Ppt5_Hybridisatie en afgeleiden.pdf

# Probehybridisatie principes en methoden Probehybridisatie is een techniek die wordt gebruikt om een specifieke doelwitsequentie van DNA of RNA te detecteren op basis van basencomplementariteit [5](#page=5). ### 1.1 Basisprincipes van probehybridisatie Het fundamentele principe van probehybridisatie berust op de specifieke interactie tussen twee complementaire enkelstrengs nucleïnezuurmoleculen, waarbij één van de moleculen fungeert als een "probe" en de andere als het "doelwit" (target) [5](#page=5). * **Probe:** Een gemerkte enkelstrengs DNA (ssDNA) of RNA molecule die ontworpen is om complementair te zijn aan de doelwitsequentie [5](#page=5). * **Doelwit (Target):** Een enkelstrengs DNA (ssDNA) of RNA molecule dat gedetecteerd moet worden [5](#page=5). * **Hybridisatie:** Het proces waarbij de probe zich bindt aan de complementaire doelwitsequentie. Dit proces vereist specifieke omstandigheden om unieke detectie te garanderen [5](#page=5). Een gesynthetiseerde probe kan specifiek ontworpen worden om complementair te zijn aan een gen van interesse. Bijvoorbeeld, als het gewenste gen de sequentie `...GGC CCT TAA...` heeft, kan een probe ontworpen worden met de complementaire sequentie `...CCG GGA ATT...`, die vervolgens gemerkt wordt [6](#page=6). Dubbelstrengs DNA (dsDNA) moet eerst gedenatureerd worden tot enkelstrengs DNA (ssDNA) alvorens hybridisatie kan plaatsvinden [11](#page=11). De sterkte van de binding tussen de probe en het doelwit wordt beïnvloed door de lengte van de sequentie en het GC-gehalte. Langere sequenties en een hoger GC-gehalte leiden over het algemeen tot sterkere binding [20](#page=20). ### 1.2 Methoden van hybridisatie Probehybridisatie kan op verschillende manieren worden uitgevoerd, afhankelijk van het toepassingsgebied en de gewenste detectiemethode. De belangrijkste methoden zijn [5](#page=5): #### 1.2.1 In oplossing Hybridisatie in oplossing vindt plaats zonder een vaste drager. Dit wordt onder andere toegepast in qPCR en bij target enrichment voor sequencing [5](#page=5). #### 1.2.2 Op vaste drager Hybridisatie op een vaste drager omvat technieken waarbij het doelwit of de probe wordt vastgezet op een oppervlak, wat verdere zuivering en detectie vereenvoudigt. Dit kan op diverse materialen gebeuren [12](#page=12) [5](#page=5): * **Membraan/Filterhybridisatie:** Dit omvat technieken zoals Dot blot, Southern blot en Northern blot, waarbij het DNA of RNA op een membraan wordt aangebracht [12](#page=12). * **Southern blot:** Een klassieke methode waarbij doelwit ssDNA wordt geblott op een membraan (zoals nylon of nitrocellulose), gevolgd door hybridisatie met een gemerkte ssDNA probe. Het proces omvat denaturatie van het doelwit DNA, blotten, prehybridisatie, hybridisatie, het wegwassen van ongebonden probes en detectie [10](#page=10) [9](#page=9). * **Northern blot:** Vergelijkbaar met Southern blot, maar wordt gebruikt voor de detectie van RNA [12](#page=12). * **Dot blot:** Een eenvoudigere methode waarbij het DNA of RNA direct op het membraan wordt aangebracht zonder voorafgaande elektroforese, om de aanwezigheid van een specifieke sequentie te detecteren [12](#page=12). * **Glazen drager:** Materialen zoals glasplaten worden gebruikt voor In situ hybridisatie en microarrays [12](#page=12). * **In situ hybridisatie (ISH) / Fluorescentie In situ hybridisatie (FISH):** Hierbij vindt de hybridisatie direct plaats op de cel- of weefselstructuur, vaak op een glazen drager. Dit maakt het mogelijk om de locatie van specifieke nucleïnezuursequenties binnen cellen of weefsels te visualiseren [16](#page=16) [8](#page=8). * **Microarray:** Een techniek waarbij honderden tot duizenden probes vastgezet zijn op een glazen drager, waardoor de gelijktijdige analyse van vele doelwitsequenties mogelijk is [12](#page=12). #### 1.2.3 Blotten (transfer naar een vaste drager) Blotten is het proces van het overbrengen van DNA (of RNA) van een gel naar een vaste drager, meestal een membraan. Er zijn verschillende methoden voor blotten [12](#page=12): * **Capillair blotten:** Maakt gebruik van capillaire werking om de vloeistof en de nucleïnezuren door het membraan te trekken [13](#page=13). * **Vacuüm blotten:** Gebruikt vacuüm om de transfer te versnellen [14](#page=14). * **Semi-droog blotten:** Een snellere methode die minder buffervloeistof vereist [15](#page=15). * **Dot blotten:** Hierbij wordt het nucleïnezuur direct op het membraan aangebracht zonder eerdere scheiding in een gel [12](#page=12). #### 1.2.4 Fixatie Na het blotten moet het vastgezette DNA gefixeerd worden op het membraan. Dit kan gebeuren door verhitting (bakken, minimaal 80°C onder vacuüm voor nitrocellulose) of door UV-bestraling [17](#page=17). #### 1.2.5 Prehybridisatie Voordat de gemerkte probe wordt toegevoegd, wordt het membraan vaak geprehybridiseerd. Dit betekent dat de resterende, onbezette bindingsplaatsen op het membraan worden geblokkeerd met niet-specifiek DNA (zoals Herpes simplex zeehonden virus DNA of zalmsperma DNA). Zonder prehybridisatie zouden de probes zich aspecifiek kunnen binden aan deze vrije plaatsen, wat zou leiden tot een hoog achtergrondsignaal en valse positieven [18](#page=18) [9](#page=9). ### 1.3 Probes: Aanmaak, Merken en Detectie #### 1.3.1 Aanmaak van probes Probes kunnen op twee hoofdmanieren worden bereid: * **Chemische synthese van oligonucleotiden:** * Oligonucleotiden tot ongeveer 100 nucleotiden kunnen via chemische synthese worden geproduceerd [21](#page=21). * De meest gebruikte methode is de fosfoforamidietmethode, waarbij nucleotiden één voor één worden opgebouwd [21](#page=21). * Gespecialiseerde bedrijven produceren deze probes [21](#page=21). * Tijdens de synthese kunnen probes gemerkt worden door de inbouw van gemerkte nucleotiden (bijv. FITC-dUTP, Cy3-dUTP, DIG-dUTP, biotine-dUTP), hoewel dit kostbaar is [21](#page=21). * Alternatieven voor inbouw zijn ddNTP's of LNA (Locked Nucleic Acids) [21](#page=21). * **Enzymatische synthese van probes:** * **PCR met eindstandige labeling:** Gebruikmakend van een gemerkte primer [25](#page=25). * **PCR met interne labeling:** Inbouw van gemerkte dNTP's tijdens de PCR-reactie [25](#page=25). * **Merking op dsDNA achteraf:** * **Nick-translatie:** DNAse I creëert enkelstrengse breuken in dsDNA. DNA polymerase I verlengt de 3'-uiteinden en 'overschrijft' de 5'-uiteinden, waarbij gemerkte nucleotiden worden ingebouwd [27](#page=27). * **Random priming labeling:** DNA wordt gedenatureerd en geannealed met korte, willekeurige oligonucleotiden (6 nt). Vervolgens vindt in vitro verlenging plaats met een DNA polymerase (zoals Klenow) en gemerkte dNTP's [29](#page=29). * **Eind-labeling met PNK (T4 polynucleotide kinase):** Voegt een 5'-fosfaatgroep toe, voornamelijk gebruikt voor radioactieve labeling [30](#page=30). * **Eind-labeling met terminaal transferase:** Voegt dNTP's toe aan het 3'-uiteinde van een DNA-streng [31](#page=31). * **RNA-probe bereiding via transcriptie van gekloneerd DNA:** * Dit proces, ook wel "run-off transcriptie" genoemd, maakt gebruik van een plasmide met een specifieke promotor (bijv. SP6). * Het plasmide-DNA wordt gelineariseerd met restrictie-enzymen [34](#page=34). * SP6 polymerase wordt gebruikt in aanwezigheid van NTP's om een gemerkte RNA probe te synthetiseren in vitro [34](#page=34). #### 1.3.2 Merken (Labels) van probes Probes kunnen op verschillende manieren gemerkt worden om hun detectie mogelijk te maken [22](#page=22): * **Radioactief gemerkte dNTPs:** Bieden directe detectie [23](#page=23) [36](#page=36). * **Fluorescent gemerkte dNTPs:** Zorgen voor directe of indirecte detectie. Voorbeelden zijn FITC, TRIT, AMCA, Cy3, Cy5, JOE, FAM, HEX, TAMRA [23](#page=23) [36](#page=36) [38](#page=38). * **Biotine-16-dUTP:** Wordt indirect gedetecteerd [23](#page=23) [36](#page=36). * **Digoxigenine-11-dUTP:** Wordt eveneens indirect gedetecteerd [23](#page=23) [36](#page=36). Bij het gebruik van biotine of digoxigenine kan een "spacer" nodig zijn om sterische hinder te vermijden bij de herkenning van het label of de vorming van de