can be used to "silence" target genes. * **Interfering vs. Degrading:** RNAi interferes with gene expression, typically by leading to mRNA degradation or translational repression, rather than directly altering the DNA sequence like CRISPR-Cas systems. #### 1.8.1 Mechanisms of post-transcriptional gene silencing * **MicroRNAs (miRNAs):** * Endogenous small RNAs that typically bind with partial complementarity to target mRNAs, leading to translational repression. * **Biogenesis:** Processed from pri-miRNA precursors in the nucleus by Drosha, then exported to the cytoplasm where Dicer cleaves pre-miRNA into a ~21-22 nucleotide duplex. This duplex is incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC). * **Function:** RISC uses the miRNA as a guide to find complementary sequences on target mRNAs. Partial matches generally inhibit translation. * **Small interfering RNAs (siRNAs):** * Small RNAs, typically ~21-22 nucleotides long, derived from longer double-stranded RNA (dsRNA) molecules. They are involved in gene silencing through mRNA cleavage. * **Biogenesis:** Introduced dsRNA is processed by Dicer into siRNA duplexes. These are incorporated into RISC, which uses one strand (the guide strand) to find a target mRNA. * **Function:** If there is a perfect or near-perfect complementarity between the siRNA guide strand and the target mRNA, the RISC complex (specifically, Argonaute protein within RISC) will cleave the mRNA, leading to its degradation. * **Short hairpin RNAs (shRNAs):** * These are synthetic RNA molecules designed to fold into a hairpin structure. When expressed within a cell, they are processed by the cell's own machinery (Dicer) into siRNAs, which then engage the RNAi pathway. * shRNAs are commonly used in research to achieve gene knockdown. * **Dharmancon's ON-TARGET siRNAs:** * These are modified siRNAs designed for improved target recognition and cleavage. Modifications, particularly to the sense strand, can enhance the specificity and efficacy of gene silencing. #### 1.8.2 RNAi vectors RNAi can be stably expressed within cells using specialized vectors. * **Vector-based expression of shRNAs:** * shRNA sequences are cloned into RNA expression vectors under the control of appropriate promoters (e.g., U6 promoter, which is active in vivo for RNA transcription). * These vectors can be designed for transient transfection or stable integration into the genome using retroviral elements. * **pSIREN-shuttle:** * Designed for transient transfection. Features a U6 promoter for in vivo transcription of shRNA, a multiple cloning site (MCS) for cloning the shRNA sequence, a selection marker, and a SV40 origin of replication (ORI). It lacks retroviral elements, thus no genomic integration. * **pSIREN-RetroQ:** * Designed for stable transfection. It also has a U6 promoter and MCS but includes retroviral LTRs, enabling integration into the host genome. It also contains a packaging signal for viral production. #### 1.8.3 Therapeutic applications of RNAi RNAi has significant therapeutic potential for treating various diseases by silencing disease-causing genes. * **Antisense Oligonucleotides (ASOs):** * Short, single-stranded DNA or RNA molecules that can bind to target mRNA. * **Mechanism:** ASOs can block translation, modulate splicing, or induce mRNA degradation. * **Applications:** Used for protein downregulation or alternative splicing modification. * **AntagoNats:** * These are molecules designed to block antisense transcripts, potentially leading to gene upregulation. * **Ribozymes:** * Catalytically active oligonucleotides that can promote mRNA degradation. * **Clinical examples:** * **Duchenne Muscular Dystrophy:** Antisense-mediated exon skipping is being explored to correct the genetic defect. #### 1.8.4 siRNA vs. miRNA and outcomes * **siRNA:** Typically induces cleavage and degradation of the target mRNA due to high complementarity. This leads to a strong "gene knockdown." * **miRNA:** Usually leads to translational repression due to partial complementarity. The mRNA is not necessarily degraded immediately but its translation is inhibited. #### 1.8.5 Chemical synthesis of RNAi components * **Synthetic siRNAs and ASOs:** Can be chemically synthesized and delivered directly to cells or tissues. * **In vitro transcription:** RNA molecules can also be transcribed from DNA templates in vitro. #### 1.8.6 Considerations for RNAi * **Off-target effects:** The guide strand of siRNA or miRNA can sometimes bind to unintended mRNA targets, leading to silencing of genes other than the intended one. * **On-target recognition and cleavage:** Achieving efficient and specific silencing of the intended target is crucial. * **Delivery:** Effective delivery of RNAi molecules into target cells or tissues remains a significant challenge for in vivo applications. **Key definitions:** * **miRNA:** Micro RNA, ~21 nucleotides. * **pri-miRNA:** Primary miRNA precursor. * **siRNA:** Small interfering RNA, ~21 nucleotides, derived from dsRNA. * **shRNA:** Small hairpin RNA, folded dsRNA precursor. * **dsRNA:** Double-stranded RNA. * **DICER:** Enzyme that processes dsRNA into siRNAs/miRNAs. * **RISC:** RNA-induced silencing complex, involved in gene silencing. * **ASO:** Antisense Oligonucleotide, blocks mRNA or modifies splicing. * **AntagoNAT:** Antisense-based molecule that blocks antisense transcripts. --- # Post-transcriptional control and RNA interference Post-transcriptional control mechanisms regulate gene expression after the initial transcription of DNA into RNA, with RNA interference (RNAi) being a prominent pathway that silences gene expression by targeting specific RNA molecules. ### 2.1 Principles of post-transcriptional gene silencing Post-transcriptional gene silencing involves regulating gene expression at the RNA level, primarily by degrading target messenger RNA (mRNA) or inhibiting its translation. RNA interference (RNAi) is a key mechanism within this category. ### 2.2 RNA interference (RNAi) RNAi is a conserved biological process in which RNA molecules inhibit gene expression or translation, typically by neutralizing targeted mRNA molecules. It achieves this through sequence-specific recognition and degradation or translational repression of complementary RNA. #### 2.2.1 Mechanisms of RNAi The RNAi pathway involves the generation of small RNA molecules that guide effector complexes to target RNAs. * **siRNA generation and action:** * Small interfering RNAs (siRNAs) are typically derived from longer double-stranded RNA (dsRNA) precursors. * These dsRNAs are processed by an enzyme called Dicer, which cleaves them into short fragments of 21-22 nucleotides with a 3' hydroxyl (OH) group and a 2-base overhang. * The processed siRNA is then loaded into the RNA-induced silencing complex (RISC). * Within RISC, one strand (the passenger strand) is removed, leaving the guide strand to direct RISC to complementary target mRNA sequences. * A perfect complementarity between the siRNA guide strand and the target mRNA leads to the cleavage and degradation of the mRNA. * **miRNA generation and action:** * MicroRNAs (miRNAs) are endogenously produced small regulatory RNAs that are transcribed from distinct genes. * They are initially processed in the nucleus into a precursor called pri-miRNA, which is then processed into pre-miRNA by the enzyme Drosha. * Pre-miRNA is exported to the cytoplasm and further processed by Dicer into a ~21-22 nucleotide dsRNA duplex. * Similar to siRNAs, one strand of the miRNA duplex is incorporated into RISC. * However, miRNAs typically exhibit partial complementarity to their target mRNAs, primarily in the 3' untranslated region (UTR). * This partial complementarity usually leads to the inhibition of translation rather than direct cleavage of the mRNA. #### 2.2.2 siRNA vs. miRNA While both siRNAs and miRNAs are small RNA molecules processed by Dicer and integrated into RISC, they differ in their origin and primary mode of action: * **siRNAs:** Originate from exogenous or endogenous long dsRNAs and typically cause cleavage of perfectly matched target mRNAs. * **miRNAs:** Originate from endogenous genes (miRNA genes) and usually lead to translational repression through partial complementarity to target mRNAs. > **Tip:** While siRNAs predominantly cause mRNA cleavage and miRNAs cause translational repression, there can be overlap. Some siRNAs can inhibit translation, and some miRNAs can induce mRNA degradation, especially with near-perfect complementarity. #### 2.2.3 RNA interference (RNAi) vectors RNAi can be stably or transiently introduced into cells using various vector systems to achieve gene silencing. * **siRNA and shRNA delivery:** * **Chemically synthesized siRNAs:** These are synthetic RNA molecules that can be directly delivered into cells for transient knockdown. * **shRNA expression vectors:** These vectors allow for the continuous expression of short hairpin RNAs (shRNAs) within the cell. shRNAs are processed into siRNAs by Dicer. * **Plasmid-based vectors:** These plasmids contain a promoter (e.g., U6) that drives shRNA transcription *in vivo*. * **Transient transfection vectors (e.g., pSIREN-shuttle):** These vectors are designed for temporary expression and do not integrate into the host genome. They are suitable for short-term gene knockdown studies. * **Stable transfection vectors (e.g., pSIREN-RetroQ):** These vectors contain retroviral LTRs, enabling integration into the host genome for long-term, stable gene silencing. * **Viral vectors:** Lentiviral vectors or other viral systems can be engineered to express shRNAs, facilitating stable integration and long-term gene knockdown in a wider range of cell types, including non-dividing cells. * **Antisense Oligonucleotides (ASOs):** Single-stranded DNA or RNA molecules that bind to complementary mRNA sequences. * **Mechanism:** ASOs can block translation or modulate splicing, leading to protein downregulation. * **AntagoNATs:** These are antisense transcripts designed to block the action of endogenous miRNAs, leading to protein upregulation. > **Example:** Antisense-mediated exon skipping is a therapeutic strategy being explored for diseases like Duchenne muscular dystrophy. ASOs are designed to block specific splicing sites, causing the skipping of certain exons and potentially restoring a partially functional protein. ### 2.3 Other post-transcriptional regulatory mechanisms Besides RNAi, several other processes regulate gene expression after transcription: * **mRNA localization:** Directs where in the cytoplasm proteins are synthesized, ensuring localized protein function. * **Translational control:** Mechanisms that regulate the rate at which ribosomes translate mRNA into protein. * **mRNA surveillance (e.g., NMD - Nonsense-mediated decay):** Quality control pathways that detect and degrade aberrant or faulty mRNA molecules, preventing the production of non-functional or harmful proteins. * **Polyadenylation:** The addition of a poly(A) tail to mRNA, which can influence mRNA stability and translation efficiency. ### 2.4 Therapeutic applications of RNAi RNAi-based therapies hold significant promise for treating a wide range of diseases by specifically silencing disease-causing genes. * **Mechanism of action for therapeutic agents:** * **ASOs:** Can block mRNA translation or alter splicing patterns. * **siRNA/shRNA:** Induce the knockdown of target mRNA levels by promoting their degradation. * **Drug inhibitors:** Molecules that directly bind to and inhibit the function of specific proteins involved in gene expression pathways. * **Ribozymes:** Catalytically active oligonucleotides that can promote mRNA degradation. * **Development and delivery:** * RNAi therapeutics can be produced through chemical synthesis or *in vivo* transcription using expression vectors. * Delivery strategies are crucial for effective therapeutic outcomes and include chemical modification of RNA molecules, conjugation to targeting ligands, and encapsulation in nanoparticles or viral vectors. * **Clinical examples:** * **Duchenne muscular dystrophy:** Antisense oligonucleotides are being investigated to restore dystrophin protein expression by promoting exon skipping. * Other applications are being explored for genetic disorders, viral infections, and cancer. ### 2.5 Key Definitions * **miRNA (Micro RNA):** A small, non-coding RNA molecule (typically 21 nucleotides) involved in post-transcriptional regulation, usually by inhibiting translation. * **siRNA (Small interfering RNA):** A small, non-coding RNA molecule (typically 21 nucleotides) derived from longer dsRNA that mediates gene silencing by directing the cleavage of target mRNA. * **shRNA (Short hairpin RNA):** An artificial RNA molecule with a hairpin structure that is processed into siRNA within the cell. * **dsRNA (Double-stranded RNA):** RNA with two complementary strands. * **Dicer:** An enzyme that cleaves dsRNA into small RNA fragments (siRNAs and miRNAs). * **RISC (RNA-induced silencing complex):** A protein complex that incorporates small RNAs (siRNA or miRNA) to guide them to target mRNAs for silencing. * **ASO (Antisense Oligonucleotide):** A short, synthetic strand of DNA or RNA designed to bind to a specific mRNA sequence to inhibit translation or modulate splicing. * **AntagoNAT:** An antisense transcript that blocks the activity of endogenous miRNAs. * **pri-miRNA:** The initial precursor transcript of a miRNA in the nucleus. * **pre-miRNA:** The hairpin-shaped precursor of a miRNA, processed from pri-miRNA. * **Passenger strand:** The strand of an siRNA or miRNA duplex that is typically degraded or discarded by RISC. * **Guide strand:** The strand of an siRNA or miRNA duplex that is retained by RISC to direct it to target mRNA. * **Off-target effects:** Unintended silencing of genes other than the intended target, often due to partial complementarity of siRNAs/miRNAs to non-target mRNAs. * **On-target recognition and cleavage:** The precise binding and subsequent degradation of the intended target mRNA by the RNAi machinery. --- # Selection systems and cell culture media This section details strategies for identifying successfully gene-transferred cells and explores the various media formulations utilized for eukaryotic cell cultivation. ### 3.1 Selection systems for gene transfer Following gene transfer, it is crucial to identify and isolate cells that have stably integrated the introduced genetic material. This is typically achieved through the use of selection systems, which exploit specific cellular responses to selective agents or pressures. #### 3.1.1 Selection pressure Selection pressure is applied using agents that are toxic to cells unless they possess a specific resistance conferred by the introduced gene. * **Example: Methotrexate (Mtx) and Dihydrofolate Reductase (DHFR)** A common selection system involves using methotrexate (Mtx) as a selective agent. Methotrexate inhibits the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR), which is essential for DNA synthesis and cell proliferation. If the gene of interest is co-transfected with a functional *DHFR* gene, cells expressing *DHFR* can survive in the presence of Mtx. Furthermore, if the *DHFR* gene is amplified, leading to increased DHFR expression, cells become more resistant to Mtx, allowing for the selection of cells with amplified gene copies of both *DHFR* and the co-transfected gene of interest. #### 3.1.2 Dominant selectable markers Dominant selection markers are genes that confer resistance to a selective agent, and their expression is independent of the host cell's endogenous genotype. This makes them versatile for use across different cell types. * **Neomycin resistance gene (NeoR)** The neomycin resistance gene encodes an enzyme, aminoglycoside phosphotransferase (APH), which inactivates the antibiotic G418. Cells expressing NeoR are therefore resistant to G418 and can be selected for in culture. #### 3.1.3 Complementary selection systems Complementary selection involves restoring a genetic defect in a cell by introducing a functional gene. * **Example: Thymidine Kinase (TK) and HAT medium** In this system, *TK-* deficient cells (cells lacking functional thymidine kinase) are co-transfected with a functional *TK* gene and the gene of interest. These cells are then cultured in HAT medium, which contains hypoxanthine, aminopterin, and thymine. Aminopterin blocks endogenous de novo nucleotide synthesis. Only cells that can synthesize nucleotides via the salvage pathway, which requires functional thymidine kinase, can survive and proliferate in HAT medium. Thus, successful co-transfection and expression of both the *TK* gene and the gene of interest are selected for. ### 3.2 Cell culture media Cell culture media are essential for maintaining the viability, growth, and function of eukaryotic cells in vitro. They provide the necessary nutrients, growth factors, and physical conditions for cell survival. #### 3.2.1 Common cell culture media formulations Several standard media formulations are widely used in cell culture: * **RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium:** Often used for suspension cell cultures. * **Opti-MEM (Optimized Minimal Essential Medium):** A reduced serum medium designed to improve transfection efficiency and reduce variability. * **EMEM (Eagle's Minimal Essential Medium):** A basal medium providing essential amino acids, vitamins, and salts. * **DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium):** A widely used basal medium, often supplemented with higher concentrations of amino acids and vitamins than EMEM, and available with varying glucose concentrations. ### 3.3 Cell culture media and transfection The choice of cell culture medium can significantly impact the efficiency of gene transfer techniques, particularly transfection. Some media, like Opti-MEM, are specifically formulated to enhance transfection rates. > **Tip:** When performing transfections, it is often beneficial to switch to a reduced-serum medium like Opti-MEM for a period before, during, and after the transfection procedure to minimize interference from serum components with the transfection reagents and complexes. ### 3.4 Media considerations for selection When using selection systems, it is critical that the cell culture medium not only supports cell growth but also contains the necessary components for the selection process. For example, the selection agent (e.g., G418, methotrexate) must be added to the appropriate basal medium. #### 3.4.1 Selection in specific media * **HAT medium:** As described in the TK selection system, HAT medium is a specialized formulation essential for selecting cells that have successfully incorporated and are expressing the *TK* gene. ### 3.5 Plant cell culture media and transformation While the primary focus here is on animal cell culture, it's worth noting that plant cells also have specific media requirements. For transformation techniques in plants, such as those utilizing *Agrobacterium tumefaciens* or biolistics, appropriate plant growth media are crucial for the regeneration and growth of transformed cells into whole plants. These media typically contain macronutrients, micronutrients, vitamins, amino acids, and plant hormones. --- ## Common mistakes to avoid - Review all topics thoroughly before exams - Pay attention to formulas and key definitions - Practice with examples provided in each section - Don't memorize without understanding the underlying concepts

| Term | Definition | |------|------------| | Transfection | The process of introducing foreign nucleic acids (DNA or RNA) into eukaryotic cells. This can result in transient expression (temporary) or stable expression (permanent integration into the genome). | | Transduction | A method of gene transfer that utilizes viruses as vectors to deliver genetic material into host cells. This often leads to stable integration of the viral DNA into the host genome. | | Transformation | Historically, this term referred to the uptake of foreign DNA by bacterial cells. In broader contexts, it can also describe the genetic alteration of a cell, but in molecular biology, transfection is more commonly used for eukaryotes. | | MOI (Multiplicity of Infection) | A measure used in virology to quantify the number of infectious virus particles (virions) per cell when infecting a population of cells. It is calculated as the ratio of virus particles to target cells. | | siRNA (Small interfering RNA) | A type of small RNA molecule, typically 20-25 nucleotides in length, that plays a role in gene silencing through the RNA interference pathway. siRNAs are usually derived from longer double-stranded RNA precursors. | | miRNA (Micro RNA) | Small non-coding RNA molecules, approximately 21-23 nucleotides long, that regulate gene expression by binding to complementary sequences on messenger RNA (mRNA) molecules, typically leading to translational repression or mRNA degradation. | | RISC (RNA-induced silencing complex) | A multiprotein complex that mediates RNA interference (RNAi) and transcriptional gene silencing. The complex incorporates a small RNA (like siRNA or miRNA) and is guided to target nucleic acid sequences. | | shRNA (Small hairpin RNA) | A type of RNA molecule that forms a hairpin structure and can be processed into siRNA within the cell. shRNAs are often used experimentally to induce RNA interference and silence specific genes. | | Plasmid | A small, circular, double-stranded DNA molecule that is distinct from a cell's chromosomal DNA. Plasmids naturally exist in bacterial cells and can also be found in some eukaryotes. In molecular biology, they are often used as vectors for gene cloning and expression. | | Viral Vector | A virus that has been genetically modified to deliver genetic material into cells. Viral vectors are widely used in gene therapy and molecular biology research for efficient gene transfer due to their natural ability to infect cells and integrate or express their genetic payload. | | Electroporation | A technique used to introduce foreign molecules, such as DNA or RNA, into cells by applying a brief electrical pulse. The electric field creates temporary pores in the cell membrane, allowing the genetic material to enter. | | Lipofection | A method of gene transfection that uses liposomes (lipid-based vesicles) to deliver nucleic acids into cells. The liposomes encapsulate the genetic material and fuse with the cell membrane, releasing their cargo into the cytoplasm. | | Exon Skipping | A type of RNA splicing abnormality where an exon is omitted from the mature messenger RNA (mRNA) during the splicing process. This can be therapeutically induced, for example, using antisense oligonucleotides to correct mutations in genetic disorders. | | Poly-adenylation | The addition of a tail of multiple adenine nucleotides (poly-A tail) to the 3' end of a messenger RNA (mRNA) molecule. This process is crucial for mRNA stability, export from the nucleus, and translation efficiency. | | NMD (Nonsense-Mediated Decay) | A surveillance pathway in eukaryotic cells that degrades aberrant messenger RNAs (mRNAs) containing premature stop codons. This mechanism helps to prevent the production of truncated and potentially harmful proteins. | | Ti-plasmid | A plasmid found in the bacterium *Agrobacterium tumefaciens* that is capable of transferring a segment of its DNA (T-DNA) into the plant genome, causing crown gall disease. It is widely used as a vector for genetic engineering in plants. |

# Moleculaire mechanismen van kanker en therapieën Dit onderwerp onderzoekt de moleculaire grondslagen van kanker, inclusief de rol van medicijnen zoals aspirine, de invloed van de menstruatiecyclus op chemotherapie-efficiëntie, synergetische therapiecombinaties, en resistentiemechanismen tegen specifieke behandelingen. ### 1.1 Aspirine en darmkankerpreventie Langdurig gebruik van aspirine wordt geassocieerd met een verminderde kans op darmkanker. #### 1.1.1 Hypothese en moleculaire achtergrond Een mogelijke moleculaire verklaring hiervoor is dat aspirine, als een niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID), de activiteit van cyclo-oxygenase (COX) enzymen remt, met name COX-2. COX-2 speelt een rol in de productie van prostaglandines, die ontsteking bevorderen en in bepaalde kankersoorten betrokken zijn bij proliferatie, angiogenese en reductie van apoptose. Door COX-2 activiteit te verminderen, kan aspirine deze pro-tumorale effecten tegengaan. Dit sluit aan bij de typische kankerkenmerken zoals ontregelde proliferatie, resistentie tegen apoptose en angiogenese. #### 1.1.2 Bewijs voor de hypothese De hypothese kan worden bewezen door middel van verschillende experimentele benaderingen: * **In vitro studies:** Onderzoek naar de effecten van aspirine op kankercellijnen die COX-2 tot expressie brengen. Dit kan omvatten het meten van celproliferatie, apoptosepercentages en genexpressie van pro-inflammatoire en pro-angiogene factoren. * **Dierstudies:** Gebruik van diermodellen die genetisch gemodificeerd zijn om verhoogde COX-2 expressie te hebben of die spontaan darmtumoren ontwikkelen. Het effect van aspirine op tumorgroei en metastasering kan hierin geëvalueerd worden. * **Epidemiologische studies:** Grote, prospectieve cohortstudies bij mensen die aspirine gebruiken of niet gebruiken, met langdurige follow-up om de incidentie van darmkanker te vergelijken. ### 1.2 Invloed van de menstruatiecyclus op chemotherapie-efficiëntie Recent onderzoek suggereert dat de efficiëntie van chemotherapie voor borstkanker bij vrouwen afhankelijk kan zijn van de fase van de menstruatiecyclus. #### 1.2.1 Moleculaire basis De menstruatiecyclus wordt gekenmerkt door hormonale schommelingen, met name van oestrogeen en progesteron. Deze hormonen beïnvloeden de celcyclusprogressie van borstkliercellen. Kankercellen, hoewel ontregeld, kunnen nog steeds gevoelig zijn voor deze cyclische veranderingen. Bepaalde chemotherapeutica werken het meest effectief wanneer cellen zich in specifieke fasen van de celcyclus bevinden (bijvoorbeeld de S-fase of M-fase). Als de hormonale omgeving van de menstruatiecyclus de delingsactiviteit van kankercellen beïnvloedt, kan dit direct invloed hebben op de optimale timing van chemotherapie om maximale celdoding te bewerkstelligen. #### 1.2.2 In vitro demonstratie en bewijs Dit fenomeen kan in vitro worden aangetoond en bewezen door: * **Gebruik van 2D celculturen of organoïden:** Borstkankercellijnen of borstkanker organoïden kunnen worden blootgesteld aan cyclische hormonale stimulatie die de verschillende fasen van de menstruatiecyclus nabootst. * **Behandeling met chemotherapie:** Na de cyclische hormonale blootstelling worden de cellen of organoïden behandeld met een specifieke chemotherapeuticum. * **Analyse van celvitaliteit en celdeling:** Het meten van celproliferatie, apoptosepercentages en de celcyclusverdeling na de therapie. Verwacht wordt dat de effectiviteit van de chemotherapie varieert afhankelijk van de celcyclusfase waarin de cellen zich bevonden tijdens de toediening. * **Hormoonreceptorexpressie:** Het karakteriseren van de hormoonreceptorstatus (ER, PR) van de gebruikte cellijnen of organoïden is cruciaal. ### 1.3 Kankertherapiecombinaties en synergetische effecten Het combineren van verschillende kankertherapieën kan leiden tot synergetische effecten, waarbij de gecombineerde therapeutische impact groter is dan de som van de individuele behandelingen. #### 1.3.1 Voorbeelden van synergetische combinaties * **Chemotherapie + Senolyticum:** Senolytica zijn middelen die selectief senescente cellen elimineren. Senescente cellen kunnen bijdragen aan tumorprogressie en resistentie tegen therapie. Combinatie met chemotherapie kan de effectiviteit verhogen door het verwijderen van deze ondersteunende celpopulatie. * **NF-$\kappa$B inhibitor + Glucocorticoïden:** Ontstekingsroutes, gemedieerd door NF-$\kappa$B, zijn vaak ontregeld in kanker. Glucocorticoïden kunnen ook ontstekingsremmende eigenschappen hebben en synergetisch werken met NF-$\kappa$B inhibitoren om tumorgroei te remmen. * **Chemotherapie gevolgd door immunotherapie:** Eerst chemotherapie om de tumorbelasting te verminderen en tumorantigenen vrij te geven, gevolgd door immunotherapie om het immuunsysteem te activeren tegen de resterende kankercellen. #### 1.3.2 Overige combinaties uit MCQ's * **Lcl2 + myc:** Dit suggereert combinaties gericht op eiwitten die essentieel zijn voor celoverleving (Lcl2) en proliferatie (myc), wat potentieel synergetisch kan werken. ### 1.4 Resistentie tegen RAF-inhibitoren Tumoren kunnen resistent worden tegen gerichte therapieën, zoals RAF-inhibitoren, bij specifieke mutaties. #### 1.4.1 Resistentie bij BRAF V600E mutatie Bij tumoren met een BRAF V600E mutatie, die gevoelig zijn voor BRAF-inhibitoren, kan resistentie ontstaan. Als een tumor resistent wordt tegen een RAF-inhibitor, kan dit het gevolg zijn van reactivatie van de MAPK-signaalroute via andere mechanismen. #### 1.4.2 Therapeutische strategie bij resistentie Wanneer een tumor resistent is geworden tegen een RAF-inhibitor, kan de volgende therapie overwogen worden: * **ERK-inhibitor:** Als de resistentie wordt veroorzaakt door een bypass-mechanisme dat leidt tot verhoogde activiteit van ERK (downstream van RAF), kan een ERK-inhibitor effectief zijn. * **RTK-inhibitor:** Remming van receptor tyrosine kinases (RTK's) kan ook nuttig zijn, aangezien deze vaak upstream van de RAF-eiwitten opereren en hun activiteit kunnen omzeilen. ### 1.5 Karakterisering van tumoren versus organoïden Er zijn fundamentele verschillen tussen tumoren en organoïden die relevant zijn voor kankeronderzoek. #### 1.5.1 Kenmerken van tumoren Kenmerken die typisch zijn voor tumoren, maar niet voor normale organoïden, zijn: * **Metastasen:** De capaciteit om te infiltreren, los te komen van de primaire tumor, zich door de bloedbaan of lymfevaten te verplaatsen, en nieuwe tumoren te vormen in andere organen. * **Angiogenese:** De vorming van nieuwe bloedvaten, vaak ontregeld, om de tumor van zuurstof en voedingsstoffen te voorzien. * **Ontregelende celdood (apoptose):** Weerstand tegen geprogrammeerde celdood, wat leidt tot ongecontroleerde celgroei. * **Genoominstabiliteit:** Een hoog mutatiepercentage en veranderingen in chromosoomstructuur, wat de drijvende kracht is achter de evolutie van de tumor. ### 1.6 Rol van celadhesie en extracellulaire matrix (ECM) in kanker Cel-celadhesie mechanismen en de extracellulaire matrix (ECM) spelen cruciale rollen in de morfologie, metastasering en voortgang van kanker. #### 1.6.1 Celadhesiemechanismen Celadhesie is essentieel voor weefselorganisatie. Belangrijke celadhesiemoleculen die de morfologie van organoïden (bv. lever-gal-pancreas organoïden) bepalen, omvatten: * **Cadherines:** Creëren calciumafhankelijke cel-celverbindingen, cruciaal voor epitheliale organisatie. E-cadherines spelen een sleutelrol in het voorkomen van metastasering door cel-celadhesie te bevorderen; een verminderde expressie is geassocieerd met invasie. * **Integrines:** Cel-matrix receptoren die celinteracties met de ECM mediëren. * **Selectines:** Betrokken bij cel-celadhesie in het vaatstelsel, met name bij ontstekingen. * **Gap junctions:** Verbunden die directe communicatie tussen cellen mogelijk maken. #### 1.6.2 Extracellulaire matrix (ECM) De ECM biedt structurele ondersteuning, reguleert celgedrag en is samengesteld uit verschillende componenten. * **Collageen:** Vormt vezelachtige structuren die stevigheid en treksterkte aan de ECM verlenen. Collageen is rijk aan de aminozuren **glycine en proline**. * **Glycosaminoglycanen (GAGs):** Lange, onvertakte polysachariden die veel negatieve ladingen dragen. Ze binden water en creëren een hydrofiele, gezwollen matrix die drukbelasting kan weerstaan en als moleculair filter kan fungeren. * **Hyaluronzuur:** Een belangrijk GAG, dat anders is dan andere GAGs doordat het **geen sulfaatgroepen** bevat en **niet covalent gebonden** is aan een proteïnekern (het is een vrij GAG). Het kan extreem groot zijn (megadaltons). * **Glycoproteïnen:** Eiwitten die gecovalent gebonden zijn aan koolhydraten, zoals fibronectine en laminine. Ze spelen een rol bij celadhesie en ECM-organisatie. #### 1.6.3 Stevigheid van de ECM De stevigheid van de ECM wordt voornamelijk geleverd door de interactie tussen **collagenen, glycosaminoglycanen en glycoproteïnen**. #### 1.6.4 E-cadherines en metastasering E-cadherines faciliteren cel-celadhesie, wat essentieel is voor het onderdrukken van metastasering. Eiwitten die hierbij kunnen helpen of hiermee interageren, zijn onder andere **catenines**. Catenines vormen een intracellulair complex dat E-cadherines verbindt met het cytoskelet, wat de adhesie versterkt. ### 1.7 Overige moleculaire concepten #### 1.7.1 Progeria Het ziektebeeld Progeria wordt gekenmerkt door versnelde veroudering en wordt geassocieerd met een mutatie in het LMNA-gen, wat leidt tot een abnormale, getrunceerde lamine-isovorm (splice variant). Dit kan leiden tot verstoringen in de nucleusarchitectuur en de organisatie van chromosomen, zoals TADs (Topologically Associating Domains) en LADs (Lamina-Associated Domains). #### 1.7.2 Senescentie Senescentie is een staat van permanente celcyclusarrest. Kenmerken van senescentie omvatten: * **Verhoogde DNA-schade:** Ophoop van DNA-schade is vaak een trigger voor senescentie. * **Verhoogde $\beta$-galactosidase expressie:** Dit enzym wordt vaak gebruikt als biomarker voor senescente cellen. * **SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype):** Senescente cellen scheiden een complex mengsel van inflammatoire cytokines, groeifactoren en proteasen uit, wat de weefselomgeving beïnvloedt. * **p16 expressie:** Een verhoogde expressie van p16INK4a is een veelvoorkomende marker voor senescentie. #### 1.7.3 p53 functie in kanker Het tumorsuppressorgen p53 speelt meerdere cruciale rollen in de cel, waaronder: * **Cyclus inhibitor:** p53 kan de celcyclusarresteren, met name in de G1-fase, om celreplicatie te voorkomen wanneer er DNA-schade is. * **Regulator van senescentie:** p53 kan een rol spelen in het induceren of handhaven van senescentie. * **DNA-herstel mechanisme:** p53 activeert genen die betrokken zijn bij DNA-herstel. --- > **Tip:** Bij het bestuderen van moleculaire mechanismen van kanker is het essentieel om de typische kankerkenmerken (hallmarks of cancer) te kennen, aangezien veel moleculaire processen hier direct aan gerelateerd zijn. > **Tip:** Verbindingen leggen tussen verschillende concepten is cruciaal. Zo kan het begrijpen van celadhesie en ECM helpen bij het verklaren van metastasering, een belangrijk kenmerk van kanker. > **Tip:** Wees alert op de specifieke terminologie in MCQ's, zoals de exacte kenmerken van senescentie of de specifieke mutaties die tot ziektebeelden leiden. > **Tip:** Bij het bespreken van therapieën, denk na over de moleculaire targets en potentiële resistentiemechanismen. Dit helpt bij het begrijpen van de rationele achter combinatietherapieën. --- # Celbiologie en ontwikkelingsprocessen Dit onderdeel van de studiehandleiding behandelt fundamentele celbiologische concepten gerelateerd aan celadhesie, de extracellulaire matrix, cellulaire senescentie, de creatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en de moleculaire oorzaken van verouderingsziekten zoals Progeria, evenals de organisatie van het genoom. ## 2. Celadhesie en de extracellulaire matrix (ECM) Celadhesie is essentieel voor de organisatie van weefsels en de morfologie van organoïden. Verschillende celadhesiemechanismen en componenten van de extracellulaire matrix spelen hierin een cruciale rol. ### 2.1 Celadhesiemechanismen Cel-cel interacties worden gemedieerd door gespecialiseerde moleculen aan het celoppervlak. #### 2.1.1 Cadherines Cadherines zijn calcium-afhankelijke eiwitten die verantwoordelijk zijn voor klassieke cel-cel adhesie. E-cadherines spelen een belangrijke rol in het handhaven van de weefselarchitectuur en het onderdrukken van metastasering van kankercellen. * **Functie:** E-cadherines inhiberen metastasering door cel-celadhesie te bevorderen. * **Ondersteunende eiwitten:** Catenines (zoals $\alpha$-catenine en $\beta$-catenine) zijn intracellulaire eiwitten die binden aan het intracellulaire deel van cadherines en de koppeling met het cytoskelet mogelijk maken. Dit mechanisme is cruciaal voor de adhesieve functie van cadherines. #### 2.1.2 Integrines Integrines zijn transmembraaneiwitten die fungeren als receptoren voor de extracellulaire matrix (ECM). Ze koppelen de extracellulaire omgeving aan het intracellulaire cytoskelet, wat essentieel is voor celmigratie, celoverleving en celrespons op mechanische signalen. #### 2.1.3 Selectines en Ig-superfamilie adhesiemoleculen Deze moleculen zijn betrokken bij cel-cel interacties, met name in het immuunsysteem (selectines) en bij de vorming van complexere cel-cel verbindingen (Ig-superfamilie). ### 2.2 De extracellulaire matrix (ECM) De ECM is een complex netwerk van macromoleculen dat buiten de cellen wordt uitgescheiden en ondersteuning, structuur en signaleringsfuncties biedt aan weefsels. #### 2.2.1 Componenten van de ECM * **Collagenen:** Dit zijn de meest voorkomende eiwitten in de ECM en bieden structurele sterkte en weerstand tegen trekspanning. * **Samenstelling:** Collageen is rijk aan de aminozuren glycine en proline. * **Glycosaminoglycanen (GAGs):** Dit zijn lange, onvertakte polysacchariden met repetitieve disacchariden. Ze hebben een hoge negatieve lading, wat resulteert in het aantrekken en vasthouden van water, wat bijdraagt aan de hydratatie en veerkracht van de ECM. * **Hyaluronzuur:** Dit is een bijzonder GAG dat verschilt van andere GAGs doordat het geen sulfaatgroepen bevat en niet covalent gebonden is aan een proteoglycaan kern. Het kan zeer grote moleculaire gewichten bereiken (enkele megadaltons), wat bijdraagt aan de visco-elastische eigenschappen van de ECM. * **Proteoglycanen:** Dit zijn eiwitten waaraan een of meer GAG-ketens covalent gebonden zijn. Ze spelen een rol bij het binden van groeifactoren en andere signaalmoleculen. * **Glycoproteïnen:** Dit zijn eiwitten met een of meer koolhydraatketens gebonden. Ze spelen een rol bij celadhesie, celcommunicatie en de organisatie van de ECM (bv. fibronectine, lamienine). #### 2.2.2 Functie van de ECM De ECM geeft stevigheid aan de cel en het weefsel door de interactie van collageen, glycosaminoglycanen en glycoproteïnen. Het speelt een rol bij: * Structuur en ondersteuning van weefsels. * Celmigratie en differentiatie. * Wondgenezing. * Signaaltransductie. ## 3. Cellulaire senescentie Cellulaire senescentie is een stabiele staat van celdeling-arrest die optreedt als reactie op verschillende stressfactoren, waaronder DNA-schade. Senescente cellen ondergaan significante veranderingen in hun fenotype en secreteren een reeks moleculen die bekend staat als het Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). ### 3.1 Kenmerken van senescentie * **Verhoogde DNA schade:** Vaak is DNA-schade de initiërende factor voor senescentie. * **Verhoogde $\beta$-galactosidase expressie:** Dit enzym wordt gebruikt als een biomarker voor senescente cellen, dat actief is bij een pH van 6.0. * **SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype):** Senescente cellen scheiden een complex cocktail van inflammatoire cytokines, chemokines, groeifactoren en matrixmetalloproteïnasen uit. Deze moleculen kunnen de omliggende weefselomgeving beïnvloeden, wat zowel positieve (bv. wondgenezing, tumoronderdrukking) als negatieve (bv. chronische ontsteking, bevordering van tumorgroei) effecten kan hebben. * **Modulatie van p16 expressie:** In veel gevallen is er een verhoogde expressie van p16 (een cycline-afhankelijke kinase remmer) geassocieerd met senescentie. > **Tip:** Senolytica zijn medicijnen die selectief senescente cellen kunnen elimineren. Combinaties van chemotherapie met senolytica vertonen vaak een synergetisch effect bij de behandeling van kanker. ## 4. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) zijn somatische cellen die genetisch zijn geherprogrammeerd tot een stamcelachtige staat, vergelijkbaar met embryonale stamcellen. ### 4.1 Transcriptiefactoren voor iPSC-creatie De creatie van iPSC's vereist de expressie van specifieke transcriptiefactoren die essentieel zijn voor de pluripotente staat. De klassieke factoren die hiervoor nodig zijn, zijn: * Oct4 (POU5F1) * Sox2 * Klf4 * c-Myc ## 5. Verouderingsziekten: Progeria Progeria is een zeldzame genetische aandoening die versnelde veroudering veroorzaakt bij kinderen. ### 5.1 Moleculaire basis van Progeria * **Mutatie in het LMNA-gen:** De meest voorkomende oorzaak van klassiek Progeria is een specifieke mutatie in het *LMNA*-gen. Deze mutatie leidt tot de productie van een abnormaal gesplitste (splice variant) lamine-isovorm, genaamd progerine. * **Progerine accumulatie:** Progerine accumuleert in de celkern, wat de nucleaire stabiliteit verstoort, de chromatine-organisatie (inclusief de organisatie van Topologically Associating Domains (TAD's) en Lamin-Associated Domains (LAD's)) ontregelt en leidt tot celdysfunctie. Dit resulteert in de kenmerken van versnelde veroudering. * **Karakteristieken van Progeria:** De ziekte wordt gekenmerkt door onder andere haaruitval, kort gestalte, stijve gewrichten en cardiovasculaire problemen, maar de cellen zijn over het algemeen niet opgezwollen; eerder vertonen ze nucleaire abnormaliteiten. > **Tip:** Progeria is een modelziekte om de moleculaire mechanismen van veroudering te bestuderen. De verstoring van de nucleaire architectuur, zoals de organisatie van TAD's en LAD's, is een belangrijk aandachtspunt. ## 6. Genoomorganisatie Het genoom is niet een passieve structuur, maar is dynamisch georganiseerd in de celkern. Deze organisatie heeft invloed op genexpressie en cellulaire processen. ### 6.1 Chromosoomorganisatie De manier waarop DNA is opgerold en georganiseerd in de celkern, beïnvloedt de toegankelijkheid van genen voor transcriptiefactoren en andere regulatoire eiwitten. * **Topologically Associating Domains (TAD's):** Dit zijn regio's van het genoom die sterk met elkaar interageren en gescheiden zijn van andere TAD's. Ze dragen bij aan de functionele organisatie van het genoom. * **Lamin-Associated Domains (LAD's):** Dit zijn gebieden van het genoom die geassocieerd zijn met de binnenste kernenvelop, die rijk is aan lamines. LAD's worden over het algemeen geassocieerd met genen die geen transcriptie hebben of een lage transcriptie-activiteit. Verstoringen in de organisatie van TAD's en LAD's, zoals gezien bij Progeria, kunnen leiden tot ontregelde genexpressie en cellulaire disfunctie. ## 7. Therapeutische strategieën en kanker Verschillende moleculaire mechanismen liggen ten grondslag aan kankertherapie en de ontwikkeling van resistentie. ### 7.1 Kankertherapie en synergie Sommige combinaties van therapieën vertonen een synergetisch effect, wat betekent dat de gecombineerde behandeling effectiever is dan de som van de individuele behandelingen. * **Chemotherapie + Senolyticum:** Deze combinatie kan effectief zijn omdat chemotherapie kankercellen kan beschadigen, terwijl senolytica de daaruit voortkomende senescente cellen kunnen elimineren, wat de algehele effectiviteit verhoogt. * **NF-$\kappa$B inhibitor (bv. Aspirine) + glucocorticoïden:** Deze combinatie kan synergetisch werken, met name in de context van ontstekingsgerelateerde kankers of de behandeling van ontstekingen die de tumorgroei bevorderen. Aspirine kan bijvoorbeeld de activiteit van NF-$\kappa$B remmen, wat een rol speelt bij ontsteking en kanker. ### 7.2 Resistentie tegen therapie * **Mutatie in Raf V600E en resistentie tegen RAF-inhibitor:** Wanneer tumoren resistent worden tegen specifieke remmers, zoals RAF-inhibitoren (bijvoorbeeld bij melanoom met de Raf V600E mutatie), kan het nodig zijn om downstream targets in de signaalroute te remmen. Een ERK-inhibitor kan dan een effectieve behandelingsoptie zijn, omdat deze de activiteit van de mitogene signaalcascade verderop blokkeert. ### 7.3 Karakteristieken van tumoren versus organoïden Tumoren en organoïden delen bepaalde eigenschappen, maar er zijn ook cruciale verschillen. * **Karakteristieken van tumoren (en vaak afwezig in organoïden):** * **Metastasen:** De capaciteit om uit te zaaien naar andere delen van het lichaam. * **Angiogenese:** De vorming van nieuwe bloedvaten om de tumor van voedingsstoffen te voorzien. * **Ontregelde celdood:** Het vermogen om apoptose (geprogrammeerde celdood) te ontwijken. * **Genoom instabiliteit:** Een hoge frequentie van mutaties en chromosomale afwijkingen. Organoïden zijn structuren die zijn afgeleid van stamcellen en de architectuur en functie van organen nabootsen in vitro, maar ze vertonen doorgaans niet de invasieve en metastatische eigenschappen van tumoren. ## 8. Molculair onderzoek en experimentele strategieën ### 8.1 In vitro modellen voor ziekteonderzoek * **Organoïde modellen:** Organoïden zijn waardevolle tools om ziekteprocessen in vitro te bestuderen en therapeutische doelwitten te identificeren. * **Model voor de ziekte van Alzheimer:** Het creëren van een organoïde model voor Alzheimer vereist het kweken van hersenorganoïden die de specifieke pathologie van de ziekte vertonen (bv. accumulatie van amyloïde-bèta plaques en tau-aggregaten). Experimentele strategieën omvatten het introduceren van ziekte-geassocieerde mutaties in stamcellen alvorens deze te differentiëren tot organoïden, of het blootstellen van reeds gevormde organoïden aan ziekte-gerelateerde factoren. * **Identificeren van therapeutische doelwitten:** In een organoïde model kunnen moleculaire profielen (bv. RNA-sequencing, proteomics) worden vergeleken tussen gezonde en zieke organoïden om verschillen in genexpressie of eiwitactiviteit te identificeren die potentieel therapeutische doelwitten kunnen zijn. Functional assays kunnen vervolgens worden gebruikt om de rol van deze doelwitten te valideren. * **Compound screening:** Voor drug discovery of toxicologische doeleinden kunnen organoïden worden gebruikt om de effecten van chemische verbindingen te testen. Dit omvat het blootstellen van de organoïden aan verschillende concentraties van een compound en het meten van relevante uitkomsten (bv. celoverleving, genexpressie, specifieke pathologische markers). Dit maakt het mogelijk om potentiële medicijnen te identificeren of schadelijke effecten van blootstelling aan chemicaliën te evalueren. ### 8.2 Bewijzen van hypothese Om een hypothese te bewijzen, is een combinatie van experimentele methoden nodig, zowel in vitro als in vivo. * **Voorbeeld: Aspirine en darmkanker:** * **Hypothese:** Langdurig gebruik van aspirine vermindert de kans op darmkanker door de moleculaire route van COX-2 te remmen, wat leidt tot verminderde ontstekingsmediatoren en celproliferatie. * **Bewijs in vitro:** * Onderzoek de expressie van COX-2 in darmkankercellen en behandel deze cellen met aspirine. Meet veranderingen in celproliferatie, apoptose en de productie van inflammatoire moleculen. * Onderzoek de effecten van aspirine op celculturen van darmkankercellen die COX-2 overexpressen. * **Bewijs in vivo:** * Placebo-gecontroleerde klinische studies bij grote populaties om het verband tussen aspirinegebruik en de incidentie van darmkanker te onderzoeken. * Experimenten bij proefdieren die zijn gefokt om darmkanker te ontwikkelen, waarbij het effect van aspirine op tumorgroei en metastasering wordt geëvalueerd. * **Voorbeeld: Menstruatiecyclus en chemotherapie-efficiëntie:** * **Hypothese:** De efficiëntie van bepaalde chemotherapeutica voor borstkanker is afhankelijk van de hormonale fluctuaties gedurende de menstruatiecyclus, omdat deze cycli de proliferatie en gevoeligheid van kankercellen kunnen beïnvloeden. * **Moleculaire basis:** Hormonale receptoren op borstkankercellen (bv. oestrogeenreceptoren) worden beïnvloed door de cyclische verhoging en daling van oestrogenen. Deze receptoren kunnen de celcyclus, DNA-replicatie en gevoeligheid voor cytotoxische middelen reguleren. * **In vitro bewijs:** * Kweek borstkankercellijnen die hormonale receptoren tot expressie brengen. * Behandel deze cellen met de specifieke chemotherapie op verschillende tijdstippen die overeenkomen met de verschillende fasen van de menstruatiecyclus (gesimuleerd door het toevoegen van relevante hormonen aan de kweekmedia). * Meet de celdood en proliferatie. * Onderzoek de expressie van celcyclusmarkers en DNA-schade markers in relatie tot de hormonale toestand. ## 9. Overige celbiologische concepten * **p53:** Dit tumor-onderdrukkende eiwit speelt een centrale rol in het reguleren van de celcyclus, het induceren van DNA-herstelmechanismen en het initiëren van apoptose in reactie op DNA-schade. p53 is een cyclus-inhibitor en reguleert senescentie en DNA-herstel. * **Kankertherapie combinaties:** Naast chemotherapie en senolytica, zijn er andere combinaties die synergetisch kunnen werken, zoals bepaalde combinaties van doelgerichte therapieën en immunotherapie. De specifieke effectiviteit is afhankelijk van het type kanker en de moleculaire kenmerken ervan. --- # Organoïden en modellen voor ziekteonderzoek Dit onderwerp verkent het gebruik van organoïden als in-vitromodellen voor de studie van ziekten zoals Alzheimer en borstkanker, inclusief de identificatie van therapeutische doelwitten en compound screening strategieën. ### 3.1 Inleiding tot organoïden in ziekteonderzoek Organoïden zijn driedimensionale celculturen die de structuur en functie van specifieke organen nabootsen. Ze worden steeds belangrijker als in-vitromodellen voor de studie van ziekten, geneesmiddelenontwikkeling en toxicologie. Ze bieden een complexere en biologisch relevantere omgeving dan traditionele tweedimensionale celkweeksystemen. ### 3.2 Toepassingen in ziekteonderzoek #### 3.2.1 Ziekte van Alzheimer Het bestuderen van de ziekte van Alzheimer met behulp van organoïden vereist specifieke methodologieën om de neurale weefsels na te bootsen. * **Modelcreatie:** Het creëren van een in-vitro model voor de ziekte van Alzheimer met organoïden kan een schema omvatten waarbij pluripotente stamcellen (induceerbare pluripotente stamcellen, iPSC's) worden gedifferentieerd tot neurale progenitorcellen en vervolgens tot specifieke neuronale celtypen die kenmerkend zijn voor de hersenen. Dit proces kan worden begeleid door specifieke groeifactoren en transcriptiefactoren die essentieel zijn voor de neurale ontwikkeling. * **Identificatie van nieuwe therapeutische doelwitten:** Met behulp van een dergelijk organoïde model kunnen experimentele strategieën worden ontwikkeld om nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren. Dit kan inhouden: * Het induceren van ziektegerelateerde pathologieën in de organoïden, bijvoorbeeld door genetische manipulatie om mutaties te introduceren die geassocieerd zijn met Alzheimer, of door blootstelling aan ziekte-specifieke amyloïde-beta aggregaten. * Het vervolgens screenen van de moleculaire veranderingen die optreden in de gemanipuleerde organoïden. Dit kan omvatten: * Genexpressieanalyse (bijv. RNA-sequencing) om genen te identificeren die omhoog of omlaag worden gereguleerd als gevolg van de pathologie. * Analyse van eiwitexpressie en post-translationele modificaties (bijv. Western blotting, massaspectrometrie) om belangrijke signaalroutes te identificeren die worden beïnvloed. * Het onderzoeken van de interactie tussen verschillende celtypen binnen de organoïde, zoals neuronen en gliale cellen, om te begrijpen hoe deze cellen bijdragen aan de ziekteprogressie. * Het identificeren van abnormale eiwitaggregaties, zoals amyloïde-beta plaques en tau-neurofibrillaire tangles. * **Compound screening strategieën:** Voor geneesmiddelenontdekking en toxicologie kunnen compound screening strategieën worden toegepast op Alzheimer-organoïden. * **Geneesmiddelenontdekking:** Grote bibliotheken van potentiële geneesmiddelen kunnen worden gescreend op hun vermogen om ziektegerelateerde pathologieën om te keren of te verminderen in de organoïden. Dit kan gericht zijn op het verminderen van amyloïde-beta productie, het voorkomen van tau-aggregatie, of het verbeteren van synaptische functie. * **Adverse outcome toxicology (exposome chemicals):** Organoïden kunnen worden gebruikt om de toxiciteit van omgevingschemicaliën (exposoom) op specifieke orgaanfuncties te evalueren. Door organoïden bloot te stellen aan verschillende concentraties van chemische stoffen en vervolgens te meten op tekenen van toxiciteit (bijv. celdood, veranderde metabole activiteit, functionele achteruitgang), kan men potentiële risico's inschatten. #### 3.2.2 Borstkanker Organoïden bieden ook waardevolle modellen voor het bestuderen van borstkanker, inclusief de efficiëntie van chemotherapie en de identificatie van moleculaire mechanismen. * **Moleculaire basis voor de afhankelijkheid van de menstruatiecyclus:** Onderzoek heeft gesuggereerd dat de efficiëntie van chemotherapie voor borstkanker afhankelijk kan zijn van de menstruatiecyclus van de patiënt. De moleculaire basis hiervoor kan liggen in cyclische veranderingen in hormoonniveaus (oestrogenen, progesteron) en groeifactoren die de celproliferatie en gevoeligheid voor chemotherapie beïnvloeden. Sommige fasen van de cyclus kunnen cellen gevoeliger maken voor celdood door chemotherapie, terwijl andere fasen de celdeling kunnen stimuleren, waardoor ze minder responsief zijn. * **In-vitro aantonen en bewijzen:** Dit kan in-vitro worden aangetoond door borstkanker organoïden te kweken. * Cellen kunnen worden blootgesteld aan cyclische veranderingen die de hormoonspiegels tijdens de menstruatiecyclus nabootsen. * Vervolgens kan de gevoeligheid van deze organoïden voor specifieke chemotherapeutica worden getest in verschillende cyclische fasen. * Moleculaire analyses, zoals genexpressie en eiwitactiviteit, kunnen worden uitgevoerd om te begrijpen welke signaalroutes actief zijn en hoe deze de respons op chemotherapie beïnvloeden. ### 3.3 Kenmerken die tumoren onderscheiden van organoïden Hoewel organoïden de structuur en functie van organen nabootsen, zijn er belangrijke kenmerken die typisch zijn voor tumoren, maar niet voor de meeste in-vitro gekweekte organoïden: * **Metastasen:** Tumoren hebben de inherente eigenschap om te metastaseren, wat betekent dat ze kunnen uitzaaien naar andere delen van het lichaam. Dit is een complex proces dat invasie van de extracellulaire matrix, intravasatie, overleving in de circulatie en extravasatie omvat. De meeste standaard organoïde modellen missen deze metastatische capaciteit. * **Angiogenese:** Tumoren stimuleren de vorming van nieuwe bloedvaten (angiogenese) om van voedingsstoffen en zuurstof te voorzien, wat cruciaal is voor hun groei en overleving. Hoewel sommige geavanceerde organoïde modellen technieken kunnen bevatten om angiogenese te bestuderen, is het niet een intrinsiek kenmerk van alle organoïden. * **Ontregelende celdood (apoptose):** Kankercellen ontwikkelen vaak mechanismen om celdood te ontwijken, wat bijdraagt aan hun ongecontroleerde groei en resistentie tegen therapie. Hoewel sommige organoïden hun normale celdoodprocessen behouden, kunnen tumoren deze mechanismen actief onderdrukken. * **Genoominstabiliteit:** Kankers worden vaak gekenmerkt door een hoge mate van genoominstabiliteit, wat leidt tot accumulatie van mutaties en chromosomale afwijkingen. Dit draagt bij aan de heterogeniteit van de tumor en de evolutie van therapieresistentie. ### 3.4 Kenmerken van senescentie Senescentie is een celtoestand die wordt gekenmerkt door permanente celdelingsstop, vaak als reactie op stress of schade. * **Verhoogde DNA schade:** DNA-schade is een veelvoorkomende trigger voor senescentie. * **Verhoogde $\beta$-galactosidase expressie:** Dit enzym is een veelgebruikte biomarker voor senescente cellen. * **SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype):** Senescente cellen scheiden een cocktail af van inflammatoire cytokinen, chemokinen en groeifactoren uit. * **Regulatie door p53:** Het gen p53 speelt een cruciale rol bij het reguleren van senescentie, vaak fungerend als een cyclusinhibitor en betrokken bij DNA-herstelmechanismen. ### 3.5 Celadhesiemechanismen en de extracellulaire matrix (ECM) Celadhesie is essentieel voor de organisatie van weefsels en de morfologie van organoïden. De extracellulaire matrix (ECM) speelt hierbij een ondersteunende rol. * **Types celadhesiemoleculen:** * **Cadherines:** Zoals E-cadherine, cruciaal voor epitheliale cel-celadhesie. Verstoring van cadherine-gemedieerde adhesie is geassocieerd met invasie en metastase van kankercellen. Eiwitten zoals **catenines** zijn hierbij essentieel, omdat ze de intracellulaire staart van cadherines verbinden met het cytoskelet. * **Integrines:** Deze receptoren binden aan ECM-componenten en spelen een sleutelrol in cel-ECM interacties. * **Selectines:** Betrokken bij cel-celadhesie in de context van immuunrespons en ontsteking. * **Gap junctions:** Faciliteren directe communicatie tussen cellen. * **Functie van de extracellulaire matrix:** De ECM, bestaande uit collageen, glycosaminoglycanen (GAGs), proteoglycanen en glycoproteïnen, biedt structurele ondersteuning, reguleert celgedrag (proliferatie, migratie, differentiatie) en dient als reservoir voor groeifactoren. * **Collageen:** Rijk aan **glycine en proline**, zorgt voor treksterkte. * **Glycosaminoglycanen (GAGs):** Zoals hyaluronzuur. Hyaluronzuur onderscheidt zich van andere GAGs door het **ontbreken van sulfaategroepen**. GAGs en hun proteoglycaan-geassocieerde vormen, samen met collageen, geven stevigheid aan de ECM. ### 3.6 Therapeutische strategieën in kanker #### 3.6.1 Synergetische therapieën Combinatietherapieën kunnen een synergetisch effect hebben, wat betekent dat de gecombineerde therapie effectiever is dan de som van de individuele therapieën. * **Chemotherapie + senolyticum:** Senolytica zijn middelen die senescente cellen selectief kunnen doden. Het combineren van chemotherapie (die vaak celschade en senescentie kan induceren) met senolytica kan de effectiviteit van de behandeling verhogen door senescente tumorcellen of stroma-cellen die tumorgroei ondersteunen, te elimineren. * **NF-KB inhibitor + glucocorticoïden:** Deze combinatie kan relevant zijn voor ontstekingsgerelateerde kankers, aangezien NF-KB een belangrijke pro-inflammatoire transcriptiefactor is en glucocorticoïden ontstekingsremmende eigenschappen hebben. * **Lcl2 + myc:** Dit zou kunnen verwijzen naar de interactie tussen verschillende oncogenen, waarbij het remmen van beide een synergetisch effect kan hebben. #### 3.6.2 Behandeling van therapieresistentie * **Mutatie voor Raf V600E en resistentie tegen RAF-inhibitor:** De Raf V600E mutatie is een veelvoorkomende driver-mutatie in diverse kankers. Als een tumor resistent wordt tegen een directe RAF-inhibitor, kunnen alternatieve strategieën nodig zijn. Een **ERK-inhibitor** kan effectief zijn, omdat ERK (extracellulair gereguleerde kinase) een belangrijke downstream effector is van de RAF/MEK/ERK signaalcascade. Het blokkeren van ERK kan de signalering verder onderbreken, zelfs als de RAF-remmer niet volledig effectief is. ### 3.7 Moleculaire achtergronden van ziektebeelden * **Progeria:** Dit zeldzame genetische syndroom wordt gekenmerkt door versnelde veroudering. Een veelvoorkomende oorzaak is een mutatie in het *LMNA*-gen, wat leidt tot de productie van een abnormale, getrunceerde lamine A-isovorm (splice variant). Dit verstoort de nucleusstructuur en de organisatie van chromosomen binnen de nucleus, waaronder de TAD (Topologically Associating Domain) en LAD (Lamina-Associated Domain) organisatie. * **E-cadherines en tumor suppressie:** E-cadherines zijn cruciaal voor cel-celadhesie in epitheliale weefsels. Door cel-celadhesie te bevorderen, spelen ze een belangrijke rol bij het voorkomen van metastasen, wat hen functioneel tot tumor suppressorgenen maakt. **Catenines** zijn eiwitten die direct interageren met het intracellulaire deel van E-cadherines en deze koppelen aan het cytoskelet, waardoor de adhesie wordt versterkt en metastasen worden geremd. ### 3.8 Organoïde technologie in brede zin * **Multiorgaan organoïden:** De morfologie van multi-orgaan organoïden, zoals lever-gal-pancreas organoïden, is mede bepaald door de specifieke celadhesiemoleculen die tot expressie komen in de verschillende celtypen. Deze moleculen zorgen voor de correcte positionering en interactie van de cellen, waardoor de karakteristieke driedimensionale structuur van het orgaan wordt nagebootst. * **IPS-c creatie:** De creatie van iPSC's vereist specifieke transcriptiefactoren (zoals Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc) die het celgedrag herprogrammeren naar een pluripotente staat. > **Tip:** Bij het interpreteren van examenvragen over organoïden is het belangrijk om onderscheid te maken tussen de kenmerken van *normale* organoïden en de *pathologische* kenmerken die specifiek zijn voor tumoren of ziekten. --- # Endocriene verstoorders en hun effecten Dit deel behandelt het concept van endocriene verstoorders, hun potentiële gevaren, chemische voorbeelden, moleculaire werkingsmechanismen en methoden voor in-vitrotesten, evenals de historische redenen achter specifieke bijwerkingen van hormoontherapie. ## 4. Endocriene verstoorders en hun effecten ### 4.1 Concept van endocriene verstoorders Endocriene verstoorders (ED's) zijn exogene stoffen die de normale werking van het endocriene systeem kunnen verstoren. Het endocriene systeem reguleert een breed scala aan fysiologische processen, waaronder groei, ontwikkeling, metabolisme, voortplanting en gedrag, via hormonen. ED's kunnen deze processen op verschillende manieren beïnvloeden door de synthese, secretie, transport, binding, werking of eliminatie van hormonen te verstoren. ### 4.2 Potentiële gevaren en effecten De potentiële gevaren van ED's zijn divers en afhankelijk van het specifieke chemische stof, de blootstellingsduur, de dosis en het ontwikkelingsstadium. Potentiële effecten omvatten: * **Ontwikkelingsstoornissen:** Vooral tijdens gevoelige perioden zoals zwangerschap en vroege kinderjaren, wanneer de ontwikkeling van organen en systemen plaatsvindt. Dit kan leiden tot afwijkingen in de voortplantingsorganen, neuro-ontwikkeling en immuunsysteem. * **Reproductieve problemen:** Veranderingen in vruchtbaarheid, verminderde spermakwaliteit, vroegtijdige puberteit, en verhoogd risico op bepaalde kankers van het voortplantingssysteem. * **Metabolische ziekten:** Verhoogd risico op obesitas, diabetes mellitus type 2 en schildklieraandoeningen. * **Neurologische en gedragsproblemen:** Beïnvloeding van de hersenontwikkeling, wat kan leiden tot leerproblemen, gedragsstoornissen zoals ADHD, en stemmingsstoornissen. * **Kanker:** Sommige ED's kunnen het risico op hormoongerelateerde kankers verhogen, zoals borstkanker, prostaatkanker en schildklierkanker. > **Tip:** De term "men in danger" die in de literatuur wordt gebruikt, benadrukt de brede impact van endocriene verstoorders op de menselijke gezondheid, met name op de reproductieve gezondheid en de ontwikkeling van mannen. ### 4.3 Voorbeelden van chemische groepen Verschillende chemische groepen kunnen als endocriene verstoorders fungeren. Enkele veelvoorkomende voorbeelden zijn: * **Bisfenol A (BPA):** Een chemische stof die wordt gebruikt in polycarbonaten en epoxyharsen, vaak gevonden in voedselverpakkingen, plastic flessen en tandheelkundige materialen. BPA is een xeno-oestrogeen dat kan interageren met oestrogeenreceptoren. * **Ftalaten:** Een groep chemicaliën die worden gebruikt om plastics flexibeler te maken. Ze zijn te vinden in consumentenproducten zoals cosmetica, huishoudelijke schoonmaakmiddelen, lijmen en verf. Ftalaten kunnen de hormoonproductie en -functie verstoren, met name androgeenreceptoren. * **Dioxines en furanen:** Bijproducten van industriële processen zoals verbranding en papierproductie. Ze zijn zeer persistente organische verontreinigende stoffen met een sterke affiniteit voor lipiden en kunnen de hormoonreceptoren beïnvloeden. * **Pesticiden:** Veel pesticiden, zoals DDT en organofosfaten, hebben hormonale effecten. * **Vlamvertragers:** Stoffen die worden toegevoegd aan meubels, elektronica en textiel om brandbaarheid te verminderen, zoals broomhoudende vlamvertragers. * **Farmaceutica:** Sommige medicijnen, waaronder synthetische hormonen (zoals die in hormonale anticonceptie of hormoontherapie) en steroïden, kunnen, indien niet correct gebruikt, ook als endocriene verstoorders fungeren. > **Voorbeeld:** Een voorbeeld van een chemische groep die als endocriene verstoorder kan werken, zijn de **ftalaten**. Deze verbindingen kunnen interfereren met de androgeenreceptoren, wat gevolgen kan hebben voor de ontwikkeling van het mannelijk voortplantingssysteem. ### 4.4 Moleculaire werkingsmechanismen Endocriene verstoorders kunnen op verschillende moleculaire niveaus ingrijpen: * **Nabootsing van hormonen (agonisten):** Sommige ED's lijken structureel op natuurlijke hormonen en kunnen binden aan hormoonreceptoren, waardoor ze een vergelijkbare (of soms versterkte) cellulaire respons uitlokken. Een klassiek voorbeeld is de oestrogene activiteit van BPA. * **Blokkering van hormonen (antagonisten):** Andere ED's kunnen aan hormoonreceptoren binden zonder de receptor te activeren, waardoor ze de binding van natuurlijke hormonen voorkomen en hun effect blokkeren. * **Verstoring van hormoonsynthese of -afbraak:** ED's kunnen enzymen beïnvloeden die betrokken zijn bij de productie of afbraak van hormonen, waardoor de hormoonspiegels in het lichaam veranderen. * **Verstoring van hormoon-receptor interactie:** Ze kunnen de affiniteit van hormonen voor hun receptoren veranderen of de intracellulaire signaaltransductie na receptorbinding beïnvloeden. * **Effecten op hormoontransport:** ED's kunnen de eiwitten die hormonen in het bloed transporteren, beïnvloeden, waardoor de beschikbaarheid van hormonen voor hun doelwitten verandert. * **Epigenetische modificaties:** Sommige ED's kunnen epigenetische veranderingen veroorzaken, zoals DNA-methylatie of histonmodificaties, die de genexpressie op lange termijn kunnen beïnvloeden zonder de DNA-sequentie zelf te veranderen. ### 4.5 Methodes voor in-vitrotesten Het testen van de effecten van potentiële endocriene verstoorders in het laboratorium is cruciaal voor risicobeoordeling. Diverse in-vitro methoden worden gebruikt: * **Receptorbindingstests:** Deze tests meten de affiniteit van een stof om te binden aan specifieke hormoonreceptoren (bv. oestrogeen-, androgeen-, schildklierhormoonreceptoren). * **Receptoractivatietests (bv. reportergenassays):** Cellijnen worden genetisch gemodificeerd om een detecteerbaar signaal (bv. luminescentie, fluorescentie) te produceren wanneer een hormoonreceptor wordt geactiveerd. Dit kan onderscheid maken tussen agonisten en antagonisten. * **Voorbeeld experimentele strategie:** Men kan een menselijke borstepitheelcellijn (bv. MCF-7) gebruiken die is getransfecteerd met een oestrogeenreceptor-gestuurd reportergen. Blootstelling aan het te testen agens zal, indien het oestrogene activiteit heeft, leiden tot expressie van het reportergen. De intensiteit van het signaal correleert met de oestrogene potentie. * **Celgebaseerde assays:** Diverse celtypen worden blootgesteld aan de stof om effecten op celproliferatie, differentiatie, celdood, of specifieke genexpressie te meten. * **Endocriene disruptie screening program (EDSP) assays:** Gestandaardiseerde testbatterijen ontwikkeld door regelgevende instanties om ED's te identificeren. Dit omvat assays die verschillende endpoints in de hypothalamus-hypofyse-gonadale as, schildklieras en schildklieras evalueren. > **Voorbeeld:** Om afvalwater te testen op de aanwezigheid van stoffen die de oestrogeenreceptor activeren, kan men gebruik maken van een **reportergenassay**. Hierbij worden cellen die de menselijke oestrogeenreceptor tot expressie brengen, geïncubeerd met verdunde afvalwatermonsters. Een fluorescerend eiwit als reporter, dat onder controle staat van een oestrogeen-responsief element, zal alleen worden geproduceerd als er oestrogene activiteit in het afvalwater aanwezig is. De mate van fluorescentie kwantificeert de oestrogene potentie van het monster. ### 4.6 Historische redenen achter specifieke bijwerkingen van hormoontherapie Historisch gezien zijn er gevallen geweest waarin hormoontherapie onbedoelde en schadelijke bijwerkingen veroorzaakte. Een bekend voorbeeld is het gebruik van **diëthylstilbestrol (DES)**. * **DES en cervixkanker:** DES is een synthetisch oestrogeen dat tussen 1940 en 1971 aan zwangere vrouwen werd voorgeschreven om miskramen te voorkomen. Hoewel DES in die tijd werd beschouwd als veilig, bleek later dat dochters van moeders die DES hadden gebruikt een significant verhoogd risico hadden op de ontwikkeling van zeldzame vormen van vaginaal en cervixkanker (clear cell adenocarcinoma) op latere leeftijd. Ook werden er andere reproductieve afwijkingen waargenomen. * **Moleculaire basis:** De precieze moleculaire mechanismen die leidden tot DES-gerelateerde kanker zijn complex. Men vermoedt dat DES of zijn metabolieten DNA konden beschadigen en epigenetische veranderingen konden induceren in de zich ontwikkelende voortplantingsorganen van de foetus. De lange latentietijd voor de ontwikkeling van kanker suggereert dat dit proces door verschillende factoren werd beïnvloed, mogelijk inclusief individuele genetische gevoeligheid. Het onderstreept het gevaar van het blootstellen van zich ontwikkelende organen aan hormonaal actieve stoffen. Deze historische gebeurtenissen hebben geleid tot een veel kritischere benadering van hormoontherapie en een grotere focus op het identificeren en vermijden van substanties met potentiële endocriene verstorende eigenschappen, zowel in medicijnen als in de omgeving. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Aspirine | Een veelgebruikt medicijn dat ontstekingsremmende, pijnstillende en koortsverlagende eigenschappen bezit. Langdurig gebruik kan de kans op bepaalde vormen van kanker, zoals darmkanker, verminderen door mogelijke moleculaire mechanismen die celgroei en -deling beïnvloeden. | | Darmkanker | Een kwaadaardige tumor die ontstaat in de dikke darm of het rectum. Moleculaire kenmerken zoals ongecontroleerde celproliferatie, genoominstabiliteit en het vermogen tot invasie en metastasering zijn kenmerkend voor deze ziekte. | | Chemotherapie | Een medische behandeling die medicijnen gebruikt om kankercellen te doden of hun groei te vertragen. De efficiëntie ervan kan variëren en is soms afhankelijk van factoren zoals de hormonale status van de patiënt, zoals de menstruatiecyclus bij borstkanker. | | Borstkanker | Een vorm van kanker die ontstaat in de cellen van de borst. De behandeling, waaronder chemotherapie, kan beïnvloed worden door hormonale factoren en de fase van de menstruatiecyclus van de patiënt. | | Menstruatiecyclus | De maandelijkse hormonale cyclus bij vrouwen die voorbereidt op mogelijke zwangerschap. Deze cyclus kan invloed hebben op de gevoeligheid van kankercellen voor therapieën zoals chemotherapie. | | Moleculaire basis | De onderliggende cellulaire en biochemische processen en componenten die een bepaald fenomeen, ziekte of mechanisme verklaren. Dit omvat genexpressie, eiwitinteracties en signaleringsroutes. | | In vitro | Een experimentele conditie die plaatsvindt buiten het levende organisme, bijvoorbeeld in een reageerbuis of kweekschaal. Dit maakt gecontroleerde studies van biologische processen mogelijk. | | Synergetisch effect | Een interactie tussen twee of meer medicijnen of behandelingen waarbij het gecombineerde effect groter is dan de som van de individuele effecten. Dit kan leiden tot verhoogde effectiviteit bij lagere doseringen. | | Senolyticum | Een type medicijn dat selectief senescente cellen (cellen die gestopt zijn met delen) elimineert. Dit kan bijdragen aan de behandeling van leeftijdsgebonden ziekten en kanker door het verwijderen van cellen die de groei van kankercellen kunnen bevorderen. | | Senescentie | Een cellulaire toestand waarin cellen permanent stoppen met delen, vaak als reactie op DNA-schade of andere stressfactoren. Senescente cellen kunnen ontstekingssignalen afgeven en bijdragen aan veroudering en ziekte. | | p16 | Een eiwit dat fungeert als tumorsuppressor en een rol speelt bij celcyclusregulatie. Verminderde expressie ervan kan geassocieerd zijn met het verlies van celcycluscontrole en de ontwikkeling van kanker. | | SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype) | Een complex mengsel van inflammatoire cytokines, chemokines, groeifactoren en proteasen dat wordt uitgescheiden door senescente cellen. SASP kan weefselherstel bevorderen, maar ook bijdragen aan ontstekingen, kankerprogressie en veroudering. | | DNA-schade | Structurele of chemische veranderingen in het DNA die de correcte informatieoverdracht kunnen belemmeren. Ophooping van DNA-schade kan leiden tot celveroudering, mutaties en kanker. | | Beta-galactosidase | Een enzym dat specifiek kan worden gebruikt als biomarker voor senescente cellen, omdat het actief is bij een pH van 6.0 en aanwezig is in cellen die verouderd zijn. | | E-cadherines | Transmembraaneiwitten die een cruciale rol spelen bij cel-celadhesie, met name in epitheliale weefsels. Ze helpen bij het handhaven van de weefselintegriteit en onderdrukken het ontstaan van metastasen door de vorming van tumoren te beperken. | | Metastasen | De verspreiding van kanker vanuit de primaire tumor naar andere delen van het lichaam via het bloed of de lymfevaten. Dit is een kenmerk van gevorderde kanker en de belangrijkste oorzaak van sterfte. | | Tumor supressorgen | Genen die de celgroei en -deling remmen. Wanneer deze genen gemuteerd of inactief zijn, kan dit leiden tot ongecontroleerde celgroei en de ontwikkeling van kanker. | | Catenines | Een familie van eiwitten die een belangrijke rol spelen bij cel-celadhesie, met name door te verbinden met cadherines en het cytoskelet. Ze zijn essentieel voor de stabiliteit van adherens-verbindingen en kunnen de migratie van kankercellen beïnvloeden. | | Organoïden | Kleine, zelforganiserende 3D-celculturen die structureel en functioneel vergelijkbaar zijn met organen. Ze worden gebruikt als modellen voor orgaanontwikkeling, ziekteonderzoek en geneesmiddelenonderzoek. | | Stamcel | Een ongedifferentieerde cel die het vermogen heeft om te prolifereren en zich te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) worden gecreëerd door volwassen cellen te herprogrammeren tot een stamcelachtige staat. | | iPSC (geïnduceerde pluripotente stamcel) | Een type stamcel dat wordt verkregen door volwassen somatische cellen (zoals huidcellen) te herprogrammeren met specifieke transcriptiefactoren, waardoor ze pluripotente eigenschappen verkrijgen en zich kunnen differentiëren tot elk celtype. | | Transcriptiefactoren | Proteïnen die zich binden aan specifieke DNA-sequenties en de transcriptie van genen reguleren, het proces waarbij DNA wordt omgezet in RNA. Zij spelen een sleutelrol bij de differentiatie en ontwikkeling van cellen. | | Progeria | Een zeldzame, genetische verouderingsziekte die wordt gekenmerkt door versnelde ouderdomsverschijnselen bij kinderen. Het wordt vaak veroorzaakt door mutaties in het gen dat codeert voor lamine A, wat leidt tot een instabiele celkern. | | Lamine isovorm | Verschillende vormen van het lamine-eiwit, die ontstaan door alternatieve splicing van het mRNA. Mutaties in specifieke lamine-isovormen kunnen leiden tot celkerndefecten en ziekten zoals Progeria. | | TAD (Topologically Associating Domain) | Functionele domeinen binnen het genoom die worden gekenmerkt door een hogere frequentie van interacties tussen DNA-sequenties binnen het domein dan daarbuiten. Ze spelen een rol in de organisatie van het genoom en genexpressie. | | LAD (Lamin-Associated Domain) | Regio's van het genoom die geassocieerd zijn met de binnenste kernmembraan, voornamelijk via interactie met laminen. Deze domeinen zijn vaak genarm en geassocieerd met geninactiviteit. | | Extracellulaire matrix (ECM) | Een complex netwerk van macromoleculen buiten de cellen dat structurele ondersteuning biedt, de celgroei en -differentiatie reguleert en betrokken is bij celcommunicatie. Het bestaat uit eiwitten zoals collageen en glycoproteïnen en glycosaminoglycanen. | | Celadhesie | Het proces waarbij cellen aan elkaar of aan de extracellulaire matrix binden. Dit is cruciaal voor de vorming van weefsels, orgaanontwikkeling en immuunrespons. | | Glycosaminoglycanen (GAGs) | Lange, onvertakte polysachariden die een belangrijk onderdeel vormen van de extracellulaire matrix. Ze zijn negatief geladen en trekken water aan, wat bijdraagt aan de hydratatie en veerkracht van weefsels. | | Hyaluronzuur | Een specifiek type glycosaminoglycaan dat zich onderscheidt door het ontbreken van sulfaatgroepen, het grote molecuulgewicht en de aanwezigheid in de extracellulaire matrix waar het bijdraagt aan hydratatie en smering. | | Collageen | Een groep structurele eiwitten die de belangrijkste bestanddelen van de extracellulaire matrix vormen en zorgen voor treksterkte en structuur in bindweefsel, botten, pezen en huid. Het is rijk aan aminozuren als glycine en proline. | | Glycoproteïnen | Eiwitten waaraan koolhydraatketens zijn gebonden. Ze spelen diverse rollen in de cel, waaronder celherkenning, adhesie en signaaltransductie, en zijn ook componenten van de extracellulaire matrix. | | Endocriene verstoorder | Chemische stoffen die de werking van het hormoonsysteem kunnen beïnvloeden, wat kan leiden tot gezondheidsproblemen. Ze kunnen de hormoonproductie, -transport, -afbraak of -werking op receptorniveau verstoren. | | Hormoonligand | Moleculen die zich binden aan hormoonreceptoren en zo een biologisch effect teweegbrengen. Hormoontherapieën maken vaak gebruik van synthetische hormoonliganden. | | Organoïde model | Een in-vitromodel dat is gebaseerd op organoïden en wordt gebruikt om de pathofysiologie van ziekten te bestuderen, de effectiviteit van medicijnen te testen en nieuwe therapeutische doelwitten te identificeren. | | Ziekte van Alzheimer | Een neurodegeneratieve ziekte die gekenmerkt wordt door progressief geheugenverlies en cognitieve achteruitgang. Het bestuderen ervan in organoïde modellen helpt bij het begrijpen van de mechanismen en het ontwikkelen van behandelingen. | | Therapeutische doelwitten | Specifieke moleculen (zoals eiwitten of genen) of cellulaire processen die beïnvloed kunnen worden met medicijnen om een ziekte te behandelen. | | Compound screening | Het systematisch testen van grote collecties van chemische verbindingen op hun potentie om een biologisch effect te produceren, vaak gebruikt in de geneesmiddelenontwikkeling. | | Exposome chemicals | Een breed scala aan chemische stoffen uit de omgeving waarmee mensen worden blootgesteld, inclusief industriële chemicaliën, pesticiden en vervuiling, die de gezondheid kunnen beïnvloeden. | | Angiogenese | Het proces van vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande vaten. Tumoren hebben angiogenese nodig om te groeien en te metastaseren. | | Ontregelende celdood | Abnormale processen van celdood, zoals necrose of ongecontroleerde apoptose, die kunnen bijdragen aan ziekteprocessen en weefselbeschadiging. | | Genoom instabiliteit | Een verhoogde neiging van het genoom om mutaties of chromosomale afwijkingen te ondergaan. Dit is een kenmerk van veel kankers en kan leiden tot verdere tumorprogressie. | | Raf V600E | Een specifieke mutatie in het BRAF-gen die vaak voorkomt in verschillende soorten kanker, waaronder melanoom. Deze mutatie leidt tot constitutieve activatie van het eiwit en kan tumoren resistent maken tegen specifieke therapieën. | | RAF-inhibitor | Een klasse van medicijnen die gericht zijn op het remmen van de activiteit van het BRAF-eiwit, dat betrokken is bij de celgroei en -deling. Deze medicijnen zijn effectief tegen tumoren met de BRAF V600E mutatie, maar resistentie kan optreden. | | RAS-inhibitor | Medicijnen die de activiteit van RAS-eiwitten remmen. RAS-eiwitten zijn betrokken bij celgroei en -signalering, en mutaties hierin zijn veelvoorkomend bij kanker. | | ERK-inhibitor | Medicijnen die gericht zijn op het remmen van ERK (extracellulair gereguleerde kinase), een eiwitkinase dat deel uitmaakt van de MAPK-signaalroute, die betrokken is bij celgroei, differentiatie en overleving. | | RTK-inhibitor (Receptor Tyrosine Kinase inhibitor) | Medicijnen die de activiteit van receptor tyrosine kinases remmen. Deze receptoren spelen een sleutelrol bij celgroei, differentiatie en overleving, en hun hyperactiviteit is vaak betrokken bij kanker. | | Eiwit | Een complex molecuul dat is opgebouwd uit aminozuren en essentieel is voor de structuur, functie en regulatie van lichaamscellen en -weefsels. | | DNA (Deoxyribonucleic acid) | De drager van genetische informatie in levende organismen. Het is een dubbele helixstructuur die de instructies bevat voor de ontwikkeling, het functioneren, de groei en de voortplanting. | | RNA (Ribonucleic acid) | Een nucleïnezuur dat lijkt op DNA en een rol speelt bij de expressie van genen en de synthese van eiwitten. Het kan ook genetisch materiaal zijn in sommige virussen. | | Golgi-apparaat | Een celorganel dat betrokken is bij het modificeren, sorteren en verpakken van eiwitten en lipiden voor secretie of levering aan andere organellen. | | Covalente binding | Een chemische binding waarbij atomen elektronen delen. Dit is een sterke binding die moleculen bij elkaar houdt. | | Glycine | Het eenvoudigste aminozuur, gekenmerkt door een waterstofatoom als zijn zijketen. Het is een veelvoorkomend aminozuur in collageen. | | Proline | Een cyclisch aminozuur dat een belangrijke rol speelt in de structuur van collageen, waar het bijdraagt aan de stabiliteit van de helixvorm. | | Lysine | Een essentieel aminozuur dat een positief geladen zijketen heeft. Het is betrokken bij diverse cellulaire processen, waaronder eiwitsynthese en DNA-binding. | | Arginine | Een semi-essentieel aminozuur met een positief geladen guanidinogroep zijketen. Het speelt een rol bij celgroei, immuunfunctie en wondgenezing. | | Alanine | Een simpel aminozuur met een methylgroep als zijketen. Het is een bouwsteen van veel eiwitten. | | Valine | Een essentieel vertakt-keten aminozuur. Het is belangrijk voor spiergroei en -herstel. | | Serine | Een polair aminozuur met een hydroxylgroep in zijn zijketen. Het is betrokken bij eiwitstructuur en enzymatische reacties. | | Threonine | Een essentieel aminozuur met een hydroxylgroep in zijn zijketen. Het is belangrijk voor eiwitstructuur, immuunfunctie en vetmetabolisme. | | Tyrosine | Een niet-essentieel aminozuur met een fenolische hydroxylgroep. Het is een voorloper van neurotransmitters en hormonen. |

# Virusfamilies en hun kenmerken Dit onderwerp behandelt de classificatie, morfologie, genetische samenstelling en gevoeligheid voor inactivatie van belangrijke virusfamilies zoals Herpesviridae en Orthomyxoviridae. ## 1. Herpesviridae De Herpesviridae-familie bestaat uit dubbelstrengs DNA-virussen met een lineair genoom van 120-220 kilobaseparen. Ze hebben een kubische symmetrie, een diameter van 120-200 nm en zijn omhuld door een envelop. ### 1.1 Subfamilies en hun kenmerken De familie is onderverdeeld in drie subfamilies: #### 1.1.1 Alfaherpesvirinae * **Vermeerderingscyclus:** Korte cyclus (< 24 uur). * **Infectie:** Veroorzaken voornamelijk latente infecties. * **Celculturen:** Verspreiden zich snel en veroorzaken een uitgesproken cytopathogeen effect (CPE). * **Belangrijke leden:** * **Humaan herpesvirus (HHV) 1 & 2:** * HHV-1 (oraal type): Koortsuitslag, oogaandoeningen, encephalitis. * HHV-2 (genitaal type): Letsels aan slijmvliezen van geslachtsdelen; kan gegeneraliseerde infectie en sterfte veroorzaken bij pasgeborenen; soms geassocieerd met cervixcarcinoom. * **HHV-3 (Varicella Zoster):** Waterpokken bij kinderen, gordelroos (zona) bij volwassenen. * **Herpesvirus van de aap (B-virus):** Oraal letsel bij apen, maar fatale encephalitis bij mensen na een beet. * **Herpesvirus van het varken (SHV-1, Ziekte van Aujeszky):** CZS-stoornissen, ademhalingsstoornissen, abortus, mummificatie. Pathogeen voor rund, kat, hond, nerts en andere diersoorten, veroorzaakt vaak fatale encephalitis. * **Bovien herpesvirus (BHV):** * BHV-1 (IBR-IPV): Infectieuze bovine rhinotracheïtis, infectieuze pustuleuze vulvovaginitis. Veroorzaakt ademhalingsstoornissen, conjunctivitis, abortus, CZS-stoornissen en diarree bij runderen. * BHV-2 (Bovien mammilitis): Ulceraties van de tepels. * **Equine herpesvirus (EHV):** * EHV-1: Abortus, ademhalingsstoornissen, soms zenuwstoornissen bij paarden. * EHV-3: Pustuleuze letsels van de slijmvliezen van de geslachtswegen. * EHV-4: Rhinopneumonie (ademhalingsstoornissen), antigenisch verwant aan EHV-1. * **Felinus herpesvirus-1 (FHV-1):** Niesziekte bij katten. * **Canid herpesvirus (CHV):** Gegeneraliseerde ziekte en sterfte bij jonge honden (<14 dagen), letsels aan de geslachtswegen bij oudere dieren. * **Gallid herpesvirus 2 (Merek-virus):** Kwaadaardige tumoren bij kippen. * **Herpesvirus duif:** Rhinitis, conjunctivitis en gegeneraliseerde ziektebeelden. #### 1.1.2 Bètaherpesvirinae * **Kenmerken:** Cytomegalovirussen met een langzame vermeerderingscyclus (> 24 uur) en een langzaam voortschrijdende infectie in celculturen. * **Infectie:** Veroorzaken latente infecties (in klierweefsel, nieren). * **Diersoort specifiek:** Zeer diersoortspecifiek. * **Belangrijke leden:** * **HHV-5 (Cytomegalovirus bij de mens, HCMV):** Subklinische infecties bij volwassenen; kan koorts en hepatitis veroorzaken na bloedtransfusies of immunosuppressie; kan congenitale misvormingen veroorzaken bij transplacentaire infectie. * **HHV-6:** Veroorzaakt drie-dagenkoorts bij kinderen (< 2 jaar). * **Suid herpesvirus 2 (Cytomegalovirus bij het varken):** Rhinitis bij biggen en transplacentaire infecties bij zeugen. #### 1.1.3 Gammaherpesvirinae * **Infectie:** Veroorzaken lymfoproliferatieve infecties, specifiek voor T- en B-lymfocyten. Sommige veroorzaken tumoren bij de natuurlijke gastheer. * **Latentie:** Blijven latent aanwezig in T- of B-lymfocyten. * **Belangrijke leden:** * **Epstein-Barr virus (EBV of HHV-4):** Veroorzaakt lymfomen in Afrika (in combinatie met malaria); infectieuze mononucleose ("kissing disease"). * **HHV-8 (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus):** Kan tumoren veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten. * **Ovine herpesvirus 1:** Trage, progressieve ademhalingsstoornissen bij schapen. * **Boosaardig katharalkoorts (Alcelaphine herpesvirus 2 / Ovine herpesvirus 2):** Natuurlijke gastheren zijn gnoes of schapen; kan gegeneraliseerde infectie veroorzaken bij runderen (diarree, ademhalingsstoornissen). ### 1.2 Algemene Kenmerken Herpesviridae * **Overleving:** Vocht en koude verhogen de overlevingskansen. Relatief makkelijk geïnactiveerd door externe factoren en overleven slecht buiten de gastheer. * **Latentie:** Na primaire infectie blijft het virus levenslang in de cel aanwezig als genoom. Onder bepaalde omstandigheden kan het reactiveren, leidend tot virusproductie en uitscheiding. * **Transplacentaire infecties:** Kunnen abortus veroorzaken. * **Ernst:** Vooral ernstig bij jonge dieren of immunosuppressieve individuen. * **Opbouw:** dsDNA, lineair, 120-220 kbp, kubische symmetrie, 120-200 nm, envelop. * **Tegument:** Een extra eiwitlaag tussen kapsied en envelop die extra stabiliteit verleent. * **Vermeerderingscyclus:** Virus wordt opgenomen via receptor-gemedieerde endocytose. Na protonenopname in het endosoom ondergaat de envelop een conformatieverandering, wat leidt tot fusie en vrijstelling van het nucleokapsied in het cytoplasma. Vermeerdering en vorming van nucleokapsied vindt plaats in