01 inleiding & techniek 25-26 & notes.pdf

# Stadia en voorwaarden van celcultivering Celcultivering omvat een reeks stappen om cellen uit een orgaan of tumor te laten groeien in vitro, wat onderzoek kan vereenvoudigen, waarbij specifieke omstandigheden cruciaal zijn voor celoverleving en groei [9](#page=9). ### 1.1 Stadia van celcultivering Het proces van het maken van een cellijn uit een weefsel omvat verschillende stappen: * **Enzymatische behandeling:** Het weefsel wordt enzymatisch behandeld om de cellen te scheiden [9](#page=9). * **Isolatie van cellen:** De cellen worden vervolgens uit de oplossing verkregen door centrifugeren of uitzakken naar de bodem van een container [9](#page=9). * **Uitplaatsten:** De geïsoleerde cellen worden in een groeirecipiënt geplaatst, zoals een petrischaal, om te starten met de cultivering [9](#page=9). * **Celgroei:** Hopelijk overleven de cellen deze behandeling en kunnen ze uitgroeien tot een populatie [9](#page=9). * **Opsplitsen:** Wanneer een confluente laag van cellen is gevormd, worden de cellen losgemaakt en gesplitst om de groei voort te zetten [9](#page=9). > **Tip:** Het succesvol in vitro laten groeien van cellen is afhankelijk van het minimaliseren van stressvolle behandelingen en het bieden van een optimale omgeving vanaf het begin [9](#page=9). ### 1.2 Typische celculturen en kolonie-vorming Celculturen kunnen worden gekenmerkt door de vorming van kolonies, die ontstaan uit individuele cellen die zich delen. Een monolaagcultuur van epitheelcellen toont een duidelijke laag cellen die aan elkaar grenzen [10](#page=10). > **Voorbeeld:** Links in een opname worden cellen sterk vergroot weergegeven, waarbij elke witte lijn de celrand aangeeft. Rechts, bij een lagere vergroting, is te zien hoe een kolonie ontstaat uit één enkele cel en uit meerdere cellen bestaat [10](#page=10). ### 1.3 Cultuurcondities Om ervoor te zorgen dat cellen die in vitro groeien vergelijkbaar zijn met cellen *in vivo*, moeten de cultuurcondities nauwkeurig zijn [11](#page=11). #### 1.3.1 CelmediA Het medium dat gebruikt wordt voor celcultivering, zoals Minimum Essential Medium (MEM), bevat essentiële componenten voor celgroei en -overleving: * **Isotonische zouten:** Inclusief een NaHCO3/H2CO3-buffer die vergelijkbaar is met het bloedbuffersysteem [11](#page=11). * **Energiebron:** Glucose wordt geleverd als primaire energiebron [11](#page=11). * **Essentiële aminozuren en vitamines:** Deze zijn noodzakelijk voor de celstofwisseling en worden niet door de cel zelf gesynthetiseerd [11](#page=11). * **Serum:** Hoewel nagenoeg essentieel, is serum een duur natuurproduct met mogelijke kwaliteitsvariaties [11](#page=11). Andere klassieke celmedia die gebruikt kunnen worden zijn DMEM, M199, McCoy’s en RPMI1640 [11](#page=11). #### 1.3.2 CO2-atmosfeer en pH-controle De culturen moeten worden gekweekt onder een atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Dit CO2-gehalte is vergelijkbaar met dat in bloed en weefselvochten (in de atmosfeer is het slechts 0,03%). Het doel hiervan is het bereiken en handhaven van een optimale pH van ongeveer 7,4, wat cruciaal is voor celactiviteit [11](#page=11). > **Tip:** Het handhaven van de juiste pH is essentieel voor celmetabolisme en -groei. De CO2/bicarbonaat buffer in het medium werkt samen met de CO2 in de atmosfeer om dit te reguleren [11](#page=11). ### 1.4 Cultuurrecipiënten Verschillende soorten recipiënten worden gebruikt voor celcultivering, afhankelijk van de toepassing en de benodigde groeioppervlakte [12](#page=12). * **Gesloten flessen:** Deze worden gebruikt in een warme kamer en vereisen dat CO2 wordt toegevoegd voordat de fles wordt afgesloten. Voorbeelden zijn falconbuizen [12](#page=12). * **Open platen:** Deze worden gebruikt in CO2-ovens en bieden gemakkelijke toegang tot de cellen [12](#page=12). * **Rollerflessen:** Deze worden ook in de warme kamer gebruikt en bieden een groot oppervlak voor celgroei met een relatief kleine hoeveelheid medium [12](#page=12). > **Voorbeeld:** Een CO2-oven is essentieel voor het creëren van de benodigde gecontroleerde omgeving, inclusief temperatuur, vochtigheid en CO2-concentratie, voor de cultuurplaten die erin worden geplaatst [12](#page=12). --- # Apparatuur en faciliteiten voor celcultuur Celcultuur vereist gespecialiseerde apparatuur en faciliteiten om een steriele en gecontroleerde omgeving te waarborgen, essentieel voor celgroei en -onderhoud [23](#page=23). ### 2.1 Essentiële apparatuur #### 2.1.1 Laminaire flowbench Een laminaire flowbench is cruciaal voor celcultuurwerkzaamheden. Deze werkbank creëert een steriele werkomgeving door continue luchtstroom die deeltjes verwijdert. Het apparaat is uitgerust met een steriliserend HEPA (High Efficiency Particulate Air) filter dat de lucht zuivert. De cellen worden binnen deze bench gehanteerd om contaminatie te voorkomen [21](#page=21) [23](#page=23). * **Functie:** Bescherming van cellen tegen contaminatie door micro-organismen en deeltjes in de lucht. * **Kenmerken:** Uitgerust met een HEPA filter voor luchtzuivering [23](#page=23). #### 2.1.2 CO2-incubator De CO2-incubator is een essentieel apparaat voor het onderhouden van de groeicondities van cellen. Deze incubatoren reguleren nauwkeurig de temperatuur, luchtvochtigheid en CO2-concentratie in de kweekkamer. De aanwezigheid van CO2 is vaak nodig om de pH van het celcultuurmedium op peil te houden, daar het medium zelf vaak een bicarbonaat buffersysteem bevat. Net als de laminaire flowbench zijn CO2-incubators ook uitgerust met steriliserende HEPA filters [23](#page=23). * **Functie:** Creëren en handhaven van een optimale omgeving voor celgroei (temperatuur, vochtigheid, CO2-niveau). * **Kenmerken:** Nauwkeurige regulatie van temperatuur, vochtigheid en CO2-concentratie. Bevat steriliserende HEPA filters [23](#page=23). #### 2.1.3 Invriezen van cellen Voor langdurige opslag worden cellen ingevroren bij extreem lage temperaturen. Vloeibare stikstof, met een temperatuur van -196°C, wordt hiervoor gebruikt. Dit proces, ook wel cryopreservatie genoemd, maakt het mogelijk om celpopulaties voor onbepaalde tijd te bewaren en later te reactiveren voor verder onderzoek [23](#page=23). * **Methode:** Opslag in vloeibare stikstof bij -196°C [23](#page=23). * **Doel:** Lange-termijn behoud van celpopulaties. ### 2.2 Celadhesie en spreiding Na het losmaken en uitplanten van cellen ondergaan deze een reeks stappen om zich aan het substraat te hechten en te verspreiden. Dit proces is cruciaal voor het succes van celkweek, omdat cellen zich in de meeste gevallen moeten hechten om te kunnen overleven en groeien [22](#page=22). #### 2.2.1 Stappen in celadhesie en spreiding 1. **Uitzakken onder invloed van gravitatie:** Direct na het uitplanten beginnen de cellen naar beneden te zakken [22](#page=22). 2. **Initieel contact met het substraat:** Cellen maken contact met het kweekoppervlak. In dit stadium is het adhesieoppervlak minimaal, omdat de cellen nog bolvormig zijn [22](#page=22). 3. **Progressieve spreiding:** In de uren die volgen, verspreiden de cellen zich geleidelijk over het substraat. Dit proces is energie-afhankelijk en vereist veranderingen in het cytoskelet, wat leidt tot een groter celcontactoppervlak en een sterkere hechting aan het substraat [22](#page=22). 4. **Sterke binding met substraat:** Uiteindelijk gaan de cellen een robuuste binding aan met het substraat. Dit wordt mede mogelijk gemaakt doordat de cellen zelf moleculen van de extracellulaire matrix (ECM) produceren en afscheiden, die bijdragen aan de adhesie [22](#page=22). #### 2.2.2 Celmigratie Ondanks de sterke cel-substraatsadhesie, kunnen cellen doorgaans migreren over het celoppervlakte. Dit gebeurt door het tijdelijk en gefocusseerd inhiberen van celadhesie op de ene locatie (waar de cel loskomt) en het gelijktijdig opbouwen van adhesie op een andere locatie in de richting van de migratie [22](#page=22). > **Tip:** De verschillende stadia van celadhesie en spreiding kunnen worden waargenomen met behulp van Scanning Elektronenmicroscopie (SEM), zoals geïllustreerd met muisfibroblasten op verschillende tijdstippen na uitplating [22](#page=22). ### 2.3 Algemene faciliteiten Naast specifieke apparatuur, beschikken celcultuurfaciliteiten over algemene faciliteiten om het werk te ondersteunen. Dit omvat vaak gedeelde ruimtes met meerdere laminaire flowbenches en incubatoren. De "CTC core" in The Core (UZ campus) is een voorbeeld van een dergelijke faciliteit, uitgerust met 17 flowbenches [24](#page=24). * **Voorbeeld:** CTC core in The Core (UZ campus) met 17 flowbenches [24](#page=24). --- # Wat zijn stamcellen en hun eigenschappen Stamcellen zijn bijzondere cellen die zich voortdurend kunnen delen en zich kunnen ontwikkelen tot verschillende andere soorten cellen en weefsels [27](#page=27). ### 3.1 Kenmerken van stamcellen Stamcellen bezitten twee fundamentele eigenschappen [28](#page=28): 1. **Zelfvernieuwing:** Stamcellen kunnen zichzelf delen en zo identieke kopieën van zichzelf produceren [28](#page=28). 2. **Differentiatie:** Stamcellen hebben het vermogen om zich te ontwikkelen tot gespecialiseerde celtypen die de organen en weefsels van een organisme vormen [28](#page=28). ### 3.2 Soorten stamcellen op basis van pluripotentie De differentiatiepotentie van stamcellen varieert en wordt aangeduid met termen als totipotent, pluripotent en multipotent. #### 3.2.1 Totipotente stamcellen Direct na de bevruchting deelt de eicel zich. De resulterende cellen, of een deel daarvan, hebben de potentie om zich te ontwikkelen tot een complete foetus. Een stamcel wordt als "totipotent" beschouwd als deze het volledige potentieel heeft om zich tot een levensvatbare foetus te ontwikkelen [28](#page=28). > **Example:** De bevruchte eicel en de cellen die ontstaan in de eerste paar delingscycli na de bevruchting zijn totipotent [28](#page=28). #### 3.2.2 Pluripotente stamcellen Ongeveer 4 dagen na de bevruchting, na diverse delingscycli, vormt de bevruchte eicel een holle bol die bekend staat als een blastocyst, bestaande uit circa 140 totipotente stamcellen. De cellen binnenin deze holle bol vormen de binnenste celmassa. Wanneer de blastocyst zich in de baarmoeder nestelt, differentiëren de buitenste cellen tot de placenta. De binnenste celmassa ontwikkelt zich vervolgens tot de foetus. Omdat de binnenste celmassa niet zonder de placenta tot een foetus kan uitgroeien, zijn deze cellen niet langer totipotent, maar pluripotent [29](#page=29). > **Definition:** Pluripotente stamcellen hebben de potentie om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen [29](#page=29). > **Example:** De cellen van de binnenste celmassa van een blastocyst zijn pluripotent [29](#page=29). #### 3.2.3 Multipotente stamcellen Geleidelijk aan worden de individuele cellen binnen de binnenste celmassa steeds meer gespecialiseerd. Multipotente stamcellen hebben een beperkter differentiatiepotentieel dan pluripotente stamcellen [30](#page=30). > **Definition:** Multipotente stamcellen hebben het potentieel om zich te ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen, maar deze differentiatie is beperkt tot een specifieke cel- of weefsellijn [30](#page=30). > **Example:** Hemopoëtische stamcellen zijn multipotent omdat ze zich kunnen ontwikkelen tot verschillende soorten bloedcellen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar ze zijn beperkt tot het bloedvormende systeem [30](#page=30). --- # kwaliteitscontrole van celculturen Celculturen vereisen strikte kwaliteitscontrole om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te garanderen, met name door de potentiële contaminatie met micro-organismen en vreemde cellen, en de inherente genetische instabiliteit [37](#page=37). ### 4.1 Contaminatie met micro-organismen en vreemde cellen #### 4.1.1 Contaminatie met micro-organismen Micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en met name antibiotica-resistente mycoplasma's (PPLO) vormen een significant probleem in celculturen. Deze organismen groeien snel in de voedzame groeimedia. Mycoplasma's zijn parasitair, kunnen deels intracellulair voorkomen en verstoren het cellulaire metabolisme, vaak door overmatige verzuring van het medium. Ze zijn moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar [37](#page=37). #### 4.1.2 Contaminatie met vreemde cellen Contaminatie met vreemde cellen is wijdverspreider dan vaak wordt erkend. Een significant deel van de "oudere" cellijnen blijkt varianten te zijn van de HeLa cellijn, afkomstig van een humane cervix-tumor. Bovendien zijn veel cellijnen die als "humaan" worden beschouwd, in werkelijkheid afkomstig van muizen of ratten. Genetische fingerprinting en karyotypering zijn methoden om dergelijke contaminaties te detecteren [37](#page=37). #### 4.1.3 Effecten van mycoplasma contaminatie Mycoplasma contaminatie kan diverse negatieve effecten hebben op eukaryote cellen, waaronder: * Veranderde niveaus van eiwit-, RNA- en DNA-synthese [38](#page=38). * Verandering van het cellulaire metabolisme [38](#page=38). * Inductie van chromosoomaberraties (numerieke en structurele veranderingen) [38](#page=38). * Verandering in de samenstelling van het celmembraan (expressie van oppervlakteantigenen en receptoren) [38](#page=38). * Verandering van de cellulaire morfologie [38](#page=38). * Inductie (of inhibitie) van lymfocytenactivatie [38](#page=38). * Inductie (of suppressie) van cytokine expressie [38](#page=38). * Verhoging (of verlaging) van viruspropagatie [38](#page=38). * Interferentie met diverse biochemische en biologische assays [38](#page=38). * Invloed op signaaltransductie [38](#page=38). * Bevordering van cellulaire transformatie [38](#page=38). * Verandering van proliferatiekenmerken (groei, vitaliteit) [38](#page=38). * Totale degeneratie en verlies van de kweek [38](#page=38). Bij hybridoomcellen kunnen de effecten specifiek zijn, zoals: * Inhibitie van cel fusie [38](#page=38). * Invloed op de selectie van fusieproducten [38](#page=38). * Interferentie bij de screening van monoklonale antilichaamreactiviteit [38](#page=38). * Productie van monoklonale antilichamen tegen mycoplasma in plaats van het doelantigeen [38](#page=38). * Verminderde opbrengst van monoklonale antilichamen [38](#page=38). * Conservering van hybridoomcellen [38](#page=38). > **Tip:** Mycoplasma contaminatie kan subtiel zijn en leiden tot onverklaarbare variaties in experimentele resultaten. Regelmatige controle is essentieel. ### 4.2 Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen De genetische zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kunnen worden beoordeeld door middel van karyotypering. Hierbij wordt het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen bepaald [39](#page=39). ### 4.3 Intrinsieke genetische instabiliteit Het genotype van gekweekte cellen, gereflecteerd door chromosoomvorm en -aantal, evolueert vaak negatief. Deze genetische instabiliteit is inherent en niet volledig te vermijden, maar kan wel worden beperkt. Dit kan worden bereikt door regelmatig terug te keren naar stock-cultures die zijn ingevroren met anti-kristallijne cryoprotectiva zoals glycerol of DMSO, bij temperaturen van vloeibare stikstof (-196°C) [40](#page=40). > **Tip:** Het regelmatig invriezen van een deel van de celpopulatie als stock-culture is een cruciale strategie om de genetische stabiliteit op lange termijn te bewaren en de gevolgen van inherente instabiliteit te minimaliseren. --- # Specifieke kleurtechnieken voor celcomponenten Deze sectie behandelt diverse specifieke kleurtechnieken die worden gebruikt om verschillende celcomponenten zichtbaar te maken en te identificeren binnen biologische monsters. ### 5.1 Algemene principes van specifieke kleurtechnieken Specifieke kleurtechnieken