Molecular Biology

# Stadia en voorwaarden van celcultivering Celcultivering omvat een reeks stappen om cellen uit een orgaan of tumor te laten groeien in vitro, wat onderzoek kan vereenvoudigen, waarbij specifieke omstandigheden cruciaal zijn voor celoverleving en groei [9](#page=9). ### 1.1 Stadia van celcultivering Het proces van het maken van een cellijn uit een weefsel omvat verschillende stappen: * **Enzymatische behandeling:** Het weefsel wordt enzymatisch behandeld om de cellen te scheiden [9](#page=9). * **Isolatie van cellen:** De cellen worden vervolgens uit de oplossing verkregen door centrifugeren of uitzakken naar de bodem van een container [9](#page=9). * **Uitplaatsten:** De geïsoleerde cellen worden in een groeirecipiënt geplaatst, zoals een petrischaal, om te starten met de cultivering [9](#page=9). * **Celgroei:** Hopelijk overleven de cellen deze behandeling en kunnen ze uitgroeien tot een populatie [9](#page=9). * **Opsplitsen:** Wanneer een confluente laag van cellen is gevormd, worden de cellen losgemaakt en gesplitst om de groei voort te zetten [9](#page=9). > **Tip:** Het succesvol in vitro laten groeien van cellen is afhankelijk van het minimaliseren van stressvolle behandelingen en het bieden van een optimale omgeving vanaf het begin [9](#page=9). ### 1.2 Typische celculturen en kolonie-vorming Celculturen kunnen worden gekenmerkt door de vorming van kolonies, die ontstaan uit individuele cellen die zich delen. Een monolaagcultuur van epitheelcellen toont een duidelijke laag cellen die aan elkaar grenzen [10](#page=10). > **Voorbeeld:** Links in een opname worden cellen sterk vergroot weergegeven, waarbij elke witte lijn de celrand aangeeft. Rechts, bij een lagere vergroting, is te zien hoe een kolonie ontstaat uit één enkele cel en uit meerdere cellen bestaat [10](#page=10). ### 1.3 Cultuurcondities Om ervoor te zorgen dat cellen die in vitro groeien vergelijkbaar zijn met cellen *in vivo*, moeten de cultuurcondities nauwkeurig zijn [11](#page=11). #### 1.3.1 CelmediA Het medium dat gebruikt wordt voor celcultivering, zoals Minimum Essential Medium (MEM), bevat essentiële componenten voor celgroei en -overleving: * **Isotonische zouten:** Inclusief een NaHCO3/H2CO3-buffer die vergelijkbaar is met het bloedbuffersysteem [11](#page=11). * **Energiebron:** Glucose wordt geleverd als primaire energiebron [11](#page=11). * **Essentiële aminozuren en vitamines:** Deze zijn noodzakelijk voor de celstofwisseling en worden niet door de cel zelf gesynthetiseerd [11](#page=11). * **Serum:** Hoewel nagenoeg essentieel, is serum een duur natuurproduct met mogelijke kwaliteitsvariaties [11](#page=11). Andere klassieke celmedia die gebruikt kunnen worden zijn DMEM, M199, McCoy’s en RPMI1640 [11](#page=11). #### 1.3.2 CO2-atmosfeer en pH-controle De culturen moeten worden gekweekt onder een atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Dit CO2-gehalte is vergelijkbaar met dat in bloed en weefselvochten (in de atmosfeer is het slechts 0,03%). Het doel hiervan is het bereiken en handhaven van een optimale pH van ongeveer 7,4, wat cruciaal is voor celactiviteit [11](#page=11). > **Tip:** Het handhaven van de juiste pH is essentieel voor celmetabolisme en -groei. De CO2/bicarbonaat buffer in het medium werkt samen met de CO2 in de atmosfeer om dit te reguleren [11](#page=11). ### 1.4 Cultuurrecipiënten Verschillende soorten recipiënten worden gebruikt voor celcultivering, afhankelijk van de toepassing en de benodigde groeioppervlakte [12](#page=12). * **Gesloten flessen:** Deze worden gebruikt in een warme kamer en vereisen dat CO2 wordt toegevoegd voordat de fles wordt afgesloten. Voorbeelden zijn falconbuizen [12](#page=12). * **Open platen:** Deze worden gebruikt in CO2-ovens en bieden gemakkelijke toegang tot de cellen [12](#page=12). * **Rollerflessen:** Deze worden ook in de warme kamer gebruikt en bieden een groot oppervlak voor celgroei met een relatief kleine hoeveelheid medium [12](#page=12). > **Voorbeeld:** Een CO2-oven is essentieel voor het creëren van de benodigde gecontroleerde omgeving, inclusief temperatuur, vochtigheid en CO2-concentratie, voor de cultuurplaten die erin worden geplaatst [12](#page=12). --- # Apparatuur en faciliteiten voor celcultuur Celcultuur vereist gespecialiseerde apparatuur en faciliteiten om een steriele en gecontroleerde omgeving te waarborgen, essentieel voor celgroei en -onderhoud [23](#page=23). ### 2.1 Essentiële apparatuur #### 2.1.1 Laminaire flowbench Een laminaire flowbench is cruciaal voor celcultuurwerkzaamheden. Deze werkbank creëert een steriele werkomgeving door continue luchtstroom die deeltjes verwijdert. Het apparaat is uitgerust met een steriliserend HEPA (High Efficiency Particulate Air) filter dat de lucht zuivert. De cellen worden binnen deze bench gehanteerd om contaminatie te voorkomen [21](#page=21) [23](#page=23). * **Functie:** Bescherming van cellen tegen contaminatie door micro-organismen en deeltjes in de lucht. * **Kenmerken:** Uitgerust met een HEPA filter voor luchtzuivering [23](#page=23). #### 2.1.2 CO2-incubator De CO2-incubator is een essentieel apparaat voor het onderhouden van de groeicondities van cellen. Deze incubatoren reguleren nauwkeurig de temperatuur, luchtvochtigheid en CO2-concentratie in de kweekkamer. De aanwezigheid van CO2 is vaak nodig om de pH van het celcultuurmedium op peil te houden, daar het medium zelf vaak een bicarbonaat buffersysteem bevat. Net als de laminaire flowbench zijn CO2-incubators ook uitgerust met steriliserende HEPA filters [23](#page=23). * **Functie:** Creëren en handhaven van een optimale omgeving voor celgroei (temperatuur, vochtigheid, CO2-niveau). * **Kenmerken:** Nauwkeurige regulatie van temperatuur, vochtigheid en CO2-concentratie. Bevat steriliserende HEPA filters [23](#page=23). #### 2.1.3 Invriezen van cellen Voor langdurige opslag worden cellen ingevroren bij extreem lage temperaturen. Vloeibare stikstof, met een temperatuur van -196°C, wordt hiervoor gebruikt. Dit proces, ook wel cryopreservatie genoemd, maakt het mogelijk om celpopulaties voor onbepaalde tijd te bewaren en later te reactiveren voor verder onderzoek [23](#page=23). * **Methode:** Opslag in vloeibare stikstof bij -196°C [23](#page=23). * **Doel:** Lange-termijn behoud van celpopulaties. ### 2.2 Celadhesie en spreiding Na het losmaken en uitplanten van cellen ondergaan deze een reeks stappen om zich aan het substraat te hechten en te verspreiden. Dit proces is cruciaal voor het succes van celkweek, omdat cellen zich in de meeste gevallen moeten hechten om te kunnen overleven en groeien [22](#page=22). #### 2.2.1 Stappen in celadhesie en spreiding 1. **Uitzakken onder invloed van gravitatie:** Direct na het uitplanten beginnen de cellen naar beneden te zakken [22](#page=22). 2. **Initieel contact met het substraat:** Cellen maken contact met het kweekoppervlak. In dit stadium is het adhesieoppervlak minimaal, omdat de cellen nog bolvormig zijn [22](#page=22). 3. **Progressieve spreiding:** In de uren die volgen, verspreiden de cellen zich geleidelijk over het substraat. Dit proces is energie-afhankelijk en vereist veranderingen in het cytoskelet, wat leidt tot een groter celcontactoppervlak en een sterkere hechting aan het substraat [22](#page=22). 4. **Sterke binding met substraat:** Uiteindelijk gaan de cellen een robuuste binding aan met het substraat. Dit wordt mede mogelijk gemaakt doordat de cellen zelf moleculen van de extracellulaire matrix (ECM) produceren en afscheiden, die bijdragen aan de adhesie [22](#page=22). #### 2.2.2 Celmigratie Ondanks de sterke cel-substraatsadhesie, kunnen cellen doorgaans migreren over het celoppervlakte. Dit gebeurt door het tijdelijk en gefocusseerd inhiberen van celadhesie op de ene locatie (waar de cel loskomt) en het gelijktijdig opbouwen van adhesie op een andere locatie in de richting van de migratie [22](#page=22). > **Tip:** De verschillende stadia van celadhesie en spreiding kunnen worden waargenomen met behulp van Scanning Elektronenmicroscopie (SEM), zoals geïllustreerd met muisfibroblasten op verschillende tijdstippen na uitplating [22](#page=22). ### 2.3 Algemene faciliteiten Naast specifieke apparatuur, beschikken celcultuurfaciliteiten over algemene faciliteiten om het werk te ondersteunen. Dit omvat vaak gedeelde ruimtes met meerdere laminaire flowbenches en incubatoren. De "CTC core" in The Core (UZ campus) is een voorbeeld van een dergelijke faciliteit, uitgerust met 17 flowbenches [24](#page=24). * **Voorbeeld:** CTC core in The Core (UZ campus) met 17 flowbenches [24](#page=24). --- # Wat zijn stamcellen en hun eigenschappen Stamcellen zijn bijzondere cellen die zich voortdurend kunnen delen en zich kunnen ontwikkelen tot verschillende andere soorten cellen en weefsels [27](#page=27). ### 3.1 Kenmerken van stamcellen Stamcellen bezitten twee fundamentele eigenschappen [28](#page=28): 1. **Zelfvernieuwing:** Stamcellen kunnen zichzelf delen en zo identieke kopieën van zichzelf produceren [28](#page=28). 2. **Differentiatie:** Stamcellen hebben het vermogen om zich te ontwikkelen tot gespecialiseerde celtypen die de organen en weefsels van een organisme vormen [28](#page=28). ### 3.2 Soorten stamcellen op basis van pluripotentie De differentiatiepotentie van stamcellen varieert en wordt aangeduid met termen als totipotent, pluripotent en multipotent. #### 3.2.1 Totipotente stamcellen Direct na de bevruchting deelt de eicel zich. De resulterende cellen, of een deel daarvan, hebben de potentie om zich te ontwikkelen tot een complete foetus. Een stamcel wordt als "totipotent" beschouwd als deze het volledige potentieel heeft om zich tot een levensvatbare foetus te ontwikkelen [28](#page=28). > **Example:** De bevruchte eicel en de cellen die ontstaan in de eerste paar delingscycli na de bevruchting zijn totipotent [28](#page=28). #### 3.2.2 Pluripotente stamcellen Ongeveer 4 dagen na de bevruchting, na diverse delingscycli, vormt de bevruchte eicel een holle bol die bekend staat als een blastocyst, bestaande uit circa 140 totipotente stamcellen. De cellen binnenin deze holle bol vormen de binnenste celmassa. Wanneer de blastocyst zich in de baarmoeder nestelt, differentiëren de buitenste cellen tot de placenta. De binnenste celmassa ontwikkelt zich vervolgens tot de foetus. Omdat de binnenste celmassa niet zonder de placenta tot een foetus kan uitgroeien, zijn deze cellen niet langer totipotent, maar pluripotent [29](#page=29). > **Definition:** Pluripotente stamcellen hebben de potentie om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen [29](#page=29). > **Example:** De cellen van de binnenste celmassa van een blastocyst zijn pluripotent [29](#page=29). #### 3.2.3 Multipotente stamcellen Geleidelijk aan worden de individuele cellen binnen de binnenste celmassa steeds meer gespecialiseerd. Multipotente stamcellen hebben een beperkter differentiatiepotentieel dan pluripotente stamcellen [30](#page=30). > **Definition:** Multipotente stamcellen hebben het potentieel om zich te ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen, maar deze differentiatie is beperkt tot een specifieke cel- of weefsellijn [30](#page=30). > **Example:** Hemopoëtische stamcellen zijn multipotent omdat ze zich kunnen ontwikkelen tot verschillende soorten bloedcellen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar ze zijn beperkt tot het bloedvormende systeem [30](#page=30). --- # kwaliteitscontrole van celculturen Celculturen vereisen strikte kwaliteitscontrole om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te garanderen, met name door de potentiële contaminatie met micro-organismen en vreemde cellen, en de inherente genetische instabiliteit [37](#page=37). ### 4.1 Contaminatie met micro-organismen en vreemde cellen #### 4.1.1 Contaminatie met micro-organismen Micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en met name antibiotica-resistente mycoplasma's (PPLO) vormen een significant probleem in celculturen. Deze organismen groeien snel in de voedzame groeimedia. Mycoplasma's zijn parasitair, kunnen deels intracellulair voorkomen en verstoren het cellulaire metabolisme, vaak door overmatige verzuring van het medium. Ze zijn moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar [37](#page=37). #### 4.1.2 Contaminatie met vreemde cellen Contaminatie met vreemde cellen is wijdverspreider dan vaak wordt erkend. Een significant deel van de "oudere" cellijnen blijkt varianten te zijn van de HeLa cellijn, afkomstig van een humane cervix-tumor. Bovendien zijn veel cellijnen die als "humaan" worden beschouwd, in werkelijkheid afkomstig van muizen of ratten. Genetische fingerprinting en karyotypering zijn methoden om dergelijke contaminaties te detecteren [37](#page=37). #### 4.1.3 Effecten van mycoplasma contaminatie Mycoplasma contaminatie kan diverse negatieve effecten hebben op eukaryote cellen, waaronder: * Veranderde niveaus van eiwit-, RNA- en DNA-synthese [38](#page=38). * Verandering van het cellulaire metabolisme [38](#page=38). * Inductie van chromosoomaberraties (numerieke en structurele veranderingen) [38](#page=38). * Verandering in de samenstelling van het celmembraan (expressie van oppervlakteantigenen en receptoren) [38](#page=38). * Verandering van de cellulaire morfologie [38](#page=38). * Inductie (of inhibitie) van lymfocytenactivatie [38](#page=38). * Inductie (of suppressie) van cytokine expressie [38](#page=38). * Verhoging (of verlaging) van viruspropagatie [38](#page=38). * Interferentie met diverse biochemische en biologische assays [38](#page=38). * Invloed op signaaltransductie [38](#page=38). * Bevordering van cellulaire transformatie [38](#page=38). * Verandering van proliferatiekenmerken (groei, vitaliteit) [38](#page=38). * Totale degeneratie en verlies van de kweek [38](#page=38). Bij hybridoomcellen kunnen de effecten specifiek zijn, zoals: * Inhibitie van cel fusie [38](#page=38). * Invloed op de selectie van fusieproducten [38](#page=38). * Interferentie bij de screening van monoklonale antilichaamreactiviteit [38](#page=38). * Productie van monoklonale antilichamen tegen mycoplasma in plaats van het doelantigeen [38](#page=38). * Verminderde opbrengst van monoklonale antilichamen [38](#page=38). * Conservering van hybridoomcellen [38](#page=38). > **Tip:** Mycoplasma contaminatie kan subtiel zijn en leiden tot onverklaarbare variaties in experimentele resultaten. Regelmatige controle is essentieel. ### 4.2 Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen De genetische zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kunnen worden beoordeeld door middel van karyotypering. Hierbij wordt het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen bepaald [39](#page=39). ### 4.3 Intrinsieke genetische instabiliteit Het genotype van gekweekte cellen, gereflecteerd door chromosoomvorm en -aantal, evolueert vaak negatief. Deze genetische instabiliteit is inherent en niet volledig te vermijden, maar kan wel worden beperkt. Dit kan worden bereikt door regelmatig terug te keren naar stock-cultures die zijn ingevroren met anti-kristallijne cryoprotectiva zoals glycerol of DMSO, bij temperaturen van vloeibare stikstof (-196°C) [40](#page=40). > **Tip:** Het regelmatig invriezen van een deel van de celpopulatie als stock-culture is een cruciale strategie om de genetische stabiliteit op lange termijn te bewaren en de gevolgen van inherente instabiliteit te minimaliseren. --- # Specifieke kleurtechnieken voor celcomponenten Deze sectie behandelt diverse specifieke kleurtechnieken die worden gebruikt om verschillende celcomponenten zichtbaar te maken en te identificeren binnen biologische monsters. ### 5.1 Algemene principes van specifieke kleurtechnieken Specifieke kleurtechnieken maken gebruik van moleculaire herkenning of enzymatische activiteit om bepaalde structuren of moleculen in cellen of weefsels aan te kleuren. Dit staat in contrast met algemene kleurstoffen die vetten kunnen aankleuren, ongeacht hun specifieke aard [68](#page=68). ### 5.2 Typen specifieke kleurtechnieken #### 5.2.1 Indifferente kleurstoffen Indifferente kleurstoffen kleuren vetten aan. Een voorbeeld hiervan is Oil Red O, dat gebruikt wordt om vetcellen te visualiseren [68](#page=68) [69](#page=69). #### 5.2.2 Immunohistochemische kleuring Immunohistochemische kleuring maakt gebruik van de specifieke binding tussen antigenen en antilichamen om bepaalde bestanddelen aan te kleuren. Het antilichaam wordt hierbij voorzien van een kleurstof, een fluorescente label of colloïdaal goud [68](#page=68). > **Voorbeeld:** Immunohistochemie kan worden toegepast om specifieke microtubuli aan te kleuren. Een ander voorbeeld is de kleuring van connexine 43 op een coupe van muishart [70](#page=70). #### 5.2.3 Enzymkleuringen Enzymkleuringen tonen de activiteit van enzymen aan door gebruik te maken van een specifiek substraat voor het betreffende enzym. De reactie tussen het enzym en het substraat resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag [68](#page=68). > **Voorbeeld:** De kleuring van glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten is een voorbeeld van een enzymkleuring. Hierbij worden erytrocyten met actieve G6PD aangekleurd, terwijl G6PD-deficiënte erytrocyten ongetint blijven. Dit kan worden uitgevoerd met de tetrazoniumzoutmethode. De visualisatie toont G6PD-bevattende erytrocyten (pijlen) en G6PD-deficiënte erytrocyten (pijpunten). Dit kan onderscheid maken tussen erytrocyten van een gezond persoon zonder G6PD-deficiëntie, waarbij ongetinte erytrocyten oud zijn en weinig actieve G6PD bevatten, en erytrocyten van een persoon met homozygote G6PD-deficiëntie, waarbij een aangekleurde erytrocyt jong is en actieve G6PD bevat. Bij heterozygote G6PD-deficiëntie is een gemengd beeld te zien [71](#page=71). --- # Mucoviscidose en cf tr eiwit lokalisatie Dit hoofdstuk bespreekt mucoviscidose (cystic fibrosis), een genetische ziekte veroorzaakt door defecten in het CFTR-eiwit, en de methoden om de lokalisatie van dit eiwit in weefsels te bestuderen [93](#page=93). ### 6.1 Mucoviscidose Mucoviscidose, ook bekend als cystic fibrosis of taaislijmziekte, is een genetische aandoening die wordt gekenmerkt door de productie van taai, visceus slijm. Deze ziekte leidt tot veranderingen in de samenstelling van de secretieproducten van diverse klieren, waaronder de pancreas, bronchiën en zweetklieren. De oorzaak van mucoviscidose ligt in mutaties in het CFTR-gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator), wat resulteert in een verstoorde productie of functie van het bijbehorende eiwit [93](#page=93). #### 6.1.1 Het CFTR eiwit Het CFTR-eiwit speelt een cruciale rol bij het transport van chloride-ionen over de celmembraan. Een van de meest voorkomende mutaties is de deletie van een aminozuur op positie 508 van het CFTR-eiwit, aangeduid als de $\Delta$F508 mutatie [93](#page=93). ##### 6.1.1.1 Normale versus gemuteerde CFTR eiwit lokalisatie * **Wild type CFTR:** Het normale, functionele CFTR-eiwit wordt via het Golgi-netwerk naar de apicale celmembraan getransporteerd [93](#page=93). * **Gemuteerd CFTR ($\Delta$F508):** Bij de meest voorkomende mutatie wordt het CFTR-eiwit niet correct gevouwen en blijft het achter in het endoplasmatisch reticulum (ER) voor afbraak. Dit fenomeen staat bekend als subcellulaire mislocatie [93](#page=93). ### 6.2 Lokalisatie van CFTR eiwit via immunohistochemie Om de lokalisatie van het CFTR-eiwit in weefsels te onderzoeken, wordt immunohistochemie toegepast. Deze techniek maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan het CFTR-eiwit [93](#page=93). #### 6.2.1 Antilichamen voor CFTR detectie Er zijn verschillende antilichamen beschikbaar voor de detectie van CFTR. Het is essentieel dat deze antilichamen zowel het wild type als de gemuteerde vormen van het eiwit kunnen herkennen om verschillen in lokalisatie te kunnen vaststellen [93](#page=93). ##### 6.2.1.1 Toepassingen in onderzoek De applicatie van specifieke antilichamen voor immunohistochemische lokalisatie van CFTR is onderzocht in zowel controleweefsels als weefsels van patiënten met cystische fibrose [94](#page=94) [95](#page=95). * **Voorbeeld van onderzoek:** Studies hebben de toepasbaarheid van verschillende antilichamen onderzocht voor de immunohistochemische lokalisatie van CFTR in zweetklieren van gezonde individuen en patiënten met cystische fibrose. De resultaten van dergelijk onderzoek tonen visuele verschillen in de CFTR-expressie en lokalisatie tussen controlepersonen en patiënten [94](#page=94) [95](#page=95). > **Tip:** Bij het interpreteren van immunohistochemie-resultaten voor CFTR is het cruciaal om rekening te houden met de specificiteit van de gebruikte antilichamen en de mogelijke verschillen in eiwitexpressie tussen wild type en gemuteerde vormen. --- # Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop (bright field microscope) maakt gebruik van doorvallend wit licht om preparaten te bekijken, waarbij het contrast voornamelijk gebaseerd is op lichtabsorptie [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). ### 7.1 Algemene principes en onderdelen De resolutie, de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven, van een lichtmicroscoop wordt beperkt tot ongeveer 200 nanometer (nm). Deze resolutie wordt bepaald door het objectief en de golflengte van het gebruikte licht, en niet door het oculair. Voor de analyse van dikker materiaal, zoals weefsels, is versnijding tot dunne secties na fixatie en inbedding noodzakelijk. Levende cellen, die doorgaans weinig contrast hebben, vereisen speciale microscopische technieken [52](#page=52). Een lichtmicroscoop bestaat uit optische en fijnmechanische onderdelen. De optische componenten omvatten drie hoofdsystemen [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55): * **Condensor:** Dit systeem, samengesteld uit meerdere lenzen, bundelt het licht van de lichtbron op het preparaat. De condensor is van cruciaal belang voor het bepalen van de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Objectief:** Dit objectief, dicht bij het preparaat geplaatst, vormt een vergroot beeld [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Oculair (eyepiece):** Dit optische onderdeel vergroot het reeds door het objectief gevormde beeld verder, zodat het op het netvlies van de observant kan worden geprojecteerd [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). Een spiegel wordt gebruikt om het licht van de lichtbron naar de condensor te leiden. Soms wordt een prisma ingezet om de lichtweg te buigen en een comfortabelere positie voor de onderzoeker te creëren [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). > **Tip:** Het klaarveldmicroscoop is de meest basale vorm van lichtmicroscopie. Het is essentieel om de rol van elk van de drie lenssystemen (condensor, objectief, oculair) te begrijpen voor het verkrijgen van een optimaal beeld. ### 7.2 Preparatie van monsters Voor klaarveldmicroscopie worden monsters op verschillende wijzen behandeld, afhankelijk van hun aard [52](#page=52): * **Celculturen:** Deze worden vaak op dekglaasjes geplaatst en als geheel behandeld [52](#page=52). * **Dikkere materialen (weefsels, orgaan-cultures):** Deze moeten worden versneden na fixatie en inbedding in paraffine. Cryosecties van bevroren materiaal, gevolgd door fixatie, zijn ook een veelgebruikte methode [52](#page=52). De detectie van structuren in gefixeerde en gekleurde preparaten gebeurt door middel van lichtabsorptie, wat kenmerkend is voor klaarveldmicroscopie [52](#page=52). > **Voorbeeld:** Het gebruik van Haematoxyline/Eosine (H&E) kleuring is een standaardmethode om weefselstructuren zichtbaar te maken door hun verschillende absorptie van licht na kleuring [52](#page=52). --- # Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie is een softwarematige bewerkingstechniek die wordt toegepast op conventionele digitale beelden om een hogere resolutie te verkrijgen [86](#page=86). ### 8.1 Principe en toepassing Conventionele fluorescentiemicroscopen produceren beelden met een lagere resolutie vergeleken met geavanceerdere technieken zoals confocale microscopie. Recentelijk is het echter mogelijk geworden om door middel van softwarematige bewerking van deze conventionele digitale beelden, met behulp van deconvolutie-algoritmes, zeer aanvaardbare hoge resoluties te bereiken. Dit maakt deconvolutie een waardevolle methode om de beeldkwaliteit van bestaande microscopische opnames te verbeteren [86](#page=86). > **Tip:** Deconvolutie kan beschouwd worden als een post-processing methode om de effecten van optische aberraties en onscherpte in het beeld te corrigeren [86](#page=86). ### 8.2 Vergelijking met andere technieken Terwijl confocale microscopie uitblinkt in het vastleggen van dynamische processen door middel van time-lapse opnames en analyse, biedt deconvolutie een methode om de resolutie van conventionele microscopie aanzienlijk te verbeteren. Dit is met name nuttig wanneer de aanschaf van geavanceerdere microscopen niet mogelijk is. Deconvolutie-algoritmes verwerken het bestaande beeld door informatie over de beeldvormingsfunctie (point spread function, PSF) te gebruiken om de oorspronkelijke, scherpere versie van het beeld te reconstrueren. Dit proces minimaliseert de bijdrage van licht dat buiten het focusvlak valt, wat een veelvoorkomend probleem is in conventionele microscopie [86](#page=86) [87](#page=87). --- # Voorbereiding en analyse van biologisch materiaal met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) De voorbereiding van biologisch materiaal voor TEM-analyse omvat diverse stappen die cruciaal zijn om structuren met hoge resolutie zichtbaar te maken . ### 9.1 Algemene principes van TEM-beeldvorming Elektronenmicroscopie maakt gebruik van elektronenbundels met een korte golflengte, die buiten het zichtbare spectrum van het menselijk oog vallen. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op elektronenstrooiing door de atomen van het weefsel. Dicht(er)e structuren absorberen meer elektronen en verschijnen donkerder, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten en lichter verschijnen. Biologisch materiaal vertoont van nature geringe densiteitsverschillen, wat de noodzaak van 'contrastering' onderstreept . ### 9.2 Voorbereidingsstappen van biologisch materiaal #### 9.2.1 Fixatie De eerste stap is de fixatie van ruwe materiaalstukjes, zoals weefselbrokjes of losse cellen, met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde. Het doel van fixatie is om de fijne intracellulaire structuren zo intact mogelijk te behouden en de celmembranen doorlaatbaar te maken voor de componenten die in latere stappen worden gebruikt . #### 9.2.2 Spoeling en 'kleuring' (contrastering) Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het biologisch materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen. Deze stoffen, zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat of kaliumpermanganaat, binden zich specifiek aan bepaalde celregio's, waaronder vetrijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern, en eiwitrijke structuren zoals cytoskeletelementen. Metaalverbindingen weerkaatsen elektronen, waardoor de ermee gemerkte structuren als donkere plekken verschijnen in de microscoop. Dit proces wordt 'kleuren' genoemd, hoewel het geen werkelijke kleuren betreft. Een verhoging van deze densiteitsverschillen, ook wel contrasteren genoemd, is cruciaal voor de beeldvorming. Osmiumtetroxide kan zowel als fixatief als contrasteringsmiddel dienen, en draagt bij aan het contrast van membranen. Uranylacetaat en loodcitraat worden gebruikt als contrasteringsvloeistof . #### 9.2.3 Dehydratatie Om ultradunne coupes (60 tot 90 nm dikte) te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, is het verwijderen van water uit het monster noodzakelijk. Dit gebeurt door het materiaal te spoelen met oplossingen van ethanol of aceton met toenemende concentraties . #### 9.2.4 Inbedding in hars Na de dehydratatie wordt het materiaal geïnfiltreerd met een nog niet-gepolymeriseerde kunsthars. Vervolgens wordt het hars-doordrongen materiaal in een houder geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule. Polymerisatie van de hars kan plaatsvinden door middel van warmte, magnetronstraling, of katalysatie met ultraviolet licht, resulterend in harde, goed snijbare blokjes materiaal . #### 9.2.5 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden Voor het verkrijgen van coupes met een dikte van ongeveer 70 nm zijn speciale messen van gespleten glas of diamanten messen vereist. Het snijden gebeurt met behulp van een ultramicrotoom . #### 9.2.6 Opvangen van coupes op een gridje Een kleine hoeveelheid water achter het mes dient als smeermiddel en voor het opvangen van de coupes. De fragiele coupes worden van het wateroppervlak 'opgeschept' op een metalen schijfje van minder dan 5 mm doorsnee met een roosterpatroon, een zogenaamd gridje . ### 9.3 Analyse en resolutie Met TEM kunnen structuren van cellulaire organellen met hoge resolutie worden waargenomen. Een voorbeeld toont twee aangrenzende pancreascellen, waarbij details zoals de kern (N), mitochondria (M), lysosomen (L), ruw endoplasmatisch reticulum (RER) en de dubbelbladige plasmamembranen (PM) zichtbaar zijn. Vergrotingen van ongeveer 40.000 keer en insets van 200.000 keer zijn mogelijk . > **Tip:** De 'kleuring' in TEM verwijst naar het gebruik van zware metalen om densiteitsverschillen te vergroten, niet naar ware kleuren zoals in lichtmicroscopie. > **Voorbeeld:** Zonder de contrastering met zware metalen zouden de verschillende membranen en organellen in een cel nauwelijks te onderscheiden zijn in de TEM vanwege hun vergelijkbare densiteit. --- # Analyse van epitheel van de trachea met behulp van microscopietechnieken Dit onderwerp bespreekt de analyse van het epitheel van de trachea (luchtpijp) met behulp van verschillende microscopietechnieken, met name transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM), om de structuur en celtypen te onderscheiden . ### 10.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse van tracheaalepitheel TEM-analyse van het epitheel van de trachea onthult twee primaire celtypen: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen . #### 10.1.1 Ondersteunende structuren Het epitheel rust op een basaal membraan (BM, basale lamina) dat overgaat in fibreus bindweefsel, bestaande uit fibrocyten, collageenvezels (Co) en elastinevezels (El) . #### 10.1.2 Celtypen in het tracheaalepitheel * **Gecilieerde cellen:** Deze cellen zijn gekenmerkt door de aanwezigheid van lange cilia en bevatten veel mitochondria en enig glad endoplasmatisch reticulum (SER). De cilia zijn begrensd door een dubbelbladige biologische membraan, vergelijkbaar met microvilli (MV), en kunnen longitudinaal, schuin of dwars worden doorgesneden . * **Mucus-producerende cellen:** Deze cellen worden geïdentificeerd door de overvloed aan ruw endoplasmatisch reticulum (ER), een uitgebreid Golgi-apparaat (G), en mucus-gevulde secretiedruppels (MD) . > **Tip:** De cilia en microvilli zijn beide begrensd door een "unit membrane" (UM), wat wijst op een gemeenschappelijke membraanstructuur . #### 10.1.3 Technieken in TEM Naast standaard TEM-preparaten, worden ook technieken zoals vries-breek (freeze-fracture) en vries-ets (freeze-etching) toegepast om membraanstructuren te visualiseren . * **Vries-breek:** Deze techniek breekt cellulaire membranen doorgaans tussen het binnen- en buitenblad, waardoor de interne membraanstructuren, waaronder eiwitten, zichtbaar worden. Het vloeibare mozaïekmodel van de biologische membraan wordt hierdoor geïllustreerd, waarbij eiwitten geassocieerd kunnen worden met de cytoplasmatische (P) of extracellulaire (E) membraanhelft . * **Vries-ets:** Deze methode genereert meer 3D-structuur door een dunne laag ijs te verwijderen via sublimatie (vast naar gas) onder vacuüm, waardoor diepere structuren blootgelegd worden . Visualisatie na deze vries-technieken gebeurt door bestuiving met zware atomen voor TEM of SEM, of door het maken van een replica om de elektronenpassage in TEM te verbeteren . > **Voorbeeld:** Een TEM-opname van een replica van een vriesbreekpreparaat van een darmepitheelcel toont organellen zoals microvilli (MV), celmembraan (CM), mitochondriën (M), Golgi-apparaat (G), nucleus (N) en kernporiën . ### 10.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) analyse van tracheaalepitheel SEM-analyse van het epitheel van de trachea toont eveneens de twee celtypen: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen. De mucus-producerende cellen vertonen een koepelvormig oppervlak . #### 10.2.1 Monsterpreparatie voor SEM Monsters die met SEM worden bekeken, moeten geleidend worden gemaakt voor elektriciteit. Dit gebeurt door ze met een sputtercoater te voorzien van een uiterst dun laagje (1,5-3 nanometer) goud of goud/palladium . ### 10.3 Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) Cryo-ET is een techniek voor 3D-reconstructie die gebaseerd is op een serie 2D-projecties, verkregen door het object of de detector rond een as te kantelen . #### 10.3.1 Principe van Cryo-ET * De reconstructie gebeurt door het progressief berekenen van terugprojecties naar een virtueel 3D-beeld van het originele object . * De nauwkeurigheid van het gereconstrueerde beeld neemt toe naarmate meer projecties met kleinere hoekverschillen kunnen worden gecombineerd, wat leidt tot minder "artefacten" door ontbrekende wiggen (missing-wedge) . > **Voorbeeld:** Het principe kan geïllustreerd worden voor de reconstructie van een 2D-beeld uit 1D-projecties, waarbij een betere beeldkwaliteit wordt bereikt met meer projecties over een groter hoekbereik . #### 10.3.2 Toepassing van Cryo-ET Cryo-ET kan worden gebruikt voor de gedetailleerde reconstructie van cellulaire structuren, zoals nucleaire pore complexen (NPC's). Door verschillende NPC's te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt . > **Voorbeeld:** Een 3D-reconstructie van een deel van het kernoppervlak toont de structuur van nucleaire pore complexe (NPC) en ruw endoplasmatisch reticulum (RER) in de celkern van de slijmzwam *Dictyostelium discoideum* . --- # Celgroei en celtransfer in celculturen Celgroei en celtransfer zijn fundamentele processen in celculturen die essentieel zijn voor het onderhouden van celpopulaties en het uitvoeren van experimenten. Dit omvat de principes van celdichtheidsafhankelijke groei, de methoden voor celtransfer, en de stappen die betrokken zijn bij celadhesie en spreiding [17](#page=17) [20](#page=20) [22](#page=22). ### 11.1 Celdichtheidsafhankelijke groei en contactinhibitie Cellen in cultuur vertonen groei tot ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Op dit punt treedt 'contactinhibitie' van celproliferatie op, deels als gevolg van concurrentie voor mitogenen. Dit betekent dat de celdeling stopt zodra de cellen elkaar raken en de beschikbare ruimte volledig is ingenomen [17](#page=17). Tumorcellen daarentegen kunnen het vermogen tot contactinhibitie verloren hebben. Hierdoor kunnen ze in dichtere aggregaten of hopen groeien, zelfs in een driedimensionale (3D) structuur, in plaats van een uniforme monolaag te vormen. Dit gedrag kan worden waargenomen met scanning electron microscopie (SEM) opnames [18](#page=18). Om een cultuur te behouden en verdere deling te stimuleren, moeten cellen gesplitst worden. Het toevoegen van vers medium kan de delingen herstarten. Een efficiëntere methode is het splitsen van de cultuur in dochterculturen, wat doorgaans gebeurt via een trypsine-EDTA procedure [17](#page=17). ### 11.2 Celtransferprocedure Celtransfer, ook wel celdeling of uitkweek genoemd, is noodzakelijk om celpopulaties te vermeerderen en te onderhouden. De procedure verschilt enigszins afhankelijk van het type celcultuur [20](#page=20). #### 11.2.1 Transfer van suspensiecultures Bij suspensiecultures gebeurt celtransfer door eenvoudige verdunning. Dit kan gebeuren na zacht centrifugeren en heropname in vers medium [20](#page=20). #### 11.2.2 Transfer van adherente cellen Voor adherente cellen vindt celtransfer plaats zodra de celmonolaag confluentie bereikt, gemiddeld om de 3 tot 7 dagen. De procedure omvat de volgende stappen [20](#page=20): 1. **Behandeling met trypsine/EDTA:** De cultuur wordt behandeld met trypsine/EDTA (TE) [20](#page=20). * **Trypsine:** Dit is een maagprotease dat bij korte behandeling de oppervlakte-eiwitten van de cellen degradeert [20](#page=20). * **EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat):** Dit cheleert calcium- en magnesiumionen, wat interfereert met zowel intercellulaire adhesie als cel-substraatbinding [20](#page=20). 2. **Loskomen van het substraat en van elkaar:** Onder geschikte condities komen de cellen los van het substraat en van elkaar, en vormen ze een suspensie van levende, opgebolde cellen [20](#page=20). 3. **Monocellulaire suspensie:** De suspensie is optimaal als deze monocellulair is, zonder meercellige aggregaten [20](#page=20). 4. **Verdunnen en uitzaden:** De monocellulaire suspensie wordt vervolgens verdund en uitgezaaid in nieuwe recipiënten. De verdunningsfactor varieert van 1 over 3 voor 'normale' cellen tot 1 over 30 voor 'tumorale' cellen [20](#page=20). 5. **Inhibitie van trypsine:** Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren, die van nature aanwezig zijn in het serum [20](#page=20). Het werken met cellen voor celsplitsing vindt plaats in een laminaire flowbench om steriele condities te waarborgen [21](#page=21). > **Tip:** De trypsine-EDTA procedure is cruciaal voor het losmaken van adherente cellen. Zorg ervoor dat de behandelingstijd geoptimaliseerd is om celschade te minimaliseren. ### 11.3 Groei in 2D- en 3D-culturen Celculturen kunnen worden opgezet om de in vivo omgeving na te bootsen [19](#page=19). * **2D-culturen:** Epitheliale cellen, zoals MDCK-cellen (Madine-Darby Canine Kidney), kunnen op een filter groeien en een 2D-cultuur vormen. In deze monolaag kunnen eiwitten apicaal of basolateraal in de cel worden geplaatst [19](#page=19). * **3D-culturen:** In een omgeving met de juiste extracellulaire componenten kunnen cellen ook cysten vormen, wat een meer driedimensionale groei nabootst. Deze 3D-structuren kunnen ook worden geobserveerd in tumoren die in dense foci groeien [18](#page=18) [19](#page=19). ### 11.4 Stappen bij celadhesie en -spreiding Nadat cellen zijn losgemaakt en uitgeplaat, ondergaan ze een proces van adhesie en spreiding op het substraat. Dit proces, geïllustreerd door SEM-opnames van muisfibroblasten op verschillende tijdstippen, omvat de volgende stappen [22](#page=22): 1. **Zinken door gravitatie:** De cellen zakken initieel uit onder invloed van de zwaartekracht [22](#page=22). 2. **Initieel contact met het substraat:** Er wordt een minimaal contactoppervlak gevormd, omdat de cellen nog opgebold zijn [22](#page=22). 3. **Progressieve spreiding:** In de daaropvolgende uren vindt er een proces van progressieve spreiding over het substraat plaats. Dit vereist energie en veranderingen in het cytoskelet. Hierdoor vergroot het celcontactoppervlak en wordt de cel-substraatsadhesie versterkt [22](#page=22). 4. **Sterke binding met het substraat:** De cellen gaan een sterke binding aan met het substraat door dit te modificeren met eigen aangemaakte extracellulaire matrix (ECM) moleculen [22](#page=22). Ondanks deze sterke adhesie kunnen cellen over het celoppervlak migreren. Dit gebeurt door focaal en tijdelijk de celadhesie te inhiberen op de plek waar de cel loskomt, en tegelijkertijd elders de celadhesie op te bouwen in de migratierichting [22](#page=22). > **Example:** De evolutie van muisfibroblasten op een substraat, waargenomen via SEM op 30 minuten, 60 minuten, 2 uur en 24 uur na uitplating, illustreert deze stappen van adhesie en spreiding duidelijk [22](#page=22). --- # Prepareren en observeren van cellen en weefsels voor microscopie Om structuren onder de lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM) te kunnen bestuderen, moeten cellen en weefsels geprepareerd worden, omdat biologisch materiaal over het algemeen te dik is om licht of elektronen door te laten en te weinig contrast bevat voor gedetailleerde waarneming. Histologische technieken maken het mogelijk weefsels voldoende dun te snijden en contrast te verhogen om structuurdetails zichtbaar te maken. Dit proces omvat doorgaans fixeren, inbedden en snijden, gevolgd door kleuren of contrasteren [42](#page=42). ### 12.1 Het belang van secties Het gebruik van dunne secties van weefsel is essentieel om subcellulaire details waar te nemen [43](#page=43) [44](#page=44). #### 12.1.1 Procedure voor paraffine coupes Een typische procedure voor het maken van paraffine coupes omvat: * Fixeren van een klein stukje weefsel (immersiefixatie) [43](#page=43). * Dehydrateren van het weefsel [43](#page=43). * Doordringen met vloeibare paraffine [43](#page=43). * Snijden van secties met een dikte van 0,5 tot 50 micrometer met behulp van een microtoom [43](#page=43). * Kleur en secties op een microscopisch glaasje plaatsen [43](#page=43). > **Voorbeeld:** H/E gekleurde secties worden gebruikt om structuren zichtbaar te maken, maar een grote wanorde in het onderste beeld kan wijzen op een carcinoom van het colon [44](#page=44). ### 12.2 Fixeren Fixeren heeft tot doel weefsels te bewaren met behoud van de oorspronkelijke structuur. Dit wordt bereikt door denaturatie van eiwitten [45](#page=45). #### 12.2.1 Doel van fixatie Wanneer een weefsel uit zijn in vivo situatie wordt verwijderd, worden afbraakenzymen actief die leiden tot weefseldegradatie. Om deze afbraakprocessen tegen te gaan, moet de activiteit van deze eiwitten gestopt worden door denaturatie [45](#page=45). #### 12.2.2 Methoden van fixatie Denaturatie van eiwitten kan op twee manieren plaatsvinden: * **Bevriezen:** Dit stopt enzymatische reacties snel. Koude fixatie maakt snelle verwerking van materiaal mogelijk en bewaart epitopen beter voor immuunkleuringen. Het wordt veel gebruikt in pathologielaboratoria voor snelle diagnoses van biopten en tumoren, zelfs tijdens operaties [45](#page=45). * **Chemische fixatieven:** Deze middelen denatureren eiwitten door ze te cross-linken (bv. met formaldehyde/formol, glutaraldehyde) of neer te slaan (precipiteren) (bv. met alcohol of aceton). Door cross-linking blijven cel/weefselcomponenten behouden voor latere procedures. Chemische fixatieven resulteren over het algemeen in een betere morfologie [45](#page=45). #### 12.2.3 Artefacten bij fixatie Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in vivo situatie worden artefacten genoemd. Dit kan leiden tot structuurveranderingen (bv. het ontstaan van een holte rond kraakbeencellen) of het op een andere plaats voorkomen van componenten (bv. glycogeendrift in een leverpreparaat) [45](#page=45). ### 12.3 Inbedden Inbedden houdt in dat het gefixeerde materiaal wordt omwikkeld en doordrongen met een inbedmiddel. Het inbedmiddel is een substantie die in het weefsel binnendringt en vervolgens hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken. Veelgebruikte inbedmiddelen zijn paraffine, hars en plastics [46](#page=46). #### 12.3.1 Vereisten voor inbedmiddelen Voor het verkrijgen van goede coupes moet het inbedmiddel het weefsel volledig kunnen binnendringen. Als dit niet gebeurt, ontstaat materiaal met verschillende hardheden, wat het snijden bemoeilijkt [46](#page=46). #### 12.3.2 Het proces van inbedden Inbedmiddelen die gebruikt worden in de routine histologie zijn hydrofoob. Aangezien biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%), moet dit water eerst verwijderd worden met behulp van een stijgende reeks alcoholbaden (bv. 30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Vervolgens wordt tolueen gebruikt voor ‘clearing’, een substantie die mengbaar is met zowel alcohol als het hydrofobe inbedmiddel [47](#page=47). > **Tip:** Hoewel er alternatieve hydrofobe harsen met hydrofiele groepen en hydrofiele inbedmiddelen bestaan, zijn deze over het algemeen minder stabiel en resulteren ze in inferieure morfologie [47](#page=47). ### 12.4 Snijden Door de hardheid van het inbedmateriaal kan het weefsel in dunne plakken gesneden worden [48](#page=48). #### 12.4.1 Dikte van de coupes * **Paraffine:** Maakt coupes van 5-10 micrometer mogelijk, wat doorlaatbaar is voor licht. Paraffine wordt verwarmd tot ongeveer 55°C, waardoor het smelt en in het weefsel kan dringen. Bij deze temperatuur blijven veel epitopen nog bewaard [48](#page=48). * **Harsen en plastics:** Laten coupes toe tot 70 nanometer, wat doorlaatbaar is voor elektronen. De polymerisatie van hars gebeurt bij 60-65°C. Omdat de meeste harsen moeilijk uit het weefsel te etsen zijn (in tegenstelling tot paraffine), zijn ze minder geschikt voor immuunkleuringen [48](#page=48). #### 12.4.2 Gebruik van de microtoom Het snijden van het ingebedde, harde materiaal gebeurt met een microtoom [48](#page=48). * Microtomen voor paraffine-ingebed materiaal zijn uitgerust met stalen messen [48](#page=48). * Microtomen voor harsen en plastics gebruiken glazen of diamanten messen [48](#page=48). #### 12.4.3 Plaatsing van de coupes * Coupes voor LM-analyse worden aangebracht op draagglaasjes [48](#page=48). * Coupes voor EM worden op metalen (koper, nikkel) roostertjes geplaatst, aangeduid als grids [48](#page=48). --- # elektronenmicroscopie technieken en toepassingen Elektronenmicroscopie (EM) maakt gebruik van elektronenbundels in plaats van licht om structuren te visualiseren die met een lichtmicroscoop niet te onderscheiden zijn, wat leidt tot aanzienlijk hogere resoluties en vergrotingen [98](#page=98) [99](#page=99). ### 13.1 Algemene principes van elektronenmicroscopie In tegenstelling tot lichtmicroscopen, waar glaslenzen het licht bundelen, gebruikt elektronenmicroscopie elektromagnetische magneten als lenzen om elektronenbundels te focussen en te manipuleren. Er is sprake van een bron, een elektronenkanon, dat elektronen genereert door verhitting van een filament in een hoog-vacuüm omgeving. Deze elektronen worden naar een anode getrokken. Elektromagnetische lenzen, waaronder een condensorlens om de bundel te concentreren en een objectieflens om scherp te stellen, sturen de elektronen. Voor scanning elektronenmicroscopie (SEM) zijn er ook componenten om de aftastbeweging te realiseren [98](#page=98). Het cruciale voordeel van elektronenmicroscopen ligt in de veel kleinere golflengte van elektronen vergeleken met zichtbaar licht. De golflengte van licht varieert van 400 tot 800 nanometer (nm), waardoor objecten kleiner dan deze golflengte niet waarneembaar zijn met een lichtmicroscoop omdat het golffront eromheen beweegt. De golflengte van elektronen is echter zo klein dat in principe individuele atomen waargenomen kunnen worden . Er zijn echter technische complicaties verbonden aan het gebruik van elektronen : * Elektronen worden gemakkelijk gestopt door gasmoleculen, wat vereist dat de elektronenmicroscoop in een nagenoeg absoluut vacuüm functioneert . * Er moet onder hoogspanning worden gewerkt om de elektronen voldoende snelheid te verlenen . * Elektrische en magnetische velden zijn noodzakelijk als lenzen om de elektronenstraal te sturen . ### 13.2 Typen elektronenmicroscopie Er wordt globaal onderscheid gemaakt tussen twee hoofdtypen elektronenmicroscopen: Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM) en Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) [99](#page=99). #### 13.2.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) TEM maakt gebruik van elektronen die door een ultradun preparaat heen gaan. De resolutie van TEM kan tot 1 nm reiken. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op de verstrooiing van elektronen op zware atoomkernen in het preparaat [100](#page=100) [99](#page=99). ##### 13.2.1.1 Preparatie- en kleuringstechnieken voor TEM Omdat biologisch materiaal van zichzelf weinig contrast geeft in een TEM, zijn aangepaste fixatie- en kleuringstechnieken essentieel . * **Fixatie:** Biologisch materiaal wordt gefixeerd met glutaaraldehyde, een bivalente crosslinker voor aminegroepen (voornamelijk in eiwitten), en osmiumtetroxide, een sterk oxidans dat lipiden en eiwitten stabiliseert . * **Kleuring:** Om contrast te creëren, wordt het materiaal blootgesteld aan verbindingen van zware metalen, zoals osmium, die elektronen weerkaatsen en zich aan specifieke structuren binden. Deze structuren verschijnen dan als donkere gebieden in het beeld, terwijl structuren met minder affiniteit voor deze 'kleurstoffen' meer elektronen doorlaten en lichter worden weergegeven. Als coupes te dik zouden zijn, zouden alle elektronen tegengehouden worden, wat resulteert in een zwart beeld . * **Negatieve kleuring:** Hierbij worden virusdeeltjes of andere structuren omgeven door een zwaar metaalzout (zoals uranylacetaat of fosfowolframzuur). Het metaal vult de ruimte rond het preparaat, waardoor het preparaat zelf wit afsteekt tegen een zwarte achtergrond . * **Shadowing (schaduwbestuiving):** Dit is een techniek waarbij het preparaat vanuit een schuine hoek wordt bestoven met een verdampt metaal (zoals platina, goud of chroom). Hierdoor ontstaat er een driedimensionaal effect doordat de ene kant van de structuur wordt belicht en de andere kant in de schaduw ligt . * **Rotary shadowing:** Een specifieke vorm van shadowing waarbij het preparaat onder een zeer lage hoek op een roterend specimen wordt bestoven, vaak gebruikt voor visualisatie van nucleïnezuren . * **Ultradunne secties:** Voor TEM worden ultradunne coupes van 50-100 nm gemaakt na fixatie. Vanwege de dunheid van de coupes is expertise vereist voor een correcte driedimensionale interpretatie . ##### 13.2.1.2 Toepassingen van TEM TEM wordt gebruikt om de interne structuur van objecten te bestuderen, zoals weefsels, cellen en virussen. Voorbeelden van TEM-analyse zijn de visualisatie van het corona virus een plantenvirus collageenvezels en poliovirusdeeltjes [99](#page=99). #### 13.2.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) SEM wordt gebruikt om het oppervlak van preparaten in beeld te brengen. Hierbij mag het preparaat groter en dikker zijn, maar het moet wel worden gecoat met een zwaar metaal. Het preparaat wordt in hoog vacuüm afgetast met een elektronenbundel. Hierbij treedt terugkaatsing van elektronen op en wordt de generatie van secundaire elektronen bevorderd. Deze secundaire elektronen worden gedetecteerd door een scintillator, waarna een driedimensionaal beeld computergestuurd wordt berekend [99](#page=99). ##### 13.2.2.1 Vergelijking TEM vs SEM | Kenmerk | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | | :------------------- | :-------------------------------------------------------------------- | :------------------------------------------------------------------------- | | **Focus** | Interne structuur van ultradunne preparaten | Oppervlaktestructuur van preparaten | [99](#page=99). | **Preparatie** | Vereist ultradunne secties (50-100 nm) | Preparaten mogen groter en dikker zijn, maar moeten metaal-gecoat zijn | [99](#page=99). | **Principe beeldvorming** | Doorlating van elektronenbundel, verstrooiing door zware atomen | Scanning met elektronenbundel, detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen | [100](#page=100) [99](#page=99). | **Beeldweergave** | Op een fluorescerend scherm | Computergestuurde 3D-reconstructie van gedetecteerde signalen | [100](#page=100) [99](#page=99). | **Resolutie** | Tot 1 nm | Typisch enkele nanometers, afhankelijk van de bundel en detector | [99](#page=99). #### 13.3 Toepassingen en vergrotingen Met elektronenmicroscopen kunnen structuren tot op 1 nm zichtbaar gemaakt worden. TEM kan vergrotingen tot 600.000 keer en meer bereiken. Het scheidend vermogen van TEM is theoretisch kleiner dan 3 nm. SEM, met zijn 3D-beeldvorming, is uitermate geschikt voor het bestuderen van oppervlakken van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen [98](#page=98) [99](#page=99). --- # lichtmicroscopische analysemethoden en hun principes Lichtmicroscopische analysemethoden maken gebruik van licht om biologische structuren zichtbaar te maken, variërend van histologische kleuringen tot geavanceerde technieken voor levende cellen die werken op basis van interferentie van licht [57](#page=57) [59](#page=59). ### 14.1 Basisprincipes van lichtmicroscopie Het zichtbaar maken van ongekleurde, transparante preparaten met een standaard klaarveldmicroscoop is vaak problematisch vanwege een gebrek aan contrast. Contrast wordt gegenereerd door het benutten van verschillen in optische dichtheid binnen het preparaat, wat resulteert in faseverschuivingen in het doorvallende licht door afwijkende brekingsindices. Deze faseverschuivingen kunnen worden omgezet in amplitudeveranderingen (licht/donker) voor visualisatie [59](#page=59) [60](#page=60). #### 14.1.1 Histologische kleuringen Histologische kleuringen verhogen het contrast door de amplitude van bepaalde golflengtes van het opvallende licht te reduceren, wat resulteert in kleurvorming. Coupes worden typisch gedeparaffineerd (met tolueen) voordat ze worden gekleurd met waterige oplossingen van kleurstoffen [60](#page=60) [63](#page=63). ##### 14.1.1.1 Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring De hematoxyline en eosine (H&E) kleuring is een veelgebruikte routinekleuring voor histologisch onderzoek. Deze methode maakt gebruik van verschillen in de chemie van het weefsel om verschillende componenten anders te kleuren, voornamelijk via ionische binding [64](#page=64). * **Hematoxyline**: Wordt gebruikt in combinatie met een beitsmiddel, meestal een metaalkation zoals aluminium. In complex met aluminiumzouten is hematoxyline kationisch en werkt als een basische kleurstof. Het is positief geladen en reageert met negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern, waardoor deze blauw of donkerpaars kleuren. H&E kleuring van kernen toont gedetailleerde intranucleaire structuren en patronen van heterochromatinedensiteit, wat diagnostisch belangrijk is bij kankerdiagnose [64](#page=64) [65](#page=65). * **Eosine**: Is anionisch en werkt als een zure kleurstof. Het is negatief geladen en reageert met positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma, waardoor deze roze kleuren. In een typisch weefsel zijn de kernen blauw, terwijl het cytoplasma en de extracellulaire matrix variabel roze gekleurd zijn. Nucleoli worden met eosine gekleurd [64](#page=64) [65](#page=65). ##### 14.1.1.2 Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring PAS kleuring wordt gebruikt om vrije suikers aan te kleuren. In het voorbeeld van een darmvillus kleurt PAS het intervilleuze slijm en de microvilli (borstelzoom) aan [57](#page=57). ##### 14.1.1.3 Combinatiekleuringen H&E kleuring wordt vaak gecombineerd met andere technieken. Hematoxyline kan nuttig zijn als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken [66](#page=66). > **Voorbeeld:** Een voorbeeld van lichtmicroscopische analyse is de kleuring van een darmvillus met PAS en hematoxyline, waarbij PAS vrije suikers aankleurt en hematoxyline zure componenten [57](#page=57). > **Voorbeeld:** Een dunne darm van een muis gekleurd met H&E toont villi, lamina propria, muscularis mucosa, submucosa en crypten [58](#page=58). #### 14.1.2 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen Voor het bestuderen van levende cellen zijn speciale lichtmicroscooptechnieken ontwikkeld die werken zonder kleuringen of met specifieke kleuringen die het leven van de cel niet schaden. * **Fasecontrastmicroscopie**: Gebaseerd op faseverschuivingen van licht en interferentie. Deze techniek is ontwikkeld door Zernike en zet kleine faseveranderingen veroorzaakt door brekingsverschillen in het preparaat om in amplitudeveranderingen (licht/donker). Het wordt toegepast op ongekleurde preparaten, zoals gekweekte levende cellen of vriescoupes [59](#page=59). > **Tip:** Fasecontrastmicroscopie is ideaal voor het bestuderen van levende, ongekleurde cellen en weefselcoupes [59](#page=59). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (ook bekend als Nomarski microscopie)**: Maakt gebruik van positieve/negatieve interferentie van gepolariseerd licht. Het vereist gespecialiseerde microscopen met prisma's en interferentiefilters. DIC visualiseert verschillen in interferentie van doorvallend gepolariseerd licht [59](#page=59). * **Digitale microscopie**: Gebruikt computerverwerking van beelden met ultragevoelige videocamera's. Deze methode is dynamisch en maakt zowel real-time als time-lapse opnamen mogelijk [59](#page=59). * **Fluorescentiemicroscopen voor ‘life cell imaging’**: Worden ook gebruikt voor het bestuderen van levende cellen [59](#page=59). > **Voorbeeld:** Afbeeldingen tonen de vergelijking tussen klaarveldmicroscopie, DIC (Nomarski) en fasecontrastmicroscopie van levende cellen [62](#page=62). #### 14.1.3 Optische paden De optische weg in een microscoop beschrijft hoe het licht door het systeem wordt geleid. * **Klaarveldmicroscoop**: Licht gaat direct door het preparaat en de observator ziet een helder veld met donkere structuren [61](#page=61). * **Fasecontrastmicroscoop**: Gebruikt een speciaal diafragma en een ringvormige lens om faseverschillen in het licht dat door het preparaat gaat, om te zetten in zichtbaar contrast [61](#page=61). > **Tip:** Het begrijpen van het optische pad is cruciaal om de principes achter de verschillende contrasttechnieken te doorgronden [61](#page=61). --- # Principes en toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen, om moleculen en structuren binnen cellen en weefsels zichtbaar te maken [72](#page=72). ### 15.1 Algemene principes van fluorescentiemicroscopie #### 15.1.1 Fluorescentie en fluorochromen Fluorescentie is het verschijnsel waarbij een stof geabsorbeerd licht uitzendt op een langere golflengte. De geabsorbeerde straling wordt door het excitatiefilter doorgelaten, terwijl het barrièrefilter deze straling moet tegenhouden. Het emissiespectrum, de uitgezonden straling, heeft altijd een golflengte die groter is of gelijk aan de golflengte van het geabsorbeerde licht. Een typisch voorbeeld is het fluorochroom fluoresceïne (of Alexa 488), waarbij het excitatie- en emissiespectrum een duidelijke scheiding vertonen [73](#page=73) [74](#page=74). #### 15.1.2 Epifluorescentiemicroscopie Epifluorescentiemicroscopie maakt gebruik van geactiveerd licht met een korte golflengte (ultraviolet-blauw, groen) dat door het preparaat gaat, waarna de fluorochrome stof emissielicht uitzendt van een langere golflengte (groen, rood-infrarood). De belangrijkste componenten van een epifluorescentiemicroscoop zijn [72](#page=72): 1. **Excitatiebron:** Meestal een kwikdamplamp of LEDs [74](#page=74). 2. **Golflengtefilters in een filterkubus:** * **Excitatiefilter:** Selecteert de golflengte voor excitatie [74](#page=74). * **Dichroïsche spiegel (beamsplitter):** Reflecteert excitatielicht naar het preparaat en laat emissielicht door naar de detector [74](#page=74). * **Emissiefilter of stopfilter:** Blokkeert het excitatielicht en laat het emissielicht door [74](#page=74). 3. **Detector:** Het menselijk oog of een camera (digitaal/analoog) [74](#page=74). > **Tip:** De scheiding tussen absorptie- en emissiefilters is cruciaal om de fluorescentie van het monster te kunnen waarnemen zonder de storende invloed van het excitatielicht [73](#page=73). #### 15.1.3 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) CLSM is een geavanceerdere vorm van fluorescentiemicroscopie die een laser als exciterende lichtbron gebruikt (meestal een Argon-laser van 488 nm). CLSM maakt het mogelijk om zeer dunne optische coupes van een preparaat te verkrijgen, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en minder achtergrondruis [72](#page=72). ### 15.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie is een veelzijdige techniek met diverse toepassingen in de biologie en geneeskunde [75](#page=75). #### 15.2.1 Kwantificeren van moleculen in cellen De fluorescentie van de gebruikte kleurstoffen kan afhangen van de concentratie van specifieke ionen of moleculen [75](#page=75). * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Deze kleurstoffen veranderen hun fluorescentie als reactie op veranderingen in de concentratie van specifieke ionen, zoals calcium (Ca²⁺). Fura-2 is een voorbeeld van een Ca²⁺-gevoelige kleurstof die intracellulaire Ca²⁺-concentraties kan meten [75](#page=75). > **Voorbeeld:** Fura-2 kleuring in levende cellen toont de distributie van Ca²⁺. Een bewegende cel kan hoge Ca²⁺-concentraties vertonen in groene gebieden, en een richtingverandering kan gepaard gaan met de vorming van een nieuwe gradient [75](#page=75). #### 15.2.2 Immunofluorescentie microscopie Bij immunofluorescentie worden specifieke eiwitten gedetecteerd met behulp van antilichamen waaraan een fluorochroom is gekoppeld. Dit maakt het mogelijk om de locatie en distributie van specifieke eiwitten in cellen en weefsels te bestuderen [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78). #### 15.2.3 Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten Eiwitten kunnen worden gemodificeerd door genen te clonen die coderen voor fluorescente eiwitten, zoals Blue Fluorescent Protein (BFP) of Yellow Fluorescent Protein (YFP). Hierdoor kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden gedetecteerd en gevolgd. Dit wordt ook wel genetische codering met fluorescentie eiwitten genoemd [75](#page=75) [79](#page=79) [80](#page=80). > **Voorbeeld:** Inbouw van genen voor Blue Fluorescent Protein en Yellow Fluorescent Protein in embryonale stamcellen van de muis resulteert in blauw en groen fluorescerende embryo's in verschillende stadia van ontwikkeling [79](#page=79). #### 15.2.4 Visualisatie van organellen Fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om specifieke organellen, zoals lysosomen en mitochondriën, in gecultiveerde cellen te visualiseren [76](#page=76). #### 15.2.5 Visualisatie van cytoskelet en celstructuren De techniek maakt het mogelijk om cytoskeletcomponenten, zoals actinekabels, en adhesiepunten, zoals vinculine, aan te kleuren. Dubbele fluorescentie kan colocalisatie van deze structuren aantonen [79](#page=79). #### 15.2.6 Gecombineerde technieken Fluorescentiemicroscopie kan worden gecombineerd met andere beeldvormingstechnieken om uitgebreide informatie te verkrijgen. > **Voorbeeld:** Een driedubbele overlay kan morfologie (met DIC – Nomarski), kernen (DNA met blauw fluorochroom) en mitochondriën (met rood fluochroom) tegelijkertijd visualiseren [82](#page=82). ### 15.3 Microscopen en registratie #### 15.3.1 Typische epifluorescentiemicroscopen Klassieke epifluorescentiemicroscopen kunnen worden gebruikt met digitale registratie, zowel met als zonder oculaire [81](#page=81). #### 15.3.2 Beeldregistratie en analyse Beelden kunnen worden geregistreerd met verschillende bit-dieptes, zoals 8-bit voor kleurkanalen of 24-bit voor overlay-beelden. Dit maakt gedetailleerde analyse van de fluorescentiepatronen mogelijk [82](#page=82). --- # Methoden en materialen voor celkweek en immunofluorescentiemicroscopie Dit onderwerp behandelt de fundamentele methoden en materialen die gebruikt worden in celkweek en immunofluorescentiemicroscopie, essentieel voor het observeren en bestuderen van cellen en weefsels. ### 16.1 Celkweek: principes en praktische aspecten Celkweektechnieken maken het mogelijk om cellen en weefsels buiten hun natuurlijke omgeving, *in vitro*, te laten groeien voor onderzoek. Dit proces is cruciaal voor het bestuderen van celgedrag, ontwikkeling en ziektes. #### 16.1.1 Historische ontwikkeling en types celculturen De geschiedenis van celkweek begon met *tissue culture* (1907; Harrison), waarbij zenuwweefsel van kikkerembryo's werd gekweekt. Later ontwikkelde zich de *monolaagcultuur* (1948; Earle), die 2D-simulaties van 3D-organen biedt. Oorspronkelijk werd gebruik gemaakt van orgaanexplantaten (*primaire cultures*), maar met de tijd werden stabielere, *geïmmortaliseerde cellijnen* ontwikkeld. Deze cellijnen, afkomstig van tumoren of verkregen na selectie (*crisis*), hebben potentieel een onbeperkte levensduur. Cellijnen zijn echter niet volledig stabiel en kunnen na meerdere passages (*splitsen*) veranderen [8](#page=8). > **Tip:** Het verschil tussen primaire culturen en cellijnen is belangrijk. Primaire culturen zijn direct uit weefsel geïsoleerd en hebben een beperkte levensduur, terwijl cellijnen langer kunnen groeien en voor consistente experimentele resultaten kunnen zorgen. #### 16.1.2 Preparatie van cellijnen Het proces om een cellijn te maken vanuit een weefselstukje omvat meerdere stappen [9](#page=9): * Enzymatische behandeling van het weefsel om cellen te isoleren [9](#page=9). * Concentratie van de cellen door uitzakken of centrifugeren [9](#page=9). * Uitplaatsten van de cellen in een geschikt groeirecipiënt [9](#page=9). * Indien succesvol, kunnen de cellen zich vermenigvuldigen en een confluente laag vormen [9](#page=9). * Bij confluente lagen worden de cellen losgemaakt en gesplitst (*getransfereerd*) naar nieuwe recipiënten [9](#page=9). #### 16.1.3 Typische celculturen Typische celculturen zijn te zien als monolaagculturen van epitheelcellen, waarbij kolonies ontstaan uit individuele cellen [10](#page=10). #### 16.1.4 Groeimedia en cultuurcondities Het medium is essentieel voor celgroei *in vitro* en moet zo veel mogelijk de *in vivo* omstandigheden nabootsen. Een klassiek voorbeeld is MEM (*Minimum Essential Medium*), dat isotonische zouten, een energiebron (glucose), essentiële aminozuren en vitamines bevat. Serum, zoals foetaal kalfsserum, is vaak noodzakelijk, maar kan kwaliteitsvariatie vertonen. Andere veelgebruikte media zijn DMEM, M199, McCoy’s en RPMI 1640 [11](#page=11). De culturen moeten groeien onder een atmosfeer van 5% CO₂ in lucht, wat vergelijkbaar is met het CO₂-gehalte in bloed en weefselvochten (0,03% in de atmosfeer), om een pH van ongeveer 7,4 te handhaven [11](#page=11). > **Tip:** De pH van het groeimedium is cruciaal. Een goede buffering met NaHCO₃/H₂CO₃ is essentieel om de pH stabiel te houden, net als in het bloed. #### 16.1.5 Cultuurrecipiënten Voor celkweek worden verschillende recipiënten gebruikt, afhankelijk van de kweekmethode: * **Gesloten flessen (falcons):** CO₂ wordt toegevoegd voordat de fles wordt gesloten [12](#page=12). * **Open platen:** Gebruikt in CO₂-ovens [12](#page=12). * **Rollerflessen:** Geschikt voor grote celoppervlakken met relatief weinig medium [12](#page=12). * **CO₂-ovens:** Waarin de cultuurplaten worden geplaatst om de juiste atmosfeer en temperatuur te handhaven [12](#page=12). #### 16.1.6 Oorsprong van cellen en cellijnen Cellen voor onderzoek kunnen afkomstig zijn van andere laboratoria, eigen isolatie (*primaire culturen*), of celbanken zoals ATCC (*The American Type Culture Collection*) en ECACC (*The European Collection of Cell Cultures*) [14](#page=14). #### 16.1.7 Groeisubstraten en -procedures Substraten beschermen cellen tegen *anoïkis* (een vorm van geprogrammeerde celdood) en zijn essentieel voor *adherente celcultures*. Veelgebruikte substraten zijn glas en voorbehandeld polystyreen. Daarnaast worden coatings gebruikt, zoals poly-D-lysine, collageen (een ECM-eiwit), of geconditioneerd medium van feeder-cellen [15](#page=15). Cellen interageren met hun micro-omgeving via: * **Aspecifieke fysieke interactie:** Dit maakt adhesie en spreiding van cellen mogelijk (in tegenstelling tot *anchorage-independence*) [16](#page=16). * **Specifieke functionele interactie:** Dit kan leiden tot differentiatie-inductie door signalen van de basaalmembraan (ECM) [16](#page=16). #### 16.1.8 Celdichtheids-afhankelijke inhibitie Cellen in cultuur stoppen met delen wanneer ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen, een fenomeen genaamd *contactinhibitie*. Dit wordt deels veroorzaakt door competitie voor groeifactoren (*mitogenen*). Het toevoegen van vers medium kan de delingen hervatten, maar efficiënter is het splitsen van de cultuur [17](#page=17). #### 16.1.9 3D-celgroei Hoewel monolaagcultures gangbaar zijn, kunnen tumorcellen ook in 3D groeien in dichte foci. Sommige celtypes, zoals epitheelcellen (bv. MDCK-cellen), kunnen 2D- of 3D-structuren vormen afhankelijk van de groeiongeving, wat de *in vivo* omgeving nabootst. In 3D-culturen kunnen cellen apicaal of basolateraal gaan functioneren, gescheiden door celmembranen [18](#page=18) [19](#page=19). #### 16.1.10 Procedure van celtransfer (splitsen) Celtransfer is noodzakelijk om de cellijnen te onderhouden. * **Suspensiecultures:** Eenvoudige verdunning met vers medium [20](#page=20). * **Adherente cellen:** Na confluentie wordt de cultuur behandeld met een trypsine/EDTA (TE) oplossing [20](#page=20). * Trypsine degradeert oppervlakte-eiwitten [20](#page=20). * EDTA cheleert calcium- en magnesiumionen, wat intercellulaire en cel-substraat-bindingen verstoort [20](#page=20). * Dit leidt tot loslaten van de cellen en vorming van een monocellulaire suspensie [20](#page=20). * De suspensie wordt vervolgens verdund (bv. 1:3 tot 1:30) en uitgezaaid in nieuwe recipiënten [20](#page=20). #### 16.1.11 Celadhesie en -spreiding Na het losmaken en uitplaatsten van cellen vinden stappen plaats van adhesie en spreiding [22](#page=22): 1. Cellen zakken uit door gravitatie [22](#page=22). 2. Initieel contact met het substraat [22](#page=22). 3. Progressieve spreiding over het substraat, wat energie en cytoskeletwijzigingen vereist [22](#page=22). 4. Vorming van sterke binding met het substraat door modificatie met eigen ECM-moleculen [22](#page=22). Ondanks sterke adhesie kunnen cellen migreren door tijdelijke inhibitie van adhesie op één plaats en opbouw elders [22](#page=22). #### 16.1.12 Speciale apparatuur voor celcultuur Essentiële apparatuur omvat: * **Laminaire flowbench:** Biedt een steriele werkomgeving met een HEPA-filter [23](#page=23). * **CO₂-oven:** Met HEPA-filter voor het handhaven van de juiste gas- en temperatuurcondities [23](#page=23). * **Opslag in vloeibare stikstof (-196°C):** Voor langdurige bewaring van cellen met behulp van cryoprotectiva zoals glycerol of DMSO [23](#page=23). De CTC core in The Core (UZ campus) beschikt over 17 flowbenches [24](#page=24). #### 16.1.13 Differentiatie *in vitro* Differentiatie is het proces waarbij een cel zich ontwikkelt tot een meer gespecialiseerd celtype. Dit kan spontaan gebeuren (bv. myoblast naar myotube) of geïnduceerd worden [26](#page=26). #### 16.1.14 Stamcellen Stamcellen zijn cellen die het vermogen hebben tot zelfvernieuwing en tot differentiatie in verschillende cel- en weefseltypes [27](#page=27). * **Totipotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot een volledige foetus en placenta. De bevruchte eicel is aanvankelijk totipotent [28](#page=28). * **Pluripotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen van de drie kiemlagen, maar niet tot de placenta. De binnenste celmassa van de blastocyst is pluripotent [29](#page=29). * **Multipotente stamcellen:** Zijn beperkt tot een specifiekere reeks celtypen binnen een bepaalde weefsellijn (bv. hemopoëtische stamcellen voor bloedcellen) [30](#page=30). De aanmaak van muizen embryonale stamcellen (mES) en humane embryonale stamcellen (hES) vereist specifieke kweekcondities, zoals feederlagen en groeifactoren zoals LIF. Het gebruik van humane embryonale stamcellen roept ethische discussies op vanwege de status van het embryo [31](#page=31) [32](#page=32) [33](#page=33). #### 16.1.15 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) iPSCs zijn ethisch minder beladen omdat ze worden gegenereerd door het reprogrammeren van somatische cellen tot een pluripotente staat [34](#page=34). #### 16.1.16 Organoïden Organoïden zijn *in vitro* gekweekte, 3D-structuren die organen nabootsen en afkomstig zijn van stamcellen [36](#page=36). #### 16.1.17 Kwaliteitscontrole in celkweek Kwaliteitscontrole is essentieel om contaminatie en genetische instabiliteit te voorkomen. * **Contaminatie met micro-organismen:** Bacteriën, gisten, schimmels en met name *mycoplasma’s* kunnen celcultures aantasten. Mycoplasma's zijn moeilijk te detecteren en te elimineren [37](#page=37). * **Contaminatie met vreemde cellen:** Verkeerde identificatie van cellijnen (bv. HeLa-varianten, muizen- of rattenonderstammen) is een bekend probleem, te detecteren via genetische fingerprinting en karyotypering [37](#page=37). * **Effecten van mycoplasma contaminatie:** Kan leiden tot veranderingen in eiwit-, RNA- en DNA-synthese, metabolisme, chromosomale aberraties, veranderingen in celmembraan, morfologie, en kan assays beïnvloeden. Specifieke effecten zijn waargenomen bij hybridoma's, zoals inhibitie van cel Fusie en interferentie met antistofscreening [38](#page=38). * **Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit:** Kan worden gemeten door karyotypering (aantal en vorm van chromosomen) [39](#page=39). * **Inherente genetische instabiliteit:** Het genotype van gecultiveerde cellen is vaak evoluerend. Dit kan worden beperkt door regelmatig terug te keren naar *stock-cultures* die zijn ingevroren in vloeibare stikstof [40](#page=40). ### 16.2 Preparatie en observatie van cellen en weefsels Om cellen en weefsels onder de lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM) te kunnen bestuderen, zijn specifieke preparatietechnieken noodzakelijk. Biologisch materiaal is vaak te dik en bevat te weinig contrast om direct geobserveerd te kunnen worden [42](#page=42) [7](#page=7). #### 16.2.1 Vereiste stappen in histologische technieken De algemene procedure omvat: 1. **Fixeren:** Behoud van de oorspronkelijke structuur door denaturatie van eiwitten [45](#page=45). 2. **Inbedden en snijden:** Het weefsel wordt ingebed in een hard materiaal en in dunne coupes gesneden [43](#page=43) [46](#page=46). 3. **Kleuren of contrasteren:** Verbetering van het zichtbare contrast in de coupes [7](#page=7). #### 16.2.2 Fixatie Fixatie stopt afbraakprocessen door enzymen te denatureren [45](#page=45). * **Chemische fixatie:** Gebruikt fixatieven zoals formol (voor LM) of glutaraldehyde (voor EM). Deze cross-linken eiwitten en behouden structurele componenten [45](#page=45). * **Invriezen (koude fixatie):** Maakt snelle preparatie mogelijk en behoudt epitopen beter voor immuunkleuringen [45](#page=45). Artefacten kunnen ontstaan door veranderingen tijdens de fixatie die afwijken van de *in vivo* situatie [45](#page=45). #### 16.2.3 Inbedden Het gefixeerde materiaal wordt omwikkeld en doordrongen met een inbedmiddel dat hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken [46](#page=46). * **Paraffine:** Een klassiek, hydrofoob inbedmiddel dat het weefsel doordringt na dehydratatie en "clearing" met tolueen [47](#page=47). * **Hars/plastics:** Hardere inbedmiddelen die dunnere coupes mogelijk maken voor EM [48](#page=48). Het weefsel moet eerst worden gedehydrateerd met een reeks alcoholbaden en vervolgens "geklaard" met een mengbare substantie zoals tolueen [47](#page=47). #### 16.2.4 Snijden Met behulp van een microtoom worden dunne coupes gemaakt: * **LM:** Paraffine coupes van 5-10 µm dik, snijdbaar met een stalen mes. Coupes worden op glazen draagglas geplaatst [48](#page=48). * **EM:** Hars/plastic coupes van 70 nm dik, snijdbaar met glazen of diamanten messen. Coupes worden op metalen roosters (grids) geplaatst [48](#page=48). #### 16.2.5 Microscopie technieken Verschillende microscopietechnieken worden gebruikt voor de observatie van cellen en weefsels. ##### 16.2.5.1 Lichtmicroscopie (LM) De resolutie van LM wordt bepaald door het objectief en de golflengte van licht, typisch rond 200 nm [52](#page=52). * **Klaarveldmicroscoop (bright field):** Het klassieke type dat doorvallend wit licht gebruikt. Bestaat uit een condensor, objectief en oculairen. Preparaten kunnen gefixeerd en gekleurd zijn, of levend maar met potentieel te weinig contrast [52](#page=52) [53](#page=53). * **Kleuringen:** Hematoxyline/Eosine (HE) is een veelgebruikte kleuring die verschillende celcomponenten aankleurt op basis van lichtabsorptie. PAS kleurt vrije suikers aan [44](#page=44) [57](#page=57). * **Effectieve resolutie:** Wordt beïnvloed door het preparaat; gefixeerd/gekleurd voor absorptiedetectie, of levend met speciale technieken [52](#page=52). * **Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen:** * **Fasecontrastmicroscopie:** Benut kleine faseverschuivingen veroorzaakt door brekingsindexverschillen om een zwart-wit beeld te creëren. Ideaal voor ongekleurde preparaten zoals levende celculturen [59](#page=59) [60](#page=60) [61](#page=61) [62](#page=62). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski):** Maakt gebruik van interferentie van gepolariseerd licht om contrast te genereren [59](#page=59) [60](#page=60) [62](#page=62). * **Digitale microscopie:** Gebruikt ultragevoelige videocamera's en computerverwerking voor dynamische beelden, inclusief *real-time* en *time-lapse* opnamen [59](#page=59). * **Fluorescentiemicroscopie:** Wordt gebruikt voor *life cell imaging* [59](#page=59). > **Tip:** Bij het observeren van levende, ongekleurde cellen zijn fasecontrast- of DIC-microscopen vaak essentieel om structuren zichtbaar te maken, omdat deze technieken het inherente contrast van de cel benutten. #### 16.2.6 Immunofluorescentiemicroscopie (Conceptueel) Hoewel de details van immunofluorescentiemicroscopie pas later in het document worden uitgewerkt, wordt al verwezen naar het gebruik ervan in celcultuur experimenten. Immunofluorescentie maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan doelmoleculen in cellen, waarna deze antilichamen gekoppeld zijn aan fluorescerende moleculen. Deze moleculen zenden licht uit wanneer ze worden geëxciteerd door een specifieke golflengte, waardoor de lokalisatie van het doelmolecuul in de cel zichtbaar wordt. Dit is een krachtige techniek om de locatie en distributie van eiwitten en andere moleculen in cellen en weefsels te bestuderen [13](#page=13). --- ## 16 Methoden en materialen voor celkweek en immunofluorescentiemicroscopie Dit onderwerp behandelt de verschillende methoden en materialen die gebruikt worden voor het prepareren van biologische monsters voor microscopische analyse, met een specifieke focus op histologische kleuringen en immunofluorescentiemicroscopie. ### 16.1 Histologische kleuringen Histologische kleuringen worden gebruikt om weefselstructuren zichtbaar te maken die anders transparant zouden zijn, waardoor een gedetailleerd beeld van het weefsel verkregen kan worden. Deze kleuringen maken gebruik van verschillen in de chemie van het weefsel om componenten verschillend te kleuren, waarbij ionische binding het belangrijkste bindingsmechanisme is [64](#page=64). #### 16.1.1 Hematoxyline en Eosine (H/E) kleuring Hematoxyline en Eosine (H&E) is de meest gebruikte routinekleuring voor histologisch onderzoek [64](#page=64). * **Hematoxyline:** In combinatie met aluminiumzouten werkt hematoxyline als een kationische, basische kleurstof. Het reageert met negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern, die hierdoor blauw tot donkerpaars kleuren. Hematoxyline zelf kleurt weefsels niet direct en vereist een beitsmiddel, meestal een metaalkation zoals aluminium. De kleuring van nucleïnezuren is complex en nog niet volledig begrepen [64](#page=64) [65](#page=65). * **Eosine:** Eosine is een anionische, zure kleurstof. Het reageert met positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma, die hierdoor roze kleuren. Eosine kleurt niet-specifiek eiwitten aan [64](#page=64) [65](#page=65). Met H&E kleuring kleuren de kernen blauw, terwijl het cytoplasma en de extracellulaire matrix in variërende mate roze gekleurd zijn. Goed gefixeerde cellen vertonen gedetailleerde intranucleaire structuren. Verschillende patronen van heterochromatinecondensatie in de kernen (hematoxyline-kleuring) zijn diagnostisch belangrijk voor weefseltypes en kankertypes. Nucleoli worden gekleurd met eosine. Overvloedige polyribosomen geven het cytoplasma een blauwe gloed, en de Golgi-zone kan geïdentificeerd worden door de afwezigheid van kleuring naast de kern [65](#page=65). > **Tip:** H&E kleuring is niet compatibel met immunofluorescentie. Echter, het gebruik van hematoxyline zonder eosine kan nuttig zijn als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures met colorimetrische substraten [65](#page=65). #### 16.1.2 Specifieke kleurtechnieken Naast H&E worden diverse specifieke kleurtechnieken toegepast: * **Indifferente kleurstoffen:** Deze kleuren voornamelijk vetten aan, zoals Oil Red O voor vetcellen [68](#page=68). * **Immunohistochemische kleuring:** Deze techniek maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan bepaalde bestanddelen in het weefsel. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, een fluorescente label of colloïdaal goud. Dit maakt de detectie van specifieke eiwitten mogelijk, zoals Connexine 43 in muishart coupes [67](#page=67) [69](#page=69). * **Enzymkleuringen:** Deze tonen de activiteit van specifieke enzymen aan door gebruik te maken van een enzymspecifiek substraat. De reactie resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de kleuring van glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten met behulp van de tetrazoniumzoutmethode [67](#page=67) [70](#page=70). ### 16.2 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen genaamd, om specifieke moleculen of structuren in cellen en weefsels te visualiseren [72](#page=72). #### 16.2.1 Werkingsprincipe Fluorescerende stoffen absorberen licht van een bepaalde golflengte (excitatie) en zenden dit vervolgens uit op een langere golflengte (emissie). Het geabsorbeerde licht wordt omgezet in fluorescentiestraling, die altijd een golflengte heeft die groter is dan of gelijk is aan die van het geabsorbeerde licht. De absorptiestraling wordt doorgelaten door een excitatiefilter, terwijl een barrièrefilter deze straalt moet tegenhouden [73](#page=73). #### 16.2.2 Typen fluorescentiemicroscopen * **Epifluorescentiemicroscopie:** Hierbij wordt het preparaat geëxciteerd met licht van korte golflengte (UV-blauw, groen), waarna de fluorochrome stof emissielicht uitzendt van langere golflengte (groen, rood-infrarood). Conventionele epifluorescentiemicroscopen gebruiken typisch een kwikdamplamp of LED's als lichtbron [72](#page=72). * **Onderdelen van een epifluorescentiemicroscoop:** 1. Excitatiebron (Hg of Xe lamp) [74](#page=74). 2. Golflengtefilters in een filterkubus: excitatiefilter, dichroïsche spiegel (beamsplitter) en emissiefilter of stopfilter [74](#page=74). 3. Detector (ogen, camera) [74](#page=74). * **Confocale laser scanning microscopie (CLSM):** Deze techniek maakt gebruik van een laser als excitatiebron (bijvoorbeeld een Argon-laser van 488 nm). CLSM scant het monster punt voor punt en gebruikt een pinhole om strooilicht van buiten het focale vlak te elimineren, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en contrast. Dit maakt het mogelijk om beelden in 3D (XYZ) te reconstrueren en is beter geschikt voor time-lapse analyses van dynamische processen [72](#page=72) [84](#page=84) [87](#page=87). #### 16.2.3 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie kan moleculen in levende en gefixeerde cellen aankleuren en kwantificeren [74](#page=74). * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** De fluorescentie van deze kleurstoffen hangt af van de ionenconcentratie. Fura-2 is een voorbeeld van een Ca²⁺-gevoelige kleurstof die gebruikt kan worden om intracellulaire Ca²⁺-concentratieveranderingen te meten [74](#page=74). * **Immunofluorescentiemicroscopie:** Detecteert specifieke eiwitten met behulp van antilichamen waaraan een fluorofoor is gekoppeld. Dit wordt gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in gefixeerde cellen en weefsels te bestuderen, zoals de CFTR eiwitlokalisatie bij cystische fibrose [74](#page=74) [92](#page=92). * **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Hiermee kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden gedetecteerd en gevolgd [74](#page=74). * **Visualisatie van organellen:** Lysosomen en mitochondria kunnen gevisualiseerd worden in gecultiveerde cellen [75](#page=75). * **Meerdere eiwitten tegelijk:** De kleuring van twee verschillende eiwitten in een cel is mogelijk. Bijvoorbeeld, het visualiseren van het cytoskelet (actine in groen) en ‘voetjes’ (vinculine in rood) toont colocalisatie aan [77](#page=77) [78](#page=78). #### 16.2.4 Geavanceerde fluorescentietechnieken * **Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie:** Softwarematige bewerking van conventionele digitale beelden met deconvolutie-algoritmes kan ook resulteren in beelden met een zeer hoge resolutie [86](#page=86). * **4D Live Cell Imaging:** Dit combineert snelle 3D-multi-kleurenimaging met time-lapse opnames om dynamische processen over tijd te bestuderen. Het vereist een speciale opstelling met een incubatiekamer, een gemotoriseerde microscoop en een digitale camera [88](#page=88) [89](#page=89). * **Virtuele microscopie:** Een digitale simulatie van klassieke microscopie via de computer, waarbij cel- en weefselpreparaten volledig worden ingescand om een gedigitaliseerd beeld te verkrijgen waarin genavigeerd en gezoomd kan worden [95](#page=95). ### 16.3 Andere microscopische technieken #### 16.3.1 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopie maakt gebruik van elektronenbundels in plaats van licht om beelden te genereren, wat resulteert in een veel hogere resolutie. De golflengte van elektronen is aanzienlijk kleiner dan die van licht, waardoor structuren tot op atomair niveau zichtbaar gemaakt kunnen worden . * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** Bij TEM wordt een elektronenbundel door een ultradun preparaat gestuurd, en het beeld wordt gevormd door de door het monster verstrooide elektronen. De resolutie kan 1 nm bedragen. TEM is geschikt voor het bestuderen van de interne structuren van objecten zoals weefsels, cellen en virussen [98](#page=98) [99](#page=99). * **Fixatie en Kleuring voor TEM:** Biologisch materiaal vertoont van zichzelf weinig contrast in een TEM. Om dit te verhogen, wordt gebruik gemaakt van verbindingen van zware metalen (zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat, loodcitraat) die elektronen weerkaatsen. Ultradunne secties (50-100 nm) zijn vereist omdat dikkere coupes alle elektronen zouden tegenhouden . * **Speciale EM technieken voor TEM:** * **Negatieve kleuring:** Het monster wordt geïncubeerd met een zwaar metaal, waardoor het monster zelf niet kleurt en wit verschijnt tegen een zwarte achtergrond van het metaal . * **Shadowing (rotary shadowing):** Het preparaat wordt onder een schuine hoek bestoven met een metaal (bijv. platina, goud). Dit wordt gebruikt om bijvoorbeeld virussen of nucleïnezuren te visualiseren . * **Scanning-elektronenmicroscopie (SEM):** Bij SEM wordt een elektronenbundel over het oppervlak van het preparaat gescand. Het beeld wordt gevormd door de gereflecteerde elektronen en secundaire elektronen. SEM is geschikt voor het in beeld brengen van het oppervlak van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen. Het preparaat moet geleidend gemaakt worden, vaak door coating met een dun laagje goud of goud/palladium [98](#page=98) [99](#page=99). * **Technische complicaties en interpretatie:** Elektronenmicroscopie vereist hoog vacuüm, hoge spanning en specifieke elektromagnetische lenzen. De interpretatie van TEM-beelden kan complex zijn, aangezien verschillende doorsneden van een kronkelige structuur sterk uiteenlopende beelden kunnen geven . #### 16.3.2 Speciale EM-technieken * **Vries-breek (freeze-fracture) en Vries-ets (freeze-etching):** Deze technieken worden gebruikt om membraanstructuren in detail te bestuderen. Celmembranen worden gebroken tussen de binnen- en buitenhelft, en vries-etsen kan meer 3D-structuur onthullen door sublimatie van ijs. Het levert informatie op over de verdeling van eiwitten in de membraanhelften . * **Cryo-elektronen-tomografie:** Maakt 3D-reconstructies van objecten mogelijk op basis van een serie 2D-projecties die gemaakt worden terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld. Dit wordt gebruikt om complexe structuren zoals nucleaire poriecomplexen in detail te bestuderen . * **SBF-SEM & FIB-SEM:** Serial Block Face Scanning Electron Microscopy en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy maken gebruik van ultramicrotomie of ionenlasers om materiaal weg te nemen in de microscoop, waardoor 3D-reconstructies van dikkere monsters mogelijk worden . ### 16.4 Celkweek en monsterpreparatie Celkweek is de basis voor veel van de hierboven beschreven microscopische technieken, met name voor het bestuderen van levende cellen en hun dynamische processen. De preparatie van specimens, of het nu gaat om gefixeerde weefsels of cellen, is cruciaal voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige beelden. Het selecteren van de juiste fixatie-, inbeddings- en kleuringstechnieken is essentieel, afhankelijk van de microscopische methode die zal worden toegepast. Bijvoorbeeld, de H&E kleuring is onverenigbaar met immunofluorescentie terwijl specifieke kleuringen noodzakelijk zijn voor zowel licht- als elektronenmicroscopie [64](#page=64) [65](#page=65) [74](#page=74) [88](#page=88). --- Dit onderwerp behandelt specifieke detectiemethoden voor eiwitten met behulp van elektronenmicroscopie en technieken voor het analyseren van grotere volumes in celbiologisch onderzoek. ### 16.1 Detectie van specifieke eiwitten met behulp van TEM De detectie van specifieke eiwitten binnen cellen kan worden uitgevoerd met behulp van immunofluorescentiemicroscopie, waarbij antilichamen worden ingezet om doelwiteiwitten te identificeren. Een voorbeeld hiervan is het gebruik van een antilichaam dat specifiek bindt aan een capsid-eiwit van bijvoorbeeld een HIV-partikel dat uit een cel uitgroeit (budding). Dit antilichaam kan vervolgens worden gekoppeld aan een marker die zichtbaar is onder de microscoop, wat de lokalisatie van het specifieke eiwit binnen de cel of extracellulair mogelijk maakt . ### 16.2 Analyse van grotere volumes met SBF-SEM en FIB-SEM Voor de analyse van grotere cellulaire volumes zijn Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) geavanceerde technieken . #### 16.2.1 Principies van SBF-SEM en FIB-SEM Beide technieken maken gebruik van de in-situ verwijdering van dunne lagen van een preparaat binnen de vacuümkamer van een Scanning Electron Microscope (SEM) . * **Serial Block-Face SEM (SBF-SEM):** Bij SBF-SEM wordt het materiaal verwijderd met behulp van een diamantmes. Na het verwijderen van een dunne laag wordt het oppervlak gescand, waarna het proces van laagverwijdering en scannen wordt herhaald. Dit resulteert in een reeks opeenvolgende beelden die samen een driedimensionale reconstructie van het monster vormen . * **Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM):** In tegenstelling tot SBF-SEM gebruikt FIB-SEM een focused ion beam (FIB) om materiaal weg te etsen. Net als bij SBF-SEM maakt dit iteratieve proces het mogelijk om grote driedimensionale volumes op hoge resolutie te reconstrueren. FIB-SEM kan met name nuttig zijn voor het prepareren van zeer specifieke gebieden binnen een monster voor analyse met hoge resolutie . Deze technieken zijn essentieel voor het bestuderen van de driedimensionale architectuur van cellen en weefsels op een niveau dat met conventionele microscopie niet haalbaar is . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Term | Definitie | | Celcultivering | Het proces waarbij cellen buiten hun natuurlijke omgeving, in een laboratorium, worden gekweekt. Dit omvat het isoleren van cellen uit weefsel, ze te plaatsen in een geschikte voedingsbodem en ze te laten groeien onder gecontroleerde omstandigheden. | | Enzymatische behandeling | Een stap in celcultivering waarbij enzymen worden gebruikt om weefsel af te breken en individuele cellen los te maken. Dit maakt het mogelijk om cellen te isoleren voor verdere kweek. | | Groeirecipiënt | Een container, zoals een petrischaal of kweekfles, waarin cellen worden geplaatst om te groeien in een celcultuur. Deze recipiënten bieden een steriele omgeving en de nodige ruimte voor celproliferatie. | | Monolaagcultuur | Een type celcultuur waarbij cellen zich verspreiden en een enkele laag vormen op het oppervlak van het groeirecipiënt. Dit is een veelvoorkomende methode voor het bestuderen van epitheelcellen en andere celtypen. | | Confluente laag | Een situatie in celcultivering waarbij de cellen zich zo hebben vermenigvuldigd dat ze het gehele beschikbare oppervlak van het groeirecipiënt bedekken en elkaar raken. Dit is vaak een signaal om de cellen te splitsen. | | Minimum Essential Medium (MEM) | Een veelgebruikt celcultuurmedium dat essentiële componenten bevat zoals isotonische zouten, een energiebron (glucose), aminozuren, vitamines en serum. Het zorgt voor de benodigde voedingsstoffen voor celgroei. | | Serum | Een bestanddeel van celcultuurmedia dat een complexe mix van groeifactoren, hormonen en andere moleculen bevat die essentieel zijn voor celgroei en -overleving. Het is een natuurlijk product met mogelijke kwaliteitsvariaties. | | CO2-incubator | Een apparaat dat wordt gebruikt om celculturen te laten groeien onder gecontroleerde omstandigheden. Het handhaaft een specifieke temperatuur, luchtvochtigheid en een atmosfeer met een verhoogd CO2-gehalte (typisch 5%) om de pH van het medium te stabiliseren. | | pH | Een maat voor de zuurgraad of alkaliteit van een oplossing. In celcultivering is het handhaven van een optimale pH (rond 7,4) cruciaal voor celgezondheid en -groei, vergelijkbaar met de pH in lichaamseigen vloeistoffen. | | Cultuurcondities | De omgevingsfactoren waaronder cellen in vitro worden gekweekt, zoals temperatuur, luchtvochtigheid, gasmengsel (bijv. 5% CO2 in lucht) en de samenstelling van het kweekmedium. Deze condities moeten zo nauwkeurig mogelijk de in vivo omgeving nabootsen. | | Cultuurrecipiënten | Diverse soorten containers die worden gebruikt voor celcultivering, waaronder gesloten flessen (zoals falcons), open platen en rollerflessen. De keuze van het recipiënt hangt af van het celtype en de specifieke kweekvereisten. | | Laminaire flowbench | Een werkstation dat een gecontroleerde, steriele omgeving creëert door middel van een continue luchtstroom, essentieel voor celkweekwerkzaamheden om contaminatie te voorkomen. | | HEPA filter | Een High Efficiency Particulate Air filter dat wordt gebruikt om de lucht in celkweekfaciliteiten te zuiveren van deeltjes, waaronder bacteriën en schimmels, om een steriele omgeving te handhaven. | | CO2 oven | Een incubatietoestel dat een gecontroleerde omgeving met een specifieke temperatuur en een verhoogde concentratie koolstofdioxide ($CO_2$) biedt, wat cruciaal is voor de groei van veel celtypen in cultuur. | | Celadhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat, zoals een kweekbodem of een ander celoppervlak, wat een fundamentele stap is voor celgroei, -spreiding en -migratie. | | Celspreiding | Het proces waarbij cellen zich progressief over een substraat verspreiden na initiële hechting, wat gepaard gaat met veranderingen in het cytoskelet en een vergroting van het celcontactoppervlak. | | Extracellulaire matrix (ECM) | Moleculen die door cellen worden aangemaakt en uitgescheiden om een ondersteunende structuur rondom de cellen te vormen, wat bijdraagt aan de cel-substraatsadhesie en weefselstructuur. | | Celmigratie | Het vermogen van een cel om zich te verplaatsen over een oppervlak, wat wordt gefaciliteerd door tijdelijke inhibitie van celadhesie op één locatie en opbouw van adhesie op een andere locatie in de bewegingsrichting. | | Vloeibare stikstof | Een cryogeen medium met een temperatuur van -196°C, gebruikt voor de langdurige opslag van ingevroren cellen om hun levensvatbaarheid te behouden voor toekomstig gebruik. | | Stamcel | Een cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen of weefsels. | | Zelfvernieuwing | Het vermogen van stamcellen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te maken, waardoor de stamcelpopulatie behouden blijft. | | Differentiëren | Het proces waarbij een minder gespecialiseerde cel verandert in een meer gespecialiseerd celtype, zoals een spiercel, zenuwcel of bloedcel. | | Totipotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot een volledige foetus, inclusief de placenta. De bevruchte eicel in de eerste uren na de bevruchting is een voorbeeld. | | Pluripotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen. De cellen van de binnenste celmassa van een blastocyst zijn pluripotent. | | Multipotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen binnen een bepaalde weefsellijn, maar beperkt is tot die specifieke lijn. Hemopoëtische stamcellen zijn een voorbeeld. | | Blastocyst | Een holle bal van cellen die zich vormt uit de bevruchte eicel ongeveer 4 dagen na de bevruchting, bestaande uit een buitenste laag cellen die de placenta vormt en een binnenste celmassa die de foetus ontwikkelt. | | Binnenste celmassa (ICM) | De groep cellen binnenin de blastocyst die het potentieel hebben om zich te ontwikkelen tot alle celtypen van de foetus. | | Contaminatie met micro-organismen | De aanwezigheid van vreemde micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en met name mycoplasma's in een celcultuur. Deze organismen kunnen zich snel vermenigvuldigen in voedingsrijke milieus en het cellulaire metabolisme verstoren, wat leidt tot problemen zoals verzuring van het medium. | | Mycoplasma's (PPLO) | Een specifieke groep micro-organismen die celculturen kunnen contamineren. Ze zijn parasitair, deels intracellulair, en kunnen het cellulaire metabolisme verstoren. Detectie kan plaatsvinden via methoden zoals cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA en PCR, en eliminatie is vaak moeilijk. | | Vreemde celcontaminatie | Het voorkomen van cellen van een andere soort of oorsprong dan de beoogde celcultuur. Dit kan variëren van cellijnen die per ongeluk zijn overgenomen van andere bronnen (bijvoorbeeld muiscellen in plaats van menselijke cellen) tot varianten van klassieke cellijnen zoals HeLa. | | Genetische fingerprinting | Een techniek die wordt gebruikt om de genetische identiteit van cellen te bepalen en zo contaminaties met vreemde cellijnen te detecteren. Het analyseert specifieke DNA-markers om de oorsprong van de cel te verifiëren. | | Karyotypering | Een diagnostische techniek waarbij het aantal en de morfologie van chromosomen in individuele cellen worden geanalyseerd. Dit helpt bij het beoordelen van de genetische stabiliteit en zuiverheid van een celcultuur, en kan afwijkingen zoals aneuploïdie of structurele chromosoomafwijkingen aan het licht brengen. | | Zuiverheid van celculturen | De mate waarin een celcultuur vrij is van ongewenste contaminanten, zoals micro-organismen of cellen van een andere oorsprong. Hoge zuiverheid is essentieel voor betrouwbare onderzoeksresultaten. | | Homogeniteit van celculturen | De mate waarin de cellen binnen een cultuur vergelijkbare kenmerken vertonen, met name op genetisch en fenotypisch niveau. Een homogene celcultuur bestaat uit cellen die grotendeels identiek zijn. | | Stabiliteit van celculturen | De mate waarin de genetische en fenotypische kenmerken van een celcultuur constant blijven over opeenvolgende passages. Cellijnen kunnen genetisch instabiel zijn en hun eigenschappen in de loop van de tijd veranderen. | | Inherente genetische instabiliteit | Het natuurlijke proces waarbij de genetische samenstelling (genotype), inclusief chromosoomvorm en -aantal, van cellen in cultuur in de loop van de tijd verandert. Dit kan leiden tot afwijkende celkenmerken en is een uitdaging bij langdurige celkweek. | | Stock-cultures | Gevriesde reserves van een celpopulatie die worden bewaard onder cryogene omstandigheden (bijvoorbeeld in vloeibare stikstof). Deze worden gebruikt om de genetische stabiliteit en identiteit van de celpopulatie te behouden door regelmatig terug te keren naar een verse, onveranderde bron. | | Cryoprotectief middel | Een stof, zoals glycerol of DMSO, die wordt toegevoegd aan cellen vóór het invriezen om de vorming van ijskristallen te minimaliseren en celschade tijdens het vries- en dooi-proces te voorkomen. | | Indifferente kleurstoffen | Kleurstoffen die vetten aankleuren, zonder specifieke affiniteit voor bepaalde celcomponenten. | | Immunohistochemische kleuring | Een techniek die specifieke celcomponenten aankleurt op basis van de binding tussen een antigeen en een antilichaam. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud om zichtbaarheid te creëren. | | Enzymkleuringen | Kleurtechnieken die de activiteit van enzymen aantonen door gebruik te maken van een voor het enzym specifiek substraat. De reactie tussen het substraat en het enzym resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag. | | Oil Red O | Een specifieke kleurstof die gebruikt wordt om vetcellen aan te kleuren, waardoor deze zichtbaar worden onder de microscoop. | | Immunocytochemische kleuring (DAB) | Een specifieke vorm van immunohistochemische kleuring die gebruikmaakt van diaminobenzidine (DAB) als substraat, wat resulteert in een bruine neerslag op de plaats van het antigeen. Deze techniek kan gebruikt worden om specifieke eiwitten zoals microtubuli of connexine 43 aan te tonen. | | Cytochemische kleuring | Een kleuringstechniek die de aanwezigheid of activiteit van specifieke chemische componenten binnen cellen of weefsels aantoont, zoals enzymen. | | Glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) activiteit | De activiteit van het enzym glucose-6-fosfaatdehydrogenase, dat een cruciale rol speelt in de pentosefosfaatroute. Cytochemische kleuringen kunnen deze activiteit in erytrocyten aantonen. | | Tetrazoniumzoutmethode | Een methode die gebruikt wordt in enzymkleuringen, specifiek voor het aantonen van de activiteit van bepaalde enzymen zoals glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD). | | Mucoviscidose | Een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door de productie van taai, visceus slijm in verschillende klieren, zoals de pancreas, bronchi en zweetklieren, als gevolg van mutaties in het CFTR-gen. | | CFTR-eiwit | Het Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator eiwit, dat betrokken is bij het transport van chloride-ionen door het celmembraan. Mutaties in het bijbehorende gen verstoren de productie of functie van dit eiwit. | | Immunohistochemie | Een techniek die wordt gebruikt om de lokalisatie van specifieke eiwitten in weefselcoupes te detecteren met behulp van antilichamen. Dit maakt onderscheid mogelijk tussen wild type en gemuteerde eiwitten. | | Wild type | De normale, niet-gemuteerde vorm van een gen of eiwit. Bij CFTR wordt het wild type eiwit naar het apicale membraan getransporteerd via het Golgi-netwerk. | | Mutatie (CFTR) | Een verandering in het CFTR-gen, waarvan de meest voorkomende een deletie van een aminozuur op positie 508 is. Dit leidt tot retentie van het eiwit in het ER en afbraak, resulterend in subcellulaire mislocatie. | | Subcellulaire mislocatie | De verkeerde plaatsing van een eiwit binnen de cel. Bij mucoviscidose kan het CFTR-eiwit mislokaliseren, waardoor het zijn functie niet kan uitoefenen. | | 4D Live Cell Imaging | Een geavanceerde microscopietechniek die een combinatie vormt van snelle 3D-multikleur-imaging en time-lapse opnames om dynamische processen in levende cellen over tijd en in drie ruimtelijke dimensies te bestuderen. | | Time lapse recording | Een methode waarbij beelden van een proces gedurende een bepaalde periode worden geregistreerd op vaste tijdspunten. Deze beelden worden vervolgens geassembleerd tot een versnelde film om snelle veranderingen zichtbaar te maken. | | 3D multi kleur imaging | Het simultaan registreren van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies, wat gedetailleerde driedimensionale beelden van celstructuren en moleculaire interacties oplevert. | | Lichtmicroscoop (LM) | Een microscoop die zichtbaar licht gebruikt om beelden van objecten te vergroten, bestaande uit optische en fijnmechanische onderdelen. | | Klaarveldmicroscopie (bright field microscopy) | Een type lichtmicroscopie waarbij preparaten worden bekeken met doorvallend wit licht, waarbij de detectie van structuren plaatsvindt op basis van lichtabsorptie. | | Resolutie | De kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden van elkaar kunnen worden waargenomen; bij een lichtmicroscoop wordt deze beperkt door de golflengte van het licht en het objectief. | | Objectief | Het lenssysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het preparaat bevindt en een eerste, vergroot beeld vormt; het bepaalt mede de resolutie van de microscoop. | | Oculair (eyepiece) | Het lenssysteem van een microscoop dat het door het objectief gevormde beeld navergroot en projecteert op het netvlies van de waarnemer. | | Condensor | Een lenssysteem in een lichtmicroscoop dat het licht van de lichtbron bundelt en richt op het preparaat, wat essentieel is voor de belichting en beeldkwaliteit. | | Preparaten | Materiaal dat wordt voorbereid en onder de microscoop wordt bekeken; dit kan variëren van celculturen op dekglaasjes tot versneden weefsels. | | Fixatie | Een proces waarbij biologisch materiaal wordt behandeld om de celstructuren te conserveren en te voorkomen dat ze afbreken, vaak een voorbereidende stap voor microscopisch onderzoek. | | Inbedding (embedding) | Het proces waarbij weefselmonsters worden omgeven door een medium, zoals paraffine, om ze stevig genoeg te maken voor het snijden van dunne secties voor microscopisch onderzoek. | | Cryosecties | Dun gesneden plakjes van bevroren biologisch materiaal, gebruikt voor microscopisch onderzoek wanneer fixatie met chemicaliën de structuur zou kunnen aantasten. | | Lichtabsorptie | Het proces waarbij een stof lichtenergie opneemt, wat bij klaarveldmicroscopie wordt gebruikt om structuren zichtbaar te maken. | | Contrast | Het verschil in helderheid of kleur tussen verschillende delen van een beeld, wat essentieel is voor de zichtbaarheid van structuren onder de microscoop. | | Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie | Een techniek die softwarematige bewerking van conventionele digitale beelden gebruikt om zeer aanvaardbare hoge resoluties te verkrijgen, vergelijkbaar met die van confocale microscopie. | | Confocaal laser scanning microscoop (CLSM) | Een type fluorescentiemicroscoop dat een laserstraal gebruikt om het monster punt voor punt optisch af te tasten, waarbij een pinhole wordt gebruikt om licht van buiten het focale vlak te elimineren en zo een hogere resolutie en contrast te bereiken. | | Pinhole | Een optisch element, vaak een kleine opening, dat in confocale microscopie wordt gebruikt om te voorkomen dat emissielicht van buiten het gewenste focale vlak de detector bereikt, wat resulteert in een scherper beeld. | | Focaal vlak | Het specifieke optische vlak binnen een monster dat zich in focus bevindt en waaruit het fluorescentielicht wordt verzameld voor detectie. | | Detector (PMT) | Een fotomultiplicatorbuis (PMT) die wordt gebruikt om het zwakke fluorescentielicht dat door het monster wordt uitgezonden te detecteren en te versterken, zodat het zichtbaar wordt gemaakt. | | Optische aftasting | Het proces waarbij een laserstraal systematisch over het oppervlak van een monster wordt bewogen om een beeld te creëren, waarbij elk punt afzonderlijk wordt gescand. | | Driedubbele fluorescentie-aankleuring | Een techniek waarbij drie verschillende fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om gelijktijdig verschillende structuren binnen een cel of weefsel zichtbaar te maken, zoals cytoskelet, mitochondria en DNA. | | Cytoskelet | Een netwerk van eiwitfilamenten en tubuli in het cytoplasma van veel organismen, dat vorm en mechanische ondersteuning biedt aan de cel. | | Mitochondria | Organellen in eukaryote cellen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire ademhaling en de productie van ATP, de belangrijkste energievaluta van de cel. | | DNA | Desoxyribonucleïnezuur, het molecuul dat de genetische instructies bevat voor de ontwikkeling, werking, groei en reproductie van alle bekende organismen. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een techniek die elektronenbundels gebruikt om beelden van zeer dunne monsters te creëren, waarbij de elektronen door het monster worden gestuurd en de interacties met de atomen van het monster worden gedetecteerd om een beeld te vormen. | | Kleuring (in TEM) | De behandeling van biologisch materiaal met verbindingen van zware metalen, zoals osmiumtetroxide of uranylacetaat, die zich binden aan specifieke celregio's en elektronen weerkaatsen, waardoor deze structuren donker verschijnen in de elektronenmicroscoop. | | Dehydratatie | Het proces van het verwijderen van water uit biologisch materiaal door middel van wasstappen met oplopende concentraties van ethanol of aceton, noodzakelijk omdat de kunstharsen die voor het inbedden worden gebruikt hydrofoob zijn. | | Inbedding in hars | Het infiltreren van biologisch materiaal met een vloeibare kunsthars die vervolgens wordt gepolymeriseerd door middel van warmte, magnetronstraling of ultraviolet licht, om harde, snijdbare blokjes te verkrijgen voor ultradun snijden. | | Ultramicrotoom | Een gespecialiseerd instrument dat wordt gebruikt om extreem dunne coupes (plakjes) van biologisch materiaal te snijden, met behulp van messen van gekliefd glas of diamant, voor analyse met TEM. | | Gridje | Een klein metalen schijfje met een roosterpatroon waarop de ultradunne coupes van biologisch materiaal worden opgevangen na het snijden, om ze vervolgens in de elektronenmicroscoop te kunnen bekijken. | | Elektronenstrooiing | Het proces waarbij elektronen die door een monster worden gestuurd, worden afgebogen door de atomen van het monster. Dichte structuren strooien meer elektronen, wat resulteert in een donkerder beeld. | | Contrastverhoging | Het proces van het vergroten van de zichtbaarheid van structuren in een TEM-beeld door het gebruik van zware metalen die de elektronenstrooiing verhogen, waardoor de densiteitsverschillen tussen verschillende delen van het monster duidelijker worden. | | Osmiumtetroxide (OsO4) | Een chemische stof die zowel als fixatief als als contrasteringsmiddel in TEM wordt gebruikt. Het bindt zich aan lipiden en eiwitten, waardoor membranen en andere structuren een verhoogd contrast krijgen. | | Uranylacetaat | Een zwaar metaalzout dat wordt gebruikt als contrasteringsmiddel in TEM. Het bindt zich aan nucleïnezuren en eiwitten, waardoor deze structuren donkerder worden in het beeld. | | Loodcitraat | Een zwaar metaalzout dat vaak wordt gebruikt in combinatie met uranylacetaat als contrasteringsmiddel in TEM. Het verhoogt het contrast van verschillende cellulaire structuren. | | Vries-breek (freeze-fracture) | Een microscopietechniek die wordt gebruikt om membraanstructuren te analyseren door cellulaire membranen te breken, meestal tussen het binnenste en buitenste blad, om zo de eiwitten en eiwitaggregaten binnen de membraanhelften te visualiseren. | | Vries-ets (freeze-etching) | Een microscopietechniek die, na het vries-breekproces, een dunne laag ijs verwijdert door sublimatie onder vacuüm, wat resulteert in een meer driedimensionale structuur van het preparaat voor visualisatie. | | Cryo-elektronen-tomografie | Een techniek voor 3D-reconstructie van een object, gebaseerd op een reeks 2D-projecties die worden verkregen terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld, waardoor gedetailleerde structuren zichtbaar worden. | | SBF-SEM (Serial Block Face-SEM) | Een scanning elektronenmicroscooptechniek waarbij een ultramicrotoom of ionenlaser delen van het preparaat wegneemt binnen de microscoop zelf, om opeenvolgende dwarsdoorsneden te verkrijgen voor 3D-reconstructie. | | FIB-SEM (Focused Ion Beam-SEM) | Een scanning elektronenmicroscooptechniek die gebruikmaakt van een gefocusseerde ionenbundel om materiaal weg te etsen, waardoor opeenvolgende lagen kunnen worden verwijderd en 3D-structuren kunnen worden gereconstrueerd. | | Epitheliale cellen | Cellen die de bekledingslaag van organen en lichaamsholtes vormen, zoals het epitheel van de trachea, dat gespecialiseerd kan zijn in functies zoals trilhaarbeweging of slijmproductie. | | Cilia (trilharen) | Kleine, haarachtige uitsteeksels op het oppervlak van bepaalde cellen, zoals die in het trachea-epitheel, die door hun beweging helpen bij het transporteren van slijm en deeltjes. | | Mucus-producerende cellen | Cellen in het epitheel, met name in de luchtwegen, die verantwoordelijk zijn voor de productie en afscheiding van slijm, een beschermende en bevochtigende substantie. | | Basale membraan (basale lamina) | Een dunne laag extracellulaire matrix die de onderkant van epitheelcellen ondersteunt en scheidt van het onderliggende bindweefsel. | | Glad endoplasmatisch reticulum (SER) | Een netwerk van membranen binnen cellen dat betrokken is bij lipidesynthese, ontgifting en calciumopslag. | | Ruvend endoplasmatisch reticulum (RER) | Een netwerk van membranen binnen cellen, bezaaid met ribosomen, dat betrokken is bij de synthese en modificatie van eiwitten voor secretie of inbedding in membranen. | | Golgi-apparaat | Een organel in eukaryote cellen dat betrokken is bij het modificeren, sorteren en verpakken van eiwitten en lipiden voor secretie of transport naar andere bestemmingen binnen de cel. | | Contactinhibitie | Het fenomeen waarbij cellen in cultuur stoppen met delen zodra ze een confluente tweedimensionale monolaag hebben gevormd, vaak als gevolg van competitie om groeifactoren. | | Monolaag (monolayer) | Een enkele laag cellen die zich op een substraat heeft verspreid en zich heeft gehecht, kenmerkend voor de groei van veel celtypen in cultuur. | | Celdichtheidsafhankelijke inhibitie | Een mechanisme dat de celgroei reguleert op basis van de dichtheid van cellen op het groeioppervlak, waarbij hoge dichtheden de proliferatie remmen. | | Trypsine-EDTA procedure | Een methode die wordt gebruikt om adherente cellen los te maken van het groeisubstraat en van elkaar, door trypsine (een protease) en EDTA (dat calciumionen cheleert) te gebruiken. | | Trypsine | Een enzym uit de maag dat, bij korte behandeling, de oppervlakte-eiwitten van cellen degradeert, wat helpt bij het losmaken van cellen in cultuur. | | EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat) | Een stof die calcium- en magnesiumionen cheleert, wat de intercellulaire adhesie en de binding van cellen aan het substraat verstoort, en zo helpt bij celafscheiding. | | Confluentie | De toestand waarbij een celcultuur het groeioppervlak volledig bedekt met een laag cellen, wat vaak leidt tot het stoppen van de celgroei door contactinhibitie. | | Suspensie van levende opgebolde cellen | Cellen die losgemaakt zijn van het substraat en van elkaar, en die in een vloeibaar medium zweven, ideaal in een monocellulaire vorm voor verdere cultuur. | | Celtransfer | Het proces van het verplaatsen van cellen van een bestaande cultuur naar nieuwe recipiënten, vaak door verdunning, om verdere groei en onderhoud mogelijk te maken. | | Adhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat of aan elkaar, essentieel voor celgroei, differentiatie en weefselvorming. | | Fixeren | Het proces waarbij weefsels worden behandeld om hun oorspronkelijke structuur te behouden, voornamelijk door eiwitten te denatureren om afbraak door enzymen tegen te gaan. Dit kan chemisch gebeuren met fixatiemiddelen zoals formaldehyde of glutaraldehyde, of door bevriezing. | | Inbedden | Het omwikkelen en doordringen van gefixeerd weefsel met een substantie (inbedmiddel) die het materiaal hard maakt, zodat het gesneden kan worden in dunne plakken (coupes) die geschikt zijn voor microscopische observatie. | | Microtoom | Een instrument dat gebruikt wordt om zeer dunne plakken (coupes) van ingebed weefsel te snijden. Voor lichtmicroscopie worden stalen messen gebruikt, terwijl voor elektronenmicroscopie glazen of diamanten messen worden ingezet. | | Artefacten | Veranderingen die tijdens de fixatie of andere preparatieprocedures in een weefsel ontstaan en afwijken van de oorspronkelijke in-vivo situatie. Dit kan leiden tot structurele veranderingen of het verplaatsen van componenten. | | Coupes | Zeer dunne plakken van weefsel die gesneden zijn na fixatie en inbedding. Deze coupes zijn noodzakelijk om lichtstralen of elektronen door het weefsel te laten dringen voor microscopische analyse. | | Denatureren | Het proces waarbij de driedimensionale structuur van eiwitten wordt veranderd, waardoor hun biologische functie verloren gaat. Bij fixatie is dit essentieel om enzymatische afbraak van weefsel te stoppen. | | Inbedmiddel | Een substantie, zoals paraffine, hars of plastic, die in gefixeerd weefsel binnendringt en het materiaal verhardt, waardoor het mogelijk wordt om dunne coupes te snijden voor microscopische observatie. | | Hydrofoob | Een eigenschap van stoffen die water afstoten. Veel inbedmiddelen die in de histologie worden gebruikt, zijn hydrofoob en vereisen daarom dat weefsel eerst wordt ontwaterd. | | Dehydrateren | Het verwijderen van water uit weefsel, meestal door het te behandelen met een reeks alcoholbaden met oplopende concentraties. Dit is een noodzakelijke stap voordat hydrofobe inbedmiddelen kunnen worden gebruikt. | | Clearing | Een stap in het preparatieproces waarbij een substantie, zoals tolueen, wordt gebruikt die mengbaar is met zowel alcohol (dat het water heeft vervangen) als met het hydrofobe inbedmiddel, om de overgang naar het inbedmiddel te vergemakkelijken. | | Elektronenmicroscopie (EM) | Een microscopische techniek die elektronen gebruikt in plaats van licht om beelden te vormen, waardoor veel hogere resoluties en vergrotingen mogelijk zijn dan met lichtmicroscopen. Dit vereist een hoog vacuüm en elektromagnetische lenzen. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij een preparaat wordt afgetast met een elektronenbundel. De detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen maakt het mogelijk om een driedimensionaal beeld van het oppervlak van het monster te creëren. | | Elektromagnetische lenzen | Componenten in een elektronenmicroscoop die de elektronenbundel manipuleren en focussen. Deze lenzen, bestaande uit spoelen die een magnetisch veld genereren, vervangen de glaslenzen die in lichtmicroscopen worden gebruikt. | | Secundaire elektronen | Elektronen die uit het monster worden gestoten wanneer het wordt gebombardeerd door de primaire elektronenbundel in een SEM. Deze secundaire elektronen worden gedetecteerd en gebruikt voor beeldvorming. | | Negatieve kleuring | Een preparatietechniek in TEM waarbij het monster wordt omgeven door een zwaar metaalzout. Het metaal vult de ruimtes rondom het monster, waardoor het monster zelf donker afsteekt tegen een lichte achtergrond. | | Shadow casting (schaduwwerping) | Een preparatietechniek waarbij het monster onder een schuine hoek wordt bestoven met een metaal. Dit creëert een driedimensionaal effect door schaduwen te werpen achter de structuren van het monster, wat de morfologie beter zichtbaar maakt. | | Ultradunne secties | Zeer dunne plakjes van biologisch materiaal, typisch 50-100 nm dik, die nodig zijn voor transmissie-elektronenmicroscopie. Deze dunne coupes maken het mogelijk dat elektronen erdoorheen kunnen dringen en een beeld kunnen vormen. | | Vacuümtechnologie | Essentieel voor elektronenmicroscopie omdat elektronen gemakkelijk worden gestopt door gasmoleculen. Een hoog vacuüm is nodig om de elektronenbundel ongehinderd door de microscoop te laten reizen. | | PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff) | Een histologische kleuringstechniek die vrije suikers aankleurt, vaak gebruikt om slijm en glycogeen zichtbaar te maken in weefselcoupes. | | Hematoxyline | Een basische kleurstof die, in combinatie met een beitsmiddel zoals aluminiumzouten, negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern aankleurt, resulterend in een blauwe of donkerpaarse kleur. | | Eosine | Een zure kleurstof die positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma, aankleurt met een roze kleur. | | HE-kleuring (Hematoxyline en Eosine) | Een veelgebruikte histologische kleuringstechniek die hematoxyline en eosine combineert om verschillende weefselstructuren zichtbaar te maken, waarbij kernen blauw/paars en cytoplasma/extracellulaire matrix roze kleuren. | | Slijmbekercellen | Cellen in het epitheel van de darm die slijm produceren en afscheiden, zichtbaar gemaakt met PAS-kleuring. | | Microvilli (borstelzoom/staafjeszoom) | Kleine, vingerachtige uitsteeksels aan het oppervlak van epitheelcellen die de absorptie vergroten; zichtbaar gemaakt met PAS-kleuring. | | Basale membraan | Een dunne laag extracellulaire matrix die epitheelcellen scheidt van het onderliggende bindweefsel; aangegeven met pijlen in de context van de darmvillus. | | Fasecontrastmicroscopie | Een lichtmicroscopische techniek die kleine faseverschuivingen in licht, veroorzaakt door brekingsverschillen in het preparaat, omzet in amplitudeveranderingen (licht/donker) om contrast te creëren in ongekleurde preparaten, zoals levende cellen. | | Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski) | Een techniek die gebruikmaakt van gepolariseerd licht en speciale prisma's om kleine verschillen in optische dichtheid en brekingsindex in een preparaat om te zetten in een beeld met hoog contrast, vaak gebruikt voor levende, ongekleurde cellen. | | Digitale microscopie | Een methode die ultragevoelige videocamera's en computerverwerking van beelden gebruikt om dynamische beelden van preparaten te genereren, inclusief real-time en time-lapse opnamen. | | Klaarveldmicroscoop | Een standaard lichtmicroscoop waarbij het preparaat wordt verlicht door wit licht, wat resulteert in een laag contrast voor ongekleurde of transparante monsters. | | Optische dichtheid | Een maat voor hoe sterk een stof licht absorbeert of verstrooit, wat bijdraagt aan het contrast in microscopische beelden. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopische techniek die gebruikmaakt van fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen) om specifieke structuren of moleculen in een preparaat zichtbaar te maken door middel van excitatie- en emissielicht. | | Fluorofoor | Een molecuul dat in staat is om licht te absorberen bij een bepaalde golflengte en dit vervolgens weer uit te zenden als fluorescentie bij een langere golflengte. | | Excitatie | Het proces waarbij een fluorofoor energie absorbeert, meestal in de vorm van licht, waardoor het naar een hogere energietoestand wordt gebracht. | | Emissie | Het proces waarbij een geëxciteerd fluorofoor terugvalt naar zijn grondtoestand, waarbij het de geabsorbeerde energie uitzendt in de vorm van fluorescentielicht. | | Golflengte | De afstand tussen opeenvolgende pieken of dalen van een golf, die de kleur van zichtbaar licht bepaalt en cruciaal is voor excitatie en emissie in fluorescentiemicroscopie. | | Epifluorescentie | Een type fluorescentiemicroscopie waarbij het excitatie- en emissielicht langs dezelfde optische weg lopen, wat resulteert in een efficiënte verlichting van het preparaat. | | Confocale laser scanning microscopie (CLSM) | Een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die een laserbundel gebruikt om het preparaat punt voor punt te scannen, waardoor optische doorsneden met hoge resolutie en minimale achtergrondruis mogelijk zijn. | | Excitatiefilter | Een optisch filter dat specifiek licht van een bepaalde golflengte doorlaat om het fluorofoor in het preparaat te exciteren. | | Emissiefilter (Stopfilter) | Een optisch filter dat het excitatielicht blokkeert en alleen het door het fluorofoor uitgezonden emissielicht doorlaat naar de detector. | | Dichroïsche spiegel (Beamsplitter) | Een speciale spiegel die licht van een bepaalde golflengte reflecteert en licht van een andere golflengte doorlaat, essentieel voor het scheiden van excitatie- en emissielicht in een microscoop. | | Ion-gevoelige kleurstoffen | Fluorochromen waarvan de fluorescentie-eigenschappen veranderen in reactie op de concentratie van specifieke ionen, zoals calcium, waardoor ionconcentraties in levende cellen gemeten kunnen worden. | | Immunofluorescentie microscopie | Een techniek die gebruikmaakt van antilichamen waaraan een fluorofoor is gekoppeld om specifieke eiwitten of antigenen in cellen of weefsels te detecteren en te visualiseren. | | Celkweek | Het in vitro kweken van cellen, waarbij ze worden onderhouden in een gecontroleerde omgeving met specifieke voedingsstoffen en omstandigheden om groei en proliferatie te bevorderen. | | Cellijn | Een populatie van cellen die afkomstig is van een enkele oorsprong en die in cultuur kan worden gehouden voor onbeperkte passages, vaak geïmmortaliseerd of afkomstig van tumoren. | | Immortalisatie | Het proces waarbij cellen het vermogen krijgen om zich onbeperkt te delen, wat kan gebeuren door natuurlijke mechanismen (zoals bij tumorcellen) of door genetische manipulatie. | | Senescence | Een proces van celveroudering waarbij cellen stoppen met delen na een bepaald aantal passages, wat leidt tot hun afsterven. | | Groeimedium | Een vloeibare voedingsoplossing die essentiële componenten bevat, zoals zouten, glucose, aminozuren, vitamines en soms serum, die nodig zijn voor de groei en het onderhoud van cellen in cultuur. | | CO2-oven | Een incubatieapparaat dat een gecontroleerde atmosfeer van 5% CO2 in lucht handhaaft, essentieel voor het stabiliseren van de pH van celcultuurmedia. | | Cultuurrecipiënt | Een container, zoals een petrischaal, kolf of plaat, waarin cellen worden gekweekt. | | Groeisubstraat | Het oppervlak waarop adherente cellen groeien; dit kan glas, polystyreen of een gecoat oppervlak zijn dat adhesie en overleving bevordert. | | Anoïkis | Een vorm van geprogrammeerde celdood die optreedt wanneer cellen hun contact met het extracellulaire matrix verliezen. |

