Molbio H17.pptx

# DNA replicatie DNA replicatie is het proces waarbij een DNA-molecuul wordt gekopieerd, wat essentieel is voor de celdeling en de overdracht van genetische informatie. ## 1. Het proces van DNA replicatie ### 1.1 Semi-conservatieve aard DNA-replicatie is semi-conservatief. Dit betekent dat bij elke replicatiecyclus elke nieuwe DNA-dubbelstreng bestaat uit één oude (parentale) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng. Het Meselson-Stahl experiment, waarbij bacteriën werden gekweekt in media met verschillende isotopen van stikstof ($^{15}$N en $^{14}$N) en het DNA vervolgens werd geanalyseerd via dichtheidsgradiëntcentrifugatie, toonde dit principe aan. Na één replicatiecyclus ontstond een hybride DNA-band met een dichtheid tussen de zware en lichte streng, wat wijst op de incorporatie van beide isotopen in de nieuwe strengen. ### 1.2 De rol van DNA polymerasen DNA polymerasen zijn enzymen die de synthese van DNA katalyseren. Ze voegen nieuwe deoxynucleotiden toe aan het 3'-hydroxyluiteinde van een groeiende DNA-keten, waardoor de fosfodiësterbindingen worden gevormd. Deze reactie is gekoppeld aan de hydrolyse van fosfoanhydridebindingen in de deoxynucleoside trifosfaten (dNTPs), wat energie levert. * **Reactie:** $$(dNMP)_n + dNTP \rightarrow (dNMP)_{n+1} + PP_i$$ De hydrolyse van pyrophosfaat ($PP_i$) tot anorganisch fosfaat ($P_i$) drijft de reactie verder aan: $$PP_i + H_2O \rightarrow 2P_i$$ Er zijn meerdere soorten DNA polymerasen. In prokaryoten is DNA polymerase III essentieel voor de replicatie, terwijl in eukaryoten vier hoofdtypen worden onderscheiden. ### 1.3 Leidende en navolgende strengen DNA-synthese vindt altijd plaats in de 5' naar 3'-richting. Omdat de twee strengen van de DNA-dubbelhelix antiparallel lopen, verloopt de replicatie op de ene streng continu (de leidende streng) en op de andere discontinu (de navolgende streng). * **Leidende streng:** Synthese verloopt continu in de richting van de replicatievork. * **Navolgende streng:** Synthese verloopt discontinu in korte fragmenten, bekend als Okazaki-fragmenten. Deze fragmenten worden later aan elkaar geligeerd door DNA-ligase. ### 1.4 Proeflezen (proofreading) DNA polymerasen hebben een ingebouwde proefleesfunctie, waarbij ze via hun 3' $\rightarrow$ 5' exonuclease activiteit verkeerd ingebouwde nucleotiden kunnen verwijderen. Dit verlaagt de foutenmarge van DNA-synthese aanzienlijk, van ongeveer 1 op 100.000 tot 1 op 10.000.000 basen. ### 1.5 Bidirectionele replicatie DNA-replicatie verloopt meestal bidirectioneel vanuit een specifiek beginpunt, de 'origin of replication' (ORI). Dit resulteert in de vorming van twee replicatievorken die zich in tegenovergestelde richtingen bewegen. ## 2. Initiatie en timing van replicatie ### 2.1 Replicatie bij bacteriën * **Origin of replication (ORI):** Bij bacteriën, zoals *E. coli*, begint de replicatie bij een enkel, AT-rijk specifiek DNA-sequentiëra (OriC). * **Initiatie:** Initiatorproteïnen, zoals DnaA, binden aan de ORI, wat leidt tot het ontwinden van de DNA-helix. Single-Strand Binding (SSB) eiwitten stabiliseren de enkelstrengige DNA-regio's en voorkomen re-hybridisatie. DnaB (een DNA-helicase) wordt gerecruteerd, wat de bidirectionele replicatie mogelijk maakt. * **Replicatiefactoren:** Primase synthetiseert korte RNA-primers. DNA polymerase III verlengt deze primers met DNA. DNA polymerase I verwijdert de RNA-primers (via 5' $\rightarrow$ 3' exonuclease activiteit) en vult de resulterende gaten op met DNA. DNA ligase sluit de nick tussen de Okazaki-fragmenten. Helicases ontwinden het DNA en topoisomerases verlichten de torsiestress. Alle eiwitten die betrokken zijn bij replicatie vormen samen het replisoom. ### 2.2 Replicatie bij eukaryoten * **Origins of replication (ORIs):** Eukaryoten hebben meerdere ORIs op hun chromosomen (ongeveer 20.000 in gist). Deze replicatie-eenheden worden replicons genoemd. * **Initiatie:** De initiatie verloopt via de vorming van een pre-replicatiecomplex (pre-RC) tijdens de G1-fase. Dit complex bestaat uit de Origin Recognition Complex (ORC), helicase-laders en het MCM-complex (Mini-Chromosome Maintenance, een helicase). Aan het begin van de S-fase wordt het pre-RC omgevormd tot een replicatiecomplex, waarna de replicatie begint. * **Replicatiefactoren:** Vergelijkbaar met bacteriën, maar er zijn verschillen in de DNA polymerasen en de