dubbele helix [24](#page=24). #### 1.3.3 Detectie van labels De detectiemethode hangt af van het type label dat in de probe is ingebouwd [36](#page=36). * **Directe detectie:** * **Radioactiviteit:** Gedetecteerd via autoradio­grafie (met röntgengevoelige films) of phospho-imaging. Phospho-imaging is directer en herbruikbaar [37](#page=37). * **Fluorochromen:** Gedetecteerd met fluorescentiemicroscopen en CCD-camera's. Deze worden veel gebruikt in FISH en microarrays, maar minder in membraanhybridisaties [38](#page=38). * **Indirecte detectie:** * Wordt gebruikt voor labels zoals digoxigenine en biotine [39](#page=39). * Vereist "reporters" die zich binden aan het label. Dit kunnen enzymen (Alkalische Fosfatase - AP, Horse Radish Peroxidase - HRP), colloïdaal goud, of fluorochromen zijn [39](#page=39). * **Enzymatische reporters (AP en HRP):** * Deze enzymen katalyseren reacties met chromogene of chemiluminogene substraten, wat resulteert in een detecteerbaar signaal [44](#page=44). * **HRP:** Kan een kleurstof produceren met DAB of AEC, of chemiluminescentie met luminol [44](#page=44) [46](#page=46). * **AP:** Kan een oplosbare kleurstof produceren met TMB, of chemiluminescentie met BCIP plus NBT, AMPPD, of CSPD. Chemiluminescentie is vaak duizenden keren gevoeliger dan chromogene detectie [44](#page=44) [46](#page=46) [47](#page=47) [48](#page=48). * **Signaalamplificatie:** Om het signaal te versterken, vooral bij een laag aantal doelwitten, kunnen technieken zoals het steptavidine-biotine-complex worden gebruikt, wat leidt tot een verhoogd aantal reporters per probe [43](#page=43) [46](#page=46). #### 1.3.4 Gebruik van de probe en wassen Na de hybridisatie is het cruciaal om overtollige, aspecifiek gebonden probe te verwijderen door grondig te wassen. Dit minimaliseert achtergrondsignalen en verbetert de specificiteit van de detectie [49](#page=49) [9](#page=9). > **Tip:** Bij het ontwerpen van probes moet rekening gehouden worden met de reactieomstandigheden, de verwachte lengte van de targetsequentie, en het gewenste sensitiviteitsniveau. > > **Tip:** Zorg ervoor dat de gebruikte bufferomstandigheden en temperatuur (Th) optimaal zijn voor de specifieke probe-target combinatie om een efficiënte en specifieke hybridisatie te garanderen [11](#page=11) [19](#page=19). --- # Hybridisatiecondities en specificiteit Dit deel behandelt de factoren die de hybridisatie beïnvloeden, met de nadruk op het bereiken van specificiteit en het beheersen van kruishybridisatie [50](#page=50) [56](#page=56). ### 2.1 Factoren die hybridevorming beïnvloeden De binding van een probe aan een target (DNA of RNA) wordt bepaald door verschillende factoren [50](#page=50): * **Grootte van de probe en target:** De lengte van de sequentie speelt een rol bij de stabiliteit van het hybride [50](#page=50) [55](#page=55). * **GC-gehalte:** Een hoger percentage GC (guanine-cytosine) basenparen leidt tot een stabielere helix, omdat GC-paren drie waterstofbruggen vormen, in tegenstelling tot de twee waterstofbruggen bij AT-paren [50](#page=50). * **Basevolgorde:** De specifieke sequentie van de basen bepaalt de complementaire binding [50](#page=50). * **Type probe:** Of de probe DNA of RNA is, beïnvloedt de hybridisatie [50](#page=50). * **Reactiecondities:** Deze omvatten temperatuur en de aanwezigheid van stoffen in de omgeving die de helixvorming kunnen beïnvloeden [50](#page=50). * **Tijdsduur van de hybridisatie:** Voldoende tijd is nodig voor de interactie tussen probe en target om plaats te vinden [50](#page=50). #### 2.1.1 Probe- en targetconcentratie De concentraties van de probe en het target zijn gecorreleerd. Bij een zeer laag aantal targets wordt een relatieve overmaat aan probe gebruikt om de kans op binding te vergroten. De probe bindt aan lineair, enkelstrengs doelwit DNA of RNA [50](#page=50). #### 2.1.2 Maximale belading (Hmax) $H_{max}$ vertegenwoordigt de maximale belading van het target met de probe. De hoeveelheid probe wordt gekozen in het lineaire gebied van de verzadigingscurve om kruishybridisatie