# Structuur en indeling van immunoglobulinen Immunoglobulinen, ook wel antistoffen of antilichamen genoemd, zijn glycoproteïnen met een essentiële rol in de humorale immuniteit. Ze worden ingedeeld op basis van structurele kenmerken zoals isotypen, subklassen en hun monomere of polymere vorm, alsook op functionele gronden [1](#page=1) [2](#page=2). ### 1.1 Basisstructuur van immunoglobulinen Immunoglobulinen (Ig) zijn glycoproteïnen die voor 80-90% uit polypeptiden en voor 10-20% uit koolhydraten bestaan. De basisstructuur kan worden geanalyseerd door middel van enzymatische digestie [1](#page=1). * **Papaïne digestie:** Dit resulteert in twee fragmenten die antigenen kunnen binden, Fab (Fragment antigen binding), en één fragment dat kristalliseert, Fc (Fragment crystallizable) [1](#page=1). * **Pepsine digestie:** Dit leidt tot het F(ab')₂ fragment, dat twee antigeenbindende armen bevat, terwijl het Fc fragment verder wordt afgebroken [1](#page=1). De algemene structuur van een immunoglobuline bevat een variabel deel, een hinge regio, en een constant deel. Immunoglobulinen maken deel uit van de grotere Ig superfamilie, die zeer heterogeen is maar centraal een immunoglobuline domein bevat. Voorbeelden van leden van de Ig superfamilie zijn T-celreceptoren, Fc-receptoren, MHC-moleculen, co-receptoren zoals CD4 en CD8, en adhesiemoleculen zoals ICAMs [1](#page=1). ### 1.2 Indeling van immunoglobulinen De indeling van immunoglobulinen kan op verschillende gronden plaatsvinden [1](#page=1). #### 1.2.1 Structurele indeling Structureel worden immunoglobulinen ingedeeld op basis van: * **Isotypen (klassen):** Er zijn vijf hoofdklassen: IgM, IgG, IgA, IgE en IgD. Deze klassen worden bepaald door de structuur van de H(eavy)-keten van het Fc-fragment [1](#page=1) [2](#page=2). * IgG is geassocieerd met de 𝛾-keten. * IgA is geassocieerd met de 𝛼-keten. * IgM is geassocieerd met de 𝜇-keten. * IgD is geassocieerd met de 𝛿-keten. * IgE is geassocieerd met de 𝜀-keten. * **Subklassen:** Binnen de IgG-klasse zijn er vier subklassen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) en binnen de IgA-klasse zijn er twee subklassen (IgA1, IgA2) [2](#page=2). * **Allotypen:** Dit zijn genetische varianten binnen dezelfde klasse of subklasse [1](#page=1). * **Idiotypen:** Dit verwijst naar de unieke variabele regio's van de antigeenbindende site [1](#page=1). #### 1.2.2 Vorm: monomeer en polymeer Immunoglobulinen kunnen monomeer of polymeer voorkomen [2](#page=2). * **Monomeren:** IgG, IgE, IgD, IgA1 en membraangebonden IgM (mIgM) zijn monomeer en hebben twee antigeenbindingsplaatsen [2](#page=2). * **Dimeren:** Secretoir IgA (sIgA) is een dimeer en heeft vier antigeenbindingsplaatsen [2](#page=2). * **Pentameren:** IgM komt voornamelijk voor als een pentameer en heeft tien antigeenbindingsplaatsen [2](#page=2). De polymere vormen worden gestabiliseerd door een J-keten (junctie keten). Secretoir IgA bevat ook een secretory component, een eiwit dat het beschermt tegen proteolytische degradatie in de luminale omgeving. Immunoglobulinen kunnen zowel oplosbaar (solubel) als membraangebonden voorkomen, waarbij de laatste vaak door alternatieve mRNA-splitsing wordt gevormd [2](#page=2). #### 1.2.3 Functionele indeling De functionele eigenschappen van immunoglobulinen worden grotendeels bepaald door het Fc-fragment. Deze functies omvatten onder andere neutralisatie van pathogenen, activatie van het complementsysteem, bevordering van opsonisatie, en placentaire transfer [2](#page=2) [8](#page=8). ### 1.3 Anatomische en cellulaire expressie #### 1.3.1 Lichte keten Elk immunoglobuline molecuul bevat twee identieke lichte ketens (L-ketens). Deze lichte ketens, samen met de zware ketens, vormen de antigeenbindende Fab-fragmenten. De variabiliteit in de lichte keten, met name in de CDR-regio's, draagt bij aan de specificiteit van de antigeenbinding [3](#page=3). #### 1.3.2 Vormen van membraanbinding en secretie Immunoglobulinen kunnen op twee manieren in het lichaam voorkomen: * **Membraangebonden immunoglobulinen (mIg):** Deze zijn te vinden op het oppervlak van B-lymfocyten. Ze worden monoklonaal en monospecifiek geproduceerd door middel van allelexclusie. mIg speelt een cruciale rol bij de herkenning van antigenen en de daaropvolgende B-celactivatie. Naïeve B-cellen uiten IgM en IgD, terwijl geheugen B-cellen na class switching IgM, IgG, IgA, of IgE kunnen uiten. Er kunnen 10 tot 100.000 mIg moleculen per cel voorkomen, waarbij ze transmembranair zijn [3](#page=3). * **Gesecreteerde immunoglobulinen (sIg):** Deze worden geproduceerd door cellen zoals macrofagen, neutrofielen, basofielen en mestcellen. Ze binden aan specifieke Fc-receptoren (FcR) op andere immuuncellen. Na antigeenbinding (vooral met IgG) faciliteren ze opsonisatie en Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC). Voor IgE gebeurt de binding aan basofielen en mestcellen al vóór antigeenbinding, wat leidt tot deactivering van deze cellen na antigeencomplexvorming [3](#page=3). #### 1.3.3 Weefseldistributie van Ig isotypen De distributie van de verschillende Ig-isotypen in het lichaam varieert aanzienlijk [2](#page=2). * **IgG:** Voornamelijk aanwezig in serum en extracellulair weefselvocht. Belangrijk voor foetale immuniteit door transfer via de placenta via de FcRn receptor [2](#page=2) [4](#page=4). * **IgA:** In serum voornamelijk als monomeer IgA1. In secreten (zoals speeksel, melk, darmvocht) komt het voornamelijk voor als dimeer secretoir IgA (sIgA) . sIgA speelt een rol in de bescherming van epitheliale barrières [2](#page=2) [8](#page=8). * **IgM:** Aantoonbaar in serum als pentameer. Verlaat het vaatbed enkel bij inflammatie naar het weefselvocht [2](#page=2). * **IgE:** In serum gebonden aan basofielen en in weefsels (subepitheel) gebonden aan mestcellen [2](#page=2). ### 1.4 Functionele onderverdeling: Fab en Fc De immunoglobuline molecule kan functioneel worden opgedeeld in het Fab- en het Fc-fragment [3](#page=3). #### 1.4.1 Fab fragment Het Fab-fragment is verantwoordelijk voor de antigeenbinding en bepaalt de specificiteit van het antilichaam [3](#page=3). * **Specificiteit:** Het Fab-deel, met name de variabele regio's, bindt aan het epitoop van het antigeen. De variabiliteit in aminozuursequenties in deze regio's, met name de drie hypervariabele regio's (Complementarity Determining Regions - CDRs), maakt een breed scala aan antigeenherkenning mogelijk. De CDRs worden gevormd door recombina- [3](#page=3). tie van V (variabele), D (diversity, enkel in H-keten) en J (join) gensegmenten. De framework regions (FRs) zijn relatief constant [3](#page=3). * **Diversiteit:** De enorme diversiteit aan antigeenspecificiteiten wordt gegenereerd door gensegmentherschikking in het DNA van lymfocyten, een proces dat bekend staat als V(D)J-recombinatie. Dit creëert miljarden verschillende specificiteiten vanuit een beperkt aantal genen. Elke lymfocyt produceert ongeveer 100.000 identieke receptoren, wat leidt tot monospecificiteit [4](#page=4). * **Antigeenherkenning:** Fab-fragmenten kunnen direct antigenen herkennen, in tegenstelling tot T-celreceptoren die antigenen na presentatie door antigenpresenterende cellen herkennen. Ze kunnen zowel lineaire (continue) als conformationele (discontinue) epitopen herkennen op eiwitten, koolhydraten, nucleïnezuren en lipiden. Somatische hypermutatie draagt verder bij aan de affiniteitsrijping van de antigeenbinding [4](#page=4). * **Functies:** De Fab-fragmenten zijn betrokken bij de neutralisatie van antigenen, zoals toxines en virussen, en kunnen de binding van pathogenen aan cellen voorkomen [3](#page=3) [8](#page=8). #### 1.4.2 Fc fragment Het Fc-fragment is het constante deel van het immunoglobuline molecule en is relatief vergelijkbaar in aminozuursequentie binnen dezelfde (sub)klasse. Het is betrokken bij diverse biologische functies [3](#page=3) [4](#page=4). * **Functies:** * **Membraanbinding:** Door interactie met Fc-receptoren op immuuncellen, faciliteert het Fc-fragment processen zoals opsonisatie, ADCC, en de activatie van mestcellen en basofielen [3](#page=3) [4](#page=4). * **Complementactivatie:** Met name IgG en IgM kunnen het complementsysteem activeren [4](#page=4) [8](#page=8). * **Transfer:** Via specifieke receptoren zoals FcRN vindt transfer van immunoglobulinen plaats, bijvoorbeeld de placentaire transfer van IgG naar de foetus [3](#page=3) [4](#page=4). * **Hinge regio:** Deze regio, gelegen tussen CH1 en CH2 in de zware keten, biedt flexibiliteit aan het molecuul door zijn proline-rijke structuur en bevat cysteïnen voor disulfidebruggen. Bij IgM en IgE ontbreekt de traditionele hinge regio, met een vergelijkbare structuur in het CH2 domein [4](#page=4). ### 1.5 Immunoglobuline IgA-subklassen IgA kent twee subklassen, IgA1 en IgA2, met belangrijke functionele en structurele verschillen [8](#page=8). * **sIgA functie:** Secretoir IgA (sIgA) speelt een cruciale rol in de bescherming van luminale oppervlakken [8](#page=8). * Het voorkomt de hechting en het binnendringen van pathogenen door complexvorming [8](#page=8). * Het neutraliseert toxines en virussen [8](#page=8). * In epitheelcellen draagt het bij aan virusneutralisatie [8](#page=8). * In de lamina propria complexeren IgA-moleculen met antigenen [8](#page=8). * Via de poly-Ig receptor wordt sIgA naar het lumen getransporteerd (trancytose) [8](#page=8). * De complexen kunnen worden opgenomen door fagocyten [8](#page=8). * sIgA kan ook bijdragen aan complementactivatie [8](#page=8). * **Verschillen IgA1 en IgA2:** * **J-keten:** Alleen sIgA bevat een J-keten [8](#page=8). * **Polymeer:** sIgA is een dimeer, terwijl serum IgA1 monomeer is [8](#page=8). * **Hinge regio:** De hinge regio van IgA1 en IgA2 bestaat uit 13 aminozuren [8](#page=8). ### 1.6 Overzicht van Ig eigenschappen en functies | Eigenschap/Functie | IgM | IgG1 | IgA | IgE | | :------------------------ | :----- | :----- | :----- | :----- | | Transport door epitheel | +/- | - | ++ | - | | Transport placenta | - | + | - | - | | Complementactivatie | ++ | + | +/- | - | | Opsonisatie | - | + | - | - | | Neutralisatie toxines/micro-organismen | +/- | + | + | - | | ADCC (NK-cellen) | - | + | - | - | | Mestcellen/basofielen activatie | - | +/- | - | + | [ ] [8](#page=8). --- # Functies en biologische rollen van immunoglobulinen Dit onderdeel van de studiehandleiding behandelt de diverse functies en biologische rollen van immunoglobulinen (antilichamen). ## 2. Functies en biologische rollen van immunoglobulinen Immunoglobulinen (Ig's) zijn glycoproteïnen die een cruciale rol spelen in het adaptieve immuunsysteem door de herkenning en neutralisatie van pathogenen en toxines. Hun functie wordt grotendeels bepaald door het Fc-deel van het antilichaam dat uiteenlopende biologische effecten teweegbrengt, zoals complementactivatie, binding aan celmembranen via Fc-receptoren, en transfer door barrières zoals de placenta [2](#page=2) [3](#page=3) [4](#page=4). ### 2.1 Structuur en diversiteit van immunoglobulinen Immunoglobulinen zijn opgebouwd uit zware (H) en lichte (L) ketens die via disulfidebruggen aan elkaar verbonden zijn. De constante regio van de zware keten bepaalt de klasse of het isotype van het immunoglobuline. Er zijn vijf klassen: IgG, IgA, IgM, IgD en IgE, met in totaal negen subklassen [2](#page=2). #### 2.1.1 Variabele Fab-regio: specificiteit en diversiteit De Fab-regio (Fragment antigen-binding) bevat de variabele delen van de zware en lichte ketens en is verantwoordelijk voor de antigeenbinding. Deze regio wordt gekenmerkt door drie hypervariabele regio's (Complementarity Determining Regions - CDR's) die de specificiteit van het antilichaam bepalen. De enorme diversiteit aan antigeenspecificiteiten (tot $10^{12}$) wordt bereikt door gensegmentherschikking (V(D)J-recombinatie) en somatische hypermutatie. In tegenstelling tot T-celreceptoren, kunnen immunoglobulinen directe antigeenbinding bewerkstelligen en zowel lineaire als conformationele epitopen herkennen [3](#page=3) [4](#page=4). #### 2.1.2 Constante Fc-regio: biologische effectorfuncties De Fc-regio (Fragment crystallizable) is relatief constant binnen een bepaalde klasse en subklasse en is verantwoordelijk voor de effectorfuncties van het antilichaam [3](#page=3) [4](#page=4). ##### 2.1.2.1 Complementactivatie IgG en IgM kunnen de klassieke route van het complementsysteem activeren. Dit leidt tot lysering van de doelwitcel (via MAC C5b-C9), opsonisatie (vooral via C3b), en pro-inflammatoire effecten [5](#page=5). ##### 2.1.2.2 Membraanbinding via Fc-receptoren Fc-receptoren (FcR) zijn eiwitten op de celmembraan van verschillende immuun- en somatische cellen, waaronder fagocyten, NK-cellen en mestcellen. Deze receptoren binden polyclonaal aan het Fc-deel van antilichamen, wat leidt tot functies zoals opsonisatie, Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC), en activatie van mestcellen en basofielen. IgE bindt reeds vóór antigeenbinding aan Fc-receptoren op mestcellen en basofielen [3](#page=3) [5](#page=5) [7](#page=7). ##### 2.1.2.3 Placenta- en interstitiële transfer De Neonatale Fc receptor (FcRn) speelt een sleutelrol in de transfer van IgG door de placenta naar de foetus, en van het interstitium naar de bloedbaan. Dit mechanisme zorgt voor passieve immuniteit bij pasgeborenen [5](#page=5). ### 2.2 Specifieke rollen van Ig-klassen #### 2.2.1 IgG * **Functies:** IgG is de belangrijkste antilichaamklasse in het serum en het extracellulaire weefselvocht. Het is cruciaal voor opsonisatie, complementactivatie en ADCC [2](#page=2) [8](#page=8). * **Transfer:** Via FcRn worden IgG's naar de foetus getransporteerd [5](#page=5). * **Subklassen:** IgG1 is het meest voorkomend en meest efficiënt in het activeren van complement en opsonisatie [8](#page=8). #### 2.2.2 IgA * **Structuur:** Hoofdzakelijk aanwezig als een dimeer secretair IgA (sIgA) in secreties, en als monomeer IgA1 in het serum. De J-keten is essentieel voor de vorming van dimeer IgA. Het secretorische component beschermt IgA tegen proteolytische degradatie [2](#page=2) [7](#page=7). * **Functies sIgA:** SlsA voorkomt de hechting en het binnendringen van pathogenen in mucosale oppervlakken door neutralisatie van toxines en virussen. Het wordt via de poly-Ig receptor actief getransporteerd naar het lumen van epitheelcellen [7](#page=7) [8](#page=8). * **Complementactivatie:** sIgA activeert het complementsysteem beperkt [7](#page=7). #### 2.2.3 IgM * **Structuur:** Aanwezig als een pentameer in het serum, met 10 antigeenbindingsplaatsen [2](#page=2). * **Functies:** IgM is de eerste antistof die wordt geproduceerd tijdens een primaire immuunrespons. Het is zeer efficiënt in het activeren van complement. Het bereikt het weefselvocht enkel bij inflammatie [2](#page=2) [3](#page=3) [5](#page=5) [8](#page=8). #### 2.2.4 IgE * **Functies:** IgE speelt een rol bij weerstand tegen parasitaire infecties en is geassocieerd met allergische reacties [7](#page=7). * **Binding:** IgE bindt via zijn Fc-receptor aan mestcellen en basofielen, waarna antigeenbinding kan leiden tot degranulatie en vrijzetting van mediatoren zoals histamine [3](#page=3) [7](#page=7). * **Thermolabiliteit:** IgE is thermolabiel [7](#page=7). #### 2.2.5 IgD * **Functies:** IgD is voornamelijk aanwezig op het celmembraan van rijpe B-lymfocyten, waar het samen met IgM de B-celreceptor vormt. De precieze functies van circulerend IgD zijn minder duidelijk, maar het kan antilichaamactiviteit vertonen tegen diverse antigenen [3](#page=3) [7](#page=7). ### 2.3 Rollen bij specifieke immuunreacties #### 2.3.1 Allergische reacties IgE-gemedieerde allergieën zijn een direct gevolg van de binding van IgE aan mestcellen en basofielen, gevolgd door degranulatie na blootstelling aan een allergeen [7](#page=7). #### 2.3.2 Parasitaire infecties IgE speelt een rol in de bescherming tegen parasitaire infecties, mede door de activatie van eosinofielen die toxische degranulatieproducten vrijgeven [7](#page=7). > **Tip:** Vergelijk de effectorfuncties van de verschillende Ig-klassen en hun specifieke rol in diverse immuunresponsen (bv. complementactivatie, celbinding, transfer). Dit is een veelvoorkomend examenvraagonderwerp. --- # B-cel activatie en immuunrespons Dit deel behandelt het proces van B-cel activatie, van naïeve B-cellen tot de vorming van plasmacellen en geheugencellen, inclusief T-cel afhankelijke en onafhankelijke reacties, isotype switch, affiniteitsmaturatie en de verschillen tussen primaire en secundaire immuunresponsen. ### 3.1 B-cel activatie: van naïeve cel tot plasmacel De activatie van een naïeve B-cel, die IgM en IgD op het membraan draagt, is een complex proces dat leidt tot de vorming van plasmacellen en geheugencellen, wat essentieel is voor een effectieve immuunrespons. Dit proces vindt plaats in secundaire lymfoïde organen zoals de milt en lymfeklieren [9](#page=9). #### 3.1.1 Mechanismen van B-cel activatie B-cel activatie kan op twee manieren plaatsvinden: * **T-cel afhankelijke activatie:** Dit mechanisme is van toepassing op eiwitantigenen. Hierbij is de interactie met T-helpercellen cruciaal voor inductie en modulatie van de respons [11](#page=11) [9](#page=9). * **T-cel onafhankelijke activatie:** Dit mechanisme treedt op bij antigenen met repetitieve structuren, zoals polysachariden. Deze reactie vereist geen extra T-cel stimulus voor de productie van immunoglobulinen [11](#page=11) [9](#page=9). #### 3.1.2 Stappen in de activatie en differentiatie Het proces van B-cel activatie volgt een reeks stappen: 1. **Activatie van de naïeve B-cel:** Een naïeve B-cel (met IgM/IgD) herkent het antigeen via zijn membraangebonden immunoglobulinen (mIg), wat het eerste signaal levert. Vaak is een tweede signaal nodig via een cognitieve synaps [11](#page=11) [3](#page=3). 2. **Migratie en fagocytose:** Gelijktijdig met de activatie, fagocyteert de B-cel het antigeen voor presentatie aan T-cellen [9](#page=9). 3. **Communicatie en doorrijping:** De geactiveerde B-cel communiceert met geprimede T-cellen in een immunologische synaps. Interacties tussen CD40 en CD40L zijn hierbij cruciaal voor isotype switch en verdere differentiatie. Ook de interactie tussen CD80 en CD28 speelt een rol [9](#page=9). 4. **Terugkeer en verdere differentiatie in het kiemcentrum:** Een deel van de T-cel geactiveerde B-cellen keert terug naar de secundaire follikels en ondergaat verdere differentiatie in het kiemcentrum. Hier vindt proliferatie, isotype switch en affiniteitsmaturatie plaats [10](#page=10). #### 3.1.3 Gevolgen van activatie De activatie van een naïeve IgM/IgD B-cel leidt tot: * Verlengde overleving en proliferatie [10](#page=10). * Verhoogde expressie van MHC klasse II moleculen, waardoor de B-cel een effectievere antigeenpresenterende cel wordt [10](#page=10). * Verhoogde expressie van CD80/CD86, integrines, CD40 en interleukine receptoren, ter voorbereiding op communicatie met geactiveerde T-cellen [10](#page=10). * De vorming van kortlevende plasmacellen die voornamelijk IgM produceren en lokaal blijven [10](#page=10). * Migratie naar het kiemcentrum, waar ze differentiëren tot geheugen B-cellen en langlevende plasmacellen [10](#page=10). ### 3.2 Isotype switch en affiniteitsmaturatie Isotype switch en affiniteitsmaturatie zijn cruciale processen die plaatsvinden in het kiemcentrum en de kwaliteit van de immuunrespons verbeteren. #### 3.2.1 Isotype switch De isotype switch is een proces waarbij de B-cel de productie van immunoglobulinen verandert van IgM naar andere isotypes (IgG, IgA, IgE) door een verandering in de zware keten. De belangrijkste factor voor isotype switch is de interactie tussen CD40 en CD40L. Verschillende cytokines sturen de switch naar specifieke isotypes [10](#page=10): * IFN$\gamma$ induceert IgG [10](#page=10). * IL21 en IL6 induceren IgM [10](#page=10). * IL10 en TGF$\beta$ induceren IgA [10](#page=10). * IL4 en IL13 induceren IgE [10](#page=10). #### 3.2.2 Affiniteitsmaturatie Affiniteitsmaturatie, ook wel somatische hypermutatie genoemd, is het proces waarbij de bindingsaffiniteit van antilichamen voor het antigeen wordt verhoogd. Dit gebeurt door mutaties in de variabele regio's van de immunoglobuline genen, specifiek in de hypervariabele regio's (CDR's). Deze mutaties kunnen leiden tot veranderingen in de paratoop, waardoor deze beter past op het epitoop van het antigeen [10](#page=10) [12](#page=12) [3](#page=3). > **Tip:** Affiniteitsmaturatie is een selectief proces. B-cellen met mutaties die leiden tot hogere affiniteit worden gestimuleerd om te prolifereren en te overleven, terwijl B-cellen met lagere affiniteit afsterven. ### 3.3 Primaire en secundaire immuunrespons De B-cel respons op een eerste blootstelling aan een antigeen (primaire respons) verschilt significant van de respons op volgende blootstellingen (secundaire respons) [11](#page=11). #### 3.3.1 Primaire immuunrespons De primaire immuunrespons wordt gekenmerkt door: * Activatie van naïeve B-cellen die voornamelijk IgM produceren [10](#page=10) [11](#page=11). * Een langzamere opbouw van antilichaamconcentraties, die over het algemeen lager zijn [11](#page=11). * De noodzaak van T-cel hulp voor de meeste antigenen (T-cel afhankelijke respons) [11](#page=11). * Beperkte isotype switch en affiniteitsmaturatie in de initiële fase [10](#page=10) [11](#page=11). * De vorming van kortlevende plasmacellen en geheugencellen [10](#page=10). #### 3.3.2 Secundaire immuunrespons De secundaire immuunrespons, die optreedt na herhaalde blootstelling aan hetzelfde antigeen, is: * Sneller en efficiënter [11](#page=11). * Gedreven door langlevende geheugencellen die al zijn gedifferentieerd en geprimed zijn [10](#page=10) [11](#page=11). * Kenmerkt zich door een hogere concentratie antilichamen met een hogere affiniteit en aviditeit [11](#page=11) [12](#page=12). * Produceert voornamelijk IgG, IgA of IgE, afhankelijk van de eerdere isotype switch [10](#page=10). * Vereist geen cognate synapse meer, wat de snelheid van de respons verklaart [11](#page=11). > **Tip:** Het verschil tussen primaire en secundaire respons is de basis van vaccinatie, waarbij het lichaam wordt voorbereid op een snellere en sterkere reactie bij een echte infectie. ### 3.4 Kenmerken van immunoglobulinen en interacties Immunoglobulinen (antilichamen) zijn eiwitten geproduceerd door B-cellen en plasmacellen met specifieke functies. #### 3.4.1 Structuur en specificiteit * **Fab-deel:** Dit deel van het antilichaam is verantwoordelijk voor de antigenbinding (paratoop) en bepaalt de specificiteit. Het bevat variabele regio's met hypervariabele regio's (CDR's) die de binding aan het epitoop van het antigeen bepalen [3](#page=3). * **Fc-deel:** Dit constante deel van het antilichaam is verantwoordelijk voor de biologische functies, zoals membraanbinding, opsonisatie, en activatie van het complementsysteem [3](#page=3). * **Idiotype:** Dit is een uniek kenmerk van een specifieke immunoglobuline, bepaald door de CDR en FR regio's [9](#page=9). * **Isotype:** Genetische merkers die gemeenschappelijk zijn voor een soort, vertegenwoordigen de subklassen van Ig [9](#page=9). * **Allotype:** Genetische merkers die aanwezig zijn op Ig van verschillende individuen van dezelfde soort [9](#page=9). #### 3.4.2 Affiniteit en aviditeit * **Affiniteit:** De bindingssterkte tussen één paratoop van een antilichaam en één epitoop van een antigeen. Deze wordt bepaald door niet-covalente bindingen [12](#page=12). * **Aviditeit:** De totale bindingssterkte tussen een antilichaam en een antigeen, wat de som is van de affiniteiten van alle interacties. Multivalente antilichamen hebben hierdoor een hogere aviditeit [12](#page=12). #### 3.4.3 Belangrijke concepten * **Immuuncomplexen:** Vormen zich wanneer antigenen en antilichamen in een perfect evenwicht zijn [12](#page=12). * **Kruisreactiviteit:** Een antilichaam kan binden aan epitoopen die vergelijkbaar zijn met het oorspronkelijke epitoop, zelfs op verschillende antigenen [12](#page=12). * **Hapteen en carrier:** Kleine antigenen (haptenen) activeren B-cellen alleen wanneer ze gebonden zijn aan een grotere drager (carrier), meestal een eiwit. De T-cel wordt geactiveerd tegen de carrier peptiden, en boost vervolgens de hapteen-specifieke B-cel [12](#page=12). | Kenmerk | T cel afhankelijk | T cel onafhankelijk | | :--------------------- | :---------------------------------------------- | :----------------------------------------- | | Type antigenen | Vooral eiwitten | Vooral polysachariden | | T cel nodig voor | Inductie en modulatie respons | Nee | | Geheugen B cel | Ja | Nee | | Isotype switch | Ja | Beperkt | | Verschijnen antilichamen | Weken | Dagen | | Concentratie antilichamen | Laag | Hoog | | Aviditeit antilichamen | Laag | Hoog | | Respons kinderen <2 jaar | Ja | Nauwelijks | | Primaire respons | Ja | Ja | | Secundaire respons | Ja | Ja | --- # Specificiteit en antigeenherkenning Dit onderwerp verklaart hoe de Fab-regio van immunoglobulinen specifieke antigenen herkent, inclusief de rol van hypervariabele regio's (CDR's) en gensegmentherschikking. ### 4.1 De Fab-regio: het antigeenbindende deel De Fab-regio van een immunoglobuline (antilichaam) is verantwoordelijk voor de specifieke herkenning van antigenen. Dit deel van het antilichaam wordt ook wel het paratoop genoemd, dat interageert met het epitop op het antigeen. De Fab-regio bestaat uit zowel de zware (H) als de lichte (L) keten van het immunoglobuline [11](#page=11) [3](#page=3). #### 4.1.1 Variabiliteit en specificiteit De specificiteit van de antigeenbinding wordt voornamelijk bepaald door de variabiliteit van de aminozuursequenties in het V-deel (variabel deel) van zowel de zware als de lichte keten [3](#page=3). * **Hypervariabele regio's (CDR's):** In het variabele deel bevinden zich drie hypervariabele regio's, de zogenaamde complementarity determining regions (CDR's) [3](#page=3). * Bij de zware keten zijn dit CDR1 en CDR2, die afkomstig zijn uit het V-intron, en CDR3, die gevormd wordt door de herschikking van VDJ-segmenten (Variable, Diversity, Joining) [3](#page=3). * Bij de lichte keten worden CDR1, CDR2 en CDR3 gevormd door de herschikking van VJ-segmenten (Variable, Joining) [3](#page=3). * **Framework regions (FR's):** Tussen de CDR's bevinden zich de framework regions, die een relatief constante aminozuursequentie hebben en geen significante variabiliteit vertonen [3](#page=3). Het is belangrijk te weten dat niet het gehele Fab-deel bindt met het antigeen, maar voornamelijk de CDR's vormen de bindingsplaats [3](#page=3). #### 4.1.2 Diversiteit door gensegmentherschikking De uitdaging in het immuunsysteem is om met een beperkt aantal genen een enorme diversiteit aan antigeenreceptoren te kunnen genereren. Elke lymfocyt produceert ongeveer 100.000 identieke receptoren, wat resulteert in monospecificiteit door middel van allelexclusie. Om miljarden verschillende antigenen te kunnen herkennen, met een genoom dat 'slechts' 25.000 genen telt, maakt het immuunsysteem gebruik van gensegmentherschikking (ook wel V(D)J recombinatie genoemd) van gekoppelde genen vanuit de kiemlijnconfiguratie. Dit proces, bestaande uit recombinatie- en junctiediversiteit, creëert een potentiële specificiteit van circa $10^{12}$ verschillende antigeenreceptoren [4](#page=4). #### 4.1.3 Antigeenherkenning door Fab De Fab-regio (paratoop) is in staat om direct antigenen te herkennen zonder dat deze gepresenteerd hoeven te worden door een antigeenpresenterende cel, zoals bij T-celreceptoren. Het kan zowel lineaire (continue) als conformationele (discontinue) epitopen herkennen. De herkenning is niet beperkt tot specifieke molecuultypen; Fab kan interageren met eiwitten, koolhydraten, nucleïnezuren en lipiden. Daarnaast kan somatische hypermutatie bijdragen aan de affiniteitsmaturatie van de antilichamen [12](#page=12) [4](#page=4). > **Tip:** De diversiteit in de antigeenherkenning is een cruciaal aspect van het adaptieve immuunsysteem. Het begrijpen van gensegmentherschikking en de rol van CDR's is essentieel voor het begrijpen van de specificiteit van antilichamen. ### 4.2 Verschillen met T-celreceptoren Hoewel zowel immunoglobulinen (B-celreceptoren) als T-celreceptoren (TcR) gericht zijn op antigeenherkenning, zijn er belangrijke verschillen [4](#page=4): * **Antigeenpresentatie:** T-celreceptoren vereisen antigeenpresentatie door een antigeenpresenterende cel (APC), terwijl B-celreceptoren antigenen direct kunnen binden [4](#page=4). * **Epitopen:** T-celreceptoren herkennen uitsluitend lineaire epitopen [4](#page=4). * αβ-T-celreceptoren herkennen peptiden en lipiden [4](#page=4). * γδ-T-celreceptoren herkennen voornamelijk lipiden [4](#page=4). * **Somatische hypermutatie:** T-celreceptoren ondergaan geen somatische hypermutatie, wat resulteert in een minder dynamische affiniteitsmaturatie in vergelijking met B-cellen. Dit heeft ook gevolgen voor de herkenning van MHC-moleculen [4](#page=4). ### 4.3 Functionele onderverdeling van immunoglobulinen: Fab en Fc Immunoglobulinen kunnen functioneel worden onderverdeeld in twee hoofdregio's: de Fab-regio en de Fc-regio [3](#page=3). * **Fab (Fragment antigen-binding):** Dit deel is verantwoordelijk voor de specificiteit van de antigeenbinding en speelt een rol bij neutralisatie en het verhinderen van antigeenbinding. Het paratoop op de Fab-regio bindt aan het epitop op het antigeen [3](#page=3). * **Fc (Fragment crystallizable):** Dit is het constante deel van het antilichaam en is verantwoordelijk voor de biologische functies, zoals membraanbinding via Fc-receptoren, complementbinding, en transfer via placentaire overdracht. Het Fc-deel interageert met verschillende cellulaire componenten en triggers effectorfuncties van het immuunsysteem [3](#page=3) [4](#page=4). #### 4.3.1 Hinge regio's De hinge regio's, die zich bevinden tussen de CH1 en CH2 domeinen van de zware keten, fungeren als een soort elastiek, waardoor de Fab-armen flexibel zijn. Deze regio's zijn rijk aan proline en cysteïne, wat bijdraagt aan hun flexibiliteit en de vorming van disulfidebruggen. Sommige isotypes, zoals IgM en IgE, missen een duidelijke hinge regio, wat hun functionele eigenschappen beïnvloedt [4](#page=4). ### 4.4 Concepten gerelateerd aan antigeenbinding #### 4.4.1 Affiniteit en aviditeit * **Affiniteit:** Dit is de bindingssterkte tussen één paratoop van een antilichaam en één epitop van een antigeen. De affiniteit wordt bepaald door de som van de interacties van vier niet-covalente bindingen tussen het paratoop en epitop. Een hoge affiniteit betekent een sterke, specifieke binding [12](#page=12). * **Aviditeit:** Dit is de totale bindingssterkte tussen een antilichaam en een antigeen, die voortkomt uit de som van de affiniteiten van alle paratoop-epitop interacties. Antilichamen die multivalent zijn (meerdere paratopen) hebben een hogere aviditeit dan monovalente antilichamen [12](#page=12). #### 4.4.2 Kruisreactiviteit Kruisreactiviteit treedt op wanneer een antilichaam dat specifiek is voor een bepaald epitop op het ene antigeen, ook bindt aan een vergelijkbaar epitop op een ander antigeen. Dit kan een zwakke binding zijn met een lagere affiniteit, of in sommige gevallen een sterke binding [12](#page=12). > **Example:** Een antilichaam dat is gemaakt tegen antigeen Y kan kruisreageren met epitopen op zowel antigeen A als antigeen B als deze structureel vergelijkbaar zijn [12](#page=12). #### 4.4.3 Hapteen en carrier Haptenen zijn kleine moleculen die zelf geen immuunrespons kunnen uitlokken, maar wel een B-cel kunnen activeren wanneer ze gebonden zijn aan een groter eiwitmolecuul, de 'carrier' [12](#page=12). * Het mechanisme hierachter is dat de B-cel het hapteen gebonden aan de carrier herkent [12](#page=12). * De B-cel neemt het complex op en presenteert peptiden van de carrier aan T-cellen [12](#page=12). * De geactiveerde T-cel kan vervolgens de hapteen-specifieke B-cel 'boosten', wat leidt tot een effectievere immuunrespons. Het is belangrijk op te merken dat de T-cel specifiek is gericht tegen dragerspecifieke peptiden, die kunnen afwijken van het oorspronkelijke hapteen. Albumine is een belangrijke carrier [12](#page=12). > **Example:** Medicijnen die klein zijn (haptenen) kunnen een immuunrespons uitlokken door te binden aan lichaamseigen eiwitten (carriers), wat leidt tot een auto-immuunreactie tegen het medicijn-carrier complex. ### 4.5 Samenvatting van kernconcepten * Immunoglobulinen (Ig) zijn eiwitten geproduceerd door B-cellen en plasmacellen [12](#page=12). * Specificiteit voor antigeenherkenning ligt in de Fab-regio (paratoop) [12](#page=12). * De biologische functie van antilichamen wordt voornamelijk bepaald door de Fc-regio, vaak afhankelijk van Fc-receptoren [12](#page=12). * Grote variabiliteit in antigeenherkenning wordt bereikt door gensegmentherschikking, gecombineerd met mutaties en junctiediversiteit [12](#page=12). * Affiniteitsmaturatie, het proces waarbij de bindingssterkte van antilichamen toeneemt, is gerelateerd aan (hyper)mutaties [12](#page=12). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Immunoglobulinen | Glycoproteïnen geproduceerd door B-cellen en plasmacellen, die een cruciale rol spelen in het immuunsysteem door het herkennen en neutraliseren van antigenen. Ze staan ook bekend als antistoffen of antilichamen. | | Glycoproteïnen | Moleculen bestaande uit een eiwitgedeelte en een koolhydraatgedeelte, die een breed scala aan biologische functies hebben, waaronder die van immunoglobulinen. | | Polypeptiden | Lange ketens van aminozuren die de eiwitcomponent van glycoproteïnen vormen en essentieel zijn voor de structuur en functie van immunoglobulinen. | | Papaïne | Een enzym dat wordt gebruikt om immunoglobulinen te verteren, wat resulteert in de vorming van twee Fab-fragmenten en één Fc-fragment, wat helpt bij het bestuderen van hun structuur en functie. | | Pepsine | Een ander enzym dat gebruikt kan worden voor de vertering van immunoglobulinen, wat leidt tot F(ab’)2-fragmenten en een volledig afgebroken Fc-gedeelte, wat inzicht geeft in de stabiliteit van verschillende delen. | | Fab-fractie | Het antigeenbindende deel van een immunoglobuline, bestaande uit delen van zowel de zware als de lichte keten, verantwoordelijk voor de specificiteit van de antigeenherkenning. | | Fc-fractie | Het constante, kristalliseerbare deel van een immunoglobuline, dat belangrijke biologische functies uitvoert, zoals het binden aan celreceptoren, complementactivatie en transfer door barrières. | | Ig-superfamilie | Een grote en diverse groep eiwitten die een gemeenschappelijke immunoglobuline-domeinstructuur delen, waaronder immunoglobulinen zelf, T-celreceptoren, MHC-moleculen en diverse celreceptoren en co-stimulatoren. | | Isotypen | Verschillende klassen van immunoglobulinen (IgM, IgG, IgA, IgD, IgE) die worden gedefinieerd door variaties in de constante regio van de zware keten (Fc-gedeelte) en die verschillende biologische functies hebben. | | Subklassen | Verdere onderverdelingen binnen de hoofdklassen van immunoglobulinen, zoals de vier subklassen van IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) en twee subklassen van IgA (IgA1, IgA2), die subtiele verschillen in structuur en functie vertonen. | | Allotypen | Genetische varianten van immunoglobulinen binnen een bepaalde soort, aanwezig op de H- of L-ketens, die kunnen worden gedetecteerd met specifieke antistoffen en die worden gebruikt voor genetisch onderzoek. | | Idiotypen | Unieke antigeenbindende kenmerken van een individueel immunoglobuline molecuul, bepaald door de variabele regio's van de zware en lichte ketens, die een specifieke determinant vormen voor dat specifieke antilichaam. | | Monomeer | Een immunoglobuline-eenheid die uit één enkele Y-vormige structuur bestaat, zoals IgG, IgE en IgD. Membraangebonden IgM is ook monomeer. | | Polymeer | Een immunoglobuline-structuur die bestaat uit meerdere eenheden, zoals de dimeer van secretoir IgA (sIgA) en het pentameer van IgM, wat resulteert in een verhoogd aantal antigenbindende plaatsen. | | J-keten (junctie keten) | Een eiwit dat essentieel is voor de assemblage van polymere immunoglobulinen, met name IgM en IgA, door disulfidebruggen te vormen en te binden aan de secretoire component. | | Secretoire component | Een eiwit dat wordt gesynthetiseerd door epitheelcellen en dat dimere IgA en pentamerische IgM omhult om ze te beschermen tegen proteolytische afbraak in secreties, zoals speeksel, tranen en moedermelk. | | Fab-fragment | De twee armen van de Y-vormige immunoglobuline-structuur, elk met een antigenbindend oppervlak, die de specificiteit van het antilichaam bepalen. | | Fc-receptor (FcR) | Receptoren op de oppervlakte van immuuncellen en sommige somatische cellen die specifiek binden aan het Fc-gedeelte van immunoglobulinen, waardoor celactivatie en fagocytose worden geïnitieerd. | | Complementactivatie | Een proces waarbij het complementsysteem, een reeks eiwitten in het bloed, wordt geactiveerd door de binding van immunoglobulinen aan antigenen, wat leidt tot de eliminatie van pathogenen door lysering, opsonisatie en ontsteking. | | Opsonisatie | Het proces waarbij pathogenen worden bedekt met moleculen zoals antistoffen en complementcomponenten, wat de herkenning en fagocytose door immuuncellen vergemakkelijkt. | | ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) | Een mechanisme waarbij immuuncellen, zoals NK-cellen, geactiveerd worden door antistoffen die gebonden zijn aan doelcellen, wat leidt tot de cytotoxiciteit van deze doelcellen. | | Neonatale Fc receptor (FcRn) | Een receptor die essentieel is voor de transfer van immunoglobulinen (vooral IgG) van de moeder naar de foetus via de placenta en in de pasgeboren periode, waardoor passieve immuniteit wordt geboden. | | Gensegmentherschikking | Een genetisch proces dat plaatsvindt tijdens de ontwikkeling van B-cellen en T-cellen, waarbij verschillende DNA-segmenten worden gecombineerd om een grote diversiteit aan antigeenreceptoren te creëren. | | CDR (Complementarity Determining Regions) | De hypervariabele regio's binnen de variabele domeinen van de zware en lichte ketens van immunoglobulinen en T-celreceptoren, die direct de antigeenbindingsplaats vormen en zeer divers zijn. | | Somatische hypermutatie | Een proces dat optreedt na de initiële activatie van B-cellen, waarbij mutaties worden geïntroduceerd in de variabele regio's van de immunoglobuline-genen, wat leidt tot verbeterde affiniteit van de antistoffen voor het antigeen. | | Affiniteit | De bindingssterkte tussen één enkele antigeenbindende plaats van een antilichaam (paratoop) en een epitoop van een antigeen. | | Aviditeit | De totale bindingssterkte tussen een antilichaam en een antigeen, die het gevolg is van de som van de affiniteiten van alle individuele interacties tussen paratopen en epitopen. | | Immuuncomplexen | Complexen die worden gevormd wanneer antigenen en antilichamen in gelijke mate aanwezig zijn en aan elkaar binden, wat kan leiden tot de depositie ervan en ontsteking. | | Kruisreactiviteit | De capaciteit van een antilichaam om te binden aan antigenen die structureel vergelijkbaar zijn met het oorspronkelijke antigeen waarvoor het is gegenereerd. | | Hapteen | Een klein molecuul dat op zichzelf geen immuunrespons kan opwekken, maar dat, wanneer gebonden aan een drager (carrier), de productie van antistoffen tegen zowel de drager als de hapteen kan stimuleren. | | Carrier | Een groter molecuul, meestal een eiwit, waaraan een hapteen is gebonden, waardoor een immuunrespons kan worden opgewekt tegen het hapteen-dragercomplex. | | Kiemcentrum | Structuren in secundaire lymfoïde organen waar B-cellen prolifereren, muteren en affiniteitsrijping ondergaan, wat leidt tot de vorming van geheugen B-cellen en langlevende plasmacellen. | | Isotypeswitch | Een proces waarbij B-cellen hun productie van het ene immunoglobuline isotype (bv. IgM) kunnen veranderen naar een ander isotype (bv. IgG, IgA, IgE) door herrangschikking van genen in de constante regio van de zware keten. | | Plasmacel | Een gespecialiseerde, effector B-cel die grote hoeveelheden antistoffen produceert en secerneert. | | Geheugencel | Een langlevend B-cel die is gegenereerd na een primaire immuunrespons en die snel kan reageren bij herhaalde blootstelling aan hetzelfde antigeen, wat resulteert in een snellere en sterkere secundaire respons. |