verwijdering van RNA-primers. RNA-primers worden verwijderd door endonuclease RNAse H en exonuclease FEN1. Chromatine-remodelleringscomplexen zijn ook betrokken om de toegang van de replicatiemachinerie tot het DNA te faciliteren. * **Timing van replicatie:** De lengte van de S-fase wordt bepaald door het aantal replicons en de snelheid waarmee pre-RCs worden geactiveerd. Euchromatine wordt eerder gerepliceerd dan heterochromatine. ### 2.3 Het probleem van chromosoomuiteinden (telomeren) Bij eukaryoten kan het einde van de lineaire chromosomen niet volledig worden gerepliceerd, wat leidt tot verkorting van de telomeren bij elke replicatiecyclus. Telomeren bestaan uit repetitieve sequenties (bij mensen TTAGGG). Na verloop van tijd, wanneer de telomeren te kort worden, kan dit leiden tot cel senescentie of apoptose. Telomerase, een enzym met reverse transcriptase activiteit, kan telomeren verlengen en is actief in proliferende cellen zoals stamcellen, geslachtscellen en kankercellen. ## 3. Polymerasekettingreactie (PCR) PCR is een moleculair-biologische techniek die het mogelijk maakt om snel grote aantallen identieke kopieën van een specifiek DNA-segment te produceren. Het proces omvat cyclische herhalingen van: 1. **Denaturatie:** Verwarmen tot hoge temperaturen om het dubbelstrengs DNA te scheiden. 2. **Hybridisatie:** Afkoelen om synthetische primers te laten binden aan de enkelstrengige DNA-matrijzen. 3. **Extensie:** Verwarmen tot de optimale temperatuur voor een hittebestendig DNA polymerase om de primers te verlengen en nieuwe DNA-strengen te synthetiseren. Elke cyclus verdubbelt de hoeveelheid doel-DNA, wat resulteert in een exponentiële toename. ## 4. Vergelijking prokaryote en eukaryote replicatie | Kenmerk | Bacteriën | Eukaryoten | | :-------------------------- | :------------------------------------------------- | :---------------------------------------------------------------------- | | Aantal origins of replication | Eén (OriC) | Meerdere (ca. 20.000) | | RNA-primer verwijdering | DNA polymerase I | RNAse H en FEN1 | | Chromatine | Afwezig | Aanwezig; nucleosomen moeten worden gereassembleerd | | Replicatiesnelheid | Ca. 50.000 basen/minuut | Ca. 2.000 basen/minuut | | DNA polymerasen | DNA polymerase III (essentieel), DNA polymerase I | Meerdere (bv. DNA polymerase $\delta$, $\epsilon$, $\alpha$, $\beta$) | | Chromosoomuiteinden | Circulaire chromosomen, geen telomeerprobleem | Lineaire chromosomen, telomeerverkorting | **Gelijkenissen:** * Gebruik van origins of replication. * Ontwinding van DNA door helicase. * Bidirectionele replicatie. * Gebruik van vergelijkbare klassen van enzymen: DNA polymerasen, primase, ligase, topoisomerase. * Semi-conservatieve replicatie. * Synthese van leidende en navolgende strengen. ## 5. De polymerasekettingreactie (PCR) in detail PCR maakt het mogelijk om een specifiek DNA-segment exponentieel te amplificeren. Het vereist: * Een DNA-matrijs die het te amplificeren segment bevat. * Twee synthetische primers die complementair zijn aan de uiteinden van het doel-DNA-segment. * Een hittebestendig DNA polymerase, zoals Taq polymerase. * Deoxynucleoside trifosfaten (dNTPs). * Een bufferoplossing met de juiste ionische sterkte en pH. De cycli van denaturatie, hybridisatie en extensie worden herhaald. Na 20-30 cycli is het doel-DNA-segment miljoenen malen vermenigvuldigd. > **Tip:** PCR is een fundamentele techniek in moleculaire biologie voor DNA-amplificatie, diagnose van ziekten, forensisch onderzoek en genetische analyse. ## 6. Oorzaken van mutaties en DNA-schade Mutaties zijn permanente veranderingen in de DNA-sequentie. Ze kunnen ontstaan door endogene factoren (bv. replicatiefouten) of externe factoren (mutagenen). ### 6.1 Endogene oorzaken * **Replicatiefouten:** DNA polymerasen maken fouten, hoewel proeflezen de frequentie sterk vermindert. Fouten kunnen optreden door: * Tautomeren van ringbasen: Zeldzame resonantiestructuren van basen kunnen leiden tot onjuiste basenparing tijdens replicatie. * Strand slippage: In repetitieve DNA-sequenties kan het polymerase 'slippen', wat leidt tot inserties of deleties van nucleotiden. * Spontane chemische modificaties: * Depurineringen: Verlies van een purinebasis door hydrolyse van de glycosidebinding, wat resulteert in een AP-site (apurine/apyrimidine). Tijdens replicatie wordt hier vaak een 'A' ingebouwd. * Deamineringen: Verlies