maken gebruik van moleculaire herkenning of enzymatische activiteit om bepaalde structuren of moleculen in cellen of weefsels aan te kleuren. Dit staat in contrast met algemene kleurstoffen die vetten kunnen aankleuren, ongeacht hun specifieke aard [68](#page=68). ### 5.2 Typen specifieke kleurtechnieken #### 5.2.1 Indifferente kleurstoffen Indifferente kleurstoffen kleuren vetten aan. Een voorbeeld hiervan is Oil Red O, dat gebruikt wordt om vetcellen te visualiseren [68](#page=68) [69](#page=69). #### 5.2.2 Immunohistochemische kleuring Immunohistochemische kleuring maakt gebruik van de specifieke binding tussen antigenen en antilichamen om bepaalde bestanddelen aan te kleuren. Het antilichaam wordt hierbij voorzien van een kleurstof, een fluorescente label of colloïdaal goud [68](#page=68). > **Voorbeeld:** Immunohistochemie kan worden toegepast om specifieke microtubuli aan te kleuren. Een ander voorbeeld is de kleuring van connexine 43 op een coupe van muishart [70](#page=70). #### 5.2.3 Enzymkleuringen Enzymkleuringen tonen de activiteit van enzymen aan door gebruik te maken van een specifiek substraat voor het betreffende enzym. De reactie tussen het enzym en het substraat resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag [68](#page=68). > **Voorbeeld:** De kleuring van glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten is een voorbeeld van een enzymkleuring. Hierbij worden erytrocyten met actieve G6PD aangekleurd, terwijl G6PD-deficiënte erytrocyten ongetint blijven. Dit kan worden uitgevoerd met de tetrazoniumzoutmethode. De visualisatie toont G6PD-bevattende erytrocyten (pijlen) en G6PD-deficiënte erytrocyten (pijpunten). Dit kan onderscheid maken tussen erytrocyten van een gezond persoon zonder G6PD-deficiëntie, waarbij ongetinte erytrocyten oud zijn en weinig actieve G6PD bevatten, en erytrocyten van een persoon met homozygote G6PD-deficiëntie, waarbij een aangekleurde erytrocyt jong is en actieve G6PD bevat. Bij heterozygote G6PD-deficiëntie is een gemengd beeld te zien [71](#page=71). --- # Mucoviscidose en cf tr eiwit lokalisatie Dit hoofdstuk bespreekt mucoviscidose (cystic fibrosis), een genetische ziekte veroorzaakt door defecten in het CFTR-eiwit, en de methoden om de lokalisatie van dit eiwit in weefsels te bestuderen [93](#page=93). ### 6.1 Mucoviscidose Mucoviscidose, ook bekend als cystic fibrosis of taaislijmziekte, is een genetische aandoening die wordt gekenmerkt door de productie van taai, visceus slijm. Deze ziekte leidt tot veranderingen in de samenstelling van de secretieproducten van diverse klieren, waaronder de pancreas, bronchiën en zweetklieren. De oorzaak van mucoviscidose ligt in mutaties in het CFTR-gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator), wat resulteert in een verstoorde productie of functie van het bijbehorende eiwit [93](#page=93). #### 6.1.1 Het CFTR eiwit Het CFTR-eiwit speelt een cruciale rol bij het transport van chloride-ionen over de celmembraan. Een van de meest voorkomende mutaties is de deletie van een aminozuur op positie 508 van het CFTR-eiwit, aangeduid als de $\Delta$F508 mutatie [93](#page=93). ##### 6.1.1.1 Normale versus gemuteerde CFTR eiwit lokalisatie * **Wild type CFTR:** Het normale, functionele CFTR-eiwit wordt via het Golgi-netwerk naar de apicale celmembraan getransporteerd [93](#page=93). * **Gemuteerd CFTR ($\Delta$F508):** Bij de meest voorkomende mutatie wordt het CFTR-eiwit niet correct gevouwen en blijft het achter in het endoplasmatisch reticulum (ER) voor afbraak. Dit fenomeen staat bekend als subcellulaire mislocatie [93](#page=93). ### 6.2 Lokalisatie van CFTR eiwit via immunohistochemie Om de lokalisatie van het CFTR-eiwit in weefsels te onderzoeken, wordt immunohistochemie toegepast. Deze techniek maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan het CFTR-eiwit [93](#page=93). #### 6.2.1 Antilichamen voor CFTR detectie Er zijn verschillende antilichamen beschikbaar voor de detectie van CFTR. Het is essentieel dat deze antilichamen zowel het wild type als de gemuteerde vormen van het eiwit kunnen herkennen om verschillen in lokalisatie te kunnen vaststellen [93](#page=93). ##### 6.2.1.1 Toepassingen in onderzoek De applicatie van specifieke antilichamen voor immunohistochemische lokalisatie van CFTR is onderzocht in zowel controleweefsels als weefsels van patiënten met cystische fibrose [94](#page=94) [95](#page=95). * **Voorbeeld van onderzoek:** Studies hebben de toepasbaarheid van verschillende antilichamen onderzocht voor de immunohistochemische lokalisatie van CFTR in zweetklieren van gezonde individuen en patiënten met cystische fibrose. De resultaten van dergelijk onderzoek tonen visuele verschillen in de CFTR-expressie en lokalisatie tussen controlepersonen en patiënten [94](#page=94) [95](#page=95). > **Tip:** Bij het interpreteren van immunohistochemie-resultaten voor CFTR is het cruciaal om rekening te houden met de specificiteit van de gebruikte antilichamen en de mogelijke verschillen in eiwitexpressie tussen wild type en gemuteerde vormen. --- # Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop (bright field microscope) maakt gebruik van doorvallend wit licht om preparaten te bekijken, waarbij het contrast voornamelijk gebaseerd is op lichtabsorptie [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). ### 7.1 Algemene principes en onderdelen De resolutie, de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven, van een lichtmicroscoop wordt beperkt tot ongeveer 200 nanometer (nm). Deze resolutie wordt bepaald door het objectief en de golflengte van het gebruikte licht, en niet door het oculair. Voor de analyse van dikker materiaal, zoals weefsels, is versnijding tot dunne secties na fixatie en inbedding noodzakelijk. Levende cellen, die doorgaans weinig contrast hebben, vereisen speciale microscopische technieken [52](#page=52). Een lichtmicroscoop bestaat uit optische en fijnmechanische onderdelen. De optische componenten omvatten drie hoofdsystemen [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55): * **Condensor:** Dit systeem, samengesteld uit meerdere lenzen, bundelt het licht van de lichtbron op het preparaat. De condensor is van cruciaal belang voor het bepalen van de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Objectief:** Dit objectief, dicht bij het preparaat geplaatst, vormt een vergroot beeld [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Oculair (eyepiece):** Dit optische onderdeel vergroot het reeds door het objectief gevormde beeld verder, zodat het op het netvlies van de observant kan worden geprojecteerd [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). Een spiegel wordt gebruikt om het licht van de lichtbron naar de condensor te leiden. Soms wordt een prisma ingezet om de lichtweg te buigen en een comfortabelere positie voor de onderzoeker te creëren [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). > **Tip:** Het klaarveldmicroscoop is de meest basale vorm van lichtmicroscopie. Het is essentieel om de rol van elk van de drie lenssystemen (condensor, objectief, oculair) te begrijpen voor het verkrijgen van een optimaal beeld. ### 7.2 Preparatie van monsters Voor klaarveldmicroscopie worden monsters op verschillende wijzen behandeld, afhankelijk van hun aard [52](#page=52): * **Celculturen:** Deze worden vaak op dekglaasjes geplaatst en als geheel behandeld [52](#page=52). * **Dikkere materialen (weefsels, orgaan-cultures):** Deze moeten worden versneden na fixatie en inbedding in paraffine. Cryosecties van bevroren materiaal, gevolgd door fixatie, zijn ook een veelgebruikte methode [52](#page=52). De detectie van structuren in gefixeerde en gekleurde preparaten gebeurt door middel van lichtabsorptie, wat kenmerkend is voor klaarveldmicroscopie [52](#page=52). > **Voorbeeld:** Het gebruik van Haematoxyline/Eosine (H&E) kleuring is een standaardmethode om weefselstructuren zichtbaar te maken door hun verschillende absorptie van licht na kleuring [52](#page=52). --- # Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie is een softwarematige bewerkingstechniek die wordt toegepast op conventionele digitale beelden om een hogere resolutie te verkrijgen [86](#page=86). ### 8.1 Principe en toepassing Conventionele fluorescentiemicroscopen produceren beelden met een lagere resolutie vergeleken met geavanceerdere technieken zoals confocale microscopie. Recentelijk is het echter mogelijk geworden om door middel van softwarematige bewerking van deze conventionele digitale beelden, met behulp van deconvolutie-algoritmes, zeer aanvaardbare hoge resoluties te bereiken. Dit maakt deconvolutie een waardevolle methode om de beeldkwaliteit van bestaande microscopische opnames te verbeteren [86](#page=86). > **Tip:** Deconvolutie kan beschouwd worden als een post-processing methode om de effecten van optische aberraties en onscherpte in het beeld te corrigeren [86](#page=86). ### 8.2 Vergelijking met andere technieken Terwijl confocale microscopie uitblinkt in het vastleggen van dynamische processen door middel van time-lapse opnames en analyse, biedt deconvolutie een methode om de resolutie van conventionele microscopie aanzienlijk te verbeteren. Dit is met name nuttig wanneer de aanschaf van geavanceerdere microscopen niet mogelijk is. Deconvolutie-algoritmes verwerken het bestaande beeld door informatie over de beeldvormingsfunctie (point spread function, PSF) te gebruiken om de oorspronkelijke, scherpere versie van het beeld te reconstrueren. Dit proces minimaliseert de bijdrage van licht dat buiten het focusvlak valt, wat een veelvoorkomend probleem is in conventionele microscopie [86](#page=86) [87](#page=87). --- # Voorbereiding en analyse van biologisch materiaal met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) De voorbereiding van biologisch materiaal voor TEM-analyse omvat diverse stappen die cruciaal zijn om structuren met hoge resolutie zichtbaar te maken . ### 9.1 Algemene principes van TEM-beeldvorming Elektronenmicroscopie maakt gebruik van elektronenbundels met een korte golflengte, die buiten het zichtbare spectrum van het menselijk oog vallen. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op elektronenstrooiing door de atomen van het weefsel. Dicht(er)e structuren absorberen meer elektronen en verschijnen donkerder, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten en lichter verschijnen. Biologisch materiaal vertoont van nature geringe densiteitsverschillen, wat de noodzaak van 'contrastering' onderstreept . ### 9.2 Voorbereidingsstappen van biologisch materiaal #### 9.2.1 Fixatie De eerste stap is de fixatie van ruwe materiaalstukjes, zoals weefselbrokjes of losse cellen, met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde. Het doel van fixatie is om de fijne intracellulaire structuren zo intact mogelijk te behouden en de celmembranen doorlaatbaar te maken voor de componenten die in latere stappen worden gebruikt . #### 9.2.2 Spoeling en 'kleuring' (contrastering) Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het biologisch materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen. Deze stoffen, zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat of kaliumpermanganaat, binden zich specifiek aan bepaalde celregio's, waaronder vetrijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern, en eiwitrijke structuren zoals cytoskeletelementen. Metaalverbindingen weerkaatsen elektronen, waardoor de ermee gemerkte structuren als donkere plekken verschijnen in de microscoop. Dit proces wordt 'kleuren' genoemd, hoewel het geen werkelijke kleuren betreft. Een verhoging van deze densiteitsverschillen, ook wel contrasteren genoemd, is cruciaal voor de beeldvorming. Osmiumtetroxide kan zowel als fixatief als contrasteringsmiddel dienen, en draagt bij aan het contrast van membranen. Uranylacetaat en loodcitraat worden gebruikt als contrasteringsvloeistof . #### 9.2.3 Dehydratatie Om ultradunne coupes (60 tot 90 nm dikte) te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, is het verwijderen van water uit het monster noodzakelijk. Dit gebeurt door het materiaal te spoelen met oplossingen van ethanol of aceton met toenemende concentraties . #### 9.2.4 Inbedding in hars Na de dehydratatie wordt het materiaal geïnfiltreerd met een nog niet-gepolymeriseerde kunsthars. Vervolgens wordt het hars-doordrongen materiaal in een houder geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule. Polymerisatie van de hars kan plaatsvinden door middel van warmte, magnetronstraling, of katalysatie met ultraviolet licht, resulterend in harde, goed snijbare blokjes materiaal . #### 9.2.5 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden Voor het verkrijgen van coupes met een dikte van ongeveer 70 nm zijn speciale messen van gespleten glas of diamanten messen vereist. Het snijden gebeurt met behulp van een ultramicrotoom . #### 9.2.6 Opvangen van coupes op een gridje Een kleine hoeveelheid water achter het mes dient als smeermiddel en voor het opvangen van de coupes. De fragiele coupes worden van het wateroppervlak 'opgeschept' op een metalen schijfje van minder dan 5 mm doorsnee met een roosterpatroon, een zogenaamd gridje . ### 9.3 Analyse en resolutie Met TEM kunnen structuren van cellulaire organellen met hoge resolutie worden waargenomen. Een voorbeeld toont twee aangrenzende pancreascellen, waarbij details zoals de kern (N), mitochondria (M), lysosomen (L), ruw endoplasmatisch reticulum (RER) en de dubbelbladige plasmamembranen (PM) zichtbaar zijn. Vergrotingen van ongeveer 40.000 keer en insets van 200.000 keer zijn mogelijk . > **Tip:** De 'kleuring' in TEM verwijst naar het gebruik van zware metalen om densiteitsverschillen te vergroten, niet naar ware kleuren zoals in lichtmicroscopie. > **Voorbeeld:** Zonder de contrastering met zware metalen zouden de verschillende membranen en organellen in een cel nauwelijks te onderscheiden zijn in de TEM vanwege hun vergelijkbare densiteit. --- # Analyse van epitheel van de trachea met behulp van microscopietechnieken Dit onderwerp bespreekt de analyse van het epitheel van de trachea (luchtpijp) met behulp van verschillende microscopietechnieken, met name transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM), om de structuur en celtypen te onderscheiden . ### 10.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse van tracheaalepitheel TEM-analyse van het epitheel van de trachea onthult twee primaire celtypen: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen . #### 10.1.1 Ondersteunende structuren Het epitheel rust op een basaal membraan (BM, basale lamina) dat overgaat in fibreus bindweefsel, bestaande uit fibrocyten, collageenvezels (Co) en elastinevezels (El) . #### 10.1.2 Celtypen in het tracheaalepitheel * **Gecilieerde cellen:** Deze cellen zijn gekenmerkt door de aanwezigheid van lange cilia en bevatten veel mitochondria en enig glad endoplasmatisch reticulum (SER). De cilia zijn begrensd door een dubbelbladige biologische membraan, vergelijkbaar met microvilli (MV), en kunnen longitudinaal, schuin of dwars worden doorgesneden . * **Mucus-producerende cellen:** Deze cellen worden geïdentificeerd door de overvloed aan ruw endoplasmatisch reticulum (ER), een uitgebreid Golgi-apparaat (G), en mucus-gevulde secretiedruppels (MD) . > **Tip:** De cilia en microvilli zijn beide begrensd door een "unit membrane" (UM), wat wijst op een gemeenschappelijke membraanstructuur . #### 10.1.3 Technieken in TEM Naast standaard TEM-preparaten, worden ook technieken zoals vries-breek (freeze-fracture) en vries-ets (freeze-etching) toegepast om membraanstructuren te visualiseren . * **Vries-breek:** Deze techniek breekt cellulaire membranen doorgaans tussen het binnen- en buitenblad, waardoor de interne membraanstructuren, waaronder eiwitten, zichtbaar worden. Het vloeibare mozaïekmodel van de biologische membraan wordt hierdoor geïllustreerd, waarbij eiwitten geassocieerd kunnen worden met de cytoplasmatische (P) of extracellulaire (E) membraanhelft . * **Vries-ets:** Deze methode genereert meer 3D-structuur door een dunne laag ijs te verwijderen via sublimatie (vast naar gas) onder vacuüm, waardoor diepere structuren blootgelegd worden . Visualisatie na deze vries-technieken gebeurt door bestuiving met zware atomen voor TEM of SEM, of door het maken van een replica om de elektronenpassage in TEM te verbeteren . > **Voorbeeld:** Een TEM-opname van een replica van een vriesbreekpreparaat van een darmepitheelcel toont organellen zoals microvilli (MV), celmembraan (CM), mitochondriën (M), Golgi-apparaat (G), nucleus (N) en kernporiën . ### 10.