tegen te gaan [53](#page=53). > **Tip:** Begrijp de relatie tussen probeconcentratie, targetconcentratie en de verzadigingscurve om optimale hybridisatiecondities te bepalen en ongewenste binding te minimaliseren [53](#page=53). #### 2.1.3 Mismatches en kruishybridisatie * **Match:** Alle basen van de probe hybridiseren volledig met het target [53](#page=53). * **Kruishybridisatie:** Niet alle basen van de probe hybridiseren met het target, wat duidt op de aanwezigheid van één of meerdere mismatches. Dit kan optreden wanneer een probe bindt aan sequenties die gedeeltelijk complementair zijn [53](#page=53) [56](#page=56). ### 2.2 Specificiteit van probe-target binding Specificiteit is cruciaal voor nauwkeurige detectie en wordt bepaald door de hybridecondities, met name de stringentie [56](#page=56). #### 2.2.1 Stringentie Stringentie verwijst naar de reactiecondities waaronder de hybridisatie plaatsvindt. Het beïnvloedt de stabiliteit van het gevormde hybride [53](#page=53) [56](#page=56). * **Hoge stringentie:** Alleen stabiele hybriden met 0% mismatch worden toegestaan. De hybride temperatuur ($T_h$) ligt minimaal 5°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). * **Lage stringentie:** Stabiele hybriden worden ook gevormd in aanwezigheid van mismatches. De hybride temperatuur ($T_h$) ligt tot 15°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). De stringentie, en dus de specificiteit, hangt af van: * **Temperatuur:** Hogere temperaturen verhogen de stringentie [58](#page=58). * **Zoutconcentratie:** Een lagere zoutconcentratie verhoogt de stringentie. Zouten stabiliseren de negatief geladen fosfaatruggengraten van de nucleïnezuren, waardoor hogere zoutconcentraties de stabiliteit van de dubbele helix verhogen [57](#page=57) [58](#page=58). * **pH:** Een hogere pH verhoogt de stringentie [58](#page=58). * **Formamideconcentratie:** Een hogere formamideconcentratie verhoogt de stringentie. Formamide denatureert de dubbele helix door waterstofbruggen te verstoren [57](#page=57) [58](#page=58). #### 2.2.2 Berekening van de smelttemperatuur (Tm) De smelttemperatuur ($T_m$) voor DNA/DNA hybriden van probes ≥ 100 bp kan empirisch worden berekend met de volgende formule [57](#page=57): $$T_m = 81.5 + 0.41(\%GC) – \frac{600}{l} – 1.5(\%mismatch) + 16.6 (\log_{10} [\text{Na}^+]) – 63(\%\text{formamide}) \quad (°C)$$ Waar: * $\%GC$ is het percentage guanine-cytosine basenparen [57](#page=57). * $l$ is de lengte van de probe in basenparen [57](#page=57). * $\%mismatch$ is het percentage mismatches tussen de probe en de targetsequentie [57](#page=57). * $[\text{Na}^+]$ is de natriumionenconcentratie [57](#page=57). * $\%\text{formamide}$ is de concentratie formamide [57](#page=57). > **Tip:** De hybride temperatuur kan verlaagd worden door aanpassingen in de formamide- of zoutconcentratie. Voor in situ hybridisatie (ISH) wordt standaard 37°C gebruikt. De formule voor $T_m$ is niet geldig voor DNA/RNA of RNA/RNA hybriden, en bij gebruik van LNA (Locked Nucleic Acid) of MGB (Minor Groove Binder) probes [57](#page=57). #### 2.2.3 Rol van de wasstap De stringentie van de wasstap is ook van belang voor de specificiteit. Na de hybridisatie worden kruishybriden (met mismatches) weggewassen, vooral bij hoge stringentie. Wassen dicht bij de smelttemperatuur helpt bij het verwijderen van zwak gebonden, minder specifieke hybriden [58](#page=58) [62](#page=62). > **Belangrijk:** Klassieke Southern blots vereisen een specifiek doelwit, wat bereikt wordt door zorgvuldige controle van stringentie tijdens de hybridisatie en de wasstap [58](#page=58). #### 2.2.4 Toepassingen en detectie van mutaties/verwante genotypen * **Detectie van mutaties:** Bij de detectie van mutaties is het essentieel om nauwkeurig de mogelijkheid van mismatches te controleren, wat specifieke stringentiecondities vereist [56](#page=56). * **Detectie van virale genotypen:** Bij het detecteren van virussen die tot een familie behoren, kan er enige mate van mismatch in de sequentie voorkomen, wat een lagere stringentie kan