van een aminogroep (bv. cytosine wordt uracil). * Oxidatie: Basen kunnen worden geoxideerd door reactieve zuurstofsoorten (ROS), bv. guanine wordt 8-oxoguanine. ### 6.2 Externe oorzaken (mutagenen) * **Chemische mutagenen:** * Ringbase-analogen: Stoffen die lijken op DNA-basen en in het DNA kunnen worden ingebouwd (bv. 5-bromo-deoxyuridine). * Ringbase-modificerende agentia: Stoffen die de structuur van basen veranderen (bv. aflatoxine, wat leidt tot depurinering). * Intercalerende agentia: Stoffen die zich tussen DNA-basen plaatsen, de dubbele helix structuur verstoren en kunnen leiden tot inserties of deleties. * **Fysische mutagenen:** * UV-straling: Veroorzaakt thyminedimeren, die replicatie kunnen blokkeren. * Ioniserende straling (bv. X-stralen): Veroorzaakt DNA-breuken en andere schade. ## 7. DNA-herstelmechanismen Cellen beschikken over diverse mechanismen om DNA-schade te herstellen: ### 7.1 Fotolyase Herstelt thyminedimeren door energie uit zichtbaar licht te gebruiken. Dit mechanisme komt voor bij prokaryoten en sommige eukaryoten, maar niet bij mensen. ### 7.2 Base Excision Repair (BER) Herstelt gewijzigde of missende basen. Een DNA-glycosylase verwijdert de beschadigde base. Vervolgens worden de fosfodiësterruggegraad door een endonuclease en lyase bewerkt, waarna DNA-polymerase het ontbrekende nucleotide aanvult en DNA-ligase de streng sluit. ### 7.3 Nucleotide Excision Repair (NER) Herstelt grotere DNA-laesies, zoals thyminedimeren en omvangrijke basemodificaties. Een complex van eiwitten (bv. UVR-AB in bacteriën, XPA-XPG in mensen) herkent de afwijking. Endonucleases knippen aan beide zijden van de laesie, waarna een helicase het beschadigde nucleotide verwijdert. DNA-polymerase vult de kloof en ligase sluit deze. NER kan ook 'transcription-coupled repair' uitvoeren, waarbij transcriptie-stoppende laesies sneller worden hersteld. ### 7.4 Mismatch Repair (MMR) Detecteert en corrigeert fouten die ontstaan tijdens de replicatie (mismatches) die niet door de proefleesfunctie van DNA polymerase zijn opgemerkt. In prokaryoten identificeert het systeem de parentale streng via methylering van A in GATC-sequenties. In eukaryoten worden Okazaki-fragmenten gebruikt om de nieuwe streng te identificeren. ### 7.5 Translesie synthese (TLS) Dit is geen echt herstelmechanisme, maar een 'bypass'-strategie waarbij speciale DNA polymerasen (bv. DNA polymerase $\eta$ in eukaryoten) beschadigde matrijsstrengen kunnen repliceren. Dit kan fouten introduceren, maar maakt replicatie mogelijk ondanks de schade. ### 7.6 Herstel van dubbelstrengs DNA-breuken * **Non-homologous end-joining (NHEJ):** Verbindt de twee gebroken uiteinden direct aan elkaar. Dit proces kan leiden tot nucleotideverlies of inserties, en is daarom 'error-prone'. Het vindt plaats in de G1-fase. * **Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA):** Een foutenvrij herstelmechanisme dat gebruik maakt van de zusterchromatide als matrijs. Het proces omvat 5'-exonuclease activiteit, invasie van de zusterchromatide, replicatie en ligatie. Treedt op tijdens en na de S-fase. * **Homologe recombinatie (HR):** Een zeer nauwkeurig herstelmechanisme dat ook de zusterchromatide gebruikt als matrijs. Het omvat de vorming van Holliday junctions en de resolutie ervan. Vindt plaats tijdens en na de S-fase. > **Tip:** Bij onherstelbare DNA-schade treedt geprogrammeerde celdood (apoptose) op om de celcyclus te beëindigen en verdere problemen te voorkomen. --- # DNA schade en foutenherstel Dit hoofdstuk behandelt de oorzaken van DNA schade, de verschillende mechanismen die cellen gebruiken om deze schade te herstellen, en de gevolgen van onherstelbare schade. ### 2.1 Oorzaken van DNA schade DNA schade kan ontstaan door zowel endogene (interne) als exogene (externe) factoren. De incidentie van mutaties is hoog, maar DNA herstelmechanismen beperken de accumulatie van deze fouten aanzienlijk. #### 2.1.1 Endogene factoren Endogene factoren zijn processen die inherent zijn aan de celcyclus en het metabolisme. * **Replicatiefouten:** Ondanks de proefleesfunctie van DNA polymerasen (reductie van foutenmarge tot ca. 1 op 10.000.000), kunnen fouten optreden. * **Tautomeren van ringbasen:** Zeldzame resonantiestructuren van basen kunnen leiden tot verkeerde basenparing tijdens de replicatie. * **Strand slippage:** Bij repetitief DNA kan het DNA polymerase 'slippen', waardoor een