# Principes van het adaptieve immuunsysteem Hier is een gedetailleerde studiehandleiding over de principes van het adaptieve immuunsysteem, gebaseerd op de verstrekte documentatie: ## 1. Principes van het adaptieve immuunsysteem Het adaptieve immuunsysteem is een gespecialiseerd en traag reagerend verdedigingsmechanisme dat wordt gekenmerkt door geheugenvorming en een enorme specificiteit in de herkenning van pathogenen. ### 1.1 Kenmerken van aangeboren en adaptieve immuniteit Het immuunsysteem kan worden onderverdeeld in twee hoofdcategorieën: * **Aangeboren immuunsysteem (innate IS):** * **Kenmerken:** Snel, herkent algemene moleculaire patronen zoals DAMPs (Damage-Associated Molecular Patterns) en PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns), en mist geheugen. * **Rol:** Geeft signalen (cytokines en costimulator expressie) die de activatie van het adaptieve immuunsysteem initiëren en de effectorfuncties ervan optimaliseren, zoals fagocytose en complementactivatie. * **Adaptief (specifiek) immuunsysteem:** * **Kenmerken:** Langzamere eerste respons (ongeveer een week), maar vormt geheugen voor toekomstige blootstelling. Bezit een vrijwel onbeperkt repertoire aan specificiteiten. * **Werking:** Optimaliseert de effector mechanismen van het aangeboren immuunsysteem. ### 1.2 De rol van de aangeboren immuniteit bij het initiëren van adaptieve responsen Het aangeboren immuunsysteem speelt een cruciale rol bij het opstarten van een adaptieve immuunrespons. Cellen van het aangeboren immuunsysteem, zoals macrofagen, herkennen pathogenen en brengen via ontstekingsreacties signalen over. Deze signalen omvatten de productie van cytokines en de expressie van membraan-costimulatoren, die essentieel zijn voor de activatie van B- en T-cellen. ### 1.3 Celactivatie en de lymfocytenreceptor repertoire Een fundamenteel principe van het adaptieve immuunsysteem is de manier waarop lymfocyten (B- en T-cellen) pathogenen herkennen. * **Verschil aangeboren en adaptief:** * **Aangeboren immuuncellen:** Elke cel kan meerdere receptoren met verschillende specificiteiten tot expressie brengen. * **Adaptieve immuuncellen:** Elke cel brengt meerdere receptoren van **dezelfde** specificiteit tot expressie. De specificiteit van elke lymfocyt is uniek en behoort tot het *lymfo-cytenrepertoire*. * **Genereren van receptorenspecificiteit:** De enorme diversiteit aan receptoren (biljoenen verschillende) wordt gegenereerd door genetische herschikking (genherschikking) van genfragmenten. Dit proces wordt ondersteund door de RAG (Recombination-Activating Genes) eiwitten, die DNA knippen en verbinden. * **V(D)J recombinatie:** Bij B-cellen en T-cellen worden de variabele domeinen van hun receptoren gevormd door de combinatie van V (Variable), D (Diversity) en J (Joining) gensegmenten. * **Junctionele diversiteit:** Extra variabiliteit wordt toegevoegd door het willekeurig toevoegen (door TdT - terminal deoxynucleotidyl transferase) of verwijderen van nucleotiden (P- en N-nucleotiden) tijdens de junctionele recombinatie. Dit proces is met name belangrijker voor T-cellen. * **Combinatorische diversiteit:** De willekeurige combinatie van verschillende V-, D-, en J-segmenten, evenals de combinatie van lichte en zware ketens (bij Ig) of alfa- en bèta-ketens (bij TCR), draagt bij aan de diversiteit. * **Selectieprocessen:** Om te zorgen dat het immuunsysteem alleen nuttige receptoren heeft en niet gericht is tegen eigen lichaamseigen structuren (auto-reactiviteit), vinden er selectieprocessen plaats: * **Positieve selectie:** Geselecteerde receptoren die bruikbaar zijn (bv. T-cellen in de thymus, B-cellen in de lymfeknopen). * **Negatieve selectie:** Auto-reactieve receptoren die schadelijk kunnen zijn, worden verwijderd (bv. T-cellen in de thymus, B-cellen in beenmerg en lymfeknopen). ### 1.4 Geheugenvorming Na de eerste blootstelling aan een pathogeen, prolifereren de specifieke B- en T-cellen en differentiëren ze tot effectorcellen. Een klein deel van deze cellen overleeft en wordt geheugencel. * **Geheugencellen:** Deze cellen hebben dezelfde receptor specificiteit als de oorspronkelijke geactiveerde cellen, maar blijven langdurig aanwezig. Bij een volgende blootstelling aan hetzelfde pathogeen zorgen deze geheugencellen voor een snellere en sterkere immuunrespons. ### 1.5 Vergelijking met aangeboren immuunresponsen * **Snelheid:** Aangeboren respons is direct, adaptieve respons is traag bij eerste contact. * **Specificiteit:** Aangeboren herkent PAMPS/DAMPS, adaptief herkent specifieke antigenen (epitopen). * **Geheugen:** Aangeboren heeft geen geheugen, adaptief wel. * **Celcomponenten:** Aangeboren maakt gebruik van neutrofielen, macrofagen, NK-cellen. Adaptief maakt gebruik van specifieke B- en T-lymfocyten. ### 1.6 De rol van RAG en transposable elements De RAG-genen, die cruciaal zijn voor de genherschikking bij B- en T-cellen, zijn waarschijnlijk geëvolueerd uit een transposon (een 'springend gen'). Transposons kunnen zichzelf verplaatsen en in het genoom inbouwen. De Rearrangement Signal Sequences (RSS) zijn afgeleid van de DNA-sequenties waarmee het transposon bindt. > **Tip:** Het begrijpen van de genetische mechanismen achter de diversiteit van B- en T-celreceptoren is fundamenteel voor het begrijpen van vaccins, kankertherapie en passieve immunisatie. ### 1.7 Immuunglobulinen (Ig) en de B-celreceptor (BCR) * **Definitie:** Immuunglobulinen (Ig) zijn eiwitten die in twee vormen voorkomen: * **Membraan-gebonden:** Dit vormt de B-celreceptor (BCR) op het oppervlak van B-cellen. Elke B-cel produceert Ig van één specifieke antigeen-binding. * **Gesecreteerd:** In de vorm van antilichamen (Ab) geproduceerd door plasmacellen na terminale differentiatie. Deze antilichamen hebben dezelfde antigeen-specificiteit als de BCR van de voorlopercel. * **Functies van antilichamen:** * **Antigeenbinding:** De variabele regio's van het antilichaam binden aan specifieke moleculen van pathogenen (epitopen). * **Recrutering van immuuncellen en moleculen:** De constante regio (Fc-regio) interageert met andere immuuncomponenten (bv. fagocyten, complement) om het pathogeen te elimineren. * **Functies van de BCR:** Bindt aan antigenen via de V-regio, wat leidt tot B-celactivatie. De C-regio is transmembranair en speelt een rol in signaaltransductie via geassocieerde Ig$\alpha$/Ig$\beta$ eiwitten. ### 1.8 Structuur van antilichamen Antilichamen hebben een karakteristieke Y-vormige structuur, bestaande uit: * **Twee zware ketens (Heavy chains, H):** Bepalen het isotype van het antilichaam (IgM, IgD, IgG, IgA, IgE). * **Twee lichte ketens (Light chains, L):** Komen voor in twee isotypes: lambda ($\lambda$) en kappa ($\kappa$). * **Ig-domeinen:** Zowel zware als lichte ketens zijn opgebouwd uit meerdere Ig-domeinen (ongeveer 110 aminozuren elk). * **Variabele (V) domeinen:** Het eerste domein van zowel de lichte (V$_L$) als de zware (V$_H$) keten bevat de variabele regio's die verantwoordelijk zijn voor antigeenbinding. * **Constante (C) domeinen:** De overige domeinen hebben een relatief constante sequentie en bepalen de effectorfunctie en het isotype. #### 1.8.1 Variabele regio De variabele regio is opgebouwd uit: * **Hypervariabele regio's (HV regio's):** Korte, zeer variabele segmenten (ongeveer 10 aminozuren lang), ook wel **complementary-determining regions (CDRs)** genoemd. Er zijn drie HV/CDR regio's op de lichte keten en drie op de zware keten. Deze 6 CDRs vormen gezamenlijk de antigeenbindingsplaats en bepalen de specificiteit voor het epitoop. * **Framework regio's (FR regio's):** Minder variabele regio's die de HV/CDR regio's ondersteunen en structureren. #### 1.8.2 Epitopen Een antilichaam kan slechts een klein specifiek deel van een macromolecuul herkennen, een **antigeen determinant** of **epitoop**. * **Soorten epitopen:** * **Conformationeel (discontinu):** Bestaat uit aminozuren die in de lineaire sequentie ver uit elkaar liggen, maar door de 3D-structuur van het eiwit dicht bij elkaar komen. * **Lineair (continu):** Bestaat uit een aaneengesloten segment van de polypeptideketen. #### 1.8.3 Antilichaam-antigeen interactie * **Specificiteit:** Bepaald door de complementaire vorm van de antigeenbindingsplaats aan het epitoop. * **Affiniteit:** De bindingssterkte van een enkele bindingsplaats aan het epitoop, bepaald door niet-covalente interacties (elektrostatische krachten, waterstofbruggen, van der Waalskrachten, hydrofobe interacties). * **Aviditeit:** De totale bindingssterkte van een multivalent antilichaam (bv. IgM-pentameer of IgA-dimeer) aan een multivalent antigeen. #### 1.8.4 Isotypen van antilichamen De constante regio van de zware keten bepaalt het isotype: * **IgM:** Vaak de eerste antistof geproduceerd, essentieel voor de initiële respons. Wordt gesecreteerd als een pentameer. * **IgD:** Voornamelijk aanwezig op het oppervlak van naïeve B-cellen, functie nog niet volledig opgehelderd. * **IgG:** Het meest voorkomende isotype in het bloed en weefsels, essentieel voor de secundaire respons. Kan transplacentair passeren. Heeft vier subklassen bij de mens (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). * **IgA:** Belangrijk voor bescherming op slijmvliezen (speeksel, tranen, moedermelk), meestal gesecreteerd als een dimeer. * **IgE:** Betrokken bij allergische reacties en bescherming tegen parasieten. #### 1.8.5 Polymerisatie van IgM en IgA * **IgM en IgA:** Kunnen polymeriseren (bv. IgM als pentameer, IgA als dimeer) door middel van disulfidebruggen en de J-keten. * **Voordeel polymerisatie:** Verhoogt de aviditeit, wat belangrijk is voor de effectieve binding aan meervoudige epitopen op pathogenen. ### 1.9 Functie van antilichamen De constante (Fc) regio van antilichamen is cruciaal voor de effectorfuncties: 1. **Interactie met Fc-receptoren (FcR):** * FcR$\gamma$: Activeert fagocytose door macrofagen en neutrofielen. * FcR$\epsilon$: Activeert mestcellen en basofielen (belangrijk bij allergieën). 2. **Interactie met complement:** Activeert de complementcascade, wat leidt tot lysis van pathogenen en opsonisatie. 3. **Distributie door het lichaam:** * IgA: Belangrijk in secreties (slijmvliezen). * IgG: Kan via de placenta worden getransporteerd naar de foetus, wat passieve immuniteit biedt. > **Voorbeeld:** Sommige bacteriën, zoals *Staphylococcus aureus* (met proteïne A) en *Haemophilus influenzae* (met proteïne D), hebben manieren ontwikkeld om de Fc-functie van antilichamen te neutraliseren. ### 1.10 De B-cel receptor (BCR) en signaaltransductie De BCR, bestaande uit membraangebonden Ig en de Ig$\alpha$/Ig$\beta$ signaaleiwitten, is verantwoordelijk voor het herkennen van antigenen. Na binding van een antigeen aan de BCR, geven de cytoplasmatische staarten van Ig$\alpha$ en Ig$\beta$ signalen door aan het cytoplasma, wat leidt tot celactivatie. De Ig-moleculen zelf signaleren niet direct. ### 1.11 De T-cel receptor (TCR) De T-cel receptor (TCR) is essentieel voor cellulaire immuniteit. * **Structuur:** Een heterodimeer, meestal bestaande uit een $\alpha$- en een $\beta$-keten (TCR$\alpha\beta$), of een $\gamma$- en een $\delta$-keten (TCR$\gamma\delta$). Elke T-cel heeft identieke TCRs op zijn oppervlak. * **Signaaltransductie:** Net als de BCR, signaleren de TCR-ketens niet zelf. Ze zijn geassocieerd met het CD3-complex, dat de signaaloverdracht naar het cytoplasma verzorgt na antigeenbinding. * **TCR vs. Ig:** * **Verschillen:** TCRs worden niet gesecreteerd, kennen geen isotype switch, en ondergaan geen somatische hypermutatie zoals Ig. * **Overeenkomsten:** Beide gebruiken RAG-gemedieerde genherschikking en junctionele diversiteit voor het genereren van repertoire. > **Belangrijk:** B-cellen en hun antilichamen herkennen intacte (native) eiwitten en suikers, terwijl T-cellen (via hun TCR) alleen peptidefragmenten herkennen die gepresenteerd worden door MHC-moleculen. ### 1.12 Antigen-presentatie en MHC (Major Histocompatibility Complex) T-cellen kunnen antigenen alleen herkennen wanneer deze gepresenteerd worden door gespecialiseerde moleculen op het celoppervlak: de Major Histocompatibility Complex (MHC) moleculen. Bij mensen wordt dit het Human Leukocyte Antigen (HLA) complex genoemd. * **Twee klassen MHC-moleculen:** * **MHC klasse I:** Gevonden op vrijwel alle kernhoudende cellen. Presenteert peptiden afkomstig uit het cytoplasma van de cel (bv. virale eiwitten, tumor-antigenen) aan CD8+ T-cellen (cytotoxische T-cellen). * **MHC klasse II:** Normaal gesproken alleen aanwezig op gespecialiseerde antigeenpresenterende cellen (APC's) zoals dendritische cellen, macrofagen en B-cellen. Presenteert peptiden afkomstig uit extracellulaire pathogenen of eiwitten die door fagocytose zijn opgenomen, aan CD4+ T-cellen (helper T-cellen). * **MHC-polymorfisme:** Het MHC-locus is extreem polymorf (veel verschillende allelen in de populatie). Dit zorgt ervoor dat de menselijke populatie een breed scala aan pathogenen kan herkennen en bestrijden. Elk individu erft twee sets HLA-genen (haplotypen) van zijn ouders. * **Antigeenprocessing en -presentatie:** * **Klasse I pathway:** Cytoplasmatische eiwitten worden afgebroken door het proteasoom tot peptiden. Deze peptiden worden via de TAP-transporter (Transporters Associated with Antigen Processing) naar het endoplasmatisch reticulum getransporteerd, waar ze binden aan nieuw gesynthetiseerde MHC klasse I moleculen. Het complex wordt vervolgens naar het celoppervlak getransporteerd. * **Klasse II pathway:** Extracellulaire antigenen worden opgenomen via endocytose en afgebroken in endosomen/lysosomen. MHC klasse II moleculen worden gevormd in het ER en reizen via het Golgi naar endosomen. Daar bindt het peptide aan de MHC klasse II groeve nadat de invariante keten (CLIP) is verwijderd. Het complex wordt daarna naar het celoppervlak getransporteerd. > **Cross-presentation:** Een uitzonderlijk proces waarbij dendritische cellen extracellulaire antigenen kunnen presenteren via MHC klasse I moleculen, wat leidt tot een CD8+ T-celrespons zonder dat de cel zelf geïnfecteerd is. ### 1.13 Alloreactiviteit en auto-immuniteit * **Alloreactiviteit:** Een immuunrespons van een individu tegen MHC-moleculen van een ander individu (bv. bij orgaantransplantatie). Dit is een zeer krachtige respons, omdat vreemde MHC-moleculen een breed scala aan 'vreemde' peptiden kunnen presenteren. * **Auto-immuniteit:** Wanneer het adaptieve immuunsysteem, door falen van de negatieve selectie of door omgevingsfactoren, lichaamseigen structuren (antigenen) aanvalt. HLA-genen spelen een significante rol in de genetische predispositie voor auto-immuunziekten. > **Verband MHC en Auto-immuniteit:** Specifieke HLA-allelen kunnen de presentatie van lichaamseigen peptiden op een manier beïnvloeden die leidt tot een auto-immuunrespons. Dit kan bijvoorbeeld komen door de binding van bepaalde peptiden in de MHC-groeve, wat T-celactivatie induceert. ### 1.14 Genereren van miljarden verschillende receptoren (T en B) De enorme diversiteit van de B- en T-celreceptoren wordt bereikt door een combinatie van processen: 1. **Combinatorische diversiteit:** Verschillende V, D, en J segmenten worden gecombineerd. 2. **Junctionele diversiteit:** Toevoeging van P- en N-nucleotiden aan de V-J/V-D-J juncties. 3. **Somatische hypermutatie (SHM):** Een proces dat optreedt in rijpe, geactiveerde B-cellen tijdens een immuunrespons. Dit leidt tot accumulatie van puntmutaties in de variabele regio's van de Ig-genen, wat resulteert in affiniteitsmaturatie (verfijning van de antigeenbindingsaffiniteit). Dit proces wordt gemedieerd door het AID (Activation-Induced Cytidine Deaminase) enzym. > **Belangrijk:** Na het verkrijgen van hun initiële receptorepertoire door V(D)J recombinatie, zijn naïeve B- en T-cellen uniek. Geheugencellen zijn uitgroei van een enkele cel en vormen dus populaties van identieke cellen met zeer specifieke receptoren. --- # Structuur en functie van immunoglobulines (antilichamen) Oké, hier is een gedetailleerd studieoverzicht over de structuur en functie van immunoglobulines (antilichamen), gebaseerd op de verstrekte documentatie. ## 2. Structuur en functie van immunoglobulines (antilichamen) Dit onderdeel belicht de structuur van antilichamen (Ig) en B-celreceptoren (BCR), inclusief de variabele en constante regio's, isotypes, en de mechanismen die leiden tot diversiteit van receptoren, evenals de functies van antilichamen. ### 2.1 Inleiding tot immunoglobulines Immunoglobulines (Ig) zijn eiwitten die een cruciale rol spelen in het adaptieve immuunsysteem. Ze kunnen membraangebonden voorkomen op B-cellen, waar ze fungeren als de B-celreceptor (BCR), of gesecreteerd worden door plasmacellen als antilichamen (Ab). Elk van deze vormen heeft een specifieke antigeenbindingsspecificiteit. Antilichamen herkennen macromoleculen, meestal eiwitten of koolhydraten, op pathogenen en markeren deze voor vernietiging. ### 2.2 Structuur van immunoglobulines Immunoglobulines hebben over het algemeen een karakteristieke Y-vormige structuur, bestaande uit zware (H) en lichte (L) ketens die door disulfidebruggen aan elkaar zijn gekoppeld. De structuur kan worden opgedeeld in verschillende regio's: * **Zware (H) ketens:** Er zijn vijf types zware ketens ($\mu$, $\delta$, $\gamma$, $\alpha$, $\epsilon$), die elk corresponderen met een immunoglobulineklasse of isotype (IgM, IgD, IgG, IgA, IgE). Deze ketens bepalen voor een groot deel de functie van het antilichaam. Het menselijke IgG kan verder onderverdeeld worden in vier subklassen: IgG1, IgG2, IgG3 en IgG4, met functionele verschillen die voortkomen uit variaties in hun constante regio. * **Lichte (L) ketens:** Er zijn twee isotypes van lichte ketens: lambda ($\lambda$) en kappa ($\kappa$). Er is geen functioneel verschil tussen deze twee. De ratio van $\kappa$/$\lambda$ ketens bij een gezond mens is ongeveer 2:1. * **Ig-domeinen:** Zowel de zware als de lichte ketens zijn opgebouwd uit een aantal gelijkaardige sequenties die bekend staan als Ig-domeinen. Dit zijn stabiele eiwitstructuren die zelfs onder extreme omstandigheden functioneel blijven. * **Variabele (V) domeinen:** De variabiliteit in sequentie is voornamelijk geconcentreerd in het eerste Ig-domein van zowel de lichte (V$_L$) als de zware (V$_H$) keten. Deze regio's zijn verantwoordelijk voor de antigeenbinding. * **Constante (C) domeinen:** De overige Ig-domeinen vertonen weinig variatie en vormen de constante regio's (C$_L$ en C$_H$). Deze domeinen zijn betrokken bij de effectorfuncties van het antilichaam. * **Hypervariabele regio's (HV-regio's):** Binnen de variabele domeinen bevinden zich drie zeer variabele lussen, de HV-regio's (elk ongeveer 10 aminozuren). De meest variabele is HV3. Deze drie HV-regio's van de lichte keten en de drie HV-regio's van de zware keten liggen dicht bij elkaar en vormen de antigeenbindingsplaats. * **Complementaire-determinerende regio's (CDR):** De HV-regio's worden ook wel CDR's genoemd (Complementarity-Determining Regions). Ze bepalen de antigeenspecificiteit door een oppervlak te vormen dat complementair is aan het epitoop van het antigeen. Een antilichaam omvat dus zes CDR's (drie van de lichte en drie van de zware keten) die samen het epitoop binden. * **Framework regio's (FR):** De minder variabele delen van de variabele domeinen, die de structuur van de HV-regio's ondersteunen, worden framework regio's genoemd. ### 2.3 Antigeenbinding en epitoop Een antilichaam herkent slechts een klein, specifiek oppervlak van een macromolecuul, het zogenaamde antigene determinant of epitoop. Een antigeen kan meerdere epitopen dragen, waardoor verschillende antilichamen eraan kunnen binden. Er zijn twee soorten epitopen: * **Conformationeel of discontinu epitoop:** Gevormd door aminozuursequenties die in de primaire structuur ver van elkaar liggen, maar door de driedimensionale vouwing van het eiwit dicht bij elkaar komen. * **Lineair of continu epitoop:** Bestaat uit een aaneengesloten segment van de polypeptideketen. De interactie tussen antilichaam en antigeen is gebaseerd op oppervlaktecomplementariteit en wordt gestuurd door niet-covalente bindingen zoals elektrostatische krachten, waterstofbruggen, van der Waalskrachten en hydrofobe interacties. Deze interactie is omkeerbaar. Hoge zoutconcentraties, extreme pH-waarden of hoge epitoopconcentraties kunnen de binding verbreken. Lineaire epitopen op eiwitten zijn doorgaans ongeveer 6 aminozuren groot. Haptenen, zoals penicilline, kunnen een deel van een epitoop vormen en aan een antistof binden, maar kunnen zonder een dragereiwit geen immuunrespons opwekken. ### 2.4 Polymerisatie van immunoglobulines Sommige immunoglobulines, met name IgM en IgA, kunnen polymeriseren. * **IgM:** Wordt gesecereteerd als een pentameer, waarbij vijf monomeren met elkaar verbonden zijn via disulfidebruggen in het staartstuk en een J-keten. De polymerisatie zorgt voor een verhoogde aviditeit (totale bindingssterkte van een antilichaammolecuul) en is cruciaal voor de herkenning van repetitieve epitopen. Door zijn grote omvang is IgM voornamelijk beperkt tot het bloed. * **IgA:** Kan dimeren vormen, wat essentieel is voor transport door epitheelcellen en aanwezigheid in secreties zoals slijm, tranen en moedermelk. Monomeer IgA komt in de bloedbaan en weefsels terecht. ### 2.5 Functies van antilichamen Antilichamen hebben twee hoofdfuncties: 1. **Antigeenbinding (via V-domein):** De variabele domeinen binden specifiek aan pathogenen of vreemde moleculen. Dit domein is verantwoordelijk voor de enorme diversiteit van antilichamen. 2. **Effectorfuncties (via C-domein):** De constante domeinen van de zware ketens (Fc-regio) zijn betrokken bij het rekruteren van andere immuuncomponenten en het activeren van specifieke cel- en moleculaire mechanismen. De effectorfuncties van de vijf isotypen, en de vier subklassen van IgG en twee van IgA, zijn specifiek. Belangrijke effectorfuncties zijn: * **Interactie met Fc-receptoren (FcR):** Fc-receptoren op fagocyten (zoals macrofagen) herkennen het Fc-deel van antilichamen die aan pathogenen gebonden zijn, wat leidt tot fagocytose. Fc$\epsilon$R op mestcellen en basofielen kan leiden tot degranulatie. * **Interactie met het complementsysteem:** Het Fc-deel kan complementfactoren activeren, wat een cascade van reacties initieert met diverse effecten, waaronder lysis van pathogenen en opsonisatie. * **Specifieke verdeling:** Het Fc-deel bepaalt de verdeling van antilichamen over het lichaam. Zo wordt IgA actief getransporteerd naar slijmvliezen en melk, terwijl IgG transplacentair kan worden overgedragen. Pathogenen hebben mechanismen ontwikkeld om de effectorfuncties van antilichamen te ontwijken, bijvoorbeeld door eiwitten te produceren die het Fc-deel neutraliseren (zoals proteïne A en G van Staphylococcus spp.). ### 2.6 De B-celreceptor (BCR) De BCR op een naïeve B-cel is een membraangebonden immunoglobuline (meestal IgM en IgD) geassocieerd met de signaaltransductie-eiwitten Ig$\alpha$ en Ig$\beta$. De Ig-moleculen zelf signaleren niet; dit gebeurt via de cytoplasmatische staart van Ig$\alpha$ en Ig$\beta$ na antigeenbinding aan de BCR. Deze interactie leidt tot B-celactivatie. ### 2.7 Vergelijking tussen B-celreceptor (BCR) en T-celreceptor (TCR) | Kenmerk | B-celreceptor (BCR/Ig) | T-celreceptor (TCR) | | :------------------ | :------------------------------------------------------- | :------------------------------------------------------------ | | **Structuur** | Y-vormig, 2 H-ketens, 2 L-ketens | Heterodimeer, 2 ketens (bv. $\alpha\beta$ of $\gamma\delta$) | | **Antigeenherkenning** | Natieve eiwitten, suikers, lipiden (oppervlakte/extracellulair) | Peptidefragmenten gebonden aan MHC-moleculen (HLA-afhankelijk) | | **Effectorfunctie** | Humorale immuniteit; mediëren via gesecreteerde antilichamen | Cellulaire immuniteit; directe cel-cel interactie | | **Isotypes** | Ja (IgM, IgD, IgG, IgA, IgE) | Nee | | **Somatische Hypermutatie** | Ja | Nee | | **Gesecreteerd?** | Ja, als antilichaam door plasmacellen | Nee | | **Membraanassociatie** | Altijd membraangebonden op naïeve B-cellen | Altijd membraangebonden | | **Signaaltransductie** | Via Ig$\alpha$/Ig$\beta$ | Via CD3-complex | ### 2.8 Genereren van de diversiteit aan receptoren De enorme diversiteit van zowel B-celreceptoren (BCR) als T-celreceptoren (TCR) wordt gegenereerd door genetische mechanismen: * **Combinatoire diversiteit:** De variabele domeinen worden gecodeerd door meerdere gensegmenten (V, (D), J) die willekeurig worden gecombineerd tijdens de ontwikkeling van lymfocyten. * Lichte keten: V$_L$ + J$_L$ * Zware keten: V$_H$ + D$_H$ + J$_H$ * **Junctionele diversiteit:** Tijdens de recombinatie van de gensegmenten kunnen willekeurig nucleotiden worden toegevoegd (door TdT - terminal deoxynucleotidyl transferase) of verwijderd (door exonucleasen). Deze "P-" en "N-" nucleotiden creëren extra variabiliteit, met name in de CDR3-regio. Deze diversiteit is groter bij T-cellen dan bij B-cellen. * **Somatische hypermutatie (SHM):** Na activatie van B-cellen door antigeen kunnen de V-genen van de immunoglobulines verder worden gemuteerd. Dit proces, gemedieerd door AID (activation-induced cytidine deaminase), leidt tot affiniteitsmaturatie, waarbij B-cellen met receptoren die een hogere affiniteit voor het antigeen hebben, worden geselecteerd. SHM treedt niet op bij T-cellen. De RAG-1 en RAG-2 eiwitcomplexen zijn essentieel voor de V(D)J recombinatie; ze herkennen en knippen de Recombinatie Signaal Sequenties (RSS) die aan de V, D, en J gensegmenten grenzen. ### 2.9 Verandering van immunoglobuline isotype (Class Switch Recombination - CSR) B-cellen kunnen hun immunoglobuline-isotype veranderen zonder de antigeenbindingsspecificiteit te verliezen. Dit proces, CSR genoemd, wordt ook gemedieerd door AID. Tijdens CSR wordt DNA tussen specifieke switch-regio's verwijderd, waardoor een ander C$_H$ gen dichter bij het herschikte VDJ-segment komt te liggen. * Naïeve B-cellen, gevormd in het beenmerg en perifere naïeve B-cellen, drukken altijd IgM en IgD uit. * Na stimulatie en onder invloed van T-celcytokines kunnen B-cellen overschakelen naar IgG, IgA of IgE. Dit resulteert in geheugen B-cellen met een BCR van een ander isotype. CSR is een irreversibel proces. ### 2.10 Antigeenpresentatie en de T-celreceptor (TCR) T-cellen herkennen geen native eiwitten of suikers, maar peptidefragmenten die op het celoppervlak worden gepresenteerd in de context van MHC (Major Histocompatibility Complex) moleculen. Dit proces omvat antigeenverwerking en -presentatie. * **Antigeenverwerking:** Macromoleculen worden afgebroken tot peptidefragmenten. * **Antigeenpresentatie:** De peptidefragmenten worden gebonden aan MHC-moleculen en getransporteerd naar het celoppervlak. Er zijn twee belangrijke routes voor antigeenpresentatie: * **MHC klasse I-route:** Cytoplasmatische eiwitten (zoals virale eiwitten) worden afgebroken door het proteasoom. De peptiden worden via TAP (Transporters Associated with Antigen Processing) naar het endoplasmatisch reticulum getransporteerd, waar ze binden aan MHC klasse I-moleculen. Dit wordt herkend door CD8$^+$ T-cellen. * **MHC klasse II-route:** Extracellulaire antigenen die door fagocytose of pinocytose worden opgenomen, worden in endosomen of fagolysosomen afgebroken. De peptiden binden aan MHC klasse II-moleculen, die in het endosomale compartiment worden gevormd en via de invariante keten de binding van andere peptiden voorkomen tot ze op de juiste plaats zijn. Dit wordt herkend door CD4$^+$ T-cellen. **Cross-presentatie:** Sommige antigeenpresenterende cellen, zoals dendritische cellen, kunnen gefagocyteerde antigenen ook via de MHC klasse I-route presenteren, waardoor CD8$^+$ T-celresponsen kunnen worden opgewekt zonder dat de cel zelf geïnfecteerd is. De TCR zelf is niet-covalent geassocieerd met het CD3-complex, dat essentieel is voor signaaltransductie na antigeenbinding. De interactie tussen de TCR en het peptide-MHC-complex is MHC-geregistreerd, wat betekent dat de TCR is afgestemd op zowel specifieke peptiden als de MHC-moleculen die ze presenteren. ### 2.11 Major Histocompatibility Complex (MHC) / Human Leukocyte Antigen (HLA) Het MHC, bij mensen bekend als HLA (Human Leukocyte Antigen), is een groep genen die coderen voor eiwitten op het celoppervlak die cruciaal zijn voor immuunherkenning. * **Polymorfisme:** HLA-genen zijn extreem polymorf, wat betekent dat er veel verschillende allelen in de populatie voorkomen. Dit zorgt voor een grote diversiteit in de peptiden die door individuen kunnen worden gepresenteerd. * **Polygenie:** Elk individu heeft meerdere genen voor MHC klasse I (HLA-A, -B, -C) en klasse II (HLA-DP, -DQ, -DR). * **Expressie:** MHC klasse I moleculen worden op vrijwel alle lichaamscellen tot expressie gebracht, terwijl MHC klasse II moleculen voornamelijk worden gevonden op antigeenpresenterende cellen (APC's) zoals dendritische cellen, macrofagen en B-cellen. Interferon-gamma (IFN-$\gamma$) kan de expressie van beide klassen verhogen. * **Haplotypes:** HLA-genen worden in clusters op chromosoom 6 overgeërfd als haplotypes. Dit is belangrijk voor orgaandonatie; HLA-identieke broers en zussen hebben de grootste kans op succesvolle transplantatie. * **Peptidebinding:** De variaties in MHC-moleculen zijn geconcentreerd in de peptide-bindingsgroeve. Deze variaties bepalen welke peptiden door een bepaald MHC-molecuul kunnen worden gebonden en gepresenteerd. Dit is cruciaal voor de T-celherkenning en kan bijdragen aan auto-immuniteit en allo-reactiviteit. ### 2.12 Alloreactiviteit en Auto-immuniteit * **Alloreactiviteit:** T-cellen vertonen een sterke reactie tegen MHC-moleculen van andere individuen (allo-MHC). Dit komt doordat allo-MHC-moleculen een breed spectrum aan "vreemde" peptiden presenteren, wat leidt tot krachtige immuunresponsen die duizendmaal sterker kunnen zijn dan responsen tegen virale peptiden. Dit is de basis van afstotingsreacties na transplantatie. * **Auto-immuniteit:** Een genetische aanleg, met name geassocieerd met bepaalde HLA-allelen, kan leiden tot auto-immuunziekten. Dit kan gebeuren wanneer MHC-moleculen lichaamseigen peptiden presenteren die door T-cellen worden herkend als vreemd, of wanneer polymorfismen in MHC-moleculen de binding van bepaalde (gemodificeerde) lichaamseigen peptiden faciliteren, wat een auto-reactieve immuunrespons uitlokt. Genetische factoren zoals polymorfismen in PTPN22 en CTLA4 spelen ook een rol. --- # T-celreceptor (TCR) en MHC-moleculen Dit onderwerp beschrijft de structuur, functie en interactie van de T-celreceptor (TCR) en Major Histocompatibility Complex (MHC) moleculen, cruciaal voor cellulaire immuniteit en het onderscheid tussen eigen en vreemde cellen. ### 3.1 Principes van het adaptieve immuunsysteem Het adaptieve immuunsysteem onderscheidt zich van het aangeboren immuunsysteem door het vermogen tot geheugen en een zeer specifieke reactie, zij het met een tragere initiële respons. Het kenmerkt zich door klonale expansie van lymfocyten na pathogen-specifieke stimulatie, waarbij dochtercellen dezelfde receptor-specificiteit behouden. Een klein aantal hiervan differentieert tot langdurige geheugencellen. Het systeem genereert een enorm repertoire aan unieke lymfocytenreceptoren door middel van genherschikking, waarbij strenge selectieprocessen in de thymus en het beenmerg autoreactieve receptoren elimineren. ### 3.2 Structuur en functie van antilichamen (Immunoglobulinen) Immunoglobulinen (Ig) kunnen membraangebonden zijn als B-celreceptor (BCR) op B-cellen, of gesecreteerd worden door plasmacellen als antilichamen (Ab). Elke B-cel produceert Ig met een unieke specificiteit. Antilichamen binden pathogenen of hun componenten via de variabele regio (V-domein), en rekruteren immuuncellen of activeren het complementsysteem via de constante regio (C-domein). #### 3.2.1 Structuur van immunoglobulinen Een antilichaammolecuul heeft een Y-vormige structuur bestaande uit twee identieke zware ketens (H) en twee identieke lichte ketens (L), verbonden door disulfidebruggen. De zware ketens bepalen het isotype (IgM, IgD, IgG, IgA, IgE), terwijl de lichte ketens kappa ($\kappa$) of lambda ($\lambda$) kunnen zijn. Beide ketens zijn opgebouwd uit Ig-domeinen, waarvan het N-terminale domein (V) zeer variabel is en het antigen-bindingsplaats vormt (CDR's: Complementary Determining Regions), terwijl de C-domeinen relatief constant zijn en de effectorfuncties mediëren. #### 3.2.2 Epitopen en affiniteit Een antilichaam herkent een specifiek deel van een macromolecuul, het epitoop. Dit kan een conformationeel (discontinu) of lineair (continu) epitoop zijn. De interactie tussen antilichaam en antigeen is gebaseerd op oppervlaktecomplementariteit en niet-covalente bindingen, wat de affiniteit bepaalt. Polymerisatie van IgA en IgM, vaak met behulp van de J-keten, verhoogt de aviteit (totale bindingssterkte). ### 3.3 Functies van antilichamen De effectorfuncties van antilichamen worden gemedieerd door het C-domein (Fc-regio) en omvatten: 1. **Interactie met Fc-receptoren (FcR)** op immuuncellen, leidend tot fagocytose of activatie van mestcellen en basofielen. 2. **Activatie van het complementsysteem**. 3. **Specifieke distributie** door het lichaam, zoals transplacentaire transfer van IgG of secretie van IgA in mucosale secreties. Pathogenen zoals *Staphylococcus* en *Haemophilus* hebben mechanismen ontwikkeld om deze effectorfuncties te omzeilen. ### 3.4 De B- en T-celreceptor Net als Ig's, zijn BCR's membraangebonden en specifiek voor één antigeen. Ze signaleren intracellulair via geassocieerde eiwitten (Ig$\alpha$/Ig$\beta$). #### 3.4.1 T-celreceptor (TCR) De TCR is een membraangebonden heterodimeer, bestaande uit $\alpha$/$\beta$- of $\gamma$/$\delta$-ketens, die associeert met het CD3-complex voor signaaltransductie. De TCR is structureel vergelijkbaar met een Fab-fragment van een Ig, met variabele en constante domeinen. TCR's zijn MHC-gereguleerd en herkennen peptide-MHC complexen. De diversiteit van TCR's is groter dan die van BCR's door een grotere junctionele diversiteit. #### 3.4.2 TCR versus BCR | Kenmerk | B-celreceptor (BCR) / Ig | T-celreceptor (TCR) | | :---------------- | :------------------------------------------- | :------------------------------------------------ | | **Humorale immuniteit** | Ja | Nee | | **Cellulaire immuniteit** | Nee | Ja | | **Antigeen type** | Oppervlakte antigenen/extracellulair (suikers, eiwitten) | (Niet-)oppervlakte en extra-/intracellulair (enkel eiwitten) | | **Effectoren** | Macrofagen, neutrofielen, NK-cellen, complement | T-cellen | | **Behandeling bacteriën** | Genezend | Nee | | **Behandeling virussen** | Preventief (voor celintreding) | Genezend (intracellulaire bacteriën/virussen) | | **HLA-afhankelijk** | Nee | Ja | ### 3.5 Genereren van miljarden verschillende receptoren De enorme diversiteit van BCR's en TCR's ontstaat door combinatorische diversiteit (combinatie van V-(D)-J gensegmenten) en junctionele diversiteit (invoeging van P- en N-nucleotiden). Dit proces, gemedieerd door RAG-1 en RAG-2 enzymen, vindt plaats tijdens de differentiatie van B- en T-cellen. #### 3.5.1 V(D)J-recombinatie Tijdens de ontwikkeling van B- en T-cellen worden de genen die coderen voor de variabele regio's van Ig en TCR herschikt. Gensegmenten (V, D, J) worden geselecteerd en samengevoegd via Recombination Signal Sequences (RSS). De RAG-complexen maken DNA-breuken, waarna de cel eigen DNA-reparatiemechanismen (NHEJ) deze breuken herstellen. Junctionele diversiteit wordt gecreëerd door de willekeurige toevoeging van nucleotiden (N-nucleotiden door TdT) en palindromische sequenties (P-nucleotiden). #### 3.5.2 Somatische hypermutatie (SHM) Bij B-cellen die al de V(D)J-recombinatie hebben ondergaan, kan de variabiliteit verder worden vergroot door somatische hypermutatie (SHM). Dit proces, gemedieerd door Activation-Induced Cytidine Deaminase (AID), introduceert puntmutaties in de V-regio's, wat leidt tot affiniteitsmaturatie waarbij B-cellen met hogere affiniteit voor het antigeen worden geselecteerd. ### 3.6 Veranderen van Ig isotype en somatische hypermutatie B-cellen doorlopen initiële IgM/IgD expressie op naïeve cellen. Na activatie en onder invloed van T-cel cytokines kan isotype switching (CSR) plaatsvinden, waarbij het C-domein van de zware keten wordt veranderd om IgG, IgA of IgE te produceren. Dit proces, ook gemedieerd door AID, is onomkeerbaar. Geheugen B-cellen dragen een BCR van een na-geswitcht isotype. ### 3.7 Major Histocompatibility Complex (MHC) of HLA De Major Histocompatibility Complex (MHC) genen coderen voor eiwitten die cruciaal zijn voor antigenpresentatie aan T-cellen. Bij mensen staan deze bekend als Human Leukocyte Antigen (HLA) genen. Het MHC-complex op chromosoom 6 bevat klasse I (HLA-A, -B, -C), klasse II (HLA-DP, -DQ, -DR) en klasse III genen. #### 3.7.1 MHC klasse I en II moleculen * **MHC klasse I moleculen** worden op vrijwel alle lichaamscellen tot expressie gebracht en presenteren peptiden afkomstig uit het cytosol (bv. virale eiwitten) aan CD8+ T-cellen. Ze bestaan uit een polymorf $\alpha$-keten en een niet-polymorfe $\beta_2$-microglobuline. * **MHC klasse II moleculen** worden voornamelijk gepresenteerd op professionele antigeen-presenterende cellen (APC's) zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen. Ze presenteren peptiden afkomstig uit het extracellulaire milieu (bv. gefagocyteerde bacteriën) aan CD4+ T-cellen. Ze bestaan uit een polymorf $\alpha$-keten en een polymorf $\beta$-keten. #### 3.7.2 Polymorfisme en alloreactiviteit MHC-moleculen zijn extreem polymorf, met veel verschillende allelen in de populatie. Dit polymorfisme is geconcentreerd in de peptide-bindende groeve, wat de specificiteit van peptidebinding beïnvloedt. Dit leidt tot sterke alloreactiviteit, waarbij T-cellen vreemde MHC-moleculen (allo-MHC) kunnen herkennen, zelfs wanneer deze eigen peptiden presenteren. Dit is evolutionair gunstig omdat het de kans vergroot dat pathogenen door T-cellen herkend worden in een populatie. #### 3.7.3 Overerving HLA-genen worden samen overgeërfd als haplotypes. Een goede donor voor transplantatie is daarom vaak een HLA-identieke familielid (broer of zus). ### 3.8 Antigenpresentatie en herkenning door TCR T-cellen herkennen geen vrije antigenen, maar peptidefragmenten die door MHC-moleculen worden gepresenteerd. Dit proces omvat antigeenverwerking (degradatie van eiwitten) en presentatie op het celoppervlak. #### 3.8.1 Antigeenverwerking en presentatie * **MHC klasse I route**: Cytosolische eiwitten worden door het proteasoom afgebroken tot peptiden. Deze peptiden worden via TAP (Transporters Associated with Antigen Processing) naar het endoplasmatisch reticulum getransporteerd, waar ze binden aan MHC klasse I moleculen. * **MHC klasse II route**: Extracellulaire antigenen die via fagocytose of endocytose worden opgenomen, worden in zure endosomen en lysosomen verwerkt tot peptiden. Deze peptiden binden aan MHC klasse II moleculen, die via de invariante keten (die later wordt verwijderd als CLIP) worden beschermd totdat ze in de juiste omgeving komen. #### 3.8.2 TCR-MHC interactie De TCR herkent een complex van een peptide gebonden aan een MHC-molecuul. CD8 T-cellen herkennen peptiden op MHC klasse I, terwijl CD4 T-cellen peptiden op MHC klasse II herkennen. Dit principe verklaart de MHC-restrictie van T-celreacties. > **Tip:** Onthoud dat B-cellen/antilichamen native eiwitten en suikers herkennen, terwijl T-cellen peptidefragmenten in de context van MHC moleculen herkennen. #### 3.8.3 Cross-presentatie Een uitzondering op de regel is cross-presentatie, waarbij APC's (vooral dendritische cellen) extracellulair opgenomen antigenen via de MHC klasse I route kunnen presenteren, wat essentieel is voor het opwekken van CD8+ T-celresponsen tegen virussen zonder dat de APC zelf geïnfecteerd is. ### 3.9 Alloreactiviteit Alloreactiviteit is de immuunreactie van een individu tegen antigenen van een ander individu van dezelfde soort, voornamelijk gemedieerd door verschillen in MHC-moleculen. De herkenning van allo-MHC-moleculen, die een ander peptide-bindingsprofiel hebben, leidt tot een zeer krachtige T-celrespons, vaak duizendmaal sterker dan een respons tegen een specifiek viraal peptide. ### 3.10 MHC en auto-immuniteit Genetische aanleg speelt een belangrijke rol bij auto-immuunziekten, waarbij HLA-genen de belangrijkste genetische component vormen. Specifieke HLA-allelen zijn geassocieerd met een verhoogd risico op bepaalde auto-immuunziekten (bv. HLA-DRB1\*04 met reumatoïde artritis). Dit komt doordat bepaalde MHC-allelen efficiënter peptiden binden die lijken op lichaamseigen structuren of gemodificeerde zelf-antigenen (zoals gecitrullineerde eiwitten), wat leidt tot een auto-immune T-celrespons. Omgevingsfactoren, zoals infecties, kunnen in combinatie met genetische predispositie auto-immuniteit triggeren. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Adaptief immuunsysteem | Een tak van het immuunsysteem dat zich aanpast aan specifieke pathogenen, gekenmerkt door geheugenvorming en een grote specificiteit van respons. Het omvat B-cellen en T-cellen. | | Aangeboren immuunsysteem | Het eerste verdedigingsmechanisme van het lichaam dat snel reageert op pathogenen met algemene receptoren. Het heeft geen geheugen en onderscheidt zich van het adaptieve immuunsysteem. | | Antigeen | Een molecuul, meestal een eiwit of koolhydraat, dat door het immuunsysteem kan worden herkend als vreemd en een immuunrespons kan uitlokken, zoals de productie van antilichamen. | | Antilichaam (Ab) | Een Y-vormig eiwit dat door plasmacellen wordt geproduceerd en specifiek bindt aan antigenen, wat leidt tot de eliminatie van pathogenen of toxines. Ook bekend als immunoglobuline (Ig). | | Affiniteit | De bindingssterkte van één enkele antigeen-bindingsplaats van een antilichaam aan een epitoop. Dit is anders dan aviditeit, wat de totale bindingssterkte van een antilichaammolecule is. | | Alloreactiviteit | Een immuunreactie die optreedt tussen cellen van verschillende individuen, voornamelijk veroorzaakt door verschillen in de Major Histocompatibility Complex (MHC) moleculen, wat leidt tot orgaanafstoting. | | Autoimmuniteit | Een aandoening waarbij het immuunsysteem van het lichaam per ongeluk eigen weefsels aanvalt, omdat het lichaam eigen componenten niet meer als "zelf" herkent. | | Aviditeit | De totale bindingssterkte van een antilichaammolecule aan een antigeen, die het gevolg is van meerdere bindingsplaatsen die samenwerken. | | B-celreceptor (BCR) | Een membraangebonden immunoglobuline (Ig) op het oppervlak van B-cellen dat specifiek aan een antigeen bindt en het startsein geeft voor B-celactivatie. | | CDR (Complementarity Determining Region) | De hypervariabele regio's van de variabele domeinen van immunoglobulines en T-celreceptoren die direct contact maken met het antigeen en bepalen de specificiteit van de binding. | | CD4 T-cel | Een type T-helpercel dat de expressie van MHC klasse II moleculen herkent en helpt bij de coördinatie van de immuunrespons, met name bij de activatie van B-cellen en andere T-cellen. | | CD8 T-cel | Een type cytotoxische T-cel die de expressie van MHC klasse I moleculen herkent en direct geïnfecteerde of abnormale cellen kan doden. | | Cilinderproteasoom | Een complex multicatalytisch enzym dat verantwoordelijk is voor de afbraak van intracellulaire eiwitten tot peptiden, die vervolgens op MHC klasse I moleculen kunnen worden gepresenteerd. | | Combinatoire diversiteit | Een mechanisme voor het genereren van een breed scala aan receptoren door de willekeurige combinatie van verschillende gensegmenten (V, (D), J) tijdens de ontwikkeling van B- en T-cellen. | | Cytokines | Signaalmoleculen die door immuuncellen worden uitgescheiden en de interactie en functie van andere immuuncellen reguleren, zoals inflammatie, celgroei en differentiatie. | | Cytosol | Het vloeibare deel van het cytoplasma binnen een cel, exclusief de organellen. Peptiden die hier ontstaan, worden doorgaans via MHC klasse I gepresenteerd. | | Endoplasmatisch reticulum (ER) | Een netwerk van membranen binnen eukaryote cellen dat betrokken is bij de synthese van eiwitten en lipiden. MHC klasse I moleculen worden hier gevormd en geladen met peptiden. | | Epitoop | Het specifieke deel van een antigeen waaraan een antilichaam of TCR bindt. Een antigeen kan meerdere verschillende epitopen hebben. | | Fagocytose | Het proces waarbij cellen, zoals macrofagen en neutrofielen, vreemde deeltjes, pathogenen of celresten insluiten en verwijderen door ze op te nemen in een fagosoom. | | Geheugencellen | Lang levende B- en T-cellen die na een eerste infectie in het lichaam achterblijven. Bij een herinfectie met hetzelfde pathogeen zorgen zij voor een snellere en krachtigere immuunrespons. | | Genetische loci | Specifieke locaties op chromosomen waar genen zijn georganiseerd. Bij immunoglobulines zijn dit de loci voor de lichte kappa- en lambda-ketens en de zware keten. | | Haptenen | Kleine moleculen die zelf geen immuunrespons kunnen opwekken, maar wel kunnen binden aan antistoffen. Wanneer ze gebonden zijn aan een drager-eiwit, kunnen ze wel een immuunrespons induceren. | | Heterozygoot | Een individu dat voor een bepaald gen twee verschillende allelen heeft geërfd, wat kan leiden tot een grotere diversiteit aan gepresenteerde peptiden door MHC-moleculen. | | HLA (Human Leukocyte Antigen) | De menselijke benaming voor de Major Histocompatibility Complex (MHC) moleculen, die een cruciale rol spelen in de immuunrespons, met name bij de herkenning van vreemde cellen en weefsels. | | Humorale immuniteit | Een tak van het immuunsysteem die voornamelijk wordt uitgevoerd door B-cellen en antilichamen, gericht tegen extracellulaire pathogenen en toxines. | | IgA | Een immunoglobuline isotype dat voornamelijk wordt gevonden in slijm, tranen en moedermelk, en een belangrijke rol speelt in de bescherming van slijmvliezen. | | IgD | Een immunoglobuline isotype dat voornamelijk op het oppervlak van naïeve B-cellen wordt aangetroffen en een rol speelt bij B-celactivatie. | | IgE | Een immunoglobuline isotype dat betrokken is bij allergische reacties en de bescherming tegen parasieten, door het activeren van mestcellen en basofielen. | | IgG | De meest voorkomende immunoglobuline isotype in het bloed, die een cruciale rol speelt bij de bescherming tegen bacteriële en virale infecties, en ook transplacentair kan worden overgedragen. | | IgM | De eerste immunoglobuline isotype die wordt geproduceerd tijdens een primaire immuunrespons, en die voornamelijk in het bloed circuleert, vaak in een pentameer structuur. | | Immuuncomplexen | Complexen gevormd door de binding van antilichamen aan antigenen. Deze complexen kunnen het complement activeren en worden opgeruimd door immuuncellen. | | Immuunrespons | De reactie van het immuunsysteem op de aanwezigheid van een antigeen, die kan leiden tot de eliminatie van het antigeen en de vorming van immunologisch geheugen. | | Inferentie | Het proces waarbij een conclusie wordt getrokken op basis van waargenomen gegevens of principes, vaak gebruikt in wetenschappelijke analyse. | | Inflammatie | Een lokale reactie van het lichaam op schade of infectie, gekenmerkt door roodheid, zwelling, warmte en pijn. Het is een belangrijk onderdeel van de immuunrespons. | | Interferon (IFN) | Een groep eiwitten die door immuuncellen worden geproduceerd en een rol spelen bij de antivirale afweer en het moduleren van de immuunrespons. | | Isotype | Een klasse van immunoglobulines (bijv. IgM, IgG, IgA, IgE, IgD) die wordt gedefinieerd door verschillen in de constante regio van de zware keten en verschillende effectorfuncties hebben. | | Junctionele diversiteit | Een mechanisme voor het genereren van receptorvariabiliteit door de toevoeging of verwijdering van nucleotiden op de verbindingsplaatsen tussen gensegmenten (V, D, J) tijdens de recombinatie. | | Kiembaan DNA | Het DNA dat wordt doorgegeven van generatie op generatie en aanwezig is in geslachtscellen. Veranderingen hierin zijn erfelijk. | | Klonale expansie | Het proces waarbij lymfocyten die specifiek een bepaald antigeen herkennen, zich snel vermenigvuldigen na activatie, wat resulteert in een grote populatie van identieke cellen. | | Kostenimulatie | Een proces waarbij signalen die worden overgedragen door membraanreceptoren op immuuncellen, de immuunrespons versterken of moduleren, naast de primaire signaaloverdracht via de antigeenreceptor. | | Leukocyteninfiltratie | De invasie van witte bloedcellen in een bepaald weefsel, vaak als reactie op inflammatie of infectie. | | Lymfeknoop (LN) | Kleine, boonvormige organen die deel uitmaken van het lymfestelsel en een belangrijke rol spelen bij de filtering van lymfe en de activatie van immuuncellen. | | Lymfocyt | Een type witte bloedcel dat een centrale rol speelt in het adaptieve immuunsysteem, waaronder B-cellen en T-cellen. | | MHC (Major Histocompatibility Complex) | Een groep genen die eiwitten produceert die een rol spelen bij de herkenning van vreemde cellen door het immuunsysteem en bij de presentatie van antigenen aan T-cellen. | | Monomeer | Een enkel molecuul dat kan binden aan andere moleculen om een grotere structuur te vormen. Bij Ig zijn monomere vormen gebruikelijk voor IgG, IgA en IgE. | | Mutaties | Veranderingen in de DNA-sequentie. Somatische mutaties zijn veranderingen die optreden in niet-geslachtscellen en zijn niet erfelijk. | | N-nucleotiden | Willekeurig toegevoegde nucleotiden tijdens de junctionele recombinatie van TCR en Ig genen, die bijdragen aan de diversiteit van de receptor. | | Natieve eiwitten | Eiwitten in hun oorspronkelijke, functionele driedimensionale structuur, zoals ze in het lichaam voorkomen. B-cellen herkennen deze, terwijl T-cellen peptiden ervan herkennen. | | NHEJ (Non-homologous end joining) | Een DNA-herstelmechanisme dat dubbelstrengs breuken in het DNA herstelt door de uiteinden direct aan elkaar te koppelen, vaak met kleine mutaties. Essentieel voor V(D)J recombinatie. | | Ongeconjugeerde vaccins | Vaccins die antigenen bevatten die niet chemisch zijn gebonden aan een drager-molecuul (zoals een eiwit), waardoor ze minder effectief zijn bij het induceren van een robuuste immuunrespons, vooral bij jonge kinderen. | | P-nucleotiden | Palindromische nucleotiden die worden gevormd na het knippen van DNA-strengen tijdens de V(D)J recombinatie, en die bijdragen aan de junctionele diversiteit. | | Pan-genoom | Het totale genoom van een soort, inclusief alle genen die in verschillende stammen of individuen binnen die soort voorkomen, zelfs als ze niet in alle individuen aanwezig zijn. | | Passieve immunisatie | Het toedienen van kant-en-klare antistoffen aan een individu om onmiddellijke bescherming te bieden tegen een specifieke ziekteverwekker, zonder dat het lichaam zelf antistoffen hoeft te produceren. | | Pathogeen | Een micro-organisme, zoals een bacterie, virus, schimmel of parasiet, dat ziekte kan veroorzaken. | | Peptide | Een korte keten van aminozuren, typisch een fragment van een groter eiwit, die door MHC-moleculen aan T-cellen wordt gepresenteerd. | | Perifere circulatie | Het bloed- en lymfestelsel dat zich buiten de primaire lymfoïde organen (beenmerg en thymus) bevindt, waar volwassen lymfocyten circuleren en infecties bestrijden. | | Plasmacellen | Gedifferentieerde B-cellen die grote hoeveelheden antilichamen produceren en afscheiden. | | Polymerisatie | Het proces waarbij meerdere identieke moleculen (monomeren) aan elkaar worden gekoppeld om een grotere structuur te vormen, zoals de pentameer structuur van IgM of dimeer structuur van IgA. | | Polypeptideketen | Een keten van aminozuren die aan elkaar zijn gebonden door peptidebindingen, de bouwstenen van eiwitten. | | Polysacharide | Een lange keten van suikermoleculen. Sommige bacteriële celwandcomponenten zijn polysachariden die als antigeen kunnen dienen. | | Populatiestudies | Onderzoeken die de genetische kenmerken en ziekteassociaties bestuderen binnen een grotere groep mensen om patronen en risicofactoren te identificeren. | | Positieve selectie | Een proces in de thymus waarbij T-cellen met receptoren die zwak interageren met eigen MHC-moleculen worden behouden en gestimuleerd om te rijpen. | | Proteasoom | Een complex van eiwitsplitsende enzymen in cellen dat abnormale of onnodige eiwitten afbreekt tot peptiden. | | Recombinatie | Een proces waarbij DNA-segmenten worden herschikt, zoals bij de vorming van B-celreceptoren en T-celreceptoren door V(D)J recombinatie. | | Rood bloedcel (RBC) | Een cel in het bloed die zuurstof transporteert. RBCs missen MHC klasse I moleculen op hun oppervlak. | | Secundaire lymfoïde organen | Organen zoals de milt en lymfeklieren waar immuuncellen antigeen-presenterende cellen tegenkomen en geactiveerd worden. | | Serumziekte | Een reactie op het inspuiten van vreemd serum (bijvoorbeeld paarden- of antilichaamserum), gekenmerkt door koorts, uitslag en ontsteking, veroorzaakt door de vorming van immuuncomplexen. | | SHM (Somatic Hypermutation) | Een proces dat optreedt in volwassen B-cellen waarbij mutaties in de variabele regio van de immunoglobuline-genen worden geïntroduceerd, wat leidt tot affiniteitsmaturatie. | | Somatische mutatie | Een mutatie die optreedt in een somatische cel (een niet-geslachtscel) en niet erfelijk is. Bij B-cellen is dit belangrijk voor affiniteitsmaturatie. | | Somatische hypermutatie | Zie SHM. | | Somatische selectie | Een proces waarbij lymfocyten die reageren op lichaamseigen structuren worden verwijderd of geïnactiveerd om autoimmuniteit te voorkomen. | | Specificiteit | Het vermogen van een immuunreceptor (zoals een antilichaam of TCR) om specifiek aan één bepaald antigeen of epitoop te binden, terwijl andere moleculen worden genegeerd. | | Thymus | Een primair lymfoïd orgaan waar T-cellen rijpen en worden geselecteerd. Hier vindt positieve en negatieve selectie plaats. | | T-celreceptor (TCR) | Een receptor op het oppervlak van T-cellen die een peptide-MHC-complex herkent. Het is essentieel voor cellulaire immuniteit. | | Transcriptie | Het proces waarbij genetische informatie van DNA wordt gekopieerd naar messenger-RNA (mRNA). | | Transposon | Een "springend gen" dat zijn positie binnen het genoom kan veranderen, wat evolutie en genetische diversiteit kan beïnvloeden. Sommige genen in het immuunsysteem kunnen hieruit zijn geëvolueerd. | | Vacuïnes | Kleine met membraan omgeven blaasjes binnen cellen die stoffen transporteren of opslaan. Endosomen zijn een type vacuïne betrokken bij antigenverwerking. | | V-domein | Het variabele domein van een immunoglobuline of T-celreceptor, dat verantwoordelijk is voor de binding van het antigeen. | | V(D)J recombinatie | Het proces van genherschikking dat de variabele domeinen van immunoglobulines en T-celreceptoren vormt, waarbij V-, D- en J-gensegmenten worden gecombineerd. | | Virale partikels | De volledige structuur van een virusdeeltje, bestaande uit genetisch materiaal omgeven door een eiwitmantel. | | Viscositeit | Een maat voor de weerstand van een vloeistof tegen stroming. De viscositeit van vloeistoffen kan variëren afhankelijk van temperatuur en samenstelling. | | Vorming | Het proces van creëren of ontwikkelen. In immunologie kan dit verwijzen naar de vorming van antilichamen, cellen of immuuncomplexen. | | X-stralen | Een vorm van elektromagnetische straling met hoge energie. Blootstelling aan ioniserende straling, zoals X-stralen, kan DNA-schade veroorzaken en de gevoeligheid voor infecties verhogen. | | Zelf-MHC restrictie | Het fenomeen dat T-celreceptoren alleen antigenen kunnen herkennen wanneer deze worden gepresenteerd door MHC-moleculen van hetzelfde individu (of een genetisch identiek individu). |