vereisen [56](#page=56). ### 2.3 Andere componenten in de hybridisatiebuffer Naast de primaire componenten zijn er diverse stoffen die de efficiëntie en specificiteit van de hybridisatie kunnen verbeteren [59](#page=59): * **Citraatbuffer en Denhardt's oplossing:** Deze buffers stabiliseren de nucleïnezuren en verminderen achtergrondondersteuning. Denhardt's oplossing bevat ficoll 400, polyvinylpyrrolidon 40 en BSA (Bovine Serum Albumin) [59](#page=59). * **Volume exclusion agentia:** Dextrane sulfaat, PEG 6000-8000 of PVP 40 verhogen de concentratie van de probe in de buurt van het target, wat de kans op interactie vergroot [59](#page=59). * **DTT (Dithiothreitol):** Heeft reducerende eigenschappen [59](#page=59). * **DMSO (Dimethylsulfoxide):** Vermindert de vorming van interne haarspeldstructuren in de nucleïnezuren [59](#page=59). * **Detergentia (Triton X100, SDS, Tween-20):** Bevorderen de diffusie van probes binnen cellen, wat met name nuttig is bij in situ hybridisatie [59](#page=59). * **RNAse inhibitor:** Noodzakelijk bij RNA-hybridisaties om afbraak van het RNA-target of de RNA-probe door ribonuclease-enzymen te voorkomen [59](#page=59). ### 2.4 Hybridisatietijd en C0t ½ De duur van de hybridisatie hangt af van de stringentie, het percentage mismatches, en de lengte van de probe. De ideale hybride-tijd wordt vaak gerelateerd aan de $C_{0}t_{1/2}$, de tijd die nodig is voor de halfwaardereactie van renaturatie van de targetsequentie [60](#page=60). De formule voor $C_{0}t_{1/2}$ (in uren) is: $$C_{0}t_{1/2} = 2 \cdot (\frac{1}{x} \cdot \frac{y}{5} \cdot \frac{z}{10})$$ Waar: * $x$ is het gewicht van de toegevoegde probe in microgram ($\mu$g) [60](#page=60). * $y$ is de complexiteit van de probe, uitgedrukt in kilobasen (Kb) [60](#page=60). * $z$ is het reactievolume in milliliters (ml) [60](#page=60). De incubatietijd kan variëren van enkele tientallen seconden tot een hele nacht, afhankelijk van de specifieke omstandigheden [60](#page=60). ### 2.5 Samenvatting van de hybridisatieprocedure 1. **Denaturatie:** Het doelwit (DNA/RNA) en de probe worden gedenatureerd om enkelstrengs structuren te verkrijgen [62](#page=62). 2. **Hybridisatie:** De gelabelde probe wordt geïncubeerd met het gedenatureerde doelwit onder gecontroleerde condities die afhangen van de probe en het doelwit [62](#page=62). 3. **Wassen:** Stappen om ongebonden probe en kruishybriden te verwijderen [62](#page=62). 4. **Wassen nabij smelttemperatuur:** Helpt bij het verwijderen van zwakke, minder specifieke hybriden [62](#page=62). 5. **Detectie:** Afhankelijk van het type label op de probe (bijv. luminescentie, radioactiviteit, fluorescentie). Moderne methoden maken vaak gebruik van digitale vastlegging via Imagers [61](#page=61) [62](#page=62). Membranen, zoals nylonmembranen, kunnen vaak hergebruikt worden voor meerdere hybridisatierondes (reprobing). Bewaarcondities zijn koel en donker [61](#page=61). --- # Afgeleide hybridisatietechnieken en toepassingen Dit onderwerp bespreekt diverse afgeleide hybridisatietechnieken zoals Southern blot, Northern blot, FISH en DNA micro-arrays, en hun praktische toepassingen in de biotechnologie en klinische diagnostiek [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.1 Introductie tot afgeleide hybridisatietechnieken Afgeleide hybridisatietechnieken maken gebruik van het principe van complementaire baseparing tussen een gelabelde probe en een doelwit-nucleïnezuursequentie. Deze technieken zijn veelzijdig en worden toegepast voor het detecteren van specifieke DNA- of RNA-sequenties. Ze omvatten technieken zoals dot blot, colony lift, Southern blot, Northern blot, FISH en DNA micro-arrays. Sommige van deze technieken, zoals line probe assay en micro-array, worden beschouwd als reverse hybridisatietechnieken [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65). ### 3.2 Dot blot De dot blot techniek is een methode voor membraan- of filterhybridisatie. Hoewel niet gedetailleerd beschreven in dit gedeelte, wordt het vermeld als een toepassing van probe hybridisatie [65](#page=65) [66](#page=66). ### 3.3 Colony and Plaque Lift Colony en plaque lift zijn typische toepassingen in de biotechnologie voor het detecteren van specifieke klonen. Het proces omvat de transfer van kolonies of plaques op een filter, waarna DNA wordt vrijgemaakt uit de bacteriën en gebonden aan het filter. Vervolgens wordt het DNA gedenatureerd, het membraan geprehybridiseerd en een gelabelde enkelstrengs DNA (ssDNA) probe toegevoegd. Na het wegwassen van ongebonden en mismatchende probes kan de detectie plaatsvinden. Dit wordt gebruikt voor de detectie van specifieke klonen [67](#page=67) [68](#page=68). ### 3.4 Southern blot De Southern blot techniek wordt gebruikt voor de analyse van DNA. Het is een membraanhybridisatietechniek [66](#page=66) [70](#page=70). #### 3.4.1 Toepassingen van Southern blot De Southern blot heeft diverse klinische en genetische manipulatietoepassingen [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74). * **Klinische toepassingen:** * Detectie van repeat expansies, zoals bij de ziekte van Huntington [72](#page=72) [73](#page=73). * **Genetische manipulatie toepassingen:** * Screeningstrategieën om onbedoeld geïntroduceerd recombinant DNA (rDNA) te detecteren bij genetisch gemodificeerde planten [74](#page=74). #### 3.4.2 RFLP – Southern blot Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), in combinatie met detectie via Southern blot, wordt gebruikt voor verschillende doeleinden [75](#page=75). * **Detectie van Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs):** Dit wordt gedaan met behulp van restrictie-enzymen (RE) [75](#page=75). * **Detectie van specifieke methylatie:** Dit gebeurt met behulp van methylatie-gevoelige restrictie-enzymen [75](#page=75). * **Detectie van andere mutaties:** RFLP kan gebruikt worden om verschillende soorten mutaties te detecteren [77](#page=77). * **Typing/fingerprinting:** * Het detecteren van verplaatsingen van insertion sequences (transposons) is kenmerkend voor bacteriële stammen, wat kan worden gebruikt om de graad van verwantschap te bepalen of bacteriën te genotyperen. Het proces omvat een restrictiedigest, het laden van DNA op een gel, een blot en een probe tegen het IS-element [78](#page=78) [79](#page=79). ### 3.5 Northern blot De Northern blot wordt gebruikt voor de analyse van (messenger) RNA ((m)RNA). Het is een membraanhybridisatietechniek [66](#page=66) [70](#page=70). * **Toepassingen:** * Het bepalen van de relatieve aanwezigheid van genexpressie [70](#page=70). * Het identificeren van de relatieve aanwezigheid van isovormen [70](#page=70). * Voorbeeld: Verschillende isovormen van EGFR kunnen detecteerbaar zijn in pancreas vs. pancreas kanker [71](#page=71). ### 3.6 FISH en ISH ((Fluorescent) In Situ Hybridisation) In situ hybridisatie (ISH) en Fluorescent In Situ Hybridisatie (FISH) houden in dat hybridisatie plaatsvindt in een morfologische context, zoals specifieke weefsels, celtypes of chromosomen. Het doelwit kan DNA of RNA zijn [80](#page=80). * **Merking van de probe:** * **Fluorescent:** Dit leidt tot FISH en detectie met een fluorescentiemicroscoop [80](#page=80). * **Biotine:** Detectie gebeurt via een streptavidine- of enzymconjugaat en een microscoop [80](#page=80). #### 3.6.1 Preparaten voor FISH en ISH Diverse preparaten kunnen worden gebruikt voor FISH en ISH [83](#page=83): * Metafase preparaten van chromosomen [83](#page=83) [97](#page=97). * (Interfase) preparaten [83](#page=83). * Cytospins [83](#page=83). * Weefselcoupes [83](#page=83). * Biofilm [83](#page=83). #### 3.6.2 Preparatie en hybridisatie stappen Voorafgaande behandelingen omvatten fixatie van preparaten, het vrijmaken van het doelwit met proteasen, permeabilisatie van cellen met vetoplossende middelen, DNAse behandeling bij hybridisatie met RNA, en RNAse behandeling bij hybridisatie met DNA. Tijdens de hybridisatie en het wassen moet de stringëntie bereikt worden zonder een te hoge temperatuur [89](#page=89). #### 3.6.3 Praktische benaderingen en controles Het is essentieel om zowel positieve als