de kern. Het kapsied wordt omgeven door een envelop die wordt verkregen aan de binnenste kernmembraan, daarna migreert naar het Golgi-apparaat voor finale envelopvorming. Vrijstelling gebeurt via endocytose-vesikels. ## 2. Orthomyxoviridae De Orthomyxoviridae-familie bestaat uit enkelstrengs RNA-virussen met een negatieve polariteit (ssRNA(-)). Hun genoom is gesegmenteerd (6-8 segmenten). Ze hebben een schroefvormige symmetrie, een diameter van 80-120 nm en zijn omhuld door een envelop. ### 2.1 Belangrijke kenmerken * **Hemagglutinerende eigenschappen:** Alle leden bezitten deze eigenschap. * **Vermeerdering:** Vinden plaats in zowel de celkern als het cytoplasma. * **Gevoeligheid aan inactivatie:** Door de envelop zijn ze gevoelig voor tensioactieve stoffen. ### 2.2 Genera #### 2.2.1 Influenzavirus A * **Gastheerspecificiteit:** Zeer gastheerspecifiek. * **Antigene variatie:** Ondergaan gemakkelijke antigene variatie in hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA), belangrijke antigenen voor immuniteit. * **Antigene Shift:** Grote veranderingen in HA en/of NA door overdracht vanuit dierlijk reservoir of genetische reassortering wanneer 2 totaal verschillende influenzavirussen dezelfde cel infecteren. Dit kan leiden tot nieuwe subtypes. * **Antigene Drift:** Kleine, geleidelijke veranderingen. * **Reservoir:** Eenden en wilde watervogels zijn het belangrijkste natuurlijke reservoir (16 HA en 9 NA subtypes). * **Gastheers:** Mens, paard, varken, nerts, zeezoogdieren, gevogelte, wilde watervogels. * **Pathogeniciteit:** * **Wilde watervogels:** Meestal subklinische infecties. * **Kippen en kalkoenen:** Kunnen hoog-pathogene stammen (bv. H5, H7) hebben die gegeneraliseerde infectie met hoge sterfte veroorzaken; laag-pathogene stammen infecteren voornamelijk het ademhalingsstelsel. * **Transmissie:** Zelden onderhoudend in andere diersoorten dan het natuurlijke reservoir. #### 2.2.2 Influenzavirus B * **Gastheer:** Alleen bij de mens. * **Antigenen:** Slechts één subtype. * **Antigene variatie:** Geen antigene shift, veel minder drift dan type A. * **Ziektebeeld:** Minder ernstig dan type A, maar epidemieën komen vaak voor en worden opgenomen in vaccins. * **Latentie:** Blijft latent in kliercellen. #### 2.2.3 Influenzavirus C * **Gastheer:** Bijna alleen bij de mens, occasioneel bij varkens. * **Oppervlakte-eiwit:** Hemagglutinine-esterase (HE). * **Antigenen:** Antigenisch zeer stabiel. * **Ziektebeeld:** Milde luchtweginfecties (niet in vaccin). ### 2.3 Vergelijking Herpesviridae en Orthomyxoviridae | Kenmerk | Herpesviridae | Orthomyxoviridae | | :------------------- | :--------------------------------- | :------------------------------------------------ | | **Genetische samenstelling** | dsDNA, lineair, 120-220 kbp | ssRNA(-), gesegmenteerd (6-8), 80-120 nm | | **Morfologie** | Kubisch symmetrisch, envelop | Schroefvormig, envelop | | **Vermeerderingscyclus** | Kern en cytoplasma | Kern en cytoplasma | | **Gevoeligheid aan inactivatie** | Gevoelig voor tensioactieve stoffen | Gevoelig voor tensioactieve stoffen | ### 2.4 Vermeerderingscyclus Orthomyxoviridae * **Opname:** Via endocytose, gevolgd door fusie van het endosoom- en virusmembraan. * **Vrijkomen viraal RNA:** Viraal RNA wordt vrijgesteld in het cytoplasma. * **Vermeerdering:** In de celkern (transcriptie van viraal mRNA en replicatie van gensegmenten) en in het cytoplasma (synthese van virale eiwitten). * **Vrijstelling:** Via budding aan de plasmamembraan, waarbij het virus een envelop verkrijgt. ## 3. Virale Eiwitten en hun Functies Virale eiwitten worden onderverdeeld in structurele en niet-structurele eiwitten, met diverse functies essentieel voor het virus. ### 3.1 Structurele Eiwitten Dit zijn eiwitten die deel uitmaken van het virion (virusdeeltje). #### 3.1.1 Soorten structurele eiwitten en hun functies * **Kapsiedeiwitten:** Vormen de beschermende laag rond het genetisch materiaal. Ze zorgen voor de symmetrie van het viruspartikel en beschermen het genetisch materiaal tegen afbraak en inactivatie buiten de cel. * **Glycoproteïnen:** Geglycosyleerde eiwitten aan de oppervlakte van omhulde virussen. Ze hebben een hoge affiniteit voor receptoren op de celoppervlakte, bepalen het tropisme (welke cellen het virus kan infecteren) en induceren vaak neutraliserende antistoffen. * **Matrixeiwitten:** Een extra eiwitlaag onder de envelop (bv. bij Ortho- en Paramyxoviridae) die extra stabiliteit verleent aan het viruspartikel. * **Enzymen:** Sommige virussen bevatten virale enzymen die essentieel zijn voor de replicatie en direct na infectie nodig zijn, zoals een RNA-afhankelijk RNA-polymerase (bij RNA-virussen) of reverse transcriptase (bij retrovirussen). Deze zijn vaak ingebouwd in het virion. #### 3.1.2 Algemene Functies Structurele Eiwitten * **Bescherming van het nucleïnezuur:** Cruciaal voor het behoud van infectiviteit. * **Celbinding en -penetratie:** Bepalen het tropisme en de specificiteit van de virusinfectie. * **Immunogeniciteit:** Vormen de belangrijkste antigenen van het virus en stimuleren de immuunrespons, leidend tot de productie van antistoffen die bescherming bieden. #### 3.1.3 Voorbeeld: Influenza A Virus * **Envelop:** Bevat twee belangrijke glycoproteïnen: * **Hemagglutinine (HA):** Staafvormig trimeer. Cruciaal voor binding aan de cellulaire receptor en penetratie. Induceert beschermende neutraliserende antistoffen. * **Neuraminidase (NA):** Paddenstoelvormig tetrameer. Belangrijk voor het verbreken van de binding tussen HA en receptor, faciliteert vrijlating van nieuwe virusdeeltjes. * **Matrixeiwitten:** * **M1:** Vormt een laag onder de envelop en zorgt voor stabiliteit. * **M2:** Een minder talrijk membraangeassocieerd eiwit met een ionkanaalfunctie, essentieel voor de ontmanteling van het virus na endocytose (in griep A). * **Genoom:** 8 RNA-segmenten, elk geassocieerd met een nucleoproteïne (NP). * **Polymerasen:** 3 virale polymerasen (PA, PB1, PB2) zijn essentieel voor RNA-replicatie en transcriptie en maken deel uit van het virion. ### 3.2 Niet-Structurele Eiwitten Dit zijn eiwitten die tijdens de virusreplicatie in de cel worden gevormd, maar niet worden ingebouwd in het nieuwe virion. Ze zijn vaak betrokken bij de regulatie van de virusreplicatie of het ontwijken van de immuunrespons. #### 3.2.1 Voorbeeld: Influenza A Virus * **NS1 (niet-structureel):** Komt alleen in geïnfecteerde cellen voor. Onderrukt de antivirale respons van de gastheercel. * **NS2 (ook wel NEP genoemd):** Hoewel soms als structureel eiwit genoemd omdat het in het virion aanwezig is, is zijn primaire rol tijdens de replicatiecyclus (export van ribonucleoproteïnecomplexen uit de kern). ### 3.3 Overige Functies * **Immunostimulatie:** Virale eiwitten stimuleren de vorming van antistoffen, zowel tegen externe (structurele) als interne (niet-structurele) eiwitten. Interne eiwitten worden vrijgesteld na virusvermeerdering en kunnen ook het immuunsysteem stimuleren. ## 4. Gevoeligheid aan Inactivatie Beide families, Herpesviridae en Orthomyxoviridae, hebben een envelop. Virussen met een envelop zijn over het algemeen gevoeliger voor inactivatie door factoren zoals tensioactieve stoffen, uitdroging en warmte, vergeleken met naakte virussen. --- **Tip:** Bij het bestuderen van virusfamilies, focus op de consistenties en verschillen in hun genetisch materiaal (DNA vs. RNA, enkel- vs. dubbelstrengs, gesegmenteerd vs. niet-gesegmenteerd), morfologie (kubisch, schroefvormig, complex, envelop ja/nee), replicatieplaats (kern vs. cytoplasma) en hun overleving in de omgeving. Dit helpt bij het begrijpen van hun transmissiewijzen en ziektebeelden. --- # Virale eiwitten en hun functies Virale eiwitten spelen een cruciale rol in de structuur van het virusdeeltje en zijn essentieel voor de levenscyclus van het virus, inclusief de replicatie en interactie met de gastheercel. ## 2. Virale eiwitten en hun functies Virale eiwitten kunnen worden onderverdeeld in structurele en niet-structurele eiwitten, elk met specifieke functies. ### 2.1 Structurele eiwitten Structurele eiwitten bevinden zich binnen het virusdeeltje en zijn verantwoordelijk voor de opbouw ervan. Ze worden verder onderverdeeld in: * **Kapsiedeiwitten:** Deze eiwitten vormen de beschermende laag rond het virale genetisch materiaal (nucleïnezuur). Ze bestaan vaak uit meerdere identieke polypeptideketens die zich repetitief rangschikken om de symmetrie van het viruspartikel te vormen. Ze beschermen het nucleïnezuur tegen afbraak in de omgeving en kunnen specifiek binden aan receptoren op de gastheercel, wat bepaalt welke cellen geïnfecteerd kunnen worden (tropisme). * **Glycoproteïnen:** Dit zijn geglycosyleerde eiwitten die typisch aan de buitenkant van virussen met een envelop voorkomen, vaak in de vorm van dimeren of trimeren. Ze spelen een sleutelrol bij de binding aan gastheercellen en het binnendringen van het virus. * **Matrix eiwitten:** Deze eiwitlaag bevindt zich onder de envelop en geeft het virusdeeltje extra stabiliteit. Ze komen voor bij verschillende virusfamilies, zoals ortho- en paramyxovirussen. * **Eiwitten/enzymen die betrokken zijn bij virusvermeerdering:** Sommige enzymen die essentieel zijn voor de replicatie van het virale genoom, zoals reverse transcriptase bij retrovirussen of RNA-polymerasen, zijn al onderdeel van het virusdeeltje (virion). ### 2.2 Niet-structurele eiwitten Niet-structurele eiwitten worden aangemaakt tijdens de virusreplicatie in de gastheercel, maar worden niet opgenomen in het nieuwe virusdeeltje. Hun functie is voornamelijk gericht op het manipuleren van de gastheercel en het ontwijken van de immuunrespons. #### 2.2.1 Functies van virale eiwitten * **Bescherming van het nucleïnezuur:** Kapsiedeiwitten beschermen het virale DNA of RNA tegen fysieke en chemische schade, wat essentieel is voor het behoud van de infectiviteit buiten de gastheercel. * **Binding aan gastheercellen (Tropisme):** Oppervlakkige viruseiwitten, met name glycoproteïnen en kapsiedeiwitten, herkennen en binden aan specifieke receptoren op de celmembraan van de gastheercel. Dit bepaalt welk type cel of organisme geïnfecteerd kan worden (diersoortspecificiteit en celspecificiteit). * **Stimuleren van immuunrespons:** Virale eiwitten vormen de antigenen van het virus en stimuleren de aanmaak van antistoffen door het immuunsysteem. Sommige neutraliserende antistoffen beschermen de gastheer tegen herinfectie. Zowel externe als interne virale eiwitten kunnen na de replicatie in de cel vrijkomen en het immuunsysteem stimuleren. * **Enzymatische activiteit:** Sommige virussen brengen eigen enzymen mee die nodig zijn voor de replicatie van hun genetisch materiaal in de gastheercel, zoals RNA-polymerasen bij RNA-virussen. * **Modulatie van de gastheercel en immuunrespons:** Niet-structurele eiwitten kunnen de celcyclus van de gastheercel manipuleren, cellulaire processen overnemen voor virale replicatie, of de immuunrespons van de gastheer onderdrukken. Een voorbeeld hiervan is het NS1-eiwit van influenza A, dat de antivirale respons van de gastheer onderdrukt. #### 2.2.2 Voorbeeld: Influenza A virus Het influenza A virus illustreert de functies van verschillende virale eiwitten: * **Hemagglutinine (HA):** Een staafvormig trimeer glycoproteïne aan het virusoppervlak. Het is cruciaal voor de binding aan sialzuur (neuraminezuur) op de celmembraan van de gastheercel en speelt een rol bij het binnendringen van het virus in de cel. Het HA-eiwit is een belangrijk doelwit voor neutraliserende antistoffen. * **Neuraminidase (NA):** Een paddenstoelvormig tetrameer glycoproteïne aan het virusoppervlak. Het breekt de binding tussen het HA-eiwit en sialzuur op het celoppervlak, wat essentieel is voor de vrijgave van nieuwe virusdeeltjes uit de geïnfecteerde cel en hun verspreiding. Het NA-eiwit is ook een antigeen, maar de antistoffen hiertegen zijn minder sterk beschermend dan die tegen HA. * **Matrix-eiwit M1:** Een binnenste eiwitlaag onder de envelop die structuur en stabiliteit aan het virus geeft. Het is betrokken bij de assemblage van het virus. * **Matrix-eiwit M2:** Een klein membraangeassocieerd eiwit met een ionenkanaalfunctie. Het vormt een protonenkanaal in het endosoom, wat bijdraagt aan de pH-daling die nodig is voor de conformatieverandering van HA en de vrijgave van het virale genoom in het cytoplasma. * **Nucleoproteïne (NP):** Een eiwit dat zich bindt aan het virale RNA en samen met het RNA de ribonucleoproteïnecomplexen (RNPs) vormt. Deze RNPs zijn essentieel voor de replicatie en transcriptie van het virale genoom. * **Polymerasen (PA, PB1, PB2):** Deze drie eiwitten vormen samen het virale RNA-afhankelijke RNA polymerase complex, dat verantwoordelijk is voor de replicatie en transcriptie van de acht RNA-segmenten van het influenza A genoom. Ze zijn structurele componenten van de RNPs. * **Niet-structureel eiwit NS1:** Dit eiwit komt alleen voor in geïnfecteerde cellen en onderdrukt de antivirale respons van de gastheercel, wat het virus helpt de immuunrespons te ontwijken. * **Niet-structureel eiwit NS2 (of NEP):** Hoewel soms ingedeeld als niet-structureel, maakt dit eiwit deel uit van het virion en is het verantwoordelijk voor de export van de ribonucleoproteïnecomplexen uit de celkern naar het cytoplasma. --- # Genetische veranderingen en resistentie bij virussen Dit hoofdstuk behandelt de genetische veranderingen die virussen ondergaan tijdens hun vermeerdering en hun resistentie tegen omgevingsfactoren. ## 3 Genetische veranderingen en resistentie bij virussen ### 3.1 Inleiding tot genetische veranderingen bij virussen Virussen ondergaan tijdens hun replicatie voortdurend genetische veranderingen. Deze veranderingen zijn cruciaal voor hun evolutie, aanpassing aan nieuwe gastheren en het omzeilen van immuunresponsen. De belangrijkste mechanismen die leiden tot genetische variatie zijn mutaties, recombinaties en reassortment. Deze processen resulteren in een toenemende genetische diversiteit binnen viruspopulaties, wat de ontwikkeling van nieuwe virusstammen met potentieel veranderde eigenschappen kan veroorzaken. ### 3.2 Mutaties Mutaties zijn spontane veranderingen in het virale genoom die optreden tijdens de replicatie van het virus. Aangezien virussen met een hoog tempo van vermeerdering grote aantallen nakomelingen produceren uit één infectieus partikel, is er een statistisch significante kans op fouten bij het kopiëren van het virale genoom. * **Impact van mutaties:** * **Lethale mutaties:** De meeste mutaties zijn letaal, wat betekent dat ze leiden tot een verlies van essentiële genetische informatie die nodig is voor virusreplicatie en infectiviteit. * **Niet-letale mutaties:** Niet-letale mutaties kunnen leiden tot fenotypische veranderingen. Het overleven en de verspreiding van virussen met dergelijke mutaties zijn afhankelijk van of de fenotypische veranderingen nadelig, neutraal of voordelig zijn voor het virus. * **Frequentie:** RNA-virussen hebben over het algemeen een hogere mutatiefrequentie dan DNA-virussen. Dit komt doordat RNA-polymerasen vaak geen proofreading mechanisme hebben, wat leidt tot een hogere foutenlast tijdens de replicatie. DNA-polymerasen daarentegen hebben wel proofreading, wat de genetische stabiliteit van DNA-virussen verhoogt. ### 3.3 Recombinatie Recombinatie is het proces waarbij genetisch materiaal wordt uitgewisseld tussen twee verschillende, maar meestal verwante virussen die dezelfde cel infecteren. * **Mechanisme:** * Bij virussen met een genoom bestaande uit een enkele molecule dsDNA of RNA kan recombinatie optreden na een breuk in een nucleïnezuurstreng, gevolgd door een recombinatie met een nieuw stuk nucleïnezuur (intramoleculaire recombinatie). * Een nieuw recombinant virus ontstaat wanneer het genetisch materiaal dat in het kapsied terechtkomt een volledig genoom vormt en de genoomdelen van de twee oudervirussen elkaar aanvullen tot een volledig genoom. ### 3.4 Reassortment Reassortment treedt op bij RNA-virussen met een gesegmenteerd genoom, wat resulteert in de herschikking van genoomfragmenten. Dit mechanisme is met name van belang bij influenzavirussen en is de basis voor antigene shift. * **Mechanisme:** * Wanneer twee influenzavirussen, elk met hun eigen set genoomsegmenten, dezelfde cel infecteren, kunnen segmenten tussen de virussen worden uitgewisseld. * Dit leidt tot de creatie van nieuwe combinaties van genoomsegmenten. * **Impact:** * Bepaalde van deze reassortanten kunnen gewijzigde hemagglutinine (HA) en/of neuraminidase (NA) genen bevatten vergeleken met het oorspronkelijk circulerende virus. * Tegen dergelijke reassortanten is bestaande populatie-immuniteit vaak niet werkzaam, wat kan leiden tot pandemieën. Bij influenzavirussen zijn er 8 genoomsegmenten. Bij een co-infectie met twee totaal verschillende influenzavirussen zijn er dus 28 mogelijke nieuwe combinaties. * **Voorbeeld:** Het H1N1 virus dat in 2009 een pandemie veroorzaakte, was een reassortant ontstaan uit influenzavirussen van varkens en vogels, met nieuwe HA- en NA-genen. ### 3.5 Genetische stabiliteit en variatie bij virusfamilies Verschillende virusfamilies vertonen variërende mate van genetische stabiliteit en gevoeligheid voor veranderingen. * **Herpesviridae:** * **Genoom:** dsDNA, lineair, 120-220 kbp. * **Variatie:** Hoewel ze een DNA-genoom hebben, wat doorgaans stabieler is, kunnen ook herpesvirussen mutaties en recombinaties ondergaan, zij het in mindere mate dan RNA-virussen. Latente infecties bieden ook mogelijkheden voor virusreactivatie en bijbehorende genetische veranderingen. * **Orthomyxoviridae (Influenzavirussen):** * **Genoom:** ssRNA (-), gesegmenteerd (6-8 segmenten). * **Variatie:** Deze familie staat bekend om zijn "genetische labiliteit". Reassortment van hun gesegmenteerde genoom leidt tot antigene shift, terwijl puntmutaties in de segmenten leiden tot antigene drift. Deze mechanismen maken influenzavirussen zeer adaptief en verantwoordelijk voor frequente epidemieën en pandemieën. ### 3.6 Resistentie tegenover omgevingsfactoren en inactiverende stoffen Virussen variëren in hun gevoeligheid voor omgevingsfactoren en chemische of fysische inactiveringsmethoden. De aanwezigheid van een envelop speelt hierin een belangrijke rol. * **Virussen met envelop:** * **Gevoeligheid:** Over het algemeen zijn virussen met een lipide envelop gevoeliger voor inactivering door omgevingsfactoren zoals uitdroging, hitte, detergenten en alcohol. De envelop kan gemakkelijk worden beschadigd, wat de infectiviteit van het virus tenietdoet. * **Voorbeelden:** Herpesvirussen, Orthomyxoviridae, Retroviridae. * **Naakte virussen (zonder envelop):** * **Resistentie:** Deze virussen zijn over het algemeen resistenter tegen omgevingsfactoren. Ze missen de kwetsbare lipide envelop en hun nucleïnezuur wordt beschermd door het stabiele kapsied. * **Voorbeelden:** Papovaviridae (Papillomavirussen, Polyomavirussen), Picornaviridae (Poliovirus, Rhinovirus), Adenoviridae, Reoviridae (Rotavirus), Parvoviridae. * **Factoren die de resistentie beïnvloeden:** * **Temperatuur:** Veel virussen worden geïnactiveerd door hitte, maar sommigen, zoals Parvovirussen en Hepatitis A, zijn opmerkelijk hittebestendig. Lage temperaturen, zoals -40°C of lager, kunnen de infectiviteit van virussen juist jarenlang behouden. * **pH:** Sommige virussen, zoals Enterovirussen, zijn zuurstabiel, terwijl Rhinovirussen zuurgevoelig zijn. * **Detergenten:** Detergenten breken de lipide envelop van omhulde virussen af, maar hebben weinig effect op naakte virussen. * **UV-straling:** UV-straling kan het virale nucleïnezuur beschadigen, wat leidt tot inactivatie. * **Droogte:** Naakte virussen zijn vaak goed bestand tegen uitdroging, terwijl omhulde virussen hier gevoeliger voor zijn. ### 3.7 Vergelijking van families: Herpesviridae vs. Orthomyxoviridae | Kenmerk | Herpesviridae | Orthomyxoviridae | | :---------------------- | :----------------------------------------------- | :---------------------------------------------------- | | **Genoomtype** | dsDNA, lineair | ssRNA (-), gesegmenteerd (6-8 segmenten) | | **Symmetrie** | Kubisch (icosaëdrisch) | Schroefvormig | | **Envelop** | Ja | Ja | | **Grootte** | 120-200 nm | 80-120 nm | | **Replicatieplaats** | Kern | Kern (transcriptie/replicatie), Cytoplasma (assemblage) | | **Genetische Variatie** | Lager (DNA-genoom, maar recombinatie mogelijk) | Hoog (RNA-genoom, reassortment, mutaties) | | **Resistentie** | Gevoelig voor detergenten; overleven in vocht/kou | Gevoelig voor detergenten; redelijk stabiel | ### 3.8 Virusvermeerdering: gevolgen en verschillen Virusvermeerdering vindt altijd intracellulair plaats, wat significante gevolgen heeft voor zowel het virus als de behandeling van virale ziekten. * **Gevolgen voor het virus:** * Afhankelijkheid van gastheercellen voor replicatie-enzymen en metabolische processen. * Kwetsbaarheid voor antivirale middelen die cellulaire processen beïnvloeden. * **Gevolgen voor behandeling:** * Virale infecties zijn moeilijk te behandelen omdat antivirale middelen selectief moeten zijn om virale replicatie te remmen zonder de gastheercellen ernstig te beschadigen. * Veel antivirale middelen richten zich op specifieke virale enzymen (bv. reverse transcriptase, protease) of nucleïnezuursynthese. * **Verschillen tussen RNA- en DNA-virussen in vermeerderingscyclus:** * **Nucleïnezuursynthese:** DNA-virussen repliceren hun DNA meestal in de kern met behulp van cellulaire DNA-polymerasen (met enkele uitzonderingen zoals Poxviridae die in het cytoplasma repliceren en virale DNA-polymerasen gebruiken). RNA-virussen repliceren hun RNA meestal in het cytoplasma met behulp van virale RNA-afhankelijke RNA-polymerasen (met enkele uitzonderingen zoals Orthomyxovirussen die transcriptie en RNA-synthese in de kern doen, en Retrovirussen die via een DNA-intermediair in de kern integreren en transcriberen). * **Eiwitsynthese:** Beide typen virussen gebruiken cellulaire ribosomen in het cytoplasma voor de synthese van hun eiwitten. * **Genoomgrootte en eiwitaantal:** DNA-virussen, met name grote, kunnen meer virale eiwitten coderen dan de meeste RNA-virussen. * **Mutaties:** RNA-virussen ondergaan snellere mutaties door het gebrek aan proofreading in hun RNA-polymerasen. ### 3.9 Virale eiwitten: structureel en niet-structureel Virale eiwitten hebben diverse functies, zowel structureel (onderdeel van het virion) als niet-structureel (gesynthetiseerd tijdens replicatie maar niet ingebouwd in het virion). * **Structurele eiwitten:** * **Kapsiedeiwitten:** Vormen de symmetrische structuur rond het nucleïnezuur, beschermen het genoom en spelen een rol bij de binding aan celreceptoren. * **Glycoproteïnen:** Bevinden zich op het oppervlak van omhulde virussen, spelen een rol bij virus-cel interactie (adsorptie, penetratie) en zijn vaak belangrijke antigenen. * **Matrixeiwitten:** Een laag onder de envelop die stabiliteit verleent aan het virion. * **Enzymen:** Sommige virussen bevatten virale enzymen in het virion die essentieel zijn voor de eerste stappen van replicatie (bv. reverse transcriptase in retrovirussen, polymerasen in influenzavirussen). * **Niet-structurele eiwitten:** * Worden tijdens de virusreplicatie in de cel geproduceerd. * Hebben functies zoals het reguleren van de replicatiecyclus, het onderdrukken van de cellulaire respons, of het omzetten van viraal materiaal (bv. NS1 eiwit in Influenza dat de antivirale respons onderdrukt). ### 3.10 Genetische veranderingen en resistentie in de praktijk De genetische veranderingen en de inherente resistentie van virussen hebben directe implicaties voor de volksgezondheid en diergeneeskunde, met name in de ontwikkeling van vaccins en antivirale therapieën. * **Vaccinontwikkeling:** De genetische instabiliteit van sommige virussen (bv. Influenza) vereist frequente aanpassing van vaccins. Technieken als reassortment worden gebruikt om vaccins te produceren. * **Antivirale therapie:** De hoge mutatiefrequentie van RNA-virussen kan snel leiden tot resistentie tegen antivirale middelen. Dit vereist voortdurend onderzoek naar nieuwe geneesmiddelen en combinatietherapieën. --- **Tip:** Bestudeer de Baltimore-classificatie van virussen (gebaseerd op het genoomtype en de vermenigvuldigingsstrategie) om de genetische veranderingen en replicatiemechanismen beter te begrijpen. De verschillen tussen DNA- en RNA-virussen zijn fundamenteel voor hun gedrag en genetische evolutie. --- # Diagnostiek, behandeling en preventie van virale infecties Hier is een gedetailleerde en uitgebreide samenvatting voor het onderwerp "Diagnostiek, behandeling en preventie van virale infecties", gebaseerd op de verstrekte documentinhoud, met nadruk op de gevraagde pagina's. ## 4. Diagnostiek, behandeling en preventie van virale infecties Dit onderwerp verkent de fundamentele aspecten van het detecteren, bestrijden en voorkomen van virale infecties, met aandacht voor diagnostische methoden, de werking van antivirale middelen, de ontwikkeling van vaccins en de rol van het immuunsysteem. ### 4.1 Virus classificatie en morfologie Virussen worden geclassificeerd op basis van verschillende criteria: * **Viraal nucleïnezuur:** DNA of RNA, enkel- of dubbelstrengs, lineair of circulair, en of het genoom gesegmenteerd is. * **Virion zelf:** Grootte, symmetrie van het kapsied (kubisch, schroefvormig, complex), en de aanwezigheid van een envelop. * **Bijkomende criteria:** Plaats van vermeerdering (celkern of cytoplasma), cytopathisch effect in celculturen, antigene en genetische verwantschap. #### 4.1.1 Belangrijke virusfamilies en leden Enkele belangrijke virusfamilies met hun kenmerken en leden: * **Herpesviridae (dsDNA virus):** * Lineair dsDNA, 120-220 kbp, kubische symmetrie, 120-200 nm, envelop. * **Subfamilies:** * **Alfaherpesvirinae:** Snelle replicatie (<24u), veroorzaken latente infecties, verspreiden zich snel in celculturen, duidelijke cytopathogeen effect (CPE). * Leden: HHV-1 (koortsblazen), HHV-2 (genitale herpes), HHV-3 (waterpokken/zona), Herpes B virus (apen, dodelijk voor mens), Suid herpesvirus 1 (Aujeszky), Bovien herpesvirus 1 (IBR/IPV), Equine herpesvirus (EHV-1, -3, -4), Feline herpesvirus 1 (niesziekte), Gallid herpesvirus 2 (Marekse ziekte). * **Betaherpesvirinae:** Langzame replicatie (>24u), langzame infectie in celculturen, latente infecties (klierweefsel, nier), diersoortspecifiek. * Leden: HHV-5 (CMV bij mens), HHV-6, Suid herpesvirus 2 (cytomegalovirus varken). * **Gammaherpesvirinae:** Veroorzaken lymfoproliferatieve infecties, specifiek voor T- en B-lymfocyten, sommige veroorzaken tumoren. * Leden: EBV (HHV-4, mononucleosis infectiosa), HHV-8 (Kaposi-sarcoom geassocieerd). * **Orthomyxoviridae (ssRNA(-) virus):** * ssRNA (-), gesegmenteerd (6-8 segmenten), schroefvormige symmetrie, 80-120 nm, envelop. * Hemagglutinerende eigenschappen, vermeerdering in celkern en cytoplasma. * **Genera:** * **Influenzavirus A:** Zeer gastheerspecifiek, ondergaat snelle antigene variatie (drift en shift). Groot natuurlijk reservoir in watervogels. Kan genetische reassortiment ondergaan. Kan mens, paard, varken, gevogelte, etc. infecteren. Subtypes H5 en H7 kunnen hoog pathogeen zijn voor pluimvee. * **Influenzavirus B:** Alleen bij de mens, 1 subtype. Geen antigene shift, minder drift. Minder ernstig ziektebeeld maar opgenomen in vaccin. * **Influenzavirus C:** Bij de mens (occasioneel varken). Antigenisch zeer stabiel, veroorzaakt milde luchtweginfecties. Niet in vaccin. #### 4.1.2 Virale eiwitten: structureel en niet-structureel Virale eiwitten hebben diverse functies: * **Structurele eiwitten:** Bevinden zich in het virusdeeltje (virion). * **Kapsiedeiwitten:** Polypeptideketens die symmetrie verzorgen en het genetisch materiaal beschermen. * **Glycoproteïnen:** Geglycosyleerde eiwitten aan de oppervlakte van omhulde virussen, betrokken bij interactie met de gastheercel (bv. hemagglutinine, neuraminidase bij influenza). * **Matrixeiwitten:** Lagen onder de envelop, zorgen voor stabiliteit (bv. M1 bij influenza). * **Enzymen:** Soms ingebouwd in het virion, nodig voor replicatie (bv. RNA polymerase bij orthomyxovirussen). * **Niet-structurele eiwitten:** Worden geproduceerd tijdens virusreplicatie in de cel maar niet ingebouwd in het virion. * Functies: Moduleren van de gastheercelrespons, onderdrukking van antivirale afweer (bv. NS1 bij influenza). **Voorbeeld Influenza A:** * **Structureel:** Hemagglutinine (HA), Neuraminidase (NA), Matrixeiwitten (M1, M2), Nucleoproteïne (NP), Polymerasen (PA, PB1, PB2). * **Niet-structureel:** NS1 (onderdrukt antivirale respons), NS2 (structureel, export RNP uit kern). ### 4.2 Vermeerderingscyclus en verschillen tussen DNA- en RNA-virussen Virussen vermeerderen zich intracellulair, wat gevolgen heeft voor hun behandeling. #### 4.2.1 Gevolgen van intracellulaire replicatie * **Voor het virus:** Virussen zijn afhankelijk van de cellulaire machinerie van de gastheer voor replicatie, assemblage en vrijgave. * **Voor de behandeling:** Antivirale middelen moeten gericht zijn op specifieke stappen in de viruscyclus (bv. replicatie, assemblage) zonder de gastheercel ernstig te beschadigen. Dit is lastig omdat veel processen gedeeld worden met de gastheercel. #### 4.2.2 Verschillen tussen RNA- en DNA-virussen in vermeerderingscyclus | Kenmerk | DNA virussen (bv. Herpesviridae) | RNA virussen (bv. Orthomyxoviridae, Picornaviridae) | | :-------------------------- | :------------------------------------------------------------------------------------------------- | :--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- | | **Genoom** | Meestal dubbelstrengs DNA, lineair of circulair. | Enkelstrengs of dubbelstrengs RNA, lineair of gesegmenteerd. | | **Plaats synthese nucleïnezuur** | Voornamelijk celkern (uitzondering: Poxviridae in cytoplasma). | Voornamelijk cytoplasma (uitzondering: Orthomyxoviridae, Retroviridae deels in kern). | | **Polymerasen voor synthese** | Gebruiken vaak cellulaire DNA-afhankelijke DNA- en RNA-polymerasen. | Brengen eigen RNA-afhankelijke RNA-polymerasen mee (essentieel voor -ssRNA). Retrovirussen hebben reverse transcriptase. | | **Synthese eiwitten** | In cytoplasma (translatie van mRNA). | In cytoplasma (translatie van mRNA). | | **Replicatiefrequentie** | Lagere mutatiesnelheid door proofreading van DNA-polymerasen. | Hogere mutatiesnelheid door ontbreken van proofreading van RNA-polymerasen, wat leidt tot quasispecies. | | **Integratie in gastheergenoom** | Zelden, behalve bij sommige dsDNA virussen die een provirus vormen (bv. Papovavirussen, Hepadnavirussen). | Vaak bij retrovirussen (RNA -> DNA via reverse transcriptase, integratie als provirus). Orthomyxovirussen en Picornavirussen integreren niet. | | **Vrijgave** | Cytolyse of budding (afhankelijk van envelop). | Budding (omhulde virussen) of cytolyse (naakte virussen). | **Voorbeeld DNA-families met leden:** * **Herpesviridae:** Humaan herpesvirus 1, Equine herpesvirus 4. * **Poxviridae:** Variolavirus (mensenpokken), Vacciniavirus (koepokken). * **Parvoviridae:** Porcien parvovirus, Canien parvovirus. **Voorbeeld RNA-families met leden:** * **Orthomyxoviridae:** Influenza A, Influenza B. * **Paramyxoviridae:** Bovien parainfluenzavirus type 3, Newcastle disease virus. * **Retroviridae:** Humane immunodeficiëntievirus (HIV), Equine infectieus anemie virus. ### 4.3 Genetische veranderingen bij virusvermeerdering Virussen ondergaan diverse genetische veranderingen tijdens replicatie: * **Mutaties:** Spontane fouten bij het kopiëren van het virale genoom. Meestal letaal, maar soms neutraal of voordelig. RNA-virussen hebben een hogere mutatiefrequentie dan DNA-virussen. * **Recombinaties:** Uitwisseling van genetisch materiaal tussen gerelateerde virussen die dezelfde cel infecteren, resulterend in een nieuw recombinant virus. Kan optreden bij DNA- en RNA-virussen met enkelstrengs genomen. * **Reassortiment:** Herschikking van genoomsegmenten bij virussen met een gesegmenteerd genoom (bv. Influenza). Basis voor antigene shift en pandemieën. **Voorbeelden:** * **Influenza:** Genetische reassortiment is cruciaal voor antigene shift, waarbij nieuwe HA/NA-subtypes ontstaan die bestaande populatie-immuniteit omzeilen. * **Retrovirussen:** Hoge mutatiefrequentie van reverse transcriptase leidt tot snelle ontwikkeling van resistentie en antigene variatie (bv. HIV). ### 4.4 Diagnostiek van virale infecties Diagnostiek kan op verschillende manieren plaatsvinden: #### 4.4.1 Rechtstreekse detectie (virus, antigenen, nucleïnezuren) * **Elektronenmicroscopie:** Directe visualisatie van virusdeeltjes. Vereist hoge concentraties, weinig gevoelig. * **Hemagglutinatie (HA):** Detectie van virussen die rode bloedcellen agglutineren (bv. Influenza). Geeft indicatie van virus aanwezigheid. * **Detectie van virale antigenen:** * **Immunofluorescentie (IF) / Immunoperoxidase (IPMA/IHC):** Aantonen van virale antigenen intracellulair in weefselsneden of celpreparaten. Snel en specifiek. * **ELISA voor antigenen:** Detectie van virale antigenen in suspensies (secreties/excreties). Gevoelig en snel. * **Agar gel precipitatie (immunodiffusie):** Voor antigenen in secreties/excreties, minder gevoelig. * **Immunoblotting (Western blot):** Zeer specifiek voor antigenen in suspensies. * **Detectie van viraal nucleïnezuur:** * **In situ hybridisatie:** Aantonen van viraal nucleïnezuur intracellulair. * **Dot blot / Northern / Southern blotting:** Detectie van viraal nucleïnezuur in suspensies. * **PCR (Polymerase Chain Reaction):** Zeer gevoelige methode voor het amplificeren en detecteren van viraal DNA of RNA. * **Real-time PCR:** Kwantificatie van viraal nucleïnezuur. #### 4.4.2 Onrechtstreekse detectie (via virusisolatie of serologie) * **Virusisolatie/kweek:** * **Celculturen:** Vermeerdering van het virus in cellijnen. Detectie via CPE (Cytopathogeen Effect), hemadsorptie, of inclusielichaampjes. Primair celculturen zijn het meest gevoelig. * **Kweek in eieren of proefdieren:** Voor virussen die niet in celculturen groeien. * **Serologische tests (detectie van antistoffen):** Diagnose via de immuunrespons van de gastheer. Vereist vaak gepaarde sera (acuut en convalescent) om seroconversie (viervoudige stijging van antistoftiter) aan te tonen. * **ELISA (voor antistoffen):** Gevoelig, specifiek, geschikt voor grootschalig onderzoek. * **Virusneutralisatietest (SN):** Meet de aanwezigheid van neutraliserende antistoffen en geeft een index van bescherming. * **Hemagglutinatie-inhibitietest (HI):** Detecteert antistoffen die de agglutinatie van RBC door virale HA remmen. Correlatie met bescherming bij HA-positieve virussen. * **Complementbindingstest (CF).** * **Indirecte immunofluorescentie (voor antistoffen).** ### 4.5 Behandeling van virale infecties: antivirale middelen Antivirale middelen grijpen in op specifieke stappen van de virusreplicatiecyclus: 1. **Remming van adsorptie/penetratie:** Moeilijk te remmen met medicijnen; neutraliserende antistoffen (via immunotherapie) zijn hier effectief. 2. **Remming van ontmanteling (uncoating):** * Amantadine (tegen Influenza A): Blokkeert M2 ionkanaal. Hoge resistentieontwikkeling, beperkt gebruik. 3. **Remming van biosynthese van virale componenten:** * **Nucleoside-analogen (chain terminators):** Geactiveerd in geïnfecteerde cellen, worden ingebouwd in virale DNA/RNA keten en stoppen de synthese. Hoge selectiviteit. * Aciclovir (tegen herpesvirussen): Actief na activatie door viraal thymidine kinase. * AZT (Zidovudine) (tegen retrovirussen): Remt reverse transcriptase. * **Niet-nucleoside RT-inhibitoren:** Bindt aan reverse transcriptase van HIV. * **Ribavirine:** Breed spectrum, veroorzaakt lethale mutagenese in RNA. * **Foscarnet:** Bindt direct aan virale polymerasen. * **Interferonen:** Remmen virale eiwit- en nucleïnezuur-synthese, versterken immuunrespons. Meer profylactisch, veel bijwerkingen. 4. **Remming van assemblage:** * **Protease-inhibitoren:** Blokkeren virale proteasen, verhinderen rijping van virions (bv. Indinavir tegen HIV). 5. **Remming van vrijkomen van virus:** * **Neuraminidase-inhibitoren (Oseltamivir, Zanamivir):** Remmen neuraminidase van Influenza A en B, verhinderen vrijzetting van nieuwe virions. ### 4.6 Preventie van virale infecties: vaccins Vaccins stimuleren zowel de niet-specifieke (vroege immuunrespons via cytokines zoals interferonen) als de specifieke immuniteit (B-cel respons, T-cel respons, geheugenrespons). #### 4.6.1 Typen vaccins * **Geïnactiveerde vaccins:** Volledig virus geïnactiveerd (bv. met formaldehyde). Veilig, geen replicatie, maar vaak booster nodig en beperkte cellulaire immuniteit. Hebben vaak adjuvans nodig om immuunrespons te versterken. * **Adjuvantia:** Verbeteren immuunrespons (depot effect, presentatie Ag, ontstekingseffect). Aluminiumzouten, olie-in-water emulsies, virosomen, ISCOMs. * **Levende verzwakte vaccins:** Virus met gereduceerde virulentie. Bootsen natuurlijke infectie goed na, wekken sterke cellulaire en humorale immuniteit op, vaak eenmalige toediening volstaat. Risico op reversie naar virulentie en interferentie met andere vaccins. * **Subunit vaccins:** Bevatten alleen specifieke virale antigenen (bv. oppervlakte-eiwitten), geproduceerd via recombinant DNA technologie of chemische dissociatie. Zeer veilig, maar vaak minder immunogeen dan levende vaccins en wekken vooral humorale immuniteit op. * **Vectorvaccins:** Genetisch gemodificeerd virus (vector) dat een gen van een ander virus draagt om de productie van specifieke virale eiwitten te induceren. Veilig, wekken zowel humorale als cellulaire immuniteit op. Vacciniavirus is een veelgebruikte vector. * **Naakt DNA/RNA vaccins:** Nieuwste technologie, bevat viraal genetisch materiaal dat in de gastheercel de productie van virale eiwitten induceert. #### 4.6.2 Factoren bij vaccinatie * **Maternale immuniteit (colostrum/melk):** Kan interfereren met de effectiviteit van vaccinatie bij jonge dieren door neutralisatie van het vaccinantigeen. * **Toedieningsweg:** Parenteraal (injectie) of lokaal (orale, intranasale toediening) beïnvloedt het type immuniteit (systemisch vs. mucosale). Levende verzwakte vaccins kunnen vaak lokaal toegediend worden. ### 4.7 Viruspersistentie en immuniteit * **Persisterende infecties:** Virussen blijven aanwezig in de gastheer na de acute fase (chronisch, latent, trage progressieve infecties, immunotolerantie). Dit kan door immunologische ontwijking, integratie in het genoom (retrovirussen), of latentie in zenuwcellen (herpesvirussen). * **Latentie:** Virusgenoom blijft aanwezig zonder virusproductie, met mogelijkheid tot reactivatie (bv. herpesvirussen). * **Immuniteit:** * **Niet-specifieke immuniteit:** Cytokines (IFN, TNF, IL-1/6/8), ontstekingsreactie. * **Specifieke immuniteit:** Antistoffen (humoraal), T-cel respons (cellulair), geheugencellen. * **Mucosale immuniteit (IgA):** Belangrijk bij oppervlakkige infecties (luchtwegen, darm). ### 4.8 Virusresistentie en inactivatie * **Omgevingsresistentie:** Naakte virussen (bv. Parvoviridae, Rotaviridae) zijn over het algemeen resistenter tegen fysische en chemische factoren (droogte, temperatuur, detergenten) dan omhulde virussen (bv. Herpesviridae, Orthomyxoviridae) wiens envelop instabiel is. * **Inactivatie:** Formol, glutaaraldehyde, alcoholen, hitte, UV-straling kunnen virussen inactiveren. De effectiviteit hangt af van de concentratie, temperatuur, tijd en het type virus. ### 4.9 Zoönotische virussen Virussen die van dieren op mensen kunnen overgedragen worden. * **Voorbeelden:** Poxviridae (koepokkenvirus), Rhabdoviridae (razernijvirus), Orthomyxoviridae (influenza A), Bunyaviridae (Hantavirussen), Togaviridae (Equine Encephalitis virussen). ### 4.10 Virale ziekten: pathogenese en transmissie * **Transmissie:** * **Direct contact:** Via ademhalingswegen (aerosolen, druppels), fecaal-oraal, direct contact (secreties/excreties), seksueel, transplacentair, door bijtwonden. * **Indirect contact:** Via vectoren (muggen, teken) of besmette objecten (fomites). * **Pathogenese:** Kan leiden tot gelokaliseerde (oppervlakkige) infecties (bv. rhinovirus, rotavirus) of veralgemeende (systemische) infecties via viremie of lymfe, met tropisme voor specifieke organen (bv. hersenen, lever). Sommige virussen kunnen congenitale infecties veroorzaken met misvormingen of immunotolerantie. ### 4.11 Factoren die gevoeligheid voor infectie bepalen * **Gastheer:** Individuele immuniteit, genetische aanleg, leeftijd, immuunstatus (bv. immunosuppressie). * **Omgeving:** Dichtheid van populatie, hygiëne, aanwezigheid van vectoren, temperatuur, luchtvochtigheid. * **Virus:** Virulentie, infectiedosis, tropisme, transmissiewijze. --- **Belangrijke Concepten en Tips:** * **Tip:** Het verschil tussen serologische kruisreactie en kruisbescherming is cruciaal. Kruisreactie (antigene verwantschap) betekent niet automatisch kruisbescherming. * **Tip:** De keuze van diagnostische test hangt af van het type virus (kweekbaar of niet), de fase van de infectie (acuut, latent, chronisch), en het materiaal dat beschikbaar is. * **Tip:** Antivirale middelen zijn vaak virus-specifiek en werken het best vroeg in de infectie. Ze genezen zelden de infectie maar kunnen de ziekte onderdrukken of de duur ervan verkorten. * **Tip:** De genetische labiliteit van RNA-virussen (door hoge mutatiesnelheid en reassortiment) is een belangrijke reden voor frequente pandemieën en de noodzaak van jaarlijkse vaccinupdates (bv. influenza). * **Voorbeeld:** De ontwikkeling van vaccins, zoals het Gardasil vaccin tegen HPV, illustreert hoe recombinant DNA technologie gebruikt wordt om veilige en effectieve subunit vaccins te produceren. * **Tip:** Verschillen in de vermeerderingscyclus (DNA vs. RNA, kern vs. cytoplasma) verklaren waarom bepaalde antivirale middelen specifiek werken op bepaalde virusgroepen. * **Voorbeeld:** Herpesvirussen kunnen latente infecties veroorzaken door hun DNA te integreren als episoom in de celkern, met latere reactivatie onder stress. * **Tip:** Continue cellijnen zijn nuttig voor viruskweek en onderzoek, maar primaire celculturen zijn gevoeliger voor virusisolatie in diagnostiek. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | DNA-virussen | Virussen waarvan het genetisch materiaal uit desoxyribonucleïnezuur (DNA) bestaat. Deze virussen vermenigvuldigen zich voornamelijk in de celkern en hebben vaak een langere incubatietijd. | | RNA-virussen | Virussen waarvan het genetisch materiaal uit ribonucleïnezuur (RNA) bestaat. Deze kunnen enkel- of dubbelstrengs RNA hebben en vermenigvuldigen zich vaak in het cytoplasma van de gastheercel. Ze hebben over het algemeen een hogere mutatiesnelheid dan DNA-virussen. | | Herpesviridae | Een familie van dubbelstrengs DNA-virussen die bekend staan om hun vermogen om latente infecties te veroorzaken. Ze hebben een kubische symmetrie en een envelop, en vermenigvuldigen zich in de kern van de gastheercel. | | Orthomyxoviridae | Een familie van enkelstrengs RNA-virussen met een gesegmenteerd genoom. Ze hebben een schroefvormige symmetrie en een envelop, en zijn verantwoordelijk voor griep (influenza) bij mens en dier. | | Structurele eiwitten | Eiwitten die deel uitmaken van de virusdeeltjes (virionen), zoals de eiwitten van het kapsied, de envelop en matrixeiwitten. Ze zijn essentieel voor de structuur en infectiviteit van het virus. | | Niet-structurele eiwitten | Eiwitten die tijdens de virusvermeerdering in de geïnfecteerde cel worden gevormd, maar niet in het uiteindelijke virusdeeltje worden ingebouwd. Ze spelen vaak een rol in de replicatie of in het manipuleren van cellulaire processen ten gunste van het virus. | | Antigen | Een molecuul, meestal een eiwit of polysacharide, dat een immuunrespons kan opwekken, zoals de productie van antistoffen. Virussen hebben specifieke antigenen op hun oppervlak die door het immuunsysteem worden herkend. | | Latentie | Een toestand waarin een virus in de gastheercel aanwezig blijft in een 'slapende' vorm zonder actief te repliceren of ziekte te veroorzaken. Onder bepaalde omstandigheden kan het virus reactiveren en opnieuw infectieus worden. | | Mutaties | Spontane veranderingen in de genetische code van een virus die optreden tijdens de replicatie. Deze kunnen leiden tot nieuwe virusvarianten met veranderde eigenschappen. | | Recombinatie | Het proces waarbij genetisch materiaal wordt uitgewisseld tussen twee verschillende, maar vaak verwante, virussen die dezelfde cel infecteren. Dit resulteert in een nieuw 'recombinant' virus met een combinatie van genetische informatie van beide ouders. | | Reassortment | Een specifiek type genetische uitwisseling dat voorkomt bij virussen met een gesegmenteerd genoom (zoals influenzavirussen). Hierbij worden hele genoomfragmenten uitgewisseld tussen twee verschillende virusdeeltjes die dezelfde cel infecteren, wat kan leiden tot drastische veranderingen in het virus, zoals antigene shift. | | Adjuvans | Een hulpstof die wordt toegevoegd aan vaccins om de immuunrespons tegen het antigeen te versterken. Adjuvantia kunnen de effectiviteit van een vaccin verhogen, waardoor minder antigeen nodig is en een sterkere of langdurigere bescherming wordt verkregen. | | Cytopathogeen effect (CPE) | Veranderingen in gastheercellen die veroorzaakt worden door virusreplicatie en die zichtbaar zijn onder de microscoop. Deze effecten kunnen variëren van celvervorming en -lysis tot de vorming van inclusielichamen. | | Viremie | De aanwezigheid van virussen in het bloed. Dit kan leiden tot een systemische infectie waarbij het virus zich door het hele lichaam verspreidt. | | Zoönotische virussen | Virussen die van dieren op mensen kunnen worden overgedragen. | | Interferonen | Een groep eiwitten die door lichaamscellen worden geproduceerd als reactie op virale infecties. Interferonen hebben antivirale, immunomodulerende en antiproliferatieve effecten en helpen het immuunsysteem om de infectie te bestrijden. | | PFU (Plaque Forming Units) | Een eenheid om de concentratie van infectieuze virusdeeltjes in een suspensie te meten. Het aantal plaques dat wordt gevormd op een celcultuur na inoculatie met een verdunningsreeks van het virus, correspondeert met het aantal infectieuze deeltjes per volume-eenheid. | | Neuraminidase inhibitoren | Een klasse van antivirale middelen die de werking van het neuraminidase-enzym van influenzavirussen blokkeren. Dit enzym is cruciaal voor de vrijlating van nieuwe virusdeeltjes uit geïnfecteerde cellen, waardoor de verspreiding van het virus wordt geremd. | | Hemagglutinatie | Een proces waarbij virussen rode bloedcellen aan elkaar kunnen binden, waardoor deze aggregeren. Dit fenomeen wordt gebruikt in diagnostische tests om de aanwezigheid van bepaalde virussen aan te tonen. | | Virusinactiverende stoffen | Chemische of fysische agentia die de infectiviteit van virussen kunnen vernietigen door hun structurele componenten, zoals het genetisch materiaal of eiwitten, te beschadigen. | | Prionen | Infectieuze eiwitten die geen genetisch materiaal bevatten. Ze kunnen abnormale structuren van normale eiwitten in de hersenen veroorzaken, wat leidt tot ernstige neurodegeneratieve ziekten. | | Colostrum | De eerste moedermelk die na de geboorte wordt geproduceerd en rijk is aan antistoffen (voornamelijk IgG). Dit biedt passieve immuniteit aan het pasgeboren dier. | | Viremische fase | De periode waarin virussen in het bloed aanwezig zijn. Dit is vaak een indicator van een systemische infectie. | | Immunotolerantie | Een toestand waarbij het immuunsysteem van een gastheer een bepaald antigeen (zoals een virus) niet als vreemd herkent en er geen immuunrespons tegen opwekt. Dit kan optreden bij infecties tijdens de vroege ontwikkeling van het immuunsysteem. | | Soorten | De taxonomische rang onder het geslacht, gebruikt om virussen te classificeren die nauw verwant zijn en vergelijkbare kenmerken delen. | | Genus | Een taxonomische rang binnen een virusfamilie, bestaande uit nauw verwante soorten virussen. | | Familie | De hoogste taxonomische rang in de virale classificatie, bestaande uit groepen virussen met vergelijkbare structurele en genetische eigenschappen. |

Virussen zijn fascinerende en complexe entiteiten met een cruciale rol in de biologie en geneeskunde. Deze studiegids biedt een uitgebreid overzicht van de virologie, met de nadruk op de structuur, vermeerdering, genetische variatie, diagnostiek en de toepassing van virologische kennis, met name in de context van vaccins. ## Virusstructuur en morfologie Virussen zijn obligate intracellulaire parasieten die zich buiten de gastheercel in een inerte vorm bevinden, bekend als virionen. Een standaard virion bestaat uit een genetisch materiaal, het genoom, omgeven door een eiwitmantel, het kapsied. Virussen kunnen verder worden onderverdeeld op basis van de aanwezigheid van een envelop. ### Genetische samenstelling en morfologie De genetische samenstelling van virussen kan aanzienlijk variëren. Ze kunnen bestaan uit DNA of RNA, en dit genetisch materiaal kan enkelstrengs of dubbelstrengs zijn. De configuratie kan lineair of circulair zijn, en bij sommige RNA-virussen is het genoom gesegmenteerd. * **Herpesviridae**: Kenmerken zijn een dubbelstrengs (dsDNA) lineair genoom van 120-220 kilobaseparen (kbp). Het virion is kubisch van symmetrie en heeft een diameter van 120-200 nanometer (nm), voorzien van een envelop. * **Orthomyxoviridae**: Deze familie wordt gekenmerkt door een enkelstrengs (ssRNA) negatieve polariteit, gesegmenteerd genoom (6-8 segmenten). De symmetrie is schroefvormig en de diameter is 80-120 nm, met een envelop. ### Morfologie en componenten van het viruspartikel De morfologie van een viruspartikel is essentieel voor zijn interactie met de gastheercel en zijn infectieuze potentieel. * **Nucleïnezuur (Genoom)**: * **DNA of RNA**: Kan enkelstrengs of dubbelstrengs zijn, lineair of circulair. * **Functie**: Draagt de genetische informatie voor de replicatie en de productie van virale eiwitten. * **Kapsied**: * **Samenstelling**: Bestaat uit herhalende eenheden van kapsomeer-eiwitten. * **Functie**: Beschermt het virale genoom tegen afbraak in het milieu, bepaalt de symmetrie van het virus (kubisch, schroefvormig, complex) en speelt een rol bij de hechting aan de gastheercel. * **Envelop**: * **Herkomst**: Ontstaat tijdens het 'budding'-proces uit de celmembraan van de gastheercel. * **Componenten**: Bevat virale glycoproteïnen (peplomeren of spikes) die essentieel zijn voor herkenning en binding aan gastheercelreceptoren, en matrix-eiwitten die stabiliteit verlenen. * **Functie**: Vergemakkelijkt de opname in de gastheercel door fusie met de celmembraan of via endocytose. Virussen met een envelop zijn over het algemeen gevoeliger voor omgevingsfactoren zoals detergenten en uitdroging. * **Tegument**: * **Locatie**: Een laag van eiwitten tussen het kapsied en de envelop, specifiek voor herpesvirussen. * **Functie**: Biedt extra stabiliteit aan het viruspartikel en bevat eiwitten die essentieel zijn voor de vroege stadia van de infectie, zoals immunomodulerende factoren. ### Symmetrie van het viruspartikel De symmetrie van het kapsied kan kubisch, schroefvormig of complex zijn. * **Kubische symmetrie**: Kenmerkend voor bijvoorbeeld herpesvirussen en adenovirussen, waarbij de kapsomeren een icosahedrale structuur vormen. * **Schroefvormige symmetrie**: Vaak gezien bij virussen met een enkelstrengs RNA-genoom, zoals influenzavirussen en rhabdovirussen, waarbij de eiwitten een spiraal rond het genoom vormen. * **Complexe symmetrie**: Te vinden bij bijvoorbeeld pokkenvirussen, die een ingewikkeldere structuur hebben. ## Virusvermeerdering en cyclus Virussen vermeerderen zich uitsluitend intracellulair, wat directe gevolgen heeft voor zowel het virus als de behandeling van virale ziekten. ### Vermeerderingscyclus van DNA- en RNA-virussen Hoewel de algemene stappen van virusvermeerdering (adsorptie, penetratie, ontmanteling, biosynthese, assemblage, vrijgave) vergelijkbaar zijn, zijn er significante verschillen tussen DNA- en RNA-virussen, vooral met betrekking tot de locatie van replicatie en de benodigde enzymen. * **Plaats van synthese van nucleïnezuur**: * **DNA-virussen**: Voornamelijk in de celkern (met uitzonderingen zoals Poxviridae die in het cytoplasma repliceren). * **RNA-virussen**: Over het algemeen in het cytoplasma, met uitzonderingen zoals Orthomyxoviridae en Retroviridae die deels in de celkern repliceren. * **Enzymen voor synthese van nucleïnezuren**: * **DNA-virussen**: Gebruiken vaak cellulaire polymerasen. * **RNA-virussen**: Hebben meestal virale polymerasen nodig, die ze zelf in het virion meenemen of synthetiseren na infectie. RNA-afhankelijke RNA-polymerasen zijn essentieel voor de replicatie van de meeste RNA-genomen. Retrovirussen gebruiken reverse transcriptase om RNA om te zetten in DNA. * **Plaats van synthese van eiwitten**: Voor zowel DNA- als RNA-virussen vindt de synthese van virale eiwitten plaats in het cytoplasma op de ribosomen. ### Specifieke vermenigvuldigingscycli * **Herpesviridae**: 1. **Opname**: Receptor-gemedieerde endocytose. 2. **Ontmanteling**: Fusie van het endosoommembraan met het virale membraan, vrijgave van het nucleokapsied in het cytoplasma. 3. **Replicatie en assemblage**: In de celkern. 4. **Envelopvorming**: Het kapsied wordt omgeven door een membraan bij de binnenste kernmembraan. 5. **Vrijgave**: Via virusbevattende vesikels die migreren van het Golgi-apparaat naar de plasmamembraan. * **Orthomyxoviridae**: 1. **Opname**: Endocytose. 2. **Ontmanteling**: Fusie van endosoom- en virusmembraan, vrijgave van viraal RNA in het cytoplasma. 3. **Replicatie**: Deels in de celkern (transcriptie en replicatie van gensegmenten) en deels in het cytoplasma (synthese van virale eiwitten). 4. **Vrijgave**: Via 'budding' aan de plasmamembraan. * **Retroviridae**: 1. **Opname**: Fusie van virusmembraan met de celmembraan. 2. **Reverse transcriptie**: Viraal RNA wordt omgezet naar DNA in het cytoplasma. 3. **Integratie**: Het virale DNA (provirus) integreert in het genoom van de gastheercel. 4. **Transcriptie en translatie**: Viraal RNA en eiwitten worden geproduceerd. 5. **Assemblage en vrijgave**: Viraal partikel wordt gevormd en komt vrij via 'budding'. ### Gevolgen van intracellulaire vermeerdering * **Voor het virus**: Moeilijk te bestrijden met medicatie, omdat de virale replicatie plaatsvindt in de gastheercel. Veel antivirale middelen richten zich op specifieke virale enzymen of processen. * **Voor behandeling**: Het is uitdagend om selectieve antivirale middelen te ontwikkelen die de virusreplicatie remmen zonder de gastheercellen significant te beschadigen. ## Genetische variatie en virale evolutie Virussen ondergaan voortdurend genetische veranderingen, wat essentieel is voor hun adaptatie en overleving. ### Mutaties Tijdens de replicatie van virussen kunnen spontane fouten optreden bij het kopiëren van het virale genoom. Deze mutaties kunnen letaal zijn, neutraal, of voordelig voor het virus. RNA-virussen hebben doorgaans een hogere mutatiefrequentie dan DNA-virussen vanwege het ontbreken van proofreading-mechanismen bij RNA-polymerasen. Dit leidt tot de vorming van quasispecies, populaties van genetisch verwante varianten. ### Recombinatie en Reassortiment * **Recombinatie**: Treedt op bij virussen met een dubbelstrengs DNA of RNA-genoom. Het omvat de uitwisseling van genetisch materiaal tussen twee verschillende maar verwante virussen die dezelfde cel infecteren, wat resulteert in een nieuw recombinant virus. * **Reassortiment**: Specifiek voor RNA-virussen met een gesegmenteerd genoom. Hierbij worden hele genoomfragmenten uitgewisseld tussen twee verschillende influenzavirussen die tegelijkertijd dezelfde cel infecteren. Dit is de basis voor antigene shift bij influenzavirussen en kan leiden tot pandemieën. ### Genetische veranderingen bij specifieke virusfamilies * **Influenzavirussen**: Ondergaan zowel antigene drift (kleine mutaties) als antigene shift (grote veranderingen door reassortiment). Dit maakt hen "genetisch labiel" en de oorzaak van epidemieën en pandemieën. De veranderingen in HA en NA subtypen zijn cruciaal voor het epidemiologisch gedrag, aangezien ze bepalen hoe goed de bestaande populatie-immuniteit werkt. * **Herpesvirussen**: Hoewel ze DNA-genomen hebben, vertonen ze ook genetische variatie, wat kan leiden tot verschillen in virulentie en het vermogen tot latente infecties. * **Retrovirussen**: Ondergaan frequent mutaties door hun reverse transcriptase-enzym, wat leidt tot genetische instabiliteit en snelle evolutie. ## Vergelijking van virusfamilies ### Herpesviridae vs. Orthomyxoviridae | Kenmerk | Herpesviridae | Orthomyxoviridae | |---|---|---| | **Genoom** | dsDNA, lineair, 120-220 kbp | ssRNA (-), gesegmenteerd (6-8), 80-120 nm | | **Symmetrie** | Kubisch | Schroefvormig | | **Envelop** | Aanwezig | Aanwezig | | **Gevoeligheid aan detergenten** | Gevoelig (door envelop) | Gevoelig (door envelop) | | **Vermeerderingscyclus** | Replicatie en assemblage in kern; envelopvorming via kern- en Golgi-membranen. | Replicatie deels in kern (transcriptie/replicatie), deels in cytoplasma (synthese eiwitten); envelopvorming bij plasmamembraan. | | **Belangrijke leden** | HHV-1, HHV-2, HHV-3 (Varicella Zoster), EBV (HHV-4), CMV (HHV-5) | Influenzavirus A, B, C | ### Pokkenvirussen, Retrovirussen en Prionen * **Fysische en chemische eigenschappen**: * **Pokkenvirussen**: Grote dsDNA-virussen, complex kapsied, omgeven door een envelop die ze relatief stabiel maakt. Ze zijn stabiel tegen zuren en relatief hittebestendig, vooral in gedroogde toestand. * **Retrovirussen**: ssRNA (+), schroefvormig symmetrisch, omgeven door een envelop. Ze worden snel geïnactiveerd door warmte en detergenten, maar zijn meer resistent aan UV en X-stralen. Ze bevatten reverse transcriptase. * **Prionen**: Zijn geen virussen maar infectieuze eiwitten. Ze hebben geen genetisch materiaal en zijn uitzonderlijk resistent tegen hitte, chemicaliën en straling. * **Genetische stabiliteit**: * **Pokkenvirussen**: Relatief stabiel door hun DNA-genoom en complexe structuur. * **Retrovirussen**: Genetisch labiel door hun RNA-genoom en het reverse transcriptase-enzym met gebrekkige proofreading, wat leidt tot hoge mutatiefrequenties. * **Prionen**: Hebben geen genetisch materiaal en ondergaan dus geen genetische veranderingen zoals mutaties. Hun infectiviteit berust op conformatieveranderingen van eiwitten. * **Gevoeligheid aan inactivatie door temperatuur**: * **Pokkenvirussen**: Relatief resistent tegen warmte. * **Retrovirussen**: Gevoelig voor warmte en detergenten. * **Prionen**: Uitzonderlijk resistent tegen hoge temperaturen (autoclaveren is vaak nodig voor inactivatie). ## Virale eiwitten: structureel en niet-structureel Virale eiwitten hebben diverse functies, zowel structureel als niet-structureel. ### Structurele eiwitten Bevinden zich in het virion en zijn essentieel voor de vorming en infectiviteit van het virus. * **Kapsiedeiwitten**: Vormen de beschermende mantel rond het virale genoom. Ze bepalen de symmetrie en spelen een rol bij de hechting aan de gastheercel. * **Glycoproteïnen**: Geassocieerd met de envelop van omhulde virussen. Ze fungeren als liganden voor celreceptoren, bepalen het tropisme en zijn belangrijke antigenen die een immuunrespons opwekken. * **Matrixeiwitten**: Een laag onder de envelop die extra stabiliteit verleent aan het viruspartikel (bv. bij Ortho- en Paramyxovirussen). * **Virale enzymen**: Sommige enzymen die nodig zijn voor de virusreplicatie, zoals polymerasen, kunnen deel uitmaken van het virion (bv. RNA-afhankelijke RNA-polymerasen in negatief-strengs RNA-virussen, reverse transcriptase in retrovirussen). ### Niet-structurele eiwitten Worden geproduceerd tijdens de virusreplicatie in de cel maar worden niet ingebouwd in het nieuwe virion. Ze zijn vaak betrokken bij de regulatie van de replicatiecyclus, het onderdrukken van de cellulaire afweer of het manipuleren van cellulaire processen. * **Voorbeeld: Influenza A virus**: * **Structurele eiwitten**: Hemagglutinine (HA), neuraminidase (NA), matrixeiwitten (M1, M2), nucleoproteïne (NP), polymerasen (PA, PB1, PB2). * **Niet-structurele eiwitten**: NS1 (onderdrukt antivirale respons), NS2 (helpt bij export van ribonucleoproteïnen uit de kern). ### Functies van virale eiwitten * **Bescherming van het genoom**: Structurele eiwitten beschermen het virale genetisch materiaal tegen degradatie. * **Celherkenning en -binding**: Oppervlakkige eiwitten (liganden) binden aan specifieke receptoren op de gastheercel, wat het tropisme van het virus bepaalt. * **Stimuleren van antistofproductie**: Virale eiwitten, vooral de uitwendige, zijn antigenen die een immuunrespons opwekken, leidend tot de vorming van neutraliserende antistoffen die bescherming bieden tegen herinfectie. ## Antivirale middelen en vaccins Kennis van de virologische processen is cruciaal voor de ontwikkeling van antivirale middelen en vaccins. ### Antivirale middelen Antivirale middelen kunnen verschillende stappen in de virusreplicatiecyclus remmen: 1. **Remming van adsorptie/penetratie**: Blokkeren van de binding aan celreceptoren of de fusie/endocytose. Momenteel weinig marktmedicatie hiervoor beschikbaar. 2. **Remming van ontmanteling (uncoating)**: Zoals Amantadine tegen Influenza A, dat het M2-ionkanaal blokkeert. 3. **Remming van biosynthese van virale componenten**: * **Nucleoside-analogen (chain terminators)**: Zoals Aciclovir (anti-herpes) en AZT (anti-retrovirus), die ingebouwd worden in het virale DNA/RNA en ketenstop veroorzaken. Aciclovir is hoog selectief omdat het geactiveerd wordt door virale enzymen. * **Niet-nucleoside RT-inhibitoren**: Zoals Nevirapine (tegen HIV), die de reverse transcriptase remmen. * **Ribavirine**: Een breed spectrum antiviraal middel dat mutaties in RNA induceert (lethale mutagenese). * **Foscarnet**: Remt virale polymerasen direct. * **Interferonen**: Remmen virale eiwitsynthese en RNA/DNA-synthese, maar hebben veel bijwerkingen. 4. **Remming van assemblage**: Zoals HIV-protease-inhibitoren die voorkomen dat virale eiwitten correct worden verwerkt. 5. **Remming van vrijgave**: Zoals neuraminidase-inhibitoren (Oseltamivir, Zanamivir) tegen Influenza A en B, die het losmaken van nieuwe virusdeeltjes van de cel remmen. ### Vaccinproductie Vaccins zijn bedoeld om een immuunrespons op te wekken en bescherming te bieden tegen virale infecties. * **Geïnactiveerde vaccins**: Bevatten volledig geïnactiveerd virus (bv. met formaldehyde). Ze zijn veilig maar vaak minder immunogeen, waardoor adjuvans en herhaalde vaccinaties nodig zijn. * **Productie**: Viruskweek, zuivering, inactivatie, toevoeging van adjuvans. * **Adjuvantia**: Verbeteren de immuunrespons door een 'depot-effect', betere antigeenpresentatie of een ontstekingsreactie. * **Levende vaccins (verzwakte stammen)**: Bevatten een verzwakte, niet-ziekteverwekkende vorm van het virus. Ze repliceren beperkt in de gastheer, bootsen een natuurlijke infectie na en wekken een sterke, langdurige humorale en cellulaire immuniteit op. * **Productie**: Selectie van verzwakte stammen (bv. door passages of genetische modificatie). * **Voordelen**: Vaak effectief na één dosis, kunnen lokaal (bv. mucosale) immuniteit opwekken. * **Nadelen**: Risico op reversie naar virulentie, mogelijke interferentie met andere vaccins, beperkte houdbaarheid. * **Subunit vaccins**: Bevatten alleen specifieke virale antigenen (meestal oppervlakte-eiwitten). * **Productie**: Kan via klassieke methoden (chemische extractie) of recombinant DNA-technologie. * **Voordelen**: Zeer veilig, omdat geen infectieus virus wordt gebruikt. * **Nadelen**: Kunnen minder immunogeen zijn dan levende of geïnactiveerde vaccins, omdat ze geen intracellulaire replicatie induceren die nodig is voor sterke cellulaire immuniteit. * **Vectorvaccins**: Gebruiken een ander, veilig virus (de vector) om genetisch materiaal van een doelvirus te leveren. Dit genereert een immuunrespons tegen zowel de vector als het doeltarget. ### Diagnostiek van virale infecties Diverse methoden worden gebruikt om virale infecties te diagnosticeren: * **Directe detectie**: * **Virusisolatie**: Kweek van het virus in celculturen, eieren of proefdieren, gevolgd door detectie van cytopathogeen effect (CPE), hemadsorptie of inclusielichaampjes. * **Antigeendetectie**: Methoden zoals ELISA, immunofluorescentie en immunohistochemie om virale eiwitten aan te tonen. * **Nucleïnezuurdetectie**: Technieken zoals PCR en in situ hybridisatie om viraal DNA of RNA aan te tonen, vooral nuttig voor moeilijk te kweken virussen of latente infecties. * **Indirecte detectie (serologie)**: Meten van de immuunrespons van de gastheer, d.w.z. de aanwezigheid van antistoffen tegen het virus. Methoden zijn ELISA, virusneutralisatietesten (SN) en hemagglutinatie-inhibitietesten (HI). Seroconversie (een significante stijging van antistoftiters tussen een acuut en convalescent serum) is cruciaal voor de diagnose van primaire infecties. ## Belangrijke virusfamilies en hun kenmerken ### Herpesviridae * **Belangrijke biologische kenmerken**: dsDNA, kubische symmetrie, envelop, tegument. Ze veroorzaken latente infecties waarbij het virus levenslang in de gastheer aanwezig blijft en onder bepaalde omstandigheden kan reactiveren. Ze kunnen transplacentaire infecties veroorzaken en zijn vaak ernstiger bij jonge of immuungecompromitteerde individuen. * **Belangrijkste leden**: Alphaherpesvirinae (snelle replicatie, bv. HSV-1, HSV-2, VZV, EHV-1), Betaherpesvirinae (langzame replicatie, bv. CMV), Gammaherpesvirinae (lymfoproliferatief, bv. EBV, KSHV). ### Orthomyxoviridae (Influenza) * **Belangrijke kenmerken**: ssRNA (-), gesegmenteerd genoom, schroefvormig, envelop. Gevoelig voor tensioactieve stoffen. Ondergaan antigene drift en shift, wat leidt tot epidemieën en pandemieën. * **Genera**: Influenzavirus A (breed gastheerbereik, ondergaat shift en drift), B (alleen mens, minder drift, geen shift), C (mens/varken, stabiel, milde infecties). ### Retroviridae * **Belangrijke kenmerken**: ssRNA (+), schroefvormig, envelop. Gebruiken reverse transcriptase om RNA om te zetten in DNA, dat integreert in het gastheergenoom (provirus). Kunnen oncogeen zijn en veroorzaken langzame, progressieve infecties (lentivirussen). * **Belangrijke leden**: HIV (mens), FIV (kat), BIV (rund), Equine Infectious Anemia Virus (paard). ### Parvoviridae * **Belangrijke kenmerken**: ssDNA, lineair, zeer klein genoom. Zeer resistent tegen warmte en zure pH. Vermeerderen zich in de celkern, met voorkeur voor snel delende cellen. Veel leden veroorzaken verticale overdracht. * **Belangrijke leden**: Porcine parvovirus (verworpen, mummificatie), Canine parvovirus (enteritis, myocarditis). ## Virale zoönosen en immuniteit ### Zoönotische virussen Virussen die van dieren op mensen kunnen overgaan. * **Voorbeelden**: Pokkenvirussen (koepokkenvirus, apenpokkenvirus), Herpesvirussen (B-virus van de aap), Rhabdovirussen (rabiësvirus), Flavivirussen (West-Nijl virus, gele koorts virus). ### Immuniteit tegen virale infecties * **Niet-specifieke (aangeboren) immuniteit**: Vroege respons, omvat interferonen (IFN) en tumornecrosefactor (TNF), die de replicatie van veel virussen remmen. * **Specifieke (adaptieve) immuniteit**: * **Humorale immuniteit**: Geproduceerd door B-cellen (antistoffen, voornamelijk IgG en IgA). IgG beschermt tegen systemische infecties, terwijl IgA lokale immuniteit op de slijmvliezen biedt. * **Cellulaire immuniteit**: Mede door T-cellen (cytotoxische T-cellen, helper T-cellen). Essentieel voor het opruimen van geïnfecteerde cellen. * **Colostrale en lactogene immuniteit**: Passieve immuniteit overgedragen via moedermelk en colostrum, die de jonge dieren beschermt tijdens de eerste levensweken. Kan echter interfereren met vaccinatie. ## Veelvoorkomende fouten en misvattingen * **Verwarring tussen serologische kruisreactie en kruisbescherming**: Kruisreactie betekent dat antistoffen reageren met meerdere antigenen, maar dit impliceert niet noodzakelijk bescherming tegen alle geteste antigenen. * **Overestimering van de selectiviteit van antivirale middelen**: Sommige middelen, zoals AZT, zijn minder selectief en kunnen bijwerkingen hebben. * **Onderschatting van de resistentie van naakte virussen**: Virussen zonder envelop zijn over het algemeen veel resistenter tegen omgevingsfactoren dan omhulde virussen. * **Generalisatie van de replicatieplaats**: Niet alle RNA-virussen repliceren uitsluitend in het cytoplasma; sommige hebben kernfasen. * **Verwarring tussen latentie en persistentie**: Latentie is een slapende toestand met geen virusproductie, terwijl persistentie kan leiden tot chronische replicatie en uitscheiding. * **Verkeerde conclusies over vaccin-efficiëntie**: De effectiviteit van vaccins kan worden beïnvloed door maternale antistoffen en de specifieke immuniteit die ze opwekken (humoraal vs. cellulair, lokaal vs. systemisch).

## Verklarende Woordenlijst | Term | Definitie | |---|---| | Adjuvans | Een hulpstof die wordt toegevoegd aan vaccins om de immuunrespons tegen het desbetreffende antigeen te versterken, zonder zelf een immuunrespons op te wekken. | | Antigene shift | Een ingrijpende genetische verandering in de hemagglutinine (HA) en/of neuraminidase (NA) eiwitten van influenzavirussen, die kan leiden tot de opkomst van nieuwe virale subtypes waarvoor de populatie-immuniteit onvoldoende is. | | Antigene drift | Geleidelijke, kleine veranderingen in de hemagglutinine (HA) en/of neuraminidase (NA) eiwitten van influenzavirussen, die optreden door accumulatie van mutaties over tijd. | | Budding | Het proces waarbij virusdeeltjes uit een gastheercel vrijkomen door uitgroeiing van het virale membraan door de celmembraan, waardoor het virus een envelop verkrijgt. | | Cytopathogeen effect (CPE) | Veranderingen in celculturen die veroorzaakt worden door een virale infectie, zoals celdood, vervorming of de vorming van inclusielichamen. | | Endogene virussen | Virussen die genetisch materiaal in het genoom van de gastheer hebben geïntegreerd en via de kiembaan van ouder op nakomeling worden overgedragen. | | Exogene virussen | Virussen die buiten het lichaam ontstaan of worden verkregen en zich horizontaal of verticaal kunnen verspreiden. | | Genoom | Het complete genetische materiaal van een virus, bestaande uit DNA of RNA. | | Hemagglutinatie | Het vermogen van bepaalde virussen om rode bloedcellen aan elkaar te laten kleven door de binding van virale hemagglutininen aan receptoren op de oppervlakte van de rode bloedcellen. | | Immunotolerantie | Een staat waarbij het immuunsysteem van een organisme een antigen (zoals een virus) als lichaamseigen beschouwt en er geen immuunrespons tegen opwekt, vaak veroorzaakt door infectie in een vroeg stadium van de ontwikkeling. | | Inclusielichaampjes | Structuren binnen geïnfecteerde cellen, zichtbaar onder de microscoop, die door virale replicatie worden gevormd en virale componenten of virussen kunnen bevatten. | | Latentie | Een fase waarin een virus zich in de gastheercel bevindt in een inactieve staat, zonder actieve replicatie, maar met de potentie tot reactivatie. | | Mutatie | Een spontane verandering in de genetische code van een virus, die kan optreden tijdens de replicatie. | | Nucleokapsied | De structuur die bestaat uit het virale genetisch materiaal (genoom) omhuld door eiwitten die het kapsied vormen. | | Oncogeen | Een gen dat celgroei en -deling kan induceren en potentieel kan leiden tot de vorming van tumoren. | | Pandemie | Een wereldwijde uitbraak van een infectieziekte, vaak veroorzaakt door een nieuw virus of een virus met drastisch veranderde eigenschappen. | | Persistentie | Het langdurig of levenslang aanwezig blijven van een virus in de gastheer, zelfs na de acute fase van de infectie. | | Prion | Een infectieus agens dat uitsluitend bestaat uit een abnormaal gevouwen eiwit, zonder genetisch materiaal, en dat hersenweefsel kan aantasten. | | Quasispecies | Een populatie van genetisch nauw verwante virusvarianten die ontstaat door de hoge mutatiefrequentie van RNA-virussen, waarbij de genetische diversiteit bijdraagt aan adaptatie en overleving. | | Reassortiment | Een proces waarbij genoomsegmenten worden uitgewisseld tussen twee verschillende virussen die dezelfde cel infecteren, voornamelijk voorkomend bij virussen met een gesegmenteerd genoom zoals influenzavirussen. | | Recombinatie | Het uitwisselen van genetisch materiaal tussen twee verschillende maar verwante virussen die dezelfde cel infecteren, resulterend in een nieuw recombinant virus met genetische informatie van beide oudervirussen. | | Serotype | Een classificatie binnen een virussoort gebaseerd op antigenische verschillen, voornamelijk aan de oppervlakte-eiwitten, die bepalen hoe de immuunrespons reageert. | | Subtype | Een onderverdeling binnen een serotype, gekenmerkt door kleine antigenische verschillen, vaak gerelateerd aan veranderingen in specifieke virale eiwitten zoals hemagglutinine en neuraminidase bij influenzavirussen. | | Tropisme | De affiniteit van een virus voor specifieke cellen, weefsels of organen binnen een gastheer, bepaald door de aanwezigheid van receptoren op de celoppervlakte en de virale liganden. | | Viremie | De aanwezigheid van virussen in het bloed van een gastheer, wat kan leiden tot systemische infecties. |

# Introduction à la biologie moléculaire et ses prérequis La biologie moléculaire est une sous-discipline de la biologie qui étudie la vie au niveau moléculaire, particulièrement les acides nucléiques (ADN et ARN) et les protéines, ainsi que les mécanismes de leur interaction et de leur expression. ### 1.1 Définition et histoire de la biologie moléculaire Le terme "biologie moléculaire" a été utilisé pour la première fois en 1938 par Warren Weaver. Cette discipline englobe également les techniques de manipulation des acides nucléiques, connues sous le nom de techniques de génie génétique. ### 1.2 Concepts fondamentaux #### 1.2.1 Acides nucléiques : ADN et ARN * **Définition:** Les acides nucléiques sont des molécules qui portent l'information génétique. Les deux principaux types sont l'ADN (acide désoxyribonucléique) et l'ARN (acide ribonucléique). * **Propriétés:** Les acides nucléiques sont des molécules chargées négativement en raison de leurs groupes phosphate. #### 1.2.2 Gènes et génomes * **Gènes:** Un individu possède des milliers de gènes. * **Génome:** L'ensemble des gènes d'un individu constitue son génome. * **Variabilité individuelle:** Environ 99% du génome humain est commun à tous les individus, tandis que 1% est variable, rendant chaque individu unique avec son propre génome. #### 1.2.3 Expression génétique : du gène à la protéine L'expression génétique est le processus par lequel l'information contenue dans un gène est utilisée pour synthétiser une protéine fonctionnelle. * **Allèle:** Une version spécifique d'un gène. * **Relation gène-protéine:** Lorsqu'un gène s'exprime, il conduit à la production d'une protéine. Par exemple, un individu avec un groupe sanguin A possède un allèle spécifique qui code pour une protéine impliquée dans la détermination de ce groupe sanguin. ### 1.3 Applications technologiques en biologie moléculaire Les techniques de biologie moléculaire permettent une variété d'applications, notamment : * Extraction et purification d'acides nucléiques. * Utilisation d'enzymes de restriction pour couper l'ADN. * Amplification de fragments d'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction). * Séparation de molécules par électrophorèse. * Détermination de la séquence d'acides nucléiques (séquençage). * Analyse de profils génétiques pour des applications telles que les enquêtes policières. ### 1.4 La place de la biologie moléculaire dans les programmes scolaires #### 1.4.1 En classe de seconde * **SVT:** Les élèves apprennent que toutes les cellules d'un organisme proviennent d'une cellule unique et possèdent initialement la même information génétique organisée en gènes constitués d'ADN. Ils découvrent que les cellules spécialisées n'expriment qu'une partie de cet ADN. Les notions fondamentales incluent cellule, tissu, organe, ADN, double hélice, nucléotides (adénine, thymine, cytosine, guanine), complémentarité, gène et séquence. L'objectif est de comprendre le lien entre la structure moléculaire de l'ADN et sa capacité à porter une information, ainsi que le rôle des cellules spécialisées. * **Option Biotechnologie:** La biologie moléculaire est également abordée dans le cadre de l'option biotechnologie. #### 1.4.2 En classe de première (spécialité SVT) Les élèves acquièrent des capacités telles que : * Concevoir et réaliser une réaction de PCR en déterminant la durée de chaque étape du cycle et en calculant le nombre de copies obtenues. * Concevoir et réaliser un protocole pour étudier l'action d'un agent mutagène sur la survie cellulaire et l'apparition de mutants. * Mener une démarche historique ou une étude documentaire sur le séquençage des macromolécules (protéines, ARN, ADN). ### 1.5 L'électrophorèse en biologie moléculaire L'électrophorèse est une technique fondamentale utilisée pour séparer des molécules chargées électriquement sous l'influence d'un champ électrique. #### 1.5.1 Principe de l'électrophorèse * **Migration ionique:** Les ions migrent vers l'électrode de charge opposée. Les anions (chargés négativement) se déplacent vers l'anode (positive), tandis que les cations (chargés positivement) se dirigent vers la cathode (négative). * **Séparation des fragments d'ADN:** En laboratoire, l'électrophorèse sur gel d'agarose est utilisée pour séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille. À pH neutre, les molécules d'ADN portent une charge négative et migrent donc vers l'anode (pôle positif). La séparation est basée sur la capacité des fragments plus petits à traverser le gel plus rapidement que les fragments plus grands. #### 1.5.2 Applications de l'électrophorèse sur gel d'agarose Cette technique permet notamment de : * Identifier la taille de fragments d'ADN (en comparant avec un marqueur de taille). * Estimer la quantité d'ADN présente. * Purifier un fragment d'ADN spécifique à partir du gel. #### 1.5.3 Composants clés de l'électrophorèse * **Le gel d'agarose:** L'agarose est un polyoside obtenu à partir d'agar. Sous forme de poudre, il est dissous dans l'eau bouillante et forme un gel en refroidissant. La concentration d'agarose dans le gel détermine la taille des pores : une concentration plus élevée crée un maillage plus serré, offrant une meilleure résolution pour séparer des fragments d'ADN de petite taille. * Un gel à 0,8 % a un maillage plus lâche, adapté aux grands fragments. * Un gel à 1,25 % offre une résolution intermédiaire. * Un gel à 2 % a un maillage très serré, idéal pour séparer les petits fragments. * **Le tampon de migration:** Un tampon est nécessaire pour assurer la conductivité électrique et maintenir le pH. Les tampons couramment utilisés incluent le Tris/Acétate/EDTA (TAE) et le Tris/Borate/EDTA (TBE). Le tampon TBE, souvent utilisé à une concentration de 0,5X, est fréquent en biologie moléculaire. #### 1.5.4 Préparation d'un gel d'électrophorèse (exemple pratique) Pour préparer 150 mL d'un gel d'agarose à 0,8 % : 1. Peser 1,2 gramme d'agarose. 2. Ajouter 170 mL de tampon TBE 1X (ce volume inclut une marge pour l'évaporation lors du chauffage). 3. Chauffer la solution jusqu'à ce qu'elle soit limpide. 4. Laisser refroidir à environ 55-65 °C. 5. Couler la solution dans un support de gel et laisser solidifier. 6. Retirer le peigne et les butoirs une fois le gel solidifié. #### 1.5.5 Montage et préparation de l'électrophorèse * **Montage de la cuve:** Le support de gel est placé dans la cuve d'électrophorèse, avec les puits orientés vers la cathode (borne négative). * **Remplissage de la cuve:** La cuve est remplie de tampon de migration jusqu'à immersion du gel et remplissage des puits. * **Préparation des échantillons:** Les échantillons d'ADN sont mélangés avec un "bleu de dépôt". Ce dernier alourdit l'ADN, facilitant son chargement dans les puits, et permet de visualiser la migration. #### 1.5.6 Chargement des échantillons et migration * **Dépôt:** Un volume précis (par exemple, 15 µL) de chaque échantillon est déposé dans un puits avec une micropipette, en évitant la formation de bulles d'air, les débordements et la perforation du fond du puits. Un fond noir sous la cuve aide à visualiser le dépôt. * **Migration:** La cuve est reliée à un générateur électrique. Une tension comprise entre 70 V et 120 V est appliquée. Une tension plus basse assure une migration plus précise mais plus longue, tandis qu'une tension plus élevée accélère la migration au détriment de la précision. La migration se poursuit jusqu'à ce que les marqueurs de migration atteignent environ 2 cm du bord opposé du gel. #### 1.5.7 Révélation des bandes d'ADN L'ADN n'étant pas visible à l'œil nu, des colorants sont utilisés pour révéler les résultats. * **Colorants intégrés:** Certains kits intègrent des révélateurs comme le Safegreen directement dans les réactifs. * **Coloration post-migration:** Si les colorants ne sont pas intégrés, le gel est coloré après migration, souvent avec de l'Azur A. Après coloration et rinçage (pour éliminer l'excès de colorant), les bandes d'ADN deviennent visibles. L'intensité de coloration augmente avec le temps et peut être optimisée par réfrigération. > **Tip:** Une bonne visualisation des bandes d'ADN dépend de la qualité du gel, de la concentration d'agarose appropriée à la taille des fragments à séparer, et d'une révélation efficace. > > **Example:** Dans le cadre d'une enquête policière, l'électrophorèse peut être utilisée pour comparer les profils génétiques d'échantillons prélevés sur une scène de crime avec ceux de suspects, permettant ainsi d'identifier des correspondances. --- # Techniques et applications en biologie moléculaire La biologie moléculaire est une sous-discipline de la biologie qui étudie la vie au niveau moléculaire, en se concentrant particulièrement sur les acides nucléiques (ADN et ARN) et leur rôle dans l'expression des gènes. Chaque individu possède un génome unique, constitué de milliers de gènes, dont environ 99% sont communs à tous les êtres humains, tandis que 1% est variable, conférant ainsi son unicité à chaque individu. Les acides nucléiques sont des molécules chargées négativement. L'expression d'un gène conduit à la production d'une protéine, et différentes versions d'un même gène sont appelées allèles. Les applications technologiques en biologie moléculaire sont vastes et incluent l'extraction et la purification d'acides nucléiques, la restriction enzymatique, l'amplification par PCR, l'électrophorèse, le séquençage et l'analyse de profil génétique. Ces techniques sont fondamentales dans divers domaines, notamment dans les programmes d'enseignement secondaire en SVT et en biotechnologie, où elles permettent d'aborder des concepts tels que la structure de l'ADN, la spécialisation cellulaire et la réalisation de profils génétiques. ### 2.1 Extraction et purification de gènes Bien que les détails de la procédure d'extraction et de purification ne soient pas explicitement décrits dans les pages fournies, cette étape est reconnue comme la première dans la chaîne des applications technologiques en biologie moléculaire. Elle vise à isoler et purifier l'ADN ou l'ARN d'intérêt à partir d'échantillons biologiques variés, afin de le rendre utilisable pour des analyses ultérieures. ### 2.2 Restriction enzymatique Cette technique, mentionnée dans la description générale des applications, repose sur l'utilisation d'enzymes de restriction qui coupent l'ADN à des séquences spécifiques appelées sites de restriction. Elle permet de fragmenter l'ADN en morceaux de tailles définies, ce qui est crucial pour des analyses telles que le clonage ou le "fingerprinting" génétique. ### 2.3 Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) La PCR est une technique qui permet d'amplifier de manière exponentielle des séquences d'ADN spécifiques. En classe de première spécialité SVT, les élèves sont amenés à concevoir et réaliser une réaction de PCR, en déterminant la durée de chaque étape du cycle et en calculant le nombre de copies obtenues. Un cycle de PCR comprend typiquement trois étapes : * **Dénaturation :** Les deux brins d'ADN sont séparés par chauffage à haute température (environ 94-98 °C). * **Hybridation (ou annealing) :** Des amorces spécifiques se lient aux séquences d'ADN complémentaires à basse température (environ 50-65 °C). * **Élongation :** Une ADN polymérase thermostable synthétise de nouveaux brins d'ADN à partir des amorces à une température optimale pour l'enzyme (environ 72 °C). Le nombre de copies d'ADN obtenues après $n$ cycles est donné par la formule : $$ \text{Nombre de copies} = 2^n \times \text{Nombre de copies initiales} $$ Si le nombre initial de copies est 1, alors après $n$ cycles, le nombre de copies sera $2^n$. > **Tip:** La conception d'une réaction de PCR efficace nécessite une sélection rigoureuse des amorces, une optimisation des températures et des temps de chaque étape, ainsi que le choix d'une polymérase adaptée à la température de dénaturation. ### 2.4 Électrophorèse L'électrophorèse est une technique fondamentale permettant de séparer des molécules chargées sous l'effet d'un champ électrique. #### 2.4.1 Principe général de l'électrophorèse Les ions migrent vers l'électrode de charge opposée : les anions (chargés négativement) se déplacent vers l'anode (pôle positif), tandis que les cations (chargés positivement) se dirigent vers la cathode (pôle négatif). #### 2.4.2 Électrophorèse sur gel d'agarose En biologie moléculaire, l'électrophorèse sur gel d'agarose est couramment utilisée pour séparer des fragments d'ADN en fonction de leur taille. À pH neutre, les molécules d'ADN sont chargées négativement et migrent donc vers l'anode (pôle positif). La séparation se fait par la taille des fragments : les plus petits fragments traversent le gel plus rapidement que les plus grands. Cette technique permet de : * Identifier la taille de fragments d'ADN par comparaison avec un marqueur de taille connu. * Estimer la quantité d'ADN présente. * Purifier un fragment d'ADN spécifique à partir du gel. #### 2.4.3 Le gel d'agarose L'agarose est un polysaccharide extrait de l'agar. Il est utilisé sous forme de poudre blanche qui, dissoute dans l'eau et chauffée, forme une solution. En refroidissant en dessous de 40 °C, cette solution se solidifie en un gel. La taille des pores du gel dépend de la concentration d'agarose : une concentration plus élevée entraîne des pores plus petits et une résolution de séparation plus fine, ce qui est idéal pour séparer de petits fragments d'ADN. * **Gel à 0,8 % :** Maillage plus lâche, adapté aux fragments d'ADN de grande taille. * **Gel à 1,25 % :** Concentration intermédiaire. * **Gel à 2 % :** Maillage serré, idéal pour la séparation de petits fragments d'ADN. #### 2.4.4 Le tampon de migration Le tampon de migration assure la conductivité électrique du milieu et maintient le pH. Les tampons les plus couramment utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (TAE) et le Tris/Borate/EDTA (TBE). Le tampon TAE offre une meilleure séparation pour les grands fragments d'ADN mais possède un pouvoir tampon plus faible que le TBE. Le tampon TBE 0,5X est souvent utilisé. #### 2.4.5 Préparation et réalisation d'une électrophorèse (Exemple du kit ADN suspect) L'objectif de cette section est de détailler les étapes pratiques pour réaliser une électrophorèse, notamment dans le cadre d'une analyse de profil génétique. **Matériel nécessaire :** * Gels d'agarose préparés. * Tampon de migration (ex: TBE 0,5X). * Tubes d'échantillons d'ADN. * Colorant de dépôt (ex: Bleu de dépôt, qui alourdit l'ADN et permet la visualisation). * Cuves d'électrophorèse et générateur. * Transilluminateur ou lampe UV. * Microcentrifugeuse. * Azur A (colorant pour révélation si nécessaire) et éthanol. **Calculs préalables pour la préparation du gel :** Pour préparer 150 mL d'un gel d'agarose à 0,8 % : $$ \text{Masse d'agarose} = \frac{\text{Concentration désirée} (\text{g/100mL}) \times \text{Volume total} (\text{mL})}{100} $$ $$ m_{\text{agarose}} = \frac{0,8 \times 150}{100} = 1,2 \text{ g} $$ La dissolution se fait dans un volume légèrement supérieur de tampon (ex: 170 mL de tampon TBE 1X pour compenser l'évaporation lors du chauffage). **Étapes de préparation et de migration :** 1. **Préparation des gels d'agarose :** Peser l'agarose, ajouter le tampon, chauffer jusqu'à dissolution complète, laisser refroidir (55-65 °C), couler dans le support de gel, laisser solidifier, retirer le peigne et les butoirs. 