# Principes van het adaptieve immuunsysteem Het adaptieve immuunsysteem is een langzame, maar zeer specifieke afweer die een immuunrespons opzet met behulp van het aangeboren immuunsysteem. Het onderscheidt zich door het vermogen tot geheugenvorming, wat resulteert in snellere en effectievere reacties bij herhaald contact met een pathogeen. ### Kenmerken van het adaptieve immuunsysteem Het adaptieve immuunsysteem is gekenmerkt door: * **Geheugen:** Snellere en effectievere respons bij herhaald contact met een agens. * **Trage eerste respons:** Een initiële reactie die ongeveer een week duurt. * **Onbeperkte specificiteit:** Het vermogen om miljarden verschillende structuren te herkennen. Het aangeboren immuunsysteem geeft toestemming aan B- en T-cellen om een immuunrespons op te zetten, onder andere via expressie van cytokines en costimulatoire moleculen. Het adaptieve immuunsysteem optimaliseert de effector-mechanismen van het aangeboren immuunsysteem, zoals complement en fagocytose. ### Lymfocytenrepertoire en selectie * **Aangeboren immuunsysteem:** Eén cel kan meerdere receptoren met verschillende specificiteiten tot expressie brengen. * **Adaptieve immuunsysteem:** Eén cel brengt meerdere receptoren met dezelfde specificiteit tot expressie. De specificiteit van elke lymfocyt is uniek, wat resulteert in een lymfocytenreceptorrepertoire dat ontstaat door genherschikking. Strikte selectieprocessen, positieve en negatieve selectie, zijn cruciaal voor het ontwikkelen van een functioneel en zelf-tolerante immuunsysteem: * **Positieve selectie:** Behoudt functionele receptoren. Dit vindt plaats in de thymus voor T-cellen en in de lymfeklieren voor B-cellen. * **Negatieve selectie:** Verwijdert autoreactieve receptoren. Dit vindt plaats in de thymus voor T-cellen en in het beenmerg en de lymfeklieren voor B-cellen. ### Genereren van receptor diversiteit Het genereren van miljarden verschillende receptoren met een beperkt aantal genen wordt bereikt door: * **Combinaties van genfragmenten:** Door het combineren van verschillende genfragmenten (V, D, J segmenten) ontstaat een grote variëteit aan receptoren. * **RAG-gemedieerde recombinatie:** Rearrangement activating genes (RAG) zijn essentieel voor het herschikken van gensegmenten (V(D)J recombinatie) om unieke receptoren te creëren. Dit proces creëert dubbelstrengse DNA-breuken die vervolgens worden hersteld via non-homologous end joining (NHEJ). #### Junctionele diversiteit Naast combinatorische diversiteit wordt junctionele diversiteit gegenereerd door: * **P-nucleotiden:** Palindroomsequenties die ontstaan na het knippen door RAG-eiwitten. * **N-nucleotiden:** Willekeurig toegevoegde nucleotiden door het enzym terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT). * Deze P- en N-nucleotiden zijn niet kiembaan-gecodeerd en coderen voornamelijk voor het CDR3-gebied, wat de antigeenbindingsplaats van de receptor bepaalt. ### Immunoglobulinen (Ig) en B-celreceptoren (BCR) * **BCR:** Membraangebonden immunoglobulinen op B-cellen, met een specifieke antigeenbindingsplaats. Elke B-cel produceert BCR's van één specificiteit. * **Antilichamen (Ab):** Gesecreteerde immunoglobulinen door plasmacellen, met dezelfde antigeenspecificiteit als de BCR. * **Antigeen (Ag):** Een macromolecuul (meestal eiwit of koolhydraat) dat door antilichamen wordt herkend en gemerkt voor vernietiging. #### Structuur van antilichamen Antilichamen hebben een Y-vormige structuur, bestaande uit: * **Twee zware ketens (H):** Bepalen het isotype (IgM, IgD, IgG, IgA, IgE). * **Twee lichte ketens (L):** Twee isotypes: lambda ($\lambda$) en kappa ($\kappa$). * **Ig-domeinen:** Stabiele eiwitstructuren die uit sequenties van ongeveer 110 aminozuren bestaan. * **Variabele regio (V):** Bevat de hypervariabele regio's (HV) of complementaire-determining regions (CDR), die verantwoordelijk zijn voor de antigeenspecificiteit. De CDR3 is het meest variabel. * **Constante regio (C):** Bepaalt de effectorfunctie en de classificatie in isotypes. #### Antigeen-antilichaam interactie * **Specificiteit:** Bepaald door de oppervlakte-complementariteit tussen het epitoop (het herkende deel van het antigeen) en de bindingsplaats van het antilichaam. * **Affiniteit:** De bindingssterkte van één bindingsplaats voor het antigeen. * **Aviditeit:** De totale bindingssterkte van een multivalent antilichaam voor een antigeen, wat verhoogd wordt door polymerisatie van IgA en IgM. * **Epitoop:** Een klein, oppervlakkig gebied van een macromolecuul. Kan conformationeel (discontinu) of lineair (continu) zijn. * **Haptenen:** Kleine moleculen die, wanneer gebonden aan een drager-eiwit, antistoffen kunnen opwekken. #### Functies van antilichamen * **Antigeenbinding (V-domein):** Herkenning van specifieke antigenen. * **Effectorfuncties (C-domein):** * Interactie met Fc-receptoren (FcR) op immuuncellen, leidend tot fagocytose of activatie van mestcellen. * Activatie van het complementsysteem. * Specifieke distributie over het lichaam (bv. IgA in secreties, IgG transplacentair). ### B-cel receptor (BCR) signalering De BCR bestaat uit membraangebonden Ig-moleculen geassocieerd met Ig$\alpha$ en Ig$\beta$ eiwitten. Bij antigeenbinding geven Ig$\alpha$ en Ig$\beta$ de signaaltransductie door aan het cytoplasma. ### T-cel receptor (TCR) * **Structuur:** TCR's zijn heterodimeren (meestal $\alpha\beta$ of $\gamma\delta$ ketens) die lijken op membraangebonden Fab-fragmenten. * **Associatie met CD3 complex:** TCR's zijn geassocieerd met het CD3 complex, dat cruciaal is voor signaaltransductie na antigeenbinding. * **MHC-restrictie:** TCR's herkennen peptiden alleen in de context van Major Histocompatibility Complex (MHC) moleculen. * **Verschillen met Ig:** TCR's hebben geen isotypes en ondergaan geen somatische hypermutatie. ### Class switch recombination (CSR) en Somatische Hypermutatie (SHM) Deze processen vinden plaats in B-cellen tijdens de immuunrespons, gemedieerd door Activation-induced cytidine deaminase (AID): * **Isotype switching (CSR):** Verandering van het constante (C) domein van de immunoglobuline, wat resulteert in een ander IgG, IgA, of IgE isotype. Dit is een irreversibel proces waarbij DNA wordt verwijderd. * **Somatische hypermutatie (SHM):** Introductie van puntmutaties in de variabele (V) genen van immunoglobulinen, wat leidt tot affiniteitsmaturatie van antilichamen. Mutaties die de affiniteit verhogen, worden bevorderd. ### Major Histocompatibility Complex (MHC) of HLA * **Functie:** Presentatie van peptiden aan T-cellen. MHC-moleculen zijn genetisch bepaald en zeer polymorf. * **Klasse I MHC:** Gecodeerd door HLA-A, -B, en -C genen. Aanwezig op vrijwel alle lichaamscellen. Presenteert intracellulaire peptiden aan CD8$^+$ T-cellen. * **Klasse II MHC:** Gecodeerd door HLA-DP, -DQ, en -DR genen. Voornamelijk aanwezig op antigeenpresenterende cellen (APC's) zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen. Presenteert extracellulaire peptiden aan CD4$^+$ T-cellen. * **Polymorfisme en Allotypie:** De vele allelen en genen binnen het MHC-complex resulteren in een hoge diversiteit van MHC-moleculen in de populatie, wat essentieel is voor de herkenning van diverse pathogenen. * **Antigen processing en presentatie:** Peptiden worden in verschillende cellulaire compartimenten verwerkt (cytosol voor klasse I, endosomen/lysosomen voor klasse II) en getransporteerd naar het endoplasmatisch reticulum om te binden aan MHC-moleculen, die vervolgens naar het celoppervlak worden getransporteerd. #### Cross-presentation Sommige dendritische cellen kunnen gefagocyteerde antigenen via een mechanisme genaamd cross-presentation presenteren op MHC klasse I-moleculen, zelfs zonder zelf geïnfecteerd te zijn. Dit maakt het mogelijk om CD8$^+$ T-celresponsen op te wekken tegen extracellulaire pathogenen. ### Alloreactiviteit * **Definitie:** Een immuunreactie tussen cellen van verschillende individuen, voornamelijk bepaald door verschillen in MHC-moleculen. * **Oorzaak:** Vreemde MHC-moleculen presenteren een andere set peptiden, wat leidt tot een krachtige T-celrespons. Dit is een fundamenteel aspect van de T-celimmuniteit. ### MHC en Auto-immuniteit * **Genetische predispositie:** Bepaalde HLA-allotypen zijn geassocieerd met een verhoogd risico op het ontwikkelen van auto-immuunziekten. * **Mechanisme:** Specifieke HLA-moleculen kunnen bepaalde peptiden (bv. gecitrullineerde eiwitten bij reumatoïde artritis) presenteren op een manier die auto-reactieve T-cellen activeert. * **Multifactorieel:** De ontwikkeling van auto-immuniteit is multifactorieel en wordt beïnvloed door genetische factoren (HLA en andere genen), omgevingsfactoren (bv. pathogenen) en de balans van activatie- en inactivatiesignalen in T-cellen. --- # Structuur en functie van antilichamen Oké, hier is de studiehandleiding voor "Structuur en functie van antilichamen", gebaseerd op de verstrekte tekst. ## 2. Structuur en functie van antilichamen Antilichamen, ook wel immunoglobulines (Ig) genoemd, zijn Y-vormige eiwitmoleculen die essentieel zijn voor de humorale immuniteit door hun vermogen om pathogenen te herkennen en te neutraliseren, en om andere immuuncomponenten te activeren. ### 2.1 Structuur van immunoglobulines Een immunoglobuline (Ig) molecuul is opgebouwd uit twee identieke zware ketens (H, heavy) en twee identieke lichte ketens (L, light), die met elkaar verbonden zijn door disulfidebruggen. De Y-vorm van het antilichaam is te onderscheiden in twee functionele regio's: * **Variabele regio (V-regio):** Deze regio bevindt zich aan de uiteinden van de twee 'armen' van het Y-vormige molecuul. De variabele regio is verantwoordelijk voor de binding aan het antigeen. Binnen de variabele regio bevinden zich de **hypervariabele regio's (HV-regio's)**, ook wel **complementary determining regions (CDR's)** genoemd. Deze CDR's vormen de uiteindelijke bindingsplaats voor het epitoop van een antigeen. Er zijn zes CDR's per antilichaam: drie op de variabele lichte keten ($V_L$) en drie op de variabele zware keten ($V_H$). * **Constante regio (C-regio):** Deze regio vormt het 'lichaam' en de 'stam' van het Y-vormige molecuul. De constante regio van de zware keten bepaalt het isotype van het antilichaam en is verantwoordelijk voor de effectorfuncties, zoals de interactie met Fc-receptoren op immuuncellen en de activatie van het complementsysteem. De lichte keten kent één constante regio ($C_L$). #### 2.1.1 Ig-domeinen Zowel de zware als de lichte ketens zijn opgebouwd uit een aantal sequenties van ongeveer 110 aminozuren, die Ig-domeinen worden genoemd. Deze domeinen vormen stabiele eiwitstructuren die functioneel blijven onder diverse omstandigheden. De variabele regio's ($V_L$ en $V_H$) bestaan uit één Ig-domein, terwijl de constante regio's ($C_L$ en $C_H$) uit één of meerdere Ig-domeinen bestaan. #### 2.1.2 Antigeenbindingsplaats De antigeenbindingsplaats van een antilichaam wordt gevormd door de drie hypervariabele lussen (CDR's) van de $V_L$-keten en de drie CDR's van de $V_H$-keten, die in elkaars nabijheid liggen. Deze structuur is complementair aan het epitoop van het antigeen, waardoor specifieke binding mogelijk is. #### 2.1.3 Epitopen Een antilichaam herkent een klein, specifiek oppervlaktegebied van een macromolecuul (eiwit, koolhydraat, lipopolysacharide, lipoproteïne) dat een **antigeen determinant** of **epitoop** wordt genoemd. Epitopen kunnen **conformationeel** (onderdelen die discontinu zijn in de aminozuursequentie maar wel bij elkaar liggen in de driedimensionale structuur) of **lineair** (één enkel segment van de polypeptideketen) zijn. Een antigeen kan meerdere epitopen dragen, wat leidt tot herkenning door meerdere antilichamen. #### 2.1.4 Isotypes van immunoglobulines Er zijn vijf hoofdklassen (isotypes) van immunoglobulines bij de mens, onderscheiden door de structuur van de constante regio van de zware keten: * **IgM** (zware keten $\mu$) * **IgD** (zware keten $\delta$) * **IgG** (zware keten $\gamma$) * **IgA** (zware keten $\alpha$) * **IgE** (zware keten $\epsilon$) Bij de mens kent IgG vier subklassen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) en IgA twee subklassen (IgA1, IgA2). Functionele verschillen tussen de isotypes zijn voornamelijk toe te schrijven aan variaties in de constante regio van de zware keten. #### 2.1.5 Lichte ketens Lichte ketens kennen twee isotypes: lambda ($\lambda$) en kappa ($\kappa$). Er is geen functioneel verschil tussen deze twee isotypes in het antilichaam. De verhouding van kappa tot lambda lichte ketens bij een gezond individu is ongeveer 2:1. #### 2.1.6 Polymerisatie van Ig IgM en IgA kunnen polymeriseren tot respectievelijk pentameren en dimeren. Dit gebeurt via disulfidebruggen die gevormd worden door cysteïneresiduen in het staartstuk van de zware ketens, vaak bevorderd door de J-keten. Polymerisatie verhoogt de **aviditeit**, de totale bindingssterkte van een multivalent antilichaammolecuul, wat belangrijk is voor de herkenning van repetitieve epitopen. Dimerisatie van IgA is cruciaal voor het transport door epitheelcellen. ### 2.2 Functies van antilichamen Antilichamen vervullen diverse cruciale functies in het immuunsysteem, voornamelijk gedreven door hun variabele en constante regio's: * **Antigeenbinding (V-regio):** De variabele regio's, met name de CDR's, herkennen en binden specifiek aan antigenen. Dit is de primaire functie voor het neutraliseren van pathogenen en het markeren ervan voor vernietiging. * **Effectorfuncties (C-regio):** De constante regio (Fc-deel) van het antilichaam is verantwoordelijk voor de interactie met andere immuuncomponenten, wat leidt tot verschillende effectorfuncties: * **Interactie met Fc-receptoren (FcR):** Binding aan FcR op fagocyten kan leiden tot fagocytose van het gebonden antigeen. Binding aan FcR op mestcellen en basofielen kan leiden tot de afgifte van mediatoren (bv. histamine). * **Activatie van het complementsysteem:** De constante regio kan het complementsysteem activeren, wat leidt tot lysis van pathogenen, opsonisatie en ontsteking. * **Verdeling door het lichaam:** Verschillende isotypes hebben een specifieke verdeling en functie; IgA wordt bijvoorbeeld aangetroffen in mucosaal secreet en moedermelk, terwijl IgG trans-placentair kan worden overgedragen. #### 2.2.1 B-cel receptor (BCR) Op het oppervlak van B-cellen zijn immunoglobulines aanwezig als de **B-cel receptor (BCR)**. Deze membraangebonden Ig-moleculen zijn geassocieerd met de signaaltransductie-eiwitten Ig$\alpha$ en Ig$\beta$. Binding van een antigeen aan de BCR activeert de B-cel, waarna deze kan differentiëren tot een plasmacel die antilichamen secerneert. De C-regio van de BCR is transmembranair. #### 2.2.2 Antilichaam-antigeen interactie De interactie tussen antilichaam en antigeen is gebaseerd op complementariteit van oppervlakken en wordt in stand gehouden door niet-covalente bindingen (elektrostatische krachten, waterstofbruggen, van der Waalskrachten, hydrofobe interacties). Deze interactie is omkeerbaar en kan worden verbroken door veranderingen in zoutconcentratie, pH, of hoge epitoopconcentraties. Binding van het antigeen kan conformationele veranderingen in het Ig-molecuul induceren, waardoor de Fc-staart toegankelijk wordt voor interactie met FcR of complement. ### 2.3 Genereren van antilichamendiversiteit Het immuunsysteem is in staat om een enorm divers repertoire aan antilichamen te produceren, nodig om te reageren op een vrijwel onbeperkt aantal antigenen. Dit wordt bereikt door genetische mechanismen die plaatsvinden tijdens de ontwikkeling van B-cellen: * **Combinatorische diversiteit:** De variabele regio's van zowel de lichte als de zware ketens worden gecodeerd door meerdere gensegmenten: V (variabel), D (diversity, alleen voor zware keten) en J (joining). Willekeurige combinaties van deze segmenten leiden tot een grote variatie in de V-regio's. * Lichte keten: $V_L$ + $J_L$ segmenten * Zware keten: $V_H$ + $D_H$ + $J_H$ segmenten * *Leader peptide* (L) sequenties worden toegevoegd om de eiwittranslocatie te sturen en worden na translatie verwijderd. * **Junctionele diversiteit:** Tijdens de herschikking van de gensegmenten worden P-nucleotiden (palindromische sequenties) en N-nucleotiden (willekeurig toegevoegde nucleotiden door TdT – *terminal deoxynucleotidyl transferase*) aan de uiteinden van de gensegmenten toegevoegd. Deze processen, met name de N-nucleotiden, creëren extra variabiliteit in de CDR3-regio, wat essentieel is voor de antigeenspecificiteit. * **Somatische hypermutatie (SHM):** Na blootstelling aan een antigeen ondergaan geactiveerde B-cellen een proces van somatische hypermutatie, waarbij willekeurige puntmutaties worden geïntroduceerd in de V-genen. Mutaties in de CDR-regio's die leiden tot een hogere affiniteit voor het antigeen worden geselecteerd, wat resulteert in affiniteitsmaturatie. Deze RAG-gemedieerde processen (RAG-1 en RAG-2 enzymen) en de junctionele diversiteit vinden plaats tijdens de differentiatie van B-cellen. Somatische hypermutatie vindt plaats in meer volwassen, geactiveerde B-cellen. ### 2.3.1 Isotype switching Naast de variatie in de V-regio, kunnen B-cellen ook hun isotype veranderen door middel van **class switch recombination (CSR)**. Dit proces wordt gemedieerd door het enzym Activation-induced cytidine deaminase (AID). CSR vindt plaats in specifieke switch-regio's in de genomen en resulteert in het verwijderen van DNA en het plaatsen van een ander C-gen direct na het herschikte VDJ-exoon. Hierdoor kan een B-cel aanvankelijk IgM/IgD produceren, en na stimulatie (en onder invloed van T-cel cytokines) overschakelen naar IgG, IgA of IgE. Dit proces is irreversibel. ### 2.4 Vergelijking met T-cel receptor (TCR) Hoewel B-cel receptoren ( BCR's, Ig) en T-cel receptoren (TCR's) beide dienen voor antigeenherkenning, zijn er belangrijke verschillen: * **Structuur:** TCR's zijn heterodimeren, meestal bestaande uit $\alpha$- en $\beta$-ketens (of $\gamma$- en $\delta$-ketens in een subpopulatie). Deze ketens bezitten Ig-achtige domeinen met variabele en constante regio's. * **Antigeenherkenning:** BCR's herkennen native, intacte antigenen (eiwitten, suikers, lipiden). TCR's herkennen peptidefragmenten die gepresenteerd worden door MHC-moleculen (Major Histocompatibility Complex) op de celmembraan. * **Diversiteit generatie:** TCR's genereren diversiteit via combinatorische en junctionele diversiteit, vergelijkbaar met Ig. Echter, TCR's ondergaan geen somatische hypermutatie en hebben geen isotypes, wat leidt tot een potentieel kleiner, maar nog steeds enorm, repertoire. * **Signaaltransductie:** Zowel BCR (met Ig$\alpha$/Ig$\beta$) als TCR (met CD3 complex) zijn afhankelijk van geassocieerde eiwitcomplexen voor signaaltransductie na antigeenbinding. De Ig-moleculen en TCR-ketens zelf signaleren niet. ### 2.5 Rol van MHC in antigeenpresentatie De herkenning van peptiden door TCR's is **MHC-beperkt**. Dit betekent dat de interactie specifiek is voor een bepaald MHC-molecuul dat het peptide presenteert. * **MHC Klasse I moleculen** (HLA-A, -B, -C) presenteren peptiden afkomstig uit het cytosol (bv. virale eiwitten, tumorantigenen) aan CD8+ T-cellen. Deze moleculen worden op vrijwel alle lichaamscellen tot expressie gebracht. * **MHC Klasse II moleculen** (HLA-DP, -DQ, -DR) presenteren peptiden afkomstig uit extracellulaire compartimenten (bv. gefagocyteerde bacteriën) aan CD4+ T-cellen. Deze moleculen worden voornamelijk gepresenteerd door antigeen-presenterende cellen (APC's) zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen. De genetische diversiteit binnen het MHC-complex (polymorfisme) zorgt ervoor dat verschillende individuen verschillende peptiden kunnen presenteren, wat essentieel is voor de immuunrespons tegen een breed scala aan pathogenen en tegelijkertijd auto-immuniteit kan beïnvloeden. Alloreactiviteit, de reactie tegen vreemde MHC-moleculen, is een gevolg van dit polymorfisme en kan zeer krachtig zijn. ### 2.6 Invloed van genetica en polymorfisme De enorme diversiteit van immunoglobulines en TCR's is mogelijk gemaakt door genetische mechanismen zoals V(D)J-recombinatie en somatische hypermutatie. Het Major Histocompatibility Complex (MHC), bij de mens HLA genoemd, is extreem polymorf. Dit betekent dat er in de populatie veel verschillende allelen bestaan voor de genen die MHC-moleculen coderen. Dit polymorfisme is geconcentreerd in de peptide-bindende groeven van de MHC-moleculen en bepaalt welke peptiden kunnen worden gebonden en gepresenteerd aan T-cellen. Dit heeft directe gevolgen voor de vatbaarheid voor auto-immuunziekten en de respons op infecties en transplantaties. > **Tip:** Begrijp het onderscheid tussen MHC klasse I en klasse II en hun respectievelijke presentatiepaden (cytosolisch vs. vesiculair). Dit is cruciaal voor het begrijpen van CD4+ versus CD8+ T-cel functies. > **Tip:** Onthoud dat antilichamen (BCR's) native antigenen herkennen, terwijl TCR's peptidefragmenten in de context van MHC herkennen. Dit is een fundamenteel verschil in hun werkingsmechanisme. --- # Antigeenpresentatie en T-celreceptor herkenning Dit onderdeel behandelt de complexe mechanismen van antigeenpresentatie door MHC-moleculen aan T-cellen en de daaropvolgende herkenning door de T-celreceptor (TCR), waarbij de verschillende klassen van MHC-moleculen, hun expressiepatronen en de routes van antigeenverwerking worden belicht. ## 3.1 De rol van MHC in antigeenpresentatie T-cellen herkennen geen native eiwitten of oplosbare eiwitten. In plaats daarvan herkennen ze peptidefragmenten van antigenen in de context van Major Histocompatibility Complex (MHC) moleculen. Dit proces omvat antigeenverwerking (het knippen van native eiwitten in peptidefragmenten) en antigeenpresentatie (het beschikbaar stellen van deze peptiden op het celoppervlak in de context van MHC-moleculen). ### 3.1.1 MHC-moleculen en hun expressie * **MHC Klasse I moleculen:** * Worden op vrijwel alle lichaamscellen tot expressie gebracht, met uitzondering van rode bloedcellen. * De expressie wordt verhoogd door interferon-gamma (IFN-$\gamma$). * Ze presenteren peptiden afkomstig uit het cytosol, typisch van intracellulaire pathogenen zoals virussen. * **MHC Klasse II moleculen:** * Worden normaal gesproken voornamelijk op bepaalde hematopoietische cellen en op thymusepitheelcellen tot expressie gebracht. * De expressie wordt verhoogd door IFN-$\gamma$, en IFN-$\gamma$ kan de expressie ook induceren op cellen die normaal gesproken geen MHC klasse II tot expressie brengen. * Ze presenteren peptiden die afkomstig zijn van antigenen die via pinocytose of fagocytose zijn opgenomen, meestal van extracellulaire pathogenen. * **MHC en T-cel co-receptoren:** * CD8-moleculen binden aan MHC klasse I moleculen op hun niet-polymorfe domeinen. Dit is kenmerkend voor cytotoxische T-cellen die geïnfecteerde cellen herkennen. * CD4-moleculen binden aan de $\beta$-keten van MHC klasse II moleculen. Dit is kenmerkend voor helper T-cellen die antigenen op antigeenpresenterende cellen herkennen. ### 3.1.2 Het Major Histocompatibility Complex (MHC) Bij mensen wordt het MHC aangeduid als Human Leukocyte Antigen (HLA). Het is gecodeerd door stabiele genen op chromosoom 6 en is genetisch polymorf (meerdere allelen in de populatie) en polygenisch (een individu heeft meerdere klasse I en klasse II genen, ook wel isotypes genoemd). * **Klasse I genen:** HLA-A, -B, en -C. Het gen voor $\beta_2$-microglobuline bevindt zich op een ander chromosoom. * **Klasse II genen:** Coderen voor de $\alpha$- en $\beta$-ketens van HLA-DP, -DQ, en -DR. * **Klasse III genen:** Coderen voor diverse immunologisch relevante eiwitten, zoals complementfactoren (C2, C4) en TNF. HLA-genen worden samen overgeërfd als een haplotype, met slechts ongeveer 2% recombinatie tijdens meiose. Dit verklaart waarom de beste donoren voor transplantaties vaak binnen families worden gevonden (broers en zussen hebben 25% kans op een HLA-identieke match per broer/zus). De variatie tussen MHC-allotypen concentreert zich voornamelijk in de peptide-bindende groeve, hetzij op de bodem of de wanden ervan. Deze variatie beïnvloedt de sequentie van de ankeraminozuren die essentieel zijn voor peptidebinding. Verschillende allotypen binden dus verschillende peptiden. Kennis van deze peptide-bindingsmotieven is belangrijk voor de ontwikkeling van peptidevaccins. ## 3.2 Antigeenverwerking De route die een antigeen doorloopt voor verwerking is afhankelijk van het compartiment waarin het zich bevindt en het type cel dat het presenteert. ### 3.2.1 MHC klasse I pathway 1. **Proteasoom degradatie:** Cytoplasmatische eiwitten worden afgebroken tot peptidefragmenten door het proteasoom, een multicatalytisch proteasecomplex. 2. **TAP transport:** Peptidefragmenten worden actief getransporteerd vanuit het cytosol naar het endoplasmatisch reticulum (ER) via het ATP-afhankelijke transportmolecule 'Transporters Associated with Antigen Processing' (TAP). 3. **MHC klasse I assemblage:** In het ER assembleren MHC klasse I moleculen zonder peptide slechts instabiel op de celmembraan. Peptiden die door TAP worden getransporteerd, binden aan de groeven van deze MHC klasse I moleculen, wat leidt tot stabilisatie en transport naar het celoppervlak. ### 3.2.2 MHC klasse II pathway 1. **Endocytose/Fagocytose:** Antigenen die door pinocytose of fagocytose worden opgenomen, komen in endosomen terecht. 2. **Degradatie in endosomen/lysosomen:** Endosomen bevatten proteasen die bij lage pH geactiveerd worden. Fusie met lysosomen, die ook zure proteasen bevatten, zorgt voor verdere afbraak van eiwitten tot peptiden. 3. **Vorming van MHC klasse II-peptidecomplexen:** In het ER worden de $\alpha$- en $\beta$-ketens van MHC klasse II moleculen gevormd en geassocieerd met een 'invariant chain' (Ii). Deze invariant chain voorkomt dat de MHC klasse II groeve vroegtijdig peptiden bindt. Wanneer de MHC klasse II moleculen in vesicles belanden waar extracellulaire eiwitafbraak plaatsvindt, wordt de invariant chain afgebroken, waarbij een klein fragment genaamd CLIP (Class II-associated invariant chain peptide) achterblijft. CLIP wordt vervolgens verdrongen door peptidefragmenten uit de endosomale/lysosomale route, waardoor het peptide-geïncubate MHC klasse II molecuul naar het celoppervlak wordt getransporteerd. ### 3.2.3 Cross-presentation Een speciaal fenomeen is 'cross-presentation', waarbij sommige cellen, met name dendritische cellen, gefagocyteerde antigenen via de MHC klasse I route kunnen presenteren, zelfs als ze zelf niet geïnfecteerd zijn. Dit stelt hen in staat om CD8-respons op te wekken tegen pathogenen die ze hebben opgenomen, zonder zelf geïnfecteerd te zijn. ## 3.3 T-celreceptor (TCR) herkenning T-cellen herkennen het complex van een peptide dat gebonden is aan een MHC-molecuul. De T-celreceptor (TCR) is specifiek voor dit complexe. ### 3.3.1 Structuur van de TCR * De TCR is een heteromeer, meestal bestaande uit een $\alpha$- en een $\beta$-keten ($\alpha\beta$ TCR), of een $\gamma$- en een $\delta$-keten ($\gamma\delta$ TCR). $\alpha\beta$ T-cellen vormen de meerderheid van de T-celpopulatie. * Net als immunoglobulinen (Ig) bevatten de TCR-ketens variabele (V) en constante (C) domeinen en zijn ze disulfide-gekoppeld. * De TCR-moleculen zijn permanent geassocieerd met het CD3-complex (bestaande uit $\gamma$, $\delta$, $\epsilon$, en $\zeta$ ketens). Het CD3-complex is cruciaal voor signaaltransductie na antigeenbinding; de TCR-ketens zelf kunnen geen signaal doorgeven. ### 3.3.2 TCR-specificiteit en MHC-restrictie * **MHC-restrictie:** T-cellen zijn 'MHC-restricted', wat betekent dat hun TCR specifiek is voor een bepaald MHC-molecuul *en* het peptide dat daarin gebonden is. Een T-cel die een peptide presenteert op MHC klasse I, zal een ander peptide op MHC klasse II niet herkennen. * **Alloreactiviteit:** De T-cel filosofie omvat ook alloactiviteit, een immuunreactie tussen cellen van verschillende individuen. Dit wordt voornamelijk veroorzaakt door verschillen in MHC-moleculen, die een totaal andere set peptiden kunnen presenteren. Alloresponsen kunnen duizendmaal krachtiger zijn dan bijvoorbeeld een antivirale respons. * **Peptide-MHC interactie:** MHC-moleculen binden peptiden met een brede specificiteit, waarbij ankeraminozuren in de peptidegroef essentieel zijn voor de binding. De TCR herkent aminozuurresiduen van zowel het MHC als het gebonden peptide. ### 3.3.3 Diversiteit van TCR's De enorme diversiteit van TCR's wordt gegenereerd door vergelijkbare mechanismen als bij B-cellen, met name: * **Combinatorische diversiteit:** Willekeurige combinatie van V, (D), en J gensegmenten. * **Junctionele diversiteit:** Toevoeging van P- en N-nucleotiden door enzymen zoals TdT en RAG-1/2. Deze diversiteit is groter bij T-cellen dan bij B-cellen. * **Geen somatische hypermutatie:** In tegenstelling tot Ig-genen ondergaan TCR-genen geen somatische hypermutatie. ### 3.3.4 MHC en auto-immuniteit Genetische factoren, met name HLA-allelen, spelen een belangrijke rol bij de vatbaarheid voor auto-immuunziekten. Verschillen in de peptide-bindende groeve van specifieke MHC-moleculen kunnen ertoe leiden dat lichaamseigen peptiden die gemodificeerd zijn (bijvoorbeeld gecitrullineerde eiwitten bij reumatoïde artritis) worden gepresenteerd op een manier die een immuunrespons uitlokt. Dit kan leiden tot de vorming van auto-antilichamen en T-celgemedieerde immuniteit tegen eigen weefsels. > **Tip:** Het cruciale verschil tussen B-cellen (humorale immuniteit) en T-cellen (cellulaire immuniteit) ligt in hun antigeenherkenning. B-cellen herkennen native antigenen (oppervlakte en extracellulair, zoals suikers en eiwitten) via hun BCR, terwijl T-cellen peptidefragmenten herkennen die gepresenteerd worden op MHC-moleculen (intra- en extracellulair, enkel eiwitten) via hun TCR. Dit maakt T-cellen essentieel voor de bestrijding van intracellulaire pathogenen. --- # MHC en auto-immuniteit Dit thema onderzoekt de rol van het Major Histocompatibility Complex (MHC) en diens menselijke equivalent, HLA, in de ontwikkeling van auto-immuunziekten, waarbij de focus ligt op genetische predispositie, specifieke HLA-allotypes en de interactie met peptiden die auto-reactiviteit kunnen veroorzaken. ## 4. MHC en auto-immuniteit Auto-immuunziekten hebben een gedeeltelijk genetische basis, waarbij HLA-genen de belangrijkste genetische component vormen. Familiale studies helpen bij het associëren van ziekten met specifieke chromosomen, terwijl populatiestudies specifieke genen kunnen aanwijzen. ### 4.1 Major histocompatibility complex (MHC) of HLA Het Major Histocompatibility Complex (MHC), bij mensen bekend als Human Leukocyte Antigen (HLA), is een genetische locus die cruciaal is voor de immuunrespons en histocompatibiliteit. #### 4.1.1 Genetische kenmerken van MHC/HLA * **Genetisch polymorfisme:** De MHC/HLA-locus is zeer polymorf, wat betekent dat er vele verschillende allelen (varianten van een gen) in de populatie bestaan. Dit leidt tot het bestaan van verschillende "allotypes" (varianten van een eiwit) in de bevolking. * **Klasse I:** HLA-A, -B, en -C zijn de meest polymorfe klasse I genen. * **Klasse II:** HLA-DR, -DQ, en -DP zijn de meest polymorfe klasse II genen, met name HLA-DR. * **Polygenisch:** Een individu bezit meerdere genen die coderen voor zowel klasse I als klasse II moleculen. Elk individu heeft bijvoorbeeld twee kopieën van de HLA-A, -B, -DR, etc. genen, die codominant tot expressie komen op het celoppervlak. * **Haplotypes:** HLA-genen worden vaak samen overgeërfd als een haplotype (een set van genen op één chromosoom). Recombinatie tijdens meiose is zeldzaam (ongeveer 2%), waardoor broers en zussen een 25% kans hebben om identieke haplotypes te delen. * **MHC complex:** Het MHC-complex op chromosoom 6 omvat meer dan 200 genen, waaronder klasse I (HLA-A, -B, -C), klasse II (coderend voor $\alpha$- en $\beta$-ketens van HLA-DP, -DQ, -DR) en klasse III genen (coderend voor diverse immuunfuncties zoals complementfactoren C2 en C4, en TNF). Het gen voor $\beta$-2-microglobuline, een essentiële component voor klasse I moleculen, bevindt zich op een ander chromosoom. #### 4.1.2 MHC en peptidebinding De variaties tussen verschillende MHC-allotypes zijn voornamelijk geconcentreerd in de peptide-bindingsgroeve, zowel op de bodem als de wanden. Dit beïnvloedt welke peptiden door een specifiek MHC-molecuul kunnen worden gebonden. * **Bindingsmotief:** Een bindingsmotief is een reeks kenmerken waaraan een peptide moet voldoen om te kunnen binden aan een specifieke MHC-eiwitgroef. Bijvoorbeeld, een peptide dat aan HLA-A\*0201 kan binden, is doorgaans 9 aminozuren lang en heeft specifieke aminozuren op bepaalde posities (bv. Leucine of Methionine op positie 2, Valine op positie 6, en Valine of Leucine op positie 9). * **Breed spectrum van binding:** MHC-moleculen binden peptiden niet met hoge specificiteit zoals Ig of TCR, maar met een breed spectrum. Verschillende allotypes kunnen daardoor verschillende peptiden presenteren, wat bijdraagt aan de populatie-immuniteit. * **Sequentie-motieven en peptide-vaccins:** Kennis van sequentie-motieven is belangrijk voor de ontwikkeling van peptide-vaccins. #### 4.1.3 Antigeenpresentatie via MHC T-cellen herkennen geen intacte of oplosbare eiwitten, maar peptidefragmenten die gepresenteerd worden in de context van MHC-moleculen. * **Antigeenverwerking (processing):** Het proces waarbij intacte eiwitten worden afgebroken tot peptidefragmenten. * **Antigeenpresentatie:** Het beschikbaar stellen van peptidefragmenten op het celoppervlak, gebonden aan MHC-moleculen. **MHC Klasse I Pathway:** * Peptiden die binden aan MHC klasse I moleculen zijn afkomstig uit het cytosol. * MHC klasse I moleculen worden gesynthetiseerd in het endoplasmatisch reticulum (ER). * Ongepaagde MHC klasse I moleculen zijn instabiel. * Peptiden worden vanuit het cytosol actief getransporteerd naar het ER via "Transporters Associated with Antigen Processing" (TAP). * Peptiden in het cytosol worden gegenereerd door het proteasoom, een multicatalytisch proteasecomplex. **MHC Klasse II Pathway:** * Antigenen die via pinocytose of fagocytose worden opgenomen, komen terecht in het endosomale/lysosomale systeem. * Deze antigenen worden afgebroken tot peptiden door proteasen die actief zijn bij lage pH. * De peptiden worden gebonden aan MHC klasse II moleculen, die in het ER worden gevormd en via het vesiculaire systeem naar de celmembraan worden getransporteerd. * De "invariant chain" (Ii) voorkomt vroegtijdige peptidebinding in het ER en wordt later verwijderd om plaats te maken voor de presentatie van externe peptiden. * **Cross-presentatie:** Een uitzonderlijk proces waarbij sommige cellen, zoals dendritische cellen, gefagocyteerde antigenen via de MHC klasse I pathway presenteren, zelfs zonder zelf geïnfecteerd te zijn. Dit maakt de opwekking van CD8 T-celresponsen tegen virussen mogelijk. #### 4.1.4 Weefseldistributie en functie * **MHC Klasse I moleculen:** Worden op vrijwel alle lichaamscellen (behalve rode bloedcellen) tot expressie gebracht. De expressie wordt verhoogd door interferonen (IFN). Ze herkennen peptiden van intracellulaire oorsprong en worden herkend door CD8 T-cellen (cytotoxische T-cellen). * **MHC Klasse II moleculen:** Worden voornamelijk tot expressie gebracht op antigen-presenterende cellen (APC's) zoals dendritische cellen, macrofagen en B-cellen, evenals op thymusepitheelcellen. De expressie wordt verhoogd en geïnduceerd op negatieve cellen door IFN-$\gamma$. Ze herkennen peptiden van extracellulaire oorsprong en worden herkend door CD4 T-cellen (helper T-cellen). ### 4.2 MHC en auto-immuniteit De polymorfie van MHC/HLA-moleculen speelt een cruciale rol in de vatbaarheid voor auto-immuunziekten. #### 4.2.1 Genetische predispositie Verschillende HLA-allotypes zijn geassocieerd met een verhoogd risico op het ontwikkelen van specifieke auto-immuunziekten. * **Reumatoïde Artritis (RA):** Een sterke associatie is gevonden met bepaalde allelen van HLA-DRB1, met name die coderend voor aminozuur 67, 70 en 71 in de peptide-bindingsgroef. Specifieke varianten (bv. DRB1\*0401, \*0404, \*0405, \*0408) zijn geassocieerd met RA-gevoeligheid, terwijl andere (bv. DRB1\*0402) niet geassocieerd zijn. Dit suggereert dat de binding van specifieke peptiden aan deze DR-eiwitten een immuunrespons kan uitlokken die bijdraagt aan RA. * **Gecitrullineerde eiwitten:** RA-patiënten met antistoffen tegen gecitrullineerde eiwitten zijn vaak HLA-DR4 positief. Het enzym peptidylargininedeaminase (PAD) kan arginine in eiwitten omzetten naar citrulline. Gecitrullineerde peptiden afkomstig van bijvoorbeeld collageen type II kunnen binden aan HLA-DR4 moleculen en een T-cel immuunrespons induceren, die op zijn beurt de productie van antistoffen en Th1-differentiatie kan bevorderen. #### 4.2.2 Mechanismen van auto-reactiviteit door MHC * **Abnormale peptidebinding:** Specifieke HLA-varianten kunnen lichaamseigen peptiden presenteren die normaliter niet herkend zouden worden door het immuunsysteem, of ze kunnen peptiden presenteren op een manier die een auto-reactieve respons uitlokt. De polymorfie in de peptide-bindingsgroeve is hierbij leidend. * **Verschil in peptiden:** Auto-immuunziekten kunnen ontstaan wanneer een individu met een bepaalde HLA-typering specifieke lichaamseigen peptiden presenteert die een auto-reactieve T-cel respons induceren. Deze respons kan ook worden versterkt door omgevingsfactoren, zoals infecties die de expressie van PAD kunnen induceren. * **Andere genetische factoren:** Naast HLA zijn er andere genen die de vatbaarheid voor auto-immuunziekten beïnvloeden, zoals genen die betrokken zijn bij T-celactivatie (bv. PTPN22, CTLA4). De interactie tussen deze genetische factoren en omgevingsfactoren bepaalt uiteindelijk of iemand een auto-immuunziekte ontwikkelt. > **Tip:** Begrip van de interactie tussen HLA-allotypes, peptide-bindingsmotieven en de specifieke peptiden die gepresenteerd worden, is essentieel voor het verklaren van de genetische aanleg voor auto-immuunziekten. De polymorfie in de peptide-bindingsgroef van MHC-moleculen creëert verschillen in de presentatie van lichaamseigen peptiden, wat kan leiden tot een immuunrespons tegen eigen weefsels. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Adaptief immuunsysteem | Dit deel van het immuunsysteem is specifiek en ontwikkelt zich gedurende het leven door blootstelling aan pathogenen. Het kenmerkt zich door geheugen, waardoor snellere en effectievere reacties bij herhaald contact mogelijk zijn. Het omvat B-cellen en T-cellen. | | Aangeboren immuunsysteem | Het aangeboren immuunsysteem is de eerste verdedigingslinie van het lichaam. Het reageert snel en is niet-specifiek, met componenten zoals fagocyten, natural killer (NK) cellen en ontstekingsreacties. Het heeft geen geheugen. | | Alloreactiviteit | Een immuunreactie die optreedt tussen individuen van dezelfde soort, meestal veroorzaakt door verschillen in de Major Histocompatibility Complex (MHC) moleculen. Dit is de basis voor afstoting bij orgaantransplantaties. | | Antigeen | Een molecuul of structuur, vaak een eiwit of koolhydraat, dat door het immuunsysteem herkend kan worden en een immuunrespons kan opwekken. Antigeenbindende plaatsen op antistoffen en T-celreceptoren zijn complementair aan epitopen op het antigeen. | | Antilichaam (Ab) | Een Y-vormig eiwitmolecuul, geproduceerd door plasmacellen (gedifferentieerde B-cellen), dat specifiek aan een antigeen bindt. Antilichamen zijn cruciaal voor de humorale immuniteit en helpen bij de eliminatie van pathogenen. | | Antigen-presenterende cel (APC) | Cellen zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen die antigenen verwerken en presenteren aan T-cellen, meestal in combinatie met MHC-moleculen. Dit is essentieel voor het initiëren van een specifieke immuunrespons. | | Autoreactiviteit | De neiging van het immuunsysteem om eigen lichaamseigen componenten (auto-antigenen) als vreemd te herkennen en aan te vallen. Dit leidt tot auto-immuunziekten. | | Aviditeit | De totale bindingssterkte van een antilichaammolecule met meerdere bindingsplaatsen aan een antigeen of aan meerdere antigenen. Dit is anders dan affiniteit, wat de bindingssterkte van één enkele bindingsplaats betreft. | | B-cel receptor (BCR) | Een membraangebonden immunoglobuline (Ig) op het oppervlak van B-cellen dat specifieke antigenen kan herkennen. Binding van een antigeen aan de BCR initieert de activatie en differentiatie van de B-cel. | | CDR (Complementary Determining Regions) | De hypervariabele regio's (HV) van de variabele domeinen van zowel de lichte als de zware keten van een antilichaam of T-celreceptor. Deze lussen vormen de antigeenbindingsplaats en bepalen de specificiteit van de binding. | | Cellulaire immuniteit | Een arm van het immuunsysteem die voornamelijk door T-cellen wordt uitgevoerd. Het richt zich op het herkennen en vernietigen van geïnfecteerde cellen, tumorcellen en vreemde cellen, met name die met intracellulaire pathogenen. | | Combinatoire diversiteit | Een mechanisme dat bijdraagt aan de enorme diversiteit van immuunreceptoren. Het ontstaat door de willekeurige combinatie van verschillende V (variabel), D (diversity) en J (joining) gensegmenten bij de vorming van de zware keten en V en J segmenten bij de lichte keten van immunoglobulines en TCRs. | | Complement | Een systeem van eiwitten in het bloed die, wanneer geactiveerd, verschillende functies vervullen zoals het markeren van pathogenen voor fagocytose, het veroorzaken van cellysis en het aantrekken van immuuncellen. | | Cross-presentatie | Een proces waarbij antigeenpresenterende cellen (APC's), met name dendritische cellen, antigenen die normaal gesproken via de MHC klasse II pathway worden verwerkt, toch via de MHC klasse I pathway aan CD8 T-cellen presenteren. Dit is belangrijk voor het opwekken van een CD8 respons tegen extracellulaire antigenen. | | Cytokines | Signaalmoleculen, meestal eiwitten, die door immuuncellen en andere cellen worden uitgescheiden en een cruciale rol spelen in de communicatie binnen het immuunsysteem. Ze reguleren celgroei, differentiatie, activatie en migratie. | | Effector functie | De specifieke activiteit van immuuncellen of moleculen die gericht is op het elimineren van pathogenen, het bestrijden van infecties of het herstellen van weefsels. Bij antilichamen omvat dit bijvoorbeeld het activeren van complement of het markeren van bacteriën voor fagocytose. | | Epitoop | Het specifieke deel van een antigeen dat wordt herkend door een antilichaam, B-celreceptor of T-celreceptor. Een antigeen kan meerdere verschillende epitopen bevatten. | | Fagocytose | Het proces waarbij bepaalde immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen, vreemde deeltjes, pathogenen of celresten "opeten" en afbreken. Dit is een belangrijk mechanisme van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. | | Genetische loci | Specifieke locaties op chromosomen waar genen zich bevinden. Bij immuunreceptoren verwijzen ze naar de clusters van gensegmenten die coderen voor de variabele en constante delen van de ketens. | | Gesecreteerd antilichaam | Antilichamen die door plasmacellen worden geproduceerd en in de extracellulaire vloeistoffen (bloed, lymfe, weefselvocht) worden uitgescheiden. Ze zijn essentieel voor humorale immuniteit. | | Haptene | Een klein molecuul dat zelf geen immuunrespons kan opwekken, maar wel aan een groter molecuul (zoals een eiwit) kan binden en het daardoor immunogeen kan maken. Penicilline is een bekend voorbeeld. | | Humorale immuniteit | Een tak van het adaptieve immuunsysteem die wordt gemedieerd door B-cellen en de productie van antilichamen. Het richt zich voornamelijk op extracellulaire pathogenen en toxines. | | Hypervariabele regio's (HV) | Delen van de variabele domeinen van immunoglobulines en T-celreceptoren die extreem variabel zijn. Deze regio's vormen de kern van de antigeenbindingsplaats en zijn cruciaal voor de specificiteit van de receptoren. | | Ig (Immunoglobuline) | De algemene term voor antilichamen. Ze zijn een familie van eiwitten die een cruciale rol spelen in het immuunsysteem door antigenen te herkennen en te neutraliseren. | | Immuuncomplex | Een complex gevormd door de binding van een antigeen aan een antilichaam. Deze complexen kunnen het complement activeren en worden vaak opgeruimd door fagocyten. | | Immuunrespons | De reactie van het immuunsysteem op de aanwezigheid van een vreemde stof, zoals een pathogeen. Dit kan variëren van de snelle, niet-specifieke reactie van het aangeboren systeem tot de gerichte, geheugen-gebaseerde reactie van het adaptieve systeem. | | Inflammatie | Een locale reactie van het lichaam op weefselbeschadiging of infectie, gekenmerkt door roodheid, zwelling, warmte en pijn. Het is een belangrijk onderdeel van zowel het aangeboren als het adaptieve immuunsysteem. | | Interferon-gamma (IFN-gamma) | Een type cytokine dat een belangrijke rol speelt in de immuunrespons, met name bij de activatie van macrofagen en het verhogen van de expressie van MHC-moleculen op veel celtypen. | | Isotype | Verschillende klassen van immunoglobulines (IgM, IgD, IgG, IgA, IgE), die elk verschillende structurele kenmerken en effectorfuncties hebben. De klasse wordt bepaald door de constante regio van de zware keten. | | Junctionele diversiteit | Diversiteit die ontstaat tijdens de V(D)J recombinatie door de willekeurige toevoeging (door TdT) of verwijdering van nucleotiden op de recombinatieplaatsen van de genen die coderen voor de variabele regio's van immunoglobulines en TCRs. Dit draagt significant bij aan de specificiteit van de receptoren. | | Kiembaan DNA | Het genetische materiaal dat wordt doorgegeven van generatie op generatie, aanwezig in de geslachtscellen (eicellen en spermacellen). Veranderingen in kiembaan DNA zijn erfelijk. | | Klonale expansie | Het proces waarbij lymfocyten (B- en T-cellen) die een specifiek antigeen herkennen, zich snel delen en vermenigvuldigen om zo een grote populatie van klonen te vormen die allemaal dezelfde receptor specificiteit hebben. | | Lichte keten | Een van de twee typen polypeptideketens waaruit een immunoglobuline molecule is opgebouwd. Er zijn twee isotypes van lichte ketens: kappa (κ) en lambda (λ). | | Lymfocyten | Een type witte bloedcel dat een cruciale rol speelt in het adaptieve immuunsysteem. De belangrijkste typen zijn B-cellen, T-cellen en NK-cellen. | | MHC (Major Histocompatibility Complex) | Een groep genen die coderen voor eiwitten op het celoppervlak die belangrijk zijn voor immuunherkenning, met name door T-cellen. Bij mensen staat dit complex bekend als HLA (Human Leukocyte Antigen). | | MHC klasse I | MHC-moleculen die aanwezig zijn op vrijwel alle kernhoudende lichaamscellen. Ze presenteren peptiden van intracellulaire antigenen (zoals virale eiwitten) aan CD8 T-cellen. | | MHC klasse II | MHC-moleculen die voornamelijk aanwezig zijn op antigeenpresenterende cellen (APC's) zoals macrofagen, dendritische cellen en B-cellen. Ze presenteren peptiden van extracellulaire antigenen aan CD4 T-cellen. | | Natieve eiwitten | Eiwitten in hun oorspronkelijke, driedimensionale structuur, zoals ze door de cel worden geproduceerd. T-cellen herkennen geen native eiwitten, maar wel peptidefragmenten die door MHC-moleculen worden gepresenteerd. | | NHEJ (Non-homologous end joining) | Een mechanisme voor DNA-herstel dat dubbelstrengige breuken in het DNA repareert door de uiteinden van de breuk direct aan elkaar te koppelen. Dit proces kan leiden tot inserties of deleties van nucleotiden, wat mutaties veroorzaakt. | | N-nucleotiden | Willekeurig ingevoegde nucleotiden tijdens de junctionele diversiteit van immuunreceptoren. Deze worden ingevoegd door het TdT-enzym en dragen bij aan de variabiliteit van de CDR3-regio. | | P-nucleotiden | Palindromische sequenties die ontstaan na het uitknippen van het tussenliggende DNA tijdens de V(D)J recombinatie. Deze sequenties kunnen worden gebruikt als template voor het invoegen van nieuwe nucleotiden, wat bijdraagt aan de junctionele diversiteit. | | Palindroomsequenties | DNA-sequenties die van links naar rechts gelezen hetzelfde zijn als van rechts naar links, met correctie voor complementaire basen. Deze spelen een rol bij DNA-recombinatieprocessen. | | Passieve immunisatie | Het toedienen van antilichamen (bijvoorbeeld van een ander individu of dier) aan een persoon om onmiddellijke bescherming te bieden tegen een infectie of toxine. Dit biedt tijdelijke bescherming, omdat het lichaam zelf geen geheugen opbouwt. | | Pathogeen | Een micro-organisme of andere factor die ziekte kan veroorzaken, zoals een bacterie, virus, schimmel of parasiet. | | Peptide | Een korte keten van aminozuren, meestal gevormd door de afbraak van grotere eiwitten. Peptiden worden door MHC-moleculen gepresenteerd aan T-cellen. | | Proteasoom | Een groot eiwitcomplex in de cel dat verantwoordelijk is voor de afbraak van overbodige of beschadigde eiwitten. Het genereert hierbij ook peptiden die via de MHC klasse I pathway aan T-cellen kunnen worden gepresenteerd. | | Recombinatie signal sequences (RSS) | Specifieke DNA-sequenties die nodig zijn voor het enzymcomplex RAG om de genherschikking van V, D en J segmenten uit te voeren bij de vorming van immuunreceptoren. | | RAG-1 en RAG-2 | Lymfocyt-specifieke eiwitten (enzymen) die essentieel zijn voor de V(D)J recombinatie bij de vorming van B- en T-celreceptoren. Ze herkennen en knippen de RSS-sequenties en faciliteren de ligatie van de gensegmenten. | | Rechtermuis | Een term die mogelijk refereert aan experimentele modellen of diersoorten die gebruikt worden in immunologisch onderzoek. | | Somatische hypermutatie (SHM) | Een proces dat optreedt in volwassen B-cellen na antigeenstimulatie, waarbij de variabele genen van immunoglobulines willekeurige puntmutaties ondergaan. Dit leidt tot affiniteitsmaturatie, waardoor antilichamen een hogere affiniteit voor het antigeen krijgen. | | Somatische mutaties | Veranderingen in het DNA die optreden in lichaamscellen gedurende het leven van een individu. Deze mutaties zijn niet erfelijk en worden niet doorgegeven aan nakomelingen. V(D)J recombinatie en SHM zijn voorbeelden van somatische genherschikkingen in B- en T-cellen. | | Specificiteit | Het vermogen van een immuunreceptor (antilichaam of TCR) om slechts één of een beperkt aantal specifieke antigenen of epitopen te herkennen en te binden. | | T-cel receptor (TCR) | Een receptor op het oppervlak van T-cellen die specifieke antigenen, gepresenteerd door MHC-moleculen, kan herkennen. De TCR speelt een centrale rol in de cellulaire immuniteit. | | Thymus | Een primair lymfoïde orgaan dat zich in de borstkas bevindt en waar T-cellen rijpen en selectie ondergaan. In de thymus worden T-cellen getraind om zelf-antigenen te tolereren en vreemde antigenen te herkennen. | | Transposon | Een mobiel genetisch element dat zichzelf uit het ene deel van het genoom kan verplaatsen naar een ander deel. Bepaalde transposons hebben bijgedragen aan de evolutie van de genen voor immuunreceptoren. | | V(D)J recombinatie | Het proces van genherschikking dat plaatsvindt in B- en T-cellen tijdens hun ontwikkeling, waarbij verschillende V, D en J gensegmenten worden gecombineerd om de variabele regio's van immunoglobulines en T-celreceptoren te vormen. Dit genereert een enorme diversiteit aan receptoren. | | Vesiculair systeem | Een netwerk van membraanomsloten organellen binnen de cel, inclusief het endoplasmatisch reticulum, het Golgi-apparaat en endosomen. Dit systeem is betrokken bij de synthese, modificatie, sortering en transport van eiwitten en lipiden, en speelt een rol bij de antigeenverwerking en -presentatie. | | V-domein (Variabel domein) | Het deel van de variabele keten van een immunoglobuline of T-celreceptor dat het meest variabel is en direct betrokken is bij de binding van het antigeen. | | Zware keten | Een van de twee typen polypeptideketens waaruit een immunoglobuline molecule is opgebouwd. De zware keten bepaalt het isotype van het antilichaam. |