deel van het DNA dubbel wordt gerepliceerd of overgeslagen. Dit kan leiden tot expansie of deletie van trinucleotiden-repeats. * **Spontane chemische modificaties:** * **Depurinering:** Verlies van een purinebase door hydrolyse van de glycosidische binding (ca. 1000 keer per cel per dag). Dit resulteert in een AP (apurine/apyrimidine) site, waarop tijdens replicatie meestal een adenine wordt toegevoegd. * **Deaminering:** Spontane hydrolyse van een aminogroep op een base (ca. 100 keer per cel per dag). Cytosine kan deamineren tot uracil (dat vervolgens tot adenine kan deamineren), wat leidt tot mismatch. * **Oxidatie:** Reactieve zuurstofsoorten (ROS) kunnen basen oxideren, bijvoorbeeld guanine tot 8-oxoguanine. #### 2.1.2 Exogene factoren Externe agentia kunnen DNA beschadigen. * **Chemische mutagenen:** * **Ringbase-analogen:** Stoffen die lijken op ringbasen en kunnen worden ingebouwd in DNA, zoals 5-bromo-deoxyuridine (BrdU), een analoog van uracil. Dit verhoogt de kans op tautomere shifts. * **Ringbase-modificerende agentia:** Stoffen die de chemische structuur van basen veranderen, zoals aflatoxine, wat kan leiden tot adductvorming en verzwakking van de glycosidische binding. Sommige agentia kunnen DNA polymerase blokkeren. * **Intercalerende agentia:** Hydrofobe stoffen met ringstructuren die zich tussen de basenparen in de dubbele helix invoegen, wat de structuur verandert en kan leiden tot breuken, deleties of inserties tijdens herstel. Voorbeelden zijn ethidiumbromide en proflavine. * **Fysische mutagenen:** * **UV-straling:** Veroorzaakt de vorming van thyminedimeren (bv. cyclobutane pyrimidine dimers), die de replicatiemachine blokkeren en tot DNA-breuken kunnen leiden. * **Ioniserende straling (bv. röntgenstraling):** Deze straling is zeer schadelijk en kan enkel- en dubbelstrengs DNA-breuken veroorzaken. ### 2.2 DNA herstelmechanismen Cellen beschikken over een arsenaal aan herstelmechanismen om verschillende soorten DNA schade te repareren. #### 2.2.1 Fotolyase * Dit enzym herstelt thyminedimeren veroorzaakt door UV-straling. * Het komt voor in prokaryoten en sommige eukaryoten (niet bij de mens). * Het gebruikt energie van zichtbaar licht om FADH$_2$ te reduceren, dat vervolgens als elektronendonor de pyrimidinedimeer breekt. Fotolyase is aanwezig in sommige zonnecrèmes. #### 2.2.2 Base excision repair (BER) * **Doel:** Herstel van gewijzigde of missende ringbasen. * **Stappen:** 1. **DNA glycosylase:** Verwijdert de beschadigde base door de glycosidische binding te verbreken. 2. **Endonuclease:** Breekt de fosfodiësterbinding naast de apurine/apyrimidine (AP) site. 3. **Lyase:** Verwijdert de resterende 5'-deoxyribose fosfaat groep. 4. **DNA polymerase (5'->3'):** Vult het gat met het juiste nucleotide op basis van de complementaire streng. 5. **DNA ligase:** Verbindt de uiteinden door een fosfodiësterbinding te katalyseren. * **Belang:** Dit mechanisme verklaart waarom DNA thymine bevat in plaats van uracil. Deaminatie van cytosine produceert uracil. Als uracil een natuurlijke DNA-base zou zijn, zou het verschil tussen de correcte en de foutieve base niet herkend kunnen worden. #### 2.2.3 Nucleotide excision repair (NER) * **Doel:** Herstel van omvangrijke (bulky) schade aan het DNA, zoals thyminedimeren door UV-straling of adducten gevormd door grote chemische groepen. * **Mechanisme (in bacteriën, UVR-systeem; in mens, XPA-XPG):** 1. **UVR-AB (of XPA-XPC/HR23B in mens):** Herkennen de afwijking in de helixstructuur. 2. **UVR-C (of XPG/XPF in mens):** Een endonuclease dat aan beide zijden van de schade de fosfodiësterbindingen knipt. 3. **UVR-D (of helicase in mens):** Verwijdert het beschadigde oligonucleotide. 4. **DNA polymerase en ligase:** Vullen het gat op en sluiten de streng. * **Transcription-coupled repair (TCR):** NER is ook betrokken bij het herstel van schade die transcriptie blokkeert. Wanneer RNA polymerase op een beschadigde plek stuit, wordt dit mechanisme geactiveerd, wat verklaart waarom actieve genen sneller worden hersteld. * **Xeroderma pigmentosum:** Mutaties in de genen die coderen voor NER-eiwitten (bv. XPA-XPG) leiden tot deze zeldzame, erfelijke aandoening, gekenmerkt door extreme gevoeligheid voor zonlicht en een sterk verhoogd risico op huidkanker. #### 2.2.4 Mismatch repair (MMR) * **Doel:** Corrigeert fouten die optreden tijdens de DNA replicatie nadat de proefleesfunctie