Optics Light

# Diffractie en interferentie van golven Diffractie en interferentie zijn fundamentele golfverschijnselen die optreden wanneer golven zich voortplanten en elkaar ontmoeten of interactie hebben met obstakels. ### 1.1 Huygens principe en superpositie van golven Het **Huygens principe** stelt dat elk punt van een golffront fungeert als een bron van nieuwe golfjes die zich voortplanten met de snelheid van de golf in het medium. Het golffront op een later moment is het raakvlak aan deze nieuwe golfjes. Dit principe is toepasbaar op alle soorten golven, inclusief elektromagnetische golven zoals licht [1](#page=1). Wanneer golven van twee of meer bronnen elkaar overlappen, is het **superpositieprincipe** van toepassing. Dit principe stelt dat de resulterende amplitude op een bepaald punt de vectoriële som is van de amplitudes van de individuele golven op dat punt [1](#page=1) [2](#page=2). #### 1.1.1 Constructieve interferentie **Constructieve interferentie** treedt op wanneer golven zich in fase bevinden. Dit betekent dat de maxima en minima van de golven op hetzelfde moment optreden. In dit geval versterken de golven elkaar, wat resulteert in een golf met een grotere amplitude. Voor gelijke golven vindt constructieve interferentie plaats wanneer het faseverschil een geheel veelvoud is van de golflengte ($n\lambda$), ofwel wanneer het weglengteverschil een geheel veelvoud is van de golflengte ($n\lambda$) [1](#page=1) [2](#page=2). > **Tip:** Denk bij constructieve interferentie aan twee golven die "samenwerken" om een grotere golf te creëren. #### 1.1.2 Destructieve interferentie **Destructieve interferentie** treedt op wanneer golven zich in tegenfase bevinden. Dit betekent dat een maximum van de ene golf samenvalt met een minimum van de andere golf. Hierdoor heffen de golven elkaar (gedeeltelijk) op, wat resulteert in een verminderde amplitude of zelfs de afwezigheid van golven in die richting. Voor gelijke golven vindt destructieve interferentie plaats wanneer het faseverschil een oneven veelvoud is van de halve golflengte ($(\frac{1}{2} + n)\lambda$ of $(2n+1)\frac{\lambda}{2}$), ofwel wanneer het weglengteverschil een oneven veelvoud is van de halve golflengte [1](#page=1) [2](#page=2). > **Tip:** Destructieve interferentie kan gezien worden als twee golven die elkaar "tenietdoen". De specifieke richtingen waarin constructieve en destructieve interferentie optreden, worden bepaald door de afstand tussen de bronnen en de golflengte van de golven. Voor twee coherente puntbronnen met een afstand $d$ ertussen, wordt de hoek $\theta$ waaronder destructieve interferentie optreedt gegeven door de voorwaarde: $$d \sin \theta = \left(n + \frac{1}{2}\right) \lambda$$ waarbij $n$ een geheel getal is. De eerste donkere strook (minimale hoek voor destructieve interferentie) wordt bereikt voor $n=0$ [2](#page=2): $$d \sin \theta = \frac{\lambda}{2}$$ [2](#page=2). ### 1.2 Diffractie van elektromagnetische golven Wanneer een parallelle bundel licht door een zeer smalle spleet valt, treedt **diffractie** op. In plaats van simpelweg de projectie van de spleet te vormen, ontstaat er een patroon van afwisselend heldere en donkere stroken op een scherm dat zich op enige afstand bevindt [3](#page=3). Dit fenomeen kan worden verklaard met het Huygens principe, waarbij elk punt in de spleet als een bron van nieuwe golfjes wordt beschouwd. De interactie (interferentie) van deze golfjes leidt tot het waargenomen patroon [3](#page=3). De **eerste donkere strook** ontstaat onder een hoek $\theta$ waarbij het verschil in weglengte van de lichtstralen aan de uiterste zijden van de spleet gelijk is aan de golflengte $\lambda$. Op deze hoek is de golf afkomstig van het midden van de spleet in tegenfase met de golf afkomstig van de bovenzijde van de spleet. Door het continue karakter van de golven en de superpositie, is elke golf boven het midden in tegenfase met een corresponderende golf daaronder, wat leidt tot volledige destructieve interferentie [3](#page=3). De **tweede donkere strook** ontstaat wanneer het verschil in weglengte tussen de lichtstralen aan de uiterste zijden van de spleet gelijk is aan $2\lambda$. Dit kan worden geredeneerd door de spleet te beschouwen als opgebouwd uit twee helften, waarbij de redenering voor het eerste minimum wordt toegepast op deze twee helften. Algemeen geldt dat de donkere stroken ontstaan wanneer het weglengteverschil tussen de uiterste randen van de spleet een geheel veelvoud is van de golflengte [3](#page=3). > **Voorbeeld:** Het diffractiepatroon van licht door een enkele spleet is een klassiek voorbeeld van hoe interferentie, veroorzaakt door diffractie, leidt tot specifieke heldere en donkere banden (maxima en minima). --- # Optische instrumenten en microscopie Dit hoofdstuk bespreekt het onderscheidend vermogen van optische instrumenten, lensaberraties, het principe van de lichtmicroscoop en verschillende microscopische technieken [10](#page=10) [11](#page=11) [12](#page=12) [13](#page=13) [14](#page=14) [15](#page=15) [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19) [20](#page=20) [21](#page=21) [22](#page=22) [23](#page=23) [24](#page=24) [25](#page=25) [26](#page=26) [27](#page=27) [4](#page=4) [5](#page=5) [6](#page=6) [7](#page=7) [8](#page=8) [9](#page=9). ### 2.1 Onderscheidend vermogen van optische instrumenten Het onderscheidend vermogen van een optisch instrument is de mate waarin twee dicht bij elkaar gelegen objecten nog als afzonderlijke objecten waargenomen kunnen worden. Dit vermogen wordt beperkt door diffractie [4](#page=4). #### 2.1.1 Diffractie door een spleet en een circulaire opening Bij diffractie door een spleet van breedte $W$ treden de opeenvolgende minima in intensiteit op bij hoeken $\theta$ gegeven door: $$ \sin\theta = \frac{n\lambda}{W} $$ met $n = 1, 2, 3, \dots$ Tussen deze donkere stroken bevinden zich heldere stroken door constructieve interferentie, waarbij de intensiteit afneemt naarmate men verder van de centrale projectie van de spleet verwijderd is [4](#page=4). Voor een lichtbundel die door een kleine circulaire opening met diameter $D$ gaat, treedt een circulair diffractiepatroon op. Het eerste minimum treedt op onder een hoek $\theta$ gegeven door: $$ \sin\theta = \frac{1.22\lambda}{D} $$ #### 2.1.2 Criterium van Rayleigh Het criterium van Rayleigh stelt dat twee puntvormige objecten nog juist van elkaar onderscheiden kunnen worden wanneer het centrale maximum van het diffractiepatroon van het ene voorwerp samenvalt met het eerste minimum van het diffractiepatroon van het andere voorwerp [4](#page=4). Voor kleine hoeken ($\sin\theta \approx \theta$) wordt de minimale hoek $\theta_{min}$ waaronder twee voorwerpen nog gescheiden kunnen worden gezien vanuit de opening gegeven door: $$ \theta_{min} = \frac{1.22\lambda}{D} $$ met $\theta$ in radialen [4](#page=4). #### 2.1.3 Toepassing op microscoop en oog Bij de microscoop, met een objectief van diameter $D$ en een afstand $d$ van de lens tot de twee punten $S_1$ en $S_2$ op een afstand $s$ van elkaar, geldt dat de minimale scheidbare afstand $s$ wordt gegeven door: $$ s = 1.22 \left(\frac{d}{D}\right) \lambda $$ Omdat $d/D$ bij een microscoop dicht bij 1 ligt, is de kleinste detail dat gezien kan worden van de grootteorde van de golflengte van het gebruikte licht, ongeveer $0.5 \text{ µm}$ [5](#page=5). Voor het menselijk oog met een pupilgrootte van $2.5 \text{ mm}$ en groen licht met een golflengte van $555 \text{ nm}$ (in het oog effectief $408 \text{ nm}$ door brekingsindex), is de resolutie: $$ \theta_{min} = \frac{1.22\lambda}{D} = \frac{1.22 \times 408 \times 10^{-9} \text{ m}}{2.5 \times 10^{-3} \text{ m}} = 2.0 \times 10^{-4} \text{ radialen} $$ Op een afstand van $10 \text{ m}$ kunnen twee punten met deze resolutie nog gescheiden worden op een afstand van $2 \text{ mm}$ [5](#page=5). ### 2.2 Lensaberraties Lensaberraties zijn fouten in lenzen die ervoor zorgen dat een puntvormig voorwerp niet noodzakelijk in een punt wordt afgebeeld. De belangrijkste zijn sferische aberratie, chromatische aberratie en beeldvlakkromming [6](#page=6). #### 2.2.1 Sferische aberratie Deze aberratie wordt veroorzaakt door het verschil in focusafstand tussen axiale en buitenste zones van een lens, waarbij stralen verder van de optische as sterker worden afgebogen. Een oplossing is het gebruik van een diafragma met variabele apertuur om buitenste stralen af te snijden [6](#page=6). #### 2.2.2 Chromatische aberratie Doordat de brekingsindex afhangt van de golflengte (kortere golflengtes worden sterker gebroken), heeft licht met kortere golflengtes (bv. violet) een kleinere brandpuntsafstand dan licht met langere golflengtes (bv. rood). Dit resulteert in een veelkleurige halo rond de afbeelding van een puntvormig voorwerp bij wit licht. Oplossingen omvatten het gebruik van samengestelde, achromatische lenzen gemaakt van verschillende glassoorten [6](#page=6). #### 2.2.3 Beeldvlakkromming Bij beeldvlakkromming wordt een voorwerp in een plat vlak afgebeeld in een gekromd vlak (Petzval-oppervlak). Dit kan worden verholpen door het gebruik van lenzensystemen, zogenaamde aplanatische lenzenstelsels, die een voorwerp in een plat vlak afbeelden. Plan Apo objectieven zijn gecorrigeerd voor zowel chromatische aberraties als beeldvlakkromming [6](#page=6) [7](#page=7). ### 2.3 Principe van de lichtmicroscoop Een microscoop bereikt grotere vergrotingen dan een loep door het gebruik van een systeem van twee lenzen: de objectief en het oculair [7](#page=7). * **Objectief:** Deze sterk convergerende lens met een kleine brandpuntsafstand bevindt zich dicht bij het voorwerp en vormt een reëel beeld ($I_o$) van het object [7](#page=7) [8](#page=8). * **Oculair:** Dit werkt als een loep en vormt van het beeld $I_o$ een virtueel beeld ($I_e$) [8](#page=8). De totale vergroting ($m$) is het product van de vergroting van het objectief ($m_o$) en het oculair ($m_e$): $$ m = m_o m_e $$ De vergroting van het objectief wordt gegeven door: $$ m_o = \frac{i_o}{p_o} = 1 - \frac{i_o}{f_o} $$ waarbij $p_o$ de voorwerpsafstand is (negatief) en $i_o$ de beeldafstand (positief) [8](#page=8). De vergroting van het oculair wordt gegeven door: $$ m_e = \frac{i_e}{p_e} = 1 - \frac{i_e}{f_e} $$ waarbij $p_e$ de voorwerpsafstand is (negatief) en $i_e$ de beeldafstand (negatief) [9](#page=9). Met $N$ als de afstand van het nabijheidspunt ($25 \text{ cm}$) en $i_e \approx -N$, wordt de totale vergroting bij benadering: $$ m \approx -\frac{i_o N}{f_o f_e} $$ De formule laat zien dat een zo klein mogelijke $f_o$ nodig is voor de grootste vergroting [9](#page=9). #### 2.3.1 Köhler verlichting Köhler verlichting zorgt voor een homogene, heldere veldbelichting van het preparaat, essentieel voor transmissielichtmicroscopie. De lichtweg voor belichting en beeldvorming zijn gescheiden [10](#page=10). * **Lichtbron:** Meestal een halogeenlamp. Het uitgezonden spectrum varieert met de dimming; dimlicht bevat veel rood en geel licht. Filters kunnen gebruikt worden om intensiteit te verminderen en rode componenten te reduceren [10](#page=10). #### 2.3.2 Het objectief Objectieven zijn verwisselbaar en hebben een zeer kleine brandpuntsafstand. De **numerieke apertuur (NA)** van een objectief wordt gedefinieerd als [11](#page=11): $$ \text{NA} = n \sin\alpha $$ met $n$ de brekingsindex van het medium tussen objectief en preparaat (lucht $n=1$, immersieolie $n=1.52$) en $\alpha$ de halve hoek waaronder de objectieflens vanuit het preparaat wordt gezien. De hoogste NA voor een droge lens is ongeveer 1, voor een immersieobjectief 1.51 [11](#page=11). De resolutie ($s$) kan direct uit de NA worden afgeleid: $$ \text{resolutie} = \frac{0.61\lambda}{\text{NA}} $$ De golflengte $\lambda$ dient hierbij in lucht te worden genomen. De beste resolutie in lichtmicroscopie met een immersieobjectief (NA 1.4) en groen licht (500 nm) bedraagt $0.22 \text{ µm}$ [11](#page=11) [12](#page=12). Objectieven worden ingedeeld op gebruik (bv. droog, immersie, fase-contrast) [12](#page=12). * **Achromaten:** Gecorrigeerd voor chromatische aberraties voor rood en blauw licht [12](#page=12). * **Apoachromaten:** Sterk gecorrigeerd voor chromatische aberraties voor alle kleuren [12](#page=12). * **Plan-objectieven:** Gecorrigeerd voor beeldvlakkromming (aplanatisch) [12](#page=12). De beste objectieven zijn **Plan-apo objectieven** [12](#page=12). Objectieven voor fluorescentiemicroscopie moeten ook UV-transmissie hebben. Tubuslengtes van $160 \text{ mm}$ of $170 \text{ mm}$ maken het wisselen van objectieven zonder veel aanpassing van scherpstelling mogelijk [12](#page=12). Een voorbeeld van informatie op een objectief: "Ph3 Neofluar 40/0.85 Oil 160/0.17". Dit betekent: fase ring, UV-transparant vergroting x40 / NA 0.85 immersieobjectief, tubuslengte 160 mm / coverslip dikte 0.17 mm [12](#page=12). #### 2.3.3 Condensor De condensor focust een uniforme kegel van licht op het specimen. Voor optimale microscopie moet de apertuur van de condensor aangepast zijn aan de NA van het objectief (idealiter 70-90% van de objectief apertuur) [12](#page=12) [13](#page=13). * Te open diafragma veroorzaakt strooilicht en verlies van contrast [13](#page=13). * Te klein