# Le support de l’information génétique et ses propriétés Voici une synthèse détaillée sur "Le support de l'information génétique et ses propriétés", conçue pour un guide d'étude exam-ready. ## 1. Le support de l’information génétique et ses propriétés L'ADN (acide désoxyribonucléique) est la molécule universelle qui porte l'information génétique, structurée en génomes dont l'organisation varie considérablement entre les procaryotes et les eucaryotes [11](#page=11). ### 1.1 L'ADN : support de l'information génétique #### 1.1.1 Découverte de l'ADN L'ADN a été découvert en 1869 par Johan Frierich Miescher. Bien que la théorie de l'hérédité ait été établie par Mendel auparavant, le lien entre l'hérédité et l'ADN n'a été pleinement compris que plus tard. À la fin du 19ème siècle, on pensait que les protéines portaient l'information génétique car l'ADN semblait trop simple. Les expériences de transformation bactérienne de Fred Griffith en 1928 ont suggéré l'existence d'un "facteur transformant". Oswald Avery et ses collaborateurs ont démontré en 1944 que ce facteur était l'ADN. L'élucidation de la structure en double hélice de l'ADN par Watson et Crick au début des années 1950 a confirmé définitivement que l'ADN est le support de l'hérédité [12](#page=12). #### 1.1.2 Structure de l'ADN La structure de l'ADN est abordée dans les prérequis MADOC. Il s'agit d'une double hélice composée de nucléotides, dont la séquence spécifique porte l'information génétique [13](#page=13). #### 1.1.3 Caractéristiques essentielles de l'information génétique L'information génétique est contenue dans les gènes, qui sont transcrits en ARN. L'ARN peut être codant (traduit en protéines) ou non codant (comme les ARN ribosomiques et de transfert). L'ADN est organisé en chromosomes. La transmission de cette information est assurée par la réplication, qui assure la conservation de l'information génétique, bien que celle-ci puisse être altérée par la recombinaison ou les mutations, conduisant à l'évolution des espèces. L'expression de l'information génétique se fait par transcription et traduction [14](#page=14). ### 1.2 Universalité de l'ADN comme support de l'information génétique Chez la majorité des organismes vivants, le support de l'information génétique est l'ADN, généralement sous forme de double brin [16](#page=16). #### 1.2.1 Localisation des génomes * **Procaryotes:** L'ADN est libre dans le cytoplasme, souvent ancré à la membrane plasmique, dans une région appelée nucléoïde. Des petites molécules d'ADN double brin circulaires, appelées plasmides, peuvent également être présentes; elles portent des gènes supplémentaires non essentiels qui confèrent un avantage, comme la résistance aux antibiotiques, et sont transmissibles entre bactéries [21](#page=21) [23](#page=23). * **Eucaryotes:** Le génome principal est situé dans le noyau, organisé en chromosomes formés d'ADN associé à des histones. Les eucaryotes photosynthétiques possèdent également de l'ADN dans les chloroplastes, et tous les eucaryotes ont de l'ADN mitochondrial [21](#page=21) [23](#page=23). #### 1.2.2 Nombre et forme des chromosomes Le nombre et la forme des chromosomes varient considérablement entre les espèces. Les procaryotes ont généralement un seul chromosome circulaire (ex: E. coli), tandis que les eucaryotes ont plusieurs chromosomes linéaires, souvent diploïdes (deux copies de chaque chromosome). Il n'y a pas de corrélation directe entre le nombre de chromosomes et la complexité de l'organisme [24](#page=24) [25](#page=25). #### 1.2.3 Taille des génomes La taille des génomes, mesurée en paires de bases (souvent en méga paires de bases, Mb), varie énormément. La corrélation entre la taille du génome et la complexité de l'organisme est imparfaite. Le nombre de gènes et, surtout, la densité génique (nombre de gènes par unité de taille) sont de meilleurs indicateurs de la complexité. Les génomes eucaryotes ont tendance à être beaucoup plus grands que les génomes procaryotes et présentent une proportion significative d'ADN non codant, souvent sous forme d'introns et de séquences intergéniques [24](#page=24) [26](#page=26) [27](#page=27). #### 1.2.4 Comparaison de séquences de génomes La comparaison de portions de génomes, comme 50 kilobases (kb), révèle des différences majeures dans l'organisation, notamment la présence de gènes morcelés (avec introns) chez les eucaryotes, contrairement aux procaryotes où les gènes sont généralement non morcelés. Les eucaryotes présentent également une abondance de séquences répétées, comme les éléments transposables et les rétrotansposons, qui sont moins présents ou organisés différemment chez les procaryotes [27](#page=27) [29](#page=29). ### 1.3 Le génome procaryote : exemple d'E. coli Le génome d'Escherichia coli (E. coli) est un exemple typique de génome procaryote [29](#page=29). * **Taille et organisation:** Le génome d'E. coli K12 mesure environ 4,6 millions de paires de bases (Mb) et contient environ 4400 gènes identifiés. Il est caractérisé par une grande compacité, avec très peu d'ADN non codant (environ 11%) et peu d'espace entre les gènes [29](#page=29). * **Gènes non morcelés:** Les gènes d'E. coli ne contiennent pas d'introns [29](#page=29). * **Opérons:** Les gènes sont souvent organisés en opérons, des unités transcrites ensemble. E. coli possède environ 600 opérons [29](#page=29). * **ADN non codant:** La majorité des séquences non codantes sont impliquées dans la régulation transcriptionnelle, et il y a quelques séquences répétées, comme les séquences d'insertion (IS) [29](#page=29). #### 1.3.1 Éléments transposables chez E. coli Les éléments transposables, ou transposons, sont des séquences d'ADN capables de se déplacer de manière autonome dans le génome [30](#page=30). * **Découverte:** Découverts par Barbara McClintock dans les années 1940 chez le maïs [30](#page=30). * **Rôle:** Ils jouent un rôle fondamental dans l'évolution et la plasticité des génomes, contribuant à la variabilité génétique. Ils peuvent avoir un effet mutagène s'ils s'insèrent dans une séquence codante [30](#page=30). * **Mécanismes de transposition :** Deux mécanismes principaux existent : * **Transposition conservative (couper/coller):** Implique une transposase [31](#page=31) [33](#page=33) [34](#page=34). * **Transposition réplicative (copier/coller):** Implique une transposase et une résolvase [31](#page=31) [34](#page=34). * **Structures des éléments mobiles :** * **Séquence d'insertion (IS):** Contient des gènes codant la transposase et des répétitions terminales inversées (ITR) [32](#page=32) [33](#page=33). * **Transposon composite:** Composé de deux éléments IS encadrant un ou plusieurs gènes [33](#page=33) [34](#page=34). * **Transposon de type Tn3:** Possède des gènes codant la transposase et la résolvase, mais pas d'IS [34](#page=34). ### 1.4 Génome eucaryote : exemple du génome humain Le génome eucaryote, illustré par le génome humain, présente une organisation beaucoup plus complexe que celui des procaryotes [36](#page=36). #### 1.4.1 Les chromosomes et le caryotype * **Structure:** Les chromosomes eucaryotes, visibles lors de la division cellulaire en métaphase, sont des structures hautement condensées de chromatine. Un chromosome en métaphase, après réplication et avant séparation, est constitué de deux chromatides sœurs attachées par le centromère [37](#page=37). * **Classification:** Les chromosomes sont classés selon leur taille et leur index centromérique (rapport entre la taille du bras court et du bras long) en métacentriques, submétacentriques et acrocentriques [38](#page=38). * **Nomenclature des locus:** La localisation précise d'un gène sur un chromosome est appelée locus. Elle est décrite par le numéro du chromosome, le bras (p pour court, q pour long), et une série de chiffres et de lettres indiquant la région, la bande et la sous-bande [40](#page=40). * **Hétérochromatine:** L'hétérochromatine constitutive est très compacte, peu transcrite, et joue un rôle structurel. Elle comprend les régions des rDNA (unités de transcription des ARN ribosomiques), les centromères (essentiels à la ségrégation des chromosomes) et les télomères (extrémités des chromosomes composées de répétitions TTAGGG) [39](#page=39). #### 1.4.2 Organisation du génome eucaryote Le génome eucaryote est composé de gènes (uniques, familles de gènes, gènes répétés) et de nombreuses séquences non codantes [42](#page=42). * **Les gènes :** * **Gènes uniques:** Représentent 25 à 50% des gènes chez les organismes pluricellulaires, présents en une seule copie (deux chez les diploïdes comme l'homme). Exemple: le gène du lysozyme chez la poule, qui comprend des exons et des introns [43](#page=43) [44](#page=44) [45](#page=45). * **Familles de gènes:** Formées par la duplication et la divergence d'un gène ancestral, elles codent pour des protéines similaires mais non identiques. Un exemple notable est la famille des gènes de la globine chez l'homme, située sur différents chromosomes, dont les différentes versions (alpha, bêta, gamma, etc.) sont exprimées à différents stades de développement [46](#page=46) [47](#page=47) [48](#page=48) [49](#page=49). * **Gènes répétés :** * **En cluster (en tandem):** Regroupés et répétés à la suite. Exemples: les gènes codant pour les histones, nécessaires en grande quantité dans les cellules eucaryotes, sont organisés en clusters répétés en tandem. Les gènes codant pour les ARN ribosomiques (ARNr 18S, 5.8S, 28S) sont aussi répétés en tandem et localisés sur les chromosomes acrocentriques. L'ARNr 5S est aussi répété en tandem, mais sur le chromosome 1 [45](#page=45) [51](#page=51) [52](#page=52) [53](#page=53). * **Dispersés:** Non regroupés et répartis dans le génome. Exemples: les gènes codant pour les ARN de transfert (ARNt) et les familles de gènes dispersés comme les actines et les tubulines [45](#page=45) [53](#page=53) [54](#page=54). * **Les pseudogènes et fragments de gènes :** * **Pseudogènes:** Séquences ressemblant à des gènes fonctionnels mais qui ne codent pas de protéines fonctionnelles en raison de mutations (ex: apparition de codons stop). Ils peuvent être des pseudogènes conventionnels ou modifiés (copies d'ARNm sans promoteur, sans introns) [50](#page=50) [56](#page=56) [57](#page=57). * **Fragments de gènes:** Vestiges de gènes tronqués ou incomplets résultant de duplications ou translocations partielles [58](#page=58). * **Les séquences intergéniques:** Représentent la majeure partie du génome eucaryote et sont considérées comme non codantes, bien qu'elles contiennent des éléments régulateurs. Elles incluent les séquences répétées [59](#page=59). * **Séquences répétées en tandem (ADN satellite) :** Constitués de courtes unités répétées des milliers de fois. * **Satellites:** Unités de 10 à 100 pb, organisées en blocs [61](#page=61) [62](#page=62). * **Minisatellites (VNTR):** Unités de 100 à 20 000 pb. Hypervariables en raison de la recombinaison inégale, elles sont utilisées pour l'empreinte génétique [62](#page=62) [63](#page=63) [64](#page=64). * **Microsatellites (STR):** Unités de 1 à 6 pb, généralement moins de 150 pb. La variabilité provient de glissements lors de la réplication [62](#page=62) [63](#page=63). Les mini- et microsatellites sont généralement localisés au même endroit chez tous les individus, mais leur longueur (nombre de répétitions) varie, permettant d'établir un profil unique pour chaque individu (empreinte génétique). Ils sont souvent localisés près des télomères et des centromères [63](#page=63) [64](#page=64). * **Séquences répétées dispersées :** Ce sont des éléments mobiles qui peuvent se déplacer dans le génome. * **Transposons (éléments transposables de classe II):** Existent chez les procaryotes et les eucaryotes. Chez les eucaryotes, ils ont des caractéristiques propres (promoteur eucaryote, introns). Les modes de transposition sont conservative (couper/coller) et réplicative (copier/coller). Exemples: élément P chez la drosophile, Tn10, Tn5 [65](#page=65) [66](#page=66). * **Rétrotransposons (éléments transposables de classe I):** Trouvés uniquement chez les eucaryotes et plus fréquents que les transposons ADN. Ils se transposent sous forme d'ARN et présentent des similitudes avec les rétrovirus. Leur déplacement nécessite une transcription ADN -> ARN, puis une rétrotranscription ARN -> ADNc [65](#page=65) [67](#page=67) [68](#page=68). * **Type I (avec LTR):** Ressemblent aux rétrovirus (ex: Copia chez la drosophile) [68](#page=68) [69](#page=69). * **Type II (sans LTR):** Incluent les LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) et les SINE (Short Interspersed Nuclear Elements). Les LINE codent souvent pour une transcriptase inverse, tandis que les SINE empruntent celle produite par d'autres éléments. Exemples: LINE-1 chez l'homme, séquences Alu (très abondantes) [68](#page=68) [70](#page=70). --- # La transmission du message génétique : la réplication La réplication de l'ADN est le processus fondamental par lequel une molécule d'ADN double brin est dupliquée pour produire deux copies identiques, assurant ainsi la transmission fidèle de l'information génétique lors de la division cellulaire. ### 1. Preuve expérimentale de la réplication semi-conservative L'expérience de Meselson-Stahl a démontré que la réplication de l'ADN est semi-conservative. Cette hypothèse stipule que chaque nouvelle molécule d'ADN est composée d'un brin parental et d'un brin nouvellement synthétisé [73](#page=73) [81](#page=81). #### 1.1. L'expérience de Meselson-Stahl Cette expérience a utilisé des cultures de bactéries *E. coli* dans des milieux enrichis en azote lourd (¹⁵N) puis en azote léger (¹⁴N) pour suivre la distribution de l'azote dans les molécules d'ADN après plusieurs cycles de division. En analysant l'ADN par centrifugation en gradient de densité, ils ont observé qu'après une division, l'ADN était d'une densité intermédiaire, et après deux divisions, moitié était légère et moitié intermédiaire, ce qui correspond au modèle semi-conservatif [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [78](#page=78) [80](#page=80). ### 2. La réplication chez les procaryotes Chez les procaryotes, la réplication de l'ADN est un processus rapide et efficace, caractérisé par une seule origine de réplication et une terminaison spécifique [83](#page=83). #### 2.1. L'initiation L'initiation débute à une origine de réplication unique, nommée OriC, qui contient des séquences consensus riches en A-T. La protéine DnaA se lie à ces séquences, entraînant l'ouverture de la double hélice d'ADN. Ce processus est facilité par la protéine HU et nécessite de l'ATP. L'hélicase DnaB est ensuite recrutée pour dérouler davantage l'ADN. Des protéines SSB (Single-Strand Binding proteins) stabilisent les brins simples exposés, et la gyrase aide à soulager la tension topologique. La primase (DnaG) synthétise ensuite une amorce d'ARN nécessaire au démarrage de la synthèse de l'ADN par les ADN polymérases [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88). #### 2.2. L'élongation L'élongation est la phase de synthèse de nouvelles chaînes d'ADN. Elle est principalement assurée par l'ADN polymérase III chez *E. coli*. Pour que la synthèse d'ADN soit possible, plusieurs éléments sont nécessaires: une matrice d'ADN, des amorces (souvent d'ARN), les quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), et des ions magnésium ($Mg^{2+}$). La polymérisation se fait toujours dans le sens $5'$ vers $3'$ du brin en cours de synthèse [90](#page=90) [94](#page=94) [95](#page=95). ##### 2.2.1. Les ADN polymérases chez les procaryotes Chez *E. coli*, l'ADN polymérase III est la principale enzyme de réplication, responsable de l'élongation. L'ADN polymérase I intervient également, notamment dans le remplacement des amorces d'ARN par de l'ADN et dans la réparation. L'ADN polymérase II est impliquée dans la réparation de l'ADN [90](#page=90) [98](#page=98). ##### 2.2.2. Les étapes de la réplication à la fourche de réplication La réplication est bidirectionnelle, se déroulant simultanément à partir de l'origine dans deux directions opposées, formant des fourches de réplication [83](#page=83) [96](#page=96). * **Brin précoce (leader)**: Synthétisé de manière continue, dans le sens de l'ouverture de la fourche de réplication [97](#page=97). * **Brin tardif (lagging)**: Synthétisé de manière discontinue sous forme de fragments d'Okazaki, car la synthèse se fait à contresens de l'ouverture de la fourche. Chaque fragment nécessite une amorce d'ARN [97](#page=97). ##### 2.2.3. La résolution des fragments d'Okazaki Après la synthèse des fragments d'Okazaki, l'amorce d'ARN doit être retirée et remplacée par de l'ADN. L'ADN polymérase I utilise son activité exonucléasique $5' \to 3'$ pour dégrader l'amorce d'ARN et son activité polymérasique $5' \to 3'$ pour synthétiser de l'ADN à sa place. Enfin, une ligase lie les fragments d'ADN nouvellement synthétisés pour former une chaîne continue [98](#page=98) [99](#page=99). ##### 2.2.4. Remplacement des amorces ARN Dans le cas du brin précoce (synthèse continue) et des fragments d'Okazaki sur le brin tardif, les amorces d'ARN sont remplacées par de l'ADN par l'ADN polymérase I, suivie d'une ligation [100](#page=100) [98](#page=98) [99](#page=99). ##### 2.2.5. Les deux fourches de réplication La réplication chez *E. coli* implique deux fourches de réplication se déplaçant en sens opposés à partir de l'origine OriC [83](#page=83). ##### 2.2.6. Fonctionnement de l'ADN polymérase III L'ADN polymérase III agit comme un dimère, capable de synthétiser à la fois le brin précoce et le brin tardif, assurant ainsi la réplication continue des deux brins . #### 2.3. La terminaison La terminaison de la réplication chez les procaryotes se produit dans une région spécifique contenant des séquences de terminaison (Ter). La protéine Tus se lie à ces séquences et peut bloquer la progression des fourches de réplication dans une direction spécifique, empêchant ainsi une sur-réplication . #### 2.4. Erreurs et correction lors de la réplication La fidélité de la duplication de l'ADN est cruciale pour la survie de l'organisme . ##### 2.4.1. Activité d'édition des ADN polymérases Les ADN polymérases I et III possèdent une activité exonucléasique $3' \to 5'$ (proofreading) qui corrige les erreurs de polymérisation, réduisant le taux d'erreur de $10^{-5}$ à $10^{-7}$. Après correction, une nouvelle synthèse est effectuée . ##### 2.4.2. Réparation des mésappariements (Mismatch Repair) Ce système intervient après la réplication pour corriger les erreurs résiduelles. Il implique les protéines MutS, MutL, et MutH. MutS détecte les mésappariements, MutL aide à l'identification du brin erroné, et MutH coupe le brin néosynthétisé au niveau des sites GATC non méthylés (la méthylation, assurée par le système Dam, distingue le brin parental du brin fils juste après la réplication). Le brin erroné est ensuite excisé par une exonucléase, la brèche comblée par une ADN polymérase, et les fragments ligaturés par une ligase. Ces mécanismes portent le taux d'erreur final de la réplication à $10^{-8}$ à $10^{-10}$ bases par . ### 3. Particularités de la réplication chez les eucaryotes La réplication chez les eucaryotes présente plusieurs différences par rapport aux procaryotes, principalement dues à la taille du génome et à la structure de la chromatine . #### 3.1. L'initiation Les chromosomes eucaryotes sont beaucoup plus longs et possèdent de multiples origines de réplication. L'initiation est strictement régulée et se déroule en deux phases : * **"Licensing" (pré-activation)**: Pendant la phase G1 du cycle cellulaire, les origines sont sélectionnées et préparées sous forme de complexe pré-RC (pré-Replication Complex) comprenant Orc, cdc6, cdt1, et MCM . * **"Firing" (activation)**: Lors de la transition G1/S, le pré-RC est activé, recrutant d'autres facteurs pour former le complexe de pré-initiation (Pré-IC), entraînant l'ouverture de l'ADN et le recrutement des protéines de la réplication . #### 3.2. Les acteurs de la réplication Les eucaryotes possèdent plusieurs ADN polymérases impliquées dans la réplication : * **ADN Pol $\alpha$/primase**: Synthèse de l'amorce ARN-ADN . * **ADN Pol $\epsilon$**: Allongement du brin précoce . * **ADN Pol $\delta$**: Allongement du brin tardif et réparation . * **ADN Pol $\gamma$**: Réplication de l'ADN mitochondrial . * **ADN Pol $\beta$**: Réparation de l'ADN . D'autres protéines essentielles incluent RPA (recouvre l'ADN simple brin), PCNA (la "pince à coulisse" qui maintient l'ADN polymérase sur la matrice), et RFC (chargeur de PCNA). La maturation des fragments d'Okazaki implique des ribonucléases (Ribonucléase H, FEN1) et une ligase . #### 3.3. Le déroulement de l'hélice est complexe L'ADN chez les eucaryotes est associé à des histones, formant la chromatine. Le déroulement de l'hélice d'ADN doit surmonter la structure des nucléosomes, ce qui rend le processus de réplication plus complexe que chez les procaryotes . #### 3.4. Le problème des télomères Les extrémités des chromosomes eucaryotes, appelées télomères, sont constituées de séquences répétées qui ne sont pas complètement copiées lors de la réplication du brin tardif. Ceci conduit à un raccourcissement des télomères à chaque division cellulaire. La télomérase, une ADN polymérase ADN-indépendante, est capable d'allonger ces extrémités pour compenser le raccourcissement. Ce mécanisme est essentiel pour la division des cellules germinales et des cellules cancéreuses, tandis que son absence dans la plupart des cellules somatiques humaines contribue à la sénescence cellulaire . #### 3.5. Réparation des erreurs Les eucaryotes possèdent des mécanismes de réparation des mésappariements similaires à ceux des procaryotes, impliquant des protéines homologues comme les protéines MSH (équivalent de MutS) et MLH/PMS (équivalent de MutL). Cependant, il y a des différences notables, notamment l'absence d'une protéine équivalente à MutH et du système de méthylation pour distinguer le brin parental du brin fils . #### 3.6. Dommages à l'ADN en dehors de la réplication L'ADN cellulaire peut être endommagé par divers agents (UV, pesticides, etc.). Des mécanismes de réparation complexes existent chez les eucaryotes pour réparer ces dommages. Le dysfonctionnement de ces mécanismes peut entraîner des pathologies, comme le Xeroderma pigmentosum, une maladie génétique causant une hypersensibilité aux UV et une forte incidence de cancers de la peau. Ces mécanismes de réparation sont également la cible de certaines chimiothérapies . --- # Structure des gènes et expression du message génétique chez E. coli Ce chapitre détaille le processus d'expression du message génétique chez E. coli, en se concentrant sur la transcription et la traduction, deux étapes fondamentales du dogme central de la biologie moléculaire . ### 3.1 Le dogme central de la biologie moléculaire Le dogme central, proposé par Francis Crick en 1956, décrit le flux d'information génétique de l'ADN vers l'ARN, puis vers les protéines. Chez les procaryotes comme E. coli, ce processus est particulièrement efficace en raison de l'absence de compartiment nucléaire, permettant la transcription et la traduction de se dérouler simultanément dans le cytosol . ### 3.2 La transcription La transcription est le processus de synthèse d'un ARN à partir d'une matrice d'ADN, catalysée par l'ARN polymérase. Chez E. coli, une seule enzyme, l'ARN polymérase, est responsable de cette tâche . #### 3.2.1 L’ARN polymérase d’E. coli L'ARN polymérase est un complexe enzymatique d'environ 500 kDa, composé de six sous-unités: $\alpha_2 \beta \beta' \omega$ . * La sous-unité $\omega$ participe à l'assemblage et à la stabilité de l'enzyme . * Les sous-unités $\alpha$ sont impliquées dans la synthèse de l'ARN et l'association non spécifique au promoteur . * Les sous-unités $\beta$ et $\beta'$ sont essentielles à l'activité polymérasique et à la synthèse de l'ARN . Pour reconnaître spécifiquement les régions promotrices, l'enzyme cœur ($\alpha_2 \beta \beta' \omega$) s'associe à un facteur sigma ($\sigma$) pour former l'holoenzyme ($\alpha_2 \beta \beta' \omega \sigma$). Le facteur $\sigma^{70}$ est le plus prédominant chez E. coli et reconnaît une classe de promoteurs partageant des caractéristiques communes . #### 3.2.2 Structure du gène procaryote Un gène procaryote est délimité par un promoteur en amont et un terminateur en aval . * **Promoteur**: Région d'ADN où l'ARN polymérase se fixe pour initier la transcription . * **Séquence codante**: Région de l'ADN qui sera transcrite en ARN messager et ensuite traduite en polypeptide. Elle contient le codon initiateur (souvent AUG) et le codon stop . * **UTR (UnTranslated Region)**: Régions non traduites situées en 5' et 3' de la séquence codante sur l'ARNm . * **Terminateur**: Séquence d'ADN qui signale la fin de la transcription . #### 3.2.3 Structure du promoteur d’E. coli Les promoteurs chez E. coli, reconnus par le facteur $\sigma^{70}$, possèdent des séquences consensus . * **Région -10 (Pribnow box)**: Séquence de 6 nucléotides, typiquement TATAAT, située environ 10 paires de bases en amont du site d'initiation (+1) . * **Région -35**: Séquence de 6 nucléotides, typiquement TTGACA, située environ 35 paires de bases en amont du site d'initiation (+1) . * La distance entre ces deux régions est cruciale pour une transcription efficace . L'expression de certains gènes peut être régulée par des protéines régulatrices (activateurs ou répresseurs) qui se fixent sur des séquences opératrices, souvent situées à proximité du promoteur . #### 3.2.4 Les étapes de la transcription La transcription se déroule en trois phases: initiation, élongation et terminaison . ##### 3.2.4.1 L’initiation de la transcription 1. **Reconnaissance et fixation du promoteur**: L'holoenzyme ARN polymérase se lie au promoteur. Cela forme un complexe binaire fermé . 2. **Ouverture de l'ADN**: L'ARN polymérase induit un changement conformationnel qui ouvre la double hélice d'ADN au niveau de la région -10, riche en A-T, formant un complexe binaire ouvert. Une bulle de transcription se crée . 3. **Premières synthèses d'ARN**: L'enzyme commence à synthétiser de courts ARN (jusqu'à 10 nucléotides), souvent de manière avortée . 4. **Passage à l'élongation**: Une fois qu'un transcrit d'ARN d'environ 10 nucléotides est synthétisé avec succès, le facteur sigma se dissocie de l'enzyme, et l'enzyme cœur peut initier la phase d'élongation . ##### 3.2.4.2 L’élongation L'enzyme cœur de l'ARN polymérase se déplace le long du brin matrice d'ADN, synthétisant l'ARN dans le sens $5' \rightarrow 3'$. Le taux d'élongation est d'environ 40 nucléotides par seconde. Une dizaine de nucléotides restent hybridés à l'ADN pendant la transcription. Des protéines comme le dimère NusA, et plus tard Nus B, E, et G, se fixent à l'enzyme cœur et jouent un rôle dans la processivité et la terminaison . ##### 3.2.4.3 La terminaison La transcription s'arrête au niveau de régions appelées terminateurs. Il existe deux mécanismes principaux : * **Terminaison Rho indépendante**: Ces terminateurs contiennent des séquences palindromiques riches en GC suivies d'une séquence riche en A. La structure en épingle à cheveux formée dans l'ARN arrête ou ralentit l'ARN polymérase. La région riche en A forme un hybride ADN-ARN peu stable, facilitant le décrochage de l'ARN et la dissociation du complexe transcriptionnel . * **Terminaison Rho dépendante**: Ce mécanisme fait intervenir la protéine Rho, un hexamère à activité ATPasique. Rho se lie à un site spécifique sur l'ARN (rut) et utilise l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP pour se déplacer le long de l'ARN. Rho rattrape l'ARN polymérase lorsqu'elle est ralentie par des structures secondaires (séquences palindromiques) dans l'ARN, provoquant la dissociation du complexe . ### 3.3 La traduction La traduction est le processus par lequel l'information portée par l'ARNm est utilisée pour synthétiser une protéine. Elle implique plusieurs composants clés: ARNm, ARNt, aminoacyl-ARNt synthétases et ribosomes . #### 3.3.1 ARNm - Cadre de lecture et code génétique L'ARNm porte la séquence codante sous forme de codons, des triplets de nucléotides . * **ORF (Open Reading Frame)**: Région codante de l'ARNm, composée de codons non chevauchants . * **Codon initiateur**: Généralement 5'-AUG-3', il marque le début de la traduction et spécifie la première méthionine (Met) ou N-formylméthionine (fMet) chez les procaryotes. Il définit le cadre de lecture . * **Codon stop**: UAA, UAG, ou UGA, ils signalent la terminaison de la synthèse protéique . **Code génétique**: Le code génétique établit la correspondance entre les 64 codons possibles (4 nucléotides$^3$) et les 20 acides aminés constituant les protéines . * 61 codons codent pour les 20 acides aminés. * 3 codons sont des codons stop . Le code génétique est **dégénéré**, signifiant que plusieurs codons peuvent spécifier le même acide aminé (sauf pour la méthionine et le tryptophane). Cette dégénérescence porte principalement sur la troisième base du codon . #### 3.3.2 Les ARNt (ARN de transfert) Les ARNt sont des molécules adaptatrices qui lient un acide aminé spécifique à un codon de l'ARNm grâce à leur anticodon . * Ils possèdent une structure secondaire en "feuille de trèfle" due à l'auto-complémentation de certaines régions . * Tous les ARNt possèdent une extrémité 3' avec la séquence 5'-CCA-3', site de liaison de l'acide aminé . * En raison de la dégénérescence du code génétique, il existe plusieurs ARNt pour un même acide aminé, appelés **ARNt isoaccepteurs**. Ils lient le même acide aminé mais présentent un anticodon différent . #### 3.3.3 Les Aminoacyl-ARNt synthétases et le chargement des ARNt Les aminoacyl-ARNt synthétases sont des enzymes essentielles qui catalysent la fixation de l'acide aminé approprié à son ARNt correspondant. Chaque enzyme reconnaît un seul acide aminé et tous les ARNt isoaccepteurs sur lesquels cet acide aminé peut se lier . Le chargement des acides aminés sur les ARNt, appelé acylation, se déroule en deux étapes : 1. **Activation de l'acide aminé**: L'acide aminé est adénylé par l'ATP, formant un complexe enzyme/acide aminé activé (Acide Aminé-AMP) . 2. **Transfert de l'acide aminé sur l'ARNt**: L'acide aminé activé est transféré sur l'extrémité 3' de l'ARNt, formant un aminoacyl-ARNt chargé et libérant de l'AMP . #### 3.3.4 Mutations non sens et souches suppressives Les mutations affectant les ARNt peuvent avoir des conséquences sur la traduction. Les **souches suppressives** sont des bactéries mutantes où un ARNt a une mutation au niveau de son anticodon. Si cet anticodon devient complémentaire d'un codon stop, il peut permettre la traduction de ce codon stop, empêchant ainsi la terminaison prématurée de la protéine. Par exemple, une mutation sur un ARNt de tyrosine peut faire en sorte qu'il reconnaisse le codon stop UAG (ambre) et le traduise en tyrosine. Ces mutations sont exploitées en laboratoire pour étudier des protéines d'intérêt . #### 3.3.5 Le ribosome et son recrutement Le ribosome est la machinerie moléculaire responsable de la synthèse protéique. Il est composé de deux sous-unités : * **Petite sous-unité (30S)**: Contient l'ARNr 16S (1540 nucléotides) et 21 protéines. L'ARNr 16S joue un rôle clé dans la reconnaissance de l'ARNm . * **Grande sous-unité (50S)**: Contient les ARNr 23S (2900 nucléotides) et 5S (120 nucléotides), ainsi que 32 protéines. Elle possède l'activité peptidyl transférase . L'ensemble forme un ribosome 70S chez les procaryotes . Pour que la traduction commence, le ribosome doit être recruté sur l'ARNm au bon endroit. Ceci est assuré par le **Site de Liaison des Ribosomes (RBS)**, aussi appelé séquence Shine-Dalgarno (SD), une courte séquence (3 à 9 nucléotides) située en amont du codon START. La séquence SD (souvent 5'-AGGAGGU-3') est complémentaire d'une séquence de l'ARNr 16S, permettant l'alignement du ribosome sur l'ORF . #### 3.3.6 Mécanisme de la traduction La traduction se déroule en trois phases: initiation, élongation et terminaison . ##### 3.3.6.1 Initiation L'initiation de la traduction implique : 1. **Recrutement du ribosome sur l'ARNm**: La petite sous-unité (30S) se lie à l'ARNm au niveau du RBS, facilitée par le facteur d'initiation IF3 . 2. **Positionnement de l'ARNt initiateur**: L'ARNt initiateur, chargé de N-formylméthionine (fMet), est apporté au complexe par le facteur IF2, et s'apparie avec le codon initiateur (AUG) dans le site P du ribosome . 3. **Formation du ribosome 70S**: La grande sous-unité (50S) se joint à la petite sous-unité, consommant de l'énergie (GTP $\rightarrow$ GDP + Pi), et libérant les facteurs d'initiation IF1, IF2, et IF3. Le ribosome complet est maintenant prêt pour l'élongation . * **NB sur la fMet**: Chez les procaryotes, la première méthionine est souvent formylée. La déformylase peut enlever le groupe formyle, et des aminopeptidases peuvent ensuite retirer la Met N-terminale . ##### 3.3.6.2 Élongation L'élongation est la synthèse de la chaîne peptidique et implique trois événements clés à chaque cycle : 1. **Arrivée d'un aminoacyl-ARNt**: Un nouvel aminoacyl-ARNt, correspondant au codon présent dans le site A du ribosome, est amené par le facteur d'élongation EF-Tu lié au GTP . 2. **Formation de la liaison peptidique**: L'activité peptidyl transférase de la grande sous-unité du ribosome catalyse la formation d'une liaison peptidique entre l'acide aminé du site A et la chaîne peptidique attachée à l'ARNt du site P. La chaîne polypeptidique est ainsi transférée sur l'ARNt du site A . 3. **Translocation**: Le ribosome se déplace de trois nucléotides le long de l'ARNm grâce au facteur d'élongation EF-G. L'ARNt porteur de la chaîne peptidique passe du site A au site P, et l'ARNt déchargé du site P migre vers le site E (vide) avant d'être éjecté. Le site A est alors libre pour l'arrivée d'un nouvel aminoacyl-ARNt. EF-Ts aide à régénérer EF-Tu lié au GTP . ##### 3.3.6.3 Inhibition de la traduction par des antibiotiques Certains antibiotiques inhibent la traduction en se liant spécifiquement aux ribosomes procaryotes. La puromycine, par exemple, ressemble à un aminoacyl-ARNt et est reconnue par le site A du ribosome. Elle peut se lier à la chaîne peptidique en cours de synthèse, entraînant une terminaison prématurée de la traduction . ##### 3.3.6.4 Terminaison La terminaison survient lorsqu'un codon stop (UAA, UAG, ou UGA) atteint le site A du ribosome. Il n'y a pas d'ARNt correspondant à ces codons. Au lieu de cela, des facteurs de libération (RF) reconnaissent les codons stop . * RF1 reconnaît UAA et UAG. * RF2 reconnaît UAA et UGA. * RF3 facilite la libération de RF1 et RF2 . Ces facteurs provoquent l'hydrolyse de la liaison entre le polypeptide et l'ARNt du site P, libérant la protéine synthétisée, le dernier ARNt, l'ARNm, et induisant la dissociation des sous-unités ribosomales. Ce processus permet le recyclage du ribosome . #### 3.3.7 Transcription et traduction sont quasiment simultanées chez E. coli Chez les procaryotes, en raison de l'absence de noyau, la traduction peut commencer sur un ARNm avant même que sa transcription ne soit terminée. Plusieurs ribosomes peuvent ainsi se fixer sur le même ARNm en cours de synthèse, formant des **polysomes**. Cette simultanéité maximise l'efficacité de l'expression génétique . --- # Régulation de l’expression génique chez les procaryotes La régulation de l'expression génique chez les procaryotes permet d'adapter la production de protéines aux besoins cellulaires, principalement au niveau transcriptionnel mais aussi traductionnel, en utilisant des structures génétiques organisées comme les opérons et divers mécanismes moléculaires . ### 4.1 Organisation des gènes en opérons Chez les procaryotes, les gènes impliqués dans une même voie métabolique ou une fonction physiologique similaire sont souvent regroupés en unités de transcription appelées opérons. Ces opérons peuvent être monocistroniques, codant pour une seule protéine, ou polycistroniques, où un seul ARNm porte plusieurs séquences codantes (ORFs ou cistrons), permettant la synthèse de plusieurs polypeptides. La traduction d'ARNm polycistroniques dépend de la présence de séquences Shine-Dalgarno (SD) associées à chaque ORF, bien que la proximité du codon stop d'une ORF et de l'AUG de la suivante puisse influencer l'efficacité de la traduction de la seconde ORF . ### 4.2 Régulation de l'expression génique La régulation de l'expression génique vise à moduler la quantité de protéines produites selon les besoins cellulaires, principalement au niveau transcriptionnel pour minimiser la dépense énergétique, mais aussi au niveau traductionnel pour une réponse plus rapide et précise . #### 4.2.1 Régulation traductionnelle La régulation traductionnelle intervient souvent au niveau de l'initiation de la traduction, par exemple en masquant la séquence Shine-Dalgarno (RBS) par des protéines régulatrices ou par le repliement de l'ARNm, empêchant ainsi la fixation de la sous-unité 30S du ribosome. Un exemple notable est la régulation des protéines ribosomiques. Leur synthèse est étroitement coordonnée avec celle des ARNr, et leur taux est modulé rapidement en fonction des conditions de croissance . ##### 4.2.1.1 Autorégulation des protéines ribosomiques Les protéines ribosomiques peuvent s'autoréguler en se liant à leur propre ARNm près de la séquence d'initiation de la traduction, provoquant un encombrement stérique qui empêche l'initiation. Ce mécanisme peut affecter la traduction de tous les ORFs de l'opéron s'il y a couplage entre eux ou si le repliement de l'ARNm rend les différentes séquences SD inaccessibles . ##### 4.2.1.2 Couplage avec la synthèse d'ARNr La synthèse des protéines ribosomiques est également couplée à la disponibilité des ARNr. En présence d'ARNr, les protéines ribosomiques régulatrices se lient préférentiellement à ceux-ci. En leur absence, ces protéines régulatrices se lient à l'ARNm et empêchent la traduction des protéines ribosomiques . #### 4.2.2 Régulation transcriptionnelle La régulation transcriptionnelle adapte la quantité d'ARN transcrits en fonction des besoins cellulaires et se concentre majoritairement sur l'initiation de la transcription . ##### 4.2.2.1 Facteurs sigma Les facteurs sigma sont des sous-unités de l'ARN polymérase qui jouent un rôle crucial dans la reconnaissance des promoteurs. Chez *E. coli*, le facteur majoritaire est Sigma 70 (s70), mais d'autres facteurs, tels que s32 (facteur de choc thermique) ou s54 (impliqué dans le métabolisme de l'azote), peuvent diriger l'ARN polymérase vers des ensembles spécifiques de gènes dans des conditions particulières. *B. subtilis* utilise également sA et sF (facteur de sporulation) . ##### 4.2.2.2 Types de promoteurs et leur régulation La force d'un promoteur dépend de sa séquence et de son affinité pour l'ARN polymérase holoenzyme, influençant l'efficacité de la transcription. Les promoteurs sont classifiés selon l'étape limitante de la transcription : 1. **Promoteurs où l'étape limitante est la fixation de l'ARN polymérase** : * Ces promoteurs ont une faible affinité pour l'ARN pol, souvent en raison d'éléments éloignés de la séquence consensus. * Une fois fixée, la formation du complexe ouvert est aisée. * Ils induisent une expression basale faible. * La régulation fait appel à des **répresseurs** (qui bloquent la fixation de l'ARN pol) ou des **activateurs** (qui aident la fixation de l'ARN pol) . 2. **Promoteurs où l'étape limitante est l'ouverture du complexe binaire fermé** : * La liaison au promoteur est forte, mais l'ouverture de l'ADN pour former le complexe ouvert est difficile. * L'activation implique des **activateurs** qui induisent un changement conformationnel de l'ARN polymérase pour faciliter l'ouverture . 3. **Promoteurs où l'étape limitante est l'échappement du promoteur** : * La fixation de l'ARN pol et l'ouverture du complexe sont efficaces, mais l'échappement pour initier l'élongation est bloqué. * L'activation par un **activateur** provoque un changement conformationnel de l'ARN polymérase qui permet l'échappement . ##### 4.2.2.3 Protéines régulatrices Les protéines régulatrices, appelées éléments TRANS-régulateurs, se fixent sur des séquences spécifiques de l'ADN appelées éléments CIS-régulateurs, souvent situées à proximité des promoteurs (opérateurs) mais pouvant aussi agir à distance en modifiant la structure de l'ADN (formation de boucles). Ces protéines peuvent être des activateurs, stimulant la transcription, ou des répresseurs, l'inhibant. L'intégration de plusieurs signaux peut nécessiter l'action combinée de plusieurs protéines régulatrices. Un exemple est la protéine NtrC qui contrôle les gènes du métabolisme de l'azote en se liant à un site régulateur à 150 paires de bases en amont du promoteur et en formant une boucle d'ADN interagissant avec l'ARN polymérase via s54, induisant un changement conformationnel pour ouvrir le complexe . ##### 4.2.2.4 L'opéron lactose L'opéron lactose chez *E. coli* est un système inductible régulé par la présence de lactose et la concentration de glucose . * **Structure:** Il comprend un promoteur (Plac) qui est considéré comme un promoteur faible, le gène lacI codant pour le répresseur, et trois gènes structuraux: lacZ (b-galactosidase), lacY (perméase) et lacA (transacétylase) . * **Régulation par le glucose:** La concentration d'AMP cyclique (AMPc) est inversement proportionnelle à la concentration de glucose. En l'absence de glucose, l'AMPc se lie à la protéine CAP (protéine activatrice de la catabolite, aussi appelée protéine réceptrice du cAMP), formant un complexe CAP-AMPc. Ce complexe se lie à un site spécifique en amont des séquences du promoteur, améliorant significativement la fixation de l'ARN polymérase et rendant le promoteur fort, ce qui conduit à une transcription élevée. En présence de glucose, le niveau d'AMPc est faible, CAP ne se lie pas, la fixation de l'ARN polymérase est faible et la transcription est basale . * **Régulation par le lactose:** En l'absence de lactose, le répresseur LacI, produit par le gène lacI, se lie à l'opérateur situé entre le promoteur et les gènes structuraux. Cette liaison empêche l'ARN polymérase de progresser, bloquant la transcription (répression). En présence de lactose, celui-ci se lie au répresseur LacI, induisant un changement conformationnel qui le dissocie de l'opérateur. La transcription peut alors commencer . L'opéron n'est jamais totalement réprimé; une expression basale faible permet la pénétration de quelques molécules de lactose, qui amorcent le processus de dérépression . > **Tip:** Comprendre l'interaction entre CAP-AMPc et le répresseur LacI est essentiel pour saisir la régulation de l'opéron lactose. Le promoteur est fort en l'absence de glucose et l'expression est induite par le lactose. ##### 4.2.2.5 L'opéron tryptophane L'opéron tryptophane (Trp) chez *E. coli* est un système répressible qui contrôle la biosynthèse du tryptophane et est régulé par la présence de cet acide aminé . * **Structure:** Il comprend des gènes structuraux (TrpE, TrpD, TrpC, TrpA, TrpB) codant pour les enzymes de la voie de biosynthèse du tryptophane, ainsi qu'un gène régulateur (TrpR) codant pour un répresseur, et des séquences régulatrices (promoteur P, opérateur O, et deux terminateurs Rho-indépendants: Term1 et Term2) . * **Régulation par répression:** En l'absence de tryptophane, le répresseur TrpR est inactif et ne se lie pas à l'opérateur. L'ARN polymérase peut ainsi initier la transcription, conduisant à la synthèse des enzymes nécessaires à la production de tryptophane. En présence de tryptophane, celui-ci agit comme un co-répresseur, se liant au répresseur TrpR et le rendant actif. Le répresseur actif se fixe à l'opérateur, bloquant la transcription et la synthèse du tryptophane . * **Régulation par atténuation:** Ce système agit en complément de la répression. Même en absence de répresseur, la présence de tryptophane peut réprimer la transcription au niveau du Terminateur 1 . * **Mécanisme :** La transcription de la région régulatrice produit un ARNm long. La structure secondaire de cet ARNm dépend de la présence d'ARNt-Trp chargés (c'est-à-dire contenant du tryptophane). * **En absence de tryptophane:** Les ARNt-Trp sont non chargés. Le ribosome, traduisant un petit ORF leader (contenant des codons Trp), se bloque au niveau de ces codons. Cela permet la formation d'une structure ARN secondaire appelée antiterminateur (liaison entre les séquences 2 et 3 de l'ARN). L'ARN polymérase poursuit la transcription, produisant un transcrit long qui code pour les enzymes de biosynthèse du tryptophane . * **En présence de tryptophane:** Les ARNt-Trp sont chargés et disponibles. Le ribosome traduit rapidement le peptide leader, débordant sur la séquence 2 de l'ARN. Cela empêche la formation de la structure 2/3 et favorise la formation d'une structure terminateur (liaison entre les séquences 3 et 4 de l'ARN). La transcription s'arrête prématurément au Terminateur 1, empêchant la synthèse des enzymes nécessaires à la production de tryptophane . > **Tip:** L'atténuation est un mécanisme sophistiqué qui lie la traduction du peptide leader à la régulation transcriptionnelle, permettant une réponse fine aux variations intracellulaires de tryptophane. Le tableau récapitulatif suivant résume les différents états de l'opéron tryptophane : | État du Tryptophane | ARNt-Trp | Répresseur | Traduction Peptide Leader | Structure ARN | Transcription | Synthèse Enzymes Trp | | :------------------ | :------- | :--------- | :------------------------ | :------------ | :------------ | :------------------- | | Absent | Non chargé | Inactif | Impossible (blocage) | Antiterminateur | Longue | Oui | | Présent | Chargé | Actif | Possible (rapide) | Terminateur | Courte | Non | --- ## Erreurs courantes à éviter - Révisez tous les sujets en profondeur avant les examens - Portez attention aux formules et définitions clés - Pratiquez avec les exemples fournis dans chaque section - Ne mémorisez pas sans comprendre les concepts sous-jacents

| Terme | Définition | |------|------------| | ADN | Acide désoxyribonucléique, molécule portant l'information génétique sous forme de séquences de nucléotides. C'est le support de l'hérédité chez la plupart des organismes vivants. | | ARN | Acide ribonucléique, molécule impliquée dans la synthèse des protéines et le transfert de l'information génétique. Il existe plusieurs types d'ARN, tels que l'ARNm, l'ARNt et l'ARNr. | | Protéine | Macromolécule biologique composée d'une chaîne d'acides aminés liés par des liaisons peptidiques. Les protéines remplissent une multitude de fonctions cellulaires, agissant comme enzymes, structures ou messagers. | | Génome | Ensemble complet du matériel génétique d'un organisme, comprenant l'ADN et, chez certains virus, l'ARN. Il est organisé en chromosomes. | | Chromosome | Structure filiforme présente dans le noyau des cellules eucaryotes, composée d'ADN enroulé autour de protéines (histones). Il porte les gènes. Chez les procaryotes, le génome est généralement circulaire et localisé dans le nucléoïde. | | Transcripition | Processus biochimique par lequel l'information génétique portée par l'ADN est copiée sous forme d'ARN. C'est la première étape de l'expression génique. | | Traduction | Processus biochimique par lequel la séquence de nucléotides d'un ARN messager (ARNm) est convertie en une séquence d'acides aminés pour former une protéine. C'est la deuxième étape de l'expression génique. | | Réplication | Processus par lequel une molécule d'ADN est dupliquée pour produire deux copies identiques. Il est essentiel à la division cellulaire et à la transmission de l'information génétique. | | Noyau | Compartiment cellulaire présent chez les eucaryotes, entouré d'une membrane, où se trouve la majorité du matériel génétique de la cellule sous forme de chromosomes. | | Cytoplasme | Substance gélatineuse qui remplit la cellule, entourant le noyau chez les eucaryotes. Il contient les organites et est le lieu de nombreuses réactions métaboliques, y compris la traduction. | | Procaryote | Organisme unicellulaire dont les cellules n'ont pas de noyau défini ni d'organites membranaires. Leur matériel génétique est généralement sous forme d'un chromosome circulaire unique dans le nucléoïde. | | Eucaryote | Organisme dont les cellules possèdent un noyau véritable entouré d'une membrane et des organites membranaires. | | Opéron | Unité fonctionnelle de transcription chez les procaryotes, composée d'un groupe de gènes structurels sous le contrôle d'un promoteur commun, et souvent d'un gène régulateur (répresseur ou activateur). | | Promoteur | Séquence d'ADN située en amont d'un gène, à laquelle se lie l'ARN polymérase pour initier la transcription. | | Terminateur | Séquence d'ADN qui signale la fin de la transcription d'un gène. | | Codon | Triplet de nucléotides dans l'ARNm qui spécifie un acide aminé particulier lors de la traduction, ou qui signale la terminaison de la synthèse protéique (codons stop). | | Anticodon | Triplet de nucléotides sur une molécule d'ARN de transfert (ARNt) qui s'apparie spécifiquement avec un codon complémentaire sur l'ARNm, assurant ainsi le placement du bon acide aminé lors de la synthèse protéique. | | ARNt | ARN de transfert, petite molécule d'ARN qui agit comme un adaptateur entre les codons de l'ARNm et les acides aminés correspondants lors de la traduction. | | ARNm | ARN messager, molécule d'ARN qui transporte l'information génétique de l'ADN vers les ribosomes pour la synthèse des protéines. | | Ribosome | Complexe moléculaire composé d'ARN ribosomique (ARNr) et de protéines, responsable de la synthèse des protéines par la traduction de l'ARNm. Il est composé de deux sous-unités. | | Histone | Protéine basique présente chez les eucaryotes, qui s'associe à l'ADN pour former la chromatine, structure qui condense et compacte l'ADN dans le noyau. | | Chromatide | Chacune des deux copies identiques d'un chromosome répliqué, reliées par le centromère, qui se séparent lors de la division cellulaire. | | Télomère | Région d'ADN répétitif située aux extrémités des chromosomes linéaires chez les eucaryotes, qui protège l'ADN des dommages et du raccourcissement lors de la réplication. | | Télomérase | Enzyme (une ADN polymérase à ARN dépendante) qui synthétise les télomères, compensant le raccourcissement des chromosomes lors de chaque cycle de réplication. | | Pseudogène | Séquence d'ADN similaire à un gène fonctionnel mais qui a perdu sa capacité à être transcrite ou traduite en une protéine fonctionnelle, généralement en raison de mutations. | | Transposon | Élément génétique mobile, une séquence d'ADN capable de se déplacer d'un site à un autre dans le génome, souvent via un mécanisme de "couper-coller" ou de "copier-coller". | | Rétrotransposon | Élément génétique mobile qui se transpose par un intermédiaire d'ARN, souvent via une enzyme réverse transcriptase. Ils sont communs chez les eucaryotes. | | Séquence répétée | Segment d'ADN qui apparaît plusieurs fois dans le génome d'un organisme. Elles peuvent être en tandem ou dispersées. | | Séquence intergénique | Région d'ADN située entre les gènes. Chez les eucaryotes, ces séquences sont souvent non codantes et peuvent contenir des éléments régulateurs ou des séquences répétées. | | ADN satellite | Forme d'ADN répétitif en tandem, souvent trouvé dans les régions centromériques et télomériques des chromosomes. Il est fractionné en bandes lors de la centrifugation. | | Microsatellite | Type de séquence répétée en tandem, caractérisée par des répétitions courtes (2 à 10 pb) et un faible nombre de répétitions, souvent utilisées dans l'identification génétique (empreinte génétique). | | Minisatellite | Type de séquence répétée en tandem, caractérisée par des répétitions plus longues (10 à 100 pb) et un nombre de répétitions variable, également utilisées pour l'empreinte génétique. | | ADN polymérase | Enzyme responsable de la synthèse de nouvelles molécules d'ADN lors de la réplication, en utilisant une matrice d'ADN existante. | | ARN polymérase | Enzyme responsable de la synthèse d'ARN à partir d'une matrice d'ADN lors de la transcription. | | Helicas | Enzyme qui déroule la double hélice d'ADN, séparant les deux brins pour permettre la réplication ou la transcription. | | Ligase | Enzyme qui relie deux fragments d'ADN en formant une liaison phosphodiester. Elle est cruciale pour la résolution des fragments d'Okazaki lors de la réplication. | | Mésappariement | Une erreur survenant lors de la réplication de l'ADN, où un nucléotide est incorrectement apparié avec son nucléotide complémentaire. Des mécanismes de réparation corrigent ces erreurs. | | ADN gyrase | Type de topoisomérase qui introduit des supertours négatifs dans l'ADN, facilitant son déroulement pendant la réplication et la transcription. | | SSB (Single-Strand Binding proteins) | Protéines qui se lient à l'ADN simple brin exposé, le stabilisant et le protégeant de la dégradation ou de la formation de structures secondaires indésirables. | | Fourche de réplication | Structure en forme de Y formée par la séparation des deux brins d'ADN lors de la réplication, où se déroule la synthèse de nouvelles chaînes d'ADN. | | Fragments d'Okazaki | Petits fragments d'ADN synthétisés de manière discontinue sur le brin tardif lors de la réplication de l'ADN. Ils sont ensuite ligaturés pour former une chaîne continue. | | Amorce ARN | Petite séquence d'ARN synthétisée par la primase, servant de point de départ pour la synthèse d'ADN par l'ADN polymérase lors de la réplication. | | Pré-RC (pré-Replication Complex) | Complexe de protéines qui se forme sur les origines de réplication chez les eucaryotes pendant la phase G1 du cycle cellulaire, préparant le terrain pour l'initiation de la réplication. | | Polycistronique | Se dit d'un ARNm qui code pour plusieurs polypeptides différents, provenant de plusieurs ORF (Open Reading Frames) distinctes sur la même molécule d'ARNm. C'est typique des procaryotes. | | Monocistronique | Se dit d'un ARNm qui ne code que pour un seul polypeptide, typique des eucaryotes et de certains gènes procaryotes. | | ORF (Open Reading Frame) | Séquence d'ADN ou d'ARN qui commence par un codon initiateur (souvent AUG) et se termine par un codon stop, et qui peut donc potentiellement être traduite en protéine. | | Répresseur | Protéine régulatrice qui se lie à une séquence d'ADN (opérateur) proche d'un promoteur, bloquant ou réduisant la transcription d'un gène ou d'un opéron. | | Activateur | Protéine régulatrice qui se lie à une séquence d'ADN (enhancer ou site d'activation) et favorise ou stimule la transcription d'un gène ou d'un opéron, souvent en facilitant la fixation de l'ARN polymérase. | | Facteur Sigma | Sous-unité de l'ARN polymérase chez les procaryotes qui est responsable de la reconnaissance des séquences promotrices spécifiques sur l'ADN, permettant ainsi l'initiation spécifique de la transcription. | | Co-répresseur | Molécule (souvent un métabolite) qui se lie à un répresseur, le rendant capable de se fixer à l'ADN et d'induire la répression de la transcription. | | Inducteur | Molécule qui se lie à un répresseur, le rendant incapable de se fixer à l'ADN et levant ainsi la répression de la transcription, permettant l'expression des gènes. | | Atténuation | Mécanisme de régulation de la transcription, souvent trouvé dans les opérons des procaryotes, où la traduction d'une courte séquence leader dans l'ARNm précoce influence la structure secondaire de l'ARN et détermine si la transcription de la partie principale de l'opéron sera terminée prématurément ou se poursuivra. | | Pores nucléaires | Complexes protéiques qui contrôlent le passage des molécules entre le noyau et le cytoplasme chez les eucaryotes, permettant le transport sélectif des ARNm matures vers le cytoplasme et des protéines vers le noyau. | | Mutation non sens | Mutation qui transforme un codon codant pour un acide aminé en un codon stop, entraînant une terminaison prématurée de la traduction et la production d'une protéine tronquée. | | Souche suppressive | Souche bactérienne mutante dans laquelle une mutation altère un ARNt de telle sorte qu'il reconnaît un codon stop normal et le traduit par un acide aminé, annulant ainsi l'effet d'une mutation non sens ailleurs dans le génome. | | Prion | Agent infectieux constitué de protéines anormalement repliées qui peuvent induire un changement de conformation chez des protéines normales correspondantes, entraînant des maladies neurodégénératives. Les prions ne contiennent pas d'acides nucléiques. | | Dogme central de la biologie moléculaire | Principe fondamental décrivant le flux de l'information génétique : ADN → ARN → Protéine. Il inclut les processus de réplication de l'ADN, de transcription de l'ADN en ARN, et de traduction de l'ARN en protéine. | | Lisosome | Organite cellulaire des eucaryotes contenant des enzymes digestives, impliqué dans la dégradation des macromolécules et des débris cellulaires. | | Lysozyme | Enzyme, présente dans les larmes, la salive et les sécrétions, qui détruit la paroi des bactéries en clivant les peptidoglycanes. Il est souvent utilisé comme exemple de gène unique. | | Globine | Famille de protéines, dont l'hémoglobine et la myoglobine, qui contiennent un groupe hème et sont impliquées dans le transport et le stockage de l'oxygène. L'organisation des gènes de globine illustre les familles de gènes chez les eucaryotes. | | Hémoglobine | Protéine présente dans les globules rouges du sang, responsable du transport de l'oxygène des poumons vers les tissus et du dioxyde de carbone des tissus vers les poumons. | | Alpha-globine | Une des chaînes composant l'hémoglobine adulte humaine. | | Bêta-globine | Une des chaînes composant l'hémoglobine adulte humaine. | | Trp | Tryptophane, un acide aminé essentiel. L'opéron tryptophane est un exemple classique de régulation génique chez les procaryotes. | | Lactose | Disaccharide composé de glucose et de galactose. L'opéron lactose est un système inductible de régulation génique chez E. coli, permettant la métabolisation du lactose lorsque le glucose n'est pas disponible. | | CAP (Catabolite Activator Protein) / CRP (cAMP Receptor Protein) | Protéine régulatrice chez les procaryotes qui se lie au complexe cAMP pour activer la transcription de certains opérons, comme l'opéron lactose, en présence de glucose bas et d'une source de carbone alternative. | | ARNr | ARN ribosomique, composant majeur des ribosomes, impliqué dans la synthèse des protéines. | | ARNt-Trp | ARN de transfert spécifique du tryptophane, nécessaire pour la traduction des codons du tryptophane. | | Séquence Shine-Dalgarno (SD) | Séquence d'ARN riche en purines (souvent AGGAGG) située en amont du codon d'initiation AUG sur l'ARNm procaryote. Elle s'hybride avec une séquence complémentaire de l'ARNr 16S de la petite sous-unité ribosomale, aidant au recrutement du ribosome et à l'initiation de la traduction. | | Site P (Peptidyl site) | Site sur le ribosome où le tRNA portant la chaîne polypeptidique en cours de synthèse est positionné. | | Site A (Aminoacyl site) | Site sur le ribosome où le nouveau tRNA, chargé de son acide aminé, arrive pour s'apparier avec le codon de l'ARNm. | | Site E (Exit site) | Site sur le ribosome d'où le tRNA déchargé de son acide aminé est expulsé après la translocation. | | N-formylméthionine (fMet) | Forme modifiée de la méthionine qui sert de premier acide aminé dans la synthèse protéique chez les procaryotes et dans les mitochondries. | | Autorégulation | Mécanisme de régulation où le produit d'un gène régule sa propre expression, souvent en se liant à son propre ARNm ou à des séquences régulatrices en amont. | | Polysome (ou Polyribosome) | Complexe formé d'un ARNm unique associé à plusieurs ribosomes qui traduisent simultanément la même molécule d'ARNm. | | Mésappariement | Voir "Erreurs et correction lors de la réplication". | | Hélicase | Voir "Réplication". | | Ligase | Voir "Réplication". | | ADN Polymérase | Voir "Réplication". | | ARN Polymérase | Voir "Transcription". | | Promotor | Voir "Transcription". | | Terminateur | Voir "Transcription". | | Opéron | Voir "Régulation de l'expression génique". | | Facteur Sigma | Voir "Transcription". | | Codon | Voir "Traduction". | | Anticodon | Voir "Traduction". | | ARNt | Voir "Traduction". | | ARNm | Voir "Traduction". | | Ribosome | Voir "Traduction". | | Histone | Voir "Support de l'information génétique". | | Chromosome | Voir "Support de l'information génétique". | | Génome | Voir "Support de l'information génétique". | | Protéine | Voir "Introduction". | | ARN | Voir "Introduction". | | ADN | Voir "Introduction". |