van DNA polymerase is voltooid. * **Principe:** Het systeem moet onderscheid maken tussen de ouderlijke streng (de originele streng) en de nieuw gesynthetiseerde dochterstreng. * **In prokaryoten:** Dit onderscheid wordt gemaakt door methylering van de ouderlijke streng (bv. op adenine in GATC-sequenties). De nieuwe streng is initieel niet gemethyleerd. * **In eukaryoten:** Het onderscheid is minder duidelijk, maar wordt deels gemaakt door de associatie met Okazaki fragmenten op de lagging strand. * **Mechanisme:** Het MMR-systeem detecteert de mismatch, identificeert de dochterstreng (gebaseerd op methylering of Okazaki fragmenten), knipt en verwijdert een segment van de dochterstreng dat de mismatch bevat, en vervolgens wordt het gat opgevuld door DNA polymerase en geligeerd door DNA ligase. #### 2.2.5 Translesie synthese (TLS) * **Doel:** Dit is geen direct herstelmechanisme, maar een 'bypass' mechanisme dat cellen toestaat DNA replicatie voort te zetten ondanks ernstige, niet-herstelbare schade aan de matrijsstreng. * **Mechanisme:** Tijdens ernstige DNA schade, vooral in prokaryoten (SOS-systeem) en eukaryoten, worden gespecialiseerde 'bypass' DNA polymerasen (bv. DNA polymerase $\eta$ (eta) in eukaryoten) gerekruteerd. Deze polymerasen kunnen repliceren op beschadigde matrijsstrengen, hoewel dit vaak gepaard gaat met de introductie van nieuwe fouten. * **Functie:** Het doel is om een complete dochterstreng te genereren, ook al is deze niet perfect, om zo de replicatie van het gehele genoom te voltooien en te voorkomen dat de cel in apoptose gaat. De schade aan de matrijsstreng zelf wordt niet hersteld. #### 2.2.6 Herstel van dubbelstrengs DNA-breuken (DSB) Dubbelstrengs DNA-breuken zijn zeer schadelijk en worden via verschillende mechanismen hersteld. * **Niet-homologe 'end-joining' (NHEJ):** * **Mechanisme:** Herkent de gebroken uiteinden en brengt deze direct samen met behulp van eiwitten zoals Ku80 en Ku70, gevolgd door DNA ligatie. * **Kenmerk:** Dit is een 'error-prone' mechanisme. Vaak worden nucleotiden verwijderd of toegevoegd aan de uiteinden, wat leidt tot inserties of deleties. * **Timing:** Treedt voornamelijk op tijdens G$_0$/G$_1$ fase, wanneer de chromosomen nog niet zijn gerepliceerd. * **Gevolg:** Kan leiden tot chromosoomfusies, bijvoorbeeld bij verlies van telomeren. * **Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA):** * **Mechanisme:** 1. Een 5'-exonuclease werkt aan de gebroken uiteinden om enkelstrengs overhangen te genereren. 2. Rad51 (een homoloog recombinatie eiwit) bindt aan het enkelstrengs DNA. 3. Het enkelstrengs DNA dringt de complementaire zusterchromatide binnen (D-loop formatie). 4. De gebroken streng wordt gerepliceerd, gebruikmakend van de zusterchromatide als matrijs. 5. Het gerepliceerde DNA dissocieert en wordt geligeerd. * **Kenmerk:** Dit is een 'error-free' herstelmechanisme. * **Timing:** Treedt op tijdens en na de S-fase, wanneer zusterchromatiden aanwezig zijn. * **Homologe recombinatie (HR):** * **Mechanisme:** Vergelijkbaar met SDSA, maar waarbij beide strengen van het gebroken DNA betrokken zijn bij de invasie van de zusterchromatide. Dit leidt tot de vorming van Holliday-junctions. * **Kenmerk:** Een 'error-free' herstelmechanisme. * **Timing:** Treedt op tijdens en na de S-fase. * **Resolutie van Holliday-junctions:** De Holliday-junctions kunnen op verschillende manieren worden opgelost ('same sense' of 'opposite sense' resolutie), wat kan leiden tot genetische uitwisseling tussen zusterchromatiden. > **Tip:** Het belangrijkste verschil tussen NHEJ en SDSA/HR is dat NHEJ fouten kan introduceren (error-prone), terwijl SDSA en HR foutenvrij herstel uitvoeren (error-free). SDSA en HR vereisen echter de aanwezigheid van een zusterchromatide. Wanneer deze afwezig is, is NHEJ de enige optie voor DSB-herstel, ondanks het risico op fouten. ### 2.3 Gevolgen van onherstelbare DNA schade Wanneer DNA schade niet succesvol kan worden hersteld, kan dit leiden tot celdood (apoptose) of, in het geval van somatische cellen, bijdragen aan celveroudering of de ontwikkeling van kanker. In geslachtscellen kan dit leiden tot erfelijke aandoeningen. --- **Belangrijke concepten om te onthouden:** * De constante dreiging van DNA schade door endogene en exogene factoren. * De diversiteit aan DNA herstelmechanismen die specifiek zijn voor verschillende soorten schade (BER voor