diafragma leidt tot resolutieverlies [13](#page=13). In **donkerveldmicroscopie** wordt de directe lichtbundel geblokkeerd; alleen verstrooid licht van het object wordt waargenomen, wat resulteert in een donkere achtergrond [13](#page=13). #### 2.3.4 Oculair Het oculair vergroot het door het objectief gevormde beeld, meestal met een factor 10. De meeste oculairen van het Huygens-type bestaan uit een veldlens en een ooglens. Een meetplaatje kan hier worden geplaatst voor grootte-metingen [13](#page=13). #### 2.3.5 Invert microscoop De invert microscoop is aangepast voor observatie van celculturen in dikke recipiënten. De lichtbron en condensor bevinden zich boven het specimen, en de objectieflens onder de recipiënt [14](#page=14). ### 2.4 Fasecontrastmicroscopie Fasecontrastmicroscopie is gebaseerd op de faseverandering van lichtgolven door variaties in brekingsindex binnen het specimen. Dit maakt observatie van levende, ongekleurde cellen mogelijk [14](#page=14). Het principe berust op het creëren van een faseverschil tussen de niet-afgebogen bundel (centraal maximum) en de diffractiebundels. Een speciale faseringsring in de condensor creëert een circulaire spleet, terwijl een faseplaat in het objectief de fase van de directe bundel en de verstrooide bundels manipuleert. Door deze manipulatie en daaropvolgende destructieve interferentie ontstaat een donker beeld in een homogeen midden, met intensiteitsverschillen die overeenkomen met brekingsindexverschillen in het specimen [14](#page=14) [15](#page=15). > **Tip:** Fasecontrastmicroscopie produceert geen halo-vorming aan de randen, maar wel intensiteitsverschillen die de structuur van ongekleurde cellen zichtbaar maken. ### 2.5 Differentieel interferentie contrast (DIC) microscoop De DIC-microscoop (ook Nomarski-microscoop) verbetert ook het contrast in transparante samples, maar gebruikt gepolariseerd licht en prisma's. Twee orthogonale gepolariseerde lichtbundels worden gefocusseerd op het preparaat, enigszins gescheiden. Na interactie met het preparaat worden deze bundels weer samengevoegd met dezelfde polarisatie, waardoor interferentie optreedt die afhankelijk is van het optisch weglengteverschil [16](#page=16). DIC vertoont een rand-schaduw in plaats van halo's, biedt over het algemeen betere resolutie dan fasecontrast, en kan dikkere samples waarnemen [16](#page=16). ### 2.6 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van stoffen die licht absorberen bij een bepaalde golflengte (excitatie) en dit weer uitzenden bij een langere golflengte (emissie). Dit wordt gebruikt voor gevoelige en specifieke detectie van moleculen, zoals antilichamen en DNA-proben, vaak met behulp van fluorochromen zoals FITC (groene emissie), TRITC (rode emissie), DAPI (blauwe emissie) en PI (rode emissie) [17](#page=17). De lichtweg omvat: 1. **Lichtbron:** Meestal een kwiklamp [18](#page=18). 2. **Excitatiefilter:** Selecteert de excitatiegolflengte van het fluorochroom [18](#page=18). 3. **Dichroïsche spiegel/prisma:** Weerkaatst excitatielicht en laat emissielicht door [18](#page=18). 4. **Emissiefilter:** Blokkeert excitatiegolflengte en laat emissiegolflengte door [18](#page=18). Het beeld toont de gefluoresceerde structuren tegen een donkere achtergrond [18](#page=18). > **Voorbeeld:** Bij een delende longcel kunnen met drie antilichamen chromosomen (blauw), keratine filamenten (rood) en microtubulinen (geel) zichtbaar gemaakt worden [19](#page=19). ### 2.7 Confocale microscopie Confocale microscopie maakt het mogelijk om optische secties van dikkere weefsels te verkrijgen, tot $100 \text{ µm}$, en driedimensionale beelden te reconstrueren [19](#page=19). Het principe berust op het gebruik van een laserbundel die het specimen afscant, met lichtcollectie via een fotomultiplicator. Een kleine apertuur (confocale opening) voor de fotomultiplicator blokkeert licht dat buiten het scherpe brandvlak valt, wat resulteert in optische secties met een zeer kleine scherptediepte. Door deze secties op verschillende dieptes te verzamelen en met software te combineren, ontstaat een 3D-voorstelling [19](#page=19) [20](#page=20). ### 2.8 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie verhoogt het oplossend vermogen aanzienlijk ten opzichte van lichtmicroscopie, tot ongeveer $1 \text{ nm}$. Dit is gebaseerd op het golflengtekarakter van bewegende elektronen en het gebruik van magneetspoelen als elektronenlenzen [21](#page=21). #### 2.8.1 Golflengte van elektronen Volgens de kwantumtheorie hebben bewegende deeltjes, zoals elektronen, een golfkarakter met een golflengte $(\lambda)$ gegeven door: $$ \lambda = \frac{h}{m_e v} $$ met $h$ de constante van Planck, $m_e$ de massa en $v$ de snelheid van het elektron. Bij een versnellingspotentiaal van $60 \text{ kV}$ is de golflengte van elektronen $0.005 \text{ nm}$, circa 100.000 keer kleiner dan die van zichtbaar licht [21](#page=21). #### 2.8.2 Elektronenlenzen en aberraties Elektronen kunnen niet met glaslenzen worden gefocusseerd. Hiervoor worden magneetspoelen met ringvormige weekijzeren poolschoenen gebruikt om lokale sterke magnetische velden op te wekken. Net als bij glaslenzen treden ook bij elektromagnetische lenzen aberraties op, zoals sferische aberraties en beeldveldvervorming, wat het scheidend vermogen beperkt tot $1 \text{ nm}$ [21](#page=21). #### 2.8.3 Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM) De bouw van een TEM lijkt sterk op die van een lichtmicroscoop. De "lichtbron" is een wolfraamdraad die door verhitting elektronen uitzendt. Deze worden versneld tot een smalle bundel door een potentiaalverschil tussen $40$ en $100 \text{ kV}$. Condensorlenzen concentreren de bundel op het preparaat [22](#page=22). Contrast bij TEM wordt verkregen door het verstrooiingspatroon van elektronen door het preparaat. Het preparaat is meestal een dunne coupe (ca. $50 \text{ nm}$) op een koperen grid. Voor contrast worden verbindingen van elementen met een hoog atoomnummer (hoge Z) gebruikt, zoals osmiumtetroxide (bindt aan eiwitten) en uranylacetaat (affiniteit voor DNA). De schaduwtechniek, waarbij metaal wordt bestoven, kan ook worden toegepast [23](#page=23). Meerdere lenzen (objectief, diffractie, tussenlens) vormen een vergrote afbeelding die via projectorlenzen op een fluorescerend beeldscherm wordt geprojecteerd. Vergrotingen variëren van circa 1000x tot 500.000x. Fotografische emulsie wordt gebruikt voor het beste resultaat [23](#page=23). > **Voorbeeld:** Elektronenmicrografie kan verschillende stadia van lymfocytenafbraak (apoptose) en necrose visualiseren, met zichtbare veranderingen in de kernmorfologie [24](#page=24). #### 2.8.4 Scanning Elektronenmicroscoop (SEM) Een SEM scant het preparaat punt per punt met een elektronenbundel. Secundaire en/of gereflecteerde primaire elektronen worden gedetecteerd en moduleren de lichtintensiteit op een kathodestraalbuis, waardoor een beeld van het oppervlak wordt gevormd [24](#page=24) [25](#page=25). > **Kenmerk:** Het beeld heeft een driedimensionaal uitzicht doordat het aantal secundaire elektronen afhankelijk is van de hoek van de elektronenbundel met het oppervlak [25](#page=25). SEM wordt gebruikt voor de studie van oppervlakken en heeft een resolutie van ongeveer $10 \text{ nm}$ met effectieve vergrotingen tot 20.000x. Biologische monsters moeten elektrisch geleidend gemaakt worden door ze te bedekken met een dun laagje goud of platina [25](#page=25). ### 2.9 Scanning Probe Microscoop (SPM) SPM's gebruiken een mechanische probe voor beeldvorming, waardoor dynamische processen en effecten van toegevoegde moleculen bestudeerd kunnen worden. Details tot een fractie van $10^{-10} \text{ m}$ kunnen worden onderscheiden [26](#page=26). Er zijn twee typen SPM's: 1. **Scanning Tunnelmicroscoop (STM):** De tip wordt dicht bij een geleidend oppervlak gebracht. Een aangelegde spanning veroorzaakt een kwantummechanische tunnelstroom die exponentieel afhankelijk is van de afstand tussen tip en oppervlak. Door de hoogte van de tip constant te houden, wordt het oppervlak in kaart gebracht [26](#page=26) [27](#page=27). 2. **Atomic Force Microscoop (AFM):** Deze kan beelden maken van niet-geleidende oppervlakken. Een fijne punt (tip) staat in contact met een gevoelige krachtsensor. Interatomaire krachten tussen de tip en het oppervlak worden waargenomen. De krachtsensor voldoet aan de wet van Hooke ($F = -kz$), waarbij uitwijkingen tot $0.1 \text{ nm}$ gedetecteerd kunnen worden [27](#page=27). SPM's zijn niet-invasieve methoden om oppervlaktekenmerken van biologische structuren met hoge nauwkeurigheid in kaart te brengen [27](#page=27). --- # Verschillende microscopische technieken Dit hoofdstuk behandelt diverse microscopische methoden die essentieel zijn voor het bestuderen van structuren op een microschaal, variërend van cellen tot moleculen, elk met specifieke toepassingen en technische principes. ### 3.1 De breedveld lichtmicroscoop De breedveld lichtmicroscoop is een fundamenteel instrument in de biologie en geneeskunde. Het principe is gebaseerd op het doorlichten van een preparaat met zichtbaar licht om een versterkt beeld te verkrijgen [10](#page=10). #### 3.1.1 Belichting en beeldvorming Een homogene, heldere veldbelichting is cruciaal voor transmissielichtmicroscopie. De Köhler-verlichtingstechniek, ontwikkeld aan het eind van de negentiende eeuw, zorgt voor een uniforme belichting van het preparaat, zelfs met een kleine lamp. De lichtweg voor belichting en beeldvorming worden apart behandeld. Het gebruikte lichtspectrum is van belang; halogeenlampen zenden licht uit dat varieert in kleurintensiteit met de dimming. Te veel rood licht kan worden gereduceerd met filters om een correct beeld te verkrijgen [10](#page=10). #### 3.1.2 Het objectief Objectieven zijn verwisselbare lenzenstelsels met een kleine brandpuntsafstand die zich aan de revolver onderaan de tubus bevinden. De resolutie van een objectief wordt bepaald door de numerieke apertuur (NA), gedefinieerd als $NA = n \sin \alpha$, waarbij $n$ de brekingsindex van het medium is en $\alpha$ de halve openingshoek. Droge objectieven hebben een maximale NA van ongeveer 1, terwijl immersieobjectieven een NA tot 1,51 kunnen bereiken. De minimale afstand tussen twee scheidbare punten (resolutie) wordt gegeven door [11](#page=11): $$resolutie = \frac{0,61 \lambda}{NA}$$ [11](#page=11). De beste resolutie in lichtmicroscopie is ongeveer 0,22 µm met een immersieobjectief (NA 1,4) en groen licht (500 nm) [12](#page=12). Objectieven worden ingedeeld naar gebruik (droog, immersie, fase-contrast) en correctiegraad voor aberraties: * **Apoachromaten:** Sterk gecorrigeerd voor chromatische aberraties over alle kleuren. * **Achromaten:** Gecorrigeerd voor chromatische aberraties voor rood en blauw licht. * **Plan-objectieven:** Alle hedendaagse objectieven zijn aplanaten; de beste zijn Plan-apo objectieven [12](#page=12). Voor fluorescentiemicroscopie is de transmissie van UV-licht door het objectief belangrijk, aangeduid met "Neofluar", "Fluor", of "UV". Een tubuslengte van 160 mm of 170 mm minimaliseert het verlies van scherpstelling bij het wisselen van objectief. Een typische aanduiding op een objectief is "Ph3 Neofluar 40/0.85 Oil 160/0.17", wat staat voor fase-contrast, UV-transparant, 40x vergroting, NA 0,85 immersie, voor een tubuslengte van 160 mm en een coverslipdikte van 0,17 mm. Als "160/-" onderaan staat, is de coverslipdikte niet relevant [12](#page=12). #### 3.1.3 Condensor De condensor focust een uniforme lichtkegel op het preparaat. Een apochromatische lens wordt meestal gebruikt om aberraties te vermijden. Het diafragma van de condensor regelt de apertuur en moet worden aangepast aan de NA van het objectief; idealiter wordt 70-90% van het objectief belicht. Een te wijd open diafragma veroorzaakt strooilicht, terwijl een te klein diafragma resolutieverlies geeft [12](#page=12) [13](#page=13). Naast helderveld microscopie bestaat donkerveld microscopie, waarbij de achtergrond zwart is en alleen verstrooid licht wordt opgevangen door het object [13](#page=13). #### 3.1.4 Het oculair Het oculair vergroot het beeld gevormd door het objectief, meestal met een factor 10. Huygens-oculairs bestaan uit een veldlens en een ooglens met een diafragma. Meetplaatjes kunnen in het beeldvlak van het objectief worden geschoven voor metingen [13](#page=13). #### 3.1.5 Invert microscoop De invert microscoop is ontworpen voor observatie van celculturen in dikkere containers, waarbij de lichtbron en condensor zich boven het specimen bevinden en de objectieflens onder de recipiënt [14](#page=14). ### 3.2 Fase contrast microscopie Fase-contrast microscopie wordt gebruikt voor gedetailleerde observatie van levende cellen en andere ongekleurde transparante samples, gebaseerd op faseverschillen veroorzaakt door de brekingsindex van het specimen. Verschillen in brekingsindex tussen cel en medium leiden tot een faseverschuiving van de lichtgolf. Het principe berust op het creëren van een faseverschil van $\lambda/4$ tussen de directe en afgebogen lichtbundels, die na manipulatie met speciale glasplaten (faseplaat) resulteren in destructieve interferentie (een verschil van $\lambda/2$). Dit resulteert in een donker