# Introduction à la biologie moléculaire et aux acides nucléiques La biologie moléculaire est une discipline scientifique qui étudie les processus biologiques au niveau moléculaire, en se concentrant particulièrement sur les interactions entre les différentes systèmes d'une cellule, y compris les interactions entre l'ADN, l'ARN, et les protéines ainsi que leur biosynthèse. ### 1.1 Définition et rôle de la biologie moléculaire Le terme "biologie moléculaire", popularisé dès 1938, englobe l'étude des mécanismes fondamentaux de la vie à l'échelle moléculaire. Il comprend également un ensemble de techniques de manipulation des acides nucléiques (ADN et ARN), souvent désignées sous le nom de techniques de génie génétique. En tant que sous-discipline de la biologie, la biologie moléculaire vise à comprendre comment ces molécules interagissent pour réguler les fonctions cellulaires, la croissance, et la reproduction. > **Tip:** La biologie moléculaire sert de pont entre la génétique, la biochimie et la biophysique, offrant une perspective unifiée sur les phénomènes du vivant. ### 1.2 Les acides nucléiques : ADN et ARN Les acides nucléiques, l'acide désoxyribonucléique (ADN) et l'acide ribonucléique (ARN), sont les molécules fondamentales porteuses de l'information génétique. #### 1.2.1 Le concept de génome L'ensemble des gènes présents chez un individu constitue son génome. Les gènes sont les unités fonctionnelles de l'hérédité, codant pour des protéines ou des ARN fonctionnels. #### 1.2.2 L'unicité individuelle Bien que la grande majorité du génome humain (environ 99 %) soit commune à tous les individus, une petite fraction (environ 1 %) est variable. Ces variations génétiques font de chaque individu un organisme unique, possédant son propre génome distinct. #### 1.2.3 Propriétés des acides nucléiques Les acides nucléiques sont des molécules intrinsèquement chargées négativement. Cette propriété est exploitée dans diverses techniques de laboratoire, notamment l'électrophorèse. > **Tip:** La structure de l'ADN, la double hélice, est cruciale pour son rôle de support de l'information génétique et pour sa capacité à se répliquer fidèlement. ### 1.3 Le dogme central de la biologie moléculaire : du gène à la protéine La biologie moléculaire explique comment l'information contenue dans un gène est exprimée pour aboutir à la synthèse d'une protéine. Ce processus implique plusieurs étapes clés : * **Transcription :** L'information d'un gène est copiée de l'ADN vers une molécule d'ARN messager (ARNm). * **Traduction :** L'ARNm est utilisé comme modèle pour assembler une séquence spécifique d'acides aminés, formant ainsi une protéine. Chaque allèle, qui est une version spécifique d'un gène, peut mener à la production d'une protéine légèrement différente, contribuant ainsi à la diversité des caractéristiques individuelles. > **Example:** Un gène codant pour un groupe sanguin peut avoir différents allèles (par exemple, A, B, O). L'expression de ces allèles détermine le groupe sanguin de l'individu. L'individu ayant pour groupe sanguin A exprime un gène spécifique conduisant à une protéine particulière. ### 1.4 Applications technologiques en biologie moléculaire La compréhension des acides nucléiques et de leurs fonctions a conduit au développement de nombreuses techniques puissantes utilisées en recherche et dans diverses applications : * **Extraction et purification :** Isolation des acides nucléiques à partir de cellules ou de tissus. * **Restriction enzymatique :** Coupure de l'ADN à des sites spécifiques par des enzymes appelées enzymes de restriction. * **Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) :** Technique permettant de multiplier spécifiquement des fragments d'ADN. * **Électrophorèse :** Séparation des molécules (comme les fragments d'ADN ou d'ARN) en fonction de leur taille et de leur charge sous l'effet d'un champ électrique. * **Séquençage :** Détermination de l'ordre exact des nucléotides dans une molécule d'ADN ou d'ARN. * **Analyse de profil génétique :** Utilisation de techniques moléculaires pour identifier ou comparer des individus, souvent dans des contextes médico-légaux. #### 1.4.1 L'électrophorèse sur gel d'agarose L'électrophorèse est une technique fondamentale en biologie moléculaire. Elle permet de séparer des ions (molécules portant une charge électrique) sous l'action d'un champ électrique. * **Principe :** Les molécules d'ADN, chargées négativement à pH neutre, migrent vers l'anode (pôle positif) lorsqu'elles sont placées dans un gel et soumises à un champ électrique. * **Séparation :** La migration à travers la matrice du gel d'agarose permet de séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille. Les fragments plus petits traversent le gel plus rapidement que les fragments plus grands. * **Applications :** * Déterminer la taille de fragments d'ADN en les comparant à un marqueur de taille connu. * Estimer la quantité d'ADN présente. * Purifier un fragment d'ADN d'intérêt à partir du gel. ##### 1.4.1.1 Le gel d'agarose L'agarose est un polysaccharide extrait de l'algue, formant un réseau de pores lorsqu'il est dissous dans l'eau chaude puis refroidi. La concentration d'agarose dans le gel influence la taille des pores et, par conséquent, la résolution de la séparation : * Une concentration d'agarose plus élevée entraîne des pores plus petits, offrant une meilleure résolution pour la séparation de fragments d'ADN de petite taille. * Inversement, une concentration plus faible est préférable pour séparer des fragments d'ADN de grande taille. > **Example:** Pour séparer des fragments d'ADN de 100 paires de bases (pb), un gel d'agarose à 2 % serait utilisé, tandis que pour des fragments de 10 000 pb, un gel à 0,8 % serait plus approprié. ##### 1.4.1.2 Le tampon de migration Le tampon de migration est une solution électrolytique qui assure la conductivité électrique nécessaire à la migration des molécules et maintient un pH stable. Les tampons couramment utilisés incluent le Tris/Acétate/EDTA (TAE) et le Tris/Borate/EDTA (TBE). * Le tampon TBE, par exemple, est un mélange de Tris, d'acide borique et d'EDTA. * Le choix du tampon peut influencer la qualité de la séparation des fragments d'ADN. Le tampon TAE est réputé pour offrir une meilleure séparation des grands fragments d'ADN, bien que le TBE soit très couramment employé. ##### 1.4.1.3 Préparation et réalisation d'une électrophorèse La préparation d'une électrophorèse implique plusieurs étapes : 1. **Préparation du gel d'agarose :** Peser l'agarose, le dissoudre dans le tampon de migration approprié (souvent sous forme concentrée, puis dilué avant chauffage), chauffer jusqu'à dissolution complète, laisser refroidir légèrement, puis couler le gel dans un support avec un peigne pour former les puits. 2. **Montage de la cuve d'électrophorèse :** Placer le gel solidifié dans la cuve et la remplir de tampon de migration de manière à ce que le gel soit complètement immergé. Les puits doivent être orientés vers la cathode (pôle négatif). 3. **Préparation des échantillons :** Les échantillons d'ADN sont généralement mélangés à un "bleu de dépôt" qui alourdit l'échantillon et permet de visualiser sa migration dans le gel. 4. **Dépôt des échantillons :** Les échantillons préparés sont soigneusement déposés dans les puits du gel à l'aide d'une micropipette. Il est crucial d'éviter de faire des bulles d'air ou de percer le fond des puits. 5. **Migration :** La cuve est connectée à un générateur de courant. Le voltage (généralement entre 70 V et 120 V) et la durée de la migration sont ajustés en fonction de la taille des fragments à séparer et de la résolution souhaitée. La migration se poursuit jusqu'à ce que les marqueurs de taille atteignent une distance prédéterminée. 6. **Révélation :** L'ADN n'étant pas visible à l'œil nu, des colorants spécifiques sont utilisés pour révéler les bandes d'ADN après migration. L'Azure A est un exemple de colorant bleu utilisé à cette fin. Le gel coloré est ensuite observé sur une lampe UV ou un transilluminateur. > **Tip:** Une bonne visualisation du dépôt est essentielle. Placer un fond noir sous la cuve d'électrophorèse facilite l'observation du liquide de dépôt entrant dans le puits. > **Example:** Dans le cadre d'une enquête policière, l'électrophorèse peut être utilisée pour comparer un échantillon d'ADN prélevé sur la scène de crime avec des échantillons suspects. Les fragments d'ADN de tailles identiques présenteront des bandes à la même position sur le gel, permettant d'identifier un lien potentiel. --- # Applications technologiques en biologie moléculaire Voici une synthèse des applications technologiques en biologie moléculaire, couvrant les techniques fondamentales d'extraction, de manipulation et d'analyse des acides nucléiques. ## 2. Applications technologiques en biologie moléculaire La biologie moléculaire s'appuie sur un ensemble de techniques sophistiquées permettant de manipuler, d'analyser et d'étudier les acides nucléiques (ADN et ARN). Ces technologies sont essentielles pour comprendre le fonctionnement des gènes, analyser le génome et développer des applications dans divers domaines comme la médecine, la criminalistique ou la recherche fondamentale. Les applications technologiques principales incluent l'extraction et la purification de gènes, la restriction enzymatique, l'amplification par PCR, l'électrophorèse et le séquençage. ### 2.1 Extraction et purification de gènes Avant de pouvoir étudier ou manipuler un gène spécifique, il est nécessaire de l'isoler du reste de l'ADN génomique. Ce processus implique plusieurs étapes visant à séparer les fragments d'ADN d'intérêt des autres composants cellulaires tels que les protéines, les lipides et d'autres acides nucléiques. ### 2.2 Restriction enzymatique Les enzymes de restriction sont des outils moléculaires cruciaux qui agissent comme des "ciseaux" moléculaires. Elles coupent l'ADN à des séquences nucléotidiques spécifiques, appelées sites de restriction. Chaque enzyme de restriction reconnaît une séquence palindromique particulière de quelques nucléotides. * **Principe :** Ces enzymes reconnaissent et lient des séquences courtes et spécifiques sur la molécule d'ADN. Elles clivent ensuite la liaison phosphodiester du squelette de l'ADN, produisant soit des extrémités franches (blunt ends), soit des extrémités cohésives (sticky ends), également appelées "boutures" ou "extrémités adhésives". * **Applications :** La restriction enzymatique est fondamentale pour le clonage de gènes, la construction de cartes génétiques, et la création de fragments d'ADN pour des analyses ultérieures comme l'électrophorèse ou le séquençage. ### 2.3 Amplification par PCR La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique révolutionnaire qui permet d'amplifier de manière exponentielle des séquences d'ADN spécifiques *in vitro*. Elle est largement utilisée pour générer un grand nombre de copies d'une région d'ADN à partir d'une quantité initiale très faible, voire unique. * **Principe :** La PCR utilise des cycles répétés de trois étapes clés : 1. **Dénaturation :** Chauffage à haute température (généralement entre 94 et 98 °C) pour séparer les deux brins de la double hélice d'ADN. 2. **Hybridation (ou recuit) :** Abaissement de la température (généralement entre 50 et 65 °C) pour permettre à de courtes séquences d'oligonucléotides synthétiques (amorces ou primers) de se fixer spécifiquement aux régions flanquant la séquence cible sur chaque brin d'ADN. 3. **Élongation :** Augmentation de la température (généralement 72 °C, température optimale pour la Taq polymérase) pour permettre à une ADN polymérase thermorésistante de synthétiser un nouveau brin d'ADN en partant de l'amorce. * **Calcul du nombre de copies :** Après $n$ cycles de PCR, le nombre théorique de copies de la séquence cible est donné par la formule : $$N = N_0 \times 2^n$$ où $N_0$ est le nombre de copies initiales de la séquence cible. * **Applications :** Détection de pathogènes, diagnostic génétique, analyse médico-légale (profilage ADN), clonage, séquençage, recherche fondamentale. ### 2.4 Électrophorèse L'électrophorèse est une technique analytique essentielle pour séparer les molécules chargées (comme les acides nucléiques ou les protéines) en fonction de leur taille et/ou de leur charge électrique lorsqu'elles sont soumises à un champ électrique. * **Principe général :** Des ions migrent dans un milieu conducteur (tampon) vers l'électrode portant une charge opposée. Les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (pôle positif), tandis que les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (pôle négatif). * **Électrophorèse sur gel d'agarose :** C'est la méthode la plus courante pour séparer des fragments d'ADN. * **Support :** Un gel d'agarose, un polysaccharide dérivé des algues, est utilisé comme matrice de séparation. La densité du gel, déterminée par la concentration d'agarose, influence la taille des pores. Une concentration d'agarose plus élevée résulte en un maillage plus serré et une meilleure résolution pour les fragments de petite taille. * Gel à 0,8 % : maillage plus lâche, adapté aux grands fragments. * Gel à 1,25 % : compromis entre taille et résolution. * Gel à 2 % : maillage serré, idéal pour les petits fragments. * **Migration de l'ADN :** À pH neutre, les molécules d'ADN sont chargées négativement en raison de leurs groupes phosphate. Elles migrent donc vers l'anode (pôle positif). La vitesse de migration dépend de la taille du fragment : les fragments plus petits traversent plus facilement la matrice du gel et migrent plus rapidement. * **Tampons de migration :** Des tampons tels que le TAE (Tris-acétate-EDTA) ou le TBE (Tris-borate-EDTA) sont utilisés pour maintenir un pH constant et assurer la conductivité électrique. Le TBE est souvent préféré pour sa meilleure capacité tampon, bien que le TAE puisse offrir une meilleure résolution pour les très grands fragments d'ADN. * **Marqueurs de taille :** Des fragments d'ADN de tailles connues (marqueurs ou "ladder") sont chargés dans des puits adjacents aux échantillons pour permettre l'estimation de la taille des fragments inconnus. * **Révélation :** L'ADN n'étant pas visible à l'œil nu, des colorants comme l'Azur A ou des agents intercalants fluorescents (par exemple, Safegreen) sont utilisés pour visualiser les bandes d'ADN après migration, souvent sous une lampe UV ou une transillumination. * **Applications :** Analyse de la taille de fragments d'ADN, vérification de succès de clonage, purification de fragments d'ADN spécifiques, analyse de profil génétique. ### 2.5 Séquençage Le séquençage d'ADN permet de déterminer l'ordre exact des nucléotides (adénine, guanine, cytosine, thymine) dans une molécule d'ADN. Cette technique est fondamentale pour comprendre la structure des gènes, identifier des mutations et étudier l'évolution. * **Méthodes historiques :** La méthode de Sanger (séquençage par terminaison de chaîne) a été la première méthode largement utilisée, basée sur l'utilisation de didésoxyribonucléotides (ddNTPs) qui bloquent l'élongation de la chaîne d'ADN. * **Séquençage de nouvelle génération (NGS) :** Des technologies plus récentes ont permis d'augmenter massivement le débit de séquençage et de réduire les coûts, ouvrant la voie au séquençage de génomes entiers à grande échelle. * **Applications :** Identification de maladies génétiques, développement de thérapies ciblées, études phylogénétiques, identification de variants génétiques, analyse de la diversité microbienne. > **Tip :** Lors de la conception d'une expérience d'électrophorèse, le choix de la concentration d'agarose est crucial. Privilégiez un gel avec un pourcentage plus élevé pour séparer des fragments d'ADN de petite taille, et un pourcentage plus faible pour des fragments de grande taille. > **Example :** L'analyse d'un profil génétique, comme dans le cadre d'une enquête policière, utilise l'électrophorèse pour comparer des fragments d'ADN provenant d'une scène de crime avec ceux d'un suspect. Des bandes d'ADN de tailles identiques à celles obtenues avec l'ADN du suspect suggèrent une correspondance. --- # L'électrophorèse sur gel d'agarose L'électrophorèse sur gel d'agarose est une technique fondamentale en biologie moléculaire utilisée pour séparer des fragments d'acides nucléiques en fonction de leur taille. ### 3.1 Principe de l'électrophorèse L'électrophorèse est une technique qui exploite le déplacement d'ions sous l'effet d'un champ électrique. Les molécules chargées positivement (cations) migrent vers la cathode (pôle négatif), tandis que les molécules chargées négativement (anions) migrent vers l'anode (pôle positif). En biologie moléculaire, lorsque l'on analyse des fragments d'ADN, ceux-ci sont chargés négativement à pH neutre en raison des groupements phosphate de leur squelette. Par conséquent, ils migrent vers l'anode (le pôle positif) lorsqu'un champ électrique est appliqué. Dans le contexte de l'électrophorèse sur gel d'agarose, la séparation des molécules d'ADN se fait principalement en fonction de leur taille. Les fragments plus petits traversent plus facilement la matrice du gel, tandis que les fragments plus grands rencontrent plus de résistance et migrent plus lentement. Les applications de l'électrophorèse sur gel d'agarose incluent : * L'identification de la taille de fragments d'ADN en la comparant à celle d'un marqueur de taille connu. * L'estimation de la quantité d'ADN présente dans un échantillon. * La purification d'un fragment d'ADN spécifique à partir du gel. ### 3.2 Matériaux utilisés #### 3.2.1 Le gel d'agarose L'agarose est un polysaccharide extrait de l'agar, composé de la répétition d'un diholoside. Il est couramment utilisé pour la préparation de gels destinés à l'électrophorèse. Sous forme de poudre blanche, l'agarose se dissout dans l'eau bouillante pour former une solution qui, en refroidissant en dessous de 40 °C, se solidifie en un gel. La concentration d'agarose dans le gel détermine la taille des pores : * Une concentration d'agarose plus élevée entraîne une taille de pores plus petite. * Plus la concentration d'agarose est élevée, plus le maillage du gel est serré, ce qui permet une séparation plus fine des fragments de petite taille. Inversement, pour séparer des fragments de grande taille, une concentration d'agarose plus faible est préférée. Les pourcentages courants de gel d'agarose et leur application : * **Gel à 0,8 %** : Convient pour la séparation de fragments d'ADN de grande taille. * **Gel à 1,25 %** : Offre une résolution intermédiaire. * **Gel à 2 %** : Idéal pour la séparation de fragments d'ADN de petite taille. > **Tip:** Le choix du pourcentage d'agarose est crucial pour obtenir une résolution optimale de séparation en fonction de la taille des fragments d'ADN que l'on souhaite analyser. #### 3.2.2 Le tampon de migration Le tampon de migration assure la conductivité électrique du milieu et maintient le pH, ce qui est essentiel pour la stabilité des acides nucléiques et la mobilité des fragments d'ADN. Les tampons les plus couramment utilisés sont : * **TAE (Tris/Acétate/EDTA)** : Possède un pouvoir tampon plus faible mais est souvent préférable pour la séparation des fragments d'ADN de grande taille. * **TBE (Tris/Borate/EDTA)** : Très utilisé pour sa bonne capacité tampon. * **SB (Sodium Borate)**. L'un des tampons utilisés dans le cadre d'une manipulation courante est le tampon TBE à une concentration de 0,5X. ### 3.3 Étapes de la préparation et de la réalisation #### 3.3.1 Préparation des gels d'agarose 1. **Pesée de l'agarose** : Peser la quantité d'agarose nécessaire en fonction du volume de gel désiré et du pourcentage d'agarose requis. Par exemple, pour préparer 150 mL d'un gel à 0,8 %, il faut 1,2 g d'agarose (calculé comme suit : $m(\text{agarose}) = \frac{0.8 \text{ g} \times 150 \text{ mL}}{100 \text{ mL}} = 1.2 \text{ g}$). 2. **Dissolution** : Dissoudre l'agarose dans le tampon de migration approprié (souvent à une concentration plus élevée, par exemple 1X, pour compenser l'ajout ultérieur d'eau et l'évaporation). Prévoir un volume légèrement supérieur au volume final souhaité (par exemple, 170 mL pour 150 mL de gel) pour tenir compte de l'évaporation lors du chauffage. 3. **Chauffage** : Chauffer la solution jusqu'à ce qu'elle devienne limpide. Cela peut être réalisé au micro-ondes ou sur une plaque chauffante, en remuant régulièrement. 4. **Refroidissement et coulée** : Laisser la solution refroidir à une température d'environ 55-65 °C avant de la couler dans le support de gel. 5. **Solidification** : Laisser le gel se solidifier complètement. 6. **Retrait du matériel** : Retirer délicatement le peigne et les butoirs qui forment les puits pour le dépôt des échantillons. #### 3.3.2 Montage de la cuve à électrophorèse 1. **Positionnement du gel** : Placer le support de gel dans la cuve à électrophorèse. Les puits doivent être orientés vers la cathode (borne négative, généralement noire). 2. **Remplissage de la cuve** : Remplir la cuve avec le tampon de migration jusqu'à ce que le gel soit complètement immergé et que les puits soient remplis de tampon. #### 3.3.3 Préparation des échantillons Les échantillons d'ADN sont généralement mélangés à un "bleu de dépôt" (loading dye). Ce bleu a deux fonctions principales : * **Alourdir l'échantillon** : Pour faciliter son dépôt au fond des puits du gel sans qu'il ne flotte. * **Visualiser la migration** : Les colorants du bleu de dépôt migrent dans le gel et permettent de suivre la progression de l'électrophorèse. #### 3.3.4 Dépôt des échantillons 1. **Volume de dépôt** : Introduire le volume d'échantillon préparé (par exemple, 15 µL) dans chaque puits à l'aide d'une micropipette. 2. **Précautions** : * Éviter de créer des bulles d'air. * Ne pas déborder des puits. * Ne pas percer le fond des puits. * Maintenir la micropipette à la verticale lors du dépôt. * Placer un fond noir sous la cuve pour mieux visualiser le dépôt. * Déposer les échantillons rapidement et démarrer l'électrophorèse sans délai excessif. #### 3.3.5 Migration 1. **Configuration de la cuve** : Fermer le couvercle de la cuve et relier la cuve au générateur d'électrophorèse à l'aide des câbles. 2. **Réglage du générateur** : Régler la tension du générateur. Une tension plus basse (par exemple, 70 V) permet une migration plus précise mais plus longue, tandis qu'une tension plus élevée (par exemple, 120 V) accélère la migration au détriment d'une résolution potentiellement moindre. 3. **Durée de la migration** : Laisser migrer jusqu'à ce que les marqueurs de migration du bleu de dépôt atteignent environ 2 cm du bord opposé du gel (côté anode). #### 3.3.6 Révélation des résultats L'ADN n'étant pas visible à l'œil nu, une étape de révélation est nécessaire. * **Option 1 : Colorants intégrés** : Certains kits incluent des colorants (comme le Safegreen) déjà mélangés aux échantillons ou au gel. L'observation peut alors se faire directement avec un transilluminateur adapté. * **Option 2 : Coloration post-migration** : Si aucun colorant n'est intégré, le gel doit être coloré après la migration. **Révélation à l'Azure A** : 1. **Préparation du colorant** : Préparer une solution alcoolique d'Azure A (par exemple, 0.04 g d'Azure A dans 100 mL d'éthanol à 20 %). 2. **Coloration** : Recouvrir la surface du gel avec la solution d'Azure A et laisser agir pendant exactement 4 minutes. 3. **Décoloration et rinçage** : Vider le colorant (qui peut être réutilisé). Éliminer l'excès de colorant de la surface avec quelques mL d'alcool à 70 % pendant quelques secondes, puis éliminer l'alcool. Rincer le gel à l'eau du robinet plusieurs fois pour éliminer le colorant restant. 4. **Observation** : Les bandes d'ADN colorées par l'Azure A apparaissent progressivement. L'intensité maximale est atteinte après quelques heures. Les bandes sont mieux visibles lorsque le gel est placé au réfrigérateur. L'observation finale se fait sur une lampe ou un transilluminateur. > **Tip:** L'Azure A est un colorant couramment disponible pour révéler l'ADN sur les gels d'agarose. Le temps de coloration et de rinçage est important pour obtenir un bon contraste entre les bandes d'ADN et le fond du gel. --- # Place de la biologie moléculaire dans les programmes scolaires L'intégration des concepts de biologie moléculaire dans les programmes scolaires français vise à familiariser les élèves avec les bases de l'information génétique, son expression et les techniques d'analyse associées. ### 4.1 Niveau secondaire (Seconde) En classe de seconde, l'accent est mis sur la cellule comme unité fondamentale du vivant et sur le rôle de l'ADN en tant que support de l'information génétique. #### 4.1.1 Concepts fondamentaux abordés * **La cellule et la spécialisation cellulaire :** Les élèves apprennent que toutes les cellules d'un organisme proviennent d'une cellule unique et possèdent initialement la même information génétique. Ils découvrent que les cellules se spécialisent pour remplir des fonctions particulières, en exprimant seulement une partie de leur ADN. * **L'ADN :** * Structure : double hélice. * Constituants : nucléotides (adénine, thymine, cytosine, guanine). * Principe de complémentarité des bases azotées. * Le gène comme unité d'information portée par une séquence d'ADN. * L'ADN porte une information qui détermine les caractéristiques de l'individu. > **Tip:** L'objectif est de comprendre que, malgré l'unicité du génome dans chaque cellule, la spécialisation résulte de l'expression différentielle des gènes. #### 4.1.2 Option Biotechnologie en Seconde Cette option introduit explicitement des aspects de la biologie moléculaire et des biotechnologies, préparant les élèves à des manipulations et analyses plus poussées. ### 4.2 Niveau secondaire (Première) En classe de première, dans la spécialité SVT, les concepts de biologie moléculaire sont approfondis, avec l'introduction de capacités expérimentales et d'analyse. #### 4.2.1 Capacités expérimentales et d'analyse Les élèves sont amenés à : * **Concevoir et réaliser une réaction de PCR (amplification en chaîne par polymérase) :** Cela inclut la détermination des durées de chaque étape du cycle de PCR et le calcul du nombre de copies obtenues après chaque cycle. La formule pour le nombre de copies après $n$ cycles, à partir d'une molécule initiale, est donnée par : $$N_n = 2^n$$ où $N_n$ est le nombre de copies après $n$ cycles. * **Concevoir et réaliser un protocole pour étudier l'action d'un agent mutagène :** Par exemple, l'étude des effets des rayons ultraviolets (UV) sur la survie cellulaire et l'apparition de mutants. * **Mener une démarche historique ou une étude documentaire sur le séquençage des macromolécules :** Cela concerne le séquençage des protéines, de l'ARN et de l'ADN. #### 4.2.2 Application concrète : l'électrophorèse L'électrophorèse est présentée comme une technique clé, illustrée par la préparation d'un profil génétique dans le cadre d'une enquête policière. ##### 4.2.2.1 Principe de l'électrophorèse L'électrophorèse est une technique qui utilise un champ électrique pour déplacer des ions. Les molécules chargées migrent vers l'électrode de charge opposée : * Les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (pôle positif). * Les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (pôle négatif). ##### 4.2.2.2 Électrophorèse de fragments d'ADN sur gel d'agarose Dans ce contexte, le gel d'agarose est utilisé pour séparer les fragments d'ADN en fonction de leur taille. * **Charge de l'ADN :** À pH neutre, les molécules d'ADN sont chargées négativement et migrent donc vers l'anode (pôle positif). * **Séparation par taille :** La migration dans le gel d'agarose permet de séparer les molécules d'ADN selon leur taille. Les fragments plus petits traversent le gel plus rapidement que les fragments plus gros. ##### 4.2.2.3 Applications de l'électrophorèse sur gel d'agarose * Identification de la taille de fragments d'ADN (par comparaison avec un marqueur de taille). * Estimation de la quantité d'ADN présente. * Purification d'un fragment d'ADN spécifique à partir du gel. ##### 4.2.2.4 Composants essentiels de l'électrophorèse * **Le gel d'agarose :** Obtenu à partir d'un polyoside extrait de l'agar. La concentration d'agarose détermine la taille des pores du gel : une concentration plus élevée crée un maillage plus serré, améliorant la résolution pour la séparation de fragments plus petits. Les concentrations courantes varient de 0,8 % à 2 %. * **Le tampon de migration :** Assure la conductivité électrique et maintient le pH. Les tampons courants incluent le TAE (Tris/Acétate/EDTA) et le TBE (Tris/Borate/EDTA). Le tampon TBE 0,5X est souvent utilisé pour la migration. ##### 4.2.2.5 Préparation et réalisation d'une électrophorèse (exemple du kit ADN suspect) La préparation implique : * **Calcul des quantités de réactifs :** Par exemple, pour préparer 150 mL de gel d'agarose à 0,8 %, il faut 1,2 gramme d'agarose. Le calcul est basé sur la proportion: $m_{agarose} = (\%\text{agarose} \times V_{gel}) / 100$. * **Préparation du gel d'agarose :** Dissolution de l'agarose dans le tampon de migration (chauffage jusqu'à obtention d'une solution limpide), puis coulée dans un support de gel et solidification. Le peigne inséré lors de la solidification crée les puits pour le dépôt des échantillons. * **Montage de la cuve à électrophorèse :** Placement du gel dans la cuve, remplissage avec le tampon de migration de manière à immerger le gel et les puits. Les puits doivent être positionnés près de la cathode (pôle négatif). * **Préparation et dépôt des échantillons :** Les échantillons d'ADN sont mélangés à un "bleu de dépôt" qui alourdit la solution et permet de visualiser la migration. Le dépôt se fait avec précision dans les puits. * **Migration :** La cuve est reliée à un générateur. Une tension électrique (entre 70 V et 120 V) est appliquée. La durée de migration dépend de la tension et de la distance à parcourir, jusqu'à ce que les marqueurs atteignent une position désirée sur le gel. * **Révélation :** L'ADN n'étant pas visible à l'œil nu, des colorants sont utilisés. L'Azur A est un exemple de colorant bleu utilisé après coloration et décoloration (par exemple, avec de l'éthanol à 70 %) pour visualiser les bandes d'ADN sur une lampe. Le gel peut être placé au réfrigérateur pour intensifier la coloration. > **Example:** Lors de l'analyse d'une scène de crime, l'électrophorèse permet de comparer les profils génétiques des suspects avec celui obtenu à partir d'une trace ADN laissée sur les lieux, aidant ainsi à identifier le coupable. Cet aperçu montre comment la biologie moléculaire s'insère progressivement dans les cursus scolaires, des concepts fondamentaux en seconde aux applications expérimentales en première, préparant les élèves à comprendre les enjeux scientifiques et technologiques contemporains. --- ## Erreurs courantes à éviter - Révisez tous les sujets en profondeur avant les examens - Portez attention aux formules et définitions clés - Pratiquez avec les exemples fournis dans chaque section - Ne mémorisez pas sans comprendre les concepts sous-jacents

| Term | Definition | |------|------------| | Biologie moléculaire | Domaine de la biologie qui étudie les processus biologiques au niveau moléculaire, en particulier les interactions entre les différentes systèmes d'une cellule, incluant les interactions entre l'ADN, l'ARN et les protéines ainsi que leur biosynthèse. | | Acides nucléiques | Polymères biologiques essentiels à la vie, qui transmettent l'information génétique. Les deux types principaux sont l'ADN (acide désoxyribonucléique) et l'ARN (acide ribonucléique). | | ADN (Acide désoxyribonucléique) | Molécule porteuse de l'information génétique chez tous les organismes vivants. Il est composé d'une double hélice formée de nucléotides. | | ARN (Acide ribonucléique) | Molécule impliquée dans la synthèse des protéines et dans d'autres fonctions cellulaires. Il existe sous différentes formes, comme l'ARNm, l'ARNt et l'ARNr. | | Gène | Unité fondamentale de l'hérédité qui code pour une protéine ou une molécule d'ARN fonctionnelle. Les gènes sont des séquences spécifiques d'ADN. | | Génome | L'ensemble complet du matériel génétique d'un organisme, comprenant tous ses gènes et les régions non codantes de son ADN. | | Allèle | Une version spécifique d'un même gène. Par exemple, pour le gène déterminant le groupe sanguin, il peut exister les allèles A, B et O. | | PCR (Amplification en chaîne par polymérase) | Technique de laboratoire permettant d'amplifier de manière exponentielle un fragment d'ADN spécifique in vitro, en répétant des cycles de dénaturation, d'hybridation et d'élongation. | | Électrophorèse | Technique analytique utilisée pour séparer des macromolécules telles que les protéines et les acides nucléiques en fonction de leur taille et de leur charge électrique, en les soumettant à un champ électrique dans un gel. | | Gel d'agarose | Matrice poreuse semi-solide préparée à partir de l'agarose, utilisée comme support pour l'électrophorèse des acides nucléiques. La concentration d'agarose détermine la taille des pores et la résolution de la séparation. | | Tampon de migration | Solution électrolytique utilisée dans les expériences d'électrophorèse pour maintenir le pH et permettre la conductivité électrique nécessaire au déplacement des molécules chargées. Le tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) et le tampon TAE (Tris-Acétate-EDTA) sont couramment utilisés. | | Anode | L'électrode positive dans un dispositif électrochimique, vers laquelle les ions négativement chargés (anions) migrent. | | Cathode | L'électrode négative dans un dispositif électrochimique, vers laquelle les ions positivement chargés (cations) migrent. | | Protocole | Ensemble détaillé d'instructions et d'étapes à suivre pour réaliser une expérience scientifique ou une procédure spécifique de manière reproductible. | | Transilluminateur | Appareil d'éclairage utilisé pour visualiser des gels d'électrophorèse après coloration, en projetant une lumière à travers le gel pour révéler les bandes d'ADN ou d'ARN. |

# Hypervariabele regio's en antigene interactie Dit onderwerp verklaart de structuur van hypervariabele regio's in antilichamen en de aard van de interacties tussen antilichamen en antigenen, inclusief de krachten die hierbij een rol spelen. ### 1.1 Structuur van hypervariabele regio's Antilichamen (AL) bezitten specifieke regio's die verantwoordelijk zijn voor de binding met antigenen (AG). Deze regio's worden hypervariabele regio's genoemd. Elk antilichaam heeft drie hypervariabele regio's op de zware keten en drie op de lichte keten. Elke regio bestaat uit ongeveer tien aminozuren (AZ). In de driedimensionale structuur van het antilichaam komen deze zes regio's samen om één hypervariabel domein per arm van het antilichaam te vormen. Dit hypervariabele domein vormt de antigen-bindende site. De regio's die de complementariteit met het antigeen bepalen, worden aangeduid als Complementariteit Determinerende Regio's (CDR) [1](#page=1). ### 1.2 Antigeen-antilichaam interactie De interactie tussen een antigeen en een antilichaam vindt plaats op een specifieke plaats op het antigeen die het epitoop wordt genoemd. Het epitoop is de regio op het antigeen waar de binding met de CDR van het antilichaam plaatsvindt [4](#page=4). #### 1.2.1 Krachten die de interactie bepalen Verschillende soorten niet-covalente krachten zijn betrokken bij de interactie tussen antigenen en antilichamen [4](#page=4): * **Elektrostatische krachten:** Deze krachten ontstaan door de interactie tussen geladen deeltjes op het antigeen en het antilichaam [4](#page=4). * **Waterstofbruggen:** Deze bindingen vormen zich tussen een waterstofatoom dat gebonden is aan een elektronegatief atoom (zoals zuurstof of stikstof) en een ander elektronegatief atoom met een vrij elektronenpaar [4](#page=4). * **Hydrofobe krachten:** Deze krachten spelen een rol bij de interactie tussen twee grote, wateronoplosbare moleculen in een waterige omgeving. Watermoleculen worden uitgestoten tussen deze hydrofobe moleculen, wat leidt tot een netto aantrekkingskracht [4](#page=4). * **Van der Waals krachten:** Deze zwakke krachten ontstaan door kortstondige, geïnduceerde elektrische dipolen in naburige moleculen [4](#page=4). #### 1.2.2 Reversibiliteit van de binding De binding tussen een antigeen en een antilichaam is **reversibel** en **niet-covalent**. Dit betekent dat de binding kan worden verbroken onder invloed van verschillende omgevingsfactoren, zoals [4](#page=4): * Verhitting [4](#page=4). * Verhoging van de zoutconcentratie [4](#page=4). * Verandering van de pH [4](#page=4). * Competitie met andere moleculen die aan hetzelfde epitoop kunnen binden [4](#page=4). > **Tip:** Het begrijpen van de aard van deze krachten is cruciaal voor het begrijpen van de specificiteit en affiniteit van antilichaam-antigeen interacties, wat essentieel is voor immunologische reacties en biotechnologische toepassingen. --- # Diversiteit en herschikking van antilichamen De enorme diversiteit van antilichamen wordt gegenereerd door verschillende mechanismen die plaatsvinden tijdens de ontwikkeling van B-cellen, waaronder genherschikking, hypermutatie en de specifieke combinaties van variabele en constante gensegmenten voor zowel de lichte als de zware ketens [6](#page=6). ### 2.1 Mechanismen voor diversiteit De diversiteit van antilichamen wordt bereikt door de combinatie van verschillende genetische elementen en door het introduceren van mutaties. De belangrijkste mechanismen zijn [6](#page=6): * **Genherschikking (V(D)J-recombinatie):** Dit proces houdt in dat verschillende genetische segmenten (V, D, J) willekeurig met elkaar worden gecombineerd om de variabele domeinen van de antilichamen te vormen [6](#page=6). * **Hypermutatie:** Na activatie van B-cellen treedt een versnelde mutatie op in de variabele regio's van de antilichamen. Dit leidt tot antilichamen met een verhoogde affiniteit voor het antigeen [16](#page=16). * **Combinatie van zware en lichte ketens:** De uiteindelijke diversiteit wordt vergroot door de willekeurige combinaties van verschillende zware en lichte ketens [17](#page=17). > **Tip:** Hoewel genherschikking en hypermutatie normaal gesproken alleen in geslachtscellen voorkomen, vinden deze processen bij antilichamen plaats via somatische genherschikking en hypermutatie in B-cellen [6](#page=6). ### 2.2 Herschikking van de lichte keten De lichte keten van een antilichaam bestaat uit een variabele (V) en een constante (C) regio. De diversiteit wordt hierin gecreëerd door de combinatie van V- en J-segmenten (joining segments). #### 2.2.1 Genetische segmenten voor de lichte keten * **Kappa (κ) lichte ketens:** De genen voor de κ-lichte keten bevinden zich op chromosoom 2 en bestaan uit ongeveer 40 V-segmenten en 5 J-segmenten, met één C-segment [8](#page=8). * **Lambda (λ) lichte ketens:** De genen voor de λ-lichte keten bevinden zich op chromosoom 22 en bevatten ongeveer 30 V-segmenten, 4 J-segmenten en 4 C-segmenten [8](#page=8). #### 2.2.2 Stappen in de herschikking van de lichte keten 1. **V-J joining:** Een willekeurig V-segment wordt op DNA-niveau gekoppeld aan een willekeurig J-segment [9](#page=9). 2. **Transcriptie:** Een RNA-molecule (pre-mRNA) wordt gesynthetiseerd die de V-, J- en C-segmenten bevat, inclusief intronsequenties die niet coderen voor eiwitten [9](#page=9). 3. **RNA-splicing:** De intron-sequenties worden uit het pre-mRNA geknipt, wat resulteert in een volwassen messenger-RNA (mRNA) [9](#page=9). 4. **Translatie:** Het mRNA wordt getransleerd naar de uiteindelijke lichte keten van het antilichaam [10](#page=10) [9](#page=9). > **Example:** Een V-segment wordt gekozen uit 40 opties, en een J-segment uit 5 opties voor de kappa lichte keten. Dit alleen al biedt $40 \times 5 = 200$ mogelijke combinaties voor het variabele deel van de kappa lichte keten [8](#page=8). ### 2.3 Herschikking van de zware keten De zware keten van een antilichaam bevat naast V- en J-segmenten ook D-segmenten (diversity segments), wat de diversiteit verder vergroot. #### 2.3.1 Genetische segmenten voor de zware keten De genen voor de zware keten bevinden zich op chromosoom 14 en omvatten: * Ongeveer 65 V-segmenten [13](#page=13). * 27 D-segmenten [13](#page=13). * 6 J-segmenten [13](#page=13). * Tientallen C-segmenten die corresponderen met de verschillende isotypes (klassen) van antilichamen, evenals niet-functionele pseudogenen [13](#page=13). De herschikkingsstappen voor de zware keten volgen een vergelijkbaar patroon als voor de lichte keten, maar de V-D-J joining creëert een groter aantal combinaties [13](#page=13). ### 2.4 Hypermutatie Hypermutatie treedt op nadat B-cellen zijn geactiveerd door een antigeen [16](#page=16). * **Proces:** Versnelde mutaties worden geïntroduceerd in de VL (variabele lichte) en VH (variabele zware) regio's van het antilichaamgen [16](#page=16). * **Gevolg:** Deze mutaties resulteren in antilichamen met gemodificeerde CDRs (complementarity-determining regions) op het B-celoppervlak [16](#page=16). * **Selectie:** B-cellen met antilichamen die een hogere affiniteit hebben voor het antigeen worden geselecteerd voor secretie van deze gemuteerde antilichamen [16](#page=16). ### 2.5 Samenvatting van diversiteit De totale diversiteit van antilichamen wordt gegenereerd door de volgende factoren [17](#page=17): * Het grote aantal beschikbare V-segmenten [17](#page=17). * De VJ- (voor lichte ketens) en VDJ- (voor zware ketens) combinaties [17](#page=17). * Het proces van recombinatie zelf [17](#page=17). * De willekeurige combinatie van zware en lichte ketens [17](#page=17). * Hypermutatie die de affiniteit verhoogt [17](#page=17). --- # Isotype switching en functies van antilichaamisotypen Isotype switching is een cruciaal proces waarbij lymfocyten de constante regio van hun antilichamen aanpassen om zo verschillende effectorfunties te verkrijgen, terwijl de antigene specificiteit behouden blijft. ### 3.1 Isotype switching Isotype switching vindt plaats na de initiële productie van antilichamen van het IgM- en IgD-isotype. Na ongeveer tien dagen kunnen B-cellen overgaan op de productie van IgG, IgA en IgE. Dit proces houdt in dat de VDJ-sequenties van het variabele deel van het antilichaam worden overgezet op een ander constant (C) gen-segment [18](#page=18). #### 3.1.1 Regulatie van isotype switching Het proces van isotype switching wordt gestuurd door cytokines, waaronder interleukine-4 (IL-4) en transformatie-groeifactor bèta (TGF-β) [19](#page=19). ### 3.2 Verschillen tussen Ig-isotypen De verschillende immunoglobuline (Ig)-isotypen (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD) onderscheiden zich van elkaar op basis van hun zware keten. Verdere verschillen betreffen het aantal disulfidebruggen, het aantal constante heavy (CH)-domeinen, en het aantal en de plaatsing van N-gekoppelde suikers. IgG, IgA en IgD hebben drie CH-domeinen, terwijl IgE en IgM er vier hebben. Het variabele heavy (VH)-gedeelte kan koppelen aan elk CH-isotype [29](#page=29). #### 3.2.1 Polymeren: IgM en IgA IgM en IgA kunnen polymeren vormen. Het laatste domein van hun constante regio bevat achttien aminozuren, waaronder een cysteïne-residu dat essentieel is voor polymerisatie. Een J-keten bevordert deze polymerisatie [30](#page=30). * **Polymeer IgM:** Wordt vroeg in een infectie geproduceerd en komt in het plasma voor als pentameren, soms hexameren. Een polymeer IgM-molecuul wordt ook wel een macroglobuline genoemd en weegt ongeveer 5 maal 190 kDa [30](#page=30). * **Polymeer IgA (secretory IgA - sIgA):** Wordt uitsluitend aangetroffen in muceuze secreties en bestaat als een dimeer [30](#page=30). > **Tip:** Polymerisatie, met name van IgM, vergroot het molecuulgewicht en de aviditeit voor pathogenen, wat belangrijk is voor de initiële immuunrespons. ### 3.3 Effectorfunties van Ig-isotypen Elk Fc-fragment van een antilichaam kan binden aan een specifieke receptor, wat leidt tot diverse cellulaire acties [34](#page=34). * **IgG1 en IgG3:** Binden aan receptoren op fagocyten, wat leidt tot de fagocytose van antigenen [34](#page=34). * **IgE:** Bindt aan receptoren op mestcellen, basofielen en geactiveerde eosinofielen, wat de secretie van inflammatoire stoffen, zoals histamine, induceert [34](#page=34). * **Complementactivatie:** Wanneer antilichamen op antigenen gebonden zijn, kan hun Fc-gedeelte binden aan componenten van het complementsysteem, wat leidt tot de activatie van de complementcascade. Dit kan resulteren in de activering van macrofagen (Mφ), stimulatie van fagocyten en directe killing van pathogenen. IgG-isotypen (behalve IgG4) kunnen complement activeren via C1q [36](#page=36) [42](#page=42). #### 3.3.1 Transport van Ig-isotypen Fc-receptoren maken transport van antilichamen naar specifieke compartimenten mogelijk. Dit omvat transport naar mucosa, traanvocht, melk (IgA) en naar de foetus [37](#page=37). #### 3.3.2 Blocking-eiwitten Micro-organismen kunnen eiwitten produceren die de werking van het Fc-gedeelte blokkeren door eraan te binden, zoals proteïne A en proteïne G [37](#page=37). ### 3.4 Functies per Ig-isotype #### 3.4.1 Functies van IgM IgM wordt snel gevormd en is niet langdurig aanwezig, wat wijst op een acute infectie. Het is een pentameer (monomeer heeft geen scharnier) en wordt niet door de placenta getransporteerd vanwege het hoge molecuulgewicht. IgM speelt een cruciale rol in de eerstelijnsdefensie door complementactivatie en is bactericide [41](#page=41). #### 3.4.2 Functies van IgG IgG vormt ongeveer 80% van de antilichamen in het serum. Het wordt door de placenta getransporteerd via de cellulaire Fc-receptor (FcRn), wat resulteert in passieve immuniteit. IgG-antilichamen neutraliseren toxines en zijn langdurig aanwezig in het bloed, zowel door hun lange productie als door een lange halfwaardetijd (ongeveer 20 dagen). De aanwezigheid van IgG duidt op een vroegere blootstelling aan een agens [42](#page=42). #### 3.4.3 Functies van IgA IgA is prominent aanwezig in de mucosa, waar het functioneert als secretoir antilichaam (sIgA) in speeksel, melk (overdracht naar baby), het maag-darmkanaal en de genitaliën (vagina). sIgA is een dimeer en wordt via transcytose door de poly-Ig receptor getransporteerd, waarbij de secretorische component mogelijk stabiliteit biedt tegen de omgeving. IgA wordt niet door de placenta getransporteerd. Het is van groot belang bij de neutralisatie van pathogenen (virussen, bacteriën) en toxines voordat ze het lichaam binnendringen [43](#page=43) [45](#page=45). > **Example:** De bescherming van een zuigeling via moedermelk, voornamelijk door IgA, is een voorbeeld van passieve immuniteit geleverd via mucosale secreties. #### 3.4.4 Functies van IgE IgE komt in zeer lage concentraties voor in bloed en extracellulaire vloeistoffen (circa 10^-5 mg/ml vergeleken met 10 mg/ml voor IgG1). IgE is gebonden aan de Fc-regio's van mestcellen. Binding van antigeen aan IgE op mestcellen leidt tot de secretie van vaso-actieve stoffen. IgE speelt een rol in de verdediging tegen parasitaire wormen en is geassocieerd met allergische reacties [47](#page=47). #### 3.4.5 Functies van IgD De specifieke functies van IgD zijn grotendeels onbekend [49](#page=49). ### 3.5 Iso-, Allo-, en Idiotypes Deze termen beschrijven verschillende niveaus van variatie binnen antilichamen: * **Isotype:** Verschillen in de constante (C) domeinen van de zware keten, zoals IgG, IgA, IgM, IgE, en IgD. Anti-isotype antilichamen zijn specifiek gericht tegen deze isotypen (bijv. anti-IgG) [50](#page=50). * **Allotype:** Kleine verschillen in bepaalde epitopen van het C-domein. Anti-allotype antilichamen kunnen tegen deze verschillen gericht zijn [50](#page=50). * **Idiotype:** Verschillen in de variabele gebieden (antigeen-bindende plaatsen) van antilichamen. Anti-idiotype antilichamen zijn gericht tegen deze unieke epitopen [50](#page=50). #### 3.5.1 Regulatie van de immuunrespons Anti-idiotype antilichamen en antigenen vertonen moleculaire gelijkenis, wat kan leiden tot het opwekken van immuniteit. Dit mechanisme helpt het immuunsysteem terug te keren naar een rusttoestand na een immuunrespons [51](#page=51). ### 3.6 Ig distributie De distributie van immunoglobulinen in het lichaam varieert per isotype, met specifieke lokalisaties en transportmechanismen die hun effectorfuncties ondersteunen [53](#page=53). --- # Antilichaamstructuur en complement-systeem Deze sectie behandelt de gedetailleerde structuur van antilichamen, inclusief hun functionele fragmenten en domeinen, evenals de verschillende activeringsroutes en regulatiemechanismen van het complement-systeem. ### 4.1 Antilichaamstructuur Antilichamen, ook wel immunoglobulinen genoemd, zijn polypeptideketens die een cruciale rol spelen in de humorale immuniteit door extracellulaire pathogenen en toxines te bestrijden. Ze worden geproduceerd door geactiveerde B-cellen en zijn te vinden in serum en extracellulaire vloeistoffen [55](#page=55). #### 4.1.1 Algemene structuur De basale structuur van een antilichaam bestaat uit twee identieke zware ketens (elk ongeveer 50 kDa) en twee identieke lichte ketens (elk ongeveer 25 kDa). Deze vormen een symmetrische Y-vormige molecuul dat behoort tot de immunoglobuline-familie. Het molecuul bevat zowel variabele regio's, die verantwoordelijk zijn voor de antigenbinding, als constante regio's [56](#page=56). #### 4.1.2 Zware ketens De zware ketens bepalen het isotype (klasse) van het antilichaam. Er zijn vijf typen zware ketens: gamma ($\gamma$) voor IgG, mu ($\mu$) voor IgM, alpha ($\alpha$) voor IgA, delta ($\delta$) voor IgD, en epsilon ($\epsilon$) voor IgE. Deze typen hebben functionele verschillen. De zware ketens zijn aan elkaar verbonden door disulfidebindingen, wat de zogenaamde 'hinge'-regio vormt [58](#page=58). #### 4.1.3 Lichte ketens Er zijn twee soorten lichte ketens: kappa ($\kappa$) en lambda ($\lambda$). Deze lichte ketens bieden geen functionele verschillen tussen antilichamen. Ze zijn via disulfidebindingen verbonden aan de zware ketens [59](#page=59). #### 4.1.4 Regio's van antilichamen Antilichamen kunnen worden opgedeeld in twee hoofdregio's [60](#page=60): * **Constante regio's (C-regio's):** De aminozuursamenstelling van deze regio's varieert niet tussen verschillende antilichamen van hetzelfde isotype. Ze bevatten meestal 3 of 4 domeinen [60](#page=60). * **Variabele regio's (V-regio's):** De aminozuursamenstelling van deze regio's varieert aanzienlijk en bepaalt de specificiteit voor het antigeen. Elke zware keten heeft een VH-domein en elke lichte keten heeft een VL-domein, die tegenover elkaar liggen om de antigenbindingsplaats te vormen [60](#page=60). #### 4.1.5 Fc- en Fab-fragmenten Door enzymatische digestie kunnen antilichamen worden opgesplitst in functionele fragmenten [63](#page=63). * **Papaïne:** Dit enzym breekt het antilichaam op twee plaatsen boven de centrale disulfidebindingen van de zware ketens. Dit resulteert in drie fragmenten: één Fc-fragment (Fragment crystallizable) en twee Fab-fragmenten (Fragment antigen-binding) [63](#page=63). * **Pepsine:** Dit enzym breekt het antilichaam één plaats onder de centrale disulfidebindingen. Dit resulteert in een F(ab')$_2$-fragment (twee Fab-armen intact) en een afgebroken Fc-fragment. Het F(ab')$_2$-fragment behoudt de mogelijkheid om antigenen te binden, terwijl het Fc-fragment verder wordt afgebroken [63](#page=63). #### 4.1.6 Immunoglobulinedomeinen Immunoglobulinedomeinen zijn de bouwstenen van antilichamen. Ze zijn globulair, tonvormig en hebben een $\beta$-barrel structuur. De disulfidebindingen binnen deze domeinen stabiliseren de Ig-plooi, die bestaat uit heen en weer gaande $\beta$-sheets. Deze domeinen zijn onderdeel van de grotere immunoglobuline superfamilie, die ook andere eiwitten omvat zoals de T-celreceptor, CD4, CD8, MHC-moleculen en adhesiemoleculen [67](#page=67). ### 4.2 Het complement-systeem Het complement-systeem is een verzameling eiwitten (C1 tot C9) die de werking van antilichamen aanvullen, met name tegen bacteriën. Het systeem is betrokken bij humorale en aangeboren immuniteit [71](#page=71). #### 4.2.1 Functies van het complement-systeem Het complement-systeem heeft diverse functies binnen het immuunsysteem [71](#page=71): * **Versterken van opsonisatie:** Door betere herkenning van pathogenen, wat leidt tot efficiëntere fagocytose [71](#page=71). * **Directe celdoding:** Het kan bijdragen aan het rechtstreeks doden van bacteriën [71](#page=71). * **Chemotaxis:** Het trekt macrofagen (M$\phi$) aan naar de plaats van infectie [71](#page=71). * **Inflammatie:** Geproduceerde complementfragmenten kunnen ontstekingsreacties mediëren [75](#page=75) [78](#page=78). #### 4.2.2 Activering van het complement-systeem Er zijn drie hoofdroutes voor de activatie van het complement-systeem, die allemaal leiden tot de knipping van complementeiwitten en uiteindelijk tot een cascade. Slechts één trigger is nodig om de cascade te starten [72](#page=72). ##### 4.2.2.1 Klassieke route De klassieke route wordt getriggerd door de binding van antilichamen (IgM of meerdere IgG moleculen) aan het oppervlak van een pathogeen [72](#page=72) [73](#page=73). 1. **Binding van C1:** Het C1-complex, bestaande uit C1q, C1r en C1s, bindt aan het antigeen-antilichaamcomplex op het pathogeen [73](#page=73). 2. **Activatie van C1s:** C1r klieft C1s, waarna C1s C4 kan splitsen tot C4a en C4b [74](#page=74). 3. **Vorming C3 convertase:** C4b bindt covalent aan het pathogeen. C2 bindt aan C4b en C1s splitst C2b af, waardoor het C4b2a-complex ontstaat. Dit complex is het C3 convertase [74](#page=74). 4. **Massaële C3 activatie:** Het C3 convertase splitst massaal C3 in C3a en C3b [75](#page=75). * C3a medieert inflammatie [75](#page=75). * C3b bindt covalent aan het pathogeen en werkt als een opsonine [75](#page=75). 5. **Vorming van het MAC:** Het C4b2a3b complex (een geactiveerd C5 convertase) bindt C5, wat leidt tot splitsing in C5a en C5b [75](#page=75). * C5a medieert inflammatie [75](#page=75). * C5b associeert met C6 en C7 op het pathogeen, waarna C8 en C9 binden. C9 polymeriseert en vormt een porie van ongeveer 10 nanometer in de celmembraan van het pathogeen, wat leidt tot lysis [76](#page=76). ##### 4.2.2.2 Alternatieve route De alternatieve route is een deel van de aangeboren immuniteit en wordt verondersteld de oudste activeringsweg te zijn. Deze route wordt geactiveerd door het oppervlak van een pathogeen, zoals bacteriën [72](#page=72) [82](#page=82). 1. **Spontane C3 omzetting:** C3 wordt spontaan omgezet in C3b [83](#page=83). 2. **Stabilisatie van C3b:** Op het oppervlak van een pathogeen bindt C3b covalent. Zonder pathogeen wordt C3b geïnactiveerd door hydrolyse [83](#page=83). 3. **Vorming C3 convertase:** Factor B bindt aan C3b en wordt door factor D geklieft in Ba en Bb. Het C3bBb-complex vormt het C3 convertase voor de alternatieve route [83](#page=83). 4. **Massaële C3 activatie:** Dit C3 convertase leidt tot massale activatie van C3 [83](#page=83). 5. **Stabilisatie door Factor P:** Factor P (properdine) bindt aan het C3 convertase, wat de activiteit stabiliseert en leidt tot aanzienlijke vorming van C3b en C3a op pathogenen [84](#page=84). ##### 4.2.2.3 Mannan-bindende lectine (MBL) activeringsroute Deze route wordt geactiveerd wanneer lectines (eiwitten die specifieke suikers herkennen) binden aan mannose-residuen op het oppervlak van bacteriën. Dit leidt tot de inductie van C3 convertase activiteit via interactie met C2 en C4 [72](#page=72) [85](#page=85). #### 4.2.3 Regulat ie van de complementcascade Om schade aan eigen cellen te voorkomen, is er een strikte regulatie van het complement-systeem [79](#page=79). * **C1-INH (C1-inhibitor):** Dit eiwit bindt aan C1r en C1s, waardoor C1q dissocieert. Dit limiteert de spontane activatie van C1 in het bloed [79](#page=79). * **DAF (Decay Accelerating Factor):** Cellen die in contact staan met het bloed produceren DAF, dat de vorming van C3 convertase verhindert door C2a uit het complex te verwijderen [79](#page=79). ##### 4.2.3.1 Klinische implicaties van disregulatie * **Angioneurotisch oedeem:** Chronische activatie van C1, bijvoorbeeld door een tekort aan C1-INH, kan leiden tot continue productie van C4a en C2a, wat resulteert in oedeem [80](#page=80). * **Paroxismale Nachtelijke Hemoglobinurie (PNH):** Bij PNH is er een defecte synthese van DAF, waardoor het eiwit niet correct aan het celoppervlak wordt geëxpresseerd. Dit leidt tot intravasculaire lyse van rode bloedcellen [81](#page=81). #### 4.2.4 Inflammatoire effecten van complementfragmenten C3a, C4a en C5a zijn anafylatoxines en spelen een rol bij inflammatie [75](#page=75) [78](#page=78): * Verhoging van de doorlaatbaarheid van bloedvaten, wat leidt tot vochtophoping (oedeem) [78](#page=78). * Aantrekken van immuuncellen zoals antilichamen en macrofagen [78](#page=78). * Stimulatie van dendritische cellen en macrofagen om pathogenen naar de lymfeknopen te transporteren [78](#page=78). * Activatie van mestcellen, wat kan leiden tot anafylactische shock [78](#page=78). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Hypervariabele regio's | Dit zijn specifieke segmenten in de variabele domeinen van antilichamen die sterk variëren in aminozuursequentie en de doorslaggevende rol spelen bij de binding aan antigenen. Ze vormen de antigenbindende site. | | Epitoop | Dit is de specifieke plaats of regio op een antigeen waar de binding met de complementaire determinantregio (CDR) van een antilichaam plaatsvindt. | | Elektrostatische interacties | Dit zijn aantrekkings- of afstotingskrachten tussen geladen deeltjes. In de context van AG-AL interacties dragen de ladingen op de aminozuurresiduen bij aan de bindingsaffiniteit. | | Waterstofbruggen | Zwakke chemische bindingen die ontstaan tussen een waterstofatoom gebonden aan een elektronegatief atoom en een ander elektronegatief atoom. Ze zijn belangrijk voor de stabiliteit van moleculaire structuren en interacties. | | Hydrofobe krachten | Krachten die optreden wanneer niet-polaire moleculen samenkomen in een polaire omgeving, zoals water. Ze proberen water uit te stoten en zo de interactie tussen de niet-polaire oppervlakken te maximaliseren. | | Van der Waals krachten | Zwakke, kortstondige intermoleculaire krachten die ontstaan door tijdelijke fluctuaties in de elektronendichtheid van moleculen, wat leidt tot tijdelijke dipolen. | | Genherschikking | Een genetisch proces waarbij verschillende gensegmenten (V, D, J) willekeurig worden gecombineerd om de variabele regio van antilichamen te creëren, wat resulteert in een grote diversiteit aan antigeenreceptoren. | | Somatische hypermutatie | Een proces dat optreedt na B-celactivatie waarbij de DNA-sequenties van de variabele genen van antilichamen worden gemuteerd, wat leidt tot een verhoogde affiniteit van het antilichaam voor het antigeen. | | V-segment | Staat voor het variabele segment van een antilichaamgen. Deze segmenten coderen voor het variabele deel van de antilichaamketen, wat cruciaal is voor antigeenbinding. | | C-segment | Staat voor het constante segment van een antilichaamgen. Deze segmenten coderen voor het constante deel van de antilichaamketen, wat bepaalt welk type immunoglobuline (isotype) wordt geproduceerd. | | J-segment | Staat voor het junction (verbindings) segment van een antilichaamgen. Deze segmenten verbinden de V- en C-segmenten tijdens genherschikking en dragen bij aan de diversiteit. | | D-segment | Staat voor het diversity (diversiteit) segment, aanwezig in de zware ketens van antilichamen. Deze segmenten vergroten de diversiteit door extra combinatiemogelijkheden tijdens genherschikking. | | RNA-splicing | Het proces waarbij intronsequenties uit een precursor-mRNA-molecuul worden verwijderd en de exonsequenties aan elkaar worden gekoppeld om een volwassen mRNA te vormen dat kan worden getransleerd naar een eiwit. | | mRNA | Messenger RNA, een molecuul dat de genetische informatie van DNA naar het ribosoom transporteert om de synthese van eiwitten te sturen. | | Translatie | Het proces waarbij de genetische code in een mRNA-molecuul wordt afgelezen door ribosomen om een specifieke sequentie van aminozuren te synthetiseren, wat leidt tot de vorming van een eiwit. | | Isotype switching | Een proces waarbij een B-cel overschakelt van de productie van één type antilichaam (bv. IgM) naar een ander type (bv. IgG, IgA, IgE) met behoud van dezelfde antigeenspecificiteit, gestuurd door cytokines. | | Cytokines | Signaalmoleculen die worden geproduceerd door cellen van het immuunsysteem om de communicatie en regulatie van immuunreacties te bevorderen. | | Fc-fragment | Het fragment van een antilichaam dat wordt verkregen na proteolytische splitsing en dat geen antigeenbindende activiteit heeft. Het bevat bindingsplaatsen voor celreceptoren en complementfactoren. | | Fab-fragment | Het fragment van een antilichaam dat de antigeenbindende plaats bevat. Het wordt verkregen na proteolytische splitsing en bestaat uit een lichte keten en een deel van een zware keten. | | Complement-systeem | Een complex systeem van plasma-eiwitten dat een cruciale rol speelt in de aangeboren en humorale immuniteit door pathogenen te elimineren via lysis, opsonisatie en ontsteking. | | Opsonisatie | Het proces waarbij pathogenen worden bedekt met moleculen zoals antilichamen of complementcomponenten, wat hun herkenning en fagocytose door immuuncellen vergemakkelijkt. | | Chemotactisch | Een eigenschap van moleculen om cellen, met name immuuncellen zoals macrofagen, aan te trekken naar een specifieke locatie, wat belangrijk is voor het rekruteren van immuunrespons. | | Klassieke route | Een van de activatieroutes van het complement-systeem, die wordt geïnitieerd door de binding van een antigeen-antilichaamcomplex (voornamelijk IgM of IgG) aan het C1-eiwit. | | Alternatieve route | Een activatieroute van het complement-systeem die onafhankelijk is van antilichamen. Het wordt direct geactiveerd door het oppervlak van bepaalde pathogenen. | | Mannan-bindende lectine (MBL) activatieroute | Een activatieroute van het complement-systeem die wordt geïnitieerd door de binding van MBL, een eiwit dat specifieke koolhydraatstructuren op pathogenen herkent, aan het pathogeen. | | C3 convertase | Een enzymcomplex binnen het complement-systeem dat C3 splitst in C3a en C3b, wat een centrale stap is in de cascade van complementactivatie en leidt tot de vorming van het lytische complex. | | Lytische complex (MAC) | Het membraan-aanvallende complex (MAC) dat wordt gevormd aan het einde van de complementcascade. Het creëert een porie in de celmembraan van pathogenen, wat leidt tot celdood. | | Anafylatoxines | Kleine peptidefragmenten (C3a, C4a, C5a) geproduceerd tijdens complementactivatie die de degranulatie van mestcellen en basofielen induceren, leidend tot ontstekingsreacties en mogelijk anafylactische shock. | | Regulatie van de complementcascade | Processen en eiwitten die de activiteit van het complement-systeem controleren om te voorkomen dat het lichaamseigen cellen aanvalt en om overmatige ontstekingsreacties te beperken. | | DAF (Decay Accelerating Factor) | Een celmembraan-eiwit dat de activiteit van C3 convertases remt door de dissociatie van hun componenten te versnellen, waardoor de complementactivatie wordt beperkt. | | Angioneurotisch oedeem | Een aandoening die wordt gekenmerkt door snelle zwelling van diepere huidlagen, slijmvliezen en submucosa, vaak veroorzaakt door chronische complementactivatie die leidt tot overmatige productie van inflammatoire mediatoren. | | Paroxismale nachtelijke hemoglobinurie (PNH) | Een zeldzame verworven hematologische aandoening waarbij rode bloedcellen defect zijn en gevoeliger voor complementgemedieerde lysis, wat leidt tot hemolytische anemie. | | Immunoglobulinedomeinen | Globulaire structurele eenheden die kenmerkend zijn voor antilichamen en andere eiwitten van de immunoglobuline-superfamilie. Ze bestaan uit een β-barrel structuur met interne β-sheets, gestabiliseerd door disulfidebruggen. | | Immunoglobuline-superfamilie | Een grote groep eiwitten die structurele en evolutionaire overeenkomsten vertonen met immunoglobulines. Ze spelen diverse rollen in celherkenning, adhesie en immuunrespons. | | Vaginaal IgA | Een specifieke vorm van IgA die aanwezig is in vaginale secreties, essentieel voor de lokale immuunbescherming tegen infecties in het genitale tractus. | | Secretorische component | Een glycoproteïne dat wordt gehecht aan IgA-dimeren tijdens transport door epitheelcellen, waardoor het secretory IgA wordt gestabiliseerd en beschermd tegen enzymatische afbraak in luminale omgevingen. | | Mastcel | Een type immuuncel dat rijk is aan granula die mediatoren van ontsteking en allergische reacties bevatten, zoals histamine. Ze spelen een rol bij de afweer tegen parasieten en bij allergieën. | | Allergenen | Stoffen die bij aanvang van een allergische reactie bij gevoelige individuen een allergische reactie kunnen veroorzaken. | | Isotype | Een classificatie van antilichamen gebaseerd op verschillen in de zware keten, resulterend in de vijf klassen: IgG, IgA, IgM, IgE en IgD, die verschillende functionele eigenschappen hebben. | | Allotype | Kleine polymorfismen of variaties in specifieke epitopen van het constante domein van antilichamen binnen een bepaald isotype, die genetisch bepaald zijn en immunogeniciteit kunnen veroorzaken. | | Idiotype | De unieke set van epitopen binnen het variabele domein van een antilichaam, die specifiek is voor de antigeenbindende site. Anti-idio-antilichamen kunnen worden gebruikt om de immuunrespons te reguleren. | | Humorale immuniteit | Een type immuniteit dat gemedieerd wordt door antilichamen die in de lichaamssappen (humeur) circuleren, geproduceerd door B-cellen, en die extracellulaire pathogenen en toxines neutraliseren. | | Aangeboren immuniteit | De eerste lijn van afweer van het lichaam, bestaande uit niet-specifieke verdedigingsmechanismen die direct beschikbaar zijn om infecties te bestrijden, zoals fagocyten en ontstekingsreacties. |

# Les mécanismes de la transcription La transcription est le processus de synthèse d'une molécule d'ARN à partir d'une matrice d'ADN, partageant des similitudes fondamentales avec la réplication de l'ADN mais présentant des différences clés quant à la catalyse, la fidélité et la portée [4](#page=4). ### 1.1 Description générale et comparaison avec la réplication La transcription est un processus essentiel au cours duquel le matériel génétique contenu dans l'ADN est copié sous forme d'ARN. Ce mécanisme est intrinsèquement similaire à la réplication de l'ADN en ce sens que les deux processus impliquent des enzymes qui synthétisent un nouveau brin d'acide nucléique en utilisant un brin d'ADN comme matrice. Cependant, des distinctions importantes existent. Contrairement à la réplication, l'ARN polymérase, l'enzyme responsable de la transcription, ne nécessite pas d'amorce pour initier la synthèse. De plus, l'ARN nouvellement synthétisé ne reste pas apparié à son brin matrice d'ADN [4](#page=4). Une autre différence notable réside dans la fidélité du processus. La transcription est généralement moins fidèle que la réplication, car elle manque d'une fonction élevée de correction. Parallèlement, la transcription copie sélectivement des parties spécifiques du génome, produisant plusieurs centaines de copies d'un gène, tandis que la réplication doit copier l'intégralité du génome en une seule fois. Il est important de noter que plusieurs ARN polymérases peuvent transcrire le même gène simultanément, permettant ainsi la production d'un grand nombre de transcrits à partir d'un seul gène. Immédiatement après la transcription, les deux brins d'ADN se réassocient [4](#page=4). > **Tip:** La capacité de produire plusieurs copies d'un ARN à partir d'un seul gène est cruciale pour répondre aux besoins protéiques cellulaires fluctuants. ### 1.2 Les étapes de la transcription La transcription se déroule en une série d'étapes. Chez les bactéries, ce cycle comprend typiquement l'initiation, l'élongation et la terminaison [14](#page=14). #### 1.2.1 L'initiation L'initiation est la phase au cours de laquelle l'ARN polymérase se lie au promoteur d'un gène et commence la synthèse d'ARN. La transition vers le complexe ouvert implique des modifications structurales de l'ARN polymérase et du promoteur. L'ARN polymérase possède plusieurs canaux: un canal pour l'arrivée des nucléotides triphosphates (NTPs), un canal de sortie pour l'ARN en croissance, et trois canaux permettant l'entrée et la sortie de l'ADN [21](#page=21). Au cours de l'initiation chez les bactéries, l'ADN entre dans l'enzyme sous forme double brin dans le centre catalytique. Dans le centre catalytique, les deux brins d'ADN se dissocient entre les positions -10 et +3, une transition facilitée par la présence de nombreux sites riches en paires AT. Le brin codant (sens) quitte le centre réactif par le canal NTP et se déplace à la surface de l'enzyme. Le brin matrice, quant à lui, passe par le centre catalytique puis le canal matrice T. La double hélice d'ADN se reforme en amont de l'enzyme, au niveau de -11 [23](#page=23). L'holoenzyme démarre la transcription des 9 premiers nucléotides sans déplacement notable. Le premier nucléotide de la chaîne d'ARN est généralement une base purique (adénine ou guanine) . Pour que l'ARN polymérase avance, le facteur sigma est relâché et remplacé par la protéine NusA [24](#page=24). #### 1.2.2 L'élongation L'élongation est la phase où la chaîne d'ARN est synthétisée de manière continue. L'ARN polymérase se déplace le long du brin matrice d'ADN, déroulant l'hélice devant elle et la refermant derrière elle. Les nucléotides sont ajoutés un par un au brin d'ARN en croissance en utilisant l'appariement des bases complémentaires avec le brin matrice d'ADN [23](#page=23) [24](#page=24) [26](#page=26). #### 1.2.3 La terminaison La terminaison marque la fin de la synthèse d'ARN. Ce processus peut être déclenché par des séquences spécifiques dans l'ADN qui signalent à l'ARN polymérase de s'arrêter [26](#page=26). > **Example:** La visualisation expérimentale de la transcription a été réalisée en cultivant des cellules en présence de 3H-thymidine (pour marquer l'ADN) et de 32P-uridine (pour marquer l'ARN), puis en extrayant et visualisant l'ADN et l'ARN par centrifugation sur gradient de densité. La radioactivité de l'ARN et de l'ADN a ensuite été analysée pour comprendre l'association ADN/ARN [7](#page=7). --- # Les ARN polymérases Cette section détaille les ARN polymérases, en distinguant celles présentes chez les bactéries (une seule) et chez les eucaryotes (trois types distincts), ainsi que leurs fonctions spécifiques dans la transcription des différents types d'ARN [9](#page=9). ### 2.1 Les ARN polymérases chez les bactéries Chez les bactéries, il n'existe qu'une seule ARN polymérase. Cette enzyme unique est responsable de la transcription de tous les types d'ARN, y compris les ARN messagers (ARNm), les ARN de transfert (ARNt) et les ARN ribosomiques (ARNr) [9](#page=9). ### 2.2 Les ARN polymérases chez les eucaryotes Les eucaryotes possèdent trois ARN polymérases distinctes, chacune spécialisée dans la transcription de catégories spécifiques de gènes [9](#page=9). #### 2.2.1 ARN polymérase I (Pol I) L'ARN polymérase I est principalement responsable de la transcription des gènes codant pour le grand précurseur des ARN ribosomiques (ARNr) dans le nucléole. Ce précurseur est ensuite clivé pour former les ARNr matures [9](#page=9). #### 2.2.2 ARN polymérase II (Pol II) L'ARN polymérase II est la polymérase clé pour la transcription des ARNm dans le noyau. Elle transcrit également la majorité des petits ARN nucléaires (snARN) et certains microARN (miARN) [9](#page=9). #### 2.2.3 ARN polymérase III (Pol III) L'ARN polymérase III est responsable de la transcription des ARNt, de certains petits ARN nucléaires (snARN) et de l'ARNr de petite taille, l'ARNr 5S, le tout dans le noyau [9](#page=9). > **Tip:** La spécialisation des ARN polymérases chez les eucaryotes permet une régulation plus fine et complexe de l'expression génique, adaptée aux besoins spécifiques de chaque type d'ARN et à la complexité des cellules eucaryotes [9](#page=9). --- # La transcription chez les procaryotes : promoteurs, initiation, élongation et terminaison La transcription chez les procaryotes est un processus essentiel qui permet la synthèse d'ARN à partir d'un modèle d'ADN, impliquant des étapes distinctes de reconnaissance du promoteur, d'initiation, d'élongation et de terminaison [17](#page=17). ### 3.1 Les promoteurs bactériens Les promoteurs sont des séquences d'ADN situées en amont du site de transcription qui dirigent l'ARN polymérase vers le début du gène. Chez *E. coli*, le facteur sigma ($\sigma$) est crucial pour la reconnaissance des promoteurs par l'ARN polymérase. L'ARN polymérase minimale a une affinité pour l'ADN, mais le facteur $\sigma$ seul n'en a pas. L'association de l'ARN polymérase minimale avec le facteur $\sigma$ forme l'holoenzyme, qui présente une forte affinité pour les séquences promotrices. Les promoteurs reconnus par le facteur $\sigma$ prédominant, $\sigma^{70}$, possèdent deux régions conservées de six nucléotides chacune: la boîte -35 et la boîte -10, situées en amont du site de démarrage de la transcription [17](#page=17). > **Tip:** Comprendre la structure et la fonction des promoteurs est fondamental pour saisir comment la transcription est spécifiquement initiée au bon endroit sur le génome bactérien. ### 3.2 L'initiation de la transcription L'initiation est la phase où l'ARN polymérase se lie au promoteur et commence la synthèse d'ARN [21](#page=21). #### 3.2.1 La formation du complexe ouvert La transition vers le complexe ouvert implique des modifications structurales de l'ARN polymérase et du promoteur. L'ARN polymérase possède plusieurs canaux: un pour l'arrivée des nucléotides triphosphates (NTP), un pour la sortie de l'ARN en croissance, et trois pour l'entrée et la sortie de l'ADN. L'ADN double brin entre dans le centre catalytique de l'enzyme. Dans ce centre, les deux brins d'ADN se dissocient entre les positions -10 et +3, une transition facilitée par la présence de nombreux sites riches en AT. Le brin codant (sens) quitte le site réactif par un canal spécifique et se déplace sur la surface de l'enzyme, tandis que le brin matrice passe par le centre catalytique puis par un canal matrice. La double hélice se reforme en amont de l'enzyme [21](#page=21) [23](#page=23). #### 3.2.2 Le démarrage de la transcription L'holoenzyme démarre la transcription, synthétisant généralement les 9 premiers nucléotides sans déplacement significatif de l'enzyme. Le premier nucléotide de la chaîne d'ARN est généralement une base purique (adénine ou guanine). Après la synthèse de ce court oligonucléotide, l'ARN polymérase doit avancer. Pour ce faire, elle relâche le facteur $\sigma$, qui est alors remplacé par la protéine NusA. Le remplacement du facteur $\sigma$ par NusA marque la transition de l'initiation à l'élongation [24](#page=24). > **Example:** Chez *E. coli*, la boîte -10 (consensus séquence TATAAT) et la boîte -35 (consensus séquence TTGACA) sont des régions clés reconnues par le facteur $\sigma^{70}$ [17](#page=17). ### 3.3 L'élongation de la transcription L'élongation est la phase de synthèse de la chaîne d'ARN pendant laquelle l'ARN polymérase se déplace le long du brin matrice d'ADN. Une fois le complexe d'initiation formé et le facteur $\sigma$ libéré, l'ARN polymérase procède à l'élongation de l'ARN de manière continue. L'enzyme utilise les nucléotides triphosphates disponibles dans le milieu pour allonger la chaîne d'ARN, en suivant les règles d'appariement des bases complémentaires avec le brin matrice d'ADN [24](#page=24) [26](#page=26). ### 3.4 La terminaison de la transcription La terminaison met fin à la synthèse de l'ARN et libère l'ARN polymérase de l'ADN matrice. Chez les procaryotes, il existe deux mécanismes principaux de terminaison [28](#page=28): #### 3.4.1 La terminaison Rho-indépendante Ce type de terminaison ne nécessite pas de protéines auxiliaires. Il est caractérisé par la présence d'une séquence d'ARN formant une structure secondaire en épingle à cheveux, suivie d'une séquence riche en uraciles (U) sur le brin d'ARN nouvellement synthétisé. La formation de l'épingle à cheveux crée une instabilité dans le complexe de transcription, et les liaisons faibles entre les résidus A de l'ADN matrice et les résidus U de l'ARN permettent la dissociation de l'ARN polymérase et de l'ARN transcrit de l'ADN [29](#page=29). #### 3.4.2 La terminaison Rho-dépendante Ce mécanisme fait intervenir une protéine appelée facteur Rho. Le facteur Rho est une hélicase qui se lie à des séquences spécifiques sur l'ARN nouvellement synthétisé, appelées sites *rut* (Rho utilisation site). Le facteur Rho utilise l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP pour se déplacer le long de l'ARN en direction de l'ARN polymérase. Lorsqu'il rencontre le complexe de transcription, le facteur Rho peut provoquer la dissociation de l'ARN polymérase, de l'ARN et de l'ADN matrice. Dans certains cas, le site de terminaison ne possède pas une structure capable de former une épingle à cheveux, rendant le facteur Rho essentiel pour augmenter l'efficacité du site de terminaison [30](#page=30). > **Tip:** Les deux mécanismes de terminaison assurant la libération correcte de l'ARN polymérase sont cruciaux pour la régulation de l'expression génique chez les procaryotes. --- # Régulation de la transcription chez les procaryotes : l'opéron lactose Ce sujet examine comment la transcription est régulée chez les procaryotes, en utilisant l'opéron lactose comme modèle pour illustrer la réponse aux changements environnementaux. ### 4.1 Le concept d'opéron chez les procaryotes L'opéron est une unité fonctionnelle de l'ADN chez les procaryotes qui comprend un ensemble de gènes structurels codant pour des protéines liées à une même voie métabolique, ainsi que des séquences régulatrices adjacentes (promoteur, opérateur) qui contrôlent leur expression [36](#page=36). #### 4.1.1 Gènes structurels et ARN polycistronique Les gènes structurels d'un opéron sont transcrits en un seul ARN messager (ARNm) polycistronique, qui contient les informations pour plusieurs protéines consécutives. Ceci est une caractéristique propre aux cellules procaryotes, contrairement aux ARN monocistroniques trouvés chez les eucaryotes [36](#page=36). ### 4.2 L'opéron lactose : un exemple de régulation inductible L'opéron lactose est un système bactérien qui permet la dégradation du lactose en glucose et galactose. Il code pour trois protéines principales: la $\beta$-galactosidase, la perméase du lactose et la transacétylase du lactose [35](#page=35). #### 4.2.1 La nécessité des enzymes liées au lactose Lorsque le lactose est absent, la bactérie n'a pas besoin de métaboliser ce sucre, et les enzymes associées ne sont donc pas synthétisées. En présence de lactose, ces enzymes deviennent nécessaires, ce qui déclenche leur synthèse [35](#page=35). #### 4.2.2 Le lactose comme inducteur Le lactose agit comme un inducteur de la transcription des gènes de l'opéron lactose. L'inducteur (dans ce cas, l'allolactose, un dérivé du lactose) se lie à un répresseur, modifiant sa conformation et l'empêchant de se lier à l'opérateur. Cela permet à l'ARN polymérase de transcrire les gènes structurels [35](#page=35) [37](#page=37) [38](#page=38) [39](#page=39). ### 4.3 Les éléments régulateurs de l'opéron lactose L'opéron lactose est composé de plusieurs éléments clés qui contrôlent son expression : * **Promoteur (P):** Site de liaison de l'ARN polymérase, initiant la transcription [36](#page=36). * **Opérateur (O):** Séquence d'ADN à laquelle se lie la protéine répresseur [36](#page=36). * **Gènes structurels :** * $lacZ$: Code pour la $\beta$-galactosidase, une enzyme qui hydrolyse le lactose en glucose et galactose [36](#page=36). * $lacY$: Code pour la perméase du lactose, une protéine membranaire qui transporte le lactose dans la cellule [36](#page=36). * $lacA$: Code pour la transacétylase du lactose, dont la fonction exacte est moins critique pour la compréhension de base [36](#page=36). * **Gène régulateur (i):** Situé en amont de l'opéron, il code pour la protéine répresseur LacI [36](#page=36). ### 4.4 Régulation de l'opéron lactose La régulation de l'opéron lactose se fait principalement de deux manières : #### 4.4.1 Régulation négative : rôle du répresseur En l'absence de lactose, la protéine répresseur LacI se lie à la séquence de l'opérateur (O), bloquant physiquement la progression de l'ARN polymérase le long de l'ADN. Par conséquent, aucun ARNm n'est produit et aucune protéine n'est synthétisée. [37](#page=37). Lorsque le lactose est présent, il est converti en allolactose, qui agit comme un inducteur. L'allolactose se lie au répresseur LacI, induisant un changement de conformation qui le rend incapable de se lier à l'opérateur. Le répresseur se détache alors de l'opérateur, permettant à l'ARN polymérase de se lier au promoteur et de transcrire les gènes structurels de l'opéron [38](#page=38) [39](#page=39). > **Tip:** La régulation négative par un répresseur est un mécanisme courant chez les procaryotes, permettant d'éteindre l'expression génique en l'absence d'un signal ou d'un substrat nécessaire. #### 4.4.2 Régulation positive : le rôle de la CAP et de l'AMPc La régulation positive intervient pour optimiser l'utilisation du lactose lorsque le glucose est en faible concentration. * **Niveau de glucose bas :** Lorsque le glucose est abondant, il inhibe la production d'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) par la bactérie. L'AMPc est nécessaire pour activer la protéine CAP (protéine activatrice par le catabolite). * **Niveau de glucose élevé:** Lorsque le glucose est abondant, l'AMPc est à faible concentration. L'AMPc ne peut donc pas se lier à la protéine CAP. La protéine CAP, non liée à l'AMPc, ne peut pas se lier efficacement au promoteur de l'opéron lactose, ce qui entraîne une transcription faible, même si le lactose est présent [40](#page=40) [41](#page=41) [42](#page=42). * **Niveau de glucose bas:** Lorsque le glucose est rare, la concentration d'AMPc augmente. L'AMPc se lie à la protéine CAP, formant un complexe CAP-AMPc. Ce complexe se lie à un site spécifique en amont du promoteur, facilitant la liaison de l'ARN polymérase et augmentant considérablement le taux de transcription de l'opéron lactose, tant que le lactose est présent [40](#page=40) [41](#page=41) [42](#page=42). > **Example:** Si une bactérie a accès au glucose et au lactose, elle préférera utiliser le glucose car son métabolisme est plus efficace. La régulation positive garantit que l'opéron lactose n'est activé qu'en l'absence de glucose, optimisant ainsi l'utilisation des ressources énergétiques. ### 4.5 Synthèse des conditions d'expression de l'opéron lactose L'expression de l'opéron lactose est régulée par une combinaison de ces mécanismes : 1. **Absence de lactose et absence de glucose:** L'opéron est fortement exprimé. Le répresseur est inactif (car le lactose est présent) et le complexe CAP-AMPc est actif (car le glucose est absent), stimulant fortement la transcription [41](#page=41). 2. **Présence de lactose et absence de glucose:** L'opéron est fortement exprimé. Le répresseur est inactif (car le lactose est présent) et le complexe CAP-AMPc est actif (car le glucose est absent) [41](#page=41). 3. **Absence de lactose et présence de glucose:** L'opéron est très faiblement exprimé. Le répresseur est actif (car le lactose est absent) et le complexe CAP-AMPc est inactif (car le glucose est présent) [41](#page=41). 4. **Présence de lactose et présence de glucose:** L'opéron est faiblement exprimé. Le répresseur est inactif (car le lactose est présent), mais le complexe CAP-AMPc est inactif (car le glucose est présent), ce qui limite la transcription [41](#page=41). L'opéron lactose illustre parfaitement la capacité des procaryotes à adapter leur machinerie métabolique en réponse aux conditions nutritionnelles de leur environnement grâce à des systèmes de régulation transcriptionnelle précis. [35](#page=35) [37](#page=37) [38](#page=38) [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41) [42](#page=42) [43](#page=43). --- # ARNt et ARNr des procaryotes La synthèse des ARN de transfert (ARNt) et des ARN ribosomiques (ARNr) chez les procaryotes implique des processus post-transcriptionnels essentiels tels que le clivage, les modifications chimiques et l'addition de nucléotides aux ARN naissants [45](#page=45). ### 5.1 Formation des ARNt et ARNr Les ARNt et ARNr sont formés soit par clivage de précurseurs plus longs, soit par des modifications chimiques des ARN naissants. Chez *E. coli*, un seul transcrit peut donner naissance à trois ARNr distincts et à un ARNt [45](#page=45). #### 5.1.1 Addition de nucléotides aux ARNt Une caractéristique spécifique de la maturation des ARNt est l'addition de nucléotides aux extrémités de certaines chaînes d'ARN. Pour tous les ARNt, une séquence CCA est ajoutée à l'extrémité 3'. Il est important de noter que cette séquence CCA n'est pas codée par l'ADN [45](#page=45). > **Tip:** L'addition de la séquence CCA à l'extrémité 3' des ARNt est un processus crucial qui assure la fonctionnalité de l'ARNt, notamment son chargement avec un acide aminé par l'aminoacyl-ARNt synthétase [45](#page=45). #### 5.1.2 Modifications chimiques des ARNr et ARNt Des modifications enzymatiques sont également apportées aux ribonucléotides des ARNr. Ces modifications peuvent inclure la méthylation ou la pseudouridylation, qui sont importantes pour la structure et la fonction des ARNr au sein des ribosomes [45](#page=45). Dans les précurseurs des ARNt, on rencontre des bases inhabituelles. Ces bases modifiées, telles que la dihydro-uridine (D) ou la pseudouridine ($\Psi$), sont formées par des modifications enzymatiques après la transcription initiale. Elles jouent un rôle dans la stabilité de la structure secondaire et tertiaire de l'ARNt et dans la reconnaissance des codons lors de la traduction [45](#page=45). > **Example:** Les modifications de bases dans les ARNt, comme la conversion d'un uracile en pseudouracile, peuvent altérer la capacité de l'ARNt à s'apparier avec l'ARNm, influençant ainsi la précision de la traduction [45](#page=45). Les trois principaux types d'ARN ribosomiques chez les procaryotes, en particulier chez *E. coli*, sont les ARNr 23S, 16S et 5S. Ces ARNr sont des composants majeurs des ribosomes bactériens et sont essentiels à la synthèse des protéines [45](#page=45). Les étapes de formation de ces ARNt et ARNr, bien que synthétisés par l'ARN polymérase, nécessitent une série de traitements post-transcriptionnels pour devenir fonctionnels [45](#page=45). --- ## Erreurs courantes à éviter - Révisez tous les sujets en profondeur avant les examens - Portez attention aux formules et définitions clés - Pratiquez avec les exemples fournis dans chaque section - Ne mémorisez pas sans comprendre les concepts sous-jacents

| Term | Definition | |------|------------| | Transcription | Processus biologique par lequel l'information génétique contenue dans l'ADN est copiée sous forme d'une molécule d'ARN. Cet ARN peut ensuite être utilisé pour synthétiser des protéines ou avoir une fonction propre. | | ARN polymérase | Enzyme responsable de la synthèse d'une molécule d'ARN à partir d'un brin d'ADN comme modèle. Elle catalyse la formation des liaisons phosphodiester entre les nucléotides de l'ARN. | | Promoteur | Séquence spécifique d'ADN située en amont d'un gène, qui sert de site de liaison pour l'ARN polymérase et initie la transcription. | | Facteur sigma | Sous-unité de l'ARN polymérase chez les bactéries qui reconnaît les séquences promotrices et aide l'enzyme à se lier spécifiquement au début d'un gène. | | Holoenzyme | Complexe enzymatique formé de l'ARN polymérase et d'un facteur sigma, qui est l'espèce active capable d'initier la transcription. | | Initiation de la transcription | Première étape de la transcription, durant laquelle l'ARN polymérase se lie au promoteur et déroule l'ADN pour former une bulle de transcription. | | Élongation de la transcription | Phase de la transcription où l'ARN polymérase se déplace le long du brin d'ADN matrice, synthétisant l'ARN en ajoutant des nucléotides complémentaires. | | Terminaison de la transcription | Dernière étape de la transcription, marquant la fin de la synthèse de l'ARN et la dissociation de l'ARN polymérase de l'ADN. | | Opéron | Ensemble de gènes chez les procaryotes qui sont transcrits ensemble à partir d'un seul promoteur, et qui sont souvent régulés de manière coordonnée. | | Lactose | Disaccharide composé de glucose et de galactose, qui sert de substrat énergétique pour certaines bactéries et de molécule inductrice pour l'expression de gènes spécifiques. | | Inducteur | Molécule qui déclenche l'expression d'un gène ou d'un opéron en se liant à un répresseur ou à un autre facteur régulateur, modifiant ainsi son activité. | | ARN monocistronique | Molécule d'ARN messager (ARNm) qui contient les informations génétiques pour la synthèse d'une seule protéine. | | ARN polycistronique | Molécule d'ARN messager (ARNm) qui contient les informations génétiques pour la synthèse de plusieurs protéines différentes, typique des procaryotes. | | ARNt (ARN de transfert) | Molécule d'ARN qui transporte des acides aminés spécifiques vers le ribosome pour leur incorporation dans une chaîne polypeptidique en cours de synthèse. | | ARNr (ARN ribosomique) | Composant majeur des ribosomes, l'ARN ribosomique est impliqué dans la catalyse de la liaison peptidique lors de la synthèse des protéines. | | Nucléotide | Unité monomère des acides nucléiques (ADN et ARN), composée d'un groupement phosphate, d'un sucre (désoxyribose dans l'ADN, ribose dans l'ARN) et d'une base azotée. |