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) analyse van tracheaalepitheel SEM-analyse van het epitheel van de trachea toont eveneens de twee celtypen: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen. De mucus-producerende cellen vertonen een koepelvormig oppervlak . #### 10.2.1 Monsterpreparatie voor SEM Monsters die met SEM worden bekeken, moeten geleidend worden gemaakt voor elektriciteit. Dit gebeurt door ze met een sputtercoater te voorzien van een uiterst dun laagje (1,5-3 nanometer) goud of goud/palladium . ### 10.3 Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) Cryo-ET is een techniek voor 3D-reconstructie die gebaseerd is op een serie 2D-projecties, verkregen door het object of de detector rond een as te kantelen . #### 10.3.1 Principe van Cryo-ET * De reconstructie gebeurt door het progressief berekenen van terugprojecties naar een virtueel 3D-beeld van het originele object . * De nauwkeurigheid van het gereconstrueerde beeld neemt toe naarmate meer projecties met kleinere hoekverschillen kunnen worden gecombineerd, wat leidt tot minder "artefacten" door ontbrekende wiggen (missing-wedge) . > **Voorbeeld:** Het principe kan geïllustreerd worden voor de reconstructie van een 2D-beeld uit 1D-projecties, waarbij een betere beeldkwaliteit wordt bereikt met meer projecties over een groter hoekbereik . #### 10.3.2 Toepassing van Cryo-ET Cryo-ET kan worden gebruikt voor de gedetailleerde reconstructie van cellulaire structuren, zoals nucleaire pore complexen (NPC's). Door verschillende NPC's te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt . > **Voorbeeld:** Een 3D-reconstructie van een deel van het kernoppervlak toont de structuur van nucleaire pore complexe (NPC) en ruw endoplasmatisch reticulum (RER) in de celkern van de slijmzwam *Dictyostelium discoideum* . --- # Celgroei en celtransfer in celculturen Celgroei en celtransfer zijn fundamentele processen in celculturen die essentieel zijn voor het onderhouden van celpopulaties en het uitvoeren van experimenten. Dit omvat de principes van celdichtheidsafhankelijke groei, de methoden voor celtransfer, en de stappen die betrokken zijn bij celadhesie en spreiding [17](#page=17) [20](#page=20) [22](#page=22). ### 11.1 Celdichtheidsafhankelijke groei en contactinhibitie Cellen in cultuur vertonen groei tot ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Op dit punt treedt 'contactinhibitie' van celproliferatie op, deels als gevolg van concurrentie voor mitogenen. Dit betekent dat de celdeling stopt zodra de cellen elkaar raken en de beschikbare ruimte volledig is ingenomen [17](#page=17). Tumorcellen daarentegen kunnen het vermogen tot contactinhibitie verloren hebben. Hierdoor kunnen ze in dichtere aggregaten of hopen groeien, zelfs in een driedimensionale (3D) structuur, in plaats van een uniforme monolaag te vormen. Dit gedrag kan worden waargenomen met scanning electron microscopie (SEM) opnames [18](#page=18). Om een cultuur te behouden en verdere deling te stimuleren, moeten cellen gesplitst worden. Het toevoegen van vers medium kan de delingen herstarten. Een efficiëntere methode is het splitsen van de cultuur in dochterculturen, wat doorgaans gebeurt via een trypsine-EDTA procedure [17](#page=17). ### 11.2 Celtransferprocedure Celtransfer, ook wel celdeling of uitkweek genoemd, is noodzakelijk om celpopulaties te vermeerderen en te onderhouden. De procedure verschilt enigszins afhankelijk van het type celcultuur [20](#page=20). #### 11.2.1 Transfer van suspensiecultures Bij suspensiecultures gebeurt celtransfer door eenvoudige verdunning. Dit kan gebeuren na zacht centrifugeren en heropname in vers medium [20](#page=20). #### 11.2.2 Transfer van adherente cellen Voor adherente cellen vindt celtransfer plaats zodra de celmonolaag confluentie bereikt, gemiddeld om de 3 tot 7 dagen. De procedure omvat de volgende stappen [20](#page=20): 1. **Behandeling met trypsine/EDTA:** De cultuur wordt behandeld met trypsine/EDTA (TE) [20](#page=20). * **Trypsine:** Dit is een maagprotease dat bij korte behandeling de oppervlakte-eiwitten van de cellen degradeert [20](#page=20). * **EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat):** Dit cheleert calcium- en magnesiumionen, wat interfereert met zowel intercellulaire adhesie als cel-substraatbinding [20](#page=20). 2. **Loskomen van het substraat en van elkaar:** Onder geschikte condities komen de cellen los van het substraat en van elkaar, en vormen ze een suspensie van levende, opgebolde cellen [20](#page=20). 3. **Monocellulaire suspensie:** De suspensie is optimaal als deze monocellulair is, zonder meercellige aggregaten [20](#page=20). 4. **Verdunnen en uitzaden:** De monocellulaire suspensie wordt vervolgens verdund en uitgezaaid in nieuwe recipiënten. De verdunningsfactor varieert van 1 over 3 voor 'normale' cellen tot 1 over 30 voor 'tumorale' cellen [20](#page=20). 5. **Inhibitie van trypsine:** Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren, die van nature aanwezig zijn in het serum [20](#page=20). Het werken met cellen voor celsplitsing vindt plaats in een laminaire flowbench om steriele condities te waarborgen [21](#page=21). > **Tip:** De trypsine-EDTA procedure is cruciaal voor het losmaken van adherente cellen. Zorg ervoor dat de behandelingstijd geoptimaliseerd is om celschade te minimaliseren. ### 11.3 Groei in 2D- en 3D-culturen Celculturen kunnen worden opgezet om de in vivo omgeving na te bootsen [19](#page=19). * **2D-culturen:** Epitheliale cellen, zoals MDCK-cellen (Madine-Darby Canine Kidney), kunnen op een filter groeien en een 2D-cultuur vormen. In deze monolaag kunnen eiwitten apicaal of basolateraal in de cel worden geplaatst [19](#page=19). * **3D-culturen:** In een omgeving met de juiste extracellulaire componenten kunnen cellen ook cysten vormen, wat een meer driedimensionale groei nabootst. Deze 3D-structuren kunnen ook worden geobserveerd in tumoren die in dense foci groeien [18](#page=18) [19](#page=19). ### 11.4 Stappen bij celadhesie en -spreiding Nadat cellen zijn losgemaakt en uitgeplaat, ondergaan ze een proces van adhesie en spreiding op het substraat. Dit proces, geïllustreerd door SEM-opnames van muisfibroblasten op verschillende tijdstippen, omvat de volgende stappen [22](#page=22): 1. **Zinken door gravitatie:** De cellen zakken initieel uit onder invloed van de zwaartekracht [22](#page=22). 2. **Initieel contact met het substraat:** Er wordt een minimaal contactoppervlak gevormd, omdat de cellen nog opgebold zijn [22](#page=22). 3. **Progressieve spreiding:** In de daaropvolgende uren vindt er een proces van progressieve spreiding over het substraat plaats. Dit vereist energie en veranderingen in het cytoskelet. Hierdoor vergroot het celcontactoppervlak en wordt de cel-substraatsadhesie versterkt [22](#page=22). 4. **Sterke binding met het substraat:** De cellen gaan een sterke binding aan met het substraat door dit te modificeren met eigen aangemaakte extracellulaire matrix (ECM) moleculen [22](#page=22). Ondanks deze sterke adhesie kunnen cellen over het celoppervlak migreren. Dit gebeurt door focaal en tijdelijk de celadhesie te inhiberen op de plek waar de cel loskomt, en tegelijkertijd elders de celadhesie op te bouwen in de migratierichting [22](#page=22). > **Example:** De evolutie van muisfibroblasten op een substraat, waargenomen via SEM op 30 minuten, 60 minuten, 2 uur en 24 uur na uitplating, illustreert deze stappen van adhesie en spreiding duidelijk [22](#page=22). --- # Prepareren en observeren van cellen en weefsels voor microscopie Om structuren onder de lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM) te kunnen bestuderen, moeten cellen en weefsels geprepareerd worden, omdat biologisch materiaal over het algemeen te dik is om licht of elektronen door te laten en te weinig contrast bevat voor gedetailleerde waarneming. Histologische technieken maken het mogelijk weefsels voldoende dun te snijden en contrast te verhogen om structuurdetails zichtbaar te maken. Dit proces omvat doorgaans fixeren, inbedden en snijden, gevolgd door kleuren of contrasteren [42](#page=42). ### 12.1 Het belang van secties Het gebruik van dunne secties van weefsel is essentieel om subcellulaire details waar te nemen [43](#page=43) [44](#page=44). #### 12.1.1 Procedure voor paraffine coupes Een typische procedure voor het maken van paraffine coupes omvat: * Fixeren van een klein stukje weefsel (immersiefixatie) [43](#page=43). * Dehydrateren van het weefsel [43](#page=43). * Doordringen met vloeibare paraffine [43](#page=43). * Snijden van secties met een dikte van 0,5 tot 50 micrometer met behulp van een microtoom [43](#page=43). * Kleur en secties op een microscopisch glaasje plaatsen [43](#page=43). > **Voorbeeld:** H/E gekleurde secties worden gebruikt om structuren zichtbaar te maken, maar een grote wanorde in het onderste beeld kan wijzen op een carcinoom van het colon [44](#page=44). ### 12.2 Fixeren Fixeren heeft tot doel weefsels te bewaren met behoud van de oorspronkelijke structuur. Dit wordt bereikt door denaturatie van eiwitten [45](#page=45). #### 12.2.1 Doel van fixatie Wanneer een weefsel uit zijn in vivo situatie wordt verwijderd, worden afbraakenzymen actief die leiden tot weefseldegradatie. Om deze afbraakprocessen tegen te gaan, moet de activiteit van deze eiwitten gestopt worden door denaturatie [45](#page=45). #### 12.2.2 Methoden van fixatie Denaturatie van eiwitten kan op twee manieren plaatsvinden: * **Bevriezen:** Dit stopt enzymatische reacties snel. Koude fixatie maakt snelle verwerking van materiaal mogelijk en bewaart epitopen beter voor immuunkleuringen. Het wordt veel gebruikt in pathologielaboratoria voor snelle diagnoses van biopten en tumoren, zelfs tijdens operaties [45](#page=45). * **Chemische fixatieven:** Deze middelen denatureren eiwitten door ze te cross-linken (bv. met formaldehyde/formol, glutaraldehyde) of neer te slaan (precipiteren) (bv. met alcohol of aceton). Door cross-linking blijven cel/weefselcomponenten behouden voor latere procedures. Chemische fixatieven resulteren over het algemeen in een betere morfologie [45](#page=45). #### 12.2.3 Artefacten bij fixatie Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in vivo situatie worden artefacten genoemd. Dit kan leiden tot structuurveranderingen (bv. het ontstaan van een holte rond kraakbeencellen) of het op een andere plaats voorkomen van componenten (bv. glycogeendrift in een leverpreparaat) [45](#page=45). ### 12.3 Inbedden Inbedden houdt in dat het gefixeerde materiaal wordt omwikkeld en doordrongen met een inbedmiddel. Het inbedmiddel is een substantie die in het weefsel binnendringt en vervolgens hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken. Veelgebruikte inbedmiddelen zijn paraffine, hars en plastics [46](#page=46). #### 12.3.1 Vereisten voor inbedmiddelen Voor het verkrijgen van goede coupes moet het inbedmiddel het weefsel volledig kunnen binnendringen. Als dit niet gebeurt, ontstaat materiaal met verschillende hardheden, wat het snijden bemoeilijkt [46](#page=46). #### 12.3.2 Het proces van inbedden Inbedmiddelen die gebruikt worden in de routine histologie zijn hydrofoob. Aangezien biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%), moet dit water eerst verwijderd worden met behulp van een stijgende reeks alcoholbaden (bv. 30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Vervolgens wordt tolueen gebruikt voor ‘clearing’, een substantie die mengbaar is met zowel alcohol als het hydrofobe inbedmiddel [47](#page=47). > **Tip:** Hoewel er alternatieve hydrofobe harsen met hydrofiele groepen en hydrofiele inbedmiddelen bestaan, zijn deze over het algemeen minder stabiel en resulteren ze in inferieure morfologie [47](#page=47). ### 12.4 Snijden Door de hardheid van het inbedmateriaal kan het weefsel in dunne plakken gesneden worden [48](#page=48). #### 12.4.1 Dikte van de coupes * **Paraffine:** Maakt coupes van 5-10 micrometer mogelijk, wat doorlaatbaar is voor licht. Paraffine wordt verwarmd tot ongeveer 55°C, waardoor het smelt en in het weefsel kan dringen. Bij deze temperatuur blijven veel epitopen nog bewaard [48](#page=48). * **Harsen en plastics:** Laten coupes toe tot 70 nanometer, wat doorlaatbaar is voor elektronen. De polymerisatie van hars gebeurt bij 60-65°C. Omdat de meeste harsen moeilijk uit het weefsel te etsen zijn (in tegenstelling tot paraffine), zijn ze minder geschikt voor immuunkleuringen [48](#page=48). #### 12.4.2 Gebruik van de microtoom Het snijden van het ingebedde, harde materiaal gebeurt met een microtoom [48](#page=48). * Microtomen voor paraffine-ingebed materiaal zijn uitgerust met stalen messen [48](#page=48). * Microtomen voor harsen en plastics gebruiken glazen of diamanten messen [48](#page=48). #### 12.4.3 Plaatsing van de coupes * Coupes voor LM-analyse worden aangebracht op draagglaasjes [48](#page=48). * Coupes voor EM worden op metalen (koper, nikkel) roostertjes geplaatst, aangeduid als grids [48](#page=48). --- # elektronenmicroscopie technieken en toepassingen Elektronenmicroscopie (EM) maakt gebruik van elektronenbundels in plaats van licht om structuren te visualiseren die met een lichtmicroscoop niet te onderscheiden zijn, wat leidt tot aanzienlijk hogere resoluties en vergrotingen [98](#page=98) [99](#page=99). ### 13.1 Algemene principes van elektronenmicroscopie In tegenstelling tot lichtmicroscopen, waar glaslenzen het licht bundelen, gebruikt elektronenmicroscopie elektromagnetische magneten als lenzen om elektronenbundels te focussen en te manipuleren. Er is sprake van een bron, een elektronenkanon, dat elektronen genereert door verhitting van een filament in een hoog-vacuüm omgeving. Deze elektronen worden naar een anode getrokken. Elektromagnetische lenzen, waaronder een condensorlens om de bundel te concentreren en een objectieflens om scherp te stellen, sturen de elektronen. Voor scanning elektronenmicroscopie (SEM) zijn er ook componenten om de aftastbeweging te realiseren [98](#page=98). Het cruciale voordeel van elektronenmicroscopen ligt in de veel kleinere golflengte van elektronen vergeleken met zichtbaar licht. De golflengte van licht varieert van 400 tot 800 nanometer (nm), waardoor objecten kleiner dan deze golflengte niet waarneembaar zijn met een lichtmicroscoop omdat het golffront eromheen beweegt. De golflengte van elektronen is echter zo klein dat in principe individuele atomen waargenomen kunnen worden . Er zijn echter technische complicaties verbonden aan het gebruik van elektronen : * Elektronen worden gemakkelijk gestopt door gasmoleculen, wat vereist dat de elektronenmicroscoop in een nagenoeg absoluut vacuüm functioneert . * Er moet onder hoogspanning worden gewerkt om de elektronen voldoende snelheid te verlenen . * Elektrische en magnetische velden zijn noodzakelijk als lenzen om de elektronenstraal te sturen . ### 13.2 Typen elektronenmicroscopie Er wordt globaal onderscheid gemaakt tussen twee hoofdtypen elektronenmicroscopen: Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM) en Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) [99](#page=99). #### 13.2.