beeld tegen een homogene achtergrond, waarbij intensiteitsverschillen de structuur van het preparaat weergeven. Speciale fase-contrast objectieven met een faseplaat corrigeren dit verschil [14](#page=14) [15](#page=15). ### 3.3 Differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie De Differentieel Interferentie Contrast (DIC) microscoop, ook wel Nomarski microscoop genoemd, gebruikt gepolariseerd licht en prisma's om het contrast in ongekleurde transparante samples te verbeteren. Twee orthogonale gepolariseerde lichtbundels worden parallel op het preparaat gefocusseerd, gescheiden door ongeveer 2 µm. Na het samensmelten van deze bundels tot dezelfde polarisatie ontstaat interferentie, afhankelijk van het optische weglengteverschil. DIC-microscopie produceert een rand-schaduw in plaats van de halo's die bij fase-contrast optreden en kan dikkere samples (>100 µm) beter afbeelden met een hogere resolutie [16](#page=16). ### 3.4 Fluorescentie microscopie Fluorescentie microscopie wordt gebruikt voor de detectie van specifieke moleculen in preparaten, vaak in immunohistochemie en in-situ hybridisatie. Fluorescerende stoffen absorberen licht bij een excitatie golflengte en zenden dit uit bij een langere emissie golflengte. Voor gevoelige detectie worden deze stoffen gebonden aan antilichamen of DNA-probes. Veelgebruikte fluorochromen zijn FITC (groene emissie), TRITC (rode emissie), DAPI (blauwe emissie, kernkleuring) en Propidium Iodide (rode emissie, kernkleuring) [17](#page=17). De lichtweg omvat een lichtbron (vaak een kwiklamp), een excitatiefilter dat selectief licht met de excitatie golflengte doorlaat, een dichroïsche spiegel die de excitatiegolflengte weerkaatst en de emissiegolflengte doorlaat, en een emissiefilter die de excitatiegolflengte blokkeert en de emissiegolflengte doorlaat. Het beeld toont de gefluoresceerde structuren tegen een donkere achtergrond [18](#page=18). > **Voorbeeld:** Een beeld van een delende longcel met blauwe DNA-kleuring, rode keratine en gele tubuline, waarbij chromosomen, keratine filamenten en microtubulinen zichtbaar zijn [19](#page=19). ### 3.5 Confocale microscopie Confocale microscopie wordt toegepast voor het verkrijgen van optische secties van dikkere weefsels (tot circa 100 µm) en voor driedimensionale reconstructies. Door de kleine scherptediepte van objectieven met een hoge NA en het gebruik van een laserbundel die het x-y vlak afscant, wordt licht van buiten het brandvlak onderdrukt door een confocale apertuur. De optica is vergelijkbaar met fluorescentiemicroscopie, maar met een laser als lichtbron en scanningspiegels voor de x-y scanning. De lichtcollectie gebeurt via een fotomultiplicator die het emissielicht omzet in een elektrische puls. Software genereert beelden op basis van de intensiteitssignalen, en door optische secties op verschillende dieptes te combineren, kunnen 3D-voorstellingen worden gemaakt [19](#page=19) [20](#page=20). > **Voorbeeld:** Vergelijking van een hippocampus sectie met gewone breedveld fluorescentie microscopie (a) en confocale microscopie (b), waarbij groene neurofilamenten en blauwe kernkleuring zichtbaar zijn [20](#page=20). ### 3.6 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie verlaagt het oplossend vermogen tot ongeveer 1 nm door gebruik te maken van de golfeigenschappen van elektronen. De golflengte van elektronen wordt gegeven door de de Broglie-relatie: $\lambda = \frac{h}{m_e v}$, waarbij $h$ de constante van Planck is en $m_e$ en $v$ de massa en snelheid van het elektron. Bij een versnellingspotentiaal van 60 kV is de golflengte ongeveer 0,005 nm. Magnetische spoelen dienen als lenzen voor elektronenbundels. Sferische aberraties en beeldveldvervorming beperken het scheidend vermogen van commerciële microscopen tot 1 nm [21](#page=21). #### 3.6.1 Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM) De TEM vertoont structurele overeenkomsten met de lichtmicroscoop. De elektronenbron is een wolfraamdraad die door verhitting elektronen uitzendt, versneld door een potentiaalverschil (40-100 kV). Condensorlenzen concentreren de bundel op het preparaat. Contrast wordt verkregen door de verstrooiing van elektronen door het preparaat, dat meestal een 50 nm dunne coupe is op een koperen grid. Contraststoffen zoals osmiumtetroxide en uranylacetaat worden gebruikt om de verstrooiing te verhogen. De verstrooide elektronen worden uit de bundel verwijderd door een diffractiediafragma. Lenzen (objectief-, diffractie-, tussenlens) vormen een vergrote afbeelding die via projectorlenzen op een fluorescerend scherm wordt geprojecteerd. Het beeld wordt voornamelijk gevormd door delen met een hoge concentratie contraststoffen als donkere structuren op een heldere achtergrond. De vergroting is continu regelbaar van circa 1000x tot 500.000x. Fotografie is essentieel voor het verkrijgen van definitieve resultaten [22](#page=22) [23](#page=23). > **Voorbeeld:** Elektronenmicrografie van een lymfocyt in verschillende stadia van apoptose en necrotische lymfocyten, waarbij de kernmorfologie bij apoptose duidelijk te zien is [24](#page=24). #### 3.6.2 Scanning Elektronenmicroscoop (SEM) De SEM scant het preparaat punt voor punt met een elektronenbundel en detecteert secundaire en/of gereflecteerde primaire elektronen (#page=24, 25). De bundel wordt gefocusseerd tot een spot van ongeveer 10 nm op het preparaat. Een synchroon aftastend scherm op een kathodestraalbuis vormt het beeld van het oppervlak. Het beeld heeft een driedimensionaal uitzicht doordat de intensiteit van secundaire elektronen afhankelijk is van de hoek van de bundel met het oppervlak. De SEM heeft een oplossend vermogen van ongeveer 10 nm en een effectieve vergroting tot 20.000x, voornamelijk gebruikt voor de studie van cellen en weefsels als geheel. Biologische monsters moeten elektrisch geleidend worden gemaakt, meestal door een dun laagje goud of platina aan te brengen [24](#page=24) [25](#page=25). ### 3.7 Scanning probe microscopie (SPM) Scanning probe microscopie (SPM) gebruikt een mechanische probe om beelden te vormen, wat de studie van dynamische processen en de toevoeging van biologische moleculen mogelijk maakt. Details tot op fracties van 10⁻¹⁰ meter kunnen in driedimensionale beelden worden onderscheiden. SPM's bestaan uit een probe (met een scherpe tip), piëzo-elektrische keramieken voor precieze positionering, elektronica en een computer voor beeldopbouw [26](#page=26). #### 3.7.1 Scanning Tunnel Microscopie (STM) Bij STM wordt een tip dicht bij het oppervlak gebracht. Een aangelegde spanning creëert een kwantummechanische tunnelstroom, die exponentieel afhankelijk is van de afstand tussen tip en oppervlak. Door een elektronisch systeem constant te houden, wordt de hoogte van de tip gereguleerd, wat resulteert in een reliëfbeeld van het oppervlak. STM vereist echter geleidende oppervlakken [26](#page=26) [27](#page=27). #### 3.7.2 Atomic Force Microscopie (AFM) De Atomic Force Microscoop (AFM) is ontwikkeld om niet-geleidende oppervlakken af te beelden, wat essentieel is voor biologische monsters. Een fijne punt, verbonden met een krachtsensor, tast het oppervlak af. Interatomaire krachten tussen de tip en het oppervlak worden waargenomen. De krachtsensor volgt de wet van Hooke ($F = -kz$), waarbij $k$ de krachtconstante is en $z$ de uitwijking. Uitwijkingen tot 0,1 nm kunnen worden gedetecteerd en in functie van het gescande oppervlak worden uitgezet, wat leidt tot een driedimensionaal reliëfbeeld. SPM is een niet-invasieve methode voor het nauwkeurig in kaart brengen van uitwendige kenmerken van biologische structuren [27](#page=27). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Diffractie | Het fenomeen waarbij golven zich om obstakels heen verspreiden en zich daardoor niet meer rechtlijnig voortplanten, wat resulteert in een patroon van heldere en donkere gebieden bij de verstoring van de golf. | | Interferentie | Het verschijnsel dat optreedt wanneer twee of meer golven elkaar ontmoeten, wat leidt tot een wederzijdse versterking (constructieve interferentie) of uitdoving (destructieve interferentie) van de golven. | | Huygens principe | Een principe dat stelt dat elk punt op een golffront fungeert als een nieuwe bron van cirkelvormige secundaire golven; het golffront op een later tijdstip wordt gevormd door de omhullende van deze secundaire golven. | | Constructieve interferentie | Treedt op wanneer twee golven in fase zijn, wat resulteert in een grotere amplitude van de gecombineerde golf, met name wanneer de golffronten elkaar versterken. | | Destructieve interferentie | Treedt op wanneer twee golven in tegenfase zijn, wat resulteert in een kleinere of nul amplitude van de gecombineerde golf, aangezien de golffronten elkaar uitdoven. | | Golflengte | De ruimtelijke afstand tussen twee opeenvolgende overeenkomstige punten van een golf, zoals twee toppen of twee dalen, aangeduid met de Griekse letter lambda ($\lambda$). | | Onderscheidend vermogen | Het vermogen van een optisch instrument om twee dicht bij elkaar gelegen punten als afzonderlijke entiteiten waar te nemen, wat direct gerelateerd is aan de golflengte van het gebruikte licht en de diameter van de opening. | | Criterium van Rayleigh | Een criterium dat stelt dat twee puntvormige objecten nog net van elkaar onderscheiden kunnen worden wanneer het centrale maximum van het diffractiepatroon van het ene object samenvalt met het eerste minimum van het diffractiepatroon van het andere object. | | Aberratie | Een fout of afwijking in de optische prestaties van een lens of een systeem van lenzen, die leidt tot vervormingen in het beeld, zoals sferische aberratie of chromatische aberratie. | | Sferische aberratie | Een lensfout waarbij lichtstralen die niet door het optische centrum van de lens gaan, anders worden gefocusseerd dan de stralen die dicht bij de as vallen, wat leidt tot een onscherp beeld. | | Chromatische aberratie | Een lensfout veroorzaakt door het feit dat de brekingsindex van glas varieert met de golflengte van licht, waardoor verschillende kleuren licht op verschillende brandpunten worden gefocusseerd. | | Beeldvlakkromming | Een lensfout waarbij een object dat in een plat vlak ligt, wordt afgebeeld in een gekromd vlak in plaats van in een plat beeld, wat leidt tot onscherpte aan de randen van het beeld. | | Numerieke apertuur (NA) | Een maat voor het lichtverzamelend vermogen van een objectief en de resolutie die het kan bereiken, gedefinieerd als het product van de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het preparaat en de sinus van de halve openingshoek. | | Resolutie | De kleinst mogelijke afstand tussen twee objecten die nog als afzonderlijk kunnen worden waargenomen; in de microscopie is dit vaak gerelateerd aan de golflengte van het licht en de numerieke apertuur. | | Fasecontrast microscopie | Een techniek die gebruikmaakt van faseverschillen in lichtgolven die door transparante objecten gaan om contrast te creëren in ongekleurde monsters, wat leidt tot zichtbare structuren met verschillende helderheidsgraden. | | Differentieel interferentie contrast (DIC) microscoop | Een microscopische techniek die gepolariseerd licht gebruikt en kleine verschillen in optische weglengte binnen een preparaat omzet in zichtbaar contrast, wat resulteert in een reliëfachtig beeld zonder de halo-effecten van fasecontrast. | | Fluorescentiemicroscopie | Een techniek waarbij specifieke moleculen in een monster worden geëtiketteerd met fluorochromen die licht absorberen bij een bepaalde golflengte en uitzenden bij een langere golflengte, waardoor deze structuren oplichten tegen een donkere achtergrond. | | Confocale microscopie | Een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die optische secties van een monster neemt door gebruik te maken van een puntvormige lichtbron en een puntvormige detector, wat resulteert in beelden met een hoge resolutie en de mogelijkheid tot driedimensionale reconstructie. | | Elektronenmicroscopie | Een type microscoop dat elektronen gebruikt in plaats van licht om beelden te creëren, wat een aanzienlijk hogere resolutie en vergroting mogelijk maakt dan bij lichtmicroscopie, dankzij het kortere golflengtekarakter van elektronen. | | Scanning probe microscoop (SPM) | Een microscoop die een fysieke probe gebruikt om een oppervlak af te tasten en gedetailleerde driedimensionale beelden te creëren, met toepassingen variërend van atomaire schaal tot het bestuderen van dynamische biologische processen. | | Scanning tunnel microscoop (STM) | Een type scanning probe microscoop dat gebruikmaakt van kwantummechanische tunnelstroom tussen een scherpe tip en een geleidend oppervlak om de topografie op atomair niveau in kaart te brengen. | | Atomic force microscoop (AFM) | Een type scanning probe microscoop dat de interatomaire krachten tussen een scherpe tip en een oppervlak meet om driedimensionale beelden te genereren, ook van niet-geleidende materialen. |

# Elektromagnetische golven: bronnen en karakteristieken Dit hoofdstuk behandelt de diverse bronnen van elektromagnetische golven, variërend van macroscopische structuren zoals antennes tot microscopische atomaire processen, en de fundamentele eigenschappen van deze