# Introduction aux techniques d'analyse de l'ADN L'analyse de l'ADN englobe diverses méthodes de laboratoire destinées à isoler, quantifier, amplifier, séquencer et visualiser le matériel génétique, avec des applications médicales cruciales. Le choix d'une technique est dicté par la question clinique spécifique et la qualité de l'échantillon biologique prélevé. Ce parcours débutera par le prélèvement et l'extraction de l'ADN, suivis par le contrôle de qualité (quantité et intégrité), puis l'amplification via PCR et ses variations (qPCR, RT-PCR, digital PCR), pour aboutir au séquençage, du méthode Sanger aux technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS). À chaque phase, les principes sous-jacents, les indications, les avantages, les limitations, ainsi que des exemples cliniques concrets seront abordés, en incluant les principes éthiques tels que le consentement et la confidentialité [5](#page=5) [6](#page=6). ### 1.1 Applications médicales En médecine, les techniques d'analyse de l'ADN jouent un rôle fondamental dans : * **La confirmation diagnostique**: notamment pour les maladies d'origine héréditaire ou les infections [5](#page=5). * **L'orientation thérapeutique**: ceci inclut la pharmacogénétique, qui personnalise les traitements en fonction du profil génétique du patient, et l'oncologie pour des thérapies ciblées [5](#page=5). * **Le suivi de l'évolution d'une maladie**: des exemples incluent le suivi de la charge virale dans les infections ou la détection de la maladie résiduelle après un traitement oncologique [5](#page=5). * **L'établissement d'une identité biologique**: par exemple, grâce à l'analyse des Short Tandem Repeats (STR) [5](#page=5). ### 1.2 Parcours typique d'un échantillon Le processus d'analyse de l'ADN suit généralement une séquence d'étapes méthodologiques : * **Prélèvement et extraction de l'ADN**: La première étape consiste à obtenir un échantillon biologique et à en extraire le matériel génétique [6](#page=6). * **Contrôle de qualité**: Une fois extrait, l'ADN doit être quantifié et son intégrité évaluée pour s'assurer de sa fiabilité pour les analyses ultérieures [6](#page=6). * **Amplification de l'ADN**: Des techniques comme la PCR (Polymerase Chain Reaction) et ses variantes (qPCR, RT-PCR, digital PCR) sont utilisées pour générer de nombreuses copies d'une région d'intérêt de l'ADN, facilitant ainsi son analyse [6](#page=6). * **Séquençage**: Cette étape permet de déterminer l'ordre précis des nucléotides dans une molécule d'ADN. Historiquement, la méthode Sanger était utilisée, mais elle est aujourd'hui largement complétée, voire remplacée, par les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) [6](#page=6). > **Tip:** La qualité de l'échantillon et le choix judicieux de la méthode sont des facteurs déterminants pour la réussite d'une analyse d'ADN à visée clinique [6](#page=6). > **Tip:** La compréhension des forces et des limites de chaque technique est essentielle pour interpréter correctement les résultats et les appliquer en contexte clinique [6](#page=6). --- # Extraction et purification des acides nucléiques L'extraction et la purification des acides nucléiques visent à isoler l'ADN ou l'ARN à partir de diverses sources biologiques pour des analyses ultérieures [9](#page=9). ### 2.1 Sources biologiques L'ADN et l'ARN peuvent être extraits d'une grande variété d'échantillons biologiques. Le choix de la source dépend de l'objectif de l'analyse [10](#page=10) [11](#page=11). * **Sang périphérique:** Permet d'obtenir de l'ADN génomique à partir des leucocytes et de l'ARN (ARNm, microARN) pour des études d'expression [10](#page=10). * **Salive / frottis buccaux:** Méthode non invasive, utile pour la génétique de population et les tests de paternité [10](#page=10). * **Tissus frais:** Incluent les biopsies tumorales et les organes [10](#page=10). * **Tissus fixés (FFPE – Formalin-Fixed Paraffin-Embedded):** L'ADN extrait de ces tissus est souvent fragmenté mais reste exploitable, notamment en oncologie [11](#page=11). * **Liquides biologiques:** L'urine, le liquide amniotique et le liquide céphalo-rachidien (LCR) peuvent être utilisés pour extraire, par exemple, de l'ADN tumoral circulant (cfDNA) [11](#page=11). * **Cellules cultivées:** Lignées cellulaires et fibroblastes [11](#page=11). > **Tip:** Pour un diagnostic prénatal, on privilégiera le liquide amniotique, tandis que pour l'analyse d'un cancer, une biopsie tumorale et l'ADN circulant libre (cfDNA) seront préférés [11](#page=11). ### 2.2 Principe général de l'extraction des acides nucléiques Le processus d'extraction suit généralement cinq étapes clés: Lyser → Protéger → Séparer → Laver → Éluer [13](#page=13) [14](#page=14) [15](#page=15) [16](#page=16). #### 2.2.1 Lyse Cette étape consiste à ouvrir les cellules pour libérer l'ADN ou l'ARN. Les outils utilisés incluent des détergents (comme le Sodium Dodecyl Sulfate ou le Triton X-100), le choc osmotique, des méthodes mécaniques (broyage) ou la chaleur [13](#page=13). #### 2.2.2 Protection de l'acide nucléique Il est crucial d'empêcher la dégradation des acides nucléiques par les nucléases. Pour cela, on utilise des sels chaotropes (tels que le thiocyanate de guanidinium), l'EDTA (qui chélate les ions magnésium nécessaires aux nucléases), des antioxydants comme le $\beta$-mercaptoéthanol, et le maintien de températures froides [13](#page=13). #### 2.2.3 Déprotéinisation / élimination des débris L'objectif est de séparer l'ADN/ARN des protéines, lipides, polysaccharides et autres inhibiteurs. Différentes stratégies existent [14](#page=14): * **Précipitation des protéines:** Utilisation de sels ou d'alcool [14](#page=14). * **Phase organique:** L'utilisation de phénol-chloroforme permet de séparer les protéines (qui se retrouvent dans la phase organique) des acides nucléiques (qui restent dans la phase aqueuse) [14](#page=14). * **Fixation sélective:** Les acides nucléiques sont fixés sur un support (silice ou billes magnétiques) tandis que les impuretés restent en solution [14](#page=14). #### 2.2.4 Lavage Cette étape vise à éliminer les impuretés résiduelles (protéines, sels, inhibiteurs de PCR) sans détacher l'acide nucléique. Des tampons alcoolisés (contenant de l'éthanol ou de l'isopropanol et du sel) sont couramment employés [15](#page=15). #### 2.2.5 Élution L'élution permet de récupérer l'ADN/ARN purifié en le détachant du support ou en re-solubilisant le culot obtenu après précipitation. Pour ce faire, on utilise de l'eau sans nucléases (nuclease-free) ou un tampon faiblement salin/à pH bas (par exemple, Tris/EDTA léger). Le résultat est un acide nucléique prêt pour diverses applications telles que la PCR, la qPCR, la RT-PCR, le séquençage Sanger ou le séquençage nouvelle génération (NGS) [16](#page=16). ### 2.3 Méthodes d'extraction Plusieurs méthodes permettent d'extraire les acides nucléiques, chacune ayant ses avantages et inconvénients [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19) [20](#page=20) [21](#page=21) [22](#page=22). #### 2.3.1 Méthode phénol-chloroforme Historiquement, cette méthode repose sur la séparation de phases en utilisant des solvants organiques. Les acides nucléiques hydrophiles se retrouvent dans la phase aqueuse, tandis que les protéines et lipides sont extraits dans la phase organique (phénol-chloroforme) [17](#page=17) [18](#page=18). * **Avantages:** Permet d'obtenir de l'ADN de haute pureté et a longtemps servi de méthode de référence [18](#page=18). * **Inconvénients:** Manipulation toxique (phénol corrosif, chloroforme cancérigène), longue et difficile à automatiser. Son utilisation est aujourd'hui limitée à la recherche, moins fréquente en diagnostic clinique [18](#page=18). #### 2.3.2 Colonnes de silice (kits commerciaux) Cette méthode, souvent commercialisée sous forme de kits, est basée sur la fixation des acides nucléiques sur une matrice de silice [19](#page=19) [20](#page=20). * **Principe:** L'ADN/ARN se lie à la silice en présence de sels chaotropiques (thiocyanate de guanidinium). Des lavages successifs éliminent les impuretés, suivis d'une élution finale avec de l'eau ou un tampon à faible teneur en sel [20](#page=20). * **Avantages:** Méthode rapide, simple, reproductible et fournissant une haute pureté adaptée à la PCR, qPCR et NGS [20](#page=20). * **Inconvénients:** Coût plus élevé et rendement parfois limité par rapport à la méthode phénol-chloroforme [20](#page=20). #### 2.3.3 Extraction magnétique / automatisée Cette technique utilise des billes magnétiques fonctionnalisées pour capturer l'ADN/ARN [21](#page=21) [22](#page=22). * **Principe:** Les billes magnétiques, recouvertes de groupements chimiques spécifiques, fixent l'ADN/ARN. La séparation s'effectue grâce à un aimant, suivie de lavages et d'une élution. Cette méthode se prête particulièrement bien à l'automatisation et est couramment utilisée dans les plateformes à haut débit, comme pour le dépistage viral (par exemple, COVID-19) [21](#page=21). * **Avantages:** Grande reproductibilité, haut débit, et adaptation aux diagnostics de routine [21](#page=21). * **Inconvénients:** Coût de l'équipement et des réactifs [21](#page=21). ### 2.4 Contrôle de la qualité de l'extraction Une extraction réussie doit produire un acide nucléique pur, intact et en quantité suffisante. Deux aspects principaux sont évalués: la quantification et l'intégrité [23](#page=23) [29](#page=29). #### 2.4.1 Quantification des acides nucléiques (AN) La quantification permet de déterminer la quantité d'ADN ou d'ARN isolée [23](#page=23) [25](#page=25) [28](#page=28). * **Spectrophotométrie (Nanodrop) :** * **Principe:** Mesure de l'absorbance de la lumière UV à 260 nm, où les bases azotées des acides nucléiques absorbent fortement [23](#page=23) [25](#page=25). * **Concentration :** * ADN double brin: 1 unité d'absorbance (A260) correspond à 50 $\mu$g/mL [25](#page=25). * ARN simple brin: 1 unité d'absorbance (A260) correspond à 40 $\mu$g/mL [25](#page=25). * ADN simple brin: 1 unité d'absorbance (A260) correspond à 33 $\mu$g/mL [25](#page=25). La concentration est calculée par la formule: `Concentration des acides nucléiques (µg/mL) = A260 \times facteur de conversion` [26](#page=26). * **Pureté :** * **Ratio A260/280:** Un rapport d'environ 1,8 pour l'ADN et 2,0 pour l'ARN indique une bonne pureté. Des valeurs basses suggèrent une contamination protéique [23](#page=23) [27](#page=27). * **Ratio A260/230:** Un rapport d'au moins 2 est souhaitable. Des valeurs plus basses indiquent une contamination par des sels ou des solvants [23](#page=23) [27](#page=27). * **Limites:** La spectrophotométrie est peu sensible pour de faibles concentrations (< 10 ng/$\mu$L) et ne détecte pas la dégradation de l'acide nucléique [27](#page=27). * **Fluorimétrie (Qubit, PicoGreen) :** * **Principe:** Utilise des colorants fluorescents spécifiques qui se lient à l'ADN ou à l'ARN [23](#page=23) [28](#page=28). * **Avantages:** Plus sensible que la spectrophotométrie (quantification en ng/$\mu$L), et permet une distinction spécifique entre ADN simple brin, double brin et ARN [23](#page=23) [28](#page=28). * **Utilisation:** Préférée pour les petits échantillons ou lorsque l'ADN est faiblement concentré et essentielle avant des applications sensibles comme la PCR, qPCR ou NGS [23](#page=23) [28](#page=28). #### 2.4.2 Contrôle de l'intégrité des acides nucléiques L'intégrité évalue l'état de dégradation de l'acide nucléique [29](#page=29). * **Électrophorèse sur gel d'agarose :** * **Principe:** Migration des acides nucléiques dans une matrice de gel en fonction de leur taille sous l'effet d'un champ électrique. Des agents intercalants fluorescents (bromure d'éthidium, SYBR Safe) sont utilisés pour visualiser les bandes sous UV [32](#page=32). * **ADN génomique:** Un ADN intact apparaît comme une bande unique et nette en haut du gel. Un ADN fragmenté se manifeste par un aspect diffus en "smear" [29](#page=29) [31](#page=31). * **ARN:** L'ARN intact présente les bandes ribosomales 28S et 18S. Un ratio 28S/18S d'environ 2 indique un ARN intact [29](#page=29) [30](#page=30). * **Applications:** Permet de vérifier l'intégrité, d'estimer la taille des fragments en comparaison avec un marqueur de poids moléculaire, et de suivre des réactions comme la PCR ou des digestions enzymatiques [32](#page=32). * **Appareils automatiques (Bioanalyzer, TapeStation):** Ces instruments fournissent un index de qualité, notamment le RIN (RNA Integrity Number) pour l'ARN, qui varie de 1 à 10 [29](#page=29). * **Gel de polyacrylamide (PAGE):** Offre une meilleure résolution pour séparer de très petits fragments (1 à 100 pb). Il est utilisé pour la détection de SNPs, de mutations ponctuelles, historiquement pour le séquençage Sanger, et pour l'analyse d'ARN de petite taille (miARN, siARN). Sa manipulation est plus complexe et l'acrylamide est toxique avant polymérisation [35](#page=35). --- # Techniques de détection et d'amplification par PCR La Polymerase Chain Reaction (PCR) est une technique fondamentale en biologie moléculaire permettant l'amplification exponentielle d'un fragment d'ADN spécifique in vitro [38](#page=38). ### 3.1 Principe de la PCR classique La PCR, développée par Kary Mullis en 1985, repose sur l'amplification in vitro d'un fragment d'ADN cible. Elle nécessite plusieurs composants essentiels [38](#page=38): * **ADN matrice (template)**: l'ADN contenant la séquence à amplifier [38](#page=38). * **Amorces spécifiques (primers)**: courtes séquences d'ADN qui délimitent la région à amplifier en se liant spécifiquement à l'ADN matrice [38](#page=38). * **ADN polymérase thermostable**: une enzyme, souvent la Taq polymérase, capable de synthétiser de nouveaux brins d'ADN et de résister aux hautes températures du cycle de dénaturation [38](#page=38). * **dNTPs (désoxynucléotides)**: les briques de construction (A, T, C, G) nécessaires à la synthèse des nouveaux brins d'ADN [38](#page=38). * **Tampon + ions Mg²⁺**: un milieu réactionnel fournissant les conditions optimales pour l'activité enzymatique et la stabilisation de l'ADN, avec les ions magnésium comme cofacteurs [38](#page=38). Le processus de PCR se déroule en cycles répétés, généralement entre 30 et 40, chacun comprenant trois étapes principales [39](#page=39): 1. **Dénaturation** (94–95 °C): L'ADN double brin est chauffé pour séparer les deux brins complémentaires [39](#page=39). 2. **Hybridation (annealing)** (50–65 °C): La température est abaissée pour permettre aux amorces de s'hybrider aux séquences d'ADN matrice complémentaires [39](#page=39). 3. **Élongation (extension)** (72 °C): La Taq polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN à partir de chaque brin matrice, en utilisant les dNTPs [39](#page=39). Chaque cycle double la quantité de produit d'amplification, conduisant à une amplification exponentielle du fragment d'ADN cible [39](#page=39). > **Tip:** La thermostabilité de la Taq polymérase est cruciale pour permettre la répétition des cycles de chauffage sans dégradation de l'enzyme [38](#page=38). ### 3.2 Applications principales de la PCR La PCR trouve de nombreuses applications dans divers domaines [42-46](#page=42,#page=43,#page=44,#page=45,#page=46). #### 3.2.1 Diagnostic des maladies infectieuses La PCR permet d'amplifier des séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques de pathogènes. Elle offre une sensibilité très élevée, permettant la détection même d'une seule copie de l'agent infectieux. Des exemples incluent la détection du VIH, des hépatites B/C et du SARS-CoV-2 (souvent via RT-PCR) [42](#page=42). #### 3.2.2 Détection des maladies génétiques Cette application consiste à amplifier et analyser des régions génomiques suspectées d'être impliquées dans des maladies héréditaires. Les exemples comprennent la mucoviscidose, caractérisée par la mutation ΔF508 dans le gène CFTR, et la drépanocytose, due à la mutation Glu6Val dans le gène HBB [43](#page=43). #### 3.2.3 Oncogénétique et cancérologie La PCR est utilisée pour rechercher des mutations somatiques dans les gènes associés à la prédisposition ou à la progression des tumeurs. Des mutations dans les gènes BRCA1/2 sont recherchées dans les cancers du sein et de l'ovaire, tandis que les mutations des gènes KRAS, NRAS et EGFR sont étudiées dans les cancers colorectaux et pulmonaires [44](#page=44). #### 3.2.4 Identification médico-légale (forensic) Cette technique amplifie des séquences microsatellites (STR), hautement variables entre individus, pour leur identification unique. Elle est utilisée en criminalistique et pour les tests de paternité [45](#page=45). #### 3.2.5 Recherche biomédicale La PCR est un outil essentiel pour étudier l'expression des gènes (via RT-PCR et qPCR), analyser des mutations somatiques dans les cancers, et mener des recherches en biologie moléculaire, génomique et transcriptomique [46](#page=46). ### 3.3 Variantes de la PCR Plusieurs variantes de la PCR ont été développées pour répondre à des besoins spécifiques [47-57](#page=47,#page=48,#page=49,#page=50,#page=53,#page=55,#page=57). #### 3.3.1 RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) La RT-PCR est utilisée pour analyser l'ARN, car la PCR ne fonctionne que sur l'ADN. Une étape préalable de transcription inverse utilise une enzyme (transcriptase inverse) pour convertir l'ARN en ADN complémentaire (ADNc). Cette méthode est couramment employée pour détecter des ARN viraux, tels que ceux du VIH ou du SARS-CoV-2 [47](#page=47). #### 3.3.2 qPCR (PCR quantitative, en temps réel) La qPCR permet la détection et la quantification du produit d'amplification en temps réel grâce à l'émission d'un signal fluorescent. Deux approches principales existent [48](#page=48): * **SYBR Green**: Ce colorant fluorescent s'intercale de manière non spécifique dans l'ADN double brin, émettant de la fluorescence à mesure que la quantité d'ADN double brin augmente [48](#page=48) [49](#page=49). * **Sondes TaqMan**: Ces sondes, spécifiques à la séquence cible, portent un fluorophore et un quencher. Lors de l'élongation, la sonde est clivée, séparant le fluorophore du quencher et entraînant une émission de fluorescence [48](#page=48) [50](#page=50). La qPCR est utilisée pour quantifier la charge virale et l'expression génique [48](#page=48). > **Tip:** Bien que SYBR Green soit plus simple et moins coûteux, les sondes TaqMan offrent une spécificité accrue et sont préférables pour des analyses plus précises ou des cibles multiples [48](#page=48). #### 3.3.3 PCR multiplex La PCR multiplex permet l'amplification simultanée de plusieurs cibles d'ADN différentes au sein d'un même tube réactionnel, en utilisant plusieurs paires d'amorces. Un exemple d'application est le dépistage combiné de plusieurs pathogènes [53](#page=53). #### 3.3.4 Digital PCR (dPCR) La dPCR fractionne l'échantillon d'ADN en des milliers, voire des millions, de micro-réactions indépendantes. Cela permet une détection et une quantification absolues du nombre de copies d'ADN sans nécessiter de courbes standard externes. Cette technique est particulièrement sensible et utile pour détecter des ADN tumoraux circulants, des maladies rares, ou des infections à faible charge [55](#page=55). ##### 3.3.4.1 Applications médicales de la dPCR La dPCR a des applications médicales significatives, notamment en oncologie pour la détection de mutations somatiques rares (comme EGFR, KRAS). Elle est également employée pour le suivi des cancers par la quantification de l'ADN tumoral circulant (ctDNA). Dans le domaine des maladies infectieuses, elle permet une mesure ultra-sensible de la charge virale pour le VIH et les hépatites. De plus, elle trouve des applications dans le suivi des transplantations, comme la détection de rejets via l'ADN circulant du donneur [57](#page=57). --- # Techniques de séquençage d'ADN Le séquençage d'ADN est une méthode fondamentale en biologie moléculaire visant à déterminer l'ordre des nucléotides A, C, G et T dans une molécule d'ADN, offrant une résolution élevée pour identifier les mutations ponctuelles et renseignant sur la structure, la fonction et les altérations d'un gène. L'automatisation a fait du séquençage la technique de référence pour l'exploration des séquences nucléotidiques [59](#page=59) [60](#page=60). ### 4.1 Séquençage de Sanger (1ère génération) #### 4.1.1 Principe Développé par Frederick Sanger en 1977, le séquençage de Sanger repose sur l'utilisation de didésoxynucléotides (ddNTPs). L'incorporation d'un ddNTP, dépourvu de groupement 3'-OH, bloque l'élongation de la chaîne d'ADN lors de la synthèse. En utilisant un mélange de dNTPs normaux et de ddNTPs marqués par fluorescence, on obtient des fragments d'ADN de tailles diverses, chacun se terminant par un ddNTP spécifique et coloré. Ces fragments sont ensuite séparés par électrophorèse capillaire pour permettre la lecture de la séquence nucléotidique [61](#page=61). > **Tip:** Le groupement hydroxyle en position 3' des dNTPs est essentiel pour la formation de la liaison phosphodiester lors de la synthèse d'ADN. L'absence de ce groupement sur les ddNTPs entraîne une terminaison de chaîne [61](#page=61). #### 4.1.2 Applications Le séquençage de Sanger est particulièrement utile pour : * La confirmation ciblée de mutations préalablement identifiées par PCR ou NGS [63](#page=63). * L'analyse de petits gènes ou exons, tels que BRCA1/2 ou HBB [63](#page=63). * Le séquençage de plasmides [63](#page=63). #### 4.1.3 Limites Les principales limitations du séquençage de Sanger incluent : * Une lecture limitée, généralement d'environ 800 à 1000 paires de bases (pb) par réaction [63](#page=63). * Un coût élevé pour le séquençage de génomes entiers [63](#page=63). * Il a été largement supplanté par le NGS pour les applications à haut débit [63](#page=63). ### 4.2 Séquençage de nouvelle génération (NGS) Le séquençage de nouvelle génération (NGS), apparu dans les années 2000, représente une avancée technologique majeure ayant révolutionné la biologie moléculaire et la médecine. Il permet de séquencer des génomes entiers, des exomes ou des panels de gènes avec une rapidité et une efficacité sans précédent, offrant un débit supérieur à un coût réduit par rapport aux méthodes traditionnelles. Le NGS a rendu les analyses génomiques accessibles pour une vaste gamme de maladies génétiques et chroniques [67](#page=67) [68](#page=68). #### 4.2.1 Impacts et applications du NGS Le NGS a une portée considérable dans la compréhension des maladies rares, qui touchent environ 5 % de la population mondiale. Il permet d'identifier les mutations causales, facilitant le diagnostic, le développement de thérapies personnalisées et la prise en charge prédictive avec un conseil génétique adapté [70](#page=70). Les domaines révolutionnés par le NGS incluent : * **Diagnostic des maladies génétiques et analyses moléculaires des pathologies chroniques**: Identification rapide des mutations responsables des maladies rares et mendéliennes [78](#page=78). * **Oncologie**: Détection de mutations spécifiques aux cancers pour des traitements personnalisés et ciblés [78](#page=78). * **Épigénétique**: Étude des modifications épigénétiques qui influencent l'expression génétique sans altérer la séquence d'ADN [79](#page=79). * **Transcriptomique**: Analyse approfondie des ARN pour explorer l'expression génétique et les réseaux de régulation [79](#page=79). * **Pharmacogénomique, Nutrigénomique, Génomique sportive** [79](#page=79). #### 4.2.2 Différentes générations de NGS ##### 4.2.2.1 NGS classique (Deuxième génération) Les technologies de deuxième génération, initiées vers 2005 (ex: technologie Illumina®), permettent un séquençage massif et parallèle, réduisant significativement le temps d'analyse de l'ADN. Leurs applications courantes comprennent le séquençage du génome entier (WGS), le séquençage de l'exome entier (WES), et le séquençage ciblé de panels de gènes [71](#page=71). ##### 4.2.2.2 Troisième génération Les technologies de troisième génération (ex: PacBio RS II / Sequel / Sequel II de Pacific Biosciences) permettent de séquencer directement l'ADN ou l'ARN natif, sans étape d'amplification, ce qui minimise les erreurs [75](#page=75). ##### 4.2.2.3 Quatrième génération La quatrième génération de séquençage (ex: Nanopore) propose des solutions portables et ultra-rapides, adaptées aux environnements cliniques ou de terrain [75](#page=75). #### 4.2.3 Défis et limitations du NGS Malgré ses nombreux avantages, le NGS présente certains défis : * **Complexité des données**: Le volume massif de données générées nécessite des outils bioinformatiques et d'intelligence artificielle performants pour l'analyse et l'interprétation [80](#page=80). * **Coût et accessibilité**: Bien que les coûts de séquençage aient diminué, l'interprétation bioinformatique, l'analyse et le stockage des données génomiques demeurent onéreux [80](#page=80). * **Sensibilité et spécificité**: Les erreurs systématiques et aléatoires peuvent affecter la fiabilité des résultats [81](#page=81). * **Aspects éthiques et juridiques**: La découverte de mutations incidentes soulève des questions complexes concernant la confidentialité, le consentement éclairé et l'information des patients [81](#page=81). --- ## Erreurs courantes à éviter - Révisez tous les sujets en profondeur avant les examens - Portez attention aux formules et définitions clés - Pratiquez avec les exemples fournis dans chaque section - Ne mémorisez pas sans comprendre les concepts sous-jacents

| Term | Definition | |------|------------| | ADN | Acide désoxyribonucléique, molécule porteuse de l'information génétique. Il est composé d'une chaîne double hélice de nucléotides. | | ARN | Acide ribonucléique, molécule impliquée dans la synthèse des protéines et la régulation de l'expression génique. Il existe sous différentes formes (ARNm, ARNt, ARNr). | | Lyse cellulaire | Processus d'ouverture des cellules pour libérer leur contenu, notamment l'ADN ou l'ARN, en utilisant des agents chimiques ou physiques. | | Nucléases | Enzymes capables de dégrader les acides nucléiques (ADN ou ARN) en fragments plus petits. Elles doivent être inactivées pendant l'extraction. | | Phénol-chloroforme | Mélange de solvants organiques utilisé historiquement pour séparer les acides nucléiques des protéines et des lipides lors de l'extraction. | | Colonne de silice | Support solide sur lequel les acides nucléiques se fixent en présence de sels chaotropiques, permettant leur purification lors des étapes de lavage et d'élution. | | Billes magnétiques | Particules recouvertes de groupes chimiques permettant de capturer les acides nucléiques, utilisées dans des systèmes d'extraction automatisée grâce à des champs magnétiques. | | Spectrophotométrie | Technique de mesure de l'absorption de la lumière par une substance. Dans l'analyse de l'ADN, elle est utilisée pour quantifier la concentration (absorbance à 260 nm) et évaluer la pureté (ratios A260/280 et A260/230). | | Fluorimétrie | Technique qui mesure la fluorescence émise par des colorants spécifiques se liant aux acides nucléiques, permettant une quantification plus sensible et spécifique. | | Électrophorèse sur gel | Technique de séparation de molécules chargées (comme l'ADN ou l'ARN) en fonction de leur taille et de leur charge, lorsqu'elles migrent dans un gel sous l'effet d'un champ électrique. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Réaction en chaîne par polymérase, technique d'amplification exponentielle in vitro d'un fragment d'ADN spécifique, utilisant une ADN polymérase thermostable. | | Amorces (Primers) | Courtes séquences d'ADN synthétiques qui s'hybrident à des régions spécifiques de l'ADN matrice, servant de point de départ pour la synthèse de nouveaux brins d'ADN par la polymérase. | | Taq polymérase | ADN polymérase thermostable isolée de la bactérie *Thermus aquaticus*, capable de résister aux températures élevées des cycles de dénaturation de la PCR. | | RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) | PCR utilisant une transcriptase inverse pour convertir l'ARN en ADN complémentaire (ADNc), permettant ainsi d'analyser des échantillons d'ARN. | | qPCR (Quantitative PCR) | PCR quantitative, aussi appelée PCR en temps réel, qui permet de suivre l'amplification de l'ADN en temps réel grâce à un signal fluorescent, offrant une quantification du matériel génétique. | | Séquençage de Sanger | Méthode de séquençage d'ADN de première génération, basée sur l'incorporation de didésoxynucléotides terminant la chaîne, suivie d'une séparation par électrophorèse. | | NGS (Next-Generation Sequencing) | Séquençage de nouvelle génération, ensemble de technologies permettant le séquençage massif et parallèle de millions de fragments d'ADN simultanément, offrant un haut débit et des coûts réduits par rapport au séquençage de Sanger. | | Fragments d'ADN | Morceaux d'ADN de tailles variables, obtenus par découpage enzymatique ou fragmentation naturelle. | | Mutation ponctuelle | Modification d'une seule paire de bases dans la séquence d'ADN. | | Génome | Ensemble complet du matériel génétique d'un organisme, incluant tous ses gènes. | | Exome | Ensemble de toutes les régions codantes de l'ADN d'un génome (les exons). | | STR (Short Tandem Repeats) | Courtes séquences répétées en tandem dans le génome, dont le nombre de répétitions varie d'un individu à l'autre, utilisées en identification médico-légale. | | Charge virale | Mesure de la quantité de virus présente dans un échantillon biologique, souvent quantifiée par qPCR ou dPCR. | | ADN tumoral circulant (ctDNA) | Fragments d'ADN libérés par les cellules tumorales dans la circulation sanguine, utiles pour le diagnostic et le suivi des cancers. |

# De structuur en samenstelling van DNA Hier is een gedetailleerde studiehandleiding over de structuur en samenstelling van DNA, opgesteld volgens de gevraagde specificaties. ## 1. De structuur en samenstelling van dna Dit onderwerp verkent de fundamentele chemische opbouw van DNA, inclusief de componenten van nucleotiden, de karakteristieke dubbele helixstructuur, de principes van basenparing, en de verschillende conformationele varianten van DNA, naast de rol van eiwitten bij DNA-compactering. ### 1.1 Chemische samenstelling van het genetisch materiaal Het genetisch materiaal van organismen is primair DNA. DNA, of desoxyribonucleïnezuur, is een polymeer opgebouwd uit nucleotiden. #### 1.1.1 Nucleotiden: de bouwstenen van DNA Een nucleotiden bestaat uit drie componenten: * **Een stikstofbase:** Dit kan een purine (Adenine - A, Guanine - G) of een pyrimidine (Cytosine - C, Thymine - T) zijn. * **Een suikermolecuul:** In DNA is dit 2'-deoxyribose, een vijf-koolstof suiker. * **Een fosfaatgroep:** Deze is gebonden aan de 5'-hydroxylgroep van de deoxyribose. De binding tussen de suiker en de stikstofbase (via de N1 van pyrimidines of N9 van purines) wordt een glycosidebinding genoemd. #### 1.1.2 Basensamenstelling van DNA: de regels van Chargaff De regels van Chargaff stellen dat in dubbelstrengs DNA, het percentage Adenine (A) altijd gelijk is aan het percentage Thymine (T), en het percentage Guanine (G) altijd gelijk is aan het percentage Cytosine (C). * $\%A = \%T$ * $\%G = \%C$ Dit suggereert een complementaire relatie tussen de basen. ### 1.2 DNA structuur De structuur van DNA is die van een dubbele helix. #### 1.2.1 De dubbele-helix structuur De dubbele helix van DNA, zoals ontdekt door Rosalind Franklin en verder uitgewerkt door Watson en Crick, kenmerkt zich door: * **Twee antiparallele complementaire strengen:** De twee DNA-strengen lopen in tegenovergestelde richtingen (5' naar 3' en 3' naar 5'). * **Rechtsdraaiende dubbele helix:** De structuur draait met de klok mee. * **Helixparameter:** Elke winding van de helix bevat ongeveer 10,5 nucleotidenparen, en de afstand tussen opeenvolgende nucleotidenparen is ongeveer $0,34$ nanometer. De ruggengraat van elke streng wordt gevormd door afwisselende fosfaatgroepen en 2'-deoxyribose suikermoleculen. De stikstofbasen wijzen naar binnen en vormen paren tussen de twee strengen. #### 1.2.2 Basenparing Complementaire basenparing vindt plaats via waterstofbruggen: * Adenine (A) paart altijd met Thymine (T) via twee waterstofbruggen. * Guanine (G) paart altijd met Cytosine (C) via drie waterstofbruggen. Een purinebase (A of G) paart altijd met een pyrimidinebase (T of C). Deze A-T en G-C paren vormen de 'sporten' van de DNA-ladder. #### 1.2.3 Structuurkenmerken en stabiliteit * **Planair vlak:** Basenparen liggen in een planair vlak, licht gekanteld ten opzichte van de helicale as. * **Base stacking:** De basen zijn gestapeld met een kleine draaiing en kanteling, wat leidt tot interacties (hydrofobe interacties en Van der Waals krachten) tussen naburige basen, die de dubbele helix stabiliseren. * **Groeven:** De ongelijke hoeken tussen de glycosidebindingen van een basenpaar leiden tot de vorming van een 'major' (brede) groef en een 'minor' (smalle) groef. Deze groeven zijn belangrijk voor eiwitbinding aan DNA. * **Drijvende krachten:** De vorming van de dubbele helix wordt gedreven door het hydrofobe effect (basen naar binnen, weg van water) en het maximaliseren van gunstige niet-covalente interacties zoals waterstofbruggen en Van der Waals interacties. #### 1.2.4 Eiwitbinding aan DNA zonder ontwrichting Eiwitten kunnen specifieke nucleotidensequenties herkennen en binden aan de DNA-dubbele helix zonder deze volledig te ontwrichten. Dit gebeurt via interacties in de major en minor groeven. #### 1.2.5 Structuurvarianten van DNA Naast de meest voorkomende B-DNA, bestaan er andere structurele varianten: * **B-DNA:** De meest voorkomende vorm in cellen; rechtsdraaiend, 10,5 basen per winding, met major en minor groeven. * **Z-DNA:** Linksdraaiend, met een zigzag-patroon in de suiker-fosfaat ruggengraat. Het is langer en dunner dan B-DNA en heeft 12 basen per winding. Tijdelijke omzetting van B-DNA naar Z-DNA kan genactivatie beïnvloeden, vaak bevorderd door GC-rijke sequenties (alternerende purines en pyrimidines). * **A-DNA:** Een rechtsdraaiende helix met 11 basen per winding. Het is korter en dikker dan B-DNA en komt voornamelijk voor in DNA-RNA en RNA-RNA dubbele helixen. #### 1.2.6 Denaturatie en renaturatie van DNA * **Denaturatie:** Door verhoging van de temperatuur of pH kunnen de twee DNA-strengen van elkaar scheiden. De temperatuur waarbij de helft van het dubbelstrengs DNA enkelstrengig wordt, wordt de smelt-temperatuur ($T_m$) genoemd. De $T_m$ wordt beïnvloed door het GC-gehalte (hoger GC-gehalte leidt tot hogere $T_m$ vanwege de drie waterstofbruggen) en de nabijheid van G en C nucleotiden (sterkere base stacking). * **Renaturatie (Hybridisatie):** Bij verlaging van de temperatuur kunnen enkelstrengs DNA-moleculen spontaan weer dubbelstrengs vormen. Dit principe wordt gebruikt in biotechnologie, bijvoorbeeld bij FISH (fluorescence in situ hybridization), waar een gemerkte 'snuffel' probe bindt aan complementaire DNA-sequenties. ### 1.3 Compactering van DNA DNA moet extreem compact verpakt worden om in de celkern te passen. #### 1.3.1 Supercoiling van DNA Circulaire DNA-moleculen (zoals bacteriële chromosomen en plasmiden) en lineair DNA in eukaryoten worden vaak 'supercoiled' (supergewonden). * **Positieve supercoiling:** Extra draaiing naar rechts veroorzaakt spanning. * **Negatieve supercoiling:** Ontwinding van de strengen veroorzaakt spanning. * In vivo is bacteriële en mitochondriaal DNA negatief supercoiled. Lineair humaan nucleair DNA wordt ook voornamelijk als negatieve supercoil opgeslagen. Supercoiling vindt plaats wanneer de DNA-strengen uit elkaar gaan, zoals tijdens transcriptie en replicatie. Enzymen zoals topoisomerasen verwijderen supercoils om de DNA-structuur te reguleren. #### 1.3.2 Compactering van bacterieel DNA Bacterieel DNA is dubbelstrengs en meestal circulair. Het ligt in een gebied genaamd de nucleoïde. Het chromosoom is negatief supercoiled en gevouwen in lussen, geassocieerd met eiwitten en RNA. Behandeling met RNAse leidt tot vrijstelling van de lussen, terwijl topoisomerase de supercoiling verwijdert. #### 1.3.3 Compactering van eukaryotisch DNA Het menselijk genoom is enorm; ongeveer 2 meter DNA in een celkern van slechts 5 micrometer. Dit wordt mogelijk gemaakt door de associatie van DNA met eiwitten, wat chromatine vormt. * **Chromatine:** DNA-eiwitcomplex. Gecondenseerd chromatine vormt chromosomen. * **Nucleosoom:** De basiseenheid van chromatine, bestaande uit ongeveer 146 basenparen DNA dat rond een octameer van histon-eiwitten (twee kopieën van H2A, H2B, H3 en H4) is gewikkeld. Histonen zijn kleine basische eiwitten met positieve ladingen, die sterk binden aan het negatief geladen DNA. * **Linker DNA:** Kortere stukken DNA (10-90 bp) tussen de nucleosomen. * **Histon H1:** Een linker histon dat helpt bij de verdere compactie van de nucleosomen tot de 30 nm chromatinevezel. #### 1.3.4 Hogere-orde structuur van chromatine De 30 nm chromatinevezel kan verder worden gecompacteerd: * **Pakkeringsgraad 7:** DNA rond histonen (nucleosoom). * **Pakkeringsgraad 42:** 30 nm chromatinevezel. * **Pakkeringsgraad 750:** Euchromatine (minder compacte vorm). * **Pakkeringsgraad ~20.000:** Volledig gecondenseerd chromosoom tijdens mitose, met een scaffold van eiwitten. #### 1.3.5 Euchromatine en heterochromatine * **Euchromatine:** Minder gecondenseerd, genetisch actief. * **Heterochromatine:** Sterk gecondenseerd. Kan **constitutief** (altijd gecondenseerd, bv. centromeren, telomeren) of **facultatief** (kan veranderen in compactheid) zijn. #### 1.3.6 Post-translationele modificaties van histonen en chromatine-remodellerende complexen De compactering van chromatine wordt gereguleerd door chemische modificaties van histonen ('histon-code'), voornamelijk op de staarten van de histonen: * **Acetylering:** Van lysines, vermindert de positieve lading van histonen, wat leidt tot een meer open chromatine structuur en genactivatie. Dit wordt gekatalyseerd door Histone Acetyltransferases (HATs). * **Deacetylering:** Verhoogt de positieve lading, wat leidt tot meer compact chromatine en geninactivatie. Gekatalyseerd door Histone Deacetylases (HDACs). * **Methylering:** Van lysines en arginines, kan zowel leiden tot activatie als repressie van genexpressie. Gekatalyseerd door Histone Methyltransferases (KMTs) en Histone Demethylases (KDMs). Deze modificaties kunnen direct de interactie tussen histonen en DNA beïnvloeden, of eiwitten rekruteren die de chromatine structuur verder aanpassen. Chromatine-remodelleer complexen kunnen nucleosomen verschuiven of verwijderen met behulp van ATP-hydrolyse. #### 1.3.7 Repetitief DNA in eukaryotisch DNA Een significant deel van het eukaryotische genoom bestaat uit repetitieve sequenties. * **Tandem repetitief DNA (ongeveer 15%):** * Regulier satelliet DNA (bv. in centromeren, telomeren). * 'Variable number of tandem repeats' (VNTRs): * Minisatelliet DNA (10-100 bp per repeat). * Microsatelliet DNA of Short Tandem Repeats (STRs) (1-10 bp per repeat). * **Verspreid repetitief DNA (ongeveer 44%):** Bestaat uit transposons. #### 1.3.8 Transposons (mobiele genetische elementen) Transposons zijn DNA-sequenties die hun positie in het genoom kunnen veranderen. * **Mechanismen:** * **Replicatieve transpositie ('copy & paste'):** Het transposon wordt gekopieerd en op een nieuwe plek ingevoegd. * **Conservatieve transpositie ('cut & paste'):** Het transposon wordt uitgeknipt en op een nieuwe plek ingevoegd. * **Intermediair:** * **DNA transposons:** Gebruiken een DNA-intermediair. Coderen voor een transposase. * **Retrotransposons:** Gebruiken een RNA-intermediair. Veelvoorkomend in eukaryoten. * **Autonomie:** * **Autonoom:** Coderen voor alle benodigde eiwitten (bv. LINEs). * **Niet-autonoom:** Coderen niet voor de benodigde eiwitten (bv. SINEs). Het humane genoom bestaat voor meer dan 60% uit repetitief DNA, waaronder veel retrotransposons zoals LINEs (bv. L1) en SINEs (bv. Alu-sequenties). #### 1.3.9 Mitochondriaal genoom Mitochondriën bevatten een klein, circulair, dubbelstrengs DNA-molecuul. Dit mitochondriale DNA bevat geen histonen en geen repetitief DNA, maar codeert voor een deel van de RNA's en eiwitten die in de mitochondriën nodig zijn. ### 1.4 De celkern De celkern is een membraanomsloten organel dat het DNA van eukaryote cellen bevat en organiseert. #### 1.4.1 Structurele organisatie van de celkern De celkern is omgeven door een dubbel membraan (kernmembraan) dat onderbroken wordt door kernporiën. De nucleaire periferie is geassocieerd met constitutief heterochromatine. #### 1.4.2 Kernporiën Kernporiën zijn complexe structuren die de uitwisseling van moleculen tussen de kern en het cytoplasma reguleren. * **Passief transport:** Voor kleine moleculen (tot ca. 30 kDa) via diffusie. * **Actief transport:** Voor grotere moleculen (eiwitten, RNA) via transportreceptoren (importines, exportines) en met energieverbruik, vaak afhankelijk van Ran-eiwitten en de Ran-GTP gradiënt over de kernenvelop. #### 1.4.3 Nucleaire matrix en nucleaire lamina * **Nucleaire matrix:** Een vezelig netwerk binnen de kern dat structurele ondersteuning biedt. * **Nucleaire lamina:** Een netwerk van lamine-eiwitten aan de binnenzijde van het kernmembraan, essentieel voor de vorm en stabiliteit van de kern. Defecten in lamine-eiwitten kunnen leiden tot aandoeningen zoals Hutchinson-Gilford progeria syndrome. #### 1.4.4 De nucleolus De nucleolus is een membraanloos subnucleair gebied dat fungeert als de 'fabriek' voor ribosomen. Het is betrokken bij rRNA-synthese en de assemblage van ribosomale subeenheden. --- # De rol van DNA in erfelijkheid en moleculaire biologie DNA fungeert als genetisch materiaal, wat wordt onderbouwd door historische experimenten en vormt de basis van het centrale dogma van de moleculaire biologie en de overdracht van informatie binnen en tussen generaties, met belangrijke implicaties voor de geneeskunde. ### 2.1 Het genetisch materiaal: bewijs en chemische samenstelling #### 2.1.1 Experimenteel bewijs voor DNA als genetisch materiaal * **Griffith's transformatie-experiment (1928):** Frederick Griffith ontdekte een 'transformerend agens' in bacteriën dat de eigenschappen van niet-virulente bacteriën kon overdragen op virulente bacteriën. Dit suggereerde dat genetische informatie overdraagbaar was. * **Avery, MacLeod en McCarty's experiment (1944):** Dit experiment toonde aan dat het transformerende agens DNA was, waarmee werd bewezen dat DNA het erfelijk materiaal van bacteriën is. * **Hershey-Chase experiment (1952):** Alfred Hershey en Martha Chase gebruikten bacteriofagen (virussen die bacteriën infecteren) om definitief aan te tonen dat DNA het genetisch materiaal is. Ze labelden de DNA-component van de faag met radioactief fosfor ($^{32}$P) en de eiwitcomponent met radioactief zwavel ($^{35}$S). Ze observeerden dat alleen het radioactief gelabelde DNA in de bacteriële cel werd geïnjecteerd en de infectie veroorzaakte, terwijl het radioactieve eiwit buiten bleef. > **Tip:** Hershey en Chase gebruikten $^{32}$P om DNA te labelen omdat DNA fosfaatgroepen bevat, maar eiwitten niet (in hoge mate). Ze gebruikten $^{35}$S om eiwitten te labelen omdat eiwitten zwavelhoudende aminozuren (zoals methionine en cysteïne) bevatten, maar DNA geen zwavel bevat. #### 2.1.2 Genetisch materiaal in verschillende organismen * **Prokaryoten en eukaryoten:** Het genoom bestaat uit DNA. * **Virussen:** Het genetisch materiaal kan DNA of RNA zijn. * RNA virussen: * Enkelstrengig RNA (ssRNA): (+) ssRNA virussen (bv. tabaksmozaïekvirus, SARS-CoV-2) en (-) ssRNA virussen (bv. influenzavirus). * Dubbelstrengig RNA (dsRNA) virussen (bv. rotavirus). * Retrovirussen: Hebben twee identieke (+) ssRNA strengen (bv. HIV, RNA tumorvirussen). * DNA virussen: * Dubbelstrengig DNA (dsDNA) virussen (bv. Human papillomavirus, de meeste bacteriofagen). * Enkelstrengig DNA (ssDNA) virussen (bv. Parvovirus). #### 2.1.3 Chemische samenstelling van DNA DNA is een nucleïnezuur, opgebouwd uit nucleotiden. Elk nucleotide bestaat uit: * Een deoxyribosesuiker. * Een fosfaatgroep. * Een stikstofbase (adenine (A), guanine (G), cytosine (C) of thymine (T)). De basen zijn gebonden aan de suiker via een glycosidische binding: purines (A, G) aan N9 van de suiker en pyrimidines (C, T) aan N1 van de suiker. #### 2.1.4 Chargaff's regels Erwin Chargaff ontdekte dat in DNA van elke soort het percentage adenine ($A$) altijd gelijk is aan het percentage thymine ($T$), en het percentage guanine ($G$) altijd gelijk is aan het percentage cytosine ($C$). Dit werd later cruciaal voor het begrijpen van de complementaire basenparing in de DNA-dubbele helix. * $\%A = \%T$ * $\%G = \%C$ ### 2.2 DNA structuur: de dubbele helix #### 2.2.1 De dubbele helix structuur De structuur van DNA werd in 1953 beschreven door Watson, Crick, Franklin en Wilkins. Het is een rechtsdraaiende dubbele helix die bestaat uit twee antiparallele en complementaire strengen. * **Ruggengraat:** Gemaakt van afwisselende fosfaatgroepen en 2'-deoxyribosesuikers. Deze ruggengraat is hydrofiel en bevindt zich aan de buitenkant van de helix. * **Basen:** De stikstofbasen wijzen naar binnen en vormen basenparen via waterstofbruggen. De basenparing is specifiek: adenine (purine) paart met thymine (pyrimidine) via twee waterstofbruggen ($A-T$), en guanine (purine) paart met cytosine (pyrimidine) via drie waterstofbruggen ($G-C$). Dit wordt complementaire basenparing genoemd. * **Antiparallel:** De twee strengen lopen in tegengestelde richting (5' naar 3' en 3' naar 5'). * **Afmetingen:** De helix bevat ongeveer 10,5 nucleotiden per winding en de afstand tussen basenparen is ongeveer 0,34 nanometer ($nm$). * **Grovven:** Door de hoek van de glycosidische bindingen tussen de basen en de suiker-fosfaatruggengraat ontstaan twee verschillende groeven: de **major groove** (breder) en de **minor groove** (smal). Eiwitten kunnen specifiek binden aan deze groeven om DNA-sequenties te herkennen zonder de dubbele helix te hoeven ontrollen. * **Drijvende krachten:** De stabiliteit van de dubbele helix wordt voornamelijk gedreven door: * **Hydrofobe interacties (hydrofoob effect):** De basen, die hydrofoob zijn, nestelen zich in het binnenste van de helix, weg van het waterige milieu. * **Base stacking:** Stapeling van de basenparen, waarbij hydrofobe en Van der Waals interacties tussen de aromatische ringen zorgen voor extra stabiliteit. Deze interacties zijn sterker tussen G en C paren. * **Waterstofbruggen:** Tussen de complementaire basen. * **Ionische interacties:** De negatief geladen fosfaatgroepen worden geneutraliseerd door kationen zoals $\text{Mg}^{2+}$ of $\text{Na}^+$. #### 2.2.2 DNA-structuurvarianten Hoewel B-DNA de meest voorkomende structuur is in cellen, zijn er ook andere vormen: * **B-DNA:** Rechtsdraaiend, 10,5 basen per winding, met duidelijke major en minor groeven. * **Z-DNA:** Linksdraaiend, 12 basen per winding, langer en dunner dan B-DNA. De suiker-fosfaatruggengraat heeft een zigzagpatroon. Een tijdelijke omzetting van B-DNA naar Z-DNA kan genactivatie bevorderen. * **A-DNA:** Rechtsdraaiend, 11 basen per winding, korter en dikker dan B-DNA. Dit is de structuur die wordt gevonden in DNA-RNA en RNA-RNA dubbele helices. #### 2.2.3 Supercoiling (superwinding) van DNA Circulair DNA (bv. bacteriële chromosomen, plasmiden, mitochondriaal DNA) en lineair DNA in eukaryoten komt voor als supercoiled DNA. Dit is een manier om het lange DNA-molecuul compacter te maken. * **Negatieve supercoiling:** Veroorzaakt door het ontrollen van de helix, wat spanning creëert. Dit is de meest voorkomende vorm in levende cellen en maakt het gemakkelijker om de DNA-strengen te scheiden tijdens replicatie en transcriptie. * **Positieve supercoiling:** Veroorzaakt door het extra in de rechterhandse richting draaien van de helix, wat ook spanning creëert. **Topoisomerasen** zijn enzymen die supercoils in DNA verwijderen of aanbrengen, essentieel voor DNA-replicatie, transcriptie en reparatie. #### 2.2.4 Denaturatie en renaturatie van DNA * **Denaturatie:** Het uiteengaan van de twee DNA-strengen, wat kan gebeuren door verhoging van temperatuur of pH. De smelttemperatuur ($T_m$) is de temperatuur waarbij de helft van het dubbelstrengs DNA enkelstrengs is. * Factoren die de $T_m$ beïnvloeden: 1. **GC-percentage:** Hoe hoger het percentage Guanine en Cytosine, hoe hoger de $T_m$, omdat G-C paren drie waterstofbruggen hebben (vs. twee bij A-T). 2. **Nabijheid van G-C paren:** Grotere concentraties van naburige G-C nucleotiden verhogen de $T_m$ door sterkere base stacking interacties. 3. **Mate van correcte baseparing:** Een hogere mate van complementaire basenparing tussen de twee strengen leidt tot een hogere $T_m$. * **Renaturatie (hybridisatie):** Het spontaan opnieuw vormen van dubbelstrengs DNA bij verlaging van de temperatuur. Deze techniek wordt gebruikt in biotechnologie, bijvoorbeeld bij FISH (fluorescence in situ hybridization) om specifieke DNA-sequenties te detecteren met behulp van een 'probe' (een complementaire, gelabelde DNA- of RNA-streng). ### 2.3 Compactering van DNA #### 2.3.1 Compactering van bacterieel DNA Bacterieel DNA, meestal een circulair dubbelstrengs chromosoom, ligt in een regio genaamd de nucleoïde. Het is: * **Negatief supercoiled:** Voor een betere compactheid en toegankelijkheid. * **Gevouwen in lussen:** Structureel georganiseerd door eiwitten en RNA, waardoor het DNA compacter wordt. Naast het chromosoom bezitten veel bacteriën ook **plasmiden**: kleine, circulaire, dubbelstrengs DNA-moleculen die autonoom kunnen repliceren en ook supercoiled zijn. #### 2.3.2 Compactering van eukaryotisch DNA Eukaryotisch DNA is extreem lang en moet zeer efficiënt worden verpakt om in de celkern te passen. * **DNA + eiwitten = chromatine:** Eukaryotisch DNA is geassocieerd met eiwitten, voornamelijk histonen, om chromatine te vormen. * **Nucleosoom:** De basiseenheid van chromatine. Het bestaat uit ongeveer 146 basenparen DNA gewikkeld rond een **histonen-octameer** (twee kopieën van elk van de vier histonen H2A, H2B, H3 en H4). Histonen zijn kleine, basische eiwitten met positief geladen lysines en arginines, die sterk binden aan het negatief geladen DNA. * **Linker DNA:** Stukken DNA tussen de nucleosomen. * **Histon H1:** Een linker histon dat helpt bij de verdere compacting van de nucleosomen tot een 30 nm chromatinevezel. * **Hogere orde structuren:** Het 30 nm chromatinevezel wordt verder opgerold en gevouwen tot chromatiden, die uiteindelijk de gecondenseerde chromosomen vormen tijdens mitose. * **Euchromatine:** Minder compact, transcriptie-actief. * **Heterochromatine:** Zeer compact. * **Constitutief heterochromatine:** Altijd compact, bevat o.a. centromeren en telomeren. * **Facultatief heterochromatine:** Kan worden omgezet in euchromatine. #### 2.3.3 Post-translationele modificaties van histonen en chromatine-compactering De modificatie van histonen beïnvloedt de chromatine-structuur en daarmee genexpressie. * **Histon-code:** Een combinatie van covalente modificaties op histon-staarten (bv. acetylering, methylering, fosforylering). * **Acetylering (bv. door HATs):** Verlaagt de positieve lading van histonen, waardoor de interactie met DNA verzwakt en chromatine opener wordt (euchromatine). Dit bevordert transcriptie. * **Deacetylering (bv. door HDACs):** Verhoogt de positieve lading, waardoor de interactie met DNA sterker wordt en chromatine compacter wordt (heterochromatine). Dit onderdrukt transcriptie. * **Methylering:** Kan transcriptie bevorderen of onderdrukken, afhankelijk van het specifieke lysine residu dat wordt gemethyleerd. * **Chromatine-remodelleercomplexen:** Deze complexen gebruiken ATP-hydrolyse om de positie of organisatie van nucleosomen te veranderen, waardoor DNA toegankelijker wordt voor transcriptiefactoren. Ze kunnen nucleosomen verschuiven, verwijderen of histone varianten introduceren. #### 2.3.4 Repetitief DNA in eukaryoten Een significant deel van het eukaryote genoom bestaat uit repetitieve DNA-sequenties. * **Tandem repetitief DNA:** * **Regulier satelliet DNA:** Grote sequenties in centromeren en telomeren. * **Variabel aantal tandem herhalingen (VNTRs) / Minisatelliet DNA:** Herhalingen van 10-100 bp. * **Korte tandem herhalingen (STRs) / Microsatelliet DNA:** Herhalingen van 1-10 bp. * **Verspreid repetitief DNA (interspersed repeats):** Bestaat voornamelijk uit **transposons** (mobiele genetische elementen). * **DNA transposons:** Verplaatsen zich via een "cut and paste" (conservatieve) mechanisme. Coderen voor een transposase. * **Retrotransposons:** Verplaatsen zich via een "copy and paste" (replicatieve) mechanisme, waarbij een RNA-intermediair wordt gevormd. Coderen voor reverse transcriptase. De meest voorkomende zijn LINEs (bv. LINE-1) en SINEs (bv. Alu-sequenties). Ongeveer 60% van het humaan genoom bestaat uit repetitief DNA. #### 2.3.5 Mitochondriaal DNA Mitochondriën bevatten hun eigen kleine, circulaire dubbelstrengs DNA-moleculen. Dit DNA codeert voor een klein percentage van de RNAs en eiwitten die nodig zijn voor de functie van de mitochondriën. Het bevat geen histonen en geen repetitief DNA. ### 2.4 Het centrale dogma van de moleculaire biologie en informatieoverdracht Het centrale dogma beschrijft de stroom van genetische informatie: DNA wordt getranscribeerd naar RNA, en RNA wordt getransleerd naar eiwit. $$ \text{DNA} \xrightarrow{\text{transcriptie}} \text{RNA} \xrightarrow{\text{translatie}} \text{Proteïne} $$ #### 2.4.1 Uitzonderingen op het centrale dogma * **Retrovirussen:** Gebruiken reverse transcriptase om viraal RNA te synthetiseren tot DNA. $$ \text{RNA} \xrightarrow{\text{reverse transcriptase}} \text{DNA} $$ #### 2.4.2 Vormen van RNA Naast messenger RNA (mRNA) dat codeert voor eiwitten, zijn er verschillende soorten non-coding RNA's die belangrijke functies hebben: * **tRNA (transfer RNA):** Essentieel voor de translatie, draagt aminozuren naar het ribosoom. * **rRNA (ribosomaal RNA):** Vormt de structurele en katalytische component van ribosomen. * **lncRNA (long non-coding RNA), snRNA (small nuclear RNA), snoRNA (small nucleolar RNA):** Hebben diverse regulerende en structurele functies. #### 2.4.3 Informatieoverdracht tussen generaties * **Replicatie:** DNA wordt gekopieerd zodat genetische informatie nauwkeurig kan worden doorgegeven aan dochtercellen tijdens celdeling (mitose en meiose). * **Mutaties:** Veranderingen in het DNA kunnen leiden tot veranderingen in het mRNA en vervolgens tot gemuteerde eiwitten, wat kan resulteren in ziekte. ### 2.5 De celkern en nucleair transport #### 2.5.1 Structuur van de celkern De celkern is een membraangebonden organel dat het genetisch materiaal van eukaryote cellen bevat. Het is omgeven door een dubbel membraan (nucleaire envelop) met **kernporiën** die de uitwisseling van moleculen tussen de kern en het cytoplasma reguleren. * **Nucleaire envelop:** Bestaat uit een buitenste en een binnenste membraan. * **Kernporiën:** Grote proteïnecomplexen die een selectief transportkanaal vormen. Kleine moleculen (tot ca. 30 kiloDalton, kDa) kunnen passief diffunderen, terwijl grotere moleculen actief transport vereisen. * **Nucleaire lamina:** Een vezelig netwerk van lamina-eiwitten aan de binnenkant van het binnenste kernmembraan, essentieel voor de structuur van de kern. Mutaties in lamines kunnen leiden tot aandoeningen zoals Hutchinson-Gilford progeria syndroom. * **Nucleolus:** Een dicht structuur binnen de kern waar rRNA wordt gesynthetiseerd en ribosomale subeenheden worden samengesteld. Het is de "fabriek" voor ribosomen. * **Nucleaire matrix (nucleoskelet):** Een onoplosbaar vezelig netwerk binnen de kern dat een rol speelt in de organisatie van het DNA en chromosoom territoria. #### 2.5.2 Nucleair transport Transport door de kernporiën is cruciaal voor de functie van de cel. * **Passief transport:** Diffusie van kleine moleculen (< ca. 30 kDa) zonder energieverbruik. * **Actief transport:** Vereist energie en transportreceptoren (bv. importines, exportines). * **Nucleaire import:** Eiwitten die naar de kern moeten, bezitten een **nucleair localisatie signaal (NLS)** dat door importines wordt herkend. Dit complex bindt aan FG-nucleoporines in de kernporie en wordt de kern ingevoerd, geholpen door de Ran-GTP gradiënt. * **Nucleaire export:** Moleculen die uit de kern moeten (bv. RNA, ribosomale subeenheden) worden herkend door exportreceptoren (bv. exportines) die een **nucleair export signaal (NES)** bevatten. Dit proces is ook afhankelijk van de Ran-GTP gradiënt. mRNA wordt vaak geëxporteerd als ribonucleoproteïne (mRNP) complexen. > **Tip:** Het aantonen dat een aminozuursequentie een NLS is, kan door een fusie-eiwit te creëren (een cytosolaire eiwit gecombineerd met de onderzochte sequentie) en vervolgens te observeren of dit fusie-eiwit naar de nucleus wordt getransporteerd na expressie. ### 2.6 Relevantie voor de geneeskunde Biochemie en moleculaire biologie vormen de basis voor het begrijpen van gezondheid en ziekte op moleculair niveau. Kennis van DNA, genexpressie en eiwitfunctie is essentieel voor: * **Diagnostiek:** Identificeren van genetische afwijkingen die ziekten veroorzaken. * **Preventie:** Begrijpen hoe genetische aanleg bijdraagt aan ziekterisico. * **Behandeling:** Ontwikkelen van gerichte therapieën, zoals: * **Gentherapie:** Corrigeren van defecte genen. * **CRISPR-Cas technologie:** Precisiegenbewerking. * **mRNA vaccins:** Gebruiken mRNA om immuunreacties op te wekken. * **Immuuntherapie:** Stimuleren van het immuunsysteem om ziekte te bestrijden. * **Geneesmiddelen:** Ontwikkelen van medicijnen die specifieke moleculaire doelen aangrijpen (bv. remmers van virale reverse transcriptase). * **Gepersonaliseerde geneeskunde:** Behandelingen afstemmen op het individuele genotype van een patiënt. Door de wisselwerking tussen fundamenteel onderzoek en geneeskunde worden innovatieve diagnostische en therapeutische benaderingen ontwikkeld. --- # Structuur en functie van de celkern en nucleair transport Dit gedeelte behandelt de organisatie van de celkern, inclusief het kernmembraan, kernporiën en de nucleaire matrix, en beschrijft het transport van moleculen van en naar de celkern via passieve en actieve mechanismen. ### 3.1 De celkern: organisatie en structurele componenten De celkern is een centraal organel dat het genetisch materiaal van eukaryotische cellen bevat en beschermt. Het speelt een cruciale rol in de regulatie van genexpressie en de replicatie van DNA. #### 3.1.1 Het kernmembraan Het kernmembraan, ook wel nucleaire envelop genoemd, scheidt de inhoud van de kern (nucleoplasma) van het cytoplasma. Het bestaat uit een dubbele membraan, gescheiden door een perinucleaire ruimte. Aan de binnenzijde van het kernmembraan bevindt zich de nucleaire lamina, een netwerk van intermediaire filamenten, voornamelijk bestaande uit lamine-eiwitten. Deze lamina is essentieel voor het handhaven van de vorm van de celkern en speelt een rol bij de organisatie van chromatine. #### 3.1.2 Kernporiën: de poorten van de celkern De kernporiën zijn complexe proteïne structuren die door de dubbele kernmembraan lopen. Ze fungeren als selectieve kanalen die moleculair verkeer tussen de kern en het cytoplasma reguleren. Een typische zoogdierencel bevat 3000 tot 4000 kernporiën, elk met een diameter van ongeveer 120 nanometer. * **Passief transport:** Kleine moleculen, zoals ionen, ATP en kleine eiwitten (tot ongeveer 30 kilodalton), kunnen via diffusie de kernporiën passeren zonder energieverbruik. Dit transport is beperkt tot moleculen met een diameter tot ongeveer 9 nanometer. * **Actief transport:** Grotere moleculen, zoals eiwitten en RNA, vereisen actief transport via transportreceptoren. Dit proces is energieafhankelijk en maakt transport mogelijk voor moleculen tot een diameter van ongeveer 26 nanometer. #### 3.1.3 De nucleaire matrix De nucleaire matrix, of het nucleoskelet, is een onoplosbaar vezelig netwerk binnen de kern dat overblijft na behandeling met detergenten en nucleasen. Het vormt een ondersteunende structuur en is betrokken bij de organisatie van chromosomen en de regulatie van genexpressie. In situ hybridisatie kan aantonen dat chromosomen zich in specifieke 'chromosoomterritoria' bevinden binnen de kern, die kunnen variëren afhankelijk van celtype en omstandigheden. #### 3.1.4 De nucleolus De nucleolus is een subnucleaire structuur zonder membraan die fungeert als de "fabriek" voor ribosomen. Het kan tot 25% van het volume van de kern innemen, afhankelijk van de cellulaire activiteit. De nucleolus bestaat uit fibrillen, waar rRNA-synthese en pre-rRNA-processing plaatsvinden, en granulen, waar de assemblage van ribosomale subeenheden plaatsvindt. ### 3.2 Nucleair transport: mechanismen en regulatie Het transport van moleculen tussen de celkern en het cytoplasma is een essentieel proces dat nauwkeurig gereguleerd wordt. Dit transport vindt plaats via de kernporiën en kan zowel passief als actief zijn. #### 3.2.1 Actieve nucleaire import Eiwitten die naar de celkern moeten worden getransporteerd, bezitten meestal een nucleair localisatie signaal (NLS). Dit signaal is een specifieke aminozuursequentie die herkenning door transportreceptoren mogelijk maakt. * **Importine/Ran-systeem:** Importine is een transportreceptor die bindt aan het NLS van het te importeren eiwit. Het complex van importine en het eiwit (de cargo) wordt vervolgens door de kernporie getransporteerd. Binnen de kern faciliteert Ran-GTP (een GTP-bindend eiwit) de dissociatie van het eiwit van importine. * **Ran-GTP gradiënt:** Een gradiënt van Ran-GTP tussen de celkern en het cytoplasma drijft het nucleaire transport aan. In de celkern bevordert een guanine-nucleotide exchange factor (GEF) de vorming van Ran-GTP, terwijl in het cytoplasma een GTPase-activating protein (GAP) de hydrolyse van GTP bevordert, wat leidt tot Ran-GDP. Dit concentratieverschil zorgt voor de directionele beweging van moleculen. #### 3.2.2 Actieve nucleaire export RNA-moleculen en eiwitten die uit de celkern moeten worden geëxporteerd, bezitten doorgaans een nucleair export signaal (NES). * **Exportine/Ran-systeem:** Exportine werkt vergelijkbaar met importine, maar transporteert NES-bevattende moleculen uit de kern. Exportine bindt aan het NES-eiwit, Ran-GTP en de FG-nucleoporines om het complex door de kernporie te transporteren. * **mRNA export:** mRNA-moleculen worden als ribonucleoproteïnecomplexen (mRNP's) geëxporteerd, vaak onafhankelijk van het Ran-systeem. #### 3.2.3 Nucleaire localisatie signalen (NLS) Een NLS is een specifieke aminozuursequentie, vaak rijk aan basische aminozuren (zoals lysine en arginine), die op het oppervlak van een eiwit voorkomt en essentieel is voor zijn import in de celkern. De ontdekking en identificatie van NLS-sequenties is cruciaal voor het begrijpen van het cellulaire compartimentalisatie. > **Tip:** Om aan te tonen dat een bepaalde aminozuursequentie een NLS is, kan men een recombinant fusie-eiwit creëren door deze sequentie te koppelen aan een cytosolisch eiwit. Als dit fusie-eiwit vervolgens naar de celkern wordt getransporteerd, bewijst dit de NLS-activiteit van de sequentie. #### 3.2.4 Nucleaire transportfactor 2 (NTF2) NTF2 is een transportreceptor die Ran-GDP van het cytoplasma terug naar de celkern transporteert, waar Ran-GDP wordt omgezet in Ran-GTP door de GEF. Dit is een cruciale stap in het handhaven van de Ran-GTP gradiënt. > **Voorbeeld:** Tijdens de replicatie van DNA worden er grote hoeveelheden histonen naar de celkern getransporteerd. Dit illustreert de omvang en efficiëntie van het actieve nucleaire importmechanisme. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Nucleotiden | De bouwstenen van nucleïnezuren zoals DNA en RNA. Een nucleotide bestaat uit een fosfaatgroep, een suiker (deoxyribose in DNA, ribose in RNA) en een stikstofbase (adenine, guanine, cytosine, thymine of uracil). | | Dubbele helix | De karakteristieke spiraalvormige structuur van DNA, bestaande uit twee complementaire strengen die om elkaar heen wikkelen, met de basen naar binnen gericht en de suiker-fosfaatruggengraat aan de buitenkant. | | Basenparing | Het specifieke koppelen van stikstofbasen in de twee DNA-strengen: adenine (A) paart altijd met thymine (T) via twee waterstofbruggen, en guanine (G) paart altijd met cytosine (C) via drie waterstofbruggen. | | Waterstofbruggen | Zwakke chemische bindingen die ontstaan tussen een waterstofatoom dat gebonden is aan een elektronegatief atoom (zoals zuurstof of stikstof) en een ander elektronegatief atoom. Deze zijn cruciaal voor de stabiliteit van de DNA-dubbele helix. | | Purine | Een type stikstofbase met een dubbele ringstructuur, waaronder adenine (A) en guanine (G). In DNA en RNA vormen purines paren met pyrimidines. | | Pyrimidine | Een type stikstofbase met een enkele ringstructuur, waaronder cytosine (C), thymine (T) en uracil (U). In DNA en RNA paren pyrimidines met purines. | | Hydrofoob effect | Het verschijnsel waarbij niet-polaire moleculen, zoals de stikstofbasen in DNA, zich aggregeren in een waterige omgeving om de interactie met water te minimaliseren. Dit is een belangrijke drijvende kracht achter de vorming van de dubbele helix. | | Base stacking | De interactie tussen naburige vlakke aromatische ringen van stikstofbasen in de DNA-dubbele helix, voornamelijk door Van der Waals-krachten en hydrofobe interacties. Deze interacties stabiliseren de helixstructuur. | | Major groeve | Een van de twee groeven die ontstaan op het oppervlak van de DNA-dubbele helix. De major groeve is breder en biedt specifieke bindingsplaatsen voor eiwitten die DNA herkennen. | | Minor groeve | De smallere van de twee groeven op het oppervlak van de DNA-dubbele helix. De interacties in de minor groeve zijn minder specifiek dan in de major groeve. | | Supercoiling (superwinding) | Het opwinden van DNA-moleculen om hun eigen as, wat resulteert in een compactere structuur. Dit proces is essentieel voor het passen van het lange DNA in de celkern en wordt gereguleerd door enzymen zoals topoisomerases. | | Topoisomerasen | Enzymen die de topologische staat van DNA kunnen veranderen door strengen te breken, te ontwarren en weer te verbinden. Ze zijn cruciaal voor processen als DNA-replicatie en transcriptie door het beheren van supercoiling. | | Denaturatie | Het proces waarbij de twee strengen van de DNA-dubbele helix scheiden, meestal veroorzaakt door verhoogde temperatuur of veranderingen in pH. Dit maakt de individuele strengen toegankelijk voor andere moleculen. | | Renaturatie (hybridisatie) | Het omgekeerde proces van denaturatie, waarbij de gescheiden DNA-strengen zich weer kunnen herenigen onder de juiste omstandigheden (bijvoorbeeld verlaagde temperatuur). Dit principe wordt gebruikt in technieken als FISH. | | FISH (fluorescence in situ hybridization) | Een moleculaire cytogenetische techniek die fluorescerende probes gebruikt om specifieke DNA-sequenties te detecteren en te visualiseren binnen cellen of weefsels, vaak op chromosomen. | | Karyotype (chromosomenkaart) | Een geordende weergave van de chromosomen van een cel of organisme, gerangschikt naar grootte, vorm en patroon. Dit helpt bij het identificeren van chromosomale afwijkingen. | | Bacterieel chromosoom | Het primaire genetisch materiaal van een bacterie, meestal een enkel, circulair, dubbelstrengs DNA-molecuul dat zich bevindt in de nucleoïde regio van de cel. | | Plasmiden | Kleine, circulaire, dubbelstrengs DNA-moleculen die autonoom kunnen repliceren binnen bacteriële cellen, naast het hoofdgenoom. Ze kunnen genetische informatie dragen die gunstig is voor de bacterie, zoals resistentie tegen antibiotica. | | Nucleoïde | Het gebied in het cytoplasma van een prokaryote cel waar het genetisch materiaal (het chromosoom) zich bevindt. Het is geen membraangebonden organel zoals de celkern van eukaryoten. | | Chromatine | Het complex van DNA en eiwitten (voornamelijk histonen) dat de bouwsteen vormt van chromosomen in eukaryote cellen. Chromatine zorgt voor de compacte verpakking van DNA en reguleert genexpressie. | | Histonen | Kleine, basische eiwitten die een essentiële rol spelen bij de verpakking van DNA in eukaryoten. Ze vormen de kern van nucleosomen, de basiseenheid van chromatine. | | Nucleosoom | De basiseenheid van chromatine, bestaande uit ongeveer 146 basenparen DNA dat rond een octameer van histonen is gewikkeld. | | Euchromatine | De minder compacte vorm van chromatine die actief is voor transcriptie. Genen in euchromatine zijn toegankelijker voor de transcriptiemachinerie. | | Heterochromatine | De sterk gecondenseerde vorm van chromatine die over het algemeen transcriptioneel inactief is. Het is onderverdeeld in constitutief heterochromatine (altijd compact) en facultatief heterochromatine (compact onder specifieke omstandigheden). | | Post-translationele modificaties van histonen | Chemische veranderingen (zoals acetylering, methylering, fosforylering) die aan histon-eiwitten worden aangebracht na hun synthese. Deze modificaties reguleren de chromatine-structuur en genexpressie. | | Acetylering van histonen | Een post-translationele modificatie waarbij een acetylgroep wordt toegevoegd aan lysineresiduen op histon-staarten. Dit verzwakt de interactie tussen histonen en DNA, wat leidt tot een opener chromatine-structuur en verhoogde genexpressie. | | Methylering van histonen | Een post-translationele modificatie waarbij een methylgroep wordt toegevoegd aan lysineresiduen of arginine-residuën op histon-staarten. Methylering kan zowel genactivatie als genonderdrukking bevorderen, afhankelijk van de locatie en het aantal methylgroepen. | | Chromatine-remodelleer complexen | Grote eiwitcomplexen die de organisatie en/of positie van nucleosomen binnen het chromatine kunnen veranderen. Ze spelen een cruciale rol bij het reguleren van DNA-toegankelijkheid voor genexpressie. | | Repetitief DNA | DNA-sequenties die meerdere keren in het genoom voorkomen. Dit omvat tandem repetitief DNA (zoals satelliet-DNA, VNTRs, microsatellieten) en verspreid repetitief DNA (zoals transposons). | | Transposons | Mobiele genetische elementen die zich binnen het genoom kunnen verplaatsen via replicatieve ('copy & paste') of conservatieve ('cut & paste') transpositie. Ze kunnen de genexpressie beïnvloeden en dragen bij aan de evolutie van het genoom. | | Retrotransposons | Een type transposon dat een RNA-intermediair gebruikt voor transpositie. Ze kopiëren zichzelf naar een nieuwe locatie in het genoom, wat resulteert in een toename van hun aantal. LINEs en SINEs zijn voorbeelden in het humane genoom. | | LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) | Een klasse van retrotransposons in eukaryote genomen die relatief lang zijn en coderen voor enzymen die nodig zijn voor hun eigen replicatie en insertie. LINE-1 (L1) is een prominent voorbeeld. | | SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) | Een klasse van retrotransposons in eukaryote genomen die korter zijn dan LINEs en meestal niet coderen voor eigen transpositie-enzymen, maar afhankelijk zijn van de machinery van andere retrotransposons. Alu-sequenties zijn een bekend voorbeeld. | | Mitochondriaal genoom | Het DNA dat zich bevindt in de mitochondriën van eukaryote cellen. Dit is meestal een klein, circulair, dubbelstrengs DNA-molecuul dat eigen ribosomen en een beperkt aantal genen bevat. | | Celkern (nucleus) | Het membraangebonden organel in eukaryote cellen dat het genetisch materiaal (DNA) bevat, georganiseerd in chromosomen. De celkern reguleert veel cellulaire processen, waaronder genexpressie en DNA-replicatie. | | Kernporiën | Complexe eiwitstructuren die de nucleaire envelop doordringen en fungeren als selectieve poorten voor het transport van moleculen tussen de celkern en het cytoplasma. | | Nucleaire matrix (nucleoskelet) | Een onoplosbaar vezelig netwerk binnen de celkern dat de organisatie van het chromatine en de structuur van de celkern helpt handhaven. | | Nucleaire lamina | Een vezelachtige eiwitstructuur aan de binnenzijde van het binnenste kernmembraan, opgebouwd uit lamine-eiwitten. Het ondersteunt de structuur van de celkern en speelt een rol bij chromatine-organisatie. | | Nucleolus | Een niet-membraangebonden subnucleair structuur in de celkern, die voornamelijk betrokken is bij de synthese van ribosomaal RNA (rRNA) en de assemblage van ribosomale subeenheden. | | Nucleair lokalisatiesignaal (NLS) | Een specifiek aminozuursequentie op een eiwit dat fungeert als een "adreslabel" dat ervoor zorgt dat het eiwit naar de celkern wordt getransporteerd. | | Nucleaire export signaal (NES) | Een specifiek aminozuursequentie op een eiwit dat ervoor zorgt dat het eiwit uit de celkern naar het cytoplasma wordt getransporteerd. |