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) TEM maakt gebruik van elektronen die door een ultradun preparaat heen gaan. De resolutie van TEM kan tot 1 nm reiken. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op de verstrooiing van elektronen op zware atoomkernen in het preparaat [100](#page=100) [99](#page=99). ##### 13.2.1.1 Preparatie- en kleuringstechnieken voor TEM Omdat biologisch materiaal van zichzelf weinig contrast geeft in een TEM, zijn aangepaste fixatie- en kleuringstechnieken essentieel . * **Fixatie:** Biologisch materiaal wordt gefixeerd met glutaaraldehyde, een bivalente crosslinker voor aminegroepen (voornamelijk in eiwitten), en osmiumtetroxide, een sterk oxidans dat lipiden en eiwitten stabiliseert . * **Kleuring:** Om contrast te creëren, wordt het materiaal blootgesteld aan verbindingen van zware metalen, zoals osmium, die elektronen weerkaatsen en zich aan specifieke structuren binden. Deze structuren verschijnen dan als donkere gebieden in het beeld, terwijl structuren met minder affiniteit voor deze 'kleurstoffen' meer elektronen doorlaten en lichter worden weergegeven. Als coupes te dik zouden zijn, zouden alle elektronen tegengehouden worden, wat resulteert in een zwart beeld . * **Negatieve kleuring:** Hierbij worden virusdeeltjes of andere structuren omgeven door een zwaar metaalzout (zoals uranylacetaat of fosfowolframzuur). Het metaal vult de ruimte rond het preparaat, waardoor het preparaat zelf wit afsteekt tegen een zwarte achtergrond . * **Shadowing (schaduwbestuiving):** Dit is een techniek waarbij het preparaat vanuit een schuine hoek wordt bestoven met een verdampt metaal (zoals platina, goud of chroom). Hierdoor ontstaat er een driedimensionaal effect doordat de ene kant van de structuur wordt belicht en de andere kant in de schaduw ligt . * **Rotary shadowing:** Een specifieke vorm van shadowing waarbij het preparaat onder een zeer lage hoek op een roterend specimen wordt bestoven, vaak gebruikt voor visualisatie van nucleïnezuren . * **Ultradunne secties:** Voor TEM worden ultradunne coupes van 50-100 nm gemaakt na fixatie. Vanwege de dunheid van de coupes is expertise vereist voor een correcte driedimensionale interpretatie . ##### 13.2.1.2 Toepassingen van TEM TEM wordt gebruikt om de interne structuur van objecten te bestuderen, zoals weefsels, cellen en virussen. Voorbeelden van TEM-analyse zijn de visualisatie van het corona virus een plantenvirus collageenvezels en poliovirusdeeltjes [99](#page=99). #### 13.2.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) SEM wordt gebruikt om het oppervlak van preparaten in beeld te brengen. Hierbij mag het preparaat groter en dikker zijn, maar het moet wel worden gecoat met een zwaar metaal. Het preparaat wordt in hoog vacuüm afgetast met een elektronenbundel. Hierbij treedt terugkaatsing van elektronen op en wordt de generatie van secundaire elektronen bevorderd. Deze secundaire elektronen worden gedetecteerd door een scintillator, waarna een driedimensionaal beeld computergestuurd wordt berekend [99](#page=99). ##### 13.2.2.1 Vergelijking TEM vs SEM | Kenmerk | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | | :------------------- | :-------------------------------------------------------------------- | :------------------------------------------------------------------------- | | **Focus** | Interne structuur van ultradunne preparaten | Oppervlaktestructuur van preparaten | [99](#page=99). | **Preparatie** | Vereist ultradunne secties (50-100 nm) | Preparaten mogen groter en dikker zijn, maar moeten metaal-gecoat zijn | [99](#page=99). | **Principe beeldvorming** | Doorlating van elektronenbundel, verstrooiing door zware atomen | Scanning met elektronenbundel, detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen | [100](#page=100) [99](#page=99). | **Beeldweergave** | Op een fluorescerend scherm | Computergestuurde 3D-reconstructie van gedetecteerde signalen | [100](#page=100) [99](#page=99). | **Resolutie** | Tot 1 nm | Typisch enkele nanometers, afhankelijk van de bundel en detector | [99](#page=99). #### 13.3 Toepassingen en vergrotingen Met elektronenmicroscopen kunnen structuren tot op 1 nm zichtbaar gemaakt worden. TEM kan vergrotingen tot 600.000 keer en meer bereiken. Het scheidend vermogen van TEM is theoretisch kleiner dan 3 nm. SEM, met zijn 3D-beeldvorming, is uitermate geschikt voor het bestuderen van oppervlakken van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen [98](#page=98) [99](#page=99). --- # lichtmicroscopische analysemethoden en hun principes Lichtmicroscopische analysemethoden maken gebruik van licht om biologische structuren zichtbaar te maken, variërend van histologische kleuringen tot geavanceerde technieken voor levende cellen die werken op basis van interferentie van licht [57](#page=57) [59](#page=59). ### 14.1 Basisprincipes van lichtmicroscopie Het zichtbaar maken van ongekleurde, transparante preparaten met een standaard klaarveldmicroscoop is vaak problematisch vanwege een gebrek aan contrast. Contrast wordt gegenereerd door het benutten van verschillen in optische dichtheid binnen het preparaat, wat resulteert in faseverschuivingen in het doorvallende licht door afwijkende brekingsindices. Deze faseverschuivingen kunnen worden omgezet in amplitudeveranderingen (licht/donker) voor visualisatie [59](#page=59) [60](#page=60). #### 14.1.1 Histologische kleuringen Histologische kleuringen verhogen het contrast door de amplitude van bepaalde golflengtes van het opvallende licht te reduceren, wat resulteert in kleurvorming. Coupes worden typisch gedeparaffineerd (met tolueen) voordat ze worden gekleurd met waterige oplossingen van kleurstoffen [60](#page=60) [63](#page=63). ##### 14.1.1.1 Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring De hematoxyline en eosine (H&E) kleuring is een veelgebruikte routinekleuring voor histologisch onderzoek. Deze methode maakt gebruik van verschillen in de chemie van het weefsel om verschillende componenten anders te kleuren, voornamelijk via ionische binding [64](#page=64). * **Hematoxyline**: Wordt gebruikt in combinatie met een beitsmiddel, meestal een metaalkation zoals aluminium. In complex met aluminiumzouten is hematoxyline kationisch en werkt als een basische kleurstof. Het is positief geladen en reageert met negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern, waardoor deze blauw of donkerpaars kleuren. H&E kleuring van kernen toont gedetailleerde intranucleaire structuren en patronen van heterochromatinedensiteit, wat diagnostisch belangrijk is bij kankerdiagnose [64](#page=64) [65](#page=65). * **Eosine**: Is anionisch en werkt als een zure kleurstof. Het is negatief geladen en reageert met positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma, waardoor deze roze kleuren. In een typisch weefsel zijn de kernen blauw, terwijl het cytoplasma en de extracellulaire matrix variabel roze gekleurd zijn. Nucleoli worden met eosine gekleurd [64](#page=64) [65](#page=65). ##### 14.1.1.2 Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring PAS kleuring wordt gebruikt om vrije suikers aan te kleuren. In het voorbeeld van een darmvillus kleurt PAS het intervilleuze slijm en de microvilli (borstelzoom) aan [57](#page=57). ##### 14.1.1.3 Combinatiekleuringen H&E kleuring wordt vaak gecombineerd met andere technieken. Hematoxyline kan nuttig zijn als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken [66](#page=66). > **Voorbeeld:** Een voorbeeld van lichtmicroscopische analyse is de kleuring van een darmvillus met PAS en hematoxyline, waarbij PAS vrije suikers aankleurt en hematoxyline zure componenten [57](#page=57). > **Voorbeeld:** Een dunne darm van een muis gekleurd met H&E toont villi, lamina propria, muscularis mucosa, submucosa en crypten [58](#page=58). #### 14.1.2 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen Voor het bestuderen van levende cellen zijn speciale lichtmicroscooptechnieken ontwikkeld die werken zonder kleuringen of met specifieke kleuringen die het leven van de cel niet schaden. * **Fasecontrastmicroscopie**: Gebaseerd op faseverschuivingen van licht en interferentie. Deze techniek is ontwikkeld door Zernike en zet kleine faseveranderingen veroorzaakt door brekingsverschillen in het preparaat om in amplitudeveranderingen (licht/donker). Het wordt toegepast op ongekleurde preparaten, zoals gekweekte levende cellen of vriescoupes [59](#page=59). > **Tip:** Fasecontrastmicroscopie is ideaal voor het bestuderen van levende, ongekleurde cellen en weefselcoupes [59](#page=59). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (ook bekend als Nomarski microscopie)**: Maakt gebruik van positieve/negatieve interferentie van gepolariseerd licht. Het vereist gespecialiseerde microscopen met prisma's en interferentiefilters. DIC visualiseert verschillen in interferentie van doorvallend gepolariseerd licht [59](#page=59). * **Digitale microscopie**: Gebruikt computerverwerking van beelden met ultragevoelige videocamera's. Deze methode is dynamisch en maakt zowel real-time als time-lapse opnamen mogelijk [59](#page=59). * **Fluorescentiemicroscopen voor ‘life cell imaging’**: Worden ook gebruikt voor het bestuderen van levende cellen [59](#page=59). > **Voorbeeld:** Afbeeldingen tonen de vergelijking tussen klaarveldmicroscopie, DIC (Nomarski) en fasecontrastmicroscopie van levende cellen [62](#page=62). #### 14.1.3 Optische paden De optische weg in een microscoop beschrijft hoe het licht door het systeem wordt geleid. * **Klaarveldmicroscoop**: Licht gaat direct door het preparaat en de observator ziet een helder veld met donkere structuren [61](#page=61). * **Fasecontrastmicroscoop**: Gebruikt een speciaal diafragma en een ringvormige lens om faseverschillen in het licht dat door het preparaat gaat, om te zetten in zichtbaar contrast [61](#page=61). > **Tip:** Het begrijpen van het optische pad is cruciaal om de principes achter de verschillende contrasttechnieken te doorgronden [61](#page=61). --- # Principes en toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen, om moleculen en structuren binnen cellen en weefsels zichtbaar te maken [72](#page=72). ### 15.1 Algemene principes van fluorescentiemicroscopie #### 15.1.1 Fluorescentie en fluorochromen Fluorescentie is het verschijnsel waarbij een stof geabsorbeerd licht uitzendt op een langere golflengte. De geabsorbeerde straling wordt door het excitatiefilter doorgelaten, terwijl het barrièrefilter deze straling moet tegenhouden. Het emissiespectrum, de uitgezonden straling, heeft altijd een golflengte die groter is of gelijk aan de golflengte van het geabsorbeerde licht. Een typisch voorbeeld is het fluorochroom fluoresceïne (of Alexa 488), waarbij het excitatie- en emissiespectrum een duidelijke scheiding vertonen [73](#page=73) [74](#page=74). #### 15.1.2 Epifluorescentiemicroscopie Epifluorescentiemicroscopie maakt gebruik van geactiveerd licht met een korte golflengte (ultraviolet-blauw, groen) dat door het preparaat gaat, waarna de fluorochrome stof emissielicht uitzendt van een langere golflengte (groen, rood-infrarood). De belangrijkste componenten van een epifluorescentiemicroscoop zijn [72](#page=72): 1. **Excitatiebron:** Meestal een kwikdamplamp of LEDs [74](#page=74). 2. **Golflengtefilters in een filterkubus:** * **Excitatiefilter:** Selecteert de golflengte voor excitatie [74](#page=74). * **Dichroïsche spiegel (beamsplitter):** Reflecteert excitatielicht naar het preparaat en laat emissielicht door naar de detector [74](#page=74). * **Emissiefilter of stopfilter:** Blokkeert het excitatielicht en laat het emissielicht door [74](#page=74). 3. **Detector:** Het menselijk oog of een camera (digitaal/analoog) [74](#page=74). > **Tip:** De scheiding tussen absorptie- en emissiefilters is cruciaal om de fluorescentie van het monster te kunnen waarnemen zonder de storende invloed van het excitatielicht [73](#page=73). #### 15.1.3 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) CLSM is een geavanceerdere vorm van fluorescentiemicroscopie die een laser als exciterende lichtbron gebruikt (meestal een Argon-laser van 488 nm). CLSM maakt het mogelijk om zeer dunne optische coupes van een preparaat te verkrijgen, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en minder achtergrondruis [72](#page=72). ### 15.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie is een veelzijdige techniek met diverse toepassingen in de biologie en geneeskunde [75](#page=75). #### 15.2.1 Kwantificeren van moleculen in cellen De fluorescentie van de gebruikte kleurstoffen kan afhangen van de concentratie van specifieke ionen of moleculen [75](#page=75). * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Deze kleurstoffen veranderen hun fluorescentie als reactie op veranderingen in de concentratie van specifieke ionen, zoals calcium (Ca²⁺). Fura-2 is een voorbeeld van een Ca²⁺-gevoelige kleurstof die intracellulaire Ca²⁺-concentraties kan meten [75](#page=75). > **Voorbeeld:** Fura-2 kleuring in levende cellen toont de distributie van Ca²⁺. Een bewegende cel kan hoge Ca²⁺-concentraties vertonen in groene gebieden, en een richtingverandering kan gepaard gaan met de vorming van een nieuwe gradient [75](#page=75). #### 15.2.2 Immunofluorescentie microscopie Bij immunofluorescentie worden specifieke eiwitten gedetecteerd met behulp van antilichamen waaraan een fluorochroom is gekoppeld. Dit maakt het mogelijk om de locatie en distributie van specifieke eiwitten in cellen en weefsels te bestuderen [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78). #### 15.2.3 Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten Eiwitten kunnen worden gemodificeerd door genen te clonen die coderen voor fluorescente eiwitten, zoals Blue Fluorescent Protein (BFP) of Yellow Fluorescent Protein (YFP). Hierdoor kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden gedetecteerd en gevolgd. Dit wordt ook wel genetische codering met fluorescentie eiwitten genoemd [75](#page=75) [79](#page=79) [80](#page=80). > **Voorbeeld:** Inbouw van genen voor Blue Fluorescent Protein en Yellow Fluorescent Protein in embryonale stamcellen van de muis resulteert in blauw en groen fluorescerende embryo's in verschillende stadia van ontwikkeling [79](#page=79). #### 15.2.4 Visualisatie van organellen Fluorescentiemicroscopie kan worden gebruikt om specifieke organellen, zoals lysosomen en mitochondriën, in gecultiveerde cellen te visualiseren [76](#page=76). #### 15.2.5 Visualisatie van cytoskelet en celstructuren De techniek maakt het mogelijk om cytoskeletcomponenten, zoals actinekabels, en adhesiepunten, zoals vinculine, aan te kleuren. Dubbele fluorescentie kan colocalisatie van deze structuren aantonen [79](#page=79). #### 15.2.6 Gecombineerde technieken Fluorescentiemicroscopie kan worden gecombineerd met andere beeldvormingstechnieken om uitgebreide informatie te verkrijgen. > **Voorbeeld:** Een driedubbele overlay kan morfologie (met DIC – Nomarski), kernen (DNA met blauw fluorochroom) en mitochondriën (met rood fluochroom) tegelijkertijd visualiseren [82](#page=82). ### 15.3 Microscopen en registratie #### 15.3.1 Typische epifluorescentiemicroscopen Klassieke epifluorescentiemicroscopen kunnen worden gebruikt met digitale registratie, zowel met als zonder oculaire [81](#page=81). #### 15.3.2 Beeldregistratie en analyse Beelden kunnen worden geregistreerd met verschillende bit-dieptes, zoals 8-bit voor kleurkanalen of 24-bit voor overlay-beelden. Dit maakt gedetailleerde analyse van de fluorescentiepatronen mogelijk [82](#page=82). --- # Methoden en materialen voor celkweek