kleine veranderingen, NER voor omvangrijke schade, MMR voor replicatiefouten, etc.). * Het cruciale belang van DSB-herstel (NHEJ, SDSA, HR) voor de genomische stabiliteit. * Het onderscheid tussen error-prone en error-free herstelmechanismen. * De link tussen DNA schade, herstel, en ernstige ziekten zoals kanker en veroudering. * De rol van telomeren in celveroudering en hun herstel door telomerase. --- # Homologe recombinatie en mobiele genetische elementen Dit hoofdstuk behandelt homologe recombinatie, essentieel voor zowel DNA-reparatie als voor de genetische variabiliteit tijdens de meiose, en introduceert mobiele genetische elementen (transposons) die de structuur en evolutie van genomen kunnen beïnvloeden. ### 3.1 Homologe recombinatie Homologe recombinatie is een proces waarbij genetisch materiaal wordt uitgewisseld tussen twee homologe DNA-moleculen of tussen zusterchromatiden. Het speelt een cruciale rol bij het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken en is een sleutelmechanisme tijdens de meiose. #### 3.1.1 Homologe recombinatie tijdens de meiose * Homologe recombinatie tijdens de meiose wordt geïnitieerd door dubbelstrengs DNA-breuken (ds-breuken). * Het enzym **Spo11** (een endonuclease) genereert deze ds-breuken en rekruteert enzymen die de 5'-uiteinden inkorten, waardoor 3'-overhangende uiteinden ontstaan. * **Rad51**, een enkelstrengs DNA-bindend eiwit, bindt aan deze 3'-overhangen. * Dit eiwit-DNA-complex initieert DNA-invasie in het homologe chromosoom (of zusterchromatide). * Het mechanisme omvat de vorming van **D-loops** en uiteindelijk **Holliday junctions**. * De resolutie van deze Holliday junctions kan op twee manieren gebeuren: "same sense resolution" of "opposite sense resolution", wat leidt tot uitwisseling van genetisch materiaal tussen niet-zusterchromatiden van homologe chromosomen. * Dit proces is cruciaal voor genetische variabiliteit. #### 3.1.2 Herstel van dubbelstrengs DNA-breuken via homologe recombinatie Homologe recombinatie is ook een belangrijk mechanisme voor het foutenvrij herstel van dubbelstrengs DNA-breuken. * **Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA)**: * Dit mechanisme treedt op wanneer zusterchromatiden beschikbaar zijn (tijdens en na de S-fase en vóór de mitose). * Het proces begint met 5'-exonuclease werking, gevolgd door binding van Rad51 aan het enkelstrengs DNA. * Invasie van de zusterchromatide vormt een D-loop. * De gebroken DNA-streng wordt vervolgens gerepliceerd, waarna dissociatie en ligatie plaatsvinden. * Dit proces is foutenvrij. * **Homologe recombinatie (HR)**: * Dit mechanisme is nauw verwant aan SDSA en omvat de vorming van Holliday junctions. * Beide strengen zijn betrokken bij de invasie en de vorming van de structuren. * Het leidt tot foutenvrij herstel en treedt op tijdens en na de S-fase. * De resolutie van Holliday junctions kan leiden tot uitwisseling van DNA-segmenten. * **Niet-homologe end-joining (NHEJ)**: * Dit is een alternatief mechanisme voor dsDNA-breuken dat niet afhankelijk is van homologie. * Het wordt gekenmerkt door de herkenning van de breuk door de Ku80 en Ku70 eiwitten, gevolgd door de inwerking van exonucleasen en DNA-ligase. * NHEJ is **niet foutenvrij** en kan leiden tot verlies van nucleotiden. * Het treedt voornamelijk op in de G0/G1-fase, wanneer zusterchromatiden nog niet beschikbaar zijn. > **Tip:** Hoewel SDSA foutenvrij herstel biedt, is het beperkt tot situaties waarin zusterchromatiden beschikbaar zijn. NHEJ is een meer universeel mechanisme voor dsDNA-breukherstel, maar ten koste van potentiële fouten. De cel kiest voor NHEJ om te overleven in plaats van te sterven door onherstelbare breuken. ### 3.2 Mobiele genetische elementen (transposons) Mobiele genetische elementen, ook wel transposons of "springende genen" genoemd, zijn DNA-sequenties die hun positie binnen het genoom kunnen veranderen. Deze mobiliteit kan leiden tot veranderingen in de genexpressie en structurele veranderingen van het genoom, wat bijdraagt aan evolutie. #### 3.2.1 Mechanismen van transpositie Er zijn twee hoofdmechanismen voor transpositie: 1. **Replicatieve transpositie (copy-paste)**: * Het transposon wordt gekopieerd en de kopie wordt op een nieuwe locatie ingebracht, terwijl het origineel op de oude locatie achterblijft. * Dit mechanisme is kenmerkend voor DNA-transposons en retrotransposons. 