# DNA replicatie DNA replicatie is het proces waarbij een DNA-molecuul wordt gekopieerd, wat essentieel is voor de celdeling en de overdracht van genetische informatie. ## 1. Het proces van DNA replicatie ### 1.1 Semi-conservatieve aard DNA-replicatie is semi-conservatief. Dit betekent dat bij elke replicatiecyclus elke nieuwe DNA-dubbelstreng bestaat uit één oude (parentale) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng. Het Meselson-Stahl experiment, waarbij bacteriën werden gekweekt in media met verschillende isotopen van stikstof ($^{15}$N en $^{14}$N) en het DNA vervolgens werd geanalyseerd via dichtheidsgradiëntcentrifugatie, toonde dit principe aan. Na één replicatiecyclus ontstond een hybride DNA-band met een dichtheid tussen de zware en lichte streng, wat wijst op de incorporatie van beide isotopen in de nieuwe strengen. ### 1.2 De rol van DNA polymerasen DNA polymerasen zijn enzymen die de synthese van DNA katalyseren. Ze voegen nieuwe deoxynucleotiden toe aan het 3'-hydroxyluiteinde van een groeiende DNA-keten, waardoor de fosfodiësterbindingen worden gevormd. Deze reactie is gekoppeld aan de hydrolyse van fosfoanhydridebindingen in de deoxynucleoside trifosfaten (dNTPs), wat energie levert. * **Reactie:** $$(dNMP)_n + dNTP \rightarrow (dNMP)_{n+1} + PP_i$$ De hydrolyse van pyrophosfaat ($PP_i$) tot anorganisch fosfaat ($P_i$) drijft de reactie verder aan: $$PP_i + H_2O \rightarrow 2P_i$$ Er zijn meerdere soorten DNA polymerasen. In prokaryoten is DNA polymerase III essentieel voor de replicatie, terwijl in eukaryoten vier hoofdtypen worden onderscheiden. ### 1.3 Leidende en navolgende strengen DNA-synthese vindt altijd plaats in de 5' naar 3'-richting. Omdat de twee strengen van de DNA-dubbelhelix antiparallel lopen, verloopt de replicatie op de ene streng continu (de leidende streng) en op de andere discontinu (de navolgende streng). * **Leidende streng:** Synthese verloopt continu in de richting van de replicatievork. * **Navolgende streng:** Synthese verloopt discontinu in korte fragmenten, bekend als Okazaki-fragmenten. Deze fragmenten worden later aan elkaar geligeerd door DNA-ligase. ### 1.4 Proeflezen (proofreading) DNA polymerasen hebben een ingebouwde proefleesfunctie, waarbij ze via hun 3' $\rightarrow$ 5' exonuclease activiteit verkeerd ingebouwde nucleotiden kunnen verwijderen. Dit verlaagt de foutenmarge van DNA-synthese aanzienlijk, van ongeveer 1 op 100.000 tot 1 op 10.000.000 basen. ### 1.5 Bidirectionele replicatie DNA-replicatie verloopt meestal bidirectioneel vanuit een specifiek beginpunt, de 'origin of replication' (ORI). Dit resulteert in de vorming van twee replicatievorken die zich in tegenovergestelde richtingen bewegen. ## 2. Initiatie en timing van replicatie ### 2.1 Replicatie bij bacteriën * **Origin of replication (ORI):** Bij bacteriën, zoals *E. coli*, begint de replicatie bij een enkel, AT-rijk specifiek DNA-sequentiëra (OriC). * **Initiatie:** Initiatorproteïnen, zoals DnaA, binden aan de ORI, wat leidt tot het ontwinden van de DNA-helix. Single-Strand Binding (SSB) eiwitten stabiliseren de enkelstrengige DNA-regio's en voorkomen re-hybridisatie. DnaB (een DNA-helicase) wordt gerecruteerd, wat de bidirectionele replicatie mogelijk maakt. * **Replicatiefactoren:** Primase synthetiseert korte RNA-primers. DNA polymerase III verlengt deze primers met DNA. DNA polymerase I verwijdert de RNA-primers (via 5' $\rightarrow$ 3' exonuclease activiteit) en vult de resulterende gaten op met DNA. DNA ligase sluit de nick tussen de Okazaki-fragmenten. Helicases ontwinden het DNA en topoisomerases verlichten de torsiestress. Alle eiwitten die betrokken zijn bij replicatie vormen samen het replisoom. ### 2.2 Replicatie bij eukaryoten * **Origins of replication (ORIs):** Eukaryoten hebben meerdere ORIs op hun chromosomen (ongeveer 20.000 in gist). Deze replicatie-eenheden worden replicons genoemd. * **Initiatie:** De initiatie verloopt via de vorming van een pre-replicatiecomplex (pre-RC) tijdens de G1-fase. Dit complex bestaat uit de Origin Recognition Complex (ORC), helicase-laders en het MCM-complex (Mini-Chromosome Maintenance, een helicase). Aan het begin van de S-fase wordt het pre-RC omgevormd tot een replicatiecomplex, waarna de replicatie begint. * **Replicatiefactoren:** Vergelijkbaar met bacteriën, maar er zijn verschillen in de DNA polymerasen en de verwijdering van RNA-primers. RNA-primers worden verwijderd door endonuclease RNAse H en exonuclease FEN1. Chromatine-remodelleringscomplexen zijn ook betrokken om de toegang van de replicatiemachinerie tot het DNA te faciliteren. * **Timing van replicatie:** De lengte van de S-fase wordt bepaald door het aantal replicons en de snelheid waarmee pre-RCs worden geactiveerd. Euchromatine wordt eerder gerepliceerd dan heterochromatine. ### 2.3 Het probleem van chromosoomuiteinden (telomeren) Bij eukaryoten kan het einde van de lineaire chromosomen niet volledig worden gerepliceerd, wat leidt tot verkorting van de telomeren bij elke replicatiecyclus. Telomeren bestaan uit repetitieve sequenties (bij mensen TTAGGG). Na verloop van tijd, wanneer de telomeren te kort worden, kan dit leiden tot cel senescentie of apoptose. Telomerase, een enzym met reverse transcriptase activiteit, kan telomeren verlengen en is actief in proliferende cellen zoals stamcellen, geslachtscellen en kankercellen. ## 3. Polymerasekettingreactie (PCR) PCR is een moleculair-biologische techniek die het mogelijk maakt om snel grote aantallen identieke kopieën van een specifiek DNA-segment te produceren. Het proces omvat cyclische herhalingen van: 1. **Denaturatie:** Verwarmen tot hoge temperaturen om het dubbelstrengs DNA te scheiden. 2. **Hybridisatie:** Afkoelen om synthetische primers te laten binden aan de enkelstrengige DNA-matrijzen. 3. **Extensie:** Verwarmen tot de optimale temperatuur voor een hittebestendig DNA polymerase om de primers te verlengen en nieuwe DNA-strengen te synthetiseren. Elke cyclus verdubbelt de hoeveelheid doel-DNA, wat resulteert in een exponentiële toename. ## 4. Vergelijking prokaryote en eukaryote replicatie | Kenmerk | Bacteriën | Eukaryoten | | :-------------------------- | :------------------------------------------------- | :---------------------------------------------------------------------- | | Aantal origins of replication | Eén (OriC) | Meerdere (ca. 20.000) | | RNA-primer verwijdering | DNA polymerase I | RNAse H en FEN1 | | Chromatine | Afwezig | Aanwezig; nucleosomen moeten worden gereassembleerd | | Replicatiesnelheid | Ca. 50.000 basen/minuut | Ca. 2.000 basen/minuut | | DNA polymerasen | DNA polymerase III (essentieel), DNA polymerase I | Meerdere (bv. DNA polymerase $\delta$, $\epsilon$, $\alpha$, $\beta$) | | Chromosoomuiteinden | Circulaire chromosomen, geen telomeerprobleem | Lineaire chromosomen, telomeerverkorting | **Gelijkenissen:** * Gebruik van origins of replication. * Ontwinding van DNA door helicase. * Bidirectionele replicatie. * Gebruik van vergelijkbare klassen van enzymen: DNA polymerasen, primase, ligase, topoisomerase. * Semi-conservatieve replicatie. * Synthese van leidende en navolgende strengen. ## 5. De polymerasekettingreactie (PCR) in detail PCR maakt het mogelijk om een specifiek DNA-segment exponentieel te amplificeren. Het vereist: * Een DNA-matrijs die het te amplificeren segment bevat. * Twee synthetische primers die complementair zijn aan de uiteinden van het doel-DNA-segment. * Een hittebestendig DNA polymerase, zoals Taq polymerase. * Deoxynucleoside trifosfaten (dNTPs). * Een bufferoplossing met de juiste ionische sterkte en pH. De cycli van denaturatie, hybridisatie en extensie worden herhaald. Na 20-30 cycli is het doel-DNA-segment miljoenen malen vermenigvuldigd. > **Tip:** PCR is een fundamentele techniek in moleculaire biologie voor DNA-amplificatie, diagnose van ziekten, forensisch onderzoek en genetische analyse. ## 6. Oorzaken van mutaties en DNA-schade Mutaties zijn permanente veranderingen in de DNA-sequentie. Ze kunnen ontstaan door endogene factoren (bv. replicatiefouten) of externe factoren (mutagenen). ### 6.1 Endogene oorzaken * **Replicatiefouten:** DNA polymerasen maken fouten, hoewel proeflezen de frequentie sterk vermindert. Fouten kunnen optreden door: * Tautomeren van ringbasen: Zeldzame resonantiestructuren van basen kunnen leiden tot onjuiste basenparing tijdens replicatie. * Strand slippage: In repetitieve DNA-sequenties kan het polymerase 'slippen', wat leidt tot inserties of deleties van nucleotiden. * Spontane chemische modificaties: * Depurineringen: Verlies van een purinebasis door hydrolyse van de glycosidebinding, wat resulteert in een AP-site (apurine/apyrimidine). Tijdens replicatie wordt hier vaak een 'A' ingebouwd. * Deamineringen: Verlies van een aminogroep (bv. cytosine wordt uracil). * Oxidatie: Basen kunnen worden geoxideerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS), bv. guanine wordt 8-oxoguanine. ### 6.2 Externe oorzaken (mutagenen) * **Chemische mutagenen:** * Ringbase-analogen: Stoffen die lijken op DNA-basen en in het DNA kunnen worden ingebouwd (bv. 5-bromo-deoxyuridine). * Ringbase-modificerende agentia: Stoffen die de structuur van basen veranderen (bv. aflatoxine, wat leidt tot depurinering). * Intercalerende agentia: Stoffen die zich tussen DNA-basen plaatsen, de dubbele helix structuur verstoren en kunnen leiden tot inserties of deleties. * **Fysische mutagenen:** * UV-straling: Veroorzaakt thyminedimeren, die replicatie kunnen blokkeren. * Ioniserende straling (bv. X-stralen): Veroorzaakt DNA-breuken en andere schade. ## 7. DNA-herstelmechanismen Cellen beschikken over diverse mechanismen om DNA-schade te herstellen: ### 7.1 Fotolyase Herstelt thyminedimeren door energie uit zichtbaar licht te gebruiken. Dit mechanisme komt voor bij prokaryoten en sommige eukaryoten, maar niet bij mensen. ### 7.2 Base Excision Repair (BER) Herstelt gewijzigde of missende basen. Een DNA-glycosylase verwijdert de beschadigde base. Vervolgens worden de fosfodiësterruggegraad door een endonuclease en lyase bewerkt, waarna DNA-polymerase het ontbrekende nucleotide aanvult en DNA-ligase de streng sluit. ### 7.3 Nucleotide Excision Repair (NER) Herstelt grotere DNA-laesies, zoals thyminedimeren en omvangrijke basemodificaties. Een complex van eiwitten (bv. UVR-AB in bacteriën, XPA-XPG in mensen) herkent de afwijking. Endonucleases knippen aan beide zijden van de laesie, waarna een helicase het beschadigde nucleotide verwijdert. DNA-polymerase vult de kloof en ligase sluit deze. NER kan ook 'transcription-coupled repair' uitvoeren, waarbij transcriptie-stoppende laesies sneller worden hersteld. ### 7.4 Mismatch Repair (MMR) Detecteert en corrigeert fouten die ontstaan tijdens de replicatie (mismatches) die niet door de proefleesfunctie van DNA polymerase zijn opgemerkt. In prokaryoten identificeert het systeem de parentale streng via methylering van A in GATC-sequenties. In eukaryoten worden Okazaki-fragmenten gebruikt om de nieuwe streng te identificeren. ### 7.5 Translesie synthese (TLS) Dit is geen echt herstelmechanisme, maar een 'bypass'-strategie waarbij speciale DNA polymerasen (bv. DNA polymerase $\eta$ in eukaryoten) beschadigde matrijsstrengen kunnen repliceren. Dit kan fouten introduceren, maar maakt replicatie mogelijk ondanks de schade. ### 7.6 Herstel van dubbelstrengs DNA-breuken * **Non-homologous end-joining (NHEJ):** Verbindt de twee gebroken uiteinden direct aan elkaar. Dit proces kan leiden tot nucleotideverlies of inserties, en is daarom 'error-prone'. Het vindt plaats in de G1-fase. * **Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA):** Een foutenvrij herstelmechanisme dat gebruik maakt van de zusterchromatide als matrijs. Het proces omvat 5'-exonuclease activiteit, invasie van de zusterchromatide, replicatie en ligatie. Treedt op tijdens en na de S-fase. * **Homologe recombinatie (HR):** Een zeer nauwkeurig herstelmechanisme dat ook de zusterchromatide gebruikt als matrijs. Het omvat de vorming van Holliday junctions en de resolutie ervan. Vindt plaats tijdens en na de S-fase. > **Tip:** Bij onherstelbare DNA-schade treedt geprogrammeerde celdood (apoptose) op om de celcyclus te beëindigen en verdere problemen te voorkomen. --- # DNA schade en foutenherstel Dit hoofdstuk behandelt de oorzaken van DNA schade, de verschillende mechanismen die cellen gebruiken om deze schade te herstellen, en de gevolgen van onherstelbare schade. ### 2.1 Oorzaken van DNA schade DNA schade kan ontstaan door zowel endogene (interne) als exogene (externe) factoren. De incidentie van mutaties is hoog, maar DNA herstelmechanismen beperken de accumulatie van deze fouten aanzienlijk. #### 2.1.1 Endogene factoren Endogene factoren zijn processen die inherent zijn aan de celcyclus en het metabolisme. * **Replicatiefouten:** Ondanks de proefleesfunctie van DNA polymerasen (reductie van foutenmarge tot ca. 1 op 10.000.000), kunnen fouten optreden. * **Tautomeren van ringbasen:** Zeldzame resonantiestructuren van basen kunnen leiden tot verkeerde basenparing tijdens de replicatie. * **Strand slippage:** Bij repetitief DNA kan het DNA polymerase 'slippen', waardoor een deel van het DNA dubbel wordt gerepliceerd of overgeslagen. Dit kan leiden tot expansie of deletie van trinucleotiden-repeats. * **Spontane chemische modificaties:** * **Depurinering:** Verlies van een purinebase door hydrolyse van de glycosidische binding (ca. 1000 keer per cel per dag). Dit resulteert in een AP (apurine/apyrimidine) site, waarop tijdens replicatie meestal een adenine wordt toegevoegd. * **Deaminering:** Spontane hydrolyse van een aminogroep op een base (ca. 100 keer per cel per dag). Cytosine kan deamineren tot uracil (dat vervolgens tot adenine kan deamineren), wat leidt tot mismatch. * **Oxidatie:** Reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen basen oxideren, bijvoorbeeld guanine tot 8-oxoguanine. #### 2.1.2 Exogene factoren Externe agentia kunnen DNA beschadigen. * **Chemische mutagenen:** * **Ringbase-analogen:** Stoffen die lijken op ringbasen en kunnen worden ingebouwd in DNA, zoals 5-bromo-deoxyuridine (BrdU), een analoog van uracil. Dit verhoogt de kans op tautomere shifts. * **Ringbase-modificerende agentia:** Stoffen die de chemische structuur van basen veranderen, zoals aflatoxine, wat kan leiden tot adductvorming en verzwakking van de glycosidische binding. Sommige agentia kunnen DNA polymerase blokkeren. * **Intercalerende agentia:** Hydrofobe stoffen met ringstructuren die zich tussen de basenparen in de dubbele helix invoegen, wat de structuur verandert en kan leiden tot breuken, deleties of inserties tijdens herstel. Voorbeelden zijn ethidiumbromide en proflavine. * **Fysische mutagenen:** * **UV-straling:** Veroorzaakt de vorming van thyminedimeren (bv. cyclobutane pyrimidine dimers), die de replicatiemachine blokkeren en tot DNA-breuken kunnen leiden. * **Ioniserende straling (bv. röntgenstraling):** Deze straling is zeer schadelijk en kan enkel- en dubbelstrengs DNA-breuken veroorzaken. ### 2.2 DNA herstelmechanismen Cellen beschikken over een arsenaal aan herstelmechanismen om verschillende soorten DNA schade te repareren. #### 2.2.1 Fotolyase * Dit enzym herstelt thyminedimeren veroorzaakt door UV-straling. * Het komt voor in prokaryoten en sommige eukaryoten (niet bij de mens). * Het gebruikt energie van zichtbaar licht om FADH$_2$ te reduceren, dat vervolgens als elektronendonor de pyrimidinedimeer breekt. Fotolyase is aanwezig in sommige zonnecrèmes. #### 2.2.2 Base excision repair (BER) * **Doel:** Herstel van gewijzigde of missende ringbasen. * **Stappen:** 1. **DNA glycosylase:** Verwijdert de beschadigde base door de glycosidische binding te verbreken. 2. **Endonuclease:** Breekt de fosfodiësterbinding naast de apurine/apyrimidine (AP) site. 3. **Lyase:** Verwijdert de resterende 5'-deoxyribose fosfaat groep. 4. **DNA polymerase (5'->3'):** Vult het gat met het juiste nucleotide op basis van de complementaire streng. 5. **DNA ligase:** Verbindt de uiteinden door een fosfodiësterbinding te katalyseren. * **Belang:** Dit mechanisme verklaart waarom DNA thymine bevat in plaats van uracil. Deaminatie van cytosine produceert uracil. Als uracil een natuurlijke DNA-base zou zijn, zou het verschil tussen de correcte en de foutieve base niet herkend kunnen worden. #### 2.2.3 Nucleotide excision repair (NER) * **Doel:** Herstel van omvangrijke (bulky) schade aan het DNA, zoals thyminedimeren door UV-straling of adducten gevormd door grote chemische groepen. * **Mechanisme (in bacteriën, UVR-systeem; in mens, XPA-XPG):** 1. **UVR-AB (of XPA-XPC/HR23B in mens):** Herkennen de afwijking in de helixstructuur. 2. **UVR-C (of XPG/XPF in mens):** Een endonuclease dat aan beide zijden van de schade de fosfodiësterbindingen knipt. 3. **UVR-D (of helicase in mens):** Verwijdert het beschadigde oligonucleotide. 4. **DNA polymerase en ligase:** Vullen het gat op en sluiten de streng. * **Transcription-coupled repair (TCR):** NER is ook betrokken bij het herstel van schade die transcriptie blokkeert. Wanneer RNA polymerase op een beschadigde plek stuit, wordt dit mechanisme geactiveerd, wat verklaart waarom actieve genen sneller worden hersteld. * **Xeroderma pigmentosum:** Mutaties in de genen die coderen voor NER-eiwitten (bv. XPA-XPG) leiden tot deze zeldzame, erfelijke aandoening, gekenmerkt door extreme gevoeligheid voor zonlicht en een sterk verhoogd risico op huidkanker. #### 2.2.4 Mismatch repair (MMR) * **Doel:** Corrigeert fouten die optreden tijdens de DNA replicatie nadat de proefleesfunctie van DNA polymerase is voltooid. * **Principe:** Het systeem moet onderscheid maken tussen de ouderlijke streng (de originele streng) en de nieuw gesynthetiseerde dochterstreng. * **In prokaryoten:** Dit onderscheid wordt gemaakt door methylering van de ouderlijke streng (bv. op adenine in GATC-sequenties). De nieuwe streng is initieel niet gemethyleerd. * **In eukaryoten:** Het onderscheid is minder duidelijk, maar wordt deels gemaakt door de associatie met Okazaki fragmenten op de lagging strand. * **Mechanisme:** Het MMR-systeem detecteert de mismatch, identificeert de dochterstreng (gebaseerd op methylering of Okazaki fragmenten), knipt en verwijdert een segment van de dochterstreng dat de mismatch bevat, en vervolgens wordt het gat opgevuld door DNA polymerase en geligeerd door DNA ligase. #### 2.2.5 Translesie synthese (TLS) * **Doel:** Dit is geen direct herstelmechanisme, maar een 'bypass' mechanisme dat cellen toestaat DNA replicatie voort te zetten ondanks ernstige, niet-herstelbare schade aan de matrijsstreng. * **Mechanisme:** Tijdens ernstige DNA schade, vooral in prokaryoten (SOS-systeem) en eukaryoten, worden gespecialiseerde 'bypass' DNA polymerasen (bv. DNA polymerase $\eta$ (eta) in eukaryoten) gerekruteerd. Deze polymerasen kunnen repliceren op beschadigde matrijsstrengen, hoewel dit vaak gepaard gaat met de introductie van nieuwe fouten. * **Functie:** Het doel is om een complete dochterstreng te genereren, ook al is deze niet perfect, om zo de replicatie van het gehele genoom te voltooien en te voorkomen dat de cel in apoptose gaat. De schade aan de matrijsstreng zelf wordt niet hersteld. #### 2.2.6 Herstel van dubbelstrengs DNA-breuken (DSB) Dubbelstrengs DNA-breuken zijn zeer schadelijk en worden via verschillende mechanismen hersteld. * **Niet-homologe 'end-joining' (NHEJ):** * **Mechanisme:** Herkent de gebroken uiteinden en brengt deze direct samen met behulp van eiwitten zoals Ku80 en Ku70, gevolgd door DNA ligatie. * **Kenmerk:** Dit is een 'error-prone' mechanisme. Vaak worden nucleotiden verwijderd of toegevoegd aan de uiteinden, wat leidt tot inserties of deleties. * **Timing:** Treedt voornamelijk op tijdens G$_0$/G$_1$ fase, wanneer de chromosomen nog niet zijn gerepliceerd. * **Gevolg:** Kan leiden tot chromosoomfusies, bijvoorbeeld bij verlies van telomeren. * **Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA):** * **Mechanisme:** 1. Een 5'-exonuclease werkt aan de gebroken uiteinden om enkelstrengs overhangen te genereren. 2. Rad51 (een homoloog recombinatie eiwit) bindt aan het enkelstrengs DNA. 3. Het enkelstrengs DNA dringt de complementaire zusterchromatide binnen (D-loop formatie). 4. De gebroken streng wordt gerepliceerd, gebruikmakend van de zusterchromatide als matrijs. 5. Het gerepliceerde DNA dissocieert en wordt geligeerd. * **Kenmerk:** Dit is een 'error-free' herstelmechanisme. * **Timing:** Treedt op tijdens en na de S-fase, wanneer zusterchromatiden aanwezig zijn. * **Homologe recombinatie (HR):** * **Mechanisme:** Vergelijkbaar met SDSA, maar waarbij beide strengen van het gebroken DNA betrokken zijn bij de invasie van de zusterchromatide. Dit leidt tot de vorming van Holliday-junctions. * **Kenmerk:** Een 'error-free' herstelmechanisme. * **Timing:** Treedt op tijdens en na de S-fase. * **Resolutie van Holliday-junctions:** De Holliday-junctions kunnen op verschillende manieren worden opgelost ('same sense' of 'opposite sense' resolutie), wat kan leiden tot genetische uitwisseling tussen zusterchromatiden. > **Tip:** Het belangrijkste verschil tussen NHEJ en SDSA/HR is dat NHEJ fouten kan introduceren (error-prone), terwijl SDSA en HR foutenvrij herstel uitvoeren (error-free). SDSA en HR vereisen echter de aanwezigheid van een zusterchromatide. Wanneer deze afwezig is, is NHEJ de enige optie voor DSB-herstel, ondanks het risico op fouten. ### 2.3 Gevolgen van onherstelbare DNA schade Wanneer DNA schade niet succesvol kan worden hersteld, kan dit leiden tot celdood (apoptose) of, in het geval van somatische cellen, bijdragen aan celveroudering of de ontwikkeling van kanker. In geslachtscellen kan dit leiden tot erfelijke aandoeningen. --- **Belangrijke concepten om te onthouden:** * De constante dreiging van DNA schade door endogene en exogene factoren. * De diversiteit aan DNA herstelmechanismen die specifiek zijn voor verschillende soorten schade (BER voor kleine veranderingen, NER voor omvangrijke schade, MMR voor replicatiefouten, etc.). * Het cruciale belang van DSB-herstel (NHEJ, SDSA, HR) voor de genomische stabiliteit. * Het onderscheid tussen error-prone en error-free herstelmechanismen. * De link tussen DNA schade, herstel, en ernstige ziekten zoals kanker en veroudering. * De rol van telomeren in celveroudering en hun herstel door telomerase. --- # Homologe recombinatie en mobiele genetische elementen Dit hoofdstuk behandelt homologe recombinatie, essentieel voor zowel DNA-reparatie als voor de genetische variabiliteit tijdens de meiose, en introduceert mobiele genetische elementen (transposons) die de structuur en evolutie van genomen kunnen beïnvloeden. ### 3.1 Homologe recombinatie Homologe recombinatie is een proces waarbij genetisch materiaal wordt uitgewisseld tussen twee homologe DNA-moleculen of tussen zusterchromatiden. Het speelt een cruciale rol bij het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken en is een sleutelmechanisme tijdens de meiose. #### 3.1.1 Homologe recombinatie tijdens de meiose * Homologe recombinatie tijdens de meiose wordt geïnitieerd door dubbelstrengs DNA-breuken (ds-breuken). * Het enzym **Spo11** (een endonuclease) genereert deze ds-breuken en rekruteert enzymen die de 5'-uiteinden inkorten, waardoor 3'-overhangende uiteinden ontstaan. * **Rad51**, een enkelstrengs DNA-bindend eiwit, bindt aan deze 3'-overhangen. * Dit eiwit-DNA-complex initieert DNA-invasie in het homologe chromosoom (of zusterchromatide). * Het mechanisme omvat de vorming van **D-loops** en uiteindelijk **Holliday junctions**. * De resolutie van deze Holliday junctions kan op twee manieren gebeuren: "same sense resolution" of "opposite sense resolution", wat leidt tot uitwisseling van genetisch materiaal tussen niet-zusterchromatiden van homologe chromosomen. * Dit proces is cruciaal voor genetische variabiliteit. #### 3.1.2 Herstel van dubbelstrengs DNA-breuken via homologe recombinatie Homologe recombinatie is ook een belangrijk mechanisme voor het foutenvrij herstel van dubbelstrengs DNA-breuken. * **Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA)**: * Dit mechanisme treedt op wanneer zusterchromatiden beschikbaar zijn (tijdens en na de S-fase en vóór de mitose). * Het proces begint met 5'-exonuclease werking, gevolgd door binding van Rad51 aan het enkelstrengs DNA. * Invasie van de zusterchromatide vormt een D-loop. * De gebroken DNA-streng wordt vervolgens gerepliceerd, waarna dissociatie en ligatie plaatsvinden. * Dit proces is foutenvrij. * **Homologe recombinatie (HR)**: * Dit mechanisme is nauw verwant aan SDSA en omvat de vorming van Holliday junctions. * Beide strengen zijn betrokken bij de invasie en de vorming van de structuren. * Het leidt tot foutenvrij herstel en treedt op tijdens en na de S-fase. * De resolutie van Holliday junctions kan leiden tot uitwisseling van DNA-segmenten. * **Niet-homologe end-joining (NHEJ)**: * Dit is een alternatief mechanisme voor dsDNA-breuken dat niet afhankelijk is van homologie. * Het wordt gekenmerkt door de herkenning van de breuk door de Ku80 en Ku70 eiwitten, gevolgd door de inwerking van exonucleasen en DNA-ligase. * NHEJ is **niet foutenvrij** en kan leiden tot verlies van nucleotiden. * Het treedt voornamelijk op in de G0/G1-fase, wanneer zusterchromatiden nog niet beschikbaar zijn. > **Tip:** Hoewel SDSA foutenvrij herstel biedt, is het beperkt tot situaties waarin zusterchromatiden beschikbaar zijn. NHEJ is een meer universeel mechanisme voor dsDNA-breukherstel, maar ten koste van potentiële fouten. De cel kiest voor NHEJ om te overleven in plaats van te sterven door onherstelbare breuken. ### 3.2 Mobiele genetische elementen (transposons) Mobiele genetische elementen, ook wel transposons of "springende genen" genoemd, zijn DNA-sequenties die hun positie binnen het genoom kunnen veranderen. Deze mobiliteit kan leiden tot veranderingen in de genexpressie en structurele veranderingen van het genoom, wat bijdraagt aan evolutie. #### 3.2.1 Mechanismen van transpositie Er zijn twee hoofdmechanismen voor transpositie: 1. **Replicatieve transpositie (copy-paste)**: * Het transposon wordt gekopieerd en de kopie wordt op een nieuwe locatie ingebracht, terwijl het origineel op de oude locatie achterblijft. * Dit mechanisme is kenmerkend voor DNA-transposons en retrotransposons. 2. **Conservatieve transpositie (cut-paste)**: * Het transposon wordt uit de oude locatie "geknipt" en op een nieuwe locatie ingevoegd. Het origineel verdwijnt dus. * Dit mechanisme komt voornamelijk voor bij DNA-transposons. #### 3.2.2 Soorten transposons Transposons kunnen worden ingedeeld op basis van hun intermediair tijdens transpositie en hun autonomie: * **Intermediair DNA transposons**: * Gebruiken een DNA-molecuul als intermediair. * Veelvoorkomend in bacteriën, maar ook aanwezig in eukaryoten. * Conservatieve DNA-transposons coderen voor een **transposase**, het enzym dat de knip- en plakeffecten uitvoert. * In bacteriën kunnen ze samengesteld ("composite") zijn (bestaande uit twee transponeerbare elementen met daartussen een gen) of niet-samengesteld ("noncomposite"). * De insertie van een DNA-transposon leidt typisch tot een **target site duplicatie**, waarbij een korte sequentie van het gastheer-DNA twee keer voorkomt aan de zijden van het ingevoegde transposon. * **Retrotransposons**: * Gebruiken een RNA-molecuul als intermediair. * Voornamelijk voorkomend in eukaryoten, niet in bacteriën. * Ze repliceren via een proces dat lijkt op reverse transcriptie. * Ze produceren een RNA-kopie van zichzelf, die vervolgens wordt omgezet naar DNA door een **reverse transcriptase** enzym. Dit DNA wordt dan op een nieuwe locatie in het genoom geïntegreerd. * Retrotransposons vormen geen infectieuze virale partikels. * In het humane genoom vormen retrotransposons een aanzienlijk deel (meer dan 40%), zoals L1 retrotransposons en Alu sequenties. #### 3.2.3 Autonomie van transposons * **Autonome transposons**: * Coderen voor alle eiwitten die nodig zijn voor hun eigen transpositie (zoals transposase en reverse transcriptase). * **Niet-autonome transposons**: * Hebben de transpositie-eiwitten niet zelf en zijn afhankelijk van de aanwezigheid van autonome transposons in het genoom om te kunnen bewegen. #### 3.2.4 Rol en effecten van transposons * **Genoomvariabiliteit en evolutie**: Transposons dragen bij aan de genetische variabiliteit door inserties, deleties, duplicaties en herschikkingen in het genoom te veroorzaken. Ze kunnen ook zorgen voor exon-shuffling of duplicatie, wat leidt tot nieuwe eiwitstructuren en -functies. * **Genactivatie of -inactivatie**: De insertie van een transposon in of nabij een gen kan leiden tot inactivatie (als het in een coderend gebied valt) of tot veranderingen in genexpressie (als het in een regulatoir element valt). * **Ziekteveroorzaker**: Transpositie kan leiden tot genetische ziekten wanneer een transposon zich integreert in een essentieel gen of een cruciaal regulatoir element. > **Example:** L1 retrotransposons in het humane genoom kunnen soms actief zijn en zich verspreiden. Als zo'n transposon zich integreert in een gen dat betrokken is bij de bloedstolling, kan dit leiden tot bloedingsstoornissen. Alu sequenties, hoewel grotendeels niet-functioneel, kunnen ook bijdragen aan recombinatie tussen niet-homologe sequenties, wat tot chromosomale afwijkingen kan leiden. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | DNA replicatie | Het proces waarbij een DNA-molecuul wordt gekopieerd om twee identieke dochtermoleculen te vormen, essentieel voor celdeling en erfelijkheid. | | Semi-conservatieve replicatie | Een replicatiemodel waarbij elke nieuwe DNA-dubbelstreng bestaat uit één originele (ouderlijke) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng. | | DNA polymerase | Een enzym dat verantwoordelijk is voor de synthese van nieuwe DNA-strengen door nucleotiden aan een groeiende keten toe te voegen, met gebruik van een bestaande DNA-streng als matrijs. | | Leidende streng (leading strand) | De DNA-streng die continu wordt gesynthetiseerd in de 5’ naar 3’ richting, parallel aan de beweging van de replicatievork. | | Navolgende streng (lagging strand) | De DNA-streng die discontinu wordt gesynthetiseerd in korte fragmenten (Okazaki-fragmenten) in de 5’ naar 3’ richting, tegengesteld aan de beweging van de replicatievork. | | Okazaki-fragmenten | Korte DNA-fragmenten die worden gesynthetiseerd op de navolgende streng tijdens de DNA-replicatie, die later aan elkaar worden geligeerd. | | Proeflezing (proofreading) | Een correctiemechanisme van DNA polymerase waarbij verkeerd ingebouwde nucleotiden direct worden verwijderd door de 3’→5’ exonuclease activiteit, waardoor de nauwkeurigheid van de replicatie wordt verhoogd. | | Polymerasekettingreactie (PCR) | Een moleculair-biologische techniek die wordt gebruikt om miljoenen tot miljarden kopieën van een specifiek DNA-segment te maken door middel van cyclische replicatie met behulp van een thermobestendig DNA polymerase. | | Telomeren | Beschermende DNA-sequenties aan de uiteinden van eukaryote chromosomen die verkorting tijdens DNA-replicatie voorkomen en essentieel zijn voor chromosomale stabiliteit. | | Telomerase | Een enzym dat de telomeren verlengt door RNA als matrijs te gebruiken en reverse transcriptase activiteit te vertonen, wat cruciaal is voor de levensduur van prolifererende cellen. | | Mutatie | Een permanente verandering in de DNA-sequentie van een organisme, die kan ontstaan door replicatiefouten, chemische schade of straling. | | Endogene factoren | Factoren die van binnenuit het lichaam ontstaan, zoals fouten tijdens DNA-replicatie of spontane chemische modificaties van DNA-basen. | | Externe factoren (mutagenen) | Stoffen of stralingen van buitenaf die DNA-schade kunnen veroorzaken en mutaties kunnen induceren, zoals UV-straling, röntgenstraling, of bepaalde chemicaliën. | | Base Excision Repair (BER) | Een DNA-herstelmechanisme dat gericht is op het verwijderen van beschadigde, gemodificeerde of ontbrekende basen uit het DNA, gevolgd door de synthese van een nieuwe nucleotide. | | Nucleotide Excision Repair (NER) | Een DNA-herstelmechanisme dat grotere DNA-beschadigingen, zoals thyminedimeren of adducten, herstelt door een groter segment van de beschadigde streng te verwijderen en opnieuw te synthetiseren. | | Mismatch repair | Een DNA-herstelmechanisme dat verkeerd gepaarde basen detecteert die ontstaan zijn tijdens de DNA-replicatie en deze corrigeren om mutaties te voorkomen. | | Translesie synthese | Een noodherstelmechanisme waarbij speciale polymerasen beschadigde DNA-matrijzen kunnen passeren om replicatie te voltooien, hoewel dit vaak gepaard gaat met het introduceren van fouten. | | Dubbelstrengs DNA-breuk (dsDNA breuk) | Een ernstige vorm van DNA-schade waarbij beide strengen van de DNA-dubbelhelix op hetzelfde punt of dicht bij elkaar worden verbroken. | | Niet-homologe end-joining (NHEJ) | Een mechanisme voor het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken dat de gebroken uiteinden direct aan elkaar verbindt, vaak resulterend in kleine deleties of inserties. | | Homologe recombinatie (HR) | Een nauwkeurig DNA-herstelmechanisme voor dubbelstrengs DNA-breuken waarbij een intacte homologe sequentie (meestal de zusterchromatide) als matrijs wordt gebruikt om de breuk te herstellen zonder verlies van informatie. | | Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA) | Een mechanisme voor het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken dat gebruik maakt van een zusterchromatide als matrijs, vergelijkbaar met homologe recombinatie, maar zonder de vorming van Holliday-junctions. | | Homologe recombinatie tijdens meiose | Het proces waarbij genetisch materiaal tussen homologe chromosomen wordt uitgewisseld tijdens de meiose, wat bijdraagt aan genetische variatie. | | Transposons | Mobiele genetische elementen die hun positie in het genoom kunnen veranderen, ook wel "springende genen" genoemd, en kunnen bijdragen aan genetische diversiteit. | | DNA transposons | Mobiele genetische elementen die zich verplaatsen via een "cut-and-paste" (conservatief) of "copy-and-paste" (replicatief) mechanisme, gebruikmakend van een DNA-intermediair. | | Retrotransposons | Mobiele genetische elementen die zich verplaatsen via een "copy-and-paste" mechanisme met behulp van een RNA-intermediair, en die een significant deel van eukaryote genomen vormen. | | Genoom editing | Technieken zoals CRISPR/Cas9 die nauwkeurige wijzigingen aan het DNA van een organisme mogelijk maken, zoals het verwijderen, toevoegen of vervangen van specifieke DNA-sequenties. | | CRISPR/Cas9 | Een geavanceerd genoom editing systeem dat is afgeleid van een natuurlijk bacterieel afweersysteem, waarmee specifieke DNA-sequenties kunnen worden geknipt en aangepast. | | Sikkelcelanemie | Een erfelijke bloedaandoening veroorzaakt door een mutatie in het gen voor hemoglobine, wat leidt tot abnormaal gevormde rode bloedcellen. | | CAR-T celtherapie | Een vorm van immuuntherapie waarbij de T-cellen van een patiënt genetisch worden aangepast om kankercellen effectiever te herkennen en te bestrijden. |

# Basisprincipes van DNA-functie en eiwitsynthese Dit onderwerp verkent de essentiële processen van DNA-replicatie, transcriptie en translatie, de fundamentele mechanismen die genetische informatie omzetten in functionele eiwitten. ### 1.1 De functies van DNA DNA vervult twee cruciale functies binnen de cel: * **Zelfreplicatie (DNA-replicatie):** Het DNA-molecuul is in staat om zichzelf te kopiëren, wat essentieel is voor celdeling en de overdracht van genetische informatie. Dit proces vereist de activiteit van enzymen zoals helicase en DNA-polymerase. * **Synthese van RNA (Transcriptie):** DNA dient als matrijs voor de aanmaak van RNA-moleculen. Dit proces, genaamd transcriptie, wordt gekatalyseerd door RNA-polymerase en vindt plaats op de antisense streng van het DNA. ### 1.2 Eiwitsynthese: transcriptie en translatie De productie van eiwitten, ook wel eiwitsynthese genoemd, omvat twee belangrijke stappen: transcriptie en translatie. * **Transcriptie:** Tijdens de transcriptie wordt de genetische informatie van een gen op het DNA overgeschreven naar een messenger-RNA (mRNA)-molecuul. * **Translatie:** Het mRNA-molecuul verlaat de celkern (bij eukaryoten) en transporteert de genetische code naar de ribosomen in het cytoplasma. Hier wordt de sequentie van nucleotiden in het mRNA vertaald naar een sequentie van aminozuren, wat resulteert in de vorming van een polypeptideketen. Naarmate het ribosoom over het mRNA beweegt, groeit deze keten. De uiteindelijke opvouwing van de polypeptideketen leidt tot een functioneel eiwit. ### 1.3 De genetische code De genetische code is het systeem dat bepaalt hoe de sequentie van nucleotiden in DNA (en RNA) wordt omgezet in de sequentie van aminozuren in eiwitten. * **Codons:** De genetische code is gebaseerd op codons, dit zijn combinaties van drie nucleotiden. Met vier verschillende basen (Adenine, Guanine, Cytosine, en Thymine in DNA; Uracil vervangt Thymine in RNA) kunnen er $4^3 = 64$ verschillende combinaties van drie basen worden gevormd. * **Amino-aciden:** Er zijn 20 verschillende aminozuren die voorkomen in eiwitten. * **Overbodigheid van de code:** De 64 codons coderen voor de 20 aminozuren en signalen. Dit betekent dat de code overbodig is, oftewel synoniem: meerdere codons kunnen coderen voor hetzelfde aminozuur. * **Stopcodons:** Drie codons fungeren als stopcodons (UAA, UAG, UGA). Deze signaleren het einde van de translatie, waardoor de synthese van de polypeptideketen stopt. * **Startcodon:** Het codon AUG dient als startcodon en codeert tevens voor het aminozuur methionine. Dit markeert het beginpunt voor de translatie. > **Tip:** Het is cruciaal om te onthouden dat in RNA Uracil (U) Thymine (T) vervangt. ### 1.4 Opdracht: Vertaal DNA naar een peptide Een voorbeeld van het omzetten van een DNA-sequentie naar een peptide is als volgt: Gegeven is een antisense DNA-streng: 3’ GCG CGC GCG CTA TAA AGG AAT CCG AGG TAG TCC GAC ACT 5’ 1. **Omzetting naar mRNA:** De antisense streng wordt gebruikt als matrijs voor mRNA-synthese, waarbij T wordt vervangen door U. mRNA: 5’ CGC GCG CGC GAU AUU UCC UUA GGC UCC AUC AGG CUG UGA 3’ 2. **Vertaling naar aminozuren:** Elk codon van drie basen wordt vertaald naar een specifiek aminozuur. Peptide: Arginine – Alanine – Arginine – Asparagine – Isoleucine – Serine – Leucine – Glycine – Serine – Isoleucine – Arginine – Leucine - Stopcodon ### 1.5 Expressie van genen Niet alle genen in een cel zijn tegelijkertijd actief. Genexpressie verwijst naar het proces waarbij de informatie van een gen wordt gebruikt om een functioneel product, meestal een eiwit, te maken. * **Huishoudgenen:** Dit zijn genen die essentieel zijn voor de basisfuncties van een cel en zijn in vrijwel elke cel actief. * **Specifieke genen:** Deze genen zijn verantwoordelijk voor de specialisatie en differentiatie van een cel, waardoor cellen verschillende functies kunnen uitvoeren. Hun expressie is vaak plaats- en/of tijdsgebonden. * **Genexpressie bij prokaryoten:** Bij prokaryoten is de regulatie van genexpressie relatief eenvoudig. * **Genexpressie bij eukaryoten:** Eukaryote cellen hebben een complexere regulatie van genexpressie. Het proces van genexpressie begint met het plaatselijk ontrollen van het DNA, wat de toegang voor transcriptie-enzymen mogelijk maakt. De activering of deactivatie van genen wordt gestuurd door de aanwezigheid van specifieke moleculen. * **Introns en Exons:** In het DNA van hogere organismen (planten en dieren) bevinden zich niet-coderende sequenties (introns) afgewisseld met coderende sequenties (exons). * **Transcriptie naar pre-mRNA:** Bij eukaryoten wordt DNA eerst omgezet naar pre-mRNA, dat zowel introns als exons bevat. * **Splicing:** Vervolgens worden de introns uit het pre-mRNA geknipt (splicing) om een volwassen mRNA-molecuul te vormen dat alleen de exons bevat. * **Locatie van transcriptie en translatie:** Bij eukaryoten vindt transcriptie plaats in de celkern. Het resulterende mRNA verlaat de kern via kernporiën en gaat naar het cytoplasma, waar translatie op de ribosomen (vaak geassocieerd met het ruw endoplasmatisch reticulum) plaatsvindt. > **Tip:** De term "pre-mRNA" is specifiek van toepassing op eukaryoten en omvat het initiële transcript dat nog introns bevat. ### 1.6 Virussen en transcriptie Virussen maken gebruik van de cellulaire machinerie van de gastheercel om zich te repliceren. De manier waarop virussen hun genetische informatie omzetten in eiwitten varieert afhankelijk van hun type: * **DNA-virussen:** Viraal DNA wordt, net als het eigen DNA van de cel, getranscribeerd naar mRNA en vervolgens vertaald naar virale eiwitten. * **RNA-virussen:** * Sommige RNA-virussen zetten hun viraal RNA om naar mRNA onder invloed van een RNA-transcriptase enzym, waarna translatie volgt. * **Retrovirussen:** Deze virussen zetten hun viraal RNA eerst om naar dubbelstrengs DNA (cDNA of copy-DNA) met behulp van het enzym reverse-transcriptase. Dit cDNA wordt vervolgens geïntegreerd in het genoom van de gastheercel, waarna het getranscribeerd wordt naar mRNA en vertaald naar eiwitten. Het reverse-transcriptase enzym wordt ook technologisch gebruikt om mRNA om te zetten naar cDNA. --- # Genexpressie bij prokaryoten en eukaryoten Genexpressie is het proces waarbij genetische informatie, opgeslagen in DNA, wordt omgezet in functionele producten zoals eiwitten. ### 2.1 Basisprincipes van genexpressie * **DNA-replicatie:** Het DNA kan zichzelf kopiëren, wat essentiële enzymen zoals helicase en DNA-polymerase vereist. * **Transcriptie:** De synthese van RNA uit DNA, waarvoor RNA-polymerase nodig is. Transcriptie vindt plaats op de antisensestreng van het DNA. * **Translatie:** De synthese van eiwitten op basis van een mRNA-template, waarbij ribosomen en tRNA betrokken zijn. #### 2.1.1 De genetische code De genetische code is gebaseerd op codons, combinaties van drie nucleotiden. * Er zijn vier basen in RNA (Adenine, Uracil, Cytosine, Guanine). * Drie basen vormen een codon, wat resulteert in $4^3 = 64$ mogelijke codons. * Elk codon codeert voor een specifiek aminozuur (AZ), of een stopcodon. Er zijn 20 verschillende aminozuren. * De overige $64 - 20 = 44$ combinaties zijn de stopcodons (UAA, UAG, UGA) en synoniemen voor aminozuren. * Synoniemen betekenen dat één aminozuur door meer dan één codon kan worden gecodeerd (bv. SER kan gecodeerd worden door UCA, UCG, AGU). * Het startcodon is AUG. #### 2.1.2 Voorbeeld van transcriptie en translatie Gegeven de antisensestreng van DNA: $3’ \text{ GCG CGC GCG CTA TAA AGG AAT CCG AGG TAG TCC GAC ACT } 5’$ Het corresponderende mRNA is: $5’ \text{ CGC GCG CGC GAU AUU UCC UUA GGC UCC AUC AGG CUG UGA } 3’$ Dit mRNA wordt vertaald tot het peptide: Arg – Ala – Arg – Asp – Ile – Ser – Leu – Gly – Ser – Ile – Arg – Leu - stopcodon. > **Tip:** In RNA wordt Thymine (T) vervangen door Uracil (U). ### 2.2 Expressie van genen Niet alle genen in een cel zijn constant actief. * **Huishoudgenen (huisgenen):** Deze genen zijn in elke cel actief en coderen voor basisfuncties die nodig zijn voor het overleven van de cel. * **Specifieke genen:** Deze genen zijn verantwoordelijk voor de specialisatie van een cel (differentiatie) en zijn plaats- en/of tijdsgebonden. Een actief gen wordt tot expressie gebracht. > **Tip:** De bewering dat in alle cellen van een dier dezelfde mRNA-moleculen aanwezig zijn, is onjuist. Cellen bevatten wel hetzelfde genetisch materiaal, maar de expressie van specifieke genen leidt tot cel-specifieke mRNA-moleculen. Huishoudgenen zijn wel in alle cellen aanwezig, maar hun expressie kan variëren. ### 2.3 Genexpressie bij prokaryoten en eukaryoten #### 2.3.1 Verschillen in transcriptie * **Prokaryoten:** Transcriptie en translatie vinden gelijktijdig plaats in hetzelfde compartiment (cytoplasma), aangezien prokaryoten geen celkern hebben. * **Eukaryoten:** Transcriptie vindt plaats in de celkern, resulterend in pre-mRNA. Dit pre-mRNA wordt vervolgens verwerkt (splicing) voordat het naar het cytoplasma wordt getransporteerd voor translatie. #### 2.3.2 Introns en exons bij eukaryoten Het DNA van hogere dieren en planten bevat niet-coderende sequenties genaamd **introns** (intermediaire stukken) en coderende sequenties genaamd **exons**. * Tijdens de transcriptie wordt het gehele gen, inclusief introns en exons, omgezet in **pre-mRNA**. * Daarna worden de introns uit het pre-mRNA geknipt (een proces genaamd **splicing**), waarna de exons aan elkaar worden geplakt om **mRNA** te vormen. > **Tip:** De bewering dat de aanmaak van een eiwit op basis van mRNA in de celkern plaatsvindt, is onjuist voor eukaryoten. In eukaryoten vindt transcriptie in de celkern plaats (vorming van mRNA), waarna het mRNA naar het cytoplasma gaat voor translatie door ribosomen op het ruw endoplasmatisch reticulum (RER). ### 2.4 Transcriptie bij virussen Virussen hebben verschillende mechanismen voor transcriptie, afhankelijk van hun genetisch materiaal. * **DNA-virussen:** Viraal DNA wordt getranscribeerd naar mRNA, dat vervolgens wordt vertaald naar eiwitten. * **RNA-virussen:** * Viraal RNA wordt, onder invloed van RNA-transcriptase, omgezet naar mRNA en vervolgens vertaald. * **Retrovirussen:** Viraal RNA wordt, onder invloed van het enzym **reverse-transcriptase**, omgezet naar DNA. Dit DNA wordt vervolgens getranscribeerd naar mRNA en vertaald. * **Reverse-transcriptase** wordt ook technologisch gebruikt om mRNA om te zetten naar dubbelstrengig DNA, ook wel **cDNA** (complementair DNA) genoemd. --- # Virussen en hun transcriptieprocessen Virussen gebruiken verschillende strategieën om hun genetische materiaal te repliceren en eiwitten te synthetiseren, waarbij ze variëren afhankelijk van of ze DNA of RNA als genetisch materiaal hebben, en specifieke enzymen inzetten zoals reverse-transcriptase. ### 3.1 Virale genexpressie: DNA- en RNA-virussen Virussen moeten hun genetische informatie omzetten naar eiwitten om zich te vermenigvuldigen. De methoden die ze hiervoor gebruiken, hangen af van het type genetisch materiaal van het virus. #### 3.1.1 DNA-virussen DNA-virussen volgen in principe dezelfde weg als cel-eigen DNA voor eiwitsynthese. Het virale DNA wordt getranscribeerd naar messenger-RNA (mRNA) door het RNA-polymerase van de gastheercel. Dit mRNA wordt vervolgens in het cytoplasma getransleerd naar virale eiwitten door de ribosomen van de gastheer. #### 3.1.2 RNA-virussen RNA-virussen hebben meer diverse transcriptieprocessen: * **RNA-transcriptie:** Sommige RNA-virussen gebruiken virale RNA als sjabloon om mRNA te produceren. Dit proces vereist een viraal enzym, RNA-transcriptase (ook wel RNA-afhankelijk RNA-polymerase genoemd), dat het virale RNA omzet naar mRNA. Dit mRNA wordt vervolgens getransleerd naar eiwitten. * **Retrovirussen:** Deze virussen hebben een unieke strategie waarbij hun RNA-genoom eerst wordt omgezet naar DNA. Dit gebeurt met behulp van het enzym **reverse-transcriptase**, dat aanwezig is in het virion. * Het virale RNA wordt door reverse-transcriptase omgezet naar een enkelstrengige DNA-streng. * Vervolgens wordt deze enkelstrengige DNA-streng gebruikt als sjabloon om een dubbelstrengige DNA-kopie te maken, ook wel **complementair DNA (cDNA)** genoemd. * Dit virale cDNA wordt geïntegreerd in het genoom van de gastheercel. * Vanaf dit geïntegreerde cDNA wordt vervolgens, net als bij een gewoon gen, mRNA getranscribeerd. * Dit mRNA wordt tenslotte in het cytoplasma getransleerd naar virale eiwitten. > **Tip:** Reverse-transcriptase is een cruciaal enzym voor retrovirussen en is ook van groot technologisch belang. Het wordt gebruikt om mRNA om te zetten naar cDNA, wat nuttig is voor moleculair biologisch onderzoek, zoals het maken van cDNA-bibliotheken. #### 3.1.3 Expressie van genen bij virussen Net als bij cellen is genexpressie bij virussen het proces waarbij de genetische informatie van een gen wordt omgezet in een functioneel product, meestal een eiwit. * **Niet-coderend DNA:** Een deel van het DNA van organismen (en potentieel ook van sommige virussen) kan niet direct coderen voor eiwitten. Bij eukaryoten worden deze niet-coderende sequenties **introns** genoemd, terwijl de coderende sequenties **exons** worden genoemd. Het proces van **splicing** verwijdert de introns uit het pre-mRNA voordat het definitieve mRNA voor translatie beschikbaar is. Hoewel dit proces primair met eukaryotische genen geassocieerd wordt, is het relevant om te begrijpen dat genexpressie niet altijd een directe één-op-één omzetting van DNA naar eiwit is. * **Plaats en tijd van expressie:** Genexpressie kan plaats- en/of tijdsgebonden zijn. Dit betekent dat bepaalde genen alleen actief zijn in specifieke celtypes of op bepaalde momenten in de ontwikkeling. Bij virussen is de expressie van virale genen gericht op de replicatie en assemblage van nieuwe virionen binnen de geïnfecteerde gastheercel. * **Verschil peptide en eiwit:** Een peptide is een korte keten van aminozuren. Een eiwit is een langer, functioneel molecuul dat kan bestaan uit één of meerdere peptideketens die zich op specifieke manieren opvouwen. De synthese op het ribosoom resulteert initieel in een peptideketen, die vervolgens verder kan worden gemodificeerd en opgevouwen tot een functioneel eiwit. > **Tip:** Onthoud dat de transcriptie bij eukaryoten (inclusief de celkern van de gastheer bij virale infecties) plaatsvindt voordat het mRNA het cytoplasma bereikt voor translatie. Bij prokaryoten, die geen celkern hebben, gebeuren transcriptie en translatie grotendeels tegelijkertijd. Virussen die eukaryote cellen infecteren, volgen de transcriptie-/translatie-locaties van de gastheercel. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | DNA Replicatie | Het proces waarbij een DNA-molecuul een exacte kopie van zichzelf maakt, essentieel voor celdeling en erfelijkheid. Dit proces vereist enzymen zoals helicase en DNA polymerase. | | Transcriptie | Het proces waarbij de genetische informatie van een DNA-streng wordt overgezet naar een mRNA-molecuul. Dit gebeurt onder invloed van RNA polymerase en vindt plaats op de antisense-streng. | | Translatie | Het proces waarbij de genetische code op een mRNA-molecuul wordt omgezet in een reeks aminozuren om een eiwit te vormen. Ribosomen en tRNA spelen hierbij een cruciale rol. | | Antisense-streng | De DNA-streng die dient als mal voor de synthese van mRNA tijdens transcriptie. Deze streng is complementair aan de mRNA-sequentie. | | Sense-streng | De DNA-streng die de coderende sequentie van een gen bevat. De sequentie van de sense-streng is vergelijkbaar met die van het mRNA, met uracil (U) in plaats van thymine (T). | | Helicase | Een enzym dat de dubbele helix van DNA ontwindt door de waterstofbruggen tussen de basen te verbreken, wat essentieel is voor zowel replicatie als transcriptie. | | DNA polymerase | Een enzym dat betrokken is bij DNA-replicatie. Het synthetiseert nieuwe DNA-moleculen door nucleotiden aan een bestaande DNA-streng toe te voegen. | | RNA polymerase | Een enzym dat betrokken is bij transcriptie. Het synthetiseert een RNA-molecuul door nucleotiden aan te rijgen volgens de sequentie van een DNA-template. | | mRNA | Messenger RNA (mRNA) is een enkelstrengs RNA-molecuul dat de genetische code van een gen van het DNA naar het ribosoom transporteert om de eiwitsynthese te instrueren. | | Peptideketen | Een reeks aminozuren die met elkaar verbonden zijn door peptidebindingen, gevormd tijdens translatie op het ribosoom. Dit is de voorloper van een eiwit. | | Eiwitsynthese | Het gehele proces waarbij eiwitten worden geproduceerd, bestaande uit transcriptie (DNA naar RNA) en translatie (RNA naar eiwit). | | Genetische code | Het systeem dat de volgorde van nucleotiden in DNA en RNA relateert aan de volgorde van aminozuren in eiwitten. De code is opgebouwd uit codons. | | Codon | Een sequentie van drie opeenvolgende nucleotiden op een mRNA-molecuul die codeert voor een specifiek aminozuur of een stopsein tijdens de eiwitsynthese. | | Aminoacid (AZ) | De bouwsteen van eiwitten. Er zijn 20 verschillende standaard aminozuren die voorkomen in eiwitten. | | Stopcodon | Een codon op het mRNA dat het einde van de eiwitsynthese aangeeft. De drie stopcodons zijn UAA, UAG en UGA. | | Startcodon | Het codon op het mRNA dat de start van de eiwitsynthese aangeeft. Het startcodon is meestal AUG, wat ook codeert voor het aminozuur methionine. | | Huishoudgenen | Genen die constant actief zijn in bijna alle cellen van een organisme, omdat ze coderen voor basisfuncties die nodig zijn voor het overleven van de cel. | | Specifieke genen | Genen die alleen in bepaalde celtypen of op bepaalde momenten actief zijn. Ze zijn verantwoordelijk voor de specialisatie en differentiatie van cellen. | | Genexpressie | Het proces waarbij de genetische informatie in een gen wordt gebruikt om een functioneel product, meestal een eiwit, te produceren. | | Prokaryoten | Eencellige organismen zonder celkern of andere membraangebonden organellen. Hun genetisch materiaal bevindt zich in het cytoplasma. | | Eukaryoten | Organismen waarvan de cellen een celkern en andere membraangebonden organellen bevatten. | | pre-mRNA | Het onbewerkte RNA-transcript dat wordt gevormd tijdens de transcriptie in eukaryoten. Het bevat zowel introns als exons. | | Introns | Niet-coderende DNA-sequenties binnen een gen die tijdens de transcriptie worden overgeschreven naar pre-mRNA, maar die vervolgens uit het pre-mRNA worden geknipt door splicing. | | Exons | Coderende DNA-sequenties binnen een gen die worden overgeschreven naar pre-mRNA en behouden blijven na splicing om de uiteindelijke mRNA-sequentie te vormen. | | Splicing | Het proces in eukaryote cellen waarbij introns uit het pre-mRNA worden verwijderd en de overgebleven exons worden samengevoegd om een volwassen mRNA-molecuul te vormen. | | Celkern | Een organel in eukaryote cellen dat het genetisch materiaal (DNA) bevat en waar de transcriptie plaatsvindt. | | Cytoplasma | Het deel van de cel buiten de celkern, waarin zich de ribosomen bevinden waar de translatie plaatsvindt. | | Reverse-transcriptase | Een enzym dat RNA als template gebruikt om DNA te synthetiseren. Het komt voor in retrovirussen en wordt technologisch gebruikt om mRNA om te zetten naar cDNA. | | cDNA (copy-DNA) | Dubbelstrengs DNA dat wordt gesynthetiseerd uit een mRNA-template met behulp van reverse-transcriptase. |