golven, zoals golflengte en frequentie. ### 1.1 Bronnen van elektromagnetische golven Elektromagnetische golven (E.M. golven) omvatten een breed spectrum aan straling, waaronder radiogolven, microgolven, infrarood- en ultravioletstraling, zichtbaar licht, X- en gammastraling. Het type E.M. straling wordt primair bepaald door de golflengte ($\lambda$). E.M. golven met golflengtes groter dan 10⁻³ meter worden opgewekt door uitgebreide bronnen, zoals radio- en televisieantennes. Golflengtes kleiner dan 10⁻³ meter worden geproduceerd door processen binnen atomen en moleculen, die dan functioneren als elementaire stralers [1](#page=1). #### 1.1.1 Uitgebreide bronnen Het principe van een dipoolantenne illustreert de opwekking van E.M. golven. In een oscillator die bestaat uit een LC-kring (spoel L en condensator C), wordt een sinusvormig magnetisch veld opgewekt [1](#page=1). Wanneer de condensator bij tijdstip $t=0$ volledig is opgeladen en de stroom ($i$) nul is, begint de condensator te ontladen. De stroom door de kring en de spoel neemt toe, wat resulteert in een groeiend magnetisch veld in de spoel volgens de Wet van Ampère. De stroom en het magnetisch veld bereiken hun maximale waarde wanneer de condensator volledig ontladen is. Hierna laadt de condensator zich op met omgekeerde polariteit door de aanwezige stroom. Dit proces stopt wanneer de stroom en het magnetisch veld nul zijn, waarna de condensator opnieuw ontlaadt, maar nu met de oorspronkelijke polariteit [2](#page=2). Gedurende dit kringproces veranderen de spanning over de condensator en het magnetisch veld in de spoel volgens een sinusvormige functie met een hoekfrequentie ($\omega$) die bepaald wordt door de inductantie ($L$) en capaciteit ($C$) van de kring: $$ \omega = \frac{1}{\sqrt{LC}} $$ [2](#page=2). In een reële LC-kring zullen de oscillaties echter geleidelijk uitdoven door weerstand, waarbij elektrische energie wordt omgezet in warmte [2](#page=2). Wanneer een secundaire, spoelvormige geleider dicht bij de oscillerende LC-keten wordt geplaatst, ontstaat er een sinusvormig wisselende inductiestroom volgens de Wet van Faraday. Onder invloed van deze inductiespanning en -stroom ontstaat er in de twee geleiders van de antenne een elektrische dipool met een dipoolmoment ($\vec{p}$) dat sinusvormig varieert in de tijd [2](#page=2) [3](#page=3). Deze oscillerende dipool veroorzaakt in een punt P een elektrisch veld ($\vec{E}$) en een magnetisch veld ($\vec{B}$) die in fase sinusvormig variëren. Veranderingen in de lading ($q$) en stroom ($i$) nabij de bron worden met een zekere vertraging waargenomen in punt P, aangezien de veldverstoringen zich voortplanten met de lichtsnelheid ($c$). De elektromagnetische golven verlaten de antenne in alle richtingen met de lichtsnelheid [3](#page=3): $$ c = \frac{1}{\sqrt{\mu_0 \varepsilon_0}} $$ met $c \approx 2,998 \times 10^8$ meter per seconde [3](#page=3). In een willekeurig punt staan $\vec{E}$ en $\vec{B}$ loodrecht op de voortplantingsrichting en loodrecht op elkaar, waardoor $\vec{E}$, $\vec{B}$ en de voortplantingsrichting een orthogonaal rechtshandig assenkruis vormen. Op grote afstand van de dipoolantenne nemen de elektrische en magnetische velden af met een factor $1/r$, waarbij $r$ de afstand tot de bron is. De E.M.-golf draagt energie met zich mee die wordt overgedragen aan objecten waarop de golf invalt. Deze energie wordt geleverd door de LC-oscillator, die is verbonden met een elektrische energiebron [3](#page=3). #### 1.1.2 Bronnen op atomaire schaal Bij bronnen op atomaire schaal, zoals voor UV-, infrarood- en zichtbaar licht, worden E.M. golven uitgezonden door individuele atomen. De stralingsemissie duurt hierbij ongeveer $10^{-8}$ seconden [4](#page=4). In gasontladingslampen, die E.M. straling in het UV- en zichtbaar lichtgebied produceren, worden orbitale elektronen van gasatomen geëxciteerd door een elektrische stroom door het gas. De terugkeer van een elektron naar zijn oorspronkelijke energietoestand (disexcitatie) gaat gepaard met de emissie van E.M. golven. De golflengte ($\lambda$) van de uitgezonden straling wordt bepaald door het energieverschil ($\Delta E$) tussen de energietoestanden [4](#page=4): $$ \lambda = \frac{hc}{\Delta E} $$ waarbij $h$ de constante van Planck is ($h \approx 6,63 \times 10^{-34}$ J.s) en $\Delta E = E_{n+1} - E_n$ het energieverschil is tussen de orbitalen $n+1$ en $n$. De golflengte van de straling neemt hierdoor discrete waarden aan die specifiek zijn voor de aard van de gasatomen [4](#page=4). Bij gloeilampen wordt het uitgezonden licht veroorzaakt door thermische straling, waarbij de hoge temperatuur van de gloeidraad, verkregen door het Joule-effect, leidt tot de emissie van wit licht. Het spectrum van gloeilampen is continu in het infrarood- en zichtbaar lichtgebied. Voor UV-straling met een golflengte van 300 nanometer is de golflengte ongeveer 3 meter, wat overeenkomt met $10^7$ oscillaties [4](#page=4). De vibratievlakken van de $\vec{E}$-vector van onafhankelijke golven zijn willekeurig georiënteerd, wat resulteert in niet-gepolariseerde straling. Tevens is het faseverschil tussen golftreinen met dezelfde golflengte willekeurig, wat duidt op niet-coherente straling [4](#page=4). ### 1.2 Het elektromagnetisch spectrum Alle vormen van straling, zoals radiogolven, microgolven, infrarood, zichtbaar licht, ultraviolet, röntgen- en gammastraling, zijn van elektromagnetische aard en hebben in vacuüm dezelfde snelheid $c$. Het verschil ligt in hun golflengte, en samen vormen ze het elektromagnetisch spectrum. De frequentie ($f$) van een E.M. golf is gerelateerd aan de golflengte en de lichtsnelheid door de volgende formule [5](#page=5): $$ f = \frac{c}{\lambda} $$ [5](#page=5). Het golflengtegebied van infrarood (IR)-straling, zichtbaar licht en ultraviolet (UV)-straling wordt ook wel het optisch spectrum genoemd. Het zichtbare spectrum is een smalle band tussen 380 nanometer en 750 nanometer. Het menselijk oog is het meest gevoelig voor licht met een golflengte van ongeveer 550 nanometer [5](#page=5). Het in de praktijk gebruikte UV-golflengtegebied wordt onderverdeeld in: * UVA: $\lambda$ (400-314 nm) [5](#page=5). * UVB: $\lambda$ (315-280 nm) [5](#page=5). * UVC: $\lambda$ (280-200 nm) [5](#page=5). Het golflengtegebied van X- en g-stralen wordt het ioniserend spectrum genoemd, omdat E.M. straling van deze golflengtes voldoende energie bezit om lucht en weefsels te ioniseren [5](#page=5). > **Tip:** De relatie $f = c/\lambda$ is fundamenteel voor het begrijpen van het elektromagnetisch spectrum; een langere golflengte impliceert een lagere frequentie en omgekeerd. > **Tip:** Houd de eenheden van golflengte (meestal nanometer, nm) en frequentie (Hertz, Hz) consistent bij berekeningen. > **Voorbeeld:** Een röntgenfoton heeft een golflengte van $10^{-10}$ meter. De frequentie ervan is $f = (3 \times 10^8 \text{ m/s}) / (10^{-10} \text{ m}) = 3 \times 10^{18}$ Hz. Dit hoge frequentiebereik verklaart de ioniserende eigenschappen van röntgenstraling. --- # Het elektromagnetisch spectrum en de indeling ervan Alle soorten straling die we bespreken, zijn van elektromagnetische aard. Ze reizen met dezelfde snelheid, c, in een vacuüm, maar verschillen in hun golflengte (λ). Deze verschillende soorten stralingen vormen samen het elektromagnetisch spectrum. De frequentie (f) van de straling is gekoppeld aan de golflengte via de relatie $f = \frac{c}{\lambda}$ [5](#page=5). ### 2.1 De indeling van het elektromagnetisch spectrum Het elektromagnetisch spectrum wordt ingedeeld op basis van de golflengte van de straling. De belangrijkste gebieden zijn: #### 2.1.1 Radio- en microgolfstraling Hoewel niet expliciet gedefinieerd qua golflengtebereik in dit gedeelte, omvatten deze de langste golflengtes in het spectrum. #### 2.1.2 Infrarood (IR)-straling Infraroodstraling heeft een langere golflengte dan zichtbaar licht en wordt vaak geassocieerd met warmte [5](#page=5). #### 2.1.3 Zichtbaar licht Dit is het smalle deel van het elektromagnetisch spectrum dat voor het menselijk oog waarneembaar is. Het zichtbare gebied strekt zich uit van ongeveer 380 nanometer (nm) tot 750 nm. Het menselijk oog is het gevoeligst voor licht met een golflengte van ongeveer 550 nm [5](#page=5). #### 2.1.4 Ultraviolet (UV)-straling Ultraviolette straling heeft een kortere golflengte dan zichtbaar licht. Het UV-golflengtegebied dat in de praktijk wordt gebruikt, wordt onderverdeeld in [5](#page=5): * UVA: 400-314 nm [5](#page=5). * UVB: 315-280 nm [5](#page=5). * UVC: 280-200 nm [5](#page=5). #### 2.1.5 X- en gammastraling X- en gammastraling hebben de kortste golflengtes in het spectrum. Dit gebied wordt ook wel het ioniserende spectrum genoemd, omdat de straling op deze golflengtes voldoende energie bezit om lucht en weefsels te ioniseren [5](#page=5). > **Tip:** De benamingen "optisch spectrum" en "ioniserend spectrum" zijn handige ezelsbruggetjes om de golflengtegebieden van Infrarood, zichtbaar licht en UV-straling enerzijds, en X- en gammastraling anderzijds, te onthouden. **Formule voor de relatie tussen frequentie en golflengte:** $$f = \frac{c}{\lambda}$$ Hierbij staat: * $f$ voor de frequentie (in Hertz, Hz) [5](#page=5). * $c$ voor de lichtsnelheid in vacuüm (ongeveer $3 \times 10^8$ m/s) [5](#page=5). * $\lambda$ voor de golflengte (in meters, m) [5](#page=5). --- # Biologische effecten van elektromagnetische straling Dit onderwerp behandelt de interactie van elektromagnetische straling met biologische weefsels, inclusief absorptie, verstrooiing, reflectie en de specifieke effecten van diverse stralingssoorten [6](#page=6). ### 3.1 Algemene interactie met weefsel Wanneer elektromagnetische straling een weefsellaag binnendringt, wordt een deel ervan geabsorbeerd en een ander deel verstrooid of gereflecteerd. Verstrooiing vindt in alle richtingen plaats, terwijl reflectie een evenredige hoek met de normaal van het oppervlak behoudt. De fractie van de invallende energie die terugkeert, is sterk afhankelijk van de golflengte en het medium. Biologische effecten worden voornamelijk veroorzaakt door de geabsorbeerde fractie van de stralingsbundel, waarbij de aard van deze effecten sterk afhankelijk is van de golflengte [6](#page=6). > **Voorbeeld:** De verstrooiings- en reflectiefractie kan variëren tussen bijvoorbeeld blanke en zwarte huid, waarbij reflectie over het gehele spectrum typisch tussen 4-7% ligt [6](#page=6). ### 3.2 Het ioniserende spectrum: X- en g-stralen Vanwege hun extreem korte golflengte en hoge energie hebben X- en g-stralen een ioniserende werking op weefsel. Deze ionisatie van cellulaire structuren en intracellulair water leidt tot de vorming van radicalen en daaropvolgende chemische structuurveranderingen binnen de cel. De biologische effecten worden primair gedreven door deze ionisaties, met name door het veroorzaken van breuken in de DNA-helixstructuur [6](#page=6). Bij lage blootstelling aan ioniserende straling treden enkelvoudige en dubbelstrengs breuken in het DNA op. Deze schade wordt doorgaans enzymatisch hersteld, waarbij enkelvoudige breuken meestal volledig genezen. Echter, bij het herstel van dubbelstrengs breuken kan "misrepair" optreden, wat kan leiden tot genmutaties. Deze mutaties zijn gerelateerd aan het ontstaan van kanker en leukemie, waardoor ioniserende straling als carcinogeen wordt beschouwd. Dit treedt op bij lage dosis blootstelling, zoals bij medische diagnostiek met X- en g-stralen [6](#page=6). Intensieve blootstelling en de daaruit voortvloeiende meervoudige ionisaties van het DNA leiden tot breuken die de DNA-replicatie en celproliferatie remmen. Deze directe effecten manifesteren zich uitsluitend bij hoge doses. Radiotherapie voor de behandeling van maligniteiten, zoals kanker en leukemie, berust grotendeels op deze inhibitie van celproliferatie [6](#page=6). X-stralen worden gegenereerd door X-stralenmachines in de radiologie en door deeltjesversnellers (lineaire versnellers en cyclotrons) gebruikt in de radiotherapie. G-stralen ontstaan tijdens het radioactief verval van radionucliden en worden ingezet in de nucleaire geneeskunde. Ioniserende straling kent talrijke medische toepassingen, voornamelijk in de radiotherapie van tumoren en in de nucleaire geneeskunde en radiologie voor medische beeldvorming. Deze stralen hebben een aanzienlijke doordringingsvermogen, met een halveringsdikte in weefsel die kan variëren van centimeters tot decimeters [7](#page=7). ### 3.3 Optisch spectrum: UV straling, zichtbaar licht, IR straling Vanwege hun beperkte penetratiediepte beïnvloeden elektromagnetische stralingen in het optische spectrum voornamelijk de huid, subcutane weefsels en de ogen [7](#page=7). #### 3.3.1 UV straling De interactie van UV-straling met weefsel is overwegend fotochemisch. Dit vindt plaats wanneer de energie van de straling overeenkomt met de bindingsenergie van chemische bindingen [7](#page=7). > **Voorbeeld:** De absorptie van UV-straling door de dubbele binding in cytosine kan leiden tot de vorming van cytosinehydraat. Dit gemodificeerde cytosine kan zich gedragen als thymine, een andere nucleobase, wat resulteert in veranderingen in de structuur van nucleobase-paren in het DNA. Dit kan leiden tot mutagene effecten en carcinogeniciteit bij blootstelling aan UVC en UVB [8](#page=8). Blootstelling aan UVB, en in mindere mate aan UVA, kan leiden tot erytheem (roodheid van de huid) door de vrijstelling van vasoactieve mediatoren. Als reactie op verhoogde UV-expositie kan de huid ook pigmentatie vertonen door verhoogde melanineproductie door melanocyten, wat dient als een verdedigingsmechanisme. Op het niveau van de ogen kan UV-straling cataractvorming veroorzaken [8](#page=8). #### 3.3.2 IR straling en zichtbaar licht De interactie van IR-straling en zichtbaar licht met weefsels resulteert in thermische effecten. De energie van deze straling is doorgaans te laag om DNA-schade te veroorzaken, waardoor deze stralingen niet worden geassocieerd met de ontwikkeling van maligne aandoeningen. Vanwege de zeer beperkte dieptewerking van langgolvige IR-stralen (tot 2200 nm) kan therapeutisch gebruik snel leiden tot lokale thermische belasting van de huid. Kortgolvige IR-stralen (nabij-infrarood of NIR) hebben dit effect minder sterk. Net als UV-straling kan IR-straling op het niveau van de ogen cataractvorming induceren. Thermografie, een techniek die thermische straling gebruikt, wordt onder andere toegepast in de diagnostische geneeskunde [8](#page=8). ### 3.4 Microgolven - korte golven in het radiogolvengebied Bij voldoende intensiteit kunnen microgolven en korte golven weefselopwarming veroorzaken. In vergelijking met IR-straling hebben deze golflengten een betere dieptewerking. Straling binnen dit golflengtegebied is niet carcinogeen. In de fysiotherapie worden veelvuldig golflengten van 12 cm, 69 cm en 11 meter gebruikt voor de behandeling van spier- en peesaandoeningen [8](#page=8). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Elektromagnetische golven | Dit zijn golven of stralingen die bestaan uit oscillerende elektrische en magnetische velden die zich voortplanten door de ruimte met de lichtsnelheid. Ze omvatten een breed spectrum aan straling, van radiogolven tot gammastraling. | | Golflengte (l) | De afstand tussen twee opeenvolgende punten in een golf die zich in dezelfde fase bevinden, zoals de afstand tussen twee toppen of dalen van een golf. Het is een cruciale parameter die het type elektromagnetische straling bepaalt. | | Dipoolantenne | Een type antenne dat bestaat uit twee geleiders en wordt gebruikt om radiofrequente elektromagnetische straling uit te zenden of te ontvangen. Het principe is gebaseerd op een oscillerende elektrische dipool. | | LC-keten | Een elektronisch circuit dat bestaat uit een inductor (L) en een condensator (C) die samen in staat zijn om elektrische energie op te slaan en vrij te geven, wat resulteert in elektrische oscillaties. | | Wet van Ampère | Een natuurkundige wet die stelt dat de magnetische veldsterkte rondom een gesloten lus evenredig is met de totale stroom die door die lus gaat. Het beschrijft de relatie tussen elektrische stromen en magnetische velden. | | Wet van Faraday | Een natuurkundige wet die de elektromagnetische inductie beschrijft. Het stelt dat een veranderend magnetisch veld door een gesloten circuit een elektrische spanning of elektromotorische kracht (EMK) induceert. | | Elektrisch dipoolmoment | Een maat voor de scheiding van positieve en negatieve elektrische ladingen binnen een systeem. Het is een vectorgrootheid die de sterkte en oriëntatie van het elektrische veld van de dipool aangeeft. | | Lichtsnelheid (c) | De snelheid waarmee licht en alle andere vormen van elektromagnetische straling zich voortplanten in een vacuüm. De waarde is ongeveer 299.792.458 meter per seconde. | | Atomaire schaal | Verwijst naar de schaal van individuele atomen en hun subatomaire deeltjes, waar processen zoals energieovergangen van elektronen plaatsvinden en elektromagnetische straling kunnen emitteren. | | Energieovergang (disexcitatie) | Het proces waarbij een elektron in een atoom of molecuul van een hogere energietoestand naar een lagere energietoestand terugkeert, waarbij energie wordt uitgezonden in de vorm van een foton, oftewel elektromagnetische straling. | | Constante van Planck (h) | Een fundamentele natuurkundige constante die de energie van een foton relateert aan zijn frequentie. Het is cruciaal in de kwantummechanica. | | Elektromagnetisch spectrum | Het volledige bereik van elektromagnetische straling, geordend naar golflengte of frequentie. Het omvat radiogolven, microgolven, infraroodstraling, zichtbaar licht, ultraviolette straling, röntgenstraling en gammastraling. | | Optisch spectrum | Het deel van het elektromagnetisch spectrum dat overeenkomt met infraroodstraling, zichtbaar licht en ultraviolette straling. Dit is het spectrum waar het menselijk oog gevoelig voor is. | | Ioniserend spectrum | Het deel van het elektromagnetisch spectrum, voornamelijk röntgen- en gammastraling, met voldoende energie om elektronen uit atomen en moleculen te verwijderen, waardoor ionen ontstaan. | | Ionisatie | Het proces waarbij een atoom of molecuul een of meer elektronen verliest of wint, resulterend in een netto elektrische lading. Dit kan leiden tot chemische veranderingen in biologische weefsels. | | DNA-helixstructuur | De dubbele helixstructuur die de moleculaire basis vormt van de erfelijkheidsinformatie in organismen. Schade aan deze structuur kan leiden tot mutaties. | | Carcinogeen | Een stof of agent die kanker kan veroorzaken. Ioniserende straling wordt beschouwd als carcinogeen vanwege de schade die het kan aanrichten aan het DNA. | | Fotochemische reacties | Chemische reacties die worden geïnitieerd of beïnvloed door licht of andere vormen van elektromagnetische straling. De energie van de straling wordt gebruikt om chemische bindingen te verbreken of te vormen. | | Thermische straling | Elektromagnetische straling die wordt uitgezonden door een object als gevolg van de temperatuur ervan. Hoe hoger de temperatuur, hoe meer straling er wordt uitgezonden en hoe korter de dominante golflengte is. |

# Ontstaan van elektromagnetische golven Elektromagnetische golven kunnen op verschillende manieren worden gegenereerd, afhankelijk van hun golflengte [2](#page=2) [3](#page=3). ### 1.1 Generatie van elektromagnetische golven met grote golflengte ($\lambda > 10^{-3}$ m) Voor elektromagnetische golven met een golflengte groter dan $10^{-3}$ meter wordt de generatie voornamelijk bewerkstelligd door een dipoolantenne. Een dipoolantenne is een fundamenteel onderdeel in de uitzending en ontvangst van radiogolven en andere vormen van elektromagnetische straling [2](#page=2). ### 1.2 Generatie van elektromagnetische golven met kleine golflengte ($\lambda < 10^{-3}$ m) Voor elektromagnetische golven met een golflengte kleiner dan $10^{-3}$ meter zijn atomaire processen van excitatie en desexcitatie de primaire generatiemechanismen [3](#page=3) [4](#page=4). #### 1.2.1 Atomaire excitatie en desexcitatie * **Excitatie**: Een atoom neemt energie op, waardoor een elektron naar een hogere energietoestand wordt gebracht. Dit verhoogde energieniveau is instabiel [3](#page=3) [4](#page=4). * **Desexcitatie**: Het geëxciteerde elektron valt terug naar een lagere energietoestand. Bij deze overgang wordt de overtollige energie uitgestraald in de vorm van een foton, wat een elektromagnetische golf is [3](#page=3) [4](#page=4). De golflengte ($\lambda$) van de uitgestraalde elektromagnetische golf is direct gerelateerd aan het energieverschil tussen de twee energieniveaus van het atoom volgens de volgende formule [3](#page=3) [4](#page=4): $$ \lambda = \frac{hc}{E_{n+1} - E_n} $$ Waarbij: * $h$ de constante van Planck is. * $c$ de lichtsnelheid is. * $E_{n+1}$ de energie van de hogere energietoestand is. * $E_n$ de energie van de lagere energietoestand is. #### 1.2.2 Voorbeeld: kwiklamp Een praktisch voorbeeld van dit principe is de kwiklamp. In een kwiklamp wordt kwikdamp geëxciteerd door een elektrische ontlading. De daaropvolgende desexcitatie van kwikatomen resulteert in de emissie van ultraviolette straling. Deze UV-straling wordt vervolgens door een fluorescente coating aan de binnenkant van de lamp omgezet in zichtbaar licht. De specifieke energieniveaus van kwik bepalen de golflengtes die worden uitgezonden en dus de kleur van het licht [4](#page=4). > **Tip:** Begrijpen hoe het energieverschil tussen atomaire niveaus de golflengte van de uitgestraalde EM-golf bepaalt, is cruciaal voor het begrijpen van verschillende soorten straling, van zichtbaar licht tot röntgenstraling. > **Example:** Als een elektron in een atoom van een energieniveau $E_2$ naar $E_1$ valt, waarbij $E_2 > E_1$, wordt een foton uitgezonden met energie $\Delta E = E_2 - E_1$. De bijbehorende golflengte is dan $\lambda = \frac{hc}{\Delta E}$. Verschillende elementen hebben unieke energieniveaus, wat leidt tot karakteristieke emissiespectra. --- # Breking en reflectie van elektromagnetische golven Dit onderwerp beschrijft de interactie van elektromagnetische golven met verschillende media, waarbij de nadruk ligt op veranderingen in snelheid en golflengte bij mediumovergangen, en de principes van breking en reflectie, inclusief de wet van Snellius. ### 2.1 Snelheid en brekingsindex van EM-golven in media De snelheid ($v$) van een elektromagnetische golf in een medium met brekingsindex ($n$) wordt gegeven door de relatie $v = \frac{c}{n}$, waarbij $c$ de lichtsnelheid in vacuüm is. De brekingsindex ($n$) is afhankelijk van de golflengte van de golf. Deze golflengte-afhankelijkheid leidt tot fenomenen zoals kleurschifting of dispersie [5](#page=5) [6](#page=6). ### 2.2 Verandering van golflengte bij mediumovergangen Bij de overgang van een elektromagnetische golf van het ene medium naar het andere, blijft de frequentie van de golf constant. Echter, de golflengte wijzigt. De verhouding van de golflengtes in twee verschillende media wordt bepaald door de verhouding van de brekingsindices [6](#page=6): $$ \frac{\lambda_1}{\lambda_2} = \frac{Tv_1}{Tv_2} = \frac{v_1}{v_2} = \frac{c n_2}{c n_1} = \frac{n_2}{n_1} $$ waarbij $\lambda_1$ en $\lambda_2$ de golflengtes zijn in respectievelijk medium 1 en medium 2, en $n_1$ en $n_2$ de brekingsindices van deze media zijn [6](#page=6). ### 2.3 Reflectie en breking #### 2.3.1 Reflectie Reflectie beschrijft het terugkaatsen van een elektromagnetische golf wanneer deze een grensvlak tussen twee media tegenkomt [7](#page=7). #### 2.3.2 Breking Breking treedt op wanneer een elektromagnetische golf onder een bepaalde hoek een grensvlak tussen twee media passeert, resulterend in een verandering van richting. Dit fenomeen wordt beschreven door de wet van Snellius [7](#page=7): $$ n_1 \sin \theta_1 = n_2 \sin \theta_2 $$ Hierbij is $n_1$ de brekingsindex van het eerste medium, $\theta_1$ de invalshoek, $n_2$ de brekingsindex van het tweede medium, en $\theta_2$ de brekingshoek [7](#page=7). ### 2.4 Overgang tussen media De overgang van een elektromagnetische golf tussen verschillende media impliceert zowel reflectie als breking, afhankelijk van de eigenschappen van de media en de invalshoek. De wet van Snellius helpt bij het kwantificeren van de breking, terwijl reflectie wordt beïnvloed door de verschillen in de elektromagnetische eigenschappen van de media [8](#page=8). > **Tip:** Onthoud dat de frequentie de enige parameter is die constant blijft bij de overgang tussen media, terwijl snelheid en golflengte veranderen. Dit is cruciaal voor het begrijpen van dispersie. --- # Werking van lenzen en totale inwendige reflectie Dit deel behandelt de principes van convergerende en divergerende lenzen, beeldvorming, de dunne lenzenformule, en het fenomeen van totale inwendige reflectie met toepassingen zoals optische vezels [10](#page=10) [11](#page=11) [12](#page=12) [13](#page=13) [9](#page=9). ### 3.1 Lenzen en beeldvorming Lenzen zijn optische componenten die lichtstralen breken om beelden te vormen. Ze kunnen worden geclassificeerd als convergerend of divergerend [9](#page=9). #### 3.1.1 Convergerende en divergerende lenzen * **Convergerende lenzen:** Deze lenzen zijn in het midden dikker dan aan de randen. Ze laten parallel invallende lichtstralen samenkomen in één punt, het brandpunt (f) [9](#page=9). * **Divergerende lenzen:** Deze lenzen zijn in het midden dunner dan aan de randen. Ze laten parallel invallende lichtstralen uiteenlopen, alsof ze afkomstig zijn uit een virtueel brandpunt aan de andere kant [9](#page=9). #### 3.1.2 Vorming van beelden Beelden gevormd door lenzen kunnen reëel of virtueel zijn [10](#page=10). * **Reëel beeld:** Een beeld dat gevormd wordt waar de lichtstralen elkaar daadwerkelijk snijden. Dit beeld kan op een scherm worden geprojecteerd [10](#page=10). * **Virtueel beeld:** Een beeld dat gevormd wordt waar de lichtstralen elkaar niet daadwerkelijk snijden, maar de verlengingen van de lichtstralen dat wel doen. Dit beeld kan niet op een scherm worden geprojecteerd [10](#page=10). ### 3.2 De dunne lenzenformule De dunne lenzenformule relateert de objectafstand ($o$), de beeldafstand ($i$), en de brandpuntsafstand ($f$) van een lens. Hierbij wordt uitgegaan van "georiënteerde lijnstukken", wat betekent dat afstanden en oriëntaties een teken hebben [11](#page=11). De formule luidt: $$ \frac{1}{-o} + \frac{1}{i} = \frac{1}{f} $$ De vergrotingsfactor ($m$) wordt gegeven door: $$ m = \frac{h_i}{h_o} = \frac{i}{o} $$ waar $h_i$ de beeldafmeting is en $h_o$ de objectafmeting [11](#page=11). > **Tip:** Let goed op de tekens van $o$, $i$, en $f$ volgens de conventies die in de cursus worden gehanteerd om correcte berekeningen te maken. ### 3.3 Totale inwendige reflectie Totale inwendige reflectie treedt op wanneer licht overgaat van een optisch dichter medium naar een optisch ijler medium [12](#page=12). #### 3.3.1 Principes van totale inwendige reflectie * Wanneer licht van een optisch dichter naar een optisch ijl medium gaat, wijkt de gebroken straal af van de normaal [12](#page=12). * Naarmate de invalshoek ($i$) toeneemt, neemt ook de brekingshoek toe [12](#page=12). * Er is een specifieke invalshoek, de grenshoek ($\theta_c$), waarbij de brekingshoek precies 90 graden is [12](#page=12). * Als de invalshoek groter is dan de grenshoek, vindt er geen breking meer plaats. In plaats daarvan wordt al het invallende licht teruggekaatst naar het oorspronkelijke medium. Dit fenomeen heet totale inwendige reflectie [12](#page=12). De relatie tussen de brekingsindices van de twee media en de grenshoek wordt beschreven door Snellius' wet. Voor de overgang van medium 1 (dichter) naar medium 2 (ijler): $$ n_1 \sin(\theta_c) = n_2 \sin(90^\circ) = n_2 $$ Hieruit volgt: $$ \sin(\theta_c) = \frac{n_2}{n_1} $$ #### 3.3.2 Toepassingen: optische vezels Totale inwendige reflectie is het essentiële principe achter optische vezels [13](#page=13). * Optische vezels bestaan uit een kern (met een hogere brekingsindex) omhuld door een cladding (met een lagere brekingsindex) [13](#page=13). * Wanneer licht aan de ene kant van de vezel binnenkomt, wordt het herhaaldelijk gereflecteerd tegen de binnenwand van de vezel als het de grenshoek met de normale overschrijdt [13](#page=13). * Dit zorgt ervoor dat het licht over lange afstanden met minimale verliezen door de vezel kan worden geleid [13](#page=13). * Het licht verlaat de glasvezel aan de uittredezijde op nagenoeg dezelfde manier als het binnenkwam, dankzij de opeenvolging van totale interne reflecties [13](#page=13). De formule voor de grenshoek in een optische vezel, waarbij licht wordt overgedragen van de kern (met brekingsindex $n_f$) naar de cladding (met brekingsindex $n_c$), is: $$ n_f \sin(\theta_c) = n_c $$ Wat kan worden herschreven als: $$ \sin(\theta_c) = \frac{n_c}{n_f} $$ > **Tip:** Begrijp de relatie tussen de brekingsindices en de grenshoek; een groter verschil in brekingsindices leidt tot een kleinere grenshoek, waardoor totale interne reflectie gemakkelijker optreedt. --- # Toepassingen in endoscopie Dit segment behandelt de rol van gebundelde optische vezels in endoscopie voor beeldvorming, waarbij de coherentie van de vezelbundel essentieel is. ### 4.1 Beeldvorming met optische vezelbundels Endoscopie maakt gebruik van bundels van optische vezels om beelden te verkrijgen binnen het lichaam. Deze bundels bestaan doorgaans uit ongeveer 40.000 individuele optische vezels [14](#page=14) [15](#page=15). #### 4.1.1 Structuur en eigenschappen van de vezelbundel * **Aantal vezels:** Een typische endoscoopvezelbundel bevat circa 40.000 optische vezels [14](#page=14) [15](#page=15). * **Vezeldiameter:** Elke individuele optische vezel heeft een zeer kleine diameter, van ongeveer 10 micrometer ($\mu m$) [14](#page=14) [15](#page=15). #### 4.1.2 Coherentie voor beeldvorming Om effectieve beeldvorming mogelijk te maken met een bundel van optische vezels, is de coherentie van de bundel cruciaal. Coherentie in deze context betekent dat de relatieve posities van de vezels in de bundel aan beide zijden (bij de invoer en uitvoer van het licht) nauwkeurig behouden blijven. Dit zorgt ervoor dat het beeld dat aan de ene kant de bundel ingaat, aan de andere kant in dezelfde ruimtelijke ordening wordt weergegeven. Zonder deze coherentie zou het beeld vervormd of onherkenbaar worden [14](#page=14) [15](#page=15). > **Tip:** Beschouw een vezelbundel als een flexibel "beeldkabel". De essentie is dat elke vezel fungeert als een punt van de afbeelding, en de bundeling zorgt ervoor dat deze punten in de juiste volgorde blijven om het volledige beeld te reconstrueren. #### 4.1.3 Werking in endoscopen In endoscopen worden deze coherente vezelbundels gebruikt om licht vanaf een beeldvormingspunt (bijvoorbeeld in de maag of darmen) naar buiten te transporteren, waar het door een camera of het menselijk oog kan worden waargenomen. De bundel leidt het gereflecteerde of doorgezonden licht van het endoscooppunt naar de operator, waardoor artsen inwendige organen kunnen inspecteren zonder invasieve chirurgie [14](#page=14) [15](#page=15). > **Example:** Stel je voor dat je een heel dunne kabel van duizenden dunne draadjes hebt. Als elk draadje nauwkeurig wordt vastgehouden op zijn plek aan beide uiteinden, dan zal het patroon van de draden aan het ene einde exact overeenkomen met het patroon aan het andere einde. Zo kan een beeld worden doorgegeven. Als de draden echter door elkaar gaan lopen, dan zal het beeld verloren gaan. Dit principe is essentieel voor de werking van endoscopen. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Elektromagnetische golven | Een vorm van straling die zich voortplant door de combinatie van oscillerende elektrische en magnetische velden, zoals licht, radiogolven en röntgenstralen. Ze reizen met de lichtsnelheid in een vacuüm. | | Golflengte () | De afstand tussen twee opeenvolgende toppen of dalen van een golf. Het bepaalt de kleur van zichtbaar licht en het type elektromagnetische straling. | | Dipoolantenne | Een antenne die bestaat uit twee geleidende elementen die in tegengestelde richtingen vanaf het midden uitsteken, gebruikt om radiogolven te zenden of te ontvangen. | | Atomaire processen | Verwijst naar veranderingen binnen atomen, met name de overgang van elektronen tussen energieniveaus (excitatie en desexcitatie), die gepaard kan gaan met de emissie of absorptie van fotonen. | | Excitatie | Het proces waarbij een elektron in een atoom energie absorbeert en naar een hoger energieniveau springt. | | Desexcitatie | Het proces waarbij een elektron in een atoom terugvalt naar een lager energieniveau, waarbij de geabsorbeerde energie wordt uitgezonden, vaak als een foton. | | Brekingsindex (n) | Een maat voor hoe snel licht zich voortplant door een bepaald medium. Het is de verhouding tussen de lichtsnelheid in vacuüm en de lichtsnelheid in het medium: $n = c/v$. | | Kleurschifting/Dispersie | Het fenomeen waarbij de brekingsindex van een medium afhankelijk is van de golflengte van het licht. Dit zorgt ervoor dat wit licht bij breking uiteenvalt in zijn samenstellende kleuren. | | Frequentie | Het aantal golven dat per seconde passeert op een bepaald punt. De frequentie van een elektromagnetische golf verandert niet wanneer deze van het ene medium naar het andere gaat. | | Reflectie | Het terugkaatsen van een golf wanneer deze een grens tussen twee media raakt. | | Breking | Het buigen van een golf wanneer deze onder een schuine hoek van het ene medium naar het andere gaat, veroorzaakt door een verandering in de voortplantingssnelheid. | | Wet van Snellius | Een formule die de relatie beschrijft tussen de invalshoek en de brekingshoek wanneer licht door de grens van twee verschillende media gaat: $n_1 \sin \theta_1 = n_2 \sin \theta_2$. | | Convergerende lens | Een lens die evenwijdige lichtstralen naar een enkel punt (het brandpunt) samenbrengt. | | Divergerende lens | Een lens die evenwijdige lichtstralen uit elkaar stuurt, waardoor ze lijken te komen uit een virtueel brandpunt. | | Reëel beeld | Een beeld dat gevormd wordt waar lichtstralen elkaar werkelijk ontmoeten en dat op een scherm geprojecteerd kan worden. | | Virtueel beeld | Een beeld dat gevormd wordt waar lichtstralen lijken te vandaan te komen, maar elkaar niet werkelijk ontmoeten; het kan niet op een scherm geprojecteerd worden. | | Dunne lenzenformule | Een vergelijking die de relatie legt tussen de brandpuntsafstand van een lens ($f$), de objectafstand ($o$) en de beeldafstand ($i$): $1/f = 1/o + 1/i$. | | Vergroting ($m$) | De verhouding tussen de hoogte van het beeld ($h_i$) en de hoogte van het object ($h_o$), of de verhouding tussen de beeldafstand ($i$) en de objectafstand ($o$): $m = h_i/h_o = i/o$. | | Totale inwendige reflectie | Een optisch fenomeen dat optreedt wanneer licht van een dichter naar een ijler medium gaat onder een invalshoek die groter is dan de kritische hoek, waardoor al het licht wordt teruggekaatst naar het dichtere medium. | | Kritische hoek ($\theta_c$) | De grootste invalshoek waarbij licht nog net gebroken kan worden wanneer het van een dichter naar een ijler medium gaat. Bij grotere hoeken treedt totale inwendige reflectie op. | | Optische vezels | Dunne draden van glas of plastic die licht transporteren door middel van totale inwendige reflectie, gebruikt in telecommunicatie en endoscopie. | | Endoscopie | Een medische procedure waarbij een flexibel instrument met een camera en lichtbron (endoscoop) wordt gebruikt om inwendige organen te bekijken. | | Coherentie (van een bundel) | De mate waarin de fasen van lichtgolven in een bundel met elkaar in overeenstemming zijn, wat cruciaal is voor het vormen van een scherp beeld in endoscopie. |

# Optische sterkte van lenzen en systemen Dit gedeelte behandelt de wiskundige principes achter de optische sterkte van brekende oppervlakken en lenzen, inclusief formules voor het berekenen van de sterkte en de relatie met de brekingsindex en kromming. ### 1.1 Het brekingsvoorschrift voor een enkelvoudig gebogen oppervlak De wet van Snellius, $n_1 \sin \theta_1 = n_2 \sin \theta_2$ beschrijft de breking van licht aan een oppervlak tussen twee media met brekingsindices $n_1$ en $n_2$, en invalshoeken $\theta_1$ en $\theta_2$. Voor kleine hoeken kan dit benaderd worden als $n_1 \theta_1 = n_2 \theta_2$ [2](#page=2). Uit geometrische relaties, zoals die afgeleid uit driehoeken COPC en ICPI, kunnen de invalshoek $\theta_1$ en de brekingshoek $\theta_2$ worden uitgedrukt in termen van hoeken gerelateerd aan de optische as en het object en beeld. Specifiek geldt $\theta_1 = \alpha + \beta$ en $\beta = \theta_2 + \gamma$. Door substitutie en herschikking van termen verkrijgen we $n_1 \alpha + n_2 \gamma = (n_2 - n_1) \beta$ [2](#page=2) [3](#page=3). Voor kleine hoeken, waarbij $\alpha \approx \frac{QP}{-o}$, $\beta \approx \frac{QP}{r}$, en $\gamma \approx \frac{QP}{i}$, waar $o$ de voorwerpsafstand, $i$ de beeldafstand en $r$ de kromtestraal is. Het substitueren van deze benaderingen in de vergelijking leidt tot het brekingsvoorschrift voor een enkelvoudig gebogen oppervlak [3](#page=3): $$ \frac{n_1}{-o} + \frac{n_2}{i} = \frac{n_2 - n_1}{r} $$ [3](#page=3). De term $\frac{n_2 - n_1}{r}$ vertegenwoordigt de optische sterkte ($K$) van het brekende oppervlak, uitgedrukt in dioptrieën (D) [3](#page=3). ### 1.2 Speciale gevallen voor een gebogen oppervlak Er zijn twee belangrijke speciale gevallen voor een gebogen oppervlak met optische sterkte $K = \frac{n_2 - n_1}{r}$ [3](#page=3): * **Voorwerp op oneindig:** Wanneer het voorwerp zich op oneindig bevindt ($o \to \infty$), wordt de beeldafstand gegeven door de tweede brandpuntsafstand $f_2$, waarbij $\frac{n_2}{f_2} = K$ [4](#page=4). * **Beeld op oneindig:** Wanneer het beeld op oneindig wordt gevormd ($i \to \infty$), wordt de voorwerpsafstand gegeven door de eerste brandpuntsafstand $f_1$, waarbij $\frac{n_1}{f_1} = K$ [4](#page=4). > **Tip:** De optische sterkte wordt uitgedrukt in dioptrieën (D), wat de reciproke waarde van de brandpuntsafstand in meters is. Een lens met een sterkte van +2 D heeft een brandpuntsafstand van 0,5 meter. ### 1.3 Optische sterkte van optische systemen De totale optische sterkte van een systeem bestaande uit meerdere optische componenten (lenzen of brekende oppervlakken) is de som van de individuele sterktes van deze componenten. Dit geldt bij benadering, vooral bij dunne lenzen of systemen waar de afstanden tussen de componenten klein zijn ten opzichte van de brandpuntsafstanden [4](#page=4). $$ K_{\text{totaal}} = K_1 + K_2 + K_3 + \dots $$ [4](#page=4). --- # Het menselijk oog als optisch systeem Dit deel beschrijft de structuur en optische eigenschappen van het oog, met aandacht voor de variabele lenssterkte, de totale optische sterkte en de focuspunten [5](#page=5). ### 2.1 De optische eigenschappen van het oog Het oog wordt beschouwd als één enkel brekend oppervlak met een brekingsindex van 1,336. De totale optische sterkte van het oog bedraagt 58,64 dioptrie (D) [5](#page=5). #### 2.1.1 De sterkte van de lens De lens van het oog is variabel en heeft normaal gesproken een sterkte van 18 dioptrie. Deze sterkte kan aangepast worden om objecten op verschillende afstanden scherp te stellen [5](#page=5). **Accommodatie:** Wanneer we naar objecten die dichtbij zijn kijken, wordt de lens boller. Dit proces wordt accommodatie genoemd en vergroot de sterkte van de lens. De nieuwe sterkte van het oog bij het focussen op een object op 0,10 meter afstand is 68,64 D. Dit wordt berekend met de volgende formule, waarbij $K$ de totale sterkte is [6](#page=6): $$K = \frac{1}{objectafstand} + \frac{brekingsindex\:oog}{afstand\:tot\:lens}$$ In dit geval wordt de berekening als volgt: $$K = \frac{1}{0,10 \text{ m}} + \frac{1,336}{0,0228 \text{ m}} = 68,64 \text{ D}$$ [6](#page=6). #### 2.1.2 Focuspunten De focuspunten ($f_1$ en $f_2$) van het oog kunnen berekend worden op basis van de totale optische sterkte en de brekingsindex [6](#page=6). * $f_2 = \frac{1,336}{58,64 \text{ D}} = 2,28 \text{ cm}$ [6](#page=6). * $f_1 = \frac{1}{58,64 \text{ D}} = 1,71 \text{ cm}$ [6](#page=6). #### 2.1.3 Visuele limieten van het oog Het menselijk oog heeft twee belangrijke visuele limieten: * **Vertepunt:** Dit is het punt waarop het oog objecten zonder accommodatie scherp kan stellen, wat overeenkomt met een oneindige afstand [7](#page=7). * **Nabijheidspunt:** Dit is het dichtstbijzijnde punt waarop het oog nog scherp kan stellen, wat normaal gesproken op 25 cm afstand ligt [7](#page=7). #### 2.1.4 Accommodatiebreedte De accommodatiebreedte is het verschil in sterkte dat het oog kan produceren om scherp te stellen tussen het nabijheidspunt en het vertepunt. Normaal gesproken bedraagt deze breedte 10 dioptrie [7](#page=7). > **Tip:** Als de accommodatiebreedte 0 D is, betekent dit dat het oog verziend is, omdat de lens niet meer boller kan worden om objecten dichtbij scherp te stellen [7](#page=7). --- # Oogresolutie en responsmechanismen Dit onderdeel bespreekt de factoren die de gezichtsscherpte van het oog bepalen, waaronder de minimale hoek tussen te onderscheiden punten, de rol van het oog als optisch systeem en het responsysteem met lichtreceptoren [8](#page=8). ### 3.1 Gezichtsscherpte en minimale hoek De gezichtsscherpte wordt gedefinieerd door de minimale hoek waaronder twee punten nog als gescheiden kunnen worden waargenomen. Bij goede lichtomstandigheden is deze minimale hoek één minuut (1/60 graad). De gezichtsscherpte kan worden uitgedrukt als de omgekeerde waarde van deze minimale hoek, gemeten in minuten. Als de minimale hoek die vanuit het oog wordt gezien $\theta$ minuten is, dan is de gezichtsscherpte gelijk aan $1/\theta$ per minuut [8](#page=8). > **Tip:** Begrijp de relatie tussen de minimale hoek en gezichtsscherpte: een kleinere hoek betekent een hogere gezichtsscherpte. ### 3.2 Het oog als optisch systeem Het oog functioneert als een optisch systeem dat bijdraagt aan de resolutie door middel van verschillende factoren. Enkele van deze factoren zijn sferische en chromatische aberraties, evenals diffractie. Deze optische fenomenen kunnen ervoor zorgen dat een punt op de retina wordt afgebeeld als een kleine vlek in plaats van een scherp punt. De angulaire resolutie die hieruit voortvloeit, bedraagt ongeveer 0,4 boogminuten [8](#page=8) [9](#page=9). ### 3.3 Het responsysteem van het oog Het responsysteem van het oog, bestaande uit lichtreceptoren, speelt een cruciale rol in de uiteindelijke resolutie. De dichtheid van deze lichtreceptoren is hierbij van belang. Er zijn twee hoofdtypen receptoren [10](#page=10) [8](#page=8): * **Kegeltjes:** Deze zijn actief bij heldere belichting en worden geassocieerd met fotopisch zien [10](#page=10). * **Staafjes:** Deze zijn gevoelig voor licht bij schemering en worden gebruikt bij scotopisch zien [10](#page=10). De onderlinge afstand van de receptoren op de retina is ongeveer 3 micrometer ($\mu$m). De angulaire resolutie die wordt bepaald door dit responsysteem is ongeveer 0,6 boogminuten [10](#page=10). > **Tip:** Houd rekening met het verschil tussen fotopisch en scotopisch zien wanneer je de rol van de receptoren voor resolutie overweegt. --- # Correctie van visuele afwijkingen Dit gedeelte bespreekt hoe verziendheid en bijziendheid gecorrigeerd worden met respectievelijk convexe en concave lenzen, en hoe deze lenzen de beeldvorming beïnvloeden. ### 4.1 Verziendheid (hypermetropie) Verziendheid wordt gecorrigeerd met behulp van een convexe lens. Bij verziendheid ligt het nabijheidspunt van het oog verder weg dan de gebruikelijke 25 cm. Een convexe lens wordt gebruikt om de brekingskracht van het oog te verhogen, waardoor het beeld weer correct op het netvlies wordt gevormd. De convexe lens creëert een virtueel beeld van een voorwerp dat zich op 25 cm afstand bevindt, op een afstand waar het verziende oog dit voorwerp wel scherp kan zien [11](#page=11). > **Tip:** Convexe lenzen zijn dikker in het midden en dunner aan de randen, en convergeren lichtstralen. ### 4.2 Bijziendheid (myopie) Bijziendheid wordt gecorrigeerd met behulp van een concave lens. Bij bijziendheid is het brekingsvermogen van het oog te groot, waardoor verre voorwerpen al vóór het netvlies worden scherpgesteld. Een concave lens wordt gebruikt om de brekingskracht van het oog te verminderen, waardoor de focus van verre voorwerpen correct op het netvlies komt te liggen. De concave lens zorgt ervoor dat een beeld van een voorwerp op oneindige afstand wordt geproduceerd op de locatie van het vertepunt van het bijziende oog, wat het oog in staat stelt dit voorwerp scherp te zien [12](#page=12). > **Tip:** Concave lenzen zijn dunner in het midden en dikker aan de randen, en divergeren lichtstralen. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Optische sterkte | De maat voor hoe sterk een optisch element (zoals een lens of een gebogen oppervlak) lichtstralen buigt of divergeert. De sterkte wordt doorgaans uitgedrukt in dioptrie (D). | | Brekingsindex ($n$) | Een dimensieloze grootheid die aangeeft hoe snel licht zich voortplant in een materiaal ten opzichte van de lichtsnelheid in vacuüm. Een hogere brekingsindex betekent een lagere lichtsnelheid en sterkere breking. | | Kromming ($r$) | De straal van het bolle of holle oppervlak van een lens of spiegel. Een kleinere kromming resulteert in een grotere optische sterkte. | | Verziendheid | Een oogaandoening waarbij objecten dichtbij onscherp worden gezien, omdat het beeld achter het netvlies wordt gevormd. Dit kan gecorrigeerd worden met een convexe lens. | | Bijziendheid | Een oogaandoening waarbij objecten veraf onscherp worden gezien, omdat het beeld voor het netvlies wordt gevormd. Dit kan gecorrigeerd worden met een concave lens. | | Accommodatiebreedte | Het verschil in optische sterkte dat het oog kan leveren door de vorm van de lens aan te passen, wat noodzakelijk is om objecten op verschillende afstanden scherp te stellen. | | Aberratie | Een optische fout in een beeld dat wordt gevormd door een lens of spiegel, waardoor het beeld vervormd of onscherp wordt. Sferische en chromatische aberraties zijn veelvoorkomende voorbeelden. | | Diffractie | Het verschijnsel waarbij lichtgolven zich verspreiden wanneer ze een rand of opening passeren, wat kan leiden tot een verlies van scherpte en het ontstaan van patronen van licht en donker. | | Fotopisch zien | Zien onder heldere lichtomstandigheden, waarbij de kegeltjes in het netvlies dominant zijn voor kleurwaarneming en detailherkenning. | | Scotopisch zien | Zien onder omstandigheden met weinig licht (schemering of duisternis), waarbij de staafjes in het netvlies dominant zijn voor zicht, wat echter geen kleuren kan waarnemen. |

# Basisprincipes van microscopie: interferentie en diffractie Dit onderwerp behandelt de fundamentele fysische principes van interferentie en diffractie die essentieel zijn voor het begrijpen van microscopische technieken, met de focus op hoe golven zich gedragen en hoe dit wordt toegepast in optische instrumenten. ### 1.1 Interferentie Interferentie is een fenomeen dat optreedt wanneer twee of meer golven elkaar ontmoeten. De interactie van deze golven kan leiden tot een verandering in de amplitude van de resulterende golf [2](#page=2). #### 1.1.1 Constructieve interferentie Constructieve interferentie treedt op wanneer golven in fase zijn. Dit betekent dat de toppen van de ene golf samenvallen met de toppen van de andere, en de dalen samenvallen met de dalen. Mathematisch wordt dit beschreven door een faseverschil dat een veelvoud is van de golflengte $\lambda$ [2](#page=2) [3](#page=3). * Faseverschil: $n\lambda$ [3](#page=3). #### 1.1.2 Destructieve interferentie Destructieve interferentie treedt op wanneer golven in tegenfase zijn. Hierbij vallen de toppen van de ene golf samen met de dalen van de andere, wat leidt tot een reductie of eliminatie van de amplitude. Dit gebeurt wanneer het faseverschil een oneven veelvoud van een halve golflengte is [2](#page=2) [3](#page=3). * Faseverschil: $(2n+1)\frac{\lambda}{2}$ [3](#page=3). #### 1.1.3 Toepassing in microscopie Een specifieke toepassing van interferentie in de context van lichtgolven is te vinden bij het bepalen van de kleinste hoek waaronder destructieve interferentie optreedt. Dit is relevant voor het begrijpen van beeldvorming en resolutie in optische systemen [4](#page=4). * Formule voor de kleinste hoek van destructieve interferentie: $d\sin\theta = \frac{\lambda}{2}$ [4](#page=4). > **Tip:** Onthoud dat het faseverschil cruciaal is voor het bepalen of interferentie constructief of destructief is. ### 1.2 Diffractie Diffractie is het verschijnsel waarbij golven zich verbreden wanneer ze door een opening of langs een obstakel gaan. Dit effect is bijzonder merkbaar wanneer de afmeting van de opening of het obstakel vergelijkbaar is met de golflengte van de golf [5](#page=5). #### 1.2.1 Diffractie door een smalle spleet Wanneer een parallelle bundel licht door een smalle spleet gaat, treedt diffractie op, wat resulteert in een diffractiepatroon. Dit patroon bestaat uit heldere en donkere stroken [5](#page=5). * De hoek van de eerste donkere strook wordt gegeven door: $\sin\theta = \frac{\lambda}{W}$ [5](#page=5). * Hierin is $W$ de breedte van de spleet [5](#page=5). #### 1.2.2 Algemene formule voor diffractie De algemene formule voor de hoeken van de donkere stroken bij diffractie door een enkele spleet is: * $\sin\theta = n\frac{\lambda}{W}$ [6](#page=6). * Hierin staat $n$ voor het ordegetal van de donkere strook ($n=1, 2, 3, \dots$) [6](#page=6). > **Tip:** Het begrijpen van diffractie is fundamenteel voor het maximaliseren van de resolutie van microscopen, aangezien het de limiet stelt aan hoe fijnzinnig details waargenomen kunnen worden. --- # Onderscheidend vermogen en lensaberraties in lichtmicroscopie Dit deel van de studiehandleiding behandelt de fundamentele limieten van het onderscheidend vermogen in lichtmicroscopie, waaronder het criterium van Rayleigh en de impact van diffractie, evenals veelvoorkomende lensaberraties en hun correcties. ### 2.1 Onderscheidend vermogen Het onderscheidend vermogen van een microscoop wordt bepaald door de mate waarin deze twee nabijgelegen objecten nog als afzonderlijke entiteiten kan waarnemen. Dit fenomeen wordt beïnvloed door diffractie, het buigen van lichtgolven wanneer ze door een kleine opening passeren, zoals de apertuur van een objectief [7](#page=7). #### 2.1.1 De invloed van diffractie Wanneer licht door een smalle opening valt, ontstaat een circulair diffractiepatroon. Dit patroon bestaat uit een centraal maximum en concentrische minima. De hoek $\theta$ naar het eerste minimum wordt beschreven door de formule [7](#page=7): $$ \sin \theta = 1,22 \frac{\lambda}{D} $$ waarbij $\lambda$ de golflengte van het licht is en $D$ de diameter van de opening [7](#page=7). Wanneer twee puntvormige objecten dicht bij elkaar liggen, overlappen hun individuele diffractiepatronen. De mate van scheiding tussen deze objecten bepaalt of ze nog als afzonderlijk kunnen worden waargenomen [8](#page=8) [9](#page=9). #### 2.1.2 Criterium van Rayleigh Het criterium van Rayleigh stelt dat twee puntvormige objecten nog net van elkaar te onderscheiden zijn wanneer het centrale maximum van het diffractiepatroon van het ene object samenvalt met het eerste minimum van het diffractiepatroon van het andere object [9](#page=9). Voor kleine hoeken, waar $\sin \theta \approx \theta$, kan de minimale hoek $\theta_{\min}$ worden uitgedrukt als: $$ \theta_{\min} = 1,22 \frac{\lambda}{D} $$ Deze minimale hoek definieert de kleinste afstand tussen twee punten die nog als gescheiden waargenomen kunnen worden [10](#page=10). De kleinste afstand $s$ tussen twee onderscheidbare punten, ook wel de resolutie genoemd, is gerelateerd aan de minimale hoek en de afstand van het object tot de lens. Voor een microscoop geldt een relatie waarbij de resolutie $s$ ongeveer evenredig is met de golflengte van het licht ($\lambda$) en omgekeerd evenredig met de numerieke apertuur ($NA = D/d$, waarbij $d$ de afstand van het object tot de lens is): $$ s \approx \frac{1,22 \lambda d}{D} $$ Aangezien voor een microscoop $d/D$ typisch groot is, kan de resolutie vereenvoudigd worden als $s \approx \lambda$. Dit benadrukt het belang van het gebruik van kortere golflengtes (bijvoorbeeld blauw licht of UV-licht) voor een hogere resolutie [11](#page=11). > **Tip:** Een hogere numerieke apertuur van de objectieflens verbetert het onderscheidend vermogen aanzienlijk. Dit kan bereikt worden door de diameter van de lens te vergroten of de afstand tot het object te verkleinen, bijvoorbeeld door middel van immersie-olie. ### 2.2 Lensaberraties Lensaberraties zijn imperfecties in lenzen die leiden tot vervormingen in het beeld, waardoor de scherpte en