negatieve controles te gebruiken [91](#page=91). * **Positieve controle:** Om te verifiëren of de probe en het experiment de gewenste detectie uitvoeren [91](#page=91). * **Negatieve controle (zonder probe):** Om auto-fluorescentie te controleren [91](#page=91). Hoewel het proces vaak manueel wordt uitgevoerd, zijn er ook geautomatiseerde ISH-systemen beschikbaar, variërend van gedeeltelijk geautomatiseerd tot volledig geautomatiseerd [91](#page=91). #### 3.6.4 Toepassingen van FISH en ISH FISH en ISH hebben een breed scala aan toepassingen [85](#page=85): 1. **Detectie van specifieke sequenties in een cellulair genoom:** Dit wordt gebruikt om cellen met DNA-afwijkingen op te sporen [85](#page=85). * **Voorbeeld:** * FISH op metafase preparaten kan telomeer-specifieke sequenties en dystrofine (allel)-specifieke sequenties (gen op chromosoom X) detecteren, samen met X-centromeer specifieke probes [93](#page=93). * Het opsporen van chromosomale afwijkingen zoals translocaties, amplificaties en deleties in kwaadaardige gezwellen, wat veel toepassingen heeft in de oncologie. Een bekend voorbeeld is de detectie van de bcr/abl herschikking geassocieerd met chronische myogene leukemie [94](#page=94). * FISH testen, zoals de Vysis PathVision van Abbott Molecular, worden gebruikt voor de analyse van de humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) en de chromosoom 17 centromeersequentie (CEN17) bij borstkanker om genamplificatie te detecteren [96](#page=96) [97](#page=97). 2. **PNA-FISH screening op microbiële preparaten (bloed/biofilms):** Hierbij worden rRNA-targets gebruikt die specifiek zijn voor bepaalde bacteriën [85](#page=85) [86](#page=86). 3. **Genexpressie beeldvorming:** Het visualiseren van genexpressie in multicellulaire organismen/weefsels, typisch voor FBT-toepassingen. Dit gebeurt met mRNA-specifieke FISH [85](#page=85). * **Voorbeeld:** In situ hybridisatie van *Drosophila* embryo’s op verschillende ontwikkelingsstadia voor het mRNA van het gen "hunchback", wat de specifieke cel- of locatiedistributie van genexpressie aantoont [87](#page=87). #### 3.6.5 Problemen bij FISH en ISH Er zijn diverse problemen die de balans tussen het behoud van DNA/RNA-targets en de hybridisatie kunnen beïnvloeden, waaronder problemen met loslaten van coupes, diffusie, gevoeligheid van probes en detectiesystemen, uitspoeling, basenverlies (depurinering) en verlies van celmorfologie [98](#page=98). ### 3.7 DNA micro-array DNA micro-arrays worden vermeld als een reverse hybridisatietechniek. Verdere details over de werking of toepassingen zijn niet opgenomen in de verstrekte tekst [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.8 Target enrichment Target enrichment, een voorbereidende stap voor sequencing, wordt genoemd als een toepassing van probe hybridisatie. Verdere details zijn niet beschikbaar in de verstrekte tekst [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.9 qPCR (real time) Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) wordt genoemd als een toepassing die gebruikmaakt van probe hybridisatie. Verdere details zijn niet opgenomen in de verstrekte tekst [63](#page=63) [64](#page=64) [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67) [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [72](#page=72) [73](#page=73) [74](#page=74) [75](#page=75) [76](#page=76) [77](#page=77) [78](#page=78) [79](#page=79) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83) [84](#page=84) [85](#page=85) [86](#page=86) [87](#page=87) [88](#page=88) [89](#page=89) [90](#page=90) [91](#page=91) [92](#page=92) [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95) [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). ### 3.10 Bevestiging van identiteit en kwantificering Probe hybridisatie kan worden gebruikt voor de bevestiging van de identiteit van gedetecteerde sequenties, vaak in combinatie met een primerset en probe. Tevens biedt het de mogelijkheid tot kwantificering [65](#page=65). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Probe | Een gemerkte enkelstrengs DNA- of RNA-molecuul die specifiek bindt aan een complementaire doelsequentie door middel van hybridisatie. | | Doelwit (Target) | Het enkelstrengs DNA- of RNA-molecuul dat wordt gedetecteerd met behulp van een complementaire, gemerkte probe. | | Hybridisatie | Het proces waarbij twee complementaire enkelstrengs nucleïnezuurstrengen, zoals een probe en een doelwit, met elkaar binden om een dubbelstrengs structuur te vormen. | | Denaturatie | Het proces waarbij dubbelstrengs DNA wordt omgezet in enkelstrengs DNA, meestal door verhitting of chemische middelen, om hybridisatie mogelijk te maken. | | Blotten | De techniek waarbij DNA, RNA of eiwitten van een gel worden overgebracht naar een vast medium, zoals een membraan, om verdere analyse mogelijk te maken. | | Southern blot | Een techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-sequenties in een mengsel van DNA te identificeren door middel van hybridisatie met een complementaire probe na een restrictie-enzymdigest en elektroforese. | | Northern blot | Een techniek die wordt gebruikt om specifieke RNA-sequenties in een mengsel van RNA te identificeren door middel van hybridisatie met een complementaire probe na elektroforese. | | FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) | Een techniek die fluorescent gelabelde probes gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties direct te visualiseren in cellen of weefsels, vaak op chromosomen. | | Prehybridisatie | Een stap voorafgaand aan de hybridisatie waarbij onbezette bindingsplaatsen op het membraan worden geblokkeerd met niet-specifiek DNA om aspecifieke binding van de probe te voorkomen. | | Stringentie | De reactieomstandigheden (temperatuur, zoutconcentratie, pH) waaronder een hybridisatie plaatsvindt, die de specificiteit van de probe-target binding bepalen. Hoge stringentie vereist perfecte complementariteit. | | Tm (Smelttemperatuur) | De temperatuur waarbij de helft van de dubbelstrengs DNA-moleculen is gedissocieerd tot enkelstrengs moleculen. Dit is een belangrijke parameter bij het bepalen van hybridisatiecondities. | | Kruishybridisatie | Het ongewenste fenomeen waarbij een probe bindt aan een niet-doelwitsequentie die slechts gedeeltelijk complementair is. Dit wordt geminimaliseerd door geschikte stringentiecondities. | | Reporter | Een molecuul (bijvoorbeeld een enzym of een fluorochroom) dat gekoppeld is aan een probe en wordt gebruikt voor de detectie van de hybridisatie. | | Chemiluminescentie | Een detectiemethode waarbij licht wordt geproduceerd door een chemische reactie, vaak gebruikt in combinatie met enzymatische reporters om signalen van hybridisatie te versterken. | | Enzymatische synthese | De productie van probes door middel van enzymen, zoals reverse transcriptase of DNA-polymerase, vaak in combinatie met gemerkte nucleotiden. | | Radioactieve labeling | Het proces waarbij probes worden gemerkt met radioactieve isotopen, zoals $^32$P of $^35$S, voor detectie via autoradiografie of phospho-imaging. | | Fluorescente labeling | Het proces waarbij probes worden gemerkt met fluorescerende moleculen (fluorochromen) die licht uitzenden wanneer ze worden geëxciteerd, voor detectie met een fluorescentiemicroscoop. | | Biotine-labeling | Een methode waarbij probes worden gemerkt met biotine, dat vervolgens wordt gedetecteerd via interactie met streptavidine-conjugaat dat is gekoppeld aan een reporter. | | Digoxigenine-labeling | Een methode waarbij probes worden gemerkt met digoxigenine, dat vervolgens wordt gedetecteerd via interactie met een antilichaam tegen digoxigenine, dat is gekoppeld aan een reporter. | | RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) | Variaties in DNA-sequenties die leiden tot verschillende fragmentlengtes na restrictie-enzymdigest, gedetecteerd met Southern blotting. | | DNA micro-array | Een techniek waarbij duizenden DNA-probes op een vast oppervlak (meestal een glazen drager) worden bevestigd om tegelijkertijd de expressie van vele genen of de aanwezigheid van vele sequenties te analyseren. |