2. **Conservatieve transpositie (cut-paste)**: * Het transposon wordt uit de oude locatie "geknipt" en op een nieuwe locatie ingevoegd. Het origineel verdwijnt dus. * Dit mechanisme komt voornamelijk voor bij DNA-transposons. #### 3.2.2 Soorten transposons Transposons kunnen worden ingedeeld op basis van hun intermediair tijdens transpositie en hun autonomie: * **Intermediair DNA transposons**: * Gebruiken een DNA-molecuul als intermediair. * Veelvoorkomend in bacteriën, maar ook aanwezig in eukaryoten. * Conservatieve DNA-transposons coderen voor een **transposase**, het enzym dat de knip- en plakeffecten uitvoert. * In bacteriën kunnen ze samengesteld ("composite") zijn (bestaande uit twee transponeerbare elementen met daartussen een gen) of niet-samengesteld ("noncomposite"). * De insertie van een DNA-transposon leidt typisch tot een **target site duplicatie**, waarbij een korte sequentie van het gastheer-DNA twee keer voorkomt aan de zijden van het ingevoegde transposon. * **Retrotransposons**: * Gebruiken een RNA-molecuul als intermediair. * Voornamelijk voorkomend in eukaryoten, niet in bacteriën. * Ze repliceren via een proces dat lijkt op reverse transcriptie. * Ze produceren een RNA-kopie van zichzelf, die vervolgens wordt omgezet naar DNA door een **reverse transcriptase** enzym. Dit DNA wordt dan op een nieuwe locatie in het genoom geïntegreerd. * Retrotransposons vormen geen infectieuze virale partikels. * In het humane genoom vormen retrotransposons een aanzienlijk deel (meer dan 40%), zoals L1 retrotransposons en Alu sequenties. #### 3.2.3 Autonomie van transposons * **Autonome transposons**: * Coderen voor alle eiwitten die nodig zijn voor hun eigen transpositie (zoals transposase en reverse transcriptase). * **Niet-autonome transposons**: * Hebben de transpositie-eiwitten niet zelf en zijn afhankelijk van de aanwezigheid van autonome transposons in het genoom om te kunnen bewegen. #### 3.2.4 Rol en effecten van transposons * **Genoomvariabiliteit en evolutie**: Transposons dragen bij aan de genetische variabiliteit door inserties, deleties, duplicaties en herschikkingen in het genoom te veroorzaken. Ze kunnen ook zorgen voor exon-shuffling of duplicatie, wat leidt tot nieuwe eiwitstructuren en -functies. * **Genactivatie of -inactivatie**: De insertie van een transposon in of nabij een gen kan leiden tot inactivatie (als het in een coderend gebied valt) of tot veranderingen in genexpressie (als het in een regulatoir element valt). * **Ziekteveroorzaker**: Transpositie kan leiden tot genetische ziekten wanneer een transposon zich integreert in een essentieel gen of een cruciaal regulatoir element. > **Example:** L1 retrotransposons in het humane genoom kunnen soms actief zijn en zich verspreiden. Als zo'n transposon zich integreert in een gen dat betrokken is bij de bloedstolling, kan dit leiden tot bloedingsstoornissen. Alu sequenties, hoewel grotendeels niet-functioneel, kunnen ook bijdragen aan recombinatie tussen niet-homologe sequenties, wat tot chromosomale afwijkingen kan leiden. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | DNA replicatie | Het proces waarbij een DNA-molecuul wordt gekopieerd om twee identieke dochtermoleculen te vormen, essentieel voor celdeling en erfelijkheid. | | Semi-conservatieve replicatie | Een replicatiemodel waarbij elke nieuwe DNA-dubbelstreng bestaat uit één originele (ouderlijke) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng. | | DNA polymerase | Een enzym dat verantwoordelijk is voor de synthese van nieuwe DNA-strengen door nucleotiden aan een groeiende keten toe te voegen, met gebruik van een bestaande DNA-streng als matrijs. | | Leidende streng (leading strand) | De DNA-streng die continu wordt gesynthetiseerd in de 5’ naar 3’ richting, parallel aan de beweging van de replicatievork. | | Navolgende streng (lagging strand) | De DNA-streng die discontinu wordt gesynthetiseerd in korte fragmenten (Okazaki-fragmenten) in de 5’ naar 3’ richting, tegengesteld aan de beweging van de replicatievork. | | Okazaki-fragmenten | Korte DNA-fragmenten die worden gesynthetiseerd op de navolgende streng tijdens de DNA-replicatie, die later aan elkaar worden geligeerd. | | Proeflezing (proofreading) | Een correctiemechanisme van DNA polymerase waarbij verkeerd ingebouwde nucleotiden direct worden verwijderd door de 3’→5’ exonuclease activiteit, waardoor de nauwkeurigheid van de replicatie