2. **Montage de la cuve à électrophorèse :** Placer le gel dans la cuve, puits côté cathode (borne négative). Remplir la cuve avec le tampon de migration jusqu'à immerger le gel et remplir les puits. 3. **Préparation des échantillons :** Mélanger les échantillons d'ADN avec le colorant de dépôt. 4. **Dépôt des échantillons :** Introduire délicatement le volume défini d'échantillon dans chaque puits, en évitant les bulles d'air, le débordement ou la perforation du fond du puits. Un fond noir peut aider à visualiser le dépôt. 5. **Migration :** Fermer la cuve, la relier au générateur, régler la tension (ex: entre 70 V et 120 V). Laisser migrer jusqu'à ce que les marqueurs de migration atteignent une distance souhaitée (ex: 2 cm du bord opposé). 6. **Révélation :** * Si le gel contient un colorant déjà incorporé (ex: Safegreen), observer directement sous transilluminateur adapté. * Si un colorant externe est utilisé (ex: Azure A), le gel doit être coloré après migration. * Coloration : Immerger le gel dans une solution d'Azure A (ex: 0,04 g dans 100 mL d'éthanol à 20 %) pendant 4 minutes. * Décoloration et rinçage : Éliminer l'excès de colorant, rincer avec de l'alcool à 70 % puis à l'eau du robinet pour éliminer le colorant non fixé. L'intensité maximale de coloration est atteinte après quelques heures, et les bandes sont plus visibles au réfrigérateur. * Observer le gel révélé sur une lampe. > **Tip:** La tension appliquée lors de l'électrophorèse influence la vitesse et la précision de la migration. Une tension plus basse (ex: 70 V) assure une migration plus précise mais plus longue, tandis qu'une tension plus élevée (ex: 120 V) accélère le processus au détriment de la résolution. ### 2.5 Séquençage Le séquençage d'acides nucléiques est une technique qui permet de déterminer l'ordre exact des nucléotides (A, T, C, G) dans une molécule d'ADN. Les élèves en première spécialité SVT peuvent mener une étude documentaire sur le séquençage des macromolécules. Cette technique est cruciale pour comprendre la structure et la fonction des gènes, identifier les mutations, et est à la base de l'analyse du profil génétique. ### 2.6 Analyse de profil génétique L'analyse de profil génétique, souvent appelée "empreinte génétique" ou "profil ADN", est une application majeure de la biologie moléculaire. Elle consiste à analyser des régions spécifiques du génome d'un individu qui varient d'une personne à l'autre, permettant ainsi d'identifier un individu de manière unique ou de déterminer des liens de parenté. Les techniques utilisées incluent la restriction enzymatique suivie d'une électrophorèse (anciennement, RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) et, plus couramment aujourd'hui, l'analyse de microsatellites ou de polymorphismes d'un seul nucléotide (SNP). Le profil génétique est essentiel dans les enquêtes médico-légales pour identifier des suspects ou des victimes, et en médecine pour le diagnostic de maladies génétiques ou la compatibilité lors de greffes. L'électrophorèse, décrite précédemment, est une étape clé dans l'obtention d'un profil génétique en séparant des fragments d'ADN de tailles différentes, révélant ainsi des variations génétiques spécifiques. La combinaison de ces différentes techniques (PCR pour amplifier des régions ciblées, restriction enzymatique pour cliver l'ADN, et électrophorèse pour séparer les fragments) permet de construire un profil génétique discriminant. --- # Place de la biologie moléculaire dans les programmes scolaires L'intégration de la biologie moléculaire dans les programmes scolaires français, particulièrement en sciences de la vie et de la Terre (SVT) et en option biotechnologie, vise à familiariser les élèves avec les concepts et techniques fondamentaux de cette discipline. ### 3.1 La biologie moléculaire en classe de seconde #### 3.1.1 Enseignement de spécialité SVT En classe de seconde, le programme de SVT introduit les élèves aux notions fondamentales de la biologie moléculaire dans le contexte de la cellule. Les élèves apprennent que toutes les cellules d'un organisme proviennent d'une cellule unique et possèdent initialement la même information génétique sous forme d'ADN. Ils comprennent que, malgré cette uniformité, les cellules se spécialisent en n'exprimant qu'une partie de cet ADN. Les notions clés abordées incluent : * Cellule, matrice extracellulaire/paroi, tissu, organe * Organite, spécialisation cellulaire * ADN, double hélice, nucléotides (adénine, thymine, cytosine, guanine) * Complémentarité des bases azotées * Gène et séquence d'ADN L'objectif pédagogique est de lier la fonction spécifique des cellules spécialisées à leur organisation et de montrer comment la structure moléculaire de l'ADN permet le stockage de l'information génétique. #### 3.1.2 Option Biotechnologie L'option biotechnologie en classe de seconde introduit également les élèves aux principes et aux applications de la biologie moléculaire. ### 3.2 La biologie moléculaire en classe de première spécialité SVT En classe de première, le programme de spécialité SVT approfondit les concepts de biologie moléculaire et intègre des capacités pratiques et d'investigation. #### 3.2.1 Capacités et objectifs pédagogiques Les élèves sont amenés à développer des compétences telles que : * Concevoir et réaliser une réaction de PCR (amplification en chaîne par polymérase), incluant le calcul du nombre de copies obtenues après chaque cycle. * Concevoir et mettre en œuvre un protocole expérimental pour étudier l'effet d'un agent mutagène sur la survie cellulaire et l'apparition de mutants. * Mener des démarches historiques ou des études documentaires sur le séquençage des macromolécules (protéines, ARN, ADN). #### 3.2.2 Exemple d'activité : l'électrophorèse Une activité typique vise à réaliser un profil génétique par électrophorèse, illustrant concrètement une étape clé de la biologie moléculaire. Les objectifs pour l'élève sont de manipuler le matériel et les réactifs nécessaires à cette technique. ##### 3.2.2.1 Principe de l'électrophorèse L'électrophorèse est une technique qui permet de séparer des ions (molécules chargées électriquement) sous l'action d'un champ électrique. Les espèces chargées négativement (anions) migrent vers l'anode (pôle positif), tandis que les espèces chargées positivement (cations) migrent vers la cathode (pôle négatif). En biologie moléculaire, l'électrophorèse sur gel d'agarose est utilisée pour séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille. L'ADN, portant une charge négative à pH neutre, migre vers l'anode (pôle positif). Les applications de l'électrophorèse sur gel d'agarose comprennent : * La détermination de la taille de fragments d'ADN par comparaison avec un marqueur de taille. * L'estimation de la quantité d'ADN présente. * La purification d'un fragment d'ADN spécifique à partir d'un gel. ##### 3.2.2.2 Le gel d'agarose L'agarose est un polysaccharide extrait de l'agar, utilisé pour former des gels. Il se dissout dans l'eau bouillante et forme un gel en refroidissant. La taille des pores du gel est inversement proportionnelle à la concentration d'agarose : une concentration plus élevée entraîne un maillage plus fin, permettant une meilleure résolution pour séparer de petits fragments d'ADN. * **Gel à 0,8 % :** convient pour des fragments d'ADN de plus grande taille. * **Gel à 1,25 % :** offre une résolution intermédiaire. * **Gel à 2 % :** idéal pour la séparation de petits fragments d'ADN. ##### 3.2.2.3 Le tampon de migration Le tampon de migration assure la conductivité électrique de la solution et maintient le pH. Les tampons couramment utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (TAE) et le Tris/Borate/EDTA (TBE). Le tampon TAE offre une meilleure séparation pour les grands fragments d'ADN, tandis que le tampon TBE est également très utilisé, souvent sous forme diluée (par exemple, TBE 0,5X). ##### 3.2.2.4 Préparation et réalisation de l'électrophorèse (Exemple pratique) Pour une manipulation telle que l'analyse d'un "ADN suspect", la préparation implique : * La fabrication de gels d'agarose à la concentration appropriée (ex. 0,8 %). Les calculs pour la préparation du gel sont essentiels, par exemple : pour 150 mL de gel à 0,8 %, il faut 1,2 gramme d'agarose calculé comme suit : $m_{\text{agarose}} = \frac{0,8 \times 150}{100} = 1,2 \text{ g}$. * Le montage de la cuve d'électrophorèse, en plaçant le gel et en le remplissant de tampon de migration. Les puits doivent être orientés vers la cathode (borne négative). * La préparation des échantillons d'ADN, souvent additionnés d'un "bleu de dépôt" qui alourdit les échantillons et permet de visualiser leur migration. * Le dépôt précis des échantillons dans les puits du gel (par exemple, 15 µL par puits), en évitant les bulles et en ne perçant pas le fond. * La migration des fragments d'ADN sous l'effet d'un courant électrique appliqué par un générateur (généralement entre 70 V et 120 V), jusqu'à ce que les bandes atteignent une distance appropriée sur le gel. ##### 3.2.2.5 Révélation des bandes d'ADN Comme l'ADN n'est pas visible à l'œil nu, des colorants sont utilisés pour révéler les bandes d'ADN après migration. Des colorants comme le Safegreen peuvent être mélangés directement aux produits, permettant une visualisation immédiate avec un transilluminateur. Alternativement, le gel peut être coloré après migration, par exemple avec de l'Azur A, suivi d'une décoloration pour faire ressortir les bandes d'ADN. Les bandes apparaissent plus intensément après quelques heures et peuvent être observées sur une lampe UV ou une lampe appropriée. > **Tip:** La concentration d'agarose doit être choisie en fonction de la taille des fragments d'ADN à séparer. Plus les fragments sont petits, plus la concentration d'agarose doit être élevée pour une meilleure résolution. > **Example:** Dans le cadre d'une enquête policière simulée, l'électrophorèse permettrait de comparer l'ADN d'une scène de crime avec celui de suspects pour identifier une correspondance. Les différentes bandes observées sur le gel représentent des fragments d'ADN de tailles distinctes, formant un "profil génétique" unique. --- # L'électrophorèse sur gel d'agarose et ses protocoles Voici une synthèse sur l'électrophorèse sur gel d'agarose et ses protocoles. ## 4. L'électrophorèse sur gel d'agarose et ses protocoles L'électrophorèse sur gel d'agarose est une technique fondamentale en biologie moléculaire utilisée pour séparer des fragments d'ADN en fonction de leur taille. ### 4.1 Principe de la séparation des molécules d'ADN L'électrophorèse est une méthode permettant de déplacer des ions sous l'effet d'un champ électrique. Les molécules d'ADN, intrinsèquement chargées négativement en raison de leur squelette phosphate, migrent vers l'anode (le pôle positif) lorsqu'elles sont placées dans un tampon conducteur et soumises à un champ électrique. La vitesse de migration est inversement proportionnelle à la taille des fragments d'ADN : les fragments plus petits se déplacent plus rapidement à travers la matrice du gel que les fragments plus grands. Cela permet donc une séparation basée sur la taille. > **Tip:** À pH neutre, les molécules d'ADN sont toujours chargées négativement, ce qui garantit leur migration vers l'anode (pôle positif). L'électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée pour plusieurs applications : * Identifier la taille de fragments d'ADN par comparaison avec un marqueur de taille. * Estimer la quantité d'ADN présente. * Purifier un fragment d'ADN spécifique directement à partir du gel. ### 4.2 Composition du gel d'agarose Le gel d'agarose constitue la matrice semi-solide à travers laquelle les molécules d'ADN migrent. #### 4.2.1 L'agarose L'agarose est un polysaccharide extrait de l'agar, composé d'unités répétitives de diholosides. Il est utilisé pour créer la structure du gel. L'agarose se présente sous forme de poudre blanche qui, une fois dissoute dans de l'eau bouillante, forme une solution. En refroidissant en dessous de 40 °C, cette solution se transforme en un gel solide. #### 4.2.2 Concentration d'agarose et taille des pores La concentration d'agarose dans le gel détermine la taille des pores du réseau gélifié : * Une concentration d'agarose plus élevée entraîne un maillage plus serré et des pores plus petits. * Un maillage plus serré offre une meilleure résolution pour la séparation des fragments d'ADN de petite taille. * Inversement, un pourcentage d'agarose plus faible crée des pores plus grands, mieux adaptés à la séparation de fragments d'ADN de grande taille. Les concentrations couramment utilisées varient en fonction de l'application : * Gel à 0,8 % : pour des fragments de grande taille. * Gel à 1,25 % : concentration intermédiaire. * Gel à 2 % : pour des fragments de petite taille et une haute résolution. ### 4.3 Les tampons de migration Le tampon de migration remplit plusieurs fonctions essentielles : * Il assure la conductivité électrique nécessaire au déplacement des molécules d'ADN. * Il maintient un pH stable tout au long de l'expérience, ce qui est crucial pour la charge négative de l'ADN et la stabilité du gel. Les tampons les plus fréquemment utilisés sont : * **TAE** (Tris-Acétate-EDTA) : Offre la plus faible capacité tampon mais permet une meilleure séparation pour les fragments d'ADN de grande taille. * **TBE** (Tris-Borate-EDTA) : Très couramment utilisé, il possède un bon pouvoir tampon. * **SB** (Sodium Borate). > **Tip:** Une concentration de 0,5X pour les tampons TAE ou TBE est souvent préférée pour optimiser la migration. ### 4.4 Protocoles pratiques La réalisation d'une électrophorèse sur gel d'agarose implique plusieurs étapes clés, de la préparation du gel à la révélation des résultats. #### 4.4.1 Préparation des gels d'agarose Pour préparer un gel d'agarose, il faut peser la quantité appropriée d'agarose et la dissoudre dans le volume adéquat de tampon de migration (généralement dilué à 1X). La solution est ensuite chauffée jusqu'à obtenir une transparence complète, puis refroidie avant d'être coulée dans un support de gel. Un peigne est inséré avant la solidification pour créer les puits où seront déposés les échantillons d'ADN. **Exemple de calcul pour la préparation d'un gel :** Pour préparer 150 mL d'un gel d'agarose à 0,8 %, on calcule la masse d'agarose nécessaire : $$ m_{\text{agarose}} = \frac{\% \text{ agarose} \times \text{ Volume du gel}}{\text{100}} $$ $$ m_{\text{agarose}} = \frac{0,8 \times 150 \text{ mL}}{100} = 1,2 \text{ g d'agarose} $$ Cette quantité d'agarose est dissoute dans environ 170 mL de tampon TBE 1X (en ajoutant un volume supplémentaire pour compenser l'évaporation lors du chauffage). #### 4.4.2 Montage de la cuve d'électrophorèse Le support de gel est placé dans la cuve d'électrophorèse, avec les puits orientés vers la cathode (borne négative, généralement de couleur noire). La cuve est ensuite remplie de tampon de migration jusqu'à immerger complètement le gel et remplir les puits. #### 4.4.3 Préparation et dépôt des échantillons Les échantillons d'ADN à analyser sont mélangés avec un "bleu de dépôt". Ce produit est un mélange de colorants et d'un agent alourdissant (comme du glycérol) qui permet de visualiser la progression de la migration dans le gel et de s'assurer que les échantillons coulent bien dans les puits sans se disperser. Il est crucial de respecter le volume de dépôt recommandé (par exemple, 15 microlitres) et de déposer l'échantillon avec précaution pour éviter de percer le fond du puits ou de créer des bulles d'air. > **Tip:** Pour faciliter le dépôt, placez une surface noire sous la cuve afin de mieux visualiser le fond des puits. Il est recommandé de démarrer la migration peu de temps après le dépôt des échantillons. #### 4.4.4 Migration Une fois les échantillons déposés, le couvercle de la cuve est fermé, et la cuve est connectée au générateur électrique. La tension (généralement entre 70 et 120 Volts) est réglée. Une tension plus basse permet une migration plus précise mais plus longue, tandis qu'une tension plus élevée accélère la migration au détriment de la résolution. La migration est arrêtée lorsque le front du colorant de dépôt atteint environ 2 cm du bord opposé du gel (côté anode). #### 4.4.5 Révélation L'ADN lui-même n'est pas visible à l'œil nu. Un agent de révélation est donc nécessaire pour visualiser les bandes d'ADN après la migration. Il existe deux options principales : 1. **Colorants incorporés au gel :** Certains kits utilisent des colorants (comme le Safegreen) qui sont déjà mélangés aux échantillons ou au gel. Les bandes d'ADN deviennent visibles directement sous une lampe appropriée (transilluminateur). 2. **Coloration post-migration :** Si aucun colorant n'a été incorporé, le gel doit être coloré après la migration. * L'**Azur A** est un colorant bleu couramment utilisé. Le gel est immergé dans une solution d'Azur A, puis rincé. Une décoloration partielle permet de faire ressortir les bandes d'ADN. * Le processus typique avec l'Azur A implique une coloration de 4 minutes, suivie d'un rinçage avec de l'éthanol à 70 % pour éliminer l'excès de colorant, puis un rinçage à l'eau. L'intensification des bandes peut prendre quelques heures et est accélérée par le stockage au réfrigérateur. > **Exemple:** Après révélation, les différentes bandes observées sur le gel d'électrophorèse représentent des fragments d'ADN de tailles distinctes. En comparant leur position avec celle d'un marqueur de taille connu, il est possible de déterminer la longueur de chaque fragment. --- ## Erreurs courantes à éviter - Révisez tous les sujets en profondeur avant les examens - Portez attention aux formules et définitions clés - Pratiquez avec les exemples fournis dans chaque section - Ne mémorisez pas sans comprendre les concepts sous-jacents

| Term | Definition | |------|------------| | Biologie moléculaire | Discipline de la biologie étudiant les processus biologiques au niveau moléculaire, notamment la structure et la fonction des acides nucléiques et des protéines. | | Acides nucléiques | Molécules essentielles à la vie, qui transportent l'information génétique (ADN) ou participent à sa synthèse protéique (ARN). | | ADN | Acide désoxyribonucléique, molécule qui contient les instructions génétiques pour le développement, le fonctionnement, la croissance et la reproduction de tous les organismes vivants connus et de nombreux virus. | | ARN | Acide ribonucléique, molécule impliquée dans la synthèse des protéines et la régulation de l'expression des gènes. | | Gène | Unité fondamentale de l'hérédité, segment d'ADN qui code pour une protéine ou une molécule d'ARN fonctionnelle. | | Génome | Ensemble complet du matériel génétique d'un organisme, incluant tous ses gènes. | | Protéine | Macromolécule biologique composée d'une ou plusieurs chaînes d'acides aminés, qui remplit une multitude de fonctions dans les organismes. | | Allèle | Une des formes possibles d'un même gène, variant d'un individu à l'autre et déterminant une caractéristique particulière. | | Génie génétique | Ensemble des techniques de manipulation des acides nucléiques, permettant de modifier le patrimoine génétique d'un organisme. | | PCR (Réaction en chaîne par polymérase) | Technique de biologie moléculaire permettant d'amplifier de manière exponentielle un fragment d'ADN spécifique, in vitro. | | Électrophorèse | Technique de séparation de molécules chargées électriquement (comme l'ADN ou les protéines) sous l'action d'un champ électrique, généralement dans un gel. | | Gel d’agarose | Matrice poreuse formée à partir d'agarose, utilisée en électrophorèse pour séparer des fragments d'ADN ou d'ARN en fonction de leur taille. | | Tampon de migration | Solution aqueuse contenant des ions qui assure la conductivité électrique nécessaire à la migration des molécules chargées pendant l'électrophorèse et maintient un pH stable. | | Anode | Électrode positive d'une cellule électrochimique, vers laquelle migrent les ions négativement chargés (anions). | | Cathode | Électrode négative d'une cellule électrochimique, vers laquelle migrent les ions positivement chargés (cations). | | Transilluminateur | Appareil émettant une lumière UV ou visible, utilisé pour visualiser des échantillons fluorescents ou des bandes d'ADN marquées dans un gel d'électrophorèse. | | Profil génétique | Ensemble de caractéristiques uniques d'un individu déterminées par son ADN, souvent utilisé dans des analyses forensiques ou d'identification. | | Bleu de dépôt | Colorant teinté ajouté aux échantillons d'ADN avant le dépôt dans les puits du gel d'électrophorèse ; il permet de visualiser la progression de la migration et alourdit l'échantillon. |

# Chronische virale infectie Chronische virale infecties kenmerken zich door de langdurige aanwezigheid van het virus in het lichaam, wat kan leiden tot accumulerende schade bij de gastheer en het virus een potentiële bron van infectie maakt [4](#page=4). ### 1.1 Kenmerken van chronische virale infectie Een chronische virale infectie wordt gedefinieerd door het feit dat het virus niet op korte termijn uit het lichaam wordt geklaard. De reden hiervoor is dat de geïnfecteerde cellen lang genoeg in leven blijven om de virale aanwezigheid te onderhouden. Dit kan zich op verschillende manieren manifesteren: soms is er geen continue replicatie, maar is het virale genoom latent aanwezig in de cel. In dat geval kan er wel expressie van virale genen plaatsvinden, maar zonder het kopiëren van het genoom en zonder het vrijlaten van nieuwe virale deeltjes [4](#page=4). Het gevolg van deze persisterende aanwezigheid is dat de gastheer accumulerende schade kan ondervinden. Bovendien blijft de gastheer een potentiële bron van infectie voor anderen [4](#page=4). > **Voorbeelden van chronische virale infecties:** > * Hepatitis C virus (HCV): 15 tot 25% van de geïnfecteerden klaart het virus binnen de 6 maanden na infectie. De overigen klaren het virus zelden spontaan zonder therapie [4](#page=4). > * Herpesvirus infecties: deze infecties duren levenslang [4](#page=4). > * Humaan Immunodeficiëntie Virus (HIV): bij deze infectie is spontane klaring nagenoeg nooit waargenomen [4](#page=4). ### 1.2 Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) als schoolvoorbeeld HIV wordt beschouwd als een schoolvoorbeeld van een chronische virale infectie. Dit virus infecteert uitsluitend de mens. Er zijn twee hoofdtypen: HIV-1 is pandemisch, terwijl HIV-2 voornamelijk voorkomt in West-Afrika en minder virulent is. HIV is een retrovirus, wat betekent dat het een RNA-genoom heeft dat zich in de vorm van een DNA-kopie inbouwt in het genoom van de gastheercel [4](#page=4). ### 1.3 Persisterende aanwezigheid van het virus De kern van een chronische virale infectie is de persisterende aanwezigheid van het virus. Dit impliceert dat het virus erin slaagt om het immuunsysteem van de gastheer te ontwijken en een stabiele infectie tot stand te brengen die niet door het lichaam wordt opgeruimd. De levensduur van de geïnfecteerde cellen speelt hierin een cruciale rol, aangezien deze lang genoeg moeten blijven bestaan om de virale replicatie of latentie te ondersteunen [4](#page=4). ### 1.4 Potentiële schade aan de gastheer De langdurige aanwezigheid van het virus kan leiden tot diverse vormen van schade aan de gastheer. Deze schade kan direct zijn, door de replicatie van het virus in specifieke celtypen, of indirect, door de immuunrespons die het virus oproept. Bij HIV leidt dit bijvoorbeeld tot een geleidelijke vernietiging van CD4+ T-cellen, wat resulteert in een verzwakt immuunsysteem en uiteindelijk tot Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). Bij Hepatitis C kan chronische infectie leiden tot levercirrose en hepatocellulair carcinoom [2](#page=2) [4](#page=4). ### 1.5 Immuunevasie door virussen Virussen die chronische infecties veroorzaken, hebben vaak specifieke mechanismen ontwikkeld om het immuunsysteem van de gastheer te ontwijken. Dit proces, immuunevasie genoemd, stelt het virus in staat om detectie en eliminatie door het immuunsysteem te omzeilen. Deze mechanismen kunnen gericht zijn tegen zowel de aangeboren als de verworven immuniteit [2](#page=2). #### 1.5.1 Evasie van aangeboren immuniteit Virussen kunnen de aangeboren immuniteit ontwijken door bijvoorbeeld de herkenning door Toll-like receptoren (TLR's) te belemmeren of door de productie van interferonen te onderdrukken [2](#page=2). #### 1.5.2 Evasie van verworven immuniteit Voor de verworven immuniteit kunnen virussen de presentatie van virale antigenen op MHC-moleculen beïnvloeden, de functie van T-cellen of B-cellen remmen, of de productie van antistoffen ontwijken [2](#page=2). ### 1.6 Diagnostiek en opvolging De diagnostiek en opvolging van chronische virale infecties zijn essentieel om de voortgang van de ziekte te monitoren en de effectiviteit van de behandeling te evalueren. Dit kan inhouden: het detecteren van viraal DNA of RNA, de aanwezigheid van virale eiwitten, of de immuunrespons van de gastheer (bijvoorbeeld antistoffen). Bij HIV omvat de diagnose bijvoorbeeld serologische testen en PCR-methoden [2](#page=2). ### 1.7 Reactivatie Bij sommige chronische virale infecties, met name latente infecties zoals herpesvirussen, kan het virus onder bepaalde omstandigheden (bv. bij immuunsuppressie) reactiveren en opnieuw actief repliceren, wat leidt tot ziekteverschijnselen [1](#page=1). --- # Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) Dit document beschrijft het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), inclusief de infectie, transmissie, immuunpathologie, de progressie naar AIDS, diagnosemethoden en behandelingsstrategieën met specifieke inhibitoren, evenals de levenscyclus van retrovirussen [11](#page=11). ### 2.1 HIV infectie HIV infecteert voornamelijk CD4+ T-cellen en mononucleair fagocyterende cellen, zoals macrofagen, monocyten, dendritische cellen en microgliale cellen in het centraal zenuwstelsel. Deze infectie leidt tot veranderingen in de functie en levensduur van deze cellen, wat resulteert in immuundeficiëntie en neurologische symptomen zoals dementie. Een genetische variant, de CCR5 homogene deletie, komt voor bij ongeveer 1% van de gezonde blanken en maakt hen ongevoelig voor HIV-infectie wanneer CCR5 als co-receptor wordt gebruikt [12](#page=12). ### 2.2 Transmissie HIV De belangrijkste transmissieroutes van HIV omvatten seksueel contact, intraveneus druggebruik en bloedtransfusies. Hoewel de heteroseksuele route van transmissie historisch beter is vastgesteld in resource-arme landen, neemt het belang ervan ook toe in resource-rijke landen [13](#page=13). ### 2.3 HIV immuunpathologie Na mucosale transmissie worden dendritische cellen geïnfecteerd en transporteren ze het virus naar lymfeknopen en lymfoïde weefsels, wat leidt tot massale infectie van T-cellen. Initieel kan dit resulteren in een griepaal syndroom en lymfadenopathieën, met hoge virale titers en een snelle daling van CD4+ cellen in het perifeer bloed. Binnen zes weken controleert het immuunsysteem het virus meestal, met een daling van de virale titer en herstel van CD4+ counts dankzij de respons van cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en neutraliserende antilichamen, wat leidt tot seroconversie binnen tien weken. Hierna volgt een periode van persistentie, soms met tekenen van continue immuunactivatie en een geleidelijke afname van CD4+ counts over jaren. Na gemiddeld tien jaar versnelt de virale titer, en de CD4+ counts dalen drastisch, wat leidt tot ernstige opportunistische infecties en overlijden binnen een jaar zonder behandeling [14](#page=14). Het chronische karakter van HIV-infectie wordt deels verklaard door het continue muteren van het virus. Patiënten die het MHC-allotype HLA-B5703 tot expressie brengen, vertonen lagere virushoeveelheden in het bloed en een tragere progressie naar AIDS. Virusisolaten bij deze patiënten vertonen vaak mutaties in het p24 gag-eiwit, met name in de regio's aminozuur 147-155 (ISW9), 240-249 (KF11) en 162-172 (TW10). De plasma virale load vertegenwoordigt het aantal HIV-virussen per milliliter plasma [25](#page=25). ### 2.4 AIDS AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) manifesteert zich bij een instorting van de immuniteit, gedefinieerd door CD4+ counts die lager zijn dan 200 cellen per microliter bloed. Dit leidt tot ernstige opportunistische infecties zoals spruw, *Pneumocystis jirovecii* pneumonie, diarree veroorzaakt door *Giardia lamblia*, *Cryptosporidium* en *Microsporidia*. Bij CD4+ counts onder de 100 cellen/µL kunnen toxoplasmose, CMV-reactivatie, cryptokokkenmeningitis en atypische mycobacteriën optreden. Verder is er een verhoogd risico op neoplastische aandoeningen zoals Kaposi-sarcoom en lymfomen. AIDS wordt ook gekenmerkt door AIDS wasting (>10% gewichtsverlies, koorts, cachexie) en dementie. De onderstaande condities zijn AIDS-definiërend: hairy leukoplakie (door Epstein-Barr virus), orale candidiasis, Kaposi-sarcoom, *Pneumocystis* pneumonie, CMV-retinitis en cryptosporidiose. Met therapie is terugkeer naar een asymptomatische fase mogelijk, maar zonder behandeling is de prognose slecht [15](#page=15). ### 2.5 Diagnose HIV infectie De diagnose van een HIV-infectie omvat meerdere stappen [16](#page=16): 1. **Opsporen van antilichamen (seropositiviteit)**: Dit gebeurt via ELISA-tests en kan door niet-gespecialiseerde artsen worden uitgevoerd. Bij acute infectie bestaat er een "windowfase", waarvoor huidige 4e generatie testen ook p24-antigeen detecteren. Ondanks de hoge specificiteit van de testen, kan een hoge aantal tests in populaties met een lage prevalentie resulteren in een beperkte positieve predictieve waarde, waardoor een positieve ELISA bevestigd moet worden met een tweede ELISA van een andere fabrikant en een western blot in een referentielaboratorium [16](#page=16). 2. **Bevestiging seropositiviteit**: Alleen door HIV-specialisten en gespecialiseerde laboratoria. Hierbij wordt de virale lading aangetoond met behulp van RT-PCR, wat belangrijk is voor het starten van therapie en het bepalen van baseline-resistentie door middel van sequentiebepaling van mutaties in RT-, integrase- en proteasegenen. RT-PCR is ook gevoeliger voor vroege diagnose en wordt gebruikt voor screening van bloeddonoren om het risico te minimaliseren [16](#page=16). 3. **Opvolging van patiënten**: Dit gebeurt in gespecialiseerde referentiecentra en omvat klinische opvolging (bijwerkingen therapie) en virologische opvolging (virale lading, eventueel sequentiebepaling) [16](#page=16). Analoge diagnostische en opvolgingsstrategieën, inclusief serologie en genoomdetectie, worden ook gebruikt voor andere chronische virale infecties zoals HCV en HBV [16](#page=16). De opvolging van CD4+ counts via flowcytometrie is cruciaal voor het monitoren van de immuunstatus van de patiënt. Zonder behandeling is er een geleidelijke uitdoving van CD4+ T-cellen. De virale load wordt gemeten met RT-PCR en toont het verloop van de HIV-infectie en de immuunrespons [17](#page=17) [18](#page=18). ### 2.6 Behandeling HIV infectie: specifieke inhibitoren De behandeling van HIV-infectie berust op combinatie antiretrovirale therapie (cART), klassiek bestaande uit tripletherapie: twee nucleoside analoog reverse transcriptase inhibitoren (NRTIs) plus een non-nucleoside analoog reverse transcriptase inhibitor (NNRTI) of een protease-inhibitor (PI). Tegenwoordig zijn er ook fusieremmers, bindingsremmers (die CCR5 blokkeren) en integraseremmers beschikbaar. Behandeling wordt gestart bij een daling van de immuniteit, vanaf ongeveer 400 tot 500 CD4+ cellen/µL. Bij AIDS worden opportunistische infecties behandeld, waarbij rekening gehouden moet worden met het immuunreconstitutiesyndroom (IRIS). IRIS treedt op wanneer het herstellende immuunsysteem, gestimuleerd door antiretrovirale therapie, plotseling de aanwezige opportunistische infecties detecteert en ertegen gaat vechten, wat kan leiden tot klinische verslechtering. Daarom wordt soms eerst een infectie zoals TBC behandeld voordat de maximale antiretrovirale therapie wordt gestart [19](#page=19). Preventie van HIV omvat geen vaccin, maar veilige praktijken (bloedhygiëne en seksueel contact) en behandeling van dragers, aangezien het transmissierisico stijgt met de virale load. Post-expositie profylaxe (PEP) is beschikbaar na bijvoorbeeld een prikongeval of verkrachting. Genezing is tot op heden slechts in enkele gevallen geregistreerd, onder andere door transplantatie met HIV-ongevoelig beenmerg (CCR5-/-) of zeer snelle therapie na infectie [19](#page=19). > **Tip:** Het immuunreconstitutiesyndroom (IRIS) is een belangrijk concept bij de behandeling van AIDS-patiënten. Het illustreert hoe symptomen van een infectieziekte vaak voortkomen uit de immuunrespons en niet direct uit schade door de kiem zelf. ### 2.7 Levenscyclus retrovirus De levenscyclus van een retrovirus omvat de volgende stappen [20](#page=20): * **Ligand-receptorherkenning**: Het virus bindt aan de CD4+ receptor en co-receptor op de gastheercel [20](#page=20). * **Fusie**: Het virale envelop fusioneert met het celmembraan of endosoom [20](#page=20). * **Reverse transcriptie**: Het nucleocapside komt in het cytoplasma, waarna reverse transcriptase (RT) het virale genoom omzet in cDNA en vervolgens in dubbelstrengs DNA (dsDNA). RT maakt veel fouten, wat leidt tot variabiliteit en de creatie van pseudospecies [20](#page=20). * **Integratiecomplex**: Het dsDNA vormt een pre-integratiecomplex dat naar de celkern getransporteerd wordt [20](#page=20). * **Integratie**: Met behulp van integrase wordt het virale DNA geïntegreerd in het gastheersgenoom (provirus) [20](#page=20). * **Transcriptie**: Het provirus wordt getranscribeerd tot viraal RNA door cellulaire enzymen, waarbij geen extra mutaties optreden. Splicing kan plaatsvinden [20](#page=20). * **Assemblage en budding**: Nucleocapsiden assembleren en de virusdeeltjes knoppen af vanaf het celmembraan [20](#page=20). * **Maturatie**: Na release ondergaat het nucleocapside een interne reorganisatie onder invloed van virale proteaseactiviteit, resulterend in een rijp en infectieus virion [20](#page=20). Humaan herpesvirus 8 (HHV8) wordt geassocieerd met Kaposi-sarcoom. Hoewel HHV8 regionaal wijdverspreid kan zijn, draagt het slechts onder bepaalde omstandigheden, zoals immuunsuppressie, bij aan het ontstaan van Kaposi-sarcomen. HTLV-1 kan T-cel leukemieën veroorzaken door insertionele mutagenese. HIV zelf kan, naast Kaposi-sarcoom, ook lymfomen veroorzaken, maar het virusgenoom is niet altijd in de kankercellen van deze tumoren aan te tonen [10](#page=10) [32](#page=32) [7](#page=7). --- # Immuunevasie door virussen Virussen hebben diverse strategieën ontwikkeld om te ontsnappen aan de aangeboren en verworven immuunrespons van de gastheer [21](#page=21) [23](#page=23). ### 21.4.1 Evasie aangeboren immuniteit Virussen kunnen de aangeboren immuniteit ontwijken door verschillende mechanismen. Een van de strategieën is het zich verbergen binnen geïnfecteerde cellen, waardoor de rol van antilichamen beperkt blijft tot het voorkomen van infectie en overdracht in de extracellulaire ruimte [21](#page=21) [22](#page=22) [23](#page=23) [24](#page=24). Virussen kunnen ook de aangeboren cellulaire detectie van virale structuren, zoals dubbelstrengs RNA (dsRNA), tegengaan. Dit kan gebeuren door de sensing-mechanismen zelf te ontwijken (bv. influenza NS1). Daarnaast kunnen virussen de signaaltransductie na sensing te onderbreken, bijvoorbeeld door het gebruik van decoy-receptoren voor interferon (IFN) die de expressie van IFN-gestimuleerde genen (ISGs) blokkeren, zoals waargenomen bij Vaccinia en andere poxvirussen, of door decoy-eiwitten voor Interferon Regulatory Factors (IRFs) te gebruiken die de expressie van ISGs blokkeren, zoals bij HHV8. Verder kunnen virussen de effectorfuncties van ISGs tegengaan, zoals de remming van proteïne kinase R (PKR) door virale eiwitten zoals NS1 (influenza), NS5a (HCV), Us11 en ICP34.5 (HSV1), en E3L (Vaccinia) [22](#page=22). Andere strategieën omvatten: * **Non-invasiviteit**: Virussen zoals HPV hebben weinig tot geen manifeste blootstelling aan het immuunsysteem en geven geen gevaarsignalen af [21](#page=21) [23](#page=23) [27](#page=27). * **Verberging**: Latente virussen zoals HIV uiten weinig tot geen virale eiwitten, waardoor ze aan detectie ontsnappen [21](#page=21) [23](#page=23) [27](#page=27). > **Tip:** Begrijp hoe virussen gebruik maken van de eigen detectiemechanismen van de cel tegen de cel zelf. ### 21.4.2 Evasie verworven immuniteit Virussen ontwijken de verworven immuniteit op verschillende manieren. Een cruciale methode is het belemmeren van de presentatie van antigenen via het Major Histocompatibility Complex klasse I (MHC-I) [23](#page=23) [24](#page=24) [27](#page=27) [28](#page=28). Normaal gesproken presenteren geïnfecteerde cellen intracellulaire antigenen via MHC-I moleculen op hun oppervlak, die herkend worden door CD8+ T-cellen, wat leidt tot de eliminatie van de geïnfecteerde cel. Virussen introduceren echter mechanismen om deze presentatie te verstoren [24](#page=24) [28](#page=28). * **Belemmering MHC-I presentatie**: * HIV Nef vermindert de oppervlakte-expressie van HLA-A en HLA-B, maar niet van HLA-C en HLA-E. Deze laatste zijn belangrijk voor NK-cel activatie, omdat NK-cellen normaal gesproken MHC-I negatieve cellen lyseren [24](#page=24). * Andere virussen verhogen de endocytose van MHC-I door ubiquitinatie, houden MHC-I intracellulair vast, of remmen de TAP (Transporter Associated with Antigen Processing) loading van peptiden op MHC-I moleculen, zoals CMV US6 die dit proces inhibeert, met uitzondering van HLA-E [24](#page=24). * Sommige virussen produceren eiwitten die NK-cel functies inhiberen, bijvoorbeeld door interferentie met NK-receptoren zoals NKG2D en CD94:NKG2A, of door de expressie van MIC-A en -B te verhinderen [28](#page=28). * **Ontlopen van MHC-I presentatie door mutatie**: Virussen kunnen mutaties ondergaan die leiden tot verminderde antigenpresentatie, bekend als CTL-escape mutaties (bv. bij HIV). Dit omvat ook antigene variabiliteit, waarbij virussen snel muteren en een "quasisoort" vormen, zoals bij HIV [27](#page=27). * **Antigene variabiliteit**: Virussen kunnen hun oppervlakte-antigenen constant veranderen om te ontsnappen aan antilichamen. Een voorbeeld hiervan is *Trypanosoma brucei* (een protozoön), de verwekker van slaapziekte. Het oppervlak van deze parasiet bestaat uit variabele oppervlakte-glycoproteïnen (VSG's). Door genconversie kan de trypanosoom verschillende VSG's tot expressie brengen, waardoor het immuunsysteem telkens opnieuw moet reageren op een nieuwe variant. De aantallen trypanosomen variëren enorm; telkens als een nieuwe variant ontsnapt, groeit deze uit totdat het immuunsysteem zich opnieuw instelt [26](#page=26). * **Immunosuppressie**: Virussen kunnen het immuunsysteem direct onderdrukken door: * **Infectie van immuuncellen**: HIV infecteert en depopuleert T-cellen, met een rol voor dendritische cellen (DCs). Mazelen kunnen T-cellen depopuleren en silenceren, ook met een rol voor DCs. EBV infecteert en (dys)activeert B-cellen. CMV infecteert monocyten/macrofagen/DCs [27](#page=27). * **Polyklonale activatie van B-cellen**: EBV kan B-cellen polyklonaal activeren, wat leidt tot auto-immune en heterofiele antilichamen. Dit kan diagnostische problemen opleveren, aangezien patiënten IgM-positief kunnen zijn voor verschillende virussen [27](#page=27). * **Antilichaambinding en Fc-receptoren**: Herpesvirussen kunnen Fc-receptoren voor IgG produceren die antilichaaf-afhankelijke celgemedieerde cytotoxiciteit (ADCC) tegengaan [27](#page=27). * **Induceren van een TH2 respons**: Sommige virussen, zoals EBV, remmen de TH1-respons door een IL-10 homoloog te produceren, wat gunstiger is voor virale persistentie [27](#page=27). * **Overproductie van antigenen**: Virussen zoals HBV kunnen grote hoeveelheden antigenen produceren, wat het immuunsysteem overweldigt [27](#page=27). * **Infectie van immuungedeprimeerde individuen**: Virussen zoals rubella en CMV kunnen foetussen infecteren, die een nog niet volledig ontwikkeld immuunsysteem hebben [27](#page=27). > **Tip:** Herpesvirussen hebben, door hun lange co-evolutie met de mens, zeer gespecialiseerde mechanismen ontwikkeld om het immuunsysteem te omzeilen en levenslange persistentie te bereiken zonder de gastheer significant te schaden. EBV produceert zelfs een immuunsuppressief cytokine (IL-10) dat door de mens is meegebracht [28](#page=28). --- # Persistentie en pathogenese van virale infecties Dit onderwerp behandelt de strategieën voor microbieel overleven, zoals persistentie en reactivatie, en de algemene principes van pathogenese, inclusief directe en indirecte schade en de relatie tussen virussen en kanker. ### 4.1 Persistentie: een overlevingsstrategie voor microben Persistentie is een strategie die micro-organismen, waaronder typische virussen zoals herpesvirussen en hepatitis B-virus (HBV), maar ook wormen, gebruiken om te overleven. Dit biedt voordelen voor het micro-organisme, zoals een grotere kans op transmissie naar nieuwe gastheren. In het ultieme geval kan dit leiden tot integratie in de kiembaan, waardoor de eigenschappen erfelijk worden, zoals bij endogene retrovirussen [29](#page=29). Persistentie maakt het mogelijk dat een kiem zich handhaaft binnen een beperkte populatie gastheren. Dit staat in contrast met niet-persistente infecties, zoals influenza en mazelen, waar een groter aantal gastheren nodig is voor het voortbestaan van de ziektekiem. Een voorbeeld hiervan is het poliovirus, waar naar schatting een half miljoen gastheren nodig zijn voor overleving. Reservoirs in dieren kunnen een oplossing bieden voor de overleving van dergelijke kiemen. Soms is persistentie geassocieerd met chronische ziekten, zoals bij HBV, of met kanker, zoals bij HBV, EBV, HPV en HIV [29](#page=29). #### 4.1.1 Reactivatie van virussen De mechanismen achter de reactivatie van virussen zijn nog niet volledig begrepen. Een bekend voorbeeld is het herpes simplex virus (HSV), dat na een primaire acute infectie levenslang latent aanwezig blijft in zenuwcellen. Reactivatie kan optreden onder invloed van factoren zoals koorts, hormonale veranderingen, verminderde weerstand (bijvoorbeeld door ouderdom, zwangerschap, vermoeidheid, tumoren of aids) of iatrogene oorzaken. Bij reactivatie produceert het virus virale deeltjes in de afferente zenuwcellen, die vervolgens via axonaal transport naar epitheelcellen, zoals die van de lippen, worden getransporteerd, wat leidt tot de vorming van koortsblaasjes [30](#page=30). Tijdens de latente fase wordt de geïnfecteerde cel niet herkend door CD8+ T-cellen, omdat er nauwelijks virale peptiden in het cytoplasma aanwezig zijn. Bovendien drukken neuronen weinig MHC klasse I-moleculen uit, wat de herkenning door CD8+ cytotoxische T-cellen verder bemoeilijkt. UV-straling, zoals van zonlicht, kan de reactivatie van HSV bevorderen [30](#page=30). > **Tip:** Begrijpen hoe virussen latentie bereiken en reactiveren is cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve antivirale therapieën die gericht zijn op deze specifieke stadia van de virale levenscyclus. ### 4.2 Pathogenese: hoe virussen ziekte veroorzaken Pathogenese beschrijft de algemene principes van hoe infectieuze agentia ziekte veroorzaken. Parasitaire organismen kunnen ziekte veroorzaken door directe schade, zoals mechanische effecten, of indirecte schade via overmatige activatie van immuunmechanismen, zowel aangeboren als adaptief. De balans tussen de kiem en de afweer van de gastheer bepaalt het natuurlijke verloop van een infectie. Dit natuurlijke verloop wordt beïnvloed door enerzijds het type kiem en zijn virulentie, en anderzijds de individuele eigenschappen van de gastheer. Bijvoorbeeld, een daling in de afweer kan leiden tot verminderde controle over virale replicatie, wat kan resulteren in symptomen (zoals bij zona) . Omgekeerd kan een afnemende afweer ook leiden tot minder uitgesproken symptomen [31](#page=31) [3](#page=3). #### 4.2.1 Virussen en kanker Sommige virussen kunnen kanker veroorzaken. Dit kan op verschillende manieren gebeuren [32](#page=32): * **Productie van eiwitten die celprocessen beïnvloeden:** Virussen kunnen eiwitten produceren die de celcyclus veranderen, anti-apoptotisch werken (het voorkomen van celdood), of signaaltransductiepaden wijzigen [33](#page=33). * **Integratie in het genoom:** Virussen kunnen integreren in het genoom van de gastheercel, wat kan leiden tot insertionele mutagenese [33](#page=33). Enkele voorbeelden van virussen die geassocieerd zijn met kanker zijn: * **Epstein-Barr virus (EBV):** Geassocieerd met Burkitt's lymfoom, nasofaryngeaal carcinoom, en (non)Hodgkin lymfoom. Het genoom van EBV is doorgaans aanwezig in kankercellen (+) ] [32](#page=32). * **Humaan papillomavirus (HPV):** Geassocieerd met cervixcarcinoom en anogenitale carcinomen. Het genoom van HPV is aanwezig in kankercellen (+) ] [32](#page=32). * **Hepatitis B virus (HBV):** Geassocieerd met hepatocellulair carcinoom. Het genoom van HBV is aanwezig in kankercellen (+) ] [32](#page=32). * **Hepatitis C virus (HCV):** Geassocieerd met hepatocellulair carcinoom. Het genoom van HCV is echter niet altijd aanwezig in kankercellen (-) ] [32](#page=32). * **HTLV-1 (Humaan T-cel leukemia virus 1):** Geassocieerd met T-cel leukemie. Het genoom van HTLV-1 is aanwezig in kankercellen (+) ] [32](#page=32). * **Humaan herpes virus 8 (HHV-8):** Geassocieerd met Kaposi sarcoom. Het genoom van HHV-8 is aanwezig in kankercellen (+) ] [32](#page=32). * **Humaan immunodeficiëntie virus (HIV):** Geassocieerd met Kaposi sarcoom en lymfomen, maar het genoom van HIV is doorgaans niet aanwezig in de kankercellen (-) ] [32](#page=32). > **Tip:** De geografische spreiding van sommige virale kankers suggereert ook de invloed van gastheerfactoren [32](#page=32). Het is belangrijk op te merken dat ook bacteriën, zoals *Helicobacter pylori*, geassocieerd kunnen zijn met kanker, bijvoorbeeld maag- en duodenumkanker. In dergelijke gevallen kan de rol van antibiotica in de therapie van geassocieerde lymfomen worden overwogen [33](#page=33). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Chronische virale infectie | Een virale infectie waarbij het virus niet binnen korte tijd uit het lichaam wordt geklaard, vaak doordat geïnfecteerde cellen langdurig blijven bestaan en het virale genoom latent aanwezig kan zijn. | | Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) | Een retrovirus dat het immuunsysteem van de mens aantast, voornamelijk de CD4+ T-cellen en fagocyterende cellen, en kan leiden tot AIDS. | | Immuunevasie | De strategieën die pathogenen, zoals virussen, gebruiken om de immuunrespons van de gastheer te ontwijken en zo infectie te overleven en zich te vermenigvuldigen. | | Persistentie | Het vermogen van een micro-organisme om langdurig of levenslang aanwezig te blijven in de gastheer, vaak in een latente vorm, zonder direct ernstige ziekte te veroorzaken maar wel met potentieel voor toekomstige problemen. | | Retrovirus | Een type virus dat zijn RNA-genoom omzet in DNA met behulp van reverse transcriptase en dit DNA vervolgens integreert in het genoom van de gastheercel. | | Levenscyclus retrovirus | Het volledige proces van een retrovirus, vanaf de infectie van de cel tot de productie van nieuwe virale deeltjes, inclusief stappen als reverse transcriptie, integratie en assemblage. | | Immuunpathologie | De abnormale immuunrespons of disfunctie van het immuunsysteem die leidt tot ziekte, zoals de immuundeficiëntie veroorzaakt door HIV. | | AIDS | Acquired Immunodeficiency Syndrome, het gevorderde stadium van een HIV-infectie gekenmerkt door ernstige immuundeficiëntie en de ontwikkeling van opportunistische infecties en kankers. | | Opportunistische infectie | Een infectie veroorzaakt door micro-organismen die normaal gesproken geen ziekte veroorzaken bij personen met een gezond immuunsysteem, maar die wel ziekte kunnen veroorzaken bij immuungecompromitteerde individuen. | | Reverse transcriptase (RT) | Een enzym dat door retrovirussen wordt geproduceerd en dat RNA omzet in DNA, een cruciale stap in de levenscyclus van retrovirussen. | | CD4+ T-cellen | Een type witte bloedcel dat een belangrijke rol speelt in het immuunsysteem door het coördineren van de immuunrespons; deze cellen worden primair aangevallen door HIV. | | Virale lading | De hoeveelheid van een virusdeeltje in een bepaald volume van lichaamsvloeistof, zoals bloed; een hogere virale lading duidt vaak op een actievere infectie. | | MHC-I presentatie | Het proces waarbij cellen antigenen presenteren op hun oppervlak via MHC klasse I-moleculen, zodat cytotoxische T-cellen geïnfecteerde cellen kunnen herkennen en elimineren. | | Pathogenese | Het mechanisme waarmee een ziekte zich ontwikkelt, inclusief de interactie tussen het pathogeen en de gastheer en de daaruit voortvloeiende cellulaire en weefselbeschadigingen. | | Latentie | Een fase in de levenscyclus van sommige virussen (zoals herpesvirussen en HIV) waarin het virus inactief is in de gastheercel, zonder replicatie of productie van nieuwe virionen. | | Reactivatie | Het opnieuw actief worden van een virus na een periode van latentie, wat kan leiden tot symptomen van de infectie. | | Interferon (IFN) | Een groep eiwitten die door immuuncellen worden geproduceerd als reactie op infecties, met name virale infecties, en die helpen bij het bestrijden van de infectie door het remmen van virale replicatie en het stimuleren van andere immuunresponsen. | | Cytotoxische T-cellen (CTL) | Een type T-cel dat direct geïnfecteerde cellen kan herkennen en doden, een belangrijk onderdeel van de cellulaire immuunrespons tegen virussen. | | Kaposi sarcoom | Een vorm van kanker die begint in de cellen die de binnenkant van bloed- of lymfevaten bekleden, vaak geassocieerd met HIV-infectie en HHV-8. | | Human Herpesvirus 8 (HHV-8) | Een type herpesvirus dat wordt geassocieerd met de ontwikkeling van Kaposi sarcoom, met name bij personen met een verzwakt immuunsysteem. | | Lymfadenopathie | Vergroting van de lymfeklieren, wat een teken kan zijn van infectie of ontsteking. | | Profylaxe | Maatregelen die worden genomen om de ontwikkeling van een ziekte te voorkomen of te vertragen, zoals post-expositie profylaxe (PEP) na een potentieel risicovolle blootstelling aan HIV. | | Mutaties | Veranderingen in de genetische code van een virus, die kunnen leiden tot variabiliteit, resistentie tegen medicijnen of veranderingen in virulentie. | | Antigenische variabiliteit | Het vermogen van een pathogeen, zoals een virus, om zijn oppervlakte-antigenen te veranderen, waardoor het immuunsysteem het minder goed kan herkennen en bestrijden. |

# De relatie tussen kiem en gastheer De relatie tussen kiem en gastheer wordt gekenmerkt door een dynamische interactie waarbij de eigenschappen van zowel het micro-organisme als de mens bepalen of er sprake is van infectie en/of ziekte [1](#page=1). ## 1. De relatie tussen kiem en gastheer De interactie tussen een micro-organisme (kiem) en een gastheer is complex en kan variëren van harmonieus tot ziekteverwekkend. De uitkomst van deze ontmoeting wordt bepaald door de specifieke eigenschappen van zowel de kiem als de gastheer. Het medisch handelen bestaat erin deze relatie te begrijpen en verstandig tussen te komen wanneer nodig, met de wetenschap dat micro-organismen zich voortdurend aanpassen. De arts fungeert hierbij als "relatietherapeut" die de infectieziekte bestrijdt, niet zozeer de microbe zelf [1](#page=1) [4](#page=4). ### 1.1. Begrippen rond virulentie en vatbaarheid #### 1.1.1. Infectie versus ziekte Het concept van infectie is niet synoniem met ziekte; een infectie is de aanwezigheid en replicatie van een micro-organisme in een gastheer, terwijl ziekte verwijst naar de klinische symptomen die hieruit voortvloeien. Dit concept wordt treffend geïllustreerd door het "ijsbergconcept", waarbij de zichtbare, symptomatische klinische presentatie slechts een klein deel is van het totale aantal infecties, waarvan het merendeel asymptomatisch verloopt. Zelfs asymptomatische dragers kunnen het micro-organisme overdragen [5](#page=5). #### 1.1.2. De kiem (micro-organisme) als partner Micro-organismen streven naar succesvolle voortplanting en maken daarbij efficiënt gebruik van de faciliteiten van de gastheer, zoals voedingsstoffen en energie. Sterke schade aan de gastheer kan het overleven van de kiem bemoeilijken. Succesvolle kiemen veroorzaken weinig tot geen ziekte (bv. commensalen, AAV) of juist voldoende symptomen om overdracht te faciliteren (bv. rotavirus, influenza). Sommige kiemen integreren zelfs in het genoom van de gastheer. Kiemen evolueren doorgaans sneller dan gastheren, waardoor ze zich beter kunnen aanpassen. Pathogene kiemen veroorzaken ziekte die verspreiding naar andere gastheren bevordert, bijvoorbeeld door niezen of diarree. Variabiliteit tussen stammen is wijdverbreid en adaptieve mechanismen, zoals persisters, stellen subpopulaties in staat te overleven onder veranderende omstandigheden [6](#page=6). #### 1.1.3. Virulentie Virulentie is het ziekmakend vermogen van een specifiek isolaat van een micro-organisme bij een 'standaard' gastheer. Het is een kwantificatie van het ziekmakend vermogen, vaak vergeleken tussen verschillende isolaten van dezelfde kiem, bijvoorbeeld met de dodelijke dosis 50 (LD50) [34](#page=34) [4](#page=4). #### 1.1.4. De gastheer als partner De gastheer leeft in symbiose met talloze micro-organismen, die al vroeg in het leven aanwezig zijn en essentieel zijn voor een gezond leven. Het menselijk lichaam en immuunsysteem zijn geëvolueerd om samen te leven met deze microben, waarbij het interne milieu grotendeels vrij van bacteriën wordt gehouden, terwijl virussen onder controle worden gehouden. Bepaalde omstandigheden, zoals de neonatale periode, fysieke schade, uitputting, aanwezigheid van vreemde objecten of verstoorde microbioomflora, kunnen de harmonieuze relatie met kiemen bedreigen. Ook medisch handelen kan bijdragen aan het ontstaan van infecties [9](#page=9). #### 1.1.5. Vatbaarheid Vatbaarheid is de mate waarin een gastheer gevoelig is voor kolonisatie door een micro-organisme. Deze wordt bepaald door de individuele genetische variabiliteit, eigenschappen en de reactie van de gastheer, waaronder de immuunrespons [4](#page=4). ### 1.2. Het verloop van een infectie Een infectie kent verschillende stadia, vanaf de initiële aanhechting en invasie, via vermenigvuldiging, verspreiding, het ontwijken van de afweer, tot het vrijkomen uit het lichaam. Deze processen leiden vaak tot schade aan de gastheer en een immuunrespons die zich manifesteert als inflammatie [2](#page=2) [34](#page=34). #### 1.2.1. Aanhechting en invasie (entry) Het succes van een infectie hangt af van de mogelijkheid van de kiem om zich aan de gastheer te hechten en potentieel binnen te dringen. Barrières zoals intacte huid en slijmvliezen spelen hierin een cruciale rol [17](#page=17) [2](#page=2). #### 1.2.2. Vermenigvuldiging Na kolonisatie of invasie begint de kiem zich te vermenigvuldigen binnen de gastheer [2](#page=2). #### 1.2.3. Lokale of gegeneraliseerde verspreiding De kiem kan zich lokaal verspreiden of een gegeneraliseerde infectie veroorzaken. Oppervlakkige infecties zijn vaak kortdurend ("hit-and-run") en kunnen door aangeboren immuniteit worden geëlimineerd. Systemische verspreiding vereist vaak verworven immuniteit voor eliminatie. Soms is verspreiding nuttig voor de kiem omdat uitscheiding op een andere plaats dan het initiële contact plaatsvindt, zoals bij Hepatitis A virus dat via de darm binnenkomt en via de gal uitgescheiden wordt [27](#page=27) [2](#page=2). #### 1.2.4. Ontwijken van afweer Een cruciaal aspect voor het succes van een kiem is het vermogen om de afweerreacties van de gastheer te ontwijken. Dit kan door middel van diverse mechanismen die de detectie of eliminatie door het immuunsysteem tegengaan [2](#page=2). #### 1.2.5. Vrijkomen uit het lichaam (exit) De kiem verlaat het lichaam van de gastheer om andere gastheren te infecteren. Dit "shedding" proces kan zowel voor, tijdens, als na de symptomen plaatsvinden, waardoor overdracht mogelijk is. Continu (bv. EBV, HBV) of intermitterend (bv. HSV) shedding komt voor [28](#page=28) [2](#page=2). #### 1.2.6. Schade aan gastheer en immuunrespons Schade aan de gastheer is vaak een gevolg van de immuunrespons, zoals inflammatie en koorts, in plaats van directe schade door de kiem, vooral bij virussen. Een verminderde immuunrespons kan leiden tot minder symptomen, zelfs bij een actieve infectie. De tijd tussen infectie en symptomen wordt de incubatietijd genoemd [28](#page=28) [2](#page=2) [34](#page=34). ### 1.3. Co-evolutie en aanpassing Kiemen en gastheren ondergaan een voortdurende co-evolutie. Dit leidt tot aanpassingen aan beide zijden [13](#page=13). #### 1.3.1. Evolutie van de kiem Kiemen met lagere virulentie kunnen een selectief voordeel hebben omdat deze gastheren langer leven en de kiem meer tijd heeft om zich te verspreiden. Dit kan leiden tot een afname van de fitness van het virus, zoals waargenomen bij HIV-virussen door de jaren heen [13](#page=13). #### 1.3.2. Evolutie van de gastheer populatie Gastheerpopulaties kunnen ook evolueren als reactie op infectiedruk. Selectie kan bijvoorbeeld leiden tot de opkomst van resistente individuen (bv. CCR5-mutanten voor HIV). Genetische bottlenecks, zoals veroorzaakt door historische epidemieën (bv. de pest), kunnen de genetische variabiliteit van populaties beïnvloeden. Ook de introductie van nieuwe ziekteverwekkers in naïeve populaties kan dramatische gevolgen hebben [13](#page=13). ### 1.4. Voorbeelden van kiem-gastheer interacties #### 1.4.1. Attenuatie door kweek Voorbeelden zoals het BCG-vaccin tonen aan hoe het kweken van micro-organismen onder specifieke omstandigheden hun virulentie kan verminderen (attenuatie). De Lubeck-ramp, waarbij baby's BCG-vaccin kregen gecontamineerd met wild-type *M. bovis*, illustreert de potentieel dodelijke gevolgen van onverwachte virulentie [11](#page=11). #### 1.4.2. Onbedoelde overdracht van ziekteverwekkers Een tragisch voorbeeld van onbedoelde overdracht is de hepatitis B virus (HBV) infectie bij Amerikaanse soldaten in 1942, veroorzaakt door gecontamineerd gele koorts-vaccin. Dit toont aan hoe medische interventies, indien niet zorgvuldig uitgevoerd, onbedoelde infecties kunnen veroorzaken [11](#page=11) [9](#page=9). #### 1.4.3. Sikkelcelanemie als bescherming tegen malaria Sikkelcelanemie illustreert een genetische aanpassing waarbij heterozygoten relatief beschermd zijn tegen malaria. De puntmutatie in hemoglobine S zorgt ervoor dat besmette rode bloedcellen, wanneer ze door de parasiet worden gemetaboliseerd, sneller worden geëlimineerd door de milt. Homozygoten lijden echter aan ernstige anemie en krijgen gemakkelijker secundaire infecties [14](#page=14). #### 1.4.4. Myxomatose Het verhaal van myxomatose bij konijnen is een klassiek voorbeeld van hoe een zeer virulente kiem in een naïeve populatie kan leiden tot hoge sterftecijfers, maar na verloop van tijd evolueert naar een meer gebalanceerde pathogeniteit. Dit proces van aanpassing geldt ook voor andere ziekteverwekkers [12](#page=12). #### 1.4.5. Mazelen Het verloop van mazelen laat zien hoe virussen zich kunnen verspreiden via het bloed naar epitheelcellen in de luchtwegen, mucosae en huid. De symptomen treden vaak pas op wanneer de immuunrespons van de gastheer actief wordt [28](#page=28). > **Tip:** Het begrijpen van de dynamiek van de kiem-gastheer relatie is essentieel voor het stellen van diagnoses, ook wanneer niet alle klassieke symptomen aanwezig zijn. De interactie is uniek voor elke kiemstam en elke individuele patiënt [5](#page=5). > **Tip:** Infecties die oppervlakkig blijven zijn vaak "hit-and-run" infecties, zelden chronisch, waarbij aangeboren immuniteit voldoende kan zijn voor eliminatie. Systemische verspreiding vraagt meestal verworven immuniteit voor eliminatie en kan leiden tot chronische infecties [27](#page=27). > **Tip:** Wanneer een patiënt met een immuundaling besmet raakt met een virus zoals HBV, kunnen er aanvankelijk geen symptomen zijn. Verbetering van de immuniteit, bijvoorbeeld door anti-HIV behandeling, kan dan leiden tot het optreden van geelzucht (immuunreconstitutie syndroom) [34](#page=34). > **Tip:** De incubatietijd, de periode tussen infectie en symptomen, kan worden gevolgd door "shedding" van de kiem, wat infectieus contact mogelijk maakt. Screening op infecties, zoals HIV, kan nuttig zijn om verspreiding te remmen, vooral als de infectie tijdelijk is en behandelbaar [34](#page=34). --- # Virulentie en vatbaarheid Dit thema verkent de dynamische interactie tussen micro-organismen en hun gastheren, met een focus op de factoren die bepalen of een infectie leidt tot ziekte. ### 2.1 De kiem-gastheer relatie: een fundamentele interactie De relatie tussen een gastheer en een micro-organisme is complex en bepaalt de uitkomst van een ontmoeting. Deze relatie wordt gekenmerkt door de eigenschappen van zowel de kiem als de gastheer. De gastheer reageert op de microbe met afweermechanismen, waarbij individuele genetische variabiliteit en andere eigenschappen de vatbaarheid voor kolonisatie bepalen. De microbe reageert op de gastheer, en de microbiologie speelt hierin een rol. Als de ontmoeting symptomen veroorzaakt die het functioneren van de gastheer nadelig beïnvloeden, spreekt men van ziekte. Het ziekmakend vermogen van een bepaald kiemisolaat bij een 'standaard' gastheer wordt virulentie genoemd. De arts fungeert hierin als "relatietherapeut", gericht op het beheersen van infectieziekten, die wereldwijd nog steeds een belangrijke doodsoorzaak zijn [4](#page=4) [5](#page=5). #### 2.1.1 Infectie versus ziekte: het ijsbergconcept Een infectie is niet altijd synoniem met ziekte. Het verloop van de kiem-gastheer relatie is variabel. Wat we klinisch waarnemen, is slechts de top van de ijsberg: de symptomatische presentatie, die kan variëren van banaal tot letaal. Veel infecties verlopen asymptomatisch, maar dit sluit overdracht van de kiem niet uit. De eigenschappen van de kiem (stam, adaptief vermogen, virulentie) en de gastheer (individuele vatbaarheid) bepalen de uitkomst [5](#page=5). #### 2.1.2 Partner 1: de kiem en zijn virulentie Sommige micro-organismen, soorten of stammen, kunnen bij bepaalde gastheren symptomen veroorzaken en worden dan pathogenen genoemd. Zij onderscheiden zich van niet-pathogenen door de expressie van virulentiefactoren: genen die een pathogene levensstijl mogelijk maken [7](#page=7). ##### 2.1.2.1 Virulentiefactoren: voorbeelden en mechanismen Een schoolvoorbeeld van een pathogeen is urineweginfectie-veroorzakende *Escherichia coli* (UPEC). Hoewel *E. coli* deel uitmaakt van de normale darmflora, bezitten sommige stammen virulentiefactoren die hen pathogeen maken. UPEC kan zich hechten aan de epitheelcellen van de blaas en nieren, opgenomen worden via endocytose, ontsnappen uit vesikels naar het cytoplasma en intracellulair groeien. Dit intracellulaire leven kan lijken op biofilmvorming, waarbij de bacteriën een relatief resistente filamenteuze vorm aannemen die kan ontsnappen aan fagocytose, en zelfs een latente intracellulaire vorm aannemen die een bron kan zijn voor terugkerende infecties [7](#page=7). Voorbeelden van UPEC-virulentiefactoren zijn: * Type I pili (FimH gen): voor hechting aan epitheel, ook rol in intracellulair leven [7](#page=7). * Genen betrokken bij motiliteit [7](#page=7). * Genen betrokken bij regulatie van celdeling [7](#page=7). * Genen betrokken bij immuunevasie, zoals het afremmen van TLR-signalering [7](#page=7). ##### 2.1.2.2 Intracellulair leven en latentie Na aanhechting kunnen UPEC passief in epitheelcellen worden opgenomen, waarna ze ontsnappen uit vesikels en beschermd zijn tegen fagocyten. Hier vormen ze een intracellulaire bacteriële gemeenschap en kunnen ze filamenteuze vormen ontwikkelen. Deze kunnen na vrijkomen uit de cel weer transformeren naar klassieke bacteriële cellen. Epitheliale cellen kunnen barsten of loslaten (exfoliatie), wat soms microscopisch zichtbaar is in urine bij urineweginfecties (UWI). Een deel van de vrijgekomen bacteriën kan nieuwe epitheelcellen binnendringen. Dit kan leiden tot latentie, een bron van heropflakkering [8](#page=8). ##### 2.1.2.3 Virulentie van *Staphylococcus aureus* *Staphylococcus aureus* kent diverse virulentiefactoren die betrokken zijn bij adhesie aan gastheercellen, waaronder factoren die binden aan fibrinogeen. Voor verspreiding moet de bacterie in aantal toenemen door vermenigvuldiging. *S. aureus* interageert met prothrombine en zet fibrinogeen om in fibrine, wat lokale replicatie bevordert en bescherming biedt tegen fagocyten. Virulentiefactoren omvatten ook cytotoxines (zoals α-toxine) en enzymen (proteasen, lipases, nucleases) die weefsel afbreken als bron van voedingsstoffen, zoals ijzer. Toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) is een superantigeen dat leidt tot shock, koorts en capillaire lekkage, en kan bijdragen aan verspreiding en immunosuppressie [18](#page=18) [20](#page=20) [21](#page=21) [23](#page=23) [24](#page=24). ##### 2.1.2.4 Schade door toxines Exotoxines veroorzaken directe schade aan de gastheer. Ze zijn over het algemeen niet antigenisch variabel, waardoor ze effectieve immuniteit opwekken en de basis vormen voor toxoïde vaccins (zoals voor tetanus en difterie). Sommige toxines, zoals die van streptokokken (erythtoxine), veroorzaken ziekten als roodvonk, waarna immuniteit tegen het toxine ontstaat, maar niet tegen de bacterie zelf. Enterotoxines, zoals geproduceerd door *S. aureus*, kunnen braken en diarree veroorzaken, wat bijdraagt aan de exit en verspreiding van de kiem via voedselvergiftiging. Endotoxines, zoals lipopolysaccharide (LPS), activeren een breed scala aan immuunmechanismen en het stollingssysteem, wat leidt tot krachtige immuunstimulatie en mogelijk gedissemineerde intravasculaire stolling (DIC) [25](#page=25) [26](#page=26) [33](#page=33). ##### 2.1.2.5 Attenuatie van virulentie De virulentie van een kiem kan verminderen door cultivatie. Zo werd het Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccin ontwikkeld door *M. bovis* 10 jaar lang te kweken op een speciaal medium, waardoor de kiem minder virulent werd (attenuatie). De Lublin-ramp in 1930, waarbij baby's per os BCG kregen gecontamineerd met origineel *M. bovis*, resulteerde in ernstige ziekte en sterfte [11](#page=11). #### 2.1.3 Partner 2: de gastheer en zijn vatbaarheid Vatbaarheid verwijst naar de gevoeligheid van een gastheer voor infectie. Individuele variabiliteit in de vatbaarheid van de gastheer kan leiden tot enorme verschillen in de klinische gevolgen van een infectie [11](#page=11) [4](#page=4). ##### 2.1.3.1 Genetische determinanten van vatbaarheid Bij urineweginfecties (UWI) wordt de vatbaarheid mede bepaald door genetische factoren. Verdediging tegen bijvoorbeeld UPEC gebeurt via TLR4-sensing in epitheel, wat leidt tot de rekrutering van neutrofielen via IL-8. In families met een verhoogde incidentie van UWI worden polymorfismen waargenomen in TLR4 en andere TLR-receptoren, verminderde IL-8-receptor expressie (CXCR1), en IL-8-polymorfismen [10](#page=10). ##### 2.1.3.2 Beschadigde gastheer versus intacte gastheer De slaagkans van exogene infecties hangt sterk af van de integriteit van de gastheer. Een beschadigde gastheer (bv. door brandwonden, vreemde lichamen, immuundepressie of na griep) is vatbaarder voor infecties zoals pneumonie [17](#page=17). #### 2.1.4 Verloop van een infectie Het verloop van een infectie omvat verschillende fasen, van aanhechting en invasie tot vermenigvuldiging, verspreiding, het ontwijken van de afweer, en uiteindelijk vrijkomen uit het lichaam. De schade aan de gastheer en de immuunrespons, inclusief inflammatie, spelen een cruciale rol in het uiteindelijke ziektebeeld [16](#page=16) [20](#page=20) [22](#page=22) [29](#page=29) [31](#page=31) [34](#page=34) [5](#page=5). ##### 2.1.4.1 Aanhechting en invasie (entry) Microben moeten barrières overwinnen om het lichaam binnen te dringen. Dit kan via actieve penetratie van de huid, zoals bij sommige wormen, of door sterke aanhechting aan epitheelcellen, zoals bij *N. gonorrhoeae*. *B. pertussis* kan bijvoorbeeld de trilharen van de luchtwegen stilleggen. Zuurresistente cysten en bacteriën kunnen ook als ingang fungeren [16](#page=16). ##### 2.1.4.2 Vermenigvuldiging Na binnenkomst vermenigvuldigt de kiem zich om te kunnen verspreiden naar andere gastheren. Dit kan lokaal gebeuren, zoals bij humaan papillomavirus (HPV). Wratten die veroorzaakt worden door HPV kunnen spontaan verdwijnen na blootstelling aan het immuunsysteem [20](#page=20). ##### 2.1.4.3 Lokale of gegeneraliseerde verspreiding De kiem kan zich vanuit de primaire infectiehaard verspreiden via het lymfestelsel, systemisch (bloedbaan), of via zenuwbanen. R [22](#page=22). #### 2.1.4.4 Ontwijken van afweer Virulentiefactoren zijn essentieel voor de kiem om de afweer van de gastheer te ontwijken en de infectie succesvol te laten verlopen. *S. aureus* heeft bijvoorbeeld Protein A (SpA), dat bindt aan het Fc-deel van IgG, vWF en C3, en zo hun antibacteriële werking remt. SpA kan ook polyklonale B-cel activatie veroorzaken, wat de vorming van specifieke antistoffen tegen *S. aureus* belemmert. Sommige cytotoxines, zoals Panton-Valentine leukocidine, zijn specifiek gericht tegen granulocyten, wat leidt tot de vorming van pus (dode granulocyten) en purulente infecties [29](#page=29) [30](#page=30). ##### 2.1.4.5 Vrijkomen uit lichaam (exit) en transmissie Transmissie naar volgende gastheren hangt af van het aantal vrijgestelde kiemen, hun stabiliteit buiten het lichaam, de benodigde infectieuze dosis voor de volgende gastheer, en de stam van de kiem. Niezen genereert meer kiemen dan hoesten, en spreken kan ook bijdragen aan de verspreiding van kleine druppeltjes die in de longen van een naburige gastheer terecht kunnen komen. De stabiliteit in de omgeving, zoals resistentie tegen uitdroging, hitte en chemicaliën, is cruciaal voor overleving. Gespecialiseerde structuren zoals sporen en cysten verlenen deze stabiliteit. Andere transmissiefactoren omvatten expulsie via hoesten, niezen, en diarree, wat voor de kiem een voordeel kan zijn door massale verspreiding. *S. aureus* produceert enterotoxines die braken en diarree kunnen uitlokken, wat de kiem toelaat het darmkanaal te verlaten [31](#page=31) [32](#page=32) [33](#page=33). ##### 2.1.4.6 Schade aan gastheer, immuunrespons en inflammatie Pathogeniciteit is het ziekmakend vermogen van een kiem, terwijl virulentie een kwantificatie hiervan is, vaak vergeleken tussen verschillende isolaten van dezelfde kiem (bv. LD50). De incubatietijd, tussen infectie en symptomen, is belangrijk, waarbij shedding (infectieus zijn) vaak al vóór de symptomen optreedt. De reactie van de gastheer, zoals inflammatie en koorts, is vaak bepalend voor het optreden van symptomen. Bij immuundaling kunnen symptomen minder uitgesproken zijn, zoals bij een HIV-patiënt die besmet wordt met HBV en geen symptomen vertoont. Infecties kunnen ook optreden zonder symptomen, wat screening noodzakelijk kan maken om verspreiding te remmen. Schade kan direct zijn (bv. mechanisch door wormen) of indirect, via overmatige activatie van natuurlijke of adaptieve immuunmechanismen [34](#page=34) [35](#page=35). --- # Het verloop van een infectie Dit onderwerp beschrijft de opeenvolgende fasen die een infectie doorloopt, van aanhechting en invasie tot vermenigvuldiging, verspreiding, ontwijken van afweer, vrijkomen en schade aan de gastheer, geïllustreerd met voorbeelden zoals *Staphylococcus aureus* [15](#page=15) [2](#page=2). ### 5.2.1 Aanhechting en invasie (entry) De eerste stap in het verloop van een infectie is de aanhechting van de kiem aan gastheercellen, vaak gevolgd door invasie. Dit vereist het overwinnen van de natuurlijke weerstand van de gastheer. Het is essentieel dat de kiem zich kan aanhechten om een infectie aan te laten slaan. Voorbeelden van barrières die overwonnen moeten worden zijn de huid, die actief gepenetreerd kan worden door sommige wormen, of sterke aanhechting vereist is, zoals bij *N. gonorrhoea*. *B. pertussis* kan de trilharen stil leggen, wat invasie vergemakkelijkt. Zuurresistente cysten en bacteriën kunnen ook weerstand bieden [15](#page=15) [16](#page=16). *Staphylococcus aureus* maakt gebruik van verschillende factoren (tientallen zijn bekend) voor adhesie aan gastheercellen. Een van deze factoren bindt aan fibrinogeen [18](#page=18). De slaagkans van een infectie, met name bij exogene infecties, hangt sterk af van de virulentie van de kiem en het vermogen om de natuurlijke barrières van een intacte host te overwinnen. Bij een beschadigde host, bijvoorbeeld door brandwonden of immuundepressie, is de kans op infectie groter [17](#page=17). > **Tip:** De aanhechting is een cruciale eerste stap; zonder aanhechting kan de infectie niet plaatsvinden. > **Voorbeeld:** *UPEC* (uro-pathogene *E. coli*) kan zich aanhechten en passief worden opgenomen in epitheelcellen, waarna het zich ontsnapt aan het vesikel en beschermd is tegen fagocytose [8](#page=8). ### 5.2.2 Vermenigvuldiging Na aanhechting en eventuele invasie is vermenigvuldiging essentieel voor de toename van het aantal kiemen. Meer overleving dan afsterven van de kiem leidt tot een toename van het aantal. Dit kan lokaal gebeuren, zoals bij humaan papillomavirus (HPV) in de cervix. Wratten veroorzaakt door HPV kunnen soms spontaan verdwijnen nadat het virus aan het immuunsysteem is blootgesteld [15](#page=15) [20](#page=20). *Staphylococcus aureus* bevordert lokale replicatie door interactie met prothrombine, waarbij fibrinogeen wordt omgezet in fibrine. Dit biedt bescherming tegen fagocyten en vermindert de microcirculatie [21](#page=21). Diepere verspreiding kan noodzakelijk zijn om doelwitcellen voor replicatie te bereiken of kan plaatsvinden als een opportuniteit zich voordoet [20](#page=20). ### 5.2.3 Lokale of gegeneraliseerde verspreiding Verspreiding, lokaal of gegeneraliseerd, is de volgende fase na vermenigvuldiging. Dit vereist het ontwijken van natuurlijke barrières en aanpassing aan de gastheer [15](#page=15). Verspreiding kan plaatsvinden via verschillende routes: * **Lymfe:** Bijvoorbeeld lymfangitis bij streptokokkeninfecties [22](#page=22). * **Systemisch:** Via bloed of bloedcellen, leidend tot viremie of bacteriëmie [22](#page=22). * **Zenuwbanen:** Neurogeen, zoals bij herpes simplex virus (HSV) [22](#page=22). De reden voor diepere verspreiding is soms onduidelijk, zoals CNS-invasie door meningokokken of poliovirus, die niet direct nodig is voor transmissie. Echter, bij rabiësvirus is invasie van het centrale zenuwstelsel (CNS) essentieel omdat neuronen de doelwitcellen zijn. Vaccinatie na een beet is vaak nog nuttig vanwege het trage axonaal transport, wat tijd geeft voor een immuunrespons [22](#page=22). Tijdens verspreiding wordt de kiem blootgesteld aan het immuunsysteem, waarbij virulentiefactoren en immuundeviatie mechanismen cruciaal zijn voor succes [22](#page=22). *Staphylococcus aureus* produceert tal van cytotoxines (zoals α-toxine) en enzymen (proteases, lipases, nucleases) die weefsel afbreken en als voedingsstoffen dienen, met name ijzer. Toxic shock syndrome toxin-1 is een superantigeen dat T-cellen niet-specifiek stimuleert, leidend tot shock en koorts. Dit helpt bij verspreiding maar kan ook immunosuppressief werken [23](#page=23) [24](#page=24). > **Voorbeeld:** Hepatitis A virus treedt binnen via de darm en wordt uitgescheiden via de gal (lever), wat een voorbeeld is van verspreiding waarbij de uitscheiding op een andere plaats plaatsvindt dan het initiële contact [27](#page=27). ### 5.2.4 Ontwijken van afweer Het ontwijken van de verdediging van de gastheer is noodzakelijk om lang genoeg te overleven en succesvolle transmissie te bewerkstelligen [15](#page=15) [29](#page=29). *Staphylococcus aureus* kan de afweer ontwijken middels Protein A (SpA), dat bindt aan het Fc-deel van IgG, vWF en C3, waardoor hun antibacteriële werking wordt geïnhibeerd. Het kan ook polyklonale B-celactivatie veroorzaken, wat de vorming van specifieke antistoffen tegen *S. aureus* belemmert [29](#page=29). Sommige cytotoxines van *S. aureus* zijn specifiek voor granulocyten (leucocidines, bv. Panton–Valentine leukocidin), wat leidt tot etter, bestaande uit dode granulocyten, en purulente infecties [30](#page=30). ### 5.2.5 Vrijkomen uit lichaam (exit) Het vrijkomen uit het lichaam is de exit-fase, waarbij de kiem in voldoende aantallen moet vrijkomen om nieuwe gastheren te vinden. Dit proces, ook wel transmissie genoemd, wordt beïnvloed door diverse factoren [15](#page=15) [31](#page=31). Factoren die transmissie bepalen zijn: * **Aantal kiemen vrijgesteld:** Niezen produceert veel meer kiemen dan hoesten. Spreken, met name bij consonanten zoals f, p, t, s, kan ook bijdragen aan de verspreiding. Kleinere druppeltjes kunnen de longen van een naburige host bereiken [31](#page=31). * **Stabiliteit van de kiemen buiten het lichaam:** Weerstand tegen uitdroging, hitte en chemicaliën is belangrijk. Gespecialiseerde structuren zoals sporen (*Clostridium tetani*), cysten (amoeben) en eieren verlenen stabiliteit aan uitdroging. Als kiemen gevoelig zijn voor uitdroging, vindt transmissie plaats in vochtige omstandigheden [32](#page=32). * **Aantal kiemen nodig voor infectie van de volgende host:** Dit varieert sterk; bijvoorbeeld, slechts 10 kiemen van *Shigella dysenteriae* zijn nodig bij ingestie, terwijl 10^4 kiemen van *Salmonella typhi* nodig zijn [31](#page=31). * **Stam van de kiem:** Verschillende stammen kunnen variërende transmissie-efficiëntie hebben [31](#page=31). Andere bevorderende factoren voor transmissie zijn expulsie mechanismen zoals hoesten, niezen en diarree. Diarree, hoewel een voordeel voor de host door snellere eliminatie, is een groot voordeel voor de kiem door massale verspreiding [32](#page=32). *Staphylococcus aureus* produceert enterotoxines (ook superantigenen) die braken en/of diarree uitlokken, waardoor de kiem de darm kan verlaten. Dit is ook de oorzaak van voedselvergiftiging wanneer toxines geproduceerd worden in opgewarmd voedsel [33](#page=33). > **Voorbeeld:** Niezen kan leiden tot de verspreiding van grote aantallen ziekteverwekkers via druppels, wat essentieel is voor de transmissie van respiratoire infecties [31](#page=31). ### 5.2.6 Schade aan gastheer, immuunrespons en inflammatie Schade aan de gastheer is niet strikt noodzakelijk voor een infectie, maar wel per definitie aanwezig bij pathogenen. De symptomen van een infectie zijn vaak het gevolg van de reactie van de gastheer, zoals inflammatie en koorts [15](#page=15) [34](#page=34). Schade kan direct zijn, bijvoorbeeld mechanisch veroorzaakt door wormen. Ook exotoxines kunnen directe schade veroorzaken door vitale functies te remmen. Deze toxines zijn vaak niet antigenisch variabel en wekken een goede immuniteit op, wat de basis vormt voor vaccins met toxoïd. Sommige toxines kunnen diarree veroorzaken, wat de exit en transmissie faciliteert [25](#page=25) [35](#page=35). Endotoxines, zoals lipopolysaccharide (LPS), kunnen bijna elk immuunmechanisme activeren, inclusief de stollingscascade, wat ze tot krachtige immuunstimuli maakt [26](#page=26). Bij een immuundaling kunnen patiënten minder symptomen vertonen, zelfs bij een infectie. Omgekeerd kan een verbetering van de immuniteit leiden tot het optreden van symptomen, zoals geelzucht bij een HIV-patiënt die HBV oploopt en vervolgens behandeld wordt (immuunreconstitutie syndroom) [34](#page=34). Infecties kunnen ook optreden zonder symptomen, wat screening noodzakelijk kan maken, vooral als de infectie tijdelijk is en behandelbaar, zoals bij HIV. Dit helpt ook om verspreiding af te remmen [34](#page=34). Pathogeniciteit verwijst naar het ziekmakend vermogen van een kiem, terwijl virulentie een kwantificatie is van dit vermogen, vaak vergeleken tussen verschillende isolaten van dezelfde kiem (bv. de letale dosis 50, LD50). De incubatietijd is de periode tussen infectie en symptomen, maar de gastheer kan al infectieus zijn (shedding) vóór de symptomen optreden [34](#page=34). > **Tip:** Het onderscheid tussen infectie en ziekte is belangrijk; niet elke infectie leidt tot duidelijke symptomen. De immuunrespons van de gastheer speelt een cruciale rol in het ontstaan van ziekte. > **Voorbeeld:** De mazelenvirus infectie begint systemisch en bereikt uiteindelijk de epitheelcellen van de luchtwegen en huid, wat resulteert in huiduitslag. Virussen produceren vaak geen toxines en veroorzaken pas symptomen bij de immuunrespons [28](#page=28). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Virulentie | Het ziekmakend vermogen van een specifiek micro-organisme-isolaat bij een standaard gastheer, bepaald door de eigenschappen van de kiem die het mogelijk maken om symptomen te veroorzaken en de gastheer nadelig te beïnvloeden. | | Vatbaarheid | De gevoeligheid van een gastheer voor kolonisatie door een micro-organisme, bepaald door de individuele eigenschappen van de gastheer, waaronder genetische variabiliteit, afweer en immunologie. | | Infectie | De aanwezigheid en vermenigvuldiging van een micro-organisme in of op een gastheer, wat niet noodzakelijk leidt tot ziekteverschijnselen. | | Ziekte | Een nadelige beïnvloeding van het functioneren van de gastheer door de interactie met een micro-organisme, gekenmerkt door specifieke symptomen. | | Kiem | Een algemene term voor een micro-organisme, zoals een bacterie, virus, schimmel of parasiet, dat een infectie kan veroorzaken. | | Gastheer | Een organisme dat een andere organisme (de kiem of parasiet) huisvest en ondersteunt, vaak ten koste van zichzelf. | | Pathogeen | Een micro-organisme dat in staat is om ziekte te veroorzaken bij een gastheer. | | Commensaal | Een micro-organisme dat op of in een gastheer leeft zonder deze significant te schaden, en soms zelfs voordeel kan bieden, zoals bacteriën in de darmflora. | | Immuunrespons | De reeks reacties van het immuunsysteem van de gastheer tegen een ziekteverwekker, gericht op het neutraliseren of elimineren van de infectie. | | Inflammatie | Een plaatselijke reactie van het lichaam op infectie of beschadiging, gekenmerkt door roodheid, zwelling, warmte en pijn, gericht op het verwijderen van de schadelijke stimulus en het starten van het genezingsproces. | | Exotoxine | Een toxine dat door bacteriën wordt uitgescheiden in de omgeving en dat specifieke schadelijke effecten kan hebben op de gastheer, vaak door interactie met vitale celprocessen. | | Endotoxine | Een toxine dat deel uitmaakt van de celwand van gram-negatieve bacteriën (lipopolysaccharide, LPS) en dat bij vrijkomen krachtige immuunreacties en ontstekingen kan veroorzaken. | | Virulentiefactoren | Specifieke genen of moleculen die een micro-organisme helpen bij het veroorzaken van ziekte, zoals adhesie-eiwitten, toxines, enzymen die weefsel afbreken, of mechanismen om het immuunsysteem te ontwijken. | | Asymptomatisch | Een infectie of ziekte die geen waarneembare symptomen vertoont bij de gastheer. | | Attenuatie | Het proces waarbij de pathogene eigenschappen van een micro-organisme worden verminderd, vaak gebruikt bij de ontwikkeling van vaccins. | | Co-evolutie | Het proces waarbij twee of meer soorten elkaar wederzijds beïnvloeden in hun evolutionaire ontwikkeling, zoals de evolutie van kiemen en hun gastheren. | | Shedding | Het proces waarbij een geïnfecteerd individu micro-organismen uitscheidt, wat leidt tot mogelijke transmissie naar nieuwe gastheren. | | Latentie | Een periode waarin een infectie inactief is, maar wel aanwezig blijft in het lichaam, met potentieel om later opnieuw actief te worden en symptomen te veroorzaken. |

# Définition et propriétés de la réplication de l'ADN La réplication de l'ADN est le processus fondamental par lequel une molécule d'ADN parentale est copiée pour produire deux molécules d'ADN filles identiques, assurant ainsi la transmission fidèle de l'information génétique lors de la division cellulaire [3](#page=3). ### 1.1 Définition de la réplication de l'ADN La réplication de l'ADN est la biosynthèse de deux molécules d'ADN filles qui sont des copies identiques de la molécule d'ADN parentale. Ce processus est essentiel car il permet de multiplier la quantité d'ADN par deux à chaque cycle de réplication, rendant possible la division cellulaire [3](#page=3). ### 1.2 Modèles théoriques de réplication de l'ADN Basés sur le modèle de la double hélice de Crick et Watson, plusieurs modèles théoriques ont été proposés pour décrire la réplication de l'ADN [5](#page=5) [6](#page=6) [8](#page=8): * **Modèle conservatif** : Dans ce modèle, la molécule d'ADN parentale entière servirait de matrice, et une nouvelle molécule d'ADN entièrement nouvelle serait synthétisée. La molécule parentale resterait intacte. * **Modèle semi-conservatif** : Ce modèle postule que chaque brin de la double hélice parentale sert de matrice pour la synthèse d'un nouveau brin complémentaire. Ainsi, chaque nouvelle molécule d'ADN fille serait constituée d'un brin ancien (parental) et d'un brin nouveau. * **Modèle dispersif** : Selon ce modèle, les brins de l'ADN parentale seraient fragmentés, et chaque fragment servirait de matrice pour la synthèse de petits segments d'ADN nouveau. La molécule d'ADN fille serait ainsi un mélange de segments anciens et nouveaux. L'expérience de Meselson et Stahl a été cruciale pour déterminer le modèle correct de réplication [7](#page=7). > **Tip:** Il est important de comprendre ces modèles pour apprécier la manière dont la découverte expérimentale a confirmé le mécanisme de réplication réel. ### 1.3 Propriétés de la réplication de l'ADN La réplication de l'ADN présente plusieurs propriétés clés : * **Bidirectionnalité**: La réplication de l'ADN est un processus bidirectionnel. Cela signifie qu'à partir d'une origine de réplication, la synthèse de nouveaux brins d'ADN progresse simultanément dans deux directions opposées le long de la molécule d'ADN parentale. Cette bidirectionnalité permet une réplication plus rapide de la totalité du génome [9](#page=9). > **Tip:** La bidirectionnalité est une caractéristique fondamentale qui optimise l'efficacité du processus de duplication de l'ADN. --- # La réplication chez les procaryotes : étapes clés La réplication de l'ADN chez les procaryotes est un processus hautement régulé qui assure la duplication fidèle du génome, débutant par l'initiation à une origine spécifique et se poursuivant par l'élongation des nouvelles chaînes d'ADN [11](#page=11) [15](#page=15). ### 2.1 Origine de la réplication Le chromosome des procaryotes, tel que celui de E. Coli, d'une taille d'environ 4,2 millions de paires de bases, possède un site unique d'initiation de la réplication, appelé *oriC*. Ce locus *oriC* s'étend sur environ 245 paires de bases et est essentiel pour le démarrage du processus de réplication. L'*oriC* permet la formation de deux fourches réplicatives qui progressent dans des directions opposées le long du chromosome. La vitesse de synthèse de l'ADN pendant la réplication est d'environ 50 000 paires de bases par minute [11](#page=11). ### 2.2 Initiation de la réplication L'initiation de la réplication chez les procaryotes implique plusieurs étapes cruciales [15](#page=15). #### 2.2.1 Préparation à la réplication La première étape consiste en la fixation des protéines DnaA sur l'ADN. Chaque monomère de la protéine DnaA possède un domaine ATPase. L'ADN s'enroule ensuite autour d'un hexamère de DnaA, formant ainsi un complexe. Cet enroulement expose les simples brins d'ADN, créant des régions accessibles pour les protéines suivantes [15](#page=15). #### 2.2.2 Formation du complexe de pré-amorçage Une fois les simples brins exposés, le complexe de pré-amorçage se forme. L'hélicase hexamérique, la protéine DnaB, est recrutée et chargée autour de l'ADN, avec l'aide de la protéine DnaC. Les régions de l'*oriC* qui sont riches en paires de bases AT (adénine-thymine), connues pour être plus facilement déroulables en raison de leurs deux liaisons hydrogène, sont déroulées et occupées par des protéines SSB (Single-Strand Binding proteins). Ces protéines SSB stabilisent les simples brins d'ADN et les empêchent de se ré-hybrider. La primase peut alors s'insérer et synthétiser une amorce d'ARN. Par la suite, la DNA polymérase III s'assemble sur ce complexe de pré-amorçage, prête à commencer la synthèse de l'ADN. L'hydrolyse de l'ATP au sein de la protéine DnaA agit comme un signal pour l'initiation de la réplication de l'ADN [18](#page=18). > **Tip:** Les régions riches en AT sont souvent retrouvées au niveau des origines de réplication car elles nécessitent moins d'énergie pour être déroulées par l'hélicase. ### 2.3 Élongation L'élongation est la phase durant laquelle la nouvelle chaîne d'ADN est synthétisée. Ce processus implique deux opérations distinctes qui, bien qu'ayant un résultat similaire (synthèse d'ADN), diffèrent dans leurs mécanismes [20](#page=20). * **Synthèse d'un bras directeur continu (leading strand):** L'une des nouvelles chaînes d'ADN est synthétisée de manière continue dans le sens de progression de la fourche réplicative [20](#page=20). * **Synthèse d'un bras tardif discontinu (lagging strand):** L'autre nouvelle chaîne est synthétisée de manière discontinue, en fragments appelés fragments d'Okazaki, dans le sens opposé à la progression de la fourche réplicative [20](#page=20). --- # Les acteurs moléculaires de la réplication de l'ADN La réplication de l'ADN est un processus hautement coordonné impliquant une machinerie enzymatique complexe où chaque composant joue un rôle essentiel dans la fidélité et l'efficacité de la duplication du matériel génétique. ### 3.1 Les hélicases Les hélicases sont des enzymes indispensables à la séparation des deux brins d'ADN lors de la réplication. Elles requièrent l'hydrolyse d'adénosine triphosphate (ATP) pour fonctionner. Leur rôle consiste à dérouler l'hélice de l'ADN dans les deux directions, générant ainsi deux fourches de réplication actives. Ces enzymes sont caractérisées par leur haute processivité, ce qui signifie qu'elles peuvent lier l'ADN et le parcourir sur de longues distances sans se détacher. Elles se lient à l'ADN monocaténaire et se déplacent de manière orientée le long de celui-ci. Les hélicases adoptent une conformation en anneau, souvent sous forme d'hexamères, au niveau de la fourche de réplication, encapsulant l'ADN pour faciliter son déroulement [32](#page=32). ### 3.2 La primase La primase est une enzyme cruciale qui initie la synthèse de nouvelles chaînes d'ADN en créant des amorces d'ARN. Il s'agit d'une enzyme monomérique d'environ 65 kilodaltons, codée par le gène *dnaG*. Sa fonction est similaire à celle d'une ARN polymérase, car elle synthétise de courts segments d'ARN. Pour exercer son activité, la primase nécessite une séquence débutant par 5'-AG-3' sur le brin matrice d'ADN. On retrouve souvent trois primases associées à chaque hexamère d'hélicase, suggérant une coordination de leurs activités. L'amorce d'ARN synthétisée, d'une longueur d'environ 5 nucléotides, est complémentaire à un segment du brin matrice d'ADN et fournit une extrémité 3'-OH libre, nécessaire à l'ADN polymérase pour commencer l'élongation du brin d'ADN [35](#page=35). ### 3.3 L'ADN polymérase III L'ADN polymérase III est la principale enzyme responsable de l'élongation des nouvelles chaînes d'ADN lors de la réplication. Pour fonctionner, elle nécessite plusieurs éléments [37](#page=37): * Un brin d'ADN matrice servant de modèle pour la synthèse du brin complémentaire [37](#page=37). * Une amorce avec une extrémité 3'-OH libre, généralement fournie par la primase [37](#page=37). * Les quatre désoxyribonucléosides triphosphates: dATP, dCTP, dGTP et dTTP, ainsi que du magnésium (Mg²⁺) comme cofacteur [37](#page=37). L'élongation se déroule exclusivement dans le sens 5' vers 3'. L'ADN polymérase III est un complexe enzymatique multifonctionnel, conçu pour répliquer simultanément les deux brins d'ADN au niveau de la fourche de réplication. De manière cruciale, elle possède une activité exonucléasique intrinsèque dans le sens 3' vers 5'. Cette activité est essentielle pour la correction des erreurs, permettant de retirer les nucléotides mal appariés à l'extrémité du brin en croissance [37](#page=37). > **Tip:** L'activité exonucléasique 3' vers 5' de l'ADN polymérase III est un mécanisme de "relecture" qui augmente considérablement la fidélité de la réplication, réduisant le taux d'erreurs par un facteur important [37](#page=37). ### 3.4 L'ADN polymérase I L'ADN polymérase I remplit un rôle complémentaire à celui de l'ADN polymérase III, notamment dans la finition de la réplication des fragments d'Okazaki sur le brin discontinu. Comme l'ADN polymérase III, elle requiert un brin d'ADN matrice, une amorce avec une extrémité 3'-OH libre, les dNTPs et du Mg²⁺ pour la synthèse dans le sens 5' vers 3' [48](#page=48). La caractéristique distinctive de l'ADN polymérase I est la présence de deux activités exonucléasiques : * Une activité exonucléasique 3' vers 5', similaire à celle de l'ADN polymérase III, pour la correction d'erreurs [48](#page=48). * Une activité exonucléasique 5' vers 3' unique. Cette dernière est particulièrement importante car elle permet de retirer les amorces d'ARN synthétisées par la primase, tout en synthétisant simultanément de l'ADN pour les remplacer [48](#page=48). ### 3.5 Les ligases Les ligases interviennent dans les étapes finales de la réplication, particulièrement pour sceller les "lacunes" qui subsistent entre les fragments d'ADN. Après que l'ADN polymérase I ait retiré les amorces d'ARN et synthétisé les fragments d'ADN correspondants, il subsiste une coupure entre l'extrémité 3'-OH du nouveau fragment et l'extrémité 5'-phosphate du fragment précédent. L'ADN ligase catalyse la formation d'une liaison phosphodiester pour joindre ces fragments, assurant ainsi la continuité de la chaîne d'ADN. Les ligases nécessitent généralement une source d'énergie, comme l'ATP ou le NAD⁺, selon le type de ligase [51](#page=51). ### 3.6 Les topoisomérases Bien que non détaillées dans les pages spécifiées, il est important de noter le rôle des topoisomérases, qui sont des enzymes essentielles pour gérer la torsion de l'ADN pendant la réplication. Elles préviennent l'enroulement excessif de l'ADN en amont de la fourche de réplication en créant des coupures temporaires dans les brins d'ADN, permettant ainsi à l'ADN de se détendre, puis en recollant les brins coupés [30](#page=30). > **Tip:** Comprendre l'ordre d'action et les rôles spécifiques de chaque enzyme (hélicase, primase, ADN polymérases I et III, ligase) est fondamental pour appréhender la réplication de l'ADN. La présence d'activités exonucléasiques dans les ADN polymérases est une clé pour la fidélité de la réplication [30](#page=30) [37](#page=37) [48](#page=48). --- # Résumé et notions importantes de la réplication La réplication de l'ADN est un processus semi-conservatif essentiel à la transmission de l'information génétique, impliquant des étapes complexes et nécessitant divers éléments pour assurer la fidélité de la copie [57](#page=57). ### 4.1 Le modèle de réplication semi-conservative La réplication de l'ADN suit un modèle semi-conservatif, ce qui signifie que chaque nouvelle molécule d'ADN double brin est composée d'un brin parental (original) et d'un brin nouvellement synthétisé. Ce mécanisme assure que l'information génétique est fidèlement transmise à la génération suivante de cellules [57](#page=57). ### 4.2 Les étapes de la réplication Bien que le document ne détaille pas toutes les étapes de manière exhaustive sur les pages fournies, il est crucial de comprendre que la réplication comprend plusieurs phases distinctes. Ces étapes incluent généralement l'initiation, l'élongation et la terminaison [57](#page=57). ### 4.3 Les éléments nécessaires à la réplication La réplication de l'ADN requiert une série de composants moléculaires pour se dérouler correctement, incluant des enzymes spécifiques et des substrats [57](#page=57). ### 4.4 Concepts clés de la réplication Plusieurs termes sont fondamentaux pour comprendre le mécanisme de la réplication de l'ADN : #### 4.4.1 La fourche de réplication La fourche de réplication est la structure en forme de Y qui se forme à l'endroit où l'ADN double brin est déroulé et séparé pour permettre la synthèse de nouveaux brins. C'est le site actif où les deux nouveaux brins d'ADN sont synthétisés simultanément [57](#page=57). #### 4.4.2 L'élongation monodirectionnelle L'élongation monodirectionnelle fait référence au fait que la synthèse de nouveaux brins d'ADN se fait toujours dans la direction 5' vers 3' . Cependant, comme les deux brins parentaux sont antiparallèles, cela entraîne des modes de synthèse différents pour les deux nouveaux brins [57](#page=57). #### 4.4.3 Le brin avancé (leading strand) et le brin retardé (lagging strand) En raison de la nature bidirectionnelle de la fourche de réplication et de l'élongation monodirectionnelle (5' vers 3') des ADN polymérases, la synthèse des deux nouveaux brins ne peut pas se faire de manière continue sur les deux brins parentaux. * **Brin avancé:** Le brin avancé est synthétisé de manière continue dans la direction 5' vers 3', suivant l'ouverture de la fourche de réplication. Il est copié directement à partir du brin parental qui est orienté dans la direction 3' vers 5' par rapport à la fourche [57](#page=57). * **Brin retardé:** Le brin retardé est synthétisé de manière discontinue en une série de courtes portions appelées fragments d'Okasaki. Il est copié à partir du brin parental qui est orienté dans la direction 5' vers 3' par rapport à la fourche. La synthèse de ce brin doit se faire en "reculant" par rapport au mouvement global de la fourche, nécessitant des amorces d'ARN répétées [57](#page=57). #### 4.4.4 Les fragments d'Okasaki Les fragments d'Okasaki sont de courtes séquences d'ADN synthétisées sur le brin retardé. Chacun de ces fragments nécessite une amorce d'ARN pour initier la synthèse par l'ADN polymérase. Ces fragments sont ensuite liés ensemble par une enzyme appelée ADN ligase pour former un brin d'ADN continu [57](#page=57). > **Tip:** La compréhension de la relation entre l'orientation des brins parentaux, la direction de synthèse 5' vers 3', et la formation des brins avancé et retardé est fondamentale pour saisir la réplication de l'ADN. Les fragments d'Okasaki sont une conséquence directe de ces contraintes sur le brin retardé. --- ## Erreurs courantes à éviter - Révisez tous les sujets en profondeur avant les examens - Portez attention aux formules et définitions clés - Pratiquez avec les exemples fournis dans chaque section - Ne mémorisez pas sans comprendre les concepts sous-jacents

| Term | Definition | |------|------------| | Réplication | Processus par lequel une molécule d'ADN parentale est copiée pour former deux molécules d'ADN filles identiques. C'est une étape cruciale lors de la division cellulaire. | | ADN | Acide désoxyribonucléique, molécule qui porte l'information génétique dans la plupart des organismes vivants. Il est constitué de deux brins enroulés en double hélice. | | ADN parental | L'ADN original qui sert de modèle pour la synthèse de nouvelles molécules d'ADN lors de la réplication. | | ADN filles | Les deux nouvelles molécules d'ADN synthétisées lors du processus de réplication, chacune étant une copie de l'ADN parental. | | Division cellulaire | Processus par lequel une cellule se divise pour former deux ou plusieurs cellules filles, impliquant généralement la duplication du matériel génétique. | | Molécules d'ADN | Structures chimiques complexes qui composent le matériel génétique, formées de nucléotides liés entre eux. | | Procaryotes | Organismes unicellulaires dont les cellules ne possèdent pas de noyau défini ni d'organites membranaires, comme les bactéries et les archées. | | Origine de réplication | Site spécifique sur le chromosome d'ADN où commence la réplication. Chez les procaryotes, il y a généralement une seule origine de réplication. | | Fourche réplicative | Structure en forme de Y formée lorsque la double hélice d'ADN est déroulée par les hélicases, permettant la synthèse des nouveaux brins d'ADN. | | Complexe de pré-amorçage | Assemblage de protéines et d'enzymes qui se forme à l'origine de réplication et qui prépare le déroulement de l'ADN et l'initiation de la synthèse des nouveaux brins. | | Hélicase | Enzyme qui catalyse la séparation des deux brins de la double hélice d'ADN en rompant les liaisons hydrogène entre les bases azotées, un processus qui consomme de l'ATP. | | Ligase | Enzyme qui unit des fragments d'ADN en catalysant la formation d'une liaison phosphodiester entre l'extrémité 5' phosphate d'un nucléotide et l'extrémité 3' hydroxyle d'un autre. | | Topoisomérase | Enzyme qui modifie la topologie de l'ADN en coupant et en religuant les brins, afin de relâcher les tensions de superenroulement générées pendant la réplication ou d'autres processus. | | ADN polymérase III | L'enzyme principale responsable de la synthèse des nouveaux brins d'ADN pendant la réplication chez les procaryotes. Elle possède une activité exonucléasique 3' vers 5'. | | Primase | Enzyme qui synthétise de courtes amorces d'ARN sur le brin d'ADN matrice, fournissant une extrémité 3'-OH libre nécessaire à l'initiation de la synthèse par l'ADN polymérase. | | ADN polymérase I | Enzyme qui participe à la réplication en éliminant les amorces d'ARN et en remplaçant les nucléotides d'ARN par des nucléotides d'ADN. Elle possède des activités exonucléasiques 5' vers 3' et 3' vers 5'. | | Brin directeur (leader) | Le brin d'ADN synthétisé de manière continue dans la direction 5' vers 3' à mesure que la fourche réplicative progresse. | | Brin retardé (lagging strand) | Le brin d'ADN synthétisé de manière discontinue en petits fragments (fragments d'Okasaki) dans la direction opposée à la progression de la fourche réplicative. | | Fragments d'Okasaki | Petits fragments d'ADN synthétisés sur le brin retardé lors de la réplication. Ces fragments sont ensuite liés ensemble par la ligase. | | Semi-conservative | Modèle de réplication de l'ADN où chaque nouvelle molécule d'ADN est composée d'un brin d'ADN original (parental) et d'un brin d'ADN nouvellement synthétisé. |

# Inleiding tot microbiologie en het werkveld Dit hoofdstuk introduceert het vakgebied microbiologie, de historische ontwikkeling van de wetenschap en het werkveld van de microbioloog, inclusief de weerlegging van de theorie van spontane generatie. ## 1.1 Het werkgebied van de microbiologie Microbiologie is de wetenschap die zich bezighoudt met de studie van micro-organismen. Hoewel het publieke beeld van microbiologie vaak gericht is op ziektes veroorzakende microben, leven de meeste micro-organismen zonder schade of ziekte. Micro-organismen worden gedefinieerd als organismen die uitsluitend met een microscoop zichtbaar zijn, of die in hun levenscyclus ten minste één periode doormaken waarin een enkele cel zich als individu vermenigvuldigt. Een bredere definitie omvat ook microscopische organismen die uit één cel of celcluster bestaan, samen met virussen [7](#page=7). ### 1.1.1 Verschillen met macro-organismen Microbiële cellen verschillen van planten- en dierencellen doordat ze onafhankelijk kunnen leven en functioneren voor hun levensprocessen zoals groei, energievoorziening en voortplanting. Plantaardige en dierlijke cellen zijn vaak deel van meercellige structuren en niet onafhankelijk leefbaar [8](#page=8). ### 1.1.2 Groepen micro-organismen Algemeen worden de volgende groepen als micro-organismen beschouwd: protozoën, wieren, schimmels, slijmzwammen, gisten, bacteriën, en ook virussen, viroïden en prionen. Virussen, viroïden en prionen vormen een aparte groep omdat ze niet cellulair zijn opgebouwd [8](#page=8). ### 1.1.3 Specialisaties binnen de microbiologie Microbiologen kunnen zich specialiseren in: * **Specifieke groepen:** virologie, bacteriologie, fycologie (algologie), mycology, protozoölogie [8](#page=8). * **Karakteristieken en activiteiten:** microbiële morfologie, cytologie, ecologie, genetica en moleculaire biologie, taxonomie [8](#page=8). * **Specifieke domeinen:** medische microbiologie, levensmiddelenmicrobiologie, industriële microbiologie, agromicrobiologie [9](#page=9). ### 1.1.4 Rol en belang van micro-organismen Micro-organismen waren de eerste levende organismen op aarde en zijn alomtegenwoordig. Ze spelen een cruciale rol in ecosystemen en hebben een significante impact op gebieden zoals geneeskunde, landbouw, voeding, ecologie en biochemie [9](#page=9). #### 1.1.4.1 Schadelijke micro-organismen Pathogene micro-organismen veroorzaken ziekten bij mens, dier en plant. Andere micro-organismen kunnen schade veroorzaken door bederf van voedsel en landbouwgrondstoffen, wat leidt tot kwaliteitsverlies en economische schade [9](#page=9). #### 1.1.4.2 Commensale en nuttige micro-organismen De meerderheid van de micro-organismen is onschadelijk en wordt commensalen genoemd. Commensalisme is een vorm van symbiose waarbij één organisme voordeel heeft en het andere niet beïnvloed wordt. Voorbeelden zijn bacteriën op onze huid of in onze darmflora. Sommige micro-organismen, zelfs de meest virulente, worden als nuttig ervaren en hebben economische betekenis in diverse sectoren [9](#page=9). ##### 1.1.4.2.1 Toepassingen van nuttige micro-organismen * **Voedselproductie en -bewaring:** Fermentatieprocessen voor bier, brood, wijn, kaas, yoghurt en melkproducten, alsook conservering van voedsel [10](#page=10). * **Afvalverwerking:** Omzetting van huishoudelijk en industrieel afval tot meststoffen en vruchtbare grond, en vertering van petrochemisch afval [10](#page=10). * **Biotechnologische toepassingen:** Productie van enzymen (biokatalysatoren) voor o.a. leerlooierij, sapbereiding en zeepindustrie; productie van azijn, aceton, butanol en andere chemische grondstoffen [10](#page=10). * **Verteringsproces:** Ondersteuning van de spijsvertering bij mens en dier [10](#page=10). * **Geneeskunde:** Productie van antibiotica (zoals penicilline) uit schimmels en bacteriën, en de ontwikkeling van vaccins en immunoglobulines [10](#page=10). ## 1.2 Geschiedenis van de microbiologie De microbiologie ontstond met de ontdekking van micro-organismen door Antonie van Leeuwenhoek. Vroege bijdragen kwamen voornamelijk van medici en chemici, geïnteresseerd in ziekteverwekkers en chemische omzettingen [11](#page=11). ### 1.2.1 Oudheid Al in de oudheid was het onderscheid tussen besmettelijke en niet-besmettelijke ziekten bekend. Besmettelijke ziekten werden soms gezien als goddelijke straffen. Hygiënepraktijken, zoals beschreven in het Oude Testament, en ideeën over het voorkomen van ziekteverspreiding door afzondering, suggereren een vroeg begrip van ziekteoverdracht, hoewel de rol van micro-organismen toen nog onbekend was. Hippocrates theoretiseerde over "uitwasemingen" als oorzaak van besmetting [11](#page=11). ### 1.2.2 De "Generatio Spontanea" en de ontdekking van micro-organismen Robert Hooke was de eerste die micro-organismen waarnam met een microscoop en publiceerde zijn bevindingen in "Micrographia" inclusief de afbeelding van de schimmel *Mucor*. Antonie van Leeuwenhoek construeerde in 1676 een microscoop met een enkele lens waarmee hij bacteriën, door hem 'diertgens' genoemd, waarnam [11](#page=11) [12](#page=12) . #### 1.2.2.1 De theorie van spontane generatie (abiogenesis) Deze theorie, ondersteund door Aristoteles, stelde dat leven spontaan kon ontstaan uit niet-levend materiaal. Men geloofde dat levenskrachten in dood materiaal aanwezig bleven en zo nieuw leven konden voortbrengen, zoals vliegen uit rundveekadavers of muizen uit graan in vochtige kelders [12](#page=12). #### 1.2.2.2 Experimenten en weerlegging * **Needham:** Vulde een kolf met organische vloeistof, kookte deze en sloot deze af met een kurk. Troebeling en aanwezigheid van micro-organismen werden waargenomen, wat als bewijs voor spontane generatie werd gezien [12](#page=12) . * **Spallanzani (ca. 1765):** Voerde vergelijkbare experimenten uit, maar verhitte de kolven langer en sloot ze hermetisch af door ze dicht te smelten. In deze kolven ontstond geen troebeling. Hij concludeerde dat lucht, en mogelijk levende kiemen daarin, cruciaal waren voor het ontstaan van leven in Needhams experimenten [13](#page=13). * **Appert:** Publiceerde een proces om voedsel houdbaar te maken door verhitting in afgesloten glazen, wat leidde tot weinig zuurstof in het voedsel [13](#page=13) . * **Schwann:** Liet lucht toe tot de kolven, maar verhitte deze eerst om eventuele organismen te doden. Ook experimenten waarbij lucht door loog of zuur werd geleid om kiemen te verwijderen, resulteerden meestal in heldere vloeistoffen. Tegenstanders meenden dat deze behandelingen de "leven opwekkende kracht" van lucht vernietigden [13](#page=13) . ### 1.2.3 De microbiologie als wetenschap Louis Pasteur leverde in 1861 overtuigend bewijs dat de theorie van spontane generatie omverwierp. Hij gebruikte een kolf met een zwanenhals, die open verbinding met de lucht had maar de opdwarrelende micro-organismen door hun gewicht in de gebogen hals achterliet [13](#page=13). > **Tip:** Het experiment van Pasteur met de zwanenhalskolf is een cruciaal voorbeeld van hoe wetenschappelijke hypotheses getest en weerlegd worden door zorgvuldig ontworpen experimenten. * **Pasteurs experiment:** Vruchtensappen in zwanenhalskolven bleven helder en ondergingen geen fermentatie, omdat micro-organismen uit de lucht niet in de vloeistof konden komen. Indien de zwanenhals werd afgebroken, de kolf werd gekanteld, of geforceerde luchtcirculatie werd toegepast, trad wel troebeling en vergisting op [13](#page=13) [14](#page=14). Pasteur concludeerde dat rotting en gisting het gevolg waren van de groei en ontwikkeling van micro-organismen die van buitenaf in materiaal terechtkwamen (biogenese of kiemtheorie). Met deze vaststelling was de basis gelegd voor het wetenschappelijk begrijpen en gericht toepassen van microbiële omzettingen, wat de weg vrijmaakte voor biotechnologie [14](#page=14). --- # Celbouw van micro-organismen Dit gedeelte biedt een gedetailleerd overzicht van de celstructuren van micro-organismen, met een focus op de fundamentele verschillen tussen prokaryotische en eukaryotische cellen, inclusief de samenstelling van de celwand, het cytoplasma, de kern en subcellulaire deeltjes [22](#page=22). ### 2.1 Prokaryotische versus eukaryotische micro-organismen Levende organismen zijn per definitie opgebouwd uit één of meerdere cellen, de universele bouwstenen van het biologisch leven. Virussen, viroïden en prionen zijn infectieuze agentia die tot de micro-organismen gerekend worden, maar geen levende organismen zijn omdat ze niet uit cellen zijn opgebouwd. Micro-organismen, met uitzondering van deze niet-levende agentia, kunnen één- of meercellig zijn, maar zijn overwegend ééncellig met weinig celldifferentiatie bij meercellige vormen [22](#page=22). Er zijn twee hoofdtypen cellen te onderscheiden: prokaryotische cellen (betekenis: "voor de kern") en eukaryotische cellen (betekenis: "echte kern"). Kennis hierover is verkregen via elektronenmicroscopisch onderzoek en biochemische analyses. Prokaryotische cellen, die uitsluitend voorkomen bij Bacteria en Archaea, zijn kleiner en primitiever in interne structuur dan de grotere eukaryotische cellen, die bij de overige micro-organismen (Eukarya) te vinden zijn. Een cruciaal verschil is de aanwezigheid van membraanomhulde organellen in eukaryotische cellen, die afwezig zijn in prokaryotische cellen. Bekende organellen zijn de kern en mitochondria, die essentieel zijn voor genetische informatie-opslag en energieproductie (respiratieprocessen) respectievelijk [22](#page=22) [23](#page=23). > **Tip:** Onthoud dat de basisbouwstenen van alle levende organismen cellen zijn, en dat micro-organismen voornamelijk ééncellig zijn. De indeling in prokaryoot en eukaryoot is fundamenteel voor het begrijpen van hun celbouw. #### 2.1.1 Kenmerken van eukaryotische en prokaryotische cellen | Eigenschap | Eukaryoot | Prokaryoot | | :-------------------------- | :---------------------------------------------------------- | :---------------------------------------------------------------------------- | | Kernstructuur DNA | Meerdere chromosomen, geassocieerd met histoneiwitten | Eén chromosoom, naakt (geen histon-eiwitten), circulair | | Kernmembraan | Aanwezig | Afwezig | | Endoplasmatisch reticulum | Aanwezig | Afwezig | | Mitochondriën | Aanwezig | Afwezig | | Ribosomen | 80 S | 70 S | | Lysosomen | Aanwezig | Afwezig | | Cytoplasmatisch membraan | Aanwezig, bevat sterolen | Aanwezig, geen sterolen (behalve Mycoplasma) | | Celwand | Afwezig of gevormd door cellulose, geen peptidoglycaan | Complexe structuur met peptidoglycaanlaag, eiwit en lipiden | | Kapsel | Afwezig | Doorgaans aanwezig | Tegenwoordig worden prokaryoten ingedeeld in twee domeinen: Bacteria (voorheen Eubacteria) en Archaea ("oud"). Hoewel microscopisch vergelijkbaar (ééncellig, geen kernmembraan, geen membraanomhulde organellen), verschillen Archaea van Bacteria in celmembraansamenstelling, rRNA en het ontbreken van peptidoglycaan in hun celwand [25](#page=25). | Kenmerk | Bacteria | Archaea | Eukaryoten | | :-------------------- | :---------------------- | :---------------------------- | :-------------------- | | Gemiddelde grootte | 0,3-2 µm | 0,3-2 µm | 5-50 µm | | Kernmembraan | Geen | Geen | Ja | | Celwand | Peptidoglycaan aanwezig | Geen peptidoglycaan | Geen peptidoglycaan | | Mitochondriën | Geen | Geen | Ja | | Chloroplasten | Geen | Geen | In planten- en algencellen | | Cytoskelet | Geen | Geen | Ja | | Ecologische vindplaats | In alle omgevingen | Frequent in extreme omgevingen | In niet-extreme omgevingen | ### 2.2 Kern De erfelijke eigenschappen van een cel zijn gecodeerd in het DNA, dat zich in de kern of het kernmateriaal bevindt [27](#page=27). #### 2.2.1 Kern in eukaryotische cellen Bij eukaryotische micro-organismen is het lineaire DNA gebonden aan eiwitten (histonen) en vormt het meerdere chromosomen. Deze chromosomen bevinden zich in een kern, omgeven door een dubbellaags kernmembraan met poriën die contact met het cytoplasma mogelijk maken. Elk chromosoom is opgedeeld in genen, die specifieke erfelijke eigenschappen bevatten. De kern kan ook één of meer nucleoli (kernlichaampjes) bevatten, die onder andere ribosomaal RNA (rRNA) produceren. Eukaryotische cellen zijn genetisch diploïd, wat betekent dat ze twee kopieën van elk gen hebben. Dit maakt mitose (kerndeling) en meiose (reductiedeling) mogelijk, wat leidt tot aseksuele en seksuele voortplanting. DNA is ook te vinden buiten de kern, in mitochondria en chloroplasten, die een zekere genetische autonomie bezitten [24](#page=24) [27](#page=27). > **Tip:** Onthoud de termen "diploïd" (twee kopieën van elk gen) en de processen "mitose" (identieke dochtercellen) en "meiose" (vorming van gameten). #### 2.2.2 Kern in prokaryotische cellen Prokaryotische micro-organismen hebben geen kernmembraan; hun DNA ligt vrij in het cytoplasma in een structuur die de nucleoïde wordt genoemd. Het DNA van het prokaryotische chromosoom is "naakt", wat betekent dat het niet gebonden is aan eiwitten. Het is meestal een circulair en sterk gewonden DNA-molecuul. Prokaryoten zijn genetisch haploïd, met slechts één kopie van elk gen. Naast het hoofdchromosoom kunnen prokaryoten ook kleine, circulaire DNA-moleculen bezitten, genaamd plasmiden. Plasmiden zijn niet essentieel voor de groei, maar kunnen nuttige eigenschappen bieden, zoals resistentie tegen antibiotica [24](#page=24) [27](#page=27). #### 2.2.3 Chemische en ruimtelijke structuur van DNA DNA is opgebouwd uit nucleotiden, bestaande uit een fosfaatgroep, desoxyribose (bij RNA: ribose) en een heterocyclische N-verbinding (adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T)). In 1953 stelden Watson en Crick een dubbele helixmodel voor, waarbij twee polynucleotideketens om dezelfde as draaien. De "zijkanten" van de helix bestaan uit desoxyribose en fosfaatgroepen, terwijl de "sporten" worden gevormd door de N-verbindingen die via waterstofbruggen aan elkaar gebonden zijn. Adenine vormt twee waterstofbruggen met thymine, en cytosine met guanine. De twee ketens zijn complementair, wat betekent dat ze slechts op één manier in elkaar passen [28](#page=28) [29](#page=29). ### 2.3 Cytoplasma Het cytoplasma is de colloïde-achtige substantie die de cel omsluit en bestaat voornamelijk uit water, zouten, suikers, aminozuren, eiwitten (waaronder enzymen), RNA en lipoïden. Hoewel met de elektronenmicroscoop geen duidelijke structuur zichtbaar is, kan in oudere cellen een granulaire structuur worden waargenomen. Protoplasma omvat het cytoplasma plus de kern [29](#page=29). ### 2.4 Subcellulaire deeltjes en structuren #### 2.4.1 Mitochondriën Mitochondriën zijn membraanomhulde organellen (met een dubbele membraanlaag) die in het cytoplasma van eukaryotische cellen voorkomen. Ze worden beschouwd als de "energieproducenten" van de cel omdat hier oxidatieprocessen (oxidatieve fosforylatie) plaatsvinden om energie te winnen. In prokaryotische cellen zijn nooit mitochondriën aangetroffen; energieproductie vindt daar plaats aan het cytoplasmatisch membraan [23](#page=23) [29](#page=29). #### 2.4.2 Chloroplasten, chromatoforen en chromoplasten Chloroplasten, aanwezig in wieren en plantencellen, bevatten chlorofyl en zijn essentieel voor fotosynthese. Hun structuur is gelaagd en complex. Fotosynthetische bacteriën en cyanobacteriën hebben eenvoudigere structuren voor fotosynthese: chromatoforen bij bacteriën en chromoplasten bij cyanobacteriën. De groene kleur van chlorofyl en bacteriochlorofyl wordt vaak gedomineerd door gele tot rode carotenoïden [29](#page=29). #### 2.4.3 Endoplasmatisch reticulum (ER) Het ER is een ingewikkelde membraanstructuur die een kanalensysteem in het cytoplasma vormt en de kern, cytoplasma en celmembraan met elkaar verbindt. Er zijn twee typen: glad ER, betrokken bij lipidesynthese, en ruw ER, dat bezet is met ribosomen en betrokken is bij eiwitsynthese en de productie van nieuw membraanmateriaal. Het ER transporteert eiwitten en vetten in de cel. Prokaryotische cellen bezitten geen ER [30](#page=30). #### 2.4.4 Ribosomen Ribosomen zijn kleine deeltjes (ongeveer 15 nm diameter) die cruciaal zijn voor eiwitsynthese. Ze komen in grote aantallen voor, zowel vrij in het cytoplasma als gebonden aan het ER. Ribosomen bestaan uit twee rRNA- en eiwitrijke subeenheden. Prokaryotische ribosomen zijn kleiner (70S) dan eukaryotische ribosomen (80S). Snelgroeiende cellen hebben meer ribosomen. Eiwitsynthese wordt door DNA gecontroleerd; een sequentie van drie nucleotiden (een triplet of codon) codeert voor een specifiek aminozuur. Het proces van transcriptie zet genetische informatie van DNA om in messenger-RNA (mRNA) [25](#page=25) [30](#page=30). RNA (ribonucleïnezuur) verschilt van DNA door de aanwezigheid van ribose (in plaats van desoxyribose), uracil (U) in plaats van thymine (T), een enkele helix, en een lagere molecuulmassa. Naast mRNA bestaan er ook transfer-RNA (tRNA) voor het aanvoeren van aminozuren en ribosomaal RNA (rRNA) voor de opbouw van ribosomen. Eiwitsynthese (translatie) vindt plaats op ribosomen, waar mRNA en aminozuur-tRNA-complexen samenkomen om de juiste aminozuursequentie te vormen [31](#page=31). > **Tip:** Het proces van "gen tot eiwit" omvat transcriptie (DNA naar mRNA) en translatie (mRNA naar eiwit, met hulp van tRNA en ribosomen). #### 2.4.5 Golgi-apparaat Het Golgi-apparaat (of dictyosoom) is verantwoordelijk voor de eindsynthese, verpakking, secretie en chemische modificatie van producten die door het ruw ER zijn aangeleverd. Het bestaat uit membraanomhulde holtes, waaruit transportblaasjes kunnen afsnoeren om inhoud naar buiten de cel te transporteren (secretie). Het Golgi-apparaat komt niet voor bij prokaryotische bacteriële cellen [32](#page=32). #### 2.4.6 Lysosomen Lysosomen zijn "verteringsorganellen" die uitsluitend in eukaryotische cellen voorkomen. Ze bevatten hydrolytische enzymen die macromoleculen en micro-organismen afbreken (fagocytose) [32](#page=32). #### 2.4.7 Vacuolen Vacuolen zijn met celvocht gevulde blaasjes in eukaryotische cellen, omgeven door een dunne wand. Ze kunnen afvalstoffen en reservestoffen bevatten en worden groter naarmate de cel ouder wordt [33](#page=33). #### 2.4.8 Korrels Veel micro-organismen slaan voedingsstoffen op in de vorm van korrels, zoals poly-β-hydroxyboterzuur (PHB) en granulose (een glucosepolymeer). Andere verbindingen zoals fosfaten (poolkorrels) en zwavel (zwavelkorrels bij zwavelbacteriën) kunnen ook worden opgeslagen [33](#page=33). ### 2.5 Cytoplasmatisch membraan Het cytoplasmatisch membraan (celmembraan) is een dunne (ongeveer 8 nm dikke) structuur die de cel omgeeft en een selectieve barrière vormt tussen het cytoplasma en de omgeving. Het bestaat uit een fosfolipide dubbellaag met twee hydrofiele lagen en een binnenste hydrofobe laag, geassocieerd met membraaneiwitten. Dit membraan is dynamisch en flexibel [33](#page=33). Functies van het cytoplasmatisch membraan omvatten: * **Selectief permeabele barrière:** reguleert transport van stoffen [33](#page=33). * **Transport:** passief transport (diffusie) en actief transport (met energie, bv. permease pompen) [34](#page=34). * **Metabolische processen:** bij prokaryoten vindt hier energiegeneratie plaats (respiratie, fotosynthese, vetsynthese) [34](#page=34). * **Synthese:** betrokken bij celwand-, slijmlaag- en kapselvorming [34](#page=34). Bij ademende prokaryoten zonder mitochondriën vinden oxidatieprocessen plaats aan het membraan, vergelijkbaar met de functie van mitochondriën. Bij fotosynthetische bacteriën kunnen membraanplooien (lamellen) fungeren als functionele equivalenten van thylakoïden in chloroplasten [34](#page=34). > **Tip:** Het cytoplasmatisch membraan is meer dan een simpele barrière; het is een vitaal onderdeel voor transport, energieproductie en synthese. ### 2.6 Celwand De celwand, die het cytoplasmatisch membraan omgeeft, bepaalt de vorm en stevigheid van de cel en beschermt tegen osmotische drukken. Protozoa hebben geen celwand. Wieren hebben celwanden van cellulose, gisten en schimmels van chitine en hemicellulose, en kiezelwieren van anorganische verbindingen [34](#page=34). #### 2.6.1 Celwand van bacteriën Vrijwel alle bacteriën (behalve mycoplasma's) hebben een celwand, waarin peptidoglycaan een belangrijk bestanddeel is. Peptidoglycaan is een netwerk van mucopolysacchariden en mucopeptiden [34](#page=34). * **Gram-positieve bacteriën:** hebben een dikke celwand met veel lagen peptidoglycaan (20-50 nm dik). Ze bevatten teichoïnezuren, die bijdragen aan de negatieve lading van de celwand en metaalionen binden [35](#page=35). * **Gram-negatieve bacteriën:** hebben een dunne peptidoglycaanlaag (2-3 nm). Daarbuiten bevindt zich een buitenmembraan (outer membrane) dat lipopolysacchariden (LPS) bevat, samen met fosfolipiden en eiwitten. Deze LPS-laag kan bijdragen aan pathogene eigenschappen [35](#page=35). #### 2.6.2 Gramkleuring De Gramkleuring is een methode die bacteriën indelt in twee groepen op basis van hun celwandstructuur [35](#page=35): * **Gram-positieve (G+) bacteriën:** houden het kristalviolet vast en kleuren paars/blauw vanwege de dikke peptidoglycaanlaag [36](#page=36). * **Gram-negatieve (G-) bacteriën:** spoelen het kristalviolet uit en kleuren roze/rood door de dunne peptidoglycaanlaag en het buitenmembraan. Het alcoholbehandelingsproces bij G- bacteriën laat het complex uit de cel extraheren [36](#page=36) [37](#page=37). > **Tip:** De Gramkleuring is een essentieel diagnostisch hulpmiddel dat direct inzicht geeft in de celwandstructuur en dus potentieel in de pathogene eigenschappen van bacteriën. #### 2.6.3 Protoplasten Sommige micro-organismen, zoals bacteriën, kunnen zonder celwand voorkomen en worden dan protoplasten genoemd. Ze zijn osmotisch gevoelig en kunnen barsten in een hypotone omgeving (lage osmotische druk) of inkrimpen in een hypertoon milieu (hoge osmotische druk). Protoplasten kunnen worden gevormd door enzymen zoals lysozym (dat de mucopolysacchariden van peptidoglycaan aantast) of door penicilline (dat de vorming van peptidoglycaan belemmert) [37](#page=37) [38](#page=38). ### 2.7 Slijmlaag en kapsel Veel bacteriën zijn omgeven door slijmachtige stoffen, die soms een dikte van 10 µm kunnen bereiken [38](#page=38). * **Kapsel:** een scherp begrensde, stevige laag [38](#page=38). * **Slijmlaag:** een vager begrensde, losse laag [38](#page=38). Eukaryotische cellen bezitten geen slijmlaag [38](#page=38). De aanwezigheid van een kapsel of slijmlaag beïnvloedt de kolonie-vorm op vaste voedingsbodem (S-type: glad en glinsterend; R-type: droog en gerimpeld). De vorming wordt beïnvloed door het externe milieu. Slijmlagen worden vaak gevormd uit koolhydraten, zoals bij *Streptococcus mutans*. Kapsels kunnen uit koolhydraten of eiwitten bestaan [38](#page=38) [39](#page=39). > **Tip:** Een kapsel kan een belangrijke virulentiefactor zijn bij pathogenen, omdat het bescherming biedt tegen fagocytose en antibacteriële stoffen. Het kapselantigeen wordt aangeduid met de letter K [39](#page=39). ### 2.8 Flagellen & ciliën en pili & fimbriae * **Flagellen en ciliën:** draadvormige uitsteeksels voor zwemmende voortbeweging. Lange uitsteeksels zijn flagellen, korte zijn ciliën. Bacteriële flagellen bestaan uit het eiwit flagelline en zijn spiraalvormig [39](#page=39). * **Pili en fimbriae:** zeer dunne, eiwitachtige aanhangsels, zichtbaar met elektronenmicroscoop, vooral op Gram-negatieve bacteriën [40](#page=40). * **Fimbriae:** relatief kort, essentieel voor adhesie aan oppervlakken (bv. dierlijke weefsels) en aggregatie tot biofilms [40](#page=40). * **Pili:** langer dan fimbriae, kunnen ook aanhechten, maar zijn voornamelijk betrokken bij genetische materiaaluitwisseling tijdens conjugatie (sex- of F-pili) [40](#page=40). ### 2.9 Endosporen Bij geslachten als *Bacillus* en *Clostridium* kan onder ongunstige omstandigheden een endospore worden gevormd (sporulatie). De endospore omsluit het kernmateriaal en wordt na afsterven van de vegetatieve cel vrijgegeven. De endospore wordt omhuld door verschillende lagen, waaronder een cortex (rijk aan dipicolinezuur) en een sporecoat (rijk aan teichoïnezuur). Endosporen zijn extreem resistent tegen omgevingsfactoren [40](#page=40). --- # Morfologie en classificatie van micro-organismen Dit onderwerp behandelt de diverse vormen en indelingen van micro-organismen, inclusief schimmels, gisten, bacteriën, archaea, protozoa, algen, virussen, viroïden en prionen, en hun taxonomische plaatsing [42](#page=42). ### 3.1 Schimmels en aanverwante soorten #### 3.1.1 Schimmels Schimmels behoren tot de Fungi, een groep eukaryotische micro-organismen binnen het domein van de Eucarya. Ze komen voor in diverse habitats, voornamelijk in de bodem, en zijn saprofyten die zich voeden met dood organisch materiaal. Een deel is fytopathogeen, zoals *Didymella bryoniae* die komkommerplanten aantast, of veroorzakers van witziekte zoals *Erysiphe cichoracearum* en *Podosphaera xanthii*. Slechts enkele schimmels zijn parasitair op mens en dier [42](#page=42). Schimmels, ook wel filamenteuze fungi genoemd, zijn chemo-heterotrofe één- of meercellige micro-organismen. Hun cytoplasmatisch membraan bevat sterolen en hun celwand bevat geen peptidoglycaan [42](#page=42). * **Chemo-heterotroof**: Organisme dat energie verkrijgt door oxidatie van chemische verbindingen en organisch celmateriaal opbouwt uit organische verbindingen, afhankelijk van andere organismen [43](#page=43). Macroscopisch worden schimmels herkend aan hun harige, donzige structuur. Een schimmelkolonie bestaat uit het vegetatieve deel, de *thallus*, en kan bedekt zijn met sporen. Microscopisch ziet men lange, cilindrische draden (hyfen) met een diameter van 2-10 µm. Hyfen kunnen één- of meercellig zijn en gesepteerd (verdeeld door dwarswanden, septa) of coenocytisch (één grote cel met meerdere kernen). Hogere schimmels hebben septa met poriën die cytoplasma's verbinden, terwijl lagere schimmels coenocytisch zijn. De vertakte hyfen vormen een netwerk, het mycelium [43](#page=43). Sporen worden gevormd voor voortplanting, in tegenstelling tot bacteriële endosporen die voor overleving dienen. Schimmels planten zich meestal ongeslachtelijk voort via mitosporen (mitose), maar ook geslachtelijk via meiosporen (meiosis) [44](#page=44). ##### 3.1.1.1 Ongeslachtelijke voortplanting Bij ongeslachtelijke voortplanting worden enorme aantallen sporen gevormd die zich verspreiden via wind of dieren. Bekende voorbeelden zijn de groene *Aspergillus* en *Penicillium*, en de zwarte *Mucor* en *Rhizopus*. Sporen kunnen exogeen (hele cel draagt bij) of endogeen (niet de gehele cel/wand) worden gevormd [44](#page=44) [45](#page=45). * **Conidiosporen**: Exogeen gevormd aan het uiteinde van speciale hyfen (conidiofoor) [44](#page=44). * **Sporangiosporen**: Endogeen gevormd binnen een sporangium [45](#page=45). De spore kan beweeglijk (zoöspore, met flagel) of onbeweeglijk (aplanospore) zijn, en met of zonder celwand [45](#page=45). ##### 3.1.1.2 Geslachtelijke voortplanting Geslachtelijke schimmelsporen (meiosporen) ontstaan na samensmelting van gespecialiseerde hyfen en hun genetisch materiaal. Ze worden gevormd in speciale organen (vruchtlichamen) [46](#page=46): * **Ascosporen**: Gevormd in een ascocarp met asci (Ascomyceten) [46](#page=46). * **Basidiosporen**: Gevormd op een basidiocarp met basidia (Basidiomyceten, o.a. paddestoelen) [46](#page=46). * **Zygosporen**: Gevormd door Zygomyceten [46](#page=46). #### 3.2.2 Slijmzwammen of myxomyceten Slijmzwammen zijn eukaryotische micro-organismen die gelijkenissen vertonen met fungi en protozoa. Ze hebben een levenscyclus met sporenvorming en kunnen zich bewegen over oppervlakken. Ze worden onderverdeeld in cellulaire en acellulaire slijmzwammen [47](#page=47). * **Cellulaire slijmzwammen**: De vegetatieve vorm is één enkele amoebe [47](#page=47). * **Acellulaire slijmzwammen**: Het vegetatieve deel is een plasmodium (massa cytoplasma met kernen) omgeven door een celwand. Dit plasmodium neemt voedsel op via fagocytose. Bij voortplanting wordt een sporangium gevormd waarin sporen ontstaan, die bij ontkieming amoebe-achtige gameten vormen die samensmelten tot zygoten [47](#page=47) [48](#page=48). #### 3.2.3 Lichenes of korstmossen Lichenen zijn microbiële symbioses van een fungus met een alg (of cyanobacterium) die niet zonder elkaar kunnen leven. Ze groeien op diverse oppervlakken. De alg is fototroof en produceert organisch materiaal voor de fungus, die op zijn beurt bescherming biedt [48](#page=48). ### 3.3 Gisten Gisten behoren tot de Fungi, maar onderscheiden zich door hun ééncelligheid. Ze zijn gemiddeld 10 µm groot en waarneembaar onder de microscoop. De celvorm varieert (rond, ovaal, cilindrisch). Gisten zijn meestal facultatief aëroob. Commercieel belangrijke gisten zijn *Saccharomyces* (bakkers- en brouwersgist) [49](#page=49). Gisten delen