en immunofluorescentiemicroscopie Dit onderwerp behandelt de fundamentele methoden en materialen die gebruikt worden in celkweek en immunofluorescentiemicroscopie, essentieel voor het observeren en bestuderen van cellen en weefsels. ### 16.1 Celkweek: principes en praktische aspecten Celkweektechnieken maken het mogelijk om cellen en weefsels buiten hun natuurlijke omgeving, *in vitro*, te laten groeien voor onderzoek. Dit proces is cruciaal voor het bestuderen van celgedrag, ontwikkeling en ziektes. #### 16.1.1 Historische ontwikkeling en types celculturen De geschiedenis van celkweek begon met *tissue culture* (1907; Harrison), waarbij zenuwweefsel van kikkerembryo's werd gekweekt. Later ontwikkelde zich de *monolaagcultuur* (1948; Earle), die 2D-simulaties van 3D-organen biedt. Oorspronkelijk werd gebruik gemaakt van orgaanexplantaten (*primaire cultures*), maar met de tijd werden stabielere, *geïmmortaliseerde cellijnen* ontwikkeld. Deze cellijnen, afkomstig van tumoren of verkregen na selectie (*crisis*), hebben potentieel een onbeperkte levensduur. Cellijnen zijn echter niet volledig stabiel en kunnen na meerdere passages (*splitsen*) veranderen [8](#page=8). > **Tip:** Het verschil tussen primaire culturen en cellijnen is belangrijk. Primaire culturen zijn direct uit weefsel geïsoleerd en hebben een beperkte levensduur, terwijl cellijnen langer kunnen groeien en voor consistente experimentele resultaten kunnen zorgen. #### 16.1.2 Preparatie van cellijnen Het proces om een cellijn te maken vanuit een weefselstukje omvat meerdere stappen [9](#page=9): * Enzymatische behandeling van het weefsel om cellen te isoleren [9](#page=9). * Concentratie van de cellen door uitzakken of centrifugeren [9](#page=9). * Uitplaatsten van de cellen in een geschikt groeirecipiënt [9](#page=9). * Indien succesvol, kunnen de cellen zich vermenigvuldigen en een confluente laag vormen [9](#page=9). * Bij confluente lagen worden de cellen losgemaakt en gesplitst (*getransfereerd*) naar nieuwe recipiënten [9](#page=9). #### 16.1.3 Typische celculturen Typische celculturen zijn te zien als monolaagculturen van epitheelcellen, waarbij kolonies ontstaan uit individuele cellen [10](#page=10). #### 16.1.4 Groeimedia en cultuurcondities Het medium is essentieel voor celgroei *in vitro* en moet zo veel mogelijk de *in vivo* omstandigheden nabootsen. Een klassiek voorbeeld is MEM (*Minimum Essential Medium*), dat isotonische zouten, een energiebron (glucose), essentiële aminozuren en vitamines bevat. Serum, zoals foetaal kalfsserum, is vaak noodzakelijk, maar kan kwaliteitsvariatie vertonen. Andere veelgebruikte media zijn DMEM, M199, McCoy’s en RPMI 1640 [11](#page=11). De culturen moeten groeien onder een atmosfeer van 5% CO₂ in lucht, wat vergelijkbaar is met het CO₂-gehalte in bloed en weefselvochten (0,03% in de atmosfeer), om een pH van ongeveer 7,4 te handhaven [11](#page=11). > **Tip:** De pH van het groeimedium is cruciaal. Een goede buffering met NaHCO₃/H₂CO₃ is essentieel om de pH stabiel te houden, net als in het bloed. #### 16.1.5 Cultuurrecipiënten Voor celkweek worden verschillende recipiënten gebruikt, afhankelijk van de kweekmethode: * **Gesloten flessen (falcons):** CO₂ wordt toegevoegd voordat de fles wordt gesloten [12](#page=12). * **Open platen:** Gebruikt in CO₂-ovens [12](#page=12). * **Rollerflessen:** Geschikt voor grote celoppervlakken met relatief weinig medium [12](#page=12). * **CO₂-ovens:** Waarin de cultuurplaten worden geplaatst om de juiste atmosfeer en temperatuur te handhaven [12](#page=12). #### 16.1.6 Oorsprong van cellen en cellijnen Cellen voor onderzoek kunnen afkomstig zijn van andere laboratoria, eigen isolatie (*primaire culturen*), of celbanken zoals ATCC (*The American Type Culture Collection*) en ECACC (*The European Collection of Cell Cultures*) [14](#page=14). #### 16.1.7 Groeisubstraten en -procedures Substraten beschermen cellen tegen *anoïkis* (een vorm van geprogrammeerde celdood) en zijn essentieel voor *adherente celcultures*. Veelgebruikte substraten zijn glas en voorbehandeld polystyreen. Daarnaast worden coatings gebruikt, zoals poly-D-lysine, collageen (een ECM-eiwit), of geconditioneerd medium van feeder-cellen [15](#page=15). Cellen interageren met hun micro-omgeving via: * **Aspecifieke fysieke interactie:** Dit maakt adhesie en spreiding van cellen mogelijk (in tegenstelling tot *anchorage-independence*) [16](#page=16). * **Specifieke functionele interactie:** Dit kan leiden tot differentiatie-inductie door signalen van de basaalmembraan (ECM) [16](#page=16). #### 16.1.8 Celdichtheids-afhankelijke inhibitie Cellen in cultuur stoppen met delen wanneer ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen, een fenomeen genaamd *contactinhibitie*. Dit wordt deels veroorzaakt door competitie voor groeifactoren (*mitogenen*). Het toevoegen van vers medium kan de delingen hervatten, maar efficiënter is het splitsen van de cultuur [17](#page=17). #### 16.1.9 3D-celgroei Hoewel monolaagcultures gangbaar zijn, kunnen tumorcellen ook in 3D groeien in dichte foci. Sommige celtypes, zoals epitheelcellen (bv. MDCK-cellen), kunnen 2D- of 3D-structuren vormen afhankelijk van de groeiongeving, wat de *in vivo* omgeving nabootst. In 3D-culturen kunnen cellen apicaal of basolateraal gaan functioneren, gescheiden door celmembranen [18](#page=18) [19](#page=19). #### 16.1.10 Procedure van celtransfer (splitsen) Celtransfer is noodzakelijk om de cellijnen te onderhouden. * **Suspensiecultures:** Eenvoudige verdunning met vers medium [20](#page=20). * **Adherente cellen:** Na confluentie wordt de cultuur behandeld met een trypsine/EDTA (TE) oplossing [20](#page=20). * Trypsine degradeert oppervlakte-eiwitten [20](#page=20). * EDTA cheleert calcium- en magnesiumionen, wat intercellulaire en cel-substraat-bindingen verstoort [20](#page=20). * Dit leidt tot loslaten van de cellen en vorming van een monocellulaire suspensie [20](#page=20). * De suspensie wordt vervolgens verdund (bv. 1:3 tot 1:30) en uitgezaaid in nieuwe recipiënten [20](#page=20). #### 16.1.11 Celadhesie en -spreiding Na het losmaken en uitplaatsten van cellen vinden stappen plaats van adhesie en spreiding [22](#page=22): 1. Cellen zakken uit door gravitatie [22](#page=22). 2. Initieel contact met het substraat [22](#page=22). 3. Progressieve spreiding over het substraat, wat energie en cytoskeletwijzigingen vereist [22](#page=22). 4. Vorming van sterke binding met het substraat door modificatie met eigen ECM-moleculen [22](#page=22). Ondanks sterke adhesie kunnen cellen migreren door tijdelijke inhibitie van adhesie op één plaats en opbouw elders [22](#page=22). #### 16.1.12 Speciale apparatuur voor celcultuur Essentiële apparatuur omvat: * **Laminaire flowbench:** Biedt een steriele werkomgeving met een HEPA-filter [23](#page=23). * **CO₂-oven:** Met HEPA-filter voor het handhaven van de juiste gas- en temperatuurcondities [23](#page=23). * **Opslag in vloeibare stikstof (-196°C):** Voor langdurige bewaring van cellen met behulp van cryoprotectiva zoals glycerol of DMSO [23](#page=23). De CTC core in The Core (UZ campus) beschikt over 17 flowbenches [24](#page=24). #### 16.1.13 Differentiatie *in vitro* Differentiatie is het proces waarbij een cel zich ontwikkelt tot een meer gespecialiseerd celtype. Dit kan spontaan gebeuren (bv. myoblast naar myotube) of geïnduceerd worden [26](#page=26). #### 16.1.14 Stamcellen Stamcellen zijn cellen die het vermogen hebben tot zelfvernieuwing en tot differentiatie in verschillende cel- en weefseltypes [27](#page=27). * **Totipotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot een volledige foetus en placenta. De bevruchte eicel is aanvankelijk totipotent [28](#page=28). * **Pluripotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen van de drie kiemlagen, maar niet tot de placenta. De binnenste celmassa van de blastocyst is pluripotent [29](#page=29). * **Multipotente stamcellen:** Zijn beperkt tot een specifiekere reeks celtypen binnen een bepaalde weefsellijn (bv. hemopoëtische stamcellen voor bloedcellen) [30](#page=30). De aanmaak van muizen embryonale stamcellen (mES) en humane embryonale stamcellen (hES) vereist specifieke kweekcondities, zoals feederlagen en groeifactoren zoals LIF. Het gebruik van humane embryonale stamcellen roept ethische discussies op vanwege de status van het embryo [31](#page=31) [32](#page=32) [33](#page=33). #### 16.1.15 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) iPSCs zijn ethisch minder beladen omdat ze worden gegenereerd door het reprogrammeren van somatische cellen tot een pluripotente staat [34](#page=34). #### 16.1.16 Organoïden Organoïden zijn *in vitro* gekweekte, 3D-structuren die organen nabootsen en afkomstig zijn van stamcellen [36](#page=36). #### 16.1.17 Kwaliteitscontrole in celkweek Kwaliteitscontrole is essentieel om contaminatie en genetische instabiliteit te voorkomen. * **Contaminatie met micro-organismen:** Bacteriën, gisten, schimmels en met name *mycoplasma’s* kunnen celcultures aantasten. Mycoplasma's zijn moeilijk te detecteren en te elimineren [37](#page=37). * **Contaminatie met vreemde cellen:** Verkeerde identificatie van cellijnen (bv. HeLa-varianten, muizen- of rattenonderstammen) is een bekend probleem, te detecteren via genetische fingerprinting en karyotypering [37](#page=37). * **Effecten van mycoplasma contaminatie:** Kan leiden tot veranderingen in eiwit-, RNA- en DNA-synthese, metabolisme, chromosomale aberraties, veranderingen in celmembraan, morfologie, en kan assays beïnvloeden. Specifieke effecten zijn waargenomen bij hybridoma's, zoals inhibitie van cel Fusie en interferentie met antistofscreening [38](#page=38). * **Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit:** Kan worden gemeten door karyotypering (aantal en vorm van chromosomen) [39](#page=39). * **Inherente genetische instabiliteit:** Het genotype van gecultiveerde cellen is vaak evoluerend. Dit kan worden beperkt door regelmatig terug te keren naar *stock-cultures* die zijn ingevroren in vloeibare stikstof [40](#page=40). ### 16.2 Preparatie en observatie van cellen en weefsels Om cellen en weefsels onder de lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM) te kunnen bestuderen, zijn specifieke preparatietechnieken noodzakelijk. Biologisch materiaal is vaak te dik en bevat te weinig contrast om direct geobserveerd te kunnen worden [42](#page=42) [7](#page=7). #### 16.2.1 Vereiste stappen in histologische technieken De algemene procedure omvat: 1. **Fixeren:** Behoud van de oorspronkelijke structuur door denaturatie van eiwitten [45](#page=45). 2. **Inbedden en snijden:** Het weefsel wordt ingebed in een hard materiaal en in dunne coupes gesneden [43](#page=43) [46](#page=46). 3. **Kleuren of contrasteren:** Verbetering van het zichtbare contrast in de coupes [7](#page=7). #### 16.2.2 Fixatie Fixatie stopt afbraakprocessen door enzymen te denatureren [45](#page=45). * **Chemische fixatie:** Gebruikt fixatieven zoals formol (voor LM) of glutaraldehyde (voor EM). Deze cross-linken eiwitten en behouden structurele componenten [45](#page=45). * **Invriezen (koude fixatie):** Maakt snelle preparatie mogelijk en behoudt epitopen beter voor immuunkleuringen [45](#page=45). Artefacten kunnen ontstaan door veranderingen tijdens de fixatie die afwijken van de *in vivo* situatie [45](#page=45). #### 16.2.3 Inbedden Het gefixeerde materiaal wordt omwikkeld en doordrongen met een inbedmiddel dat hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken [46](#page=46). * **Paraffine:** Een klassiek, hydrofoob inbedmiddel dat het weefsel doordringt na dehydratatie en "clearing" met tolueen [47](#page=47). * **Hars/plastics:** Hardere inbedmiddelen die dunnere coupes mogelijk maken voor EM [48](#page=48). Het weefsel moet eerst worden gedehydrateerd met een reeks alcoholbaden en vervolgens "geklaard" met een mengbare substantie zoals tolueen [47](#page=47). #### 16.2.4 Snijden Met behulp van een microtoom worden dunne coupes gemaakt: * **LM:** Paraffine coupes van 5-10 µm dik, snijdbaar met een stalen mes. Coupes worden op glazen draagglas geplaatst [48](#page=48). * **EM:** Hars/plastic coupes van 70 nm dik, snijdbaar met glazen of diamanten messen. Coupes worden op metalen roosters (grids) geplaatst [48](#page=48). #### 16.2.5 Microscopie technieken Verschillende microscopietechnieken worden gebruikt voor de observatie van cellen en weefsels. ##### 16.2.5.1 Lichtmicroscopie (LM) De resolutie van LM wordt bepaald door het objectief en de golflengte van licht, typisch rond 200 nm [52](#page=52). * **Klaarveldmicroscoop (bright field):** Het klassieke type dat doorvallend wit licht gebruikt. Bestaat uit een condensor, objectief en oculairen. Preparaten kunnen gefixeerd en gekleurd zijn, of levend maar met potentieel te weinig contrast [52](#page=52) [53](#page=53). * **Kleuringen:** Hematoxyline/Eosine (HE) is een veelgebruikte kleuring die verschillende celcomponenten aankleurt op basis van lichtabsorptie. PAS kleurt vrije suikers aan [44](#page=44) [57](#page=57). * **Effectieve resolutie:** Wordt beïnvloed door het preparaat; gefixeerd/gekleurd voor absorptiedetectie, of levend met speciale technieken [52](#page=52). * **Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen:** * **Fasecontrastmicroscopie:** Benut kleine faseverschuivingen veroorzaakt door brekingsindexverschillen om een zwart-wit beeld te creëren. Ideaal voor ongekleurde preparaten zoals levende celculturen [59](#page=59) [60](#page=60) [61](#page=61) [62](#page=62). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski):** Maakt gebruik van interferentie van gepolariseerd licht om contrast te genereren [59](#page=59) [60](#page=60) [62](#page=62). * **Digitale microscopie:** Gebruikt ultragevoelige videocamera's en computerverwerking voor dynamische beelden, inclusief *real-time* en *time-lapse* opnamen [59](#page=59). * **Fluorescentiemicroscopie:** Wordt gebruikt voor *life cell imaging* [59](#page=59). > **Tip:** Bij het observeren van levende, ongekleurde cellen zijn fasecontrast- of DIC-microscopen vaak essentieel om structuren zichtbaar te maken, omdat deze technieken het inherente contrast van de cel benutten. #### 16.2.6 Immunofluorescentiemicroscopie (Conceptueel) Hoewel de details van immunofluorescentiemicroscopie pas later in het document worden uitgewerkt, wordt al verwezen naar het gebruik ervan in celcultuur experimenten. Immunofluorescentie maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan doelmoleculen in cellen, waarna deze antilichamen gekoppeld zijn aan fluorescerende moleculen. Deze moleculen zenden licht uit wanneer ze worden geëxciteerd door een specifieke golflengte, waardoor de lokalisatie van het doelmolecuul in de cel zichtbaar wordt. Dit is een krachtige techniek om de locatie en distributie van eiwitten en andere moleculen in cellen en weefsels te bestuderen [13](#page=13). --- ## 16 Methoden en materialen voor celkweek en immunofluorescentiemicroscopie Dit onderwerp behandelt de verschillende methoden en materialen die gebruikt worden voor het prepareren van biologische monsters voor microscopische analyse, met een specifieke focus op histologische kleuringen en immunofluorescentiemicroscopie. ### 16.1 Histologische kleuringen Histologische kleuringen worden gebruikt om weefselstructuren zichtbaar te maken die anders transparant zouden zijn, waardoor een gedetailleerd beeld van het weefsel verkregen kan worden. Deze kleuringen maken gebruik van verschillen in de chemie van het weefsel om componenten verschillend te kleuren, waarbij ionische binding het belangrijkste bindingsmechanisme is [64](#page=64). #### 16.1.1 Hematoxyline en Eosine (H/E) kleuring Hematoxyline en Eosine (H&E) is de meest gebruikte routinekleuring voor histologisch onderzoek [64](#page=64). * **Hematoxyline:** In combinatie met aluminiumzouten werkt hematoxyline als een kationische, basische kleurstof. Het reageert met negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern, die hierdoor blauw tot donkerpaars kleuren. Hematoxyline zelf kleurt weefsels niet direct en vereist een beitsmiddel, meestal een metaalkation zoals aluminium. De kleuring van nucleïnezuren is complex en nog niet volledig begrepen [64](#page=64) [65](#page=65). * **Eosine:** Eosine is een anionische, zure kleurstof. Het reageert met positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma, die hierdoor roze kleuren. Eosine kleurt niet-specifiek eiwitten aan [64](#page=64) [65](#page=65). Met H&E kleuring kleuren de kernen blauw, terwijl het cytoplasma en de extracellulaire matrix in variërende mate roze gekleurd zijn. Goed gefixeerde cellen vertonen gedetailleerde intranucleaire structuren. Verschillende patronen van heterochromatinecondensatie in de kernen (hematoxyline-kleuring) zijn diagnostisch belangrijk voor weefseltypes en kankertypes. Nucleoli worden gekleurd met eosine. Overvloedige polyribosomen geven het cytoplasma een blauwe gloed, en de Golgi-zone kan geïdentificeerd worden door de afwezigheid van kleuring naast de kern [65](#page=65). > **Tip:** H&E kleuring is niet compatibel met immunofluorescentie. Echter, het gebruik van hematoxyline zonder eosine kan nuttig zijn als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures met colorimetrische substraten [65](#page=65). #### 16.1.2 Specifieke kleurtechnieken Naast H&E worden diverse specifieke kleurtechnieken toegepast: * **Indifferente kleurstoffen:** Deze kleuren voornamelijk vetten aan, zoals Oil Red O voor vetcellen [68](#page=68). * **Immunohistochemische kleuring:** Deze techniek maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan bepaalde bestanddelen in het weefsel. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, een fluorescente label of colloïdaal goud. Dit maakt de detectie van specifieke eiwitten mogelijk, zoals Connexine 43 in muishart coupes [67](#page=67) [69](#page=69). * **Enzymkleuringen:** Deze tonen de activiteit van specifieke enzymen aan door gebruik te maken van een enzymspecifiek substraat. De reactie resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de kleuring van glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten met behulp van de tetrazoniumzoutmethode [67](#page=67) [70](#page=70). ### 16.2 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen genaamd, om specifieke moleculen of structuren in cellen en weefsels te visualiseren [72](#page=72). #### 16.2.1 Werkingsprincipe Fluorescerende stoffen absorberen licht van een bepaalde golflengte (excitatie) en zenden dit vervolgens uit op een langere golflengte (emissie). Het geabsorbeerde licht wordt omgezet in fluorescentiestraling, die altijd een golflengte heeft die groter is dan of gelijk is aan die van het geabsorbeerde licht. De absorptiestraling wordt doorgelaten door een excitatiefilter, terwijl een barrièrefilter deze straalt moet tegenhouden [73](#page=73). #### 16.2.2 Typen fluorescentiemicroscopen * **Epifluorescentiemicroscopie:** Hierbij wordt het preparaat geëxciteerd met licht van korte golflengte (UV-blauw, groen), waarna de fluorochrome stof emissielicht uitzendt van langere golflengte (groen, rood-infrarood). Conventionele epifluorescentiemicroscopen gebruiken typisch een kwikdamplamp of LED's als lichtbron [72](#page=72). * **Onderdelen van een epifluorescentiemicroscoop:** 1. Excitatiebron (Hg of Xe lamp) [74](#page=74). 2. Golflengtefilters in een filterkubus: excitatiefilter, dichroïsche spiegel (beamsplitter) en emissiefilter of stopfilter [74](#page=74). 3. Detector (ogen, camera) [74](#page=74). * **Confocale laser scanning microscopie (CLSM):** Deze techniek maakt gebruik van een laser als excitatiebron (bijvoorbeeld een Argon-laser van 488 nm). CLSM scant het monster punt voor punt en gebruikt een pinhole om strooilicht van buiten het focale vlak te elimineren, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en contrast. Dit maakt het mogelijk om beelden in 3D (XYZ) te reconstrueren en is beter geschikt voor time-lapse analyses van dynamische processen [72](#page=72) [84](#page=84) [87](#page=87). #### 16.2.3 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie kan moleculen in levende en gefixeerde cellen aankleuren en kwantificeren [74](#page=74). * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** De fluorescentie van deze kleurstoffen hangt af van de ionenconcentratie. Fura-2 is een voorbeeld van een Ca²⁺-gevoelige kleurstof die gebruikt kan worden om intracellulaire Ca²⁺-concentratieveranderingen te meten [74](#page=74). * **Immunofluorescentiemicroscopie:** Detecteert specifieke eiwitten met behulp van antilichamen waaraan een fluorofoor is gekoppeld. Dit wordt gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in gefixeerde cellen en weefsels te bestuderen, zoals de CFTR eiwitlokalisatie bij cystische fibrose [74](#page=74) [92](#page=92). * **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Hiermee kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden gedetecteerd en gevolgd [74](#page=74). * **Visualisatie van organellen:** Lysosomen en mitochondria kunnen gevisualiseerd worden in gecultiveerde cellen [75](#page=75). * **Meerdere eiwitten tegelijk:** De kleuring van twee verschillende eiwitten in een cel is mogelijk. Bijvoorbeeld, het visualiseren van het cytoskelet (actine in groen) en ‘voetjes’ (vinculine in rood) toont colocalisatie aan [77](#page=77) [78](#page=78). #### 16.2.4 Geavanceerde fluorescentietechnieken * **Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie:** Softwarematige bewerking van conventionele digitale beelden met deconvolutie-algoritmes kan ook resulteren in beelden met een zeer hoge resolutie [86](#page=86). * **4D Live Cell Imaging:** Dit combineert snelle 3D-multi-kleurenimaging met time-lapse opnames om dynamische processen over tijd te bestuderen. Het vereist een speciale opstelling met een incubatiekamer, een gemotoriseerde microscoop en een digitale camera [88](#page=88) [89](#page=89). * **Virtuele microscopie:** Een digitale simulatie van klassieke microscopie via de computer, waarbij cel- en weefselpreparaten volledig worden ingescand om een gedigitaliseerd beeld te verkrijgen waarin genavigeerd en gezoomd kan worden [95](#page=95). ### 16.3 Andere microscopische technieken #### 16.3.1 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopie maakt gebruik van elektronenbundels in plaats van licht om beelden te genereren, wat resulteert in een veel hogere resolutie. De golflengte van elektronen is aanzienlijk kleiner dan die van licht, waardoor structuren tot op atomair niveau zichtbaar gemaakt kunnen worden . * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** Bij TEM wordt een elektronenbundel door een ultradun preparaat gestuurd, en het beeld wordt gevormd door de door het monster verstrooide elektronen. De resolutie kan 1 nm bedragen. TEM is geschikt voor het bestuderen van de interne structuren van objecten zoals weefsels, cellen en virussen [98](#page=98) [99](#page=99). * **Fixatie en Kleuring voor TEM:** Biologisch materiaal vertoont van zichzelf weinig contrast in een TEM. Om dit te verhogen, wordt gebruik gemaakt van verbindingen van zware metalen (zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat, loodcitraat) die elektronen weerkaatsen. Ultradunne secties (50-100 nm) zijn vereist omdat dikkere coupes alle elektronen zouden tegenhouden . * **Speciale EM technieken voor TEM:** * **Negatieve kleuring:** Het monster wordt geïncubeerd met een zwaar metaal, waardoor het monster zelf niet kleurt en wit verschijnt tegen een zwarte achtergrond van het metaal . * **Shadowing (rotary shadowing):** Het preparaat wordt onder een schuine hoek bestoven met een metaal (bijv. platina, goud). Dit wordt gebruikt om bijvoorbeeld virussen of nucleïnezuren te visualiseren . * **Scanning-elektronenmicroscopie (SEM):** Bij SEM wordt een elektronenbundel over het oppervlak van het preparaat gescand. Het beeld wordt gevormd door de gereflecteerde elektronen en secundaire elektronen. SEM is geschikt voor het in beeld brengen van het oppervlak van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen. Het preparaat moet geleidend gemaakt worden, vaak door coating met een dun laagje goud of goud/palladium [98](#page=98) [99](#page=99). * **Technische complicaties en interpretatie:** Elektronenmicroscopie vereist hoog vacuüm, hoge spanning en specifieke elektromagnetische lenzen. De interpretatie van TEM-beelden kan complex zijn, aangezien verschillende doorsneden van een kronkelige structuur sterk uiteenlopende beelden kunnen geven . #### 16.3.2 Speciale EM-technieken * **Vries-breek (freeze-fracture) en Vries-ets (freeze-etching):** Deze technieken worden gebruikt om membraanstructuren in detail te bestuderen. Celmembranen worden gebroken tussen de binnen- en buitenhelft, en vries-etsen kan meer 3D-structuur onthullen door sublimatie van ijs. Het levert informatie op over de verdeling van eiwitten in de membraanhelften . * **Cryo-elektronen-tomografie:** Maakt 3D-reconstructies van objecten mogelijk op basis van een serie 2D-projecties die gemaakt worden terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld. Dit wordt gebruikt om complexe structuren zoals nucleaire poriecomplexen in detail te bestuderen . * **SBF-SEM & FIB-SEM:** Serial Block Face Scanning Electron Microscopy en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy maken gebruik van ultramicrotomie of ionenlasers om materiaal weg te nemen in de microscoop, waardoor 3D-reconstructies van dikkere monsters mogelijk worden . ### 16.4 Celkweek en monsterpreparatie Celkweek is de basis voor veel van de hierboven beschreven microscopische technieken, met name voor het bestuderen van levende cellen en hun dynamische processen. De preparatie van specimens, of het nu gaat om gefixeerde weefsels of cellen, is cruciaal voor het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige beelden. Het selecteren van de juiste fixatie-, inbeddings- en kleuringstechnieken is essentieel, afhankelijk van de microscopische methode die zal worden toegepast. Bijvoorbeeld, de H&E kleuring is onverenigbaar met immunofluorescentie terwijl specifieke kleuringen noodzakelijk zijn voor zowel licht- als elektronenmicroscopie [64](#page=64) [65](#page=65) [74](#page=74) [88](#page=88). --- Dit onderwerp behandelt specifieke detectiemethoden voor eiwitten met behulp van elektronenmicroscopie en technieken voor het analyseren van grotere volumes in celbiologisch onderzoek. ### 16.1 Detectie van specifieke eiwitten met behulp van TEM De detectie van specifieke eiwitten binnen cellen kan worden uitgevoerd met behulp van immunofluorescentiemicroscopie, waarbij antilichamen worden ingezet om doelwiteiwitten te identificeren. Een voorbeeld hiervan is het gebruik van een antilichaam dat specifiek bindt aan een capsid-eiwit van bijvoorbeeld een HIV-partikel dat uit een cel uitgroeit (budding). Dit antilichaam kan vervolgens worden gekoppeld aan een marker die zichtbaar is onder de microscoop, wat de lokalisatie van het specifieke eiwit binnen de cel of extracellulair mogelijk maakt . ### 16.2 Analyse van grotere volumes met SBF-SEM en FIB-SEM Voor de analyse van grotere cellulaire volumes zijn Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) geavanceerde technieken . #### 16.2.1 Principies van SBF-SEM en FIB-SEM Beide technieken maken gebruik van de in-situ verwijdering van dunne lagen van een preparaat binnen de vacuümkamer van een Scanning Electron Microscope (SEM) . * **Serial Block-Face SEM (SBF-SEM):** Bij SBF-SEM wordt het materiaal verwijderd met behulp van een diamantmes. Na het verwijderen van een dunne laag wordt het oppervlak gescand, waarna het proces van laagverwijdering en scannen wordt herhaald. Dit resulteert in een reeks opeenvolgende beelden die samen een driedimensionale reconstructie van het monster vormen . * **Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM):** In tegenstelling tot SBF-SEM gebruikt FIB-SEM een focused ion beam (FIB) om materiaal weg te etsen. Net als bij SBF-SEM maakt dit iteratieve proces het mogelijk om grote driedimensionale volumes op hoge resolutie te reconstrueren. FIB-SEM kan met name nuttig zijn voor het prepareren van zeer specifieke gebieden binnen een monster voor analyse met hoge resolutie . Deze technieken zijn essentieel voor het bestuderen van de driedimensionale architectuur van cellen en weefsels op een niveau dat met conventionele microscopie niet haalbaar is . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Term | Definitie | | Celcultivering | Het proces waarbij cellen buiten hun natuurlijke omgeving, in een laboratorium, worden gekweekt. Dit omvat het isoleren van cellen uit weefsel, ze te plaatsen in een geschikte voedingsbodem en ze te laten groeien onder gecontroleerde omstandigheden. | | Enzymatische behandeling | Een stap in celcultivering waarbij enzymen worden gebruikt om weefsel af te breken en individuele cellen los te maken. Dit maakt het mogelijk om cellen te isoleren voor verdere kweek. | | Groeirecipiënt | Een container, zoals een petrischaal of kweekfles, waarin cellen worden geplaatst om te groeien in een celcultuur. Deze recipiënten bieden een steriele omgeving en de nodige ruimte voor celproliferatie. | | Monolaagcultuur | Een type celcultuur waarbij cellen zich verspreiden en een enkele laag vormen op het oppervlak van het groeirecipiënt. Dit is een veelvoorkomende methode voor het bestuderen van epitheelcellen en andere celtypen. | | Confluente laag | Een situatie in celcultivering waarbij de cellen zich zo hebben vermenigvuldigd dat ze het gehele beschikbare oppervlak van het groeirecipiënt bedekken en elkaar raken. Dit is vaak een signaal om de cellen te splitsen. | | Minimum Essential Medium (MEM) | Een veelgebruikt celcultuurmedium dat essentiële componenten bevat zoals isotonische zouten, een energiebron (glucose), aminozuren, vitamines en serum. Het zorgt voor de benodigde voedingsstoffen voor celgroei. | | Serum | Een bestanddeel van celcultuurmedia dat een complexe mix van groeifactoren, hormonen en andere moleculen bevat die essentieel zijn voor celgroei en -overleving. Het is een natuurlijk product met mogelijke kwaliteitsvariaties. | | CO2-incubator | Een apparaat dat wordt gebruikt om celculturen te laten groeien onder gecontroleerde omstandigheden. Het handhaaft een specifieke temperatuur, luchtvochtigheid en een atmosfeer met een verhoogd CO2-gehalte (typisch 5%) om de pH van het medium te stabiliseren. | | pH | Een maat voor de zuurgraad of alkaliteit van een oplossing. In celcultivering is het handhaven van een optimale pH (rond 7,4) cruciaal voor celgezondheid en -groei, vergelijkbaar met de pH in lichaamseigen vloeistoffen. | | Cultuurcondities | De omgevingsfactoren waaronder cellen in vitro worden gekweekt, zoals temperatuur, luchtvochtigheid, gasmengsel (bijv. 5% CO2 in lucht) en de samenstelling van het kweekmedium. Deze condities moeten zo nauwkeurig mogelijk de in vivo omgeving nabootsen. | | Cultuurrecipiënten | Diverse soorten containers die worden gebruikt voor celcultivering, waaronder gesloten flessen (zoals falcons), open platen en rollerflessen. De keuze van het recipiënt hangt af van het celtype en de specifieke kweekvereisten. | | Laminaire flowbench | Een werkstation dat een gecontroleerde, steriele omgeving creëert door middel van een continue luchtstroom, essentieel voor celkweekwerkzaamheden om contaminatie te voorkomen. | | HEPA filter | Een High Efficiency Particulate Air filter dat wordt gebruikt om de lucht in celkweekfaciliteiten te zuiveren van