wordt verhoogd. | | Polymerasekettingreactie (PCR) | Een moleculair-biologische techniek die wordt gebruikt om miljoenen tot miljarden kopieën van een specifiek DNA-segment te maken door middel van cyclische replicatie met behulp van een thermobestendig DNA polymerase. | | Telomeren | Beschermende DNA-sequenties aan de uiteinden van eukaryote chromosomen die verkorting tijdens DNA-replicatie voorkomen en essentieel zijn voor chromosomale stabiliteit. | | Telomerase | Een enzym dat de telomeren verlengt door RNA als matrijs te gebruiken en reverse transcriptase activiteit te vertonen, wat cruciaal is voor de levensduur van prolifererende cellen. | | Mutatie | Een permanente verandering in de DNA-sequentie van een organisme, die kan ontstaan door replicatiefouten, chemische schade of straling. | | Endogene factoren | Factoren die van binnenuit het lichaam ontstaan, zoals fouten tijdens DNA-replicatie of spontane chemische modificaties van DNA-basen. | | Externe factoren (mutagenen) | Stoffen of stralingen van buitenaf die DNA-schade kunnen veroorzaken en mutaties kunnen induceren, zoals UV-straling, röntgenstraling, of bepaalde chemicaliën. | | Base Excision Repair (BER) | Een DNA-herstelmechanisme dat gericht is op het verwijderen van beschadigde, gemodificeerde of ontbrekende basen uit het DNA, gevolgd door de synthese van een nieuwe nucleotide. | | Nucleotide Excision Repair (NER) | Een DNA-herstelmechanisme dat grotere DNA-beschadigingen, zoals thyminedimeren of adducten, herstelt door een groter segment van de beschadigde streng te verwijderen en opnieuw te synthetiseren. | | Mismatch repair | Een DNA-herstelmechanisme dat verkeerd gepaarde basen detecteert die ontstaan zijn tijdens de DNA-replicatie en deze corrigeren om mutaties te voorkomen. | | Translesie synthese | Een noodherstelmechanisme waarbij speciale polymerasen beschadigde DNA-matrijzen kunnen passeren om replicatie te voltooien, hoewel dit vaak gepaard gaat met het introduceren van fouten. | | Dubbelstrengs DNA-breuk (dsDNA breuk) | Een ernstige vorm van DNA-schade waarbij beide strengen van de DNA-dubbelhelix op hetzelfde punt of dicht bij elkaar worden verbroken. | | Niet-homologe end-joining (NHEJ) | Een mechanisme voor het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken dat de gebroken uiteinden direct aan elkaar verbindt, vaak resulterend in kleine deleties of inserties. | | Homologe recombinatie (HR) | Een nauwkeurig DNA-herstelmechanisme voor dubbelstrengs DNA-breuken waarbij een intacte homologe sequentie (meestal de zusterchromatide) als matrijs wordt gebruikt om de breuk te herstellen zonder verlies van informatie. | | Synthesis-Dependent Strand Annealing (SDSA) | Een mechanisme voor het herstel van dubbelstrengs DNA-breuken dat gebruik maakt van een zusterchromatide als matrijs, vergelijkbaar met homologe recombinatie, maar zonder de vorming van Holliday-junctions. | | Homologe recombinatie tijdens meiose | Het proces waarbij genetisch materiaal tussen homologe chromosomen wordt uitgewisseld tijdens de meiose, wat bijdraagt aan genetische variatie. | | Transposons | Mobiele genetische elementen die hun positie in het genoom kunnen veranderen, ook wel "springende genen" genoemd, en kunnen bijdragen aan genetische diversiteit. | | DNA transposons | Mobiele genetische elementen die zich verplaatsen via een "cut-and-paste" (conservatief) of "copy-and-paste" (replicatief) mechanisme, gebruikmakend van een DNA-intermediair. | | Retrotransposons | Mobiele genetische elementen die zich verplaatsen via een "copy-and-paste" mechanisme met behulp van een RNA-intermediair, en die een significant deel van eukaryote genomen vormen. | | Genoom editing | Technieken zoals CRISPR/Cas9 die nauwkeurige wijzigingen aan het DNA van een organisme mogelijk maken, zoals het verwijderen, toevoegen of vervangen van specifieke DNA-sequenties. | | CRISPR/Cas9 | Een geavanceerd genoom editing systeem dat is afgeleid van een natuurlijk bacterieel afweersysteem, waarmee specifieke DNA-sequenties kunnen worden geknipt en aangepast. | | Sikkelcelanemie | Een erfelijke bloedaandoening veroorzaakt door een mutatie in het gen voor hemoglobine, wat leidt tot abnormaal gevormde rode bloedcellen. | | CAR-T celtherapie | Een vorm van immuuntherapie waarbij de T-cellen van een patiënt genetisch worden aangepast om kankercellen effectiever te herkennen en te bestrijden. |