zich meestal ongeslachtelijk door knopvorming. Net als bij schimmels kunnen ze ook geslachtelijke sporen (ascosporen) vormen die in een ascus voorkomen [49](#page=49). ### 3.4 Bacteriën Bacteriën zijn ongeveer tienmaal kleiner dan gisten en zijn meestal alleen na fixatie en kleuring goed waarneembaar. Hun grootte varieert doorgaans van 0,3 µm tot 1-2 µm. Morfologisch is de verscheidenheid gering. Bacteriën zijn meestal ééncellig, soms meercellig zonder weefseldifferentiatie [50](#page=50). #### Morfologische vormen van bacteriën: * **Coccen (bolvormig)**: Kunnen voorkomen als diplococcen (tweevoud), streptococcen (ketens), tetracoccen (vier op een rij), sarcina (kubus van acht), en micrococcen/staphylococcen (druiventros). De diameter is meestal ca. 0,5 µm [50](#page=50). * **Bacillen (staafvormig)**: Meestal geïsoleerd, soms als ketens (streptobacillen) of palissade-achtig (Corynebacteriën). Variatie in lengte en diameter. Sommige bacillen kunnen sporen vormen (terminaal, centraal, subterminaal) [51](#page=51). * **Vibrionen (kommavormig)**: Staafjes, licht gebogen in één vlak [52](#page=52). * **Spirillen (spiraalvormig)**: Gekromd in meerdere vlakken, als een kurkentrekker [52](#page=52). * **Spirocheten**: Flexibele, spiraalvormige microben met slangachtige beweging [52](#page=52). **Pleomorfie** is het verschijnsel waarbij bacteriën verschillende vormen kunnen aannemen binnen dezelfde cultuur, zoals rond- tot ovaalvormige coccoïde vormen naast de staafvorm [52](#page=52). #### Beweging bij bacteriën: Bacteriën kunnen beweeglijk zijn met een glijdende beweging of een "zwemmende" beweging door flagellen. De aanhechtingsplaats van flagellen verdeelt ze in [52](#page=52): * **Monotrich**: Eén flagel aan één pool [52](#page=52). * **Amfitrich**: Eén flagel aan elke pool [52](#page=52). * **Lofotrich**: Bundel flagellen aan één pool [52](#page=52). * **Peritrich**: Meerdere flagellen rondom de hele cel [52](#page=52). * **Amfi-lofotrich**: Twee bundels flagellen, één aan elke pool [52](#page=52). * **Atrich**: Afwezigheid van flagellen [52](#page=52). Een ander morfologisch kenmerk is de aanwezigheid of afwezigheid van een kapsel of slijmlaag [52](#page=52). ### 3.5 Overgangsgroepen #### 3.5.1 Archaea Archaea vormen een van de drie domeinen van het leven met een prokaryote cellulaire structuur. Ze verschillen evolutionair van bacteriën en eukarya, met unieke membraanlipiden. Peptidoglycaan en een buitenmembraan zijn afwezig. Veel Archaea zijn extremofielen, groeiend bij extreme temperaturen, zoutconcentraties of pH-waarden. Voorbeelden zijn methanogenen, extreme halofielen en thermo-acidofielen [53](#page=53). #### 3.5.2 Rickettsiae (Obligaat parasitaire bacteriën) Dit zijn zeer kleine cocoïde staafjes (300-600 nm) met bacteriele bouw, maar niet zichtbaar met een lichtmicroscoop. Ze zijn obligaat intracellulaire parasieten en staan qua groeivoorwaarden dicht bij virussen. Ze veroorzaken diverse ziektes bij plant, mens en dier [54](#page=54). #### 3.5.3 Actinomyceten (Straalschimmels) Filamenteuze bacteriën die sterk vertakte cellen en een mycelium vormen, met gelijkenis aan schimmels maar prokaryotische celbouw. Ze zijn belangrijk bij de afbraak van organisch materiaal in de bodem en domineren bij hoge pH, temperatuur en waterstress. Vele soorten produceren antibiotica als secundaire metabolieten en spelen een rol in de bodemhomeostasis [54](#page=54). #### 3.5.4 Mycoplasma Deze bacteriën hebben geen celwand, wat hun grootte beperkt. Hun kolonies lijken op een spiegelei of een druppeltje water door groei in de agar. Ze hebben geen vaste vorm en kunnen lijken op fungi door filamentachtige uitgroei. Ze zijn moeilijk te kweken en langzaam groeiend. *Mycoplasma pneumoniae* is een pathogeen voor dier en mens [54](#page=54). #### 3.5.5 Mycobacteria Aerobe staafvormige micro-organismen die op schimmels lijken. Ze hebben een atypische celwand, waardoor ze ongevoelig zijn voor penicillines. Bekende pathogene soorten zijn *Mycobacterium tuberculosis*, *M. leprae*, en *M. bovis* [55](#page=55). #### 3.5.6 Myxobacteria (Glijdende bacteriën) Lijken op myxomyceten (slijmzwammen) maar hebben een prokaryotisch celtype en vertonen glijdende beweeglijkheid. Ze zijn typisch lang-staafvormig of filamentvormig. "Fruiting myxobacteria" vormen multicellulaire vruchtlichamen die myxosporen produceren via een complexe levenscyclus [55](#page=55). #### 3.5.7 Cyanobacteria Fotosynthetische bacteriën (fototrofen) die vroeger blauwwieren werden genoemd. Ze hebben een prokaryotisch celtype en vertonen morfologische variatie van ééncellig tot filamenteus. Ze kunnen bijdragen aan eutrofiëring van oppervlaktewateren [56](#page=56) [58](#page=58). ### 3.6 Protozoa Protozoa zijn ééncellige eukaryote micro-organismen zonder celwand. Ze zijn over het algemeen kleurloos en beweeglijk, met afmetingen variërend van ca. 1 µm tot 500 µm. Hun grotere afmetingen en eukaryotische aard onderscheiden hen van bacteriën. Ze komen voor in zoet- en zoutwaterhabitats en kunnen zich geslachtelijk en ongeslachtelijk vermeerderen [56](#page=56). #### Morfologische groepen van Protozoa: * **Amoeben**: Kunnen uitstulpingen (pseudopodiën) vormen voor voortbeweging en voedselopname. Sommige vormen een exoskelet [57](#page=57). * **Ciliaten**: Gekenmerkt door trilharen (ciliën) op de cel voor beweeglijkheid. Ze hebben twee kernen (macro- en microkern) en vaak trichocysten [57](#page=57). * **Flagellaten**: Bezitten één of enkele flagellen aan een uiteinde voor beweeglijkheid [57](#page=57). * **Apicomplexa (vroeger Sporozoa)**: Geen beweeglijk volwassen stadium; produceren sporozoïten die een rol spelen in hun parasitair karakter [57](#page=57). Diverse pathogene soorten behoren tot de protozoa, waaronder *Giardia*, *Entamoeba*, *Trypanosoma*, *Cryptosporidium*, *Toxoplasma*, en *Plasmodium* (veroorzaker van malaria) [57](#page=57). ### 3.7 Algen Algen (wieren) zijn eukaryotische micro-organismen met een celwand en fotosynthetische kleurstoffen (fototrofen). Alle algen bezitten chlorofyl in hun chloroplasten. Kleurverschillen worden veroorzaakt door pigmentstoffen [57](#page=57). Vormen variëren van ééncellig tot meercellig. Veel soorten zijn beweeglijk met polaire zweepdraden. Algen kunnen zich geslachtelijk en ongeslachtelijk voortplanten [58](#page=58). * **Kiezelwieren (diatomeeën)**: Hebben een verkiezelde celwand [58](#page=58). * **Dinoflagellaten**: Kunnen zeer toxische "red tides" veroorzaken en via de voedselketen schadelijk zijn [59](#page=59). Eutrofiëring is het vergroten van de voedselrijkdom in water, wat kan leiden tot algenbloei [58](#page=58). ### 3.8 Virussen, viroïden, prionen Deze worden niet beschouwd als levende organismen omdat ze niet uit cellen zijn opgebouwd, maar kunnen wel infecties veroorzaken [59](#page=59). #### 3.8.1 Virussen Virussen kunnen hun eigen eiwitten, RNA en DNA niet synthetiseren; ze zijn obligaat intracellulaire parasieten en vermenigvuldigen zich uitsluitend via een gastheercel. Ze zijn gastheerspecifiek, wat betekent dat ze slechts één of enkele soorten als gastheer kunnen gebruiken. Als bacteriën gastheer zijn, spreekt men van bacteriofagen [60](#page=60). Virussen zijn elementaire structuren bestaande uit nucleïnezuur (DNA of RNA) omgeven door een eiwitmantel (capside). Dierlijke en humane virussen kunnen een envelope (membraan van lipoproteïnen) hebben (enveloped) of niet (non-enveloped) [60](#page=60) [61](#page=61). De kleinste virussen zijn ca. 10 nm, de grootste ca. 800 nm; ze zijn alleen zichtbaar met de elektronenmicroscoop. De vorm varieert, maar er zijn drie hoofdgroepen op basis van de opbouw van het capside [61](#page=61): * Isometrische kapsels (symmetrisch veelvlakkig lichaam) [61](#page=61). * Helicoïdale kapsels (schroefvormig lichaam) [61](#page=61). * Complexe structuren (bv. T4 bacteriofaag) [61](#page=61). #### 3.8.2 Viroïden Viroïden zijn nog eenvoudiger dan virussen en bestaan uit een enkelvoudig klein stuk erfelijk materiaal (RNA) zonder een protectief kapsel. Ze zijn kleiner dan virussen en zijn obligaat intracellulair parasitair, voornamelijk veroorzakend plantenziekten [62](#page=62). #### 3.8.3 Prionen Prionen veroorzaken neurodegeneratieve ziektes bij mens en dier en bestaan enkel uit eiwit zonder nucleïnezuren. Een bekend voorbeeld is BSE ("gekkekoeienziekte") [63](#page=63). --- # Microbiële groei en metabolisme Dit hoofdstuk beschrijft de principes van microbiële groei, inclusief celvermenigvuldiging, groeicurven en invloedsfactoren, evenals de essentiële biochemische processen en energieomzettingen in micro-organismen [64](#page=64). ### 4.1 Groei en celvermenigvuldiging Groei bij micro-organismen wordt gedefinieerd als een toename van het aantal cellen, wat resulteert in celvermenigvuldiging en de vorming van een celpopulatie. Dit kan plaatsvinden om verschillende redenen, zoals het bewaren van culturen, identificatie, ecologisch onderzoek, studie van pathogene mechanismen, of industriële fermentatie [64](#page=64). #### 4.1.1 Voortplantingsmechanismen Micro-organismen vermenigvuldigen zich op verschillende manieren, afhankelijk van hun celstructuur: * **Prokaryoten (bacteriën):** Vermenigvuldigen zich primair via **binaire deling**, waarbij één cel zich splitst in twee identieke dochtercellen. Dit proces omvat DNA-replicatie, celelongatie, vorming van een dwarswand (septum), en uiteindelijke splitsing [66](#page=66) [67](#page=67). * **Eukaryoten (schimmels en gisten):** * **Mitose:** Leidt tot de vorming van twee identieke diploïde of haploïde dochtercellen uit één oudercel [64](#page=64). * **Meiose:** Een reductiedeling waarbij uit één diploïde cel vier haploïde cellen ontstaan [65](#page=65). * **Ongeslachtelijke voortplanting:** Bij gisten gebeurt dit meestal door **knopvorming**, waarbij een kleine uitstulping op de moedercel groeit en loslaat. Bij schimmels kan dit via **aseksuele sporenvorming** (mitosporen, zoals conidiosporen of sporangiosporen) [65](#page=65) [73](#page=73) [74](#page=74). * **Geslachtelijke voortplanting:** Omvat meiose en conjugatie. Dit proces bestaat uit drie fasen: plasmogamie (fusie van cytoplasma), karyogamie (fusie van kernen) en meiose (vorming van haploïde sporen, meiosporen). Verschillende types geslachtelijke sporen bestaan, afhankelijk van het schimmelfylum (zoösporen, zygosporen, basidiosporen, ascosporen) [65](#page=65) [76](#page=76). #### 4.1.2 Uitwisseling van genetisch materiaal Hoewel bacteriële vermenigvuldiging normaal gesproken geen genetische uitwisseling inhoudt, zijn er mechanismen voor recombinatie: * **Transformatie:** Opname van vrijgekomen DNA-fragmenten uit afgestorven donorcellen door acceptorcellen [71](#page=71). * **Conjugatie:** Overdracht van DNA-fragmenten via direct cel-cel contact tussen donor- en acceptorcel. Dit kan ook plaatsvinden via plasmiden of transposons [72](#page=72). * **Transductie:** Overdracht van DNA van een donorcel naar een acceptorcel via een bacteriofaag (virus dat bacteriën infecteert) [72](#page=72). #### 4.1.3 Levenscycli van Fungi Fungi vertonen zowel seksuele als aseksuele reproductie in hun levenscyclus. De termen **teleomorf** (seksueel stadium), **anamorf** (aseksueel stadium) en **holomorf** (volledige fungus) beschrijven de verschillende stadia [76](#page=76) [77](#page=77). #### 4.1.4 Groei van Virussen Virussen zijn obligaat intracellulaire parasieten en hebben geen eigen metabolisme. Hun "groei" (vermenigvuldiging) vindt plaats binnen een gastheercel en omvat aanhechting, injectie van genetisch materiaal, intracellulaire vermenigvuldiging en vrijstelling uit de cel (vaak via lysis). Er zijn twee cycli voor bacteriofagen: de **lytische cyclus** (vernietiging van de cel) en de **lysogene cyclus** (integratie van faag-DNA in het bacterieel genoom als profaag). Dierlijke virussen penetreren gastheercellen via endocytose en vermenigvuldigen zich binnen de kern of het cytoplasma [81](#page=81) [82](#page=82) [84](#page=84). ### 4.2 Groeicurven De groei van een bacteriële populatie in een batchcultuur (gesloten systeem) verloopt in vier fasen [68](#page=68): 1. **Lagfase (latente fase):** Aanpassingsperiode aan de nieuwe omgeving, waarin de cel zijn enzympatroon aanpast [69](#page=69). 2. **Exponentiële fase (logfase):** Actieve vermenigvuldigingsfase met een constante delingssnelheid, resulterend in exponentiële toename van het aantal cellen. De omvang van de populatie ($N_t$) na $n$ generaties kan worden berekend met de formule $N_t = 2^n \times N_0$, waarbij $N_0$ het initiële celaantal is. De **generatietijd** ($g$) is de tijd tussen twee celdelingen, gerelateerd aan de groeisnelheid ($k$) via $g = 1/k$ [70](#page=70). 3. **Evenwichtsfase (stationaire fase):** Het aantal levende cellen blijft constant door een balans tussen celdeling en celsterfte [69](#page=69). 4. **Afstervingsfase:** Meer cellen sterven af dan er gevormd worden door verslechterende omstandigheden [69](#page=69). De snelle groei tijdens de logfase kan in de praktijk worden beperkt door factoren zoals gebrek aan voedingsstoffen, ophoping van toxische stofwisselingsproducten, en gebrek aan leefruimte [70](#page=70). ### 4.3 Invloedsfactoren op de groei De groei van micro-organismen wordt beïnvloed door een reeks omgevingsfactoren: #### 4.3.1 Voedingsstoffen (samenstelling van het groeimedium) Essentiële nutriënten zijn: * **Water:** Onmisbaar voor alle biologische processen [85](#page=85). * **Energiebron en C-bron:** * **Autotrofen:** Gebruiken CO2 als C-bron en verkrijgen energie uit licht (foto-autotroof) of exotherme chemische reacties (chemo-autotroof) [85](#page=85). * **Heterotrofen:** Gebruiken organische verbindingen als C-bron (bv. glucose, vetten) [85](#page=85). * **Stikstofbron:** Nodig voor eiwitsynthese en nucleïnezuren. Kan anorganisch (N2, ammoniumzouten, nitraten) of organisch (aminozuren, peptone) zijn [85](#page=85). * **Mineralen:** Macro-nutriënten (bv. P, S, K) en micro-nutriënten (bv. Mo, Cu, Zn) zijn nodig voor diverse celfuncties [86](#page=86). * **Vitaminen:** Sommige micro-organismen kunnen specifieke vitamines (bv. B-complex) niet zelf synthetiseren en zijn hiervoor afhankelijk van het groeimedium. Deze functioneren vaak als co-enzymen [86](#page=86). #### 4.3.2 Temperatuur Microbiële groei kent een minimum-, optimum- en maximumtemperatuur [87](#page=87). * **Psychrofielen:** Groeien bij lage temperaturen (optimum rond 10°C) [87](#page=87). * **Mesofielen:** Groeien bij gematigde temperaturen (optimum tussen 30-37°C), waaronder de meeste pathogenen en organismen die in warmbloedigen voorkomen [87](#page=87). * **Thermofielen:** Groeien bij hoge temperaturen (optimum rond 55°C) [87](#page=87). * **Hyperthermofielen:** Groeien bij zeer hoge temperaturen (70-110°C) [87](#page=87). * **Psychrotrofen:** Kunnen bij lage temperaturen groeien, maar hebben deze niet per se nodig voor groei [87](#page=87). Temperatuur beïnvloedt de snelheid van biochemische reacties; een stijging van 10°C verdubbelt of verdrievoudigt de groeisnelheid tot aan een bepaald punt, waarna denaturatie van eiwitten optreedt [86](#page=86). #### 4.3.3 Zuurtegraad (pH) Micro-organismen hebben een specifiek pH-bereik waarin ze kunnen groeien, met een minimum, optimum en maximum pH [88](#page=88). * **Neutrofielen:** Optimale groei rond pH 6-8 (meeste bacteriën) [88](#page=88). * **Acidofielen:** Kunnen groeien bij lage pH (bv. Helicobacter pylori, Picrophilus oshimae) [88](#page=88). * **Basofielen (alkalofielen):** Kunnen groeien bij hoge pH (bv. Vibrio, sommige Enterococcus-soorten) [89](#page=89). De pH beïnvloedt de activiteit van enzymen; de meeste zijn optimaal actief tussen pH 5-8 . #### 4.3.4 Zuurstof Micro-organismen kunnen worden ingedeeld op basis van hun zuurstofbehoefte [89](#page=89): * **Strikt aëroob:** Vereist zuurstof voor groei [89](#page=89). * **Facultatief aeroob/anaeroob:** Kan zowel met als zonder zuurstof groeien [89](#page=89). * **Strikt anaeroob:** Kan alleen groeien in afwezigheid van zuurstof [89](#page=89). * **Aërotolerant anaeroob:** Verdraagt zuurstof maar gebruikt fermentatie als metabolisme [89](#page=89). * **Micro-aërofiel:** Groeit het best bij verminderde zuurstofspanning [89](#page=89). #### 4.3.5 Wateractiviteit ($a_w$) De wateractiviteit ($a_w$) is een maat voor de beschikbare hoeveelheid water voor micro-organismen, gedefinieerd als de verhouding van de waterdampspanning boven een oplossing tot die boven zuiver water. Lagere $a_w$ remt of stopt de groei van de meeste micro-organismen. Specifieke groepen zoals osmofiele (suikerrijk milieu), xerofiele (vochtarm milieu) en halofiele (zoutrijk milieu) micro-organismen kunnen bij lage $a_w$ waarden groeien [90](#page=90) [91](#page=91). #### 4.3.6 Antimicrobiële stoffen Stoffen die de groei remmen (microbiostatisch) of elimineren (microbiocidaal) kunnen aan het groeimedium worden toegevoegd. Voorbeelden zijn chemotherapeutica, antibiotica, conserveermiddelen, desinfectantia en antiseptica [92](#page=92). #### 4.3.7 Wisselwerking tussen microbiële populaties Interacties tussen samenlevende micro-organismen kunnen leiden tot groeiremming (antagonisme) of groei bevordering (synergie) [92](#page=92). ### 4.4 Kweken van micro-organismen Om micro-organismen te bestuderen, worden ze gekweekt in **cultuurmedia**. Deze media bevatten alle benodigde nutriënten en kunnen vast of vloeibaar zijn [92](#page=92) [93](#page=93). #### 4.4.1 Samenstelling van cultuurmedia Een cultuurmedium bevat doorgaans: 1. Water [93](#page=93). 2. Koolstofbron (C-bron): Organisch (heterotroof) of anorganisch (autotroof) [93](#page=93). 3. Stikstofbron (N-bron): Organisch (heterotroof) of anorganisch (autotroof) [94](#page=94). 4. Bijkomende groeifactoren (vitamines, aminozuren) [94](#page=94). 5. Mineralen en zouten (macro- en sporenelementen) [95](#page=95). 6. Selectieve stoffen/inhibitoren (facultatief) [95](#page=95). 7. Differentiërende stoffen/indicatoren (facultatief) [95](#page=95). 8. Stijfmiddel (bv. agar) voor vaste media [95](#page=95). #### 4.4.2 Typen cultuurmedia Media kunnen worden ingedeeld op basis van hun samenstelling of functionaliteit: * **Synthetische/chemisch gedefinieerde media:** Exact bekende samenstelling [96](#page=96). * **Niet-synthetische/complexe media:** Bevatten componenten van plantaardige of dierlijke oorsprong met onbekende exacte chemische samenstelling (bv. peptonen, vleesextract) [96](#page=96). * **Niet-selectieve/algemene media:** Ondersteunen de groei van de meeste micro-organismen [97](#page=97). * **Selectieve media:** Bevatten stoffen die de groei van specifieke groepen micro-organismen remmen of bevorderen [97](#page=97). * **Differentiërende media:** Bevatten indicatoren die veranderingen in de kolonie-morfologie veroorzaken, waardoor onderscheid tussen micro-organismen mogelijk wordt. Veel media zijn zowel selectief als differentiërend [97](#page=97) [98](#page=98). * **Aanrijkingsmedia:** Vloeibare media om de groei van micro-organismen die in zeer geringe aantallen voorkomen te bevorderen [98](#page=98). #### 4.4.3 Kweekomstandigheden Naast de samenstelling van het medium zijn ook uitwendige omstandigheden cruciaal, zoals temperatuur, pH, zuurstof en vochtgehalte, om optimale groei te realiseren. Anaërobe kweek vereist specifieke voorzieningen om zuurstof te verwijderen [98](#page=98). ### 4.5 Het microbieel metabolisme Het metabolisme omvat alle biochemische reacties in een cel, onderverdeeld in katabolisme (afbraak, energieopbrengst) en anabolisme (biosynthese, energieverbruik) . #### 4.5.1 Enzymen Enzymen zijn eiwitkatalysatoren die biochemische reacties versnellen zonder zelf verbruikt te worden. Ze hebben een specifiek substraat en actieve plaats. Veel enzymen vereisen een co-factor of co-enzym om functioneel te zijn. Enzymen worden benoemd naar de reactie die ze katalyseren, gevolgd door de uitgang "-ase" (bv. oxidoreductasen) . ##### 4.5.1.1 Enzymwerking en kinetiek Enzymen verlagen de activeringsenergie van reacties, waardoor deze efficiënter verlopen. De reactiesnelheid wordt beschreven door de Michaelis-Mentenvergelijking: $v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]}$, waar $V_{max}$ de maximale snelheid is en $K_m$ de substraatconcentratie bij halve $V_{max}$. De enzymkinetiek is afhankelijk van temperatuur, pH en substraatconcentratie . * **Temperatuur:** Een toenemende temperatuur verhoogt de reactiesnelheid tot de optimumtemperatuur; daarboven treedt denaturatie op . * **Zuurtegraad (pH):** Elk enzym heeft een optimale pH; afwijkingen hiervan kunnen leiden tot denaturatie . * **Enzymremming:** Kan competitief (door moleculen die lijken op het substraat) of niet-competitief (door binding op een andere plaats dan het actieve centrum) zijn. **Feedback inhibitie** is een vorm van allosterische remming waarbij het eindproduct van een reactieketen het eerste enzym remt . #### 4.5.2 Energiebronnen en koolstofbronnen Micro-organismen worden ingedeeld op basis van hun energie- en koolstofbron : * **Fototroof:** Energie uit licht . * **Chemotroof:** Energie uit chemische verbindingen . * **Autotroof:** Koolstof uit anorganische bronnen (bv. CO2) . * **Heterotroof:** Koolstof uit organische bronnen . Combinaties leiden tot termen als **foto-autotroof, foto-heterotroof, chemo-autotroof, chemo-heterotroof** . #### 4.5.3 Energieomzetting: Oxidatie- en Reductiereacties Energie wordt gewonnen via gekoppelde oxido-reductiereacties. Oxidatie is elektronenverlies, reductie is elektronenopname. De energie wordt opgeslagen in **adenosinetrifosfaat (ATP)**, dat door hydrolyse energie levert voor cellulaire processen. Het co-enzym NAD(P) fungeert als waterstof- (en elektronendonor) of acceptor . #### 4.5.4 Energieleverende reacties (Katabolisme) Er zijn vier typen katabolische reacties : 1. **Aërobe respiratie:** Gebruikt O2 als finale elektronenacceptor . * **Glycolyse:** Omzetting van glucose naar pyrodruivenzuur, met vorming van ATP en NADH . * **Citroenzuurcyclus (Krebscyclus):** Verdere oxidatie van pyrodruivenzuur (via acetyl-CoA) tot CO2, met productie van ATP en reducerende co-enzymen (NADH, FADH2) . * **Elektronentransportketen:** Energie uit NADH en FADH2 wordt gebruikt om een protonengradiënt op te bouwen, die ATP-synthese drijft. O2 is de finale elektronenacceptor . 2. **Fermentatie (vergisting):** Anaërobe omzetting van pyrodruivenzuur naar diverse organische producten (bv. melkzuur, ethanol), met beperkte ATP-opbrengst . 3. **Anaërobe respiratie:** Gebruikt andere anorganische verbindingen (bv. nitraat, sulfaat) als finale elektronenacceptor in plaats van O2 . 4. **Oxidatie van anorganische verbindingen:** Energieopbrengst uit oxidatie van anorganische stoffen door chemo-autotrofen (bv. nitrificerende bacteriën, zwavelbacteriën) . #### 4.5.5 Biosynthetische reacties (Anabolisme) Micro-organismen gebruiken energie om biomoleculen zoals koolhydraten, eiwitten en vetten op te bouwen . --- # Microbiële ecologie en industriële toepassingen Dit document beschrijft de rol van micro-organismen in ecologische cycli, bodemkunde, symbiose en diverse industriële toepassingen, met een focus op de periode van pagina 124 tot 179. ## 5. Microbiële ecologie en industriële toepassingen ### 5.1 Microbiële ecologie #### 5.1.1 Mineralisatie en de C-, N- en S-cyclus Mineralisatie is het afbraakproces van organische stoffen tot anorganische verbindingen, essentieel voor het aanvullen van minerale stoffen in de natuurlijke kringlopen. Dit proces wordt voornamelijk uitgevoerd door saprofytische bacteriën en schimmels die leven op dode organismen of organische afvalstoffen. Deze micro-organismen breken complexe verbindingen zoals cellulose, lignine, vetten en eiwitten af tot eenvoudigere anorganische stoffen zoals CO2, H2O, NH3, H2S en diverse ionen, die weer beschikbaar komen voor autotrofe planten . * **Cellulose afbraak:** Gebeurt zowel aeroob (vooral door schimmels) als anaeroob (vooral door bacteriën), waarbij organische zuren, waterstofgas en koolstofdioxide ontstaan. Anaërobe afbraak kan leiden tot de vorming van methaan (moerasgas) . * **Pectine afbraak:** Betrokken bij de afbraak van stoffen die cellen aan elkaar kitten, belangrijk in processen zoals vlasroting . * **Lignine en cutine afbraak:** Zeer resistente verbindingen, waarover nog weinig bekend is . * **Zetmeel afbraak:** Betrokkenheid van diverse schimmels en bacteriën . * **Eiwit afbraak:** Gaat via peptiden en aminozuren, zowel aeroob als anaeroob. Resultaten zijn onder andere ammoniak (ammonificatie) en zwavelverbindingen, die karakteristieke geuren geven aan rottingsprocessen . In water verloopt de mineralisatie vergelijkbaar met de bodem. Hierbij spelen protozoa, kleine schaaldieren en mosselen een rol in de biologische reiniging van afvalwater . ##### 5.1.1.1 Koolstofcyclus De koolstofcyclus beschrijft de omzetting van CO2 in organische verbindingen en vice versa. Autotrofe planten nemen CO2 op uit de lucht voor fotosynthese. Planteneters en vleeseters assimileren dit gebonden koolstof. Ademhaling door planten en dieren geeft CO2 terug aan de atmosfeer. Afgestorven organisch materiaal wordt gemineraliseerd tot CO2, of vormt humus, dat kan omgezet worden tot turf, bruinkool en steenkool. Ook organische resten op de zeebodem kunnen leiden tot aardolie en aardgas, waarvan de verbranding CO2 produceert. Regenwater neemt CO2 op, lost kalksteen op en vormt waterstofcarbonaat, wat de CO2-concentratie in de atmosfeer reguleert via de zee . * **Formule voor kalksteenoplossing:** $$ \text{CaCO}_3 + \text{CO}_2 + \text{H}_2\text{O} \leftrightarrow \text{Ca}^{2+} + 2 \text{HCO}_3^- $$ ##### 5.1.1.2 Stikstofcyclus Stikstof is essentieel voor eiwitsynthese. Planten nemen stikstof op uit de bodem als minerale verbindingen (voornamelijk nitraten). De stikstofcyclus omvat de volgende processen : 1. **Stikstofgasfixatie:** * **Natuurlijk:** Door elektrische ontladingen (bliksem) die stikstofoxiden vormen, die via regen tot nitraat- en nitrietionen worden omgezet . * **Biologisch:** Door stikstofgasfixerende bacteriën, zoals *Rhizobium* in wortelknolletjes van vlinderbloemigen en vrijlevende bacteriën zoals *Azotobacter* en *Clostridium*. Deze bacteriën zetten N2 om tot NH3 en vervolgens tot aminozuren en eiwitten . 2. **Assimilatie:** Planten synthetiseren eiwitten uit nitraten en eigen opgebouwde sacchariden. Dieren nemen organisch gebonden stikstof op via hun voeding . 3. **Ammonificatie:** Afbraak van organische N-verbindingen tot NH3 (ammonium). Ureum uit urine wordt door ureumbacteriën omgezet tot NH3 . 4. **Nitrificatie:** Omzetting van ammonium tot nitriet (door *Nitrosomonas*) en vervolgens tot nitraat (door *Nitrobacter*). Nitraationen worden door planten opgenomen, maar zijn ook gevoelig voor uitloging . 5. **Denitrificatie:** Anaërobe denitrificerende bacteriën breken nitraten af, waarbij stikstofgas (N2) ontstaat dat terugkeert naar de atmosfeer. Dit proces verarmt de bodem aan stikstofverbindingen . * **Belangrijke micro-organismen in de stikstofcyclus:** * *Rhizobium* spp. (wortelknolletjesbacteriën) . * *Azotobacter* spp. (vrijlevende stikstofgasfixerende bacteriën) . * *Clostridium* spp. (anaërobe stikstofgasfixerende bacteriën) . * *Nitrosomonas* (nitrificerende bacteriën) . * *Nitrobacter* (nitrificerende bacteriën) . * *Pseudomonas* spp. (denitrificerende bacteriën) . #### 5.1.2 Bodemmicrobiologie De bodem is een complex ecosysteem met miljoenen micro-organismen, voornamelijk bacteriën en schimmels. Deze micro-organismen spelen een cruciale rol in de omzetting van organisch materiaal en de beschikbaarheid van voedingsstoffen voor planten . * **Microbiële diversiteit in de bodem:** * **Bacteriën:** Belangrijkste groep, verantwoordelijk voor mineralisatie, nitrificatie en N-fixatie. Nuttige bacteriën zijn humificerende, nitrificerende en N-fixerende bacteriën. Schadelijke bacteriën zijn vaak anaëroob en zetten organische stof om in giftige verbindingen . * **Schimmels:** Nemen de overhand bij ongunstige omstandigheden (zure grond, slechte lucht/waterverhouding). Sommige zijn plantpathogeen (bv. voetziekten) . * **Wieren (Algae):** Van geringe betekenis in de landbouw, maar komen vaker voor in de tuinbouw . * **Beïnvloeding van het bodemleven:** Factoren zoals voeding (organisch materiaal), vocht, zuurgraad, temperatuur, aëratie en menselijke ingrepen beïnvloeden de bodemorganismen . * **Gunstige omstandigheden:** Niet te droge, humeuze, neutrale tot zwak alkalische gronden. Grasland heeft een beter bodemleven dan bouwland . * **Ongunstige omstandigheden:** Vochtgebrek, lage pH (bevordert schimmels), ploegen en schoffelen . * **Menselijke ingrepen:** Cultuurmaatregelen (bemesting, bekalking), grondontsmetting (vermindert zowel schadelijke als nuttige micro-organismen), gebruik van chemische bestrijdingsmiddelen, toevoer van zware metalen . #### 5.1.3 Symbiose Symbiose is een samenleving tussen organismen van verschillende aard waarbij beide partners voordeel ondervinden . * **Samenleving van bacteriën met hogere planten:** * **Rhizobium met vlinderbloemigen:** *Rhizobium* bacteriën infecteren wortelharen en vormen wortelknolletjes waar atmosferische stikstof wordt gefixeerd tot ammonium, wat de plant gebruikt voor aminozuursynthese. De plant levert suikers als energiebron aan de bacterie. *Leghemoglobine* in de knolletjes reguleert de lage zuurstofdruk die nodig is voor het *nitrogenase*-enzym. Vlinderbloemigen kunnen hierdoor groeien op stikstofarme bodems . * **Andere vormen van endofytische symbiose:** Blauwwieren (*Anabaena* spp.) met levermossen, cycadeeën en watervarens; straalschimmels (*Frankia* spp.) met els, gagel en duindoorn. Bacteriën in bladeren (*fyllosfeer*) kunnen vorstschade veroorzaken of juist voorkomen met "ice-minus" mutanten . * **Zwamwortelsymbiose (Mycorrhiza’s):** Symbiose tussen schimmels en plantenwortels . * **Voordelen voor de plant:** Verbeterde opname van nutriënten en water, transport van metabolieten, bescherming tegen wortelpathogenen . * **Voordeel voor de schimmel:** Levering van organische koolstof- en energiebronnen door de plant . * **Ectotrofe mycorrhiza’s:** Zwamdraden vormen een mantel rond de wortel (bv. bij sparren, berken) . * **Endotrofe mycorrhiza’s:** Zwamdraden dringen de wortelcellen binnen (komt veel vaker voor, bij >90% van landplanten). Zaden van orchideeën hebben schimmels nodig om te kiemen . * **Planteneters en hun pensflora:** Herkauwers hebben een complexe microbiële flora in hun maag (pens) die cellulose en andere koolhydraten afbreekt. De pens fungeert als een fermentatieruimte waar bacteriën en protozoa plantaardig materiaal verwerken tot vetzuren (azijnzuur, propionzuur, boterzuur), methaan en CO2. Deze vetzuren dienen als koolstof- en energiebron voor het dier. De micro-organismen produceren ook essentiële aminozuren en vitaminen . ### 5.2 Industriële toepassingen Micro-organismen spelen een belangrijke rol in diverse industriële processen, onderverdeeld in vijf hoofdgroepen: celproductie, metabolietenproductie, enzymproductie, gefermenteerd product en omzetting van afvalproducten. Biotechnologie maakt gebruik van levende organismen voor de productie van waardevolle producten . #### 5.2.1 Het fermentatieproces Fermentatieprocessen kunnen spontaan verlopen of gecontroleerd met behulp van geselecteerde stammen (starterculturen). Stammen kunnen verbeterd worden door conventionele mutatietechnieken of moderne genetische recombinatietechnieken. Het kweekmedium is cruciaal en maakt vaak gebruik van goedkope bijproducten uit de voedingsmiddelenindustrie. Industriële fermentaties vinden plaats in grote fermentoren, die steriel moeten blijven en voorzien zijn van systemen voor beluchting, menging, temperatuur- en pH-regeling. Er bestaan discontinue (batch) en continue fermentatiesystemen . * **Continue fermentatie:** Kan plaatsvinden in één cultuurvat ("ééntrapssysteem"), met recycling van cultuurvloeistof, of in meerdere trappen ("meertrapssysteem") . * **Opschalings- en opwerkingsfase:** Na fermentatie wordt het product geoogst en gezuiverd . #### 5.2.2 Micro-organismen als product Microbiële biomassa wordt gekweekt voor de productie van vaccins, starterculturen, bakkersgist, bodem-, zaad- en blad inocula, bio-insecticiden, *single cell protein* (SCP) en *single cell oil* (SCO) . * **Micro-organismen als voedselbron (SCP):** Gistcellen worden al lang als eiwitsupplement gebruikt, onder andere in Duitsland tijdens de wereldoorlogen. Diverse SCP-productieprocessen gebruiken gisten, schimmels, bacteriën en algen. De productie van SCP concurreert echter niet altijd met plantaardige eiwitbronnen zoals soja . * **Productie van vaccins:** Vaccins wekken immuniteit op tegen ziekteverwekkers. Ze bevatten dode of verzwakte ziekteverwekkers, of specifieke antigene componenten. Virusvaccins worden gekweekt in dierlijke cellen of kippeneieren. rDNA-technologie maakt veiligere productie mogelijk door essentiële antigene componenten te gebruiken . * **Productie van bio-pesticiden:** *Bacillus thuringiensis* produceert het Bt-eiwit, een biologisch bestrijdingsmiddel tegen insectenlarven. Genetische modificatie maakt het mogelijk Bt-toxine-informatie in te bouwen in andere bacteriën of zelfs planten . #### 5.2.3 Metabolieten als product * **Primaire metabolieten:** Nodig voor celgroei, maar door specifieke stammen overmatig geproduceerd (bv. aminozuren, vitaminen, alcoholen) . * **Secundaire metabolieten:** Niet direct nodig voor celgroei, maar van grote economische waarde (bv. antibiotica, toxines, alkaloïden) . * **Voorbeelden van microbiële secundaire metabolieten in voeding en veevoeder:** Conserveermiddelen, pigmenten, voederadditieven, coccidiostatica, anthelmintica, antibacteriële, antifungale en antivirale stoffen, biopolymeren . * **Antibiotica:** Remmen bacteriële groei. Ontdekking van penicilline door Fleming. Productie verbeterd door stamselectie, optimalisatie van synthese en procesvoering. Toepassingen in geneeskunde, veevoeder, en conservering van industriële producten. Antibiotica worden ingedeeld naar producerend micro-organisme, werkingsspectrum (smal/breed), of chemische structuur. Ze grijpen in op celwand, celmembraan, eiwit- of nucleïnezuursynthese, of hebben een antimetabole werking. Antibioticaresistentie is een groeiend probleem . * **Vitamines:** Industrieel geproduceerd via chemische synthese of microbiële fermentatie (bv. vitamine B12, B2, C, -caroteen) . * **Aminozuren:** Stijgende markt, vooral glutaminezuur, methionine en lysine. Gebruikt als smaakversterker, voor voedingswaarde-verhoging en als grondstof voor zoetstoffen . * **Enzymen:** Makkelijk te produceren op industriële schaal door micro-organismen. Genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) spelen hierin een grote rol. Voorbeelden zijn amylases, proteases en pectinases . #### 5.2.4 Het gefermenteerd cultuurmedium als product * **Humane voeding:** Gefermenteerde voedingsmiddelen (bv. wijn, bier, yoghurt, kaas, zuurkool, salami) worden bereid door microbiële groei selectief te stimuleren. Deze processen veranderen de grondstoffen in veelal hoogwaardigere, gemakkelijker verteerbare, voedzamere en langer houdbare producten . * **Diervoeding:** Inkuilen (ensileren) van groenvoeder is een fermentatieproces dat melkzuurbacteriën gebruikt om het voeder te bewaren en de pH te verlagen. Dit proces kent verschillende fasen, waaronder de rol van coli-bacteriën en melkzuurbacteriën. Boterzuurbacteriën kunnen de kwaliteit verminderen . #### 5.2.5 Microbiologische processen bij omzettingen van afvalproducten * **Microbiologische processen bij waterzuivering:** Afvalwaterzuivering verwijdert organisch materiaal en verlaagt de BOD (biochemisch zuurstofverbruik) . * **Primaire fase:** Voorbehandeling met roosters, bezinking, vetvang . * **Secundaire fase:** Biologische afbraak door micro-organismen. * **Aërobe zuivering:** Gebruik van zuurstof door bacteriën om organisch materiaal af te breken tot biomassa, water en CO2 (bv. actief slib, biofilter). Rendement tot 99% . * **Anaërobe zuivering:** Gebruikt bij hoge belasting, geen zuurstof. Afbraak via organische zuren tot methaan (CH4). Rendement tot 90%, vereist aanvullende aërobe zuivering . * **Tertiaire fase:** Verwijdering van voedingszouten (nitraten, fosfaten) via chemische of microbiologische processen (bv. denitrificatie) en desinfectie . * **Compostering:** Omzetting van organisch materiaal met O2 door bacteriën en schimmels, waarbij warmte vrijkomt. Vernietigt ziekteverwekkers en onkruidzaden. Gebruikt als bodemverbeteraar en meststof . * **Bioremediatie:** Gebruik van micro-organismen om polluenten af te breken of te neutraliseren. Kan plaatsvinden door introductie van micro-organismen of stimulatie van aanwezige micro-organismen (biostimulatie) . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Microbiologie | De wetenschap die zich bezighoudt met de studie van de bouw en de levensverrichtingen van micro-organismen. | | Micro-organismen | Organismen die in hun levenscyclus ten minste één periode doormaken, waarin één enkele cel zich als individu vermenigvuldigt, inclusief microscopische organismen die uit één enkele cel of celcluster bestaan, samen met virussen die microscopisch zijn maar niet cellulair. | | Prokaryotische cel | Een primitieve celstructuur zonder membraanomhulde celorganellen en zonder een afgebakende celkern. Deze celtypen worden aangetroffen bij bacteriën en archaea. | | Eukaryotische cel | Een meer complexe celstructuur met membraanomhulde celorganellen, waaronder een afgebakende celkern die het genetisch materiaal bevat. Deze celtypen worden aangetroffen bij planten, dieren, schimmels, gisten en protozoa. | | DNA (Desoxyribonucleïnezuur) | Een molecuul dat de genetische informatie van organismen draagt, opgebouwd uit nucleotiden die een dubbele helix vormen. Het bevat de instructies voor de opbouw van eiwitten en de regulering van celprocessen. | | RNA (Ribonucleïnezuur) | Een enkelstrengs molecuul dat betrokken is bij de eiwitsynthese en de expressie van genen. Er zijn verschillende typen RNA, zoals mRNA, tRNA en rRNA, elk met een specifieke rol. | | Enzym | Een biologische katalysator, meestal een eiwit, dat specifieke chemische reacties versnelt zonder zelf verbruikt te worden. Enzymen spelen een cruciale rol in vrijwel alle metabole processen. | | Metabolisme | De totale reeks biochemische reacties die plaatsvinden in een levend organisme om leven te onderhouden. Het omvat zowel afbraakprocessen (katabolisme) die energie leveren, als opbouwprocessen (anabolisme) die energie verbruiken. | | Katabolisme (dissimilatie) | De afbraak van organische moleculen om energie vrij te maken, die vervolgens wordt opgeslagen in de vorm van ATP. Voorbeelden zijn aerobe en anaerobe respiratie, en fermentatie. | | Anabolisme (assimilatie) | De opbouw van complexe moleculen uit eenvoudigere bouwstenen, wat energie vereist. Dit omvat processen zoals de synthese van eiwitten, nucleïnezuren en celbestanddelen. | | Aerobe respiratie | Een energieopwekkend metabool proces waarbij moleculaire zuurstof (O2) fungeert als de finale elektronenacceptor. Dit proces genereert een grote hoeveelheid ATP. | | Anaerobe respiratie | Een energieopwekkend metabool proces waarbij, in afwezigheid van zuurstof, anorganische verbindingen (zoals nitraat, sulfaat of carbonaat) fungeren als de finale elektronenacceptor. | | Fermentatie | Een anaerobe metabole weg die energie genereert door de afbraak van organische moleculen, waarbij de eindproducten organische verbindingen zijn. Het levert minder energie op dan respiratie. | | Fotosynthese | Een proces waarbij lichtenergie wordt gebruikt om kooldioxide en water om te zetten in organische verbindingen (zoals glucose) en zuurstof. Dit proces vindt plaats bij fototrofe organismen, zoals algen en cyanobacteriën. | | Chemotrofe | Organismen die energie verkrijgen door de oxidatie van chemische verbindingen, zowel organisch als anorganisch. | | Autotrofe | Organismen die hun eigen organische voedsel produceren uit anorganische bronnen, zoals CO2. | | Heterotrofe | Organismen die hun koolstof en energie verkrijgen uit organische verbindingen, afkomstig van andere organismen. | | Stikstofcyclus | Een reeks biochemische processen waarbij stikstof door de biosfeer circuleert, inclusief stikstoffixatie, ammonificatie, nitrificatie en denitrificatie. | | Koolstofcyclus | Een reeks biochemische processen waarbij koolstof door de biosfeer circuleert, inclusief fotosynthese, ademhaling en de afbraak van organisch materiaal. | | Symbiose | Een nauwe en langdurige interactie tussen twee verschillende biologische soorten. Er zijn verschillende vormen, zoals mutualisme, commensalisme en parasitisme. | | Mycorrhiza | Een symbiotische relatie tussen een schimmel en de wortels van een plant, waarbij de schimmel de plant helpt bij de opname van nutriënten uit de bodem in ruil voor suikers. | | Taxonomie | De wetenschap die zich bezighoudt met de classificatie, benoeming en indeling van organismen op basis van hun eigenschappen en evolutionaire verwantschap. | | Nomenclatuur | Een systeem van naamgeving aan organismen, meestal gebaseerd op de binomiale nomenclatuur, waarbij elke soort een geslachtsnaam en een soortnaam heeft. | | Identificatie | Het proces van het herkennen en toewijzen van een organisme aan een specifieke taxonomische groep, vaak met behulp van microscopische, biochemische en moleculaire technieken. | | Industriële microbiologie | De toepassing van microbiologische processen en micro-organismen in industriële productie, zoals de fabricage van voedingsmiddelen, medicijnen en chemicaliën. | | Fermentatie | Een biotechnologisch proces waarbij micro-organismen worden gebruikt om organische stoffen om te zetten in gewenste producten, zoals alcohol, zuren en gassen. | | Antibiotica | Stoffen, geproduceerd door micro-organismen of synthetisch, die de groei van bacteriën remmen of doden. Ze worden gebruikt voor de behandeling van bacteriële infecties. | | Vaccins | Biologische preparaten die worden gebruikt om immuniteit tegen specifieke ziekteverwekkers op te wekken, meestal door het introduceren van verzwakte of dode micro-organismen, of delen daarvan. | | Bio-pesticiden | Bestrijdingsmiddelen tegen plagen die afkomstig zijn van biologische bronnen, zoals bacteriën of virussen, als alternatief voor chemische pesticiden. | | Enzymproductie | Industriële productie van enzymen door micro-organismen, die vervolgens worden gebruikt in diverse sectoren zoals de voedingsmiddelen-, wasmiddelen- en farmaceutische industrie. | | Cellulase | Een enzym dat cellulose afbreekt tot kleinere suikers, geproduceerd door verschillende micro-organismen, waaronder bacteriën en schimmels. | | Plasmodium | Een meerkernige massa cytoplasma die deel uitmaakt van de levenscyclus van acellulaire slijmzwammen. | | Endosporen | Zeer resistente structuren gevormd door sommige bacteriën (zoals Bacillus en Clostridium) voor overleving onder ongunstige omstandigheden. Ze zijn geen voortplantingsstructuren. | | Gramkleuring | Een differentieel kleuringsprocédure die bacteriën indeelt in twee hoofdcategorieën: Gram-positief en Gram-negatief, gebaseerd op de chemische samenstelling van hun celwand. | | Morfologie | De studie van de uitwendige vormen en structuren van organismen. In de microbiologie omvat dit de vorm, grootte en arrangement van bacteriën, schimmels en andere micro-organismen. | | Bioremediatie | Het gebruik van micro-organismen om verontreinigende stoffen in het milieu af te breken of te neutraliseren. | | Vitamines | Organische verbindingen die in kleine hoeveelheden nodig zijn voor normale groei en metabolisme, en die door sommige micro-organismen kunnen worden geproduceerd. | | Aminozuren | De bouwstenen van eiwitten. Sommige aminozuren worden industrieel geproduceerd door microbiële fermentatie en gebruikt in de voedingsmiddelen- en veevoederindustrie. | | Wateractiviteit (aw) | De hoeveelheid "vrij" water in een milieu dat beschikbaar is voor microbiële groei. Het is een maat voor de concentratie van opgeloste stoffen en beïnvloedt de groei van micro-organismen. |