deeltjes, waaronder bacteriën en schimmels, om een steriele omgeving te handhaven. | | CO2 oven | Een incubatietoestel dat een gecontroleerde omgeving met een specifieke temperatuur en een verhoogde concentratie koolstofdioxide ($CO_2$) biedt, wat cruciaal is voor de groei van veel celtypen in cultuur. | | Celadhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat, zoals een kweekbodem of een ander celoppervlak, wat een fundamentele stap is voor celgroei, -spreiding en -migratie. | | Celspreiding | Het proces waarbij cellen zich progressief over een substraat verspreiden na initiële hechting, wat gepaard gaat met veranderingen in het cytoskelet en een vergroting van het celcontactoppervlak. | | Extracellulaire matrix (ECM) | Moleculen die door cellen worden aangemaakt en uitgescheiden om een ondersteunende structuur rondom de cellen te vormen, wat bijdraagt aan de cel-substraatsadhesie en weefselstructuur. | | Celmigratie | Het vermogen van een cel om zich te verplaatsen over een oppervlak, wat wordt gefaciliteerd door tijdelijke inhibitie van celadhesie op één locatie en opbouw van adhesie op een andere locatie in de bewegingsrichting. | | Vloeibare stikstof | Een cryogeen medium met een temperatuur van -196°C, gebruikt voor de langdurige opslag van ingevroren cellen om hun levensvatbaarheid te behouden voor toekomstig gebruik. | | Stamcel | Een cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen of weefsels. | | Zelfvernieuwing | Het vermogen van stamcellen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te maken, waardoor de stamcelpopulatie behouden blijft. | | Differentiëren | Het proces waarbij een minder gespecialiseerde cel verandert in een meer gespecialiseerd celtype, zoals een spiercel, zenuwcel of bloedcel. | | Totipotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot een volledige foetus, inclusief de placenta. De bevruchte eicel in de eerste uren na de bevruchting is een voorbeeld. | | Pluripotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen. De cellen van de binnenste celmassa van een blastocyst zijn pluripotent. | | Multipotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen binnen een bepaalde weefsellijn, maar beperkt is tot die specifieke lijn. Hemopoëtische stamcellen zijn een voorbeeld. | | Blastocyst | Een holle bal van cellen die zich vormt uit de bevruchte eicel ongeveer 4 dagen na de bevruchting, bestaande uit een buitenste laag cellen die de placenta vormt en een binnenste celmassa die de foetus ontwikkelt. | | Binnenste celmassa (ICM) | De groep cellen binnenin de blastocyst die het potentieel hebben om zich te ontwikkelen tot alle celtypen van de foetus. | | Contaminatie met micro-organismen | De aanwezigheid van vreemde micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en met name mycoplasma's in een celcultuur. Deze organismen kunnen zich snel vermenigvuldigen in voedingsrijke milieus en het cellulaire metabolisme verstoren, wat leidt tot problemen zoals verzuring van het medium. | | Mycoplasma's (PPLO) | Een specifieke groep micro-organismen die celculturen kunnen contamineren. Ze zijn parasitair, deels intracellulair, en kunnen het cellulaire metabolisme verstoren. Detectie kan plaatsvinden via methoden zoals cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA en PCR, en eliminatie is vaak moeilijk. | | Vreemde celcontaminatie | Het voorkomen van cellen van een andere soort of oorsprong dan de beoogde celcultuur. Dit kan variëren van cellijnen die per ongeluk zijn overgenomen van andere bronnen (bijvoorbeeld muiscellen in plaats van menselijke cellen) tot varianten van klassieke cellijnen zoals HeLa. | | Genetische fingerprinting | Een techniek die wordt gebruikt om de genetische identiteit van cellen te bepalen en zo contaminaties met vreemde cellijnen te detecteren. Het analyseert specifieke DNA-markers om de oorsprong van de cel te verifiëren. | | Karyotypering | Een diagnostische techniek waarbij het aantal en de morfologie van chromosomen in individuele cellen worden geanalyseerd. Dit helpt bij het beoordelen van de genetische stabiliteit en zuiverheid van een celcultuur, en kan afwijkingen zoals aneuploïdie of structurele chromosoomafwijkingen aan het licht brengen. | | Zuiverheid van celculturen | De mate waarin een celcultuur vrij is van ongewenste contaminanten, zoals micro-organismen of cellen van een andere oorsprong. Hoge zuiverheid is essentieel voor betrouwbare onderzoeksresultaten. | | Homogeniteit van celculturen | De mate waarin de cellen binnen een cultuur vergelijkbare kenmerken vertonen, met name op genetisch en fenotypisch niveau. Een homogene celcultuur bestaat uit cellen die grotendeels identiek zijn. | | Stabiliteit van celculturen | De mate waarin de genetische en fenotypische kenmerken van een celcultuur constant blijven over opeenvolgende passages. Cellijnen kunnen genetisch instabiel zijn en hun eigenschappen in de loop van de tijd veranderen. | | Inherente genetische instabiliteit | Het natuurlijke proces waarbij de genetische samenstelling (genotype), inclusief chromosoomvorm en -aantal, van cellen in cultuur in de loop van de tijd verandert. Dit kan leiden tot afwijkende celkenmerken en is een uitdaging bij langdurige celkweek. | | Stock-cultures | Gevriesde reserves van een celpopulatie die worden bewaard onder cryogene omstandigheden (bijvoorbeeld in vloeibare stikstof). Deze worden gebruikt om de genetische stabiliteit en identiteit van de celpopulatie te behouden door regelmatig terug te keren naar een verse, onveranderde bron. | | Cryoprotectief middel | Een stof, zoals glycerol of DMSO, die wordt toegevoegd aan cellen vóór het invriezen om de vorming van ijskristallen te minimaliseren en celschade tijdens het vries- en dooi-proces te voorkomen. | | Indifferente kleurstoffen | Kleurstoffen die vetten aankleuren, zonder specifieke affiniteit voor bepaalde celcomponenten. | | Immunohistochemische kleuring | Een techniek die specifieke celcomponenten aankleurt op basis van de binding tussen een antigeen en een antilichaam. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud om zichtbaarheid te creëren. | | Enzymkleuringen | Kleurtechnieken die de activiteit van enzymen aantonen door gebruik te maken van een voor het enzym specifiek substraat. De reactie tussen het substraat en het enzym resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag. | | Oil Red O | Een specifieke kleurstof die gebruikt wordt om vetcellen aan te kleuren, waardoor deze zichtbaar worden onder de microscoop. | | Immunocytochemische kleuring (DAB) | Een specifieke vorm van immunohistochemische kleuring die gebruikmaakt van diaminobenzidine (DAB) als substraat, wat resulteert in een bruine neerslag op de plaats van het antigeen. Deze techniek kan gebruikt worden om specifieke eiwitten zoals microtubuli of connexine 43 aan te tonen. | | Cytochemische kleuring | Een kleuringstechniek die de aanwezigheid of activiteit van specifieke chemische componenten binnen cellen of weefsels aantoont, zoals enzymen. | | Glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) activiteit | De activiteit van het enzym glucose-6-fosfaatdehydrogenase, dat een cruciale rol speelt in de pentosefosfaatroute. Cytochemische kleuringen kunnen deze activiteit in erytrocyten aantonen. | | Tetrazoniumzoutmethode | Een methode die gebruikt wordt in enzymkleuringen, specifiek voor het aantonen van de activiteit van bepaalde enzymen zoals glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD). | | Mucoviscidose | Een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door de productie van taai, visceus slijm in verschillende klieren, zoals de pancreas, bronchi en zweetklieren, als gevolg van mutaties in het CFTR-gen. | | CFTR-eiwit | Het Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator eiwit, dat betrokken is bij het transport van chloride-ionen door het celmembraan. Mutaties in het bijbehorende gen verstoren de productie of functie van dit eiwit. | | Immunohistochemie | Een techniek die wordt gebruikt om de lokalisatie van specifieke eiwitten in weefselcoupes te detecteren met behulp van antilichamen. Dit maakt onderscheid mogelijk tussen wild type en gemuteerde eiwitten. | | Wild type | De normale, niet-gemuteerde vorm van een gen of eiwit. Bij CFTR wordt het wild type eiwit naar het apicale membraan getransporteerd via het Golgi-netwerk. | | Mutatie (CFTR) | Een verandering in het CFTR-gen, waarvan de meest voorkomende een deletie van een aminozuur op positie 508 is. Dit leidt tot retentie van het eiwit in het ER en afbraak, resulterend in subcellulaire mislocatie. | | Subcellulaire mislocatie | De verkeerde plaatsing van een eiwit binnen de cel. Bij mucoviscidose kan het CFTR-eiwit mislokaliseren, waardoor het zijn functie niet kan uitoefenen. | | 4D Live Cell Imaging | Een geavanceerde microscopietechniek die een combinatie vormt van snelle 3D-multikleur-imaging en time-lapse opnames om dynamische processen in levende cellen over tijd en in drie ruimtelijke dimensies te bestuderen. | | Time lapse recording | Een methode waarbij beelden van een proces gedurende een bepaalde periode worden geregistreerd op vaste tijdspunten. Deze beelden worden vervolgens geassembleerd tot een versnelde film om snelle veranderingen zichtbaar te maken. | | 3D multi kleur imaging | Het simultaan registreren van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies, wat gedetailleerde driedimensionale beelden van celstructuren en moleculaire interacties oplevert. | | Lichtmicroscoop (LM) | Een microscoop die zichtbaar licht gebruikt om beelden van objecten te vergroten, bestaande uit optische en fijnmechanische onderdelen. | | Klaarveldmicroscopie (bright field microscopy) | Een type lichtmicroscopie waarbij preparaten worden bekeken met doorvallend wit licht, waarbij de detectie van structuren plaatsvindt op basis van lichtabsorptie. | | Resolutie | De kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden van elkaar kunnen worden waargenomen; bij een lichtmicroscoop wordt deze beperkt door de golflengte van het licht en het objectief. | | Objectief | Het lenssysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het preparaat bevindt en een eerste, vergroot beeld vormt; het bepaalt mede de resolutie van de microscoop. | | Oculair (eyepiece) | Het lenssysteem van een microscoop dat het door het objectief gevormde beeld navergroot en projecteert op het netvlies van de waarnemer. | | Condensor | Een lenssysteem in een lichtmicroscoop dat het licht van de lichtbron bundelt en richt op het preparaat, wat essentieel is voor de belichting en beeldkwaliteit. | | Preparaten | Materiaal dat wordt voorbereid en onder de microscoop wordt bekeken; dit kan variëren van celculturen op dekglaasjes tot versneden weefsels. | | Fixatie | Een proces waarbij biologisch materiaal wordt behandeld om de celstructuren te conserveren en te voorkomen dat ze afbreken, vaak een voorbereidende stap voor microscopisch onderzoek. | | Inbedding (embedding) | Het proces waarbij weefselmonsters worden omgeven door een medium, zoals paraffine, om ze stevig genoeg te maken voor het snijden van dunne secties voor microscopisch onderzoek. | | Cryosecties | Dun gesneden plakjes van bevroren biologisch materiaal, gebruikt voor microscopisch onderzoek wanneer fixatie met chemicaliën de structuur zou kunnen aantasten. | | Lichtabsorptie | Het proces waarbij een stof lichtenergie opneemt, wat bij klaarveldmicroscopie wordt gebruikt om structuren zichtbaar te maken. | | Contrast | Het verschil in helderheid of kleur tussen verschillende delen van een beeld, wat essentieel is voor de zichtbaarheid van structuren onder de microscoop. | | Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie | Een techniek die softwarematige bewerking van conventionele digitale beelden gebruikt om zeer aanvaardbare hoge resoluties te verkrijgen, vergelijkbaar met die van confocale microscopie. | | Confocaal laser scanning microscoop (CLSM) | Een type fluorescentiemicroscoop dat een laserstraal gebruikt om het monster punt voor punt optisch af te tasten, waarbij een pinhole wordt gebruikt om licht van buiten het focale vlak te elimineren en zo een hogere resolutie en contrast te bereiken. | | Pinhole | Een optisch element, vaak een kleine opening, dat in confocale microscopie wordt gebruikt om te voorkomen dat emissielicht van buiten het gewenste focale vlak de detector bereikt, wat resulteert in een scherper beeld. | | Focaal vlak | Het specifieke optische vlak binnen een monster dat zich in focus bevindt en waaruit het fluorescentielicht wordt verzameld voor detectie. | | Detector (PMT) | Een fotomultiplicatorbuis (PMT) die wordt gebruikt om het zwakke fluorescentielicht dat door het monster wordt uitgezonden te detecteren en te versterken, zodat het zichtbaar wordt gemaakt. | | Optische aftasting | Het proces waarbij een laserstraal systematisch over het oppervlak van een monster wordt bewogen om een beeld te creëren, waarbij elk punt afzonderlijk wordt gescand. | | Driedubbele fluorescentie-aankleuring | Een techniek waarbij drie verschillende fluorescerende kleurstoffen worden gebruikt om gelijktijdig verschillende structuren binnen een cel of weefsel zichtbaar te maken, zoals cytoskelet, mitochondria en DNA. | | Cytoskelet | Een netwerk van eiwitfilamenten en tubuli in het cytoplasma van veel organismen, dat vorm en mechanische ondersteuning biedt aan de cel. | | Mitochondria | Organellen in eukaryote cellen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire ademhaling en de productie van ATP, de belangrijkste energievaluta van de cel. | | DNA | Desoxyribonucleïnezuur, het molecuul dat de genetische instructies bevat voor de ontwikkeling, werking, groei en reproductie van alle bekende organismen. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een techniek die elektronenbundels gebruikt om beelden van zeer dunne monsters te creëren, waarbij de elektronen door het monster worden gestuurd en de interacties met de atomen van het monster worden gedetecteerd om een beeld te vormen. | | Kleuring (in TEM) | De behandeling van biologisch materiaal met verbindingen van zware metalen, zoals osmiumtetroxide of uranylacetaat, die zich binden aan specifieke celregio's en elektronen weerkaatsen, waardoor deze structuren donker verschijnen in de elektronenmicroscoop. | | Dehydratatie | Het proces van het verwijderen van water uit biologisch materiaal door middel van wasstappen met oplopende concentraties van ethanol of aceton, noodzakelijk omdat de kunstharsen die voor het inbedden worden gebruikt hydrofoob zijn. | | Inbedding in hars | Het infiltreren van biologisch materiaal met een vloeibare kunsthars die vervolgens wordt gepolymeriseerd door middel van warmte, magnetronstraling of ultraviolet licht, om harde, snijdbare blokjes te verkrijgen voor ultradun snijden. | | Ultramicrotoom | Een gespecialiseerd instrument dat wordt gebruikt om extreem dunne coupes (plakjes) van biologisch materiaal te snijden, met behulp van messen van gekliefd glas of diamant, voor analyse met TEM. | | Gridje | Een klein metalen schijfje met een roosterpatroon waarop de ultradunne coupes van biologisch materiaal worden opgevangen na het snijden, om ze vervolgens in de elektronenmicroscoop te kunnen bekijken. | | Elektronenstrooiing | Het proces waarbij elektronen die door een monster worden gestuurd, worden afgebogen door de atomen van het monster. Dichte structuren strooien meer elektronen, wat resulteert in een donkerder beeld. | | Contrastverhoging | Het proces van het vergroten van de zichtbaarheid van structuren in een TEM-beeld door het gebruik van zware metalen die de elektronenstrooiing verhogen, waardoor de densiteitsverschillen tussen verschillende delen van het monster duidelijker worden. | | Osmiumtetroxide (OsO4) | Een chemische stof die zowel als fixatief als als contrasteringsmiddel in TEM wordt gebruikt. Het bindt zich aan lipiden en eiwitten, waardoor membranen en andere structuren een verhoogd contrast krijgen. | | Uranylacetaat | Een zwaar metaalzout dat wordt gebruikt als contrasteringsmiddel in TEM. Het bindt zich aan nucleïnezuren en eiwitten, waardoor deze structuren donkerder worden in het beeld. | | Loodcitraat | Een zwaar metaalzout dat vaak wordt gebruikt in combinatie met uranylacetaat als contrasteringsmiddel in TEM. Het verhoogt het contrast van verschillende cellulaire structuren. | | Vries-breek (freeze-fracture) | Een microscopietechniek die wordt gebruikt om membraanstructuren te analyseren door cellulaire membranen te breken, meestal tussen het binnenste en buitenste blad, om zo de eiwitten en eiwitaggregaten binnen de membraanhelften te visualiseren. | | Vries-ets (freeze-etching) | Een microscopietechniek die, na het vries-breekproces, een dunne laag ijs verwijdert door sublimatie onder vacuüm, wat resulteert in een meer driedimensionale structuur van het preparaat voor visualisatie. | | Cryo-elektronen-tomografie | Een techniek voor 3D-reconstructie van een object, gebaseerd op een reeks 2D-projecties die worden verkregen terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld, waardoor gedetailleerde structuren zichtbaar worden. | | SBF-SEM (Serial Block Face-SEM) | Een scanning elektronenmicroscooptechniek waarbij een ultramicrotoom of ionenlaser delen van het preparaat wegneemt binnen de microscoop zelf, om opeenvolgende dwarsdoorsneden te verkrijgen voor 3D-reconstructie. | | FIB-SEM (Focused Ion Beam-SEM) | Een scanning elektronenmicroscooptechniek die gebruikmaakt van een gefocusseerde ionenbundel om materiaal weg te etsen, waardoor opeenvolgende lagen kunnen worden verwijderd en 3D-structuren kunnen worden gereconstrueerd. | | Epitheliale cellen | Cellen die de bekledingslaag van organen en lichaamsholtes vormen, zoals het epitheel van de trachea, dat gespecialiseerd kan zijn in functies zoals trilhaarbeweging of slijmproductie. | | Cilia (trilharen) | Kleine, haarachtige uitsteeksels op het oppervlak van bepaalde cellen, zoals die in het trachea-epitheel, die door hun beweging helpen bij het transporteren van slijm en deeltjes. | | Mucus-producerende cellen | Cellen in het epitheel, met name in de luchtwegen, die verantwoordelijk zijn voor de productie en afscheiding van slijm, een beschermende en bevochtigende substantie. | | Basale membraan (basale lamina) | Een dunne laag extracellulaire matrix die de onderkant van epitheelcellen ondersteunt en scheidt van het onderliggende bindweefsel. | | Glad endoplasmatisch reticulum (SER) | Een netwerk van membranen binnen cellen dat betrokken is bij lipidesynthese, ontgifting en calciumopslag. | | Ruvend endoplasmatisch reticulum (RER) | Een netwerk van membranen binnen cellen, bezaaid met ribosomen, dat betrokken is bij de synthese en modificatie van eiwitten voor secretie of inbedding in membranen. | | Golgi-apparaat | Een organel in eukaryote cellen dat betrokken is bij het modificeren, sorteren en verpakken van eiwitten en lipiden voor secretie of transport naar andere bestemmingen binnen de cel. | | Contactinhibitie | Het fenomeen waarbij cellen in cultuur stoppen met delen zodra ze een confluente tweedimensionale monolaag hebben gevormd, vaak als gevolg van competitie om groeifactoren. | | Monolaag (monolayer) | Een enkele laag cellen die zich op een substraat heeft verspreid en zich heeft gehecht, kenmerkend voor de groei van veel celtypen in cultuur. | | Celdichtheidsafhankelijke inhibitie | Een mechanisme dat de celgroei reguleert op basis van de dichtheid van cellen op het groeioppervlak, waarbij hoge dichtheden de proliferatie remmen. | | Trypsine-EDTA procedure | Een methode die wordt gebruikt om adherente cellen los te maken van het groeisubstraat en van elkaar, door trypsine (een protease) en EDTA (dat calciumionen cheleert) te gebruiken. | | Trypsine | Een enzym uit de maag dat, bij korte behandeling, de oppervlakte-eiwitten van cellen degradeert, wat helpt bij het losmaken van cellen in cultuur. | | EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat) | Een stof die calcium- en magnesiumionen cheleert, wat de intercellulaire adhesie en de binding van cellen aan het substraat verstoort, en zo helpt bij celafscheiding. | | Confluentie | De toestand waarbij een celcultuur het groeioppervlak volledig bedekt met een laag cellen, wat vaak leidt tot het stoppen van de celgroei door contactinhibitie. | | Suspensie van levende opgebolde cellen | Cellen die losgemaakt zijn van het substraat en van elkaar, en die in een vloeibaar medium zweven, ideaal in een monocellulaire vorm voor verdere cultuur. | | Celtransfer | Het proces van het verplaatsen van cellen van een bestaande cultuur naar nieuwe recipiënten, vaak door verdunning, om verdere groei en onderhoud mogelijk te maken. | | Adhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat of aan elkaar, essentieel voor celgroei, differentiatie en weefselvorming. | | Fixeren | Het proces waarbij weefsels worden behandeld om hun oorspronkelijke structuur te behouden, voornamelijk door eiwitten te denatureren om afbraak door enzymen tegen te gaan. Dit kan chemisch gebeuren met fixatiemiddelen zoals formaldehyde of glutaraldehyde, of door bevriezing. | | Inbedden | Het omwikkelen en doordringen van gefixeerd weefsel met een substantie (inbedmiddel) die het materiaal hard maakt, zodat het gesneden kan worden in dunne plakken (coupes) die geschikt zijn voor microscopische observatie. | | Microtoom | Een instrument dat gebruikt wordt om zeer dunne plakken (coupes) van ingebed weefsel te snijden. Voor lichtmicroscopie worden stalen messen gebruikt, terwijl voor elektronenmicroscopie glazen of diamanten messen worden ingezet. | | Artefacten | Veranderingen die tijdens de fixatie of andere preparatieprocedures in een weefsel ontstaan en afwijken van de oorspronkelijke in-vivo situatie. Dit kan leiden tot structurele veranderingen of het verplaatsen van componenten. | | Coupes | Zeer dunne plakken van weefsel die gesneden zijn na fixatie en inbedding. Deze coupes zijn noodzakelijk om lichtstralen of elektronen door het weefsel te laten dringen voor microscopische analyse. | | Denatureren | Het proces waarbij de driedimensionale structuur van eiwitten wordt veranderd, waardoor hun biologische functie verloren gaat. Bij fixatie is dit essentieel om enzymatische afbraak van weefsel te stoppen. | | Inbedmiddel | Een substantie, zoals paraffine, hars of plastic, die in gefixeerd weefsel binnendringt en het materiaal verhardt, waardoor het mogelijk wordt om dunne coupes te snijden voor microscopische observatie. | | Hydrofoob | Een eigenschap van stoffen die water afstoten. Veel inbedmiddelen die in de histologie worden gebruikt, zijn hydrofoob en vereisen daarom dat weefsel eerst wordt ontwaterd. | | Dehydrateren | Het verwijderen van water uit weefsel, meestal door het te behandelen met een reeks alcoholbaden met oplopende concentraties. Dit is een noodzakelijke stap voordat hydrofobe inbedmiddelen kunnen worden gebruikt. | | Clearing | Een stap in het preparatieproces waarbij een substantie, zoals tolueen, wordt gebruikt die mengbaar is met zowel alcohol (dat het water heeft vervangen) als met het hydrofobe inbedmiddel, om de overgang naar het inbedmiddel te vergemakkelijken. | | Elektronenmicroscopie (EM) | Een microscopische techniek die elektronen gebruikt in plaats van licht om beelden te vormen, waardoor veel hogere resoluties en vergrotingen mogelijk zijn dan met lichtmicroscopen. Dit vereist een hoog vacuüm en elektromagnetische lenzen. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij een preparaat wordt afgetast met een elektronenbundel. De detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen maakt het mogelijk om een driedimensionaal beeld van het oppervlak van het monster te creëren. | | Elektromagnetische lenzen | Componenten in een elektronenmicroscoop die de elektronenbundel manipuleren en focussen. Deze lenzen, bestaande uit spoelen die een magnetisch veld genereren, vervangen de glaslenzen die in lichtmicroscopen worden gebruikt. | | Secundaire elektronen | Elektronen die uit het monster worden gestoten wanneer het wordt gebombardeerd door de primaire elektronenbundel in een SEM. Deze secundaire elektronen worden gedetecteerd en gebruikt voor beeldvorming. | | Negatieve kleuring | Een preparatietechniek in TEM waarbij het monster wordt omgeven door een zwaar metaalzout. Het metaal vult de ruimtes rondom het monster, waardoor het monster zelf donker afsteekt tegen een lichte achtergrond. | | Shadow casting (schaduwwerping) | Een preparatietechniek waarbij het monster onder een schuine hoek wordt bestoven met een metaal. Dit creëert een driedimensionaal effect door schaduwen te werpen achter de structuren van het monster, wat de morfologie beter zichtbaar maakt. | | Ultradunne secties | Zeer dunne plakjes van biologisch materiaal, typisch 50-100 nm dik, die nodig zijn voor transmissie-elektronenmicroscopie. Deze dunne coupes maken het mogelijk dat elektronen erdoorheen kunnen dringen en een beeld kunnen vormen. | | Vacuümtechnologie | Essentieel voor elektronenmicroscopie omdat elektronen gemakkelijk worden gestopt door gasmoleculen. Een hoog vacuüm is nodig om de elektronenbundel ongehinderd door de microscoop te laten reizen. | | PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff) | Een histologische kleuringstechniek die vrije suikers aankleurt, vaak gebruikt om slijm en glycogeen zichtbaar te maken in weefselcoupes. | | Hematoxyline | Een basische kleurstof die, in combinatie met een beitsmiddel zoals aluminiumzouten, negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern aankleurt, resulterend in een blauwe of donkerpaarse kleur. | | Eosine | Een zure kleurstof die positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma, aankleurt met een roze kleur. | | HE-kleuring (Hematoxyline en Eosine) | Een veelgebruikte histologische kleuringstechniek die hematoxyline en eosine combineert om verschillende weefselstructuren zichtbaar te maken, waarbij kernen blauw/paars en cytoplasma/extracellulaire matrix roze kleuren. | | Slijmbekercellen | Cellen in het epitheel van de darm die slijm produceren en afscheiden, zichtbaar gemaakt met PAS-kleuring. | | Microvilli (borstelzoom/staafjeszoom) | Kleine, vingerachtige uitsteeksels aan het oppervlak van epitheelcellen die de absorptie vergroten; zichtbaar gemaakt met PAS-kleuring. | | Basale membraan | Een dunne laag extracellulaire matrix die epitheelcellen scheidt van het onderliggende bindweefsel; aangegeven met pijlen in de context van de darmvillus. | | Fasecontrastmicroscopie | Een lichtmicroscopische techniek die kleine faseverschuivingen in licht, veroorzaakt door brekingsverschillen in het preparaat, omzet in amplitudeveranderingen (licht/donker) om contrast te creëren in ongekleurde preparaten, zoals levende cellen. | | Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski) | Een techniek die gebruikmaakt van gepolariseerd licht en speciale prisma's om kleine verschillen in optische dichtheid en brekingsindex in een preparaat om te zetten in een beeld met hoog contrast, vaak gebruikt voor levende, ongekleurde cellen. | | Digitale microscopie | Een methode die ultragevoelige videocamera's en computerverwerking van beelden gebruikt om dynamische beelden van preparaten te genereren, inclusief real-time en time-lapse opnamen. | | Klaarveldmicroscoop | Een standaard lichtmicroscoop waarbij het preparaat wordt verlicht door wit licht, wat resulteert in een laag contrast voor ongekleurde of transparante monsters. | | Optische dichtheid | Een maat voor hoe sterk een stof licht absorbeert of verstrooit, wat bijdraagt aan het contrast in microscopische beelden. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopische techniek die gebruikmaakt van fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen) om specifieke structuren of moleculen in een preparaat zichtbaar te maken door middel van excitatie- en emissielicht. | | Fluorofoor | Een molecuul dat in staat is om licht te absorberen bij een bepaalde golflengte en dit vervolgens weer uit te zenden als fluorescentie bij een langere golflengte. | | Excitatie | Het proces waarbij een fluorofoor energie absorbeert, meestal in de vorm van licht, waardoor het naar een hogere energietoestand wordt gebracht. | | Emissie | Het proces waarbij een geëxciteerd fluorofoor terugvalt naar zijn grondtoestand, waarbij het de geabsorbeerde energie uitzendt in de vorm van fluorescentielicht. | | Golflengte | De afstand tussen opeenvolgende pieken of dalen van een golf, die de kleur van zichtbaar licht bepaalt en cruciaal is voor excitatie en emissie in fluorescentiemicroscopie. | | Epifluorescentie | Een type fluorescentiemicroscopie waarbij het excitatie- en emissielicht langs dezelfde optische weg lopen, wat resulteert in een efficiënte verlichting van het preparaat. | | Confocale laser scanning microscopie (CLSM) | Een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die een laserbundel gebruikt om het preparaat punt voor punt te scannen, waardoor optische doorsneden met hoge resolutie en minimale achtergrondruis mogelijk zijn. | | Excitatiefilter | Een optisch filter dat specifiek licht van een bepaalde golflengte doorlaat om het fluorofoor in het preparaat te exciteren. | | Emissiefilter (Stopfilter) | Een optisch filter dat het excitatielicht blokkeert en alleen het door het fluorofoor uitgezonden emissielicht doorlaat naar de detector. | | Dichroïsche spiegel (Beamsplitter) | Een speciale spiegel die licht van een bepaalde golflengte reflecteert en licht van een andere golflengte doorlaat, essentieel voor het scheiden van excitatie- en emissielicht in een microscoop. | | Ion-gevoelige kleurstoffen | Fluorochromen waarvan de fluorescentie-eigenschappen veranderen in reactie op de concentratie van specifieke ionen, zoals calcium, waardoor ionconcentraties in levende cellen gemeten kunnen worden. | | Immunofluorescentie microscopie | Een techniek die gebruikmaakt van antilichamen waaraan een fluorofoor is gekoppeld om specifieke eiwitten of antigenen in cellen of weefsels te detecteren en te visualiseren. | | Celkweek | Het in vitro kweken van cellen, waarbij ze worden onderhouden in een gecontroleerde omgeving met specifieke voedingsstoffen en omstandigheden om groei en proliferatie te bevorderen. | | Cellijn | Een populatie van cellen die afkomstig is van een enkele oorsprong en die in cultuur kan worden gehouden voor onbeperkte passages, vaak geïmmortaliseerd of afkomstig van tumoren. | | Immortalisatie | Het proces waarbij cellen het vermogen krijgen om zich onbeperkt te delen, wat kan gebeuren door natuurlijke mechanismen (zoals bij tumorcellen) of door genetische manipulatie. | | Senescence | Een proces van celveroudering waarbij cellen stoppen met delen na een bepaald aantal passages, wat leidt tot hun afsterven. | | Groeimedium | Een vloeibare voedingsoplossing die essentiële componenten bevat, zoals zouten, glucose, aminozuren, vitamines en soms serum, die nodig zijn voor de groei en het onderhoud van cellen in cultuur. | | CO2-oven | Een incubatieapparaat dat een gecontroleerde atmosfeer van 5% CO2 in lucht handhaaft, essentieel voor het stabiliseren van de pH van celcultuurmedia. | | Cultuurrecipiënt | Een container, zoals een petrischaal, kolf of plaat, waarin cellen worden gekweekt. | | Groeisubstraat | Het oppervlak waarop adherente cellen groeien; dit kan glas, polystyreen of een gecoat oppervlak zijn dat adhesie en overleving bevordert. | | Anoïkis | Een vorm van geprogrammeerde celdood die optreedt wanneer cellen hun contact met het extracellulaire matrix verliezen. |