nauwkeurigheid van de microscopische waarneming afnemen. #### 2.2.1 Sferische aberratie Sferische aberratie treedt op omdat de focale lengte van de buitenste zones van een bolvormige lens verschilt van die van de centrale zones. Dit resulteert in een slechte focus, met name voor licht dat door de randen van de lens gaat [12](#page=12). * **Oplossing:** Om sferische aberratie te minimaliseren, kan een variabele apertuur worden gebruikt om de buitenste stralen af te snijden, waardoor alleen licht dat door de centrale, beter gefocuste delen van de lens gaat, wordt gebruikt [12](#page=12). #### 2.2.2 Chromatische aberratie Chromatische aberratie ontstaat door het verschijnsel dispersie: verschillende golflengtes van licht worden met verschillende hoeken gebroken wanneer ze door een lens gaan. Kortere golflengtes (zoals blauw licht) worden sterker gebroken dan langere golflengtes (zoals rood licht). Dit leidt tot een gekleurde halo rondom het object en een onscherp beeld, aangezien de verschillende kleuren niet op hetzelfde punt focussen [13](#page=13). * **Oplossing:** Chromatische aberratie wordt gecorrigeerd door het gebruik van samengestelde lenzen, ook wel achromatische of apochromatische lenzen genoemd. Deze lenzen bestaan uit meerdere elementen gemaakt van verschillende glassoorten met variërende brekingsindices, die ontworpen zijn om de dispersie van verschillende golflengtes te compenseren [13](#page=13). #### 2.2.3 Beeldvlakkromming Beeldvlakkromming (ook wel veldkromming genoemd) is een aberratie waarbij een object dat in een plat vlak ligt, wordt afgebeeld in een gekromd vlak. Dit betekent dat, zelfs als het centrum van het beeld scherp is, de randen onscherp kunnen zijn, of vice versa [14](#page=14). * **Oplossing:** Beeldvlakkromming wordt aangepakt door het gebruik van lenzensystemen in plaats van enkele lenzen. Lenzenstelsels, zoals die in aplanatische lenzen, worden geconstrueerd om dit effect te corrigeren [14](#page=14). --- # Componenten en werking van een lichtmicroscoop Dit onderwerp beschrijft de diverse onderdelen van een lichtmicroscoop, inclusief de lichtbron, condensor, objectief en oculair, met uitleg over de formules voor vergroting en een introductie tot verschillende microscopietypes. ### 3.1 Componenten van een lichtmicroscoop Een lichtmicroscoop bestaat uit verschillende essentiële componenten die samenwerken om vergrote beelden van specimens te produceren [15](#page=15). #### 3.1.1 Lichtbron De lichtbron, vaak een halogeenlamp, produceert zichtbaar licht dat door de microscoop wordt gebruikt om het specimen te verlichten. Het lichtspectrum van een halogeenlamp is afhankelijk van de dimming; bij sterk gedimd licht is er een sterkere aanwezigheid van geel/rood licht. Het is cruciaal om de juiste lichtsterkte te gebruiken en aangepaste filters toe te passen voor optimale beeldvorming [31](#page=31). #### 3.1.2 Condensor en diafragma De condensor is verantwoordelijk voor het gelijkmatig verdelen van het licht over het specimen. Hij focust een kegel van licht met uniforme intensiteit op het specimen. Het diafragma, een onderdeel van de condensor, regelt de apertuur van de condensor. De apertuur van de condensor moet zo ingesteld zijn dat deze 70-90% van het objectief belicht, om reflecties of resolutieverlies te voorkomen [15](#page=15) [32](#page=32). In donkerveldmicroscopie wordt de condensor gebruikt om te verhinderen dat de directe lichtbundel het objectief bereikt, door middel van een centrale lichtstop [33](#page=33). #### 3.1.3 Tafel voor specimen De tafel voor het specimen is in hoogte verstelbaar en dient voor het plaatsen van het preparaat. De hoogteverstelling is essentieel voor het scherpstellen van het beeld [15](#page=15). #### 3.1.4 Objectief Het objectief is het eerste vergrotende lenzensysteem in de microscoop. Het is gemonteerd op een roterende houder, waardoor verschillende objectieven gemakkelijk kunnen worden verwisseld. Objectieven bestaan uit samengestelde lenzen [15](#page=15). De numerieke apertuur (NA) van een objectief is gedefinieerd als $NA = n \sin\alpha$, waarbij $n$ de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het specimen is, en $\alpha$ de halve openingshoek van de lichtkegel is. De resolutie van een microscoop wordt bepaald door de golflengte van het licht ($\lambda$) en de numerieke apertuur, volgens de formule: $d = \frac{\lambda}{2 \cdot NA}$. De best mogelijke resolutie met een lichtmicroscoop is ongeveer 0.2 micrometer [34](#page=34). De formule voor de resolutie kan ook worden uitgedrukt als $d = \frac{1.22 \lambda}{NA_{condensor} + NA_{objectief}}$ of $d = \frac{0.61 \lambda}{NA}$ [34](#page=34). Er wordt onderscheid gemaakt tussen objectieven met en zonder immersieolie. Immersieolie wordt gebruikt om de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het specimen te verhogen, wat de numerieke apertuur en daarmee de resolutie verbetert [35](#page=35). #### 3.1.5 Oculair Het oculair, ook wel bekend als het ooglensysteem, is een vergrootglas dat het reeds vergrote beeld van het objectief verder vergroot. Het oculair biedt een beperkte vergroting, typisch rond de 10x. Sommige oculairs zijn uitgerust met een meetplaatje om lengtemetingen uit te voeren na ijking [15](#page=15) [41](#page=41). ### 3.2 Vergroting van de microscoop De totale vergroting van een lichtmicroscoop wordt verkregen door de vergroting van het objectief te vermenigvuldigen met de vergroting van het oculair [29](#page=29). #### 3.2.1 Vergroting van het objectief De vergroting van het objectief ($m_o$) wordt bepaald door de verhouding van de beeldafstand ($i_o$) tot de voorwerpafstand ($p_o$). Hierbij is de voorwerpafstand $p_o$ negatief en de beeldafstand $i_o$ en brandpuntsafstand $f_o$ positief. De dunne lensformule wordt hier toegepast [27](#page=27): $$ \frac{1}{p_o} + \frac{1}{i_o} = \frac{1}{f_o} $$ [27](#page=27). De vergroting van het objectief wordt gegeven door: $$ m_o = \frac{i_o}{p_o} $$ [27](#page=27). Omdat $p_o$ negatief is, wordt de formule voor de vergroting vaak geschreven als: $$ m_o = -\frac{i_o}{p_o} $$ [27](#page=27). Of, wanneer de tubuslengte ($d$) en brandpuntsafstand van het objectief ($f_o$) bekend zijn: $$ m_o = \frac{d}{f_o} $$ [27](#page=27). #### 3.2.2 Vergroting van het oculair Voor het oculair ($m_e$) zijn de voorwerpafstand ($p_e$) en de beeldafstand ($i_e$) vaak negatief, terwijl de brandpuntsafstand ($f_e$) positief is. De dunne lensformule voor het oculair is [28](#page=28): $$ \frac{1}{p_e} + \frac{1}{i_e} = \frac{1}{f_e} $$ [28](#page=28). De vergroting van het oculair wordt gegeven door: $$ m_e = \frac{i_e}{p_e} $$ [28](#page=28). Wanneer het beeld door het oculair gevormd wordt op het nabijheidspunt (N = 25 cm), is $i_e \approx -N$. De vergroting van het oculair wordt dan: $$ m_e = \frac{-N}{p_e} $$ [28](#page=28). Of, als benadering, de vergroting van het oculair wordt gegeven door: $$ m_e \approx \frac{N}{f_e} $$ [28](#page=28). #### 3.2.3 Totale vergroting De totale vergroting ($m$) van de microscoop is het product van de vergroting van het objectief ($m_o$) en de vergroting van het oculair ($m_e$): $$ m = m_o \cdot m_e $$ [29](#page=29). Wanneer $N$ de afstand van het nabijheidspunt (25 cm) is, kan de totale vergroting bij benadering worden uitgedrukt als: $$ m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ [29](#page=29). Een meer nauwkeurige benadering houdt rekening met de beeldafstand van het objectief ($i_o$): $$ m \approx \frac{i_o}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ [29](#page=29). Een nog nauwkeurigere formule, waarbij de relatie tussen de tubuslengte ($d$), de beeldafstand van het objectief ($i_o$) en de voorwerpafstand van het oculair ($p_e$) in acht wordt genomen ($d = i_o - p_e$): $$ m = -\frac{i_o}{f_o} \left(1 + \frac{N}{f_e}\right) $$ [29](#page=29). **Voorbeeld van vergrotingberekening:** Gegeven: brandpuntsafstand objectief $f_o$ = 5 mm, brandpuntsafstand oculair $f_e$ = 30 mm, tubuslengte $d$ = 230 mm. Bereken bij benadering de vergroting. De voorwerpafstand van het oculair ($p_e$) kan worden afgeleid uit de tubuslengte en de brandpuntsafstanden. De beeldafstand van het objectief ($i_o$) is ongeveer gelijk aan de tubuslengte ($d$) verminderd met de voorwerpafstand van het oculair ($p_e$). We hebben $d = i_o - p_e$. Uit de lensformule voor het objectief, met $i_o \approx d$, kunnen we $p_o$ berekenen: $$ \frac{1}{p_o} = \frac{1}{f_o} - \frac{1}{i_o} = \frac{1}{5 \text{ mm}} - \frac{1}{230 \text{ mm}} = \frac{230 - 5}{5 \cdot 230} = \frac{225}{1150} $$ $$ p_o \approx \frac{1150}{225} \approx 5.11 \text{ mm} $$ De vergroting van het objectief is dan: $$ m_o = \frac{i_o}{p_o} = \frac{230 \text{ mm}}{-5.11 \text{ mm}} \approx -45.0 $$ De vergroting van het oculair, met het beeld op het nabijheidspunt (N=250 mm), is: $$ m_e \approx \frac{N}{f_e} = \frac{250 \text{ mm}}{30 \text{ mm}} \approx 8.33 $$ De totale vergroting is dan: $$ m = m_o \cdot m_e \approx -45.0 \cdot 8.33 \approx -375 $$ De negatieve waarde geeft de omkering van het beeld aan. De vergroting is dus ongeveer 375x. Gebruikmakend van de benaderingsformule: $$ m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ $$ m \approx \frac{230 \text{ mm}}{5 \text{ mm}} \cdot \frac{250 \text{ mm}}{30 \text{ mm}} = 46 \cdot 8.33 \approx 383.18 $$ Dit is een benadering. Volgens de gegeven berekening op [30](#page=30): $i_o = d - p_e$ en $p_e = N$ voor het oog op het nabijheidspunt. De formules op lijken deze specifieke berekening te hanteren [30](#page=30): $i_o = 230 \text{ mm} - (250 \text{ mm} \cdot \frac{30 \text{ mm}}{30 \text{ mm}}) = 230 \text{ mm} - 250 \text{ mm} = -20 \text{ mm}$ (Dit is onlogisch, beeldafstand kan niet negatief zijn indien de lens in het midden is geplaatst) De formule $i_o = d+p_e$ wordt gebruikt in de bron: $i_o = 230 + 250 = 480$ mm (Dit is ook niet logisch) De berekening op pagina 30 lijkt de formules $e_{o}f_{o}N/i_{o}f_{e}$ te gebruiken voor de vergroting, met $i_o$ afgeleid uit de tubuslengte. Een correcte berekening voor de gegeven voorbeeld is: Brandpuntsafstand objectief ($f_o$) = 5 mm. Tubuslengte ($d$) = 230 mm. Nabijheidspunt ($N$) = 250 mm. Brandpuntsafstand oculair ($f_e$) = 30 mm. De beeldafstand van het objectief ($i_o$) is ongeveer gelijk aan de tubuslengte: $i_o \approx d = 230$ mm. De voorwerpafstand van het oculair ($p_e$) wordt afgeleid uit de tubuslengte en de brandpuntsafstand van het oculair, waarbij het beeld op het nabijheidspunt wordt gevormd. Echter, de vereenvoudigde formules op zijn [29](#page=29): $$ m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ $$ m \approx \frac{230}{5} \cdot \frac{250}{30} = 46 \cdot 8.33 \approx 383 $$ De berekening op pagina 30 lijkt de formule $m = \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ te gebruiken, met enigszins afwijkende waarden in de tussenstappen: $i_o = 230$ mm ( tubuslengte) $p_e = i_o - d = 230 - 230 = 0$? (Dit is fout) De correcte formule $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ geeft $m \approx \frac{230}{5} \cdot \frac{250}{30} \approx 383$ [29](#page=29) [30](#page=30). De berekening in het voorbeeld op is [30](#page=30): $i_o \approx d = 230$ mm $p_e \approx N - f_e = 250 - 30 = 220$ mm (Dit is de voorwerpafstand voor een beeld op afstand N) $m_e = N / p_e = 250 / 220 \approx 1.14$? (Dit klopt niet met de 10x typische vergroting) De berekening op lijkt de formule $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ te gebruiken [30](#page=30): $m \approx \frac{230}{5} \cdot \frac{250}{30} = 46 \cdot 8.33 = 383$ (ongeveer) De stappen op gebruiken echter [30](#page=30): $i_o = 230 \text{ mm} - 250 \text{ mm} = -20$ (Deze stap is incorrect en niet fysiek zinvol) $m \approx 30 \cdot 250 \cdot 20 / (30 \cdot 5) = 340 \cdot 30 \cdot 5 / 250 \cdot 20 = 30250 / 230$ (Deze berekeningen lijken niet te kloppen met de bekende formules.) Echter, als we de formule $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ toepassen: $m \approx \frac{230 \text{ mm}}{5 \text{ mm}} \cdot \frac{250 \text{ mm}}{30 \text{ mm}} = 46 \cdot 8.33 \approx 383$ [29](#page=29) [30](#page=30). De berekening op pagina 30 gebruikt $m \approx \frac{N f_o}{f_e}$ is ook niet correct. De formule gebruikt op is [30](#page=30): $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ $m \approx \frac{230}{5} \times \frac{250}{30} = 46 \times 8.33 = 383$ De tussenstap $20330250$ en $340305$ zijn verwarrend en lijken een andere aanpak te volgen. De directe toepassing van de formule op geeft echter een resultaat rond de 383 [29](#page=29). > **Tip:** Let goed op de correcte toepassing van de dunne lensformule en de definities van de verschillende afstanden bij het berekenen van de vergroting. De benaderingsformule is vaak voldoende voor examens. ### 3.3 Verschillende microscopietypes Naast de conventionele lichtmicroscoop zijn er diverse gespecialiseerde types die voor specifieke toepassingen worden gebruikt. #### 3.3.1 Invers microscoop Een invers microscoop wordt gebruikt wanneer het object te dik is om op een conventionele microscoop scherp te worden weergegeven. Bij dit type microscoop staan de lichtbron en de condensor boven het object, terwijl het objectief zich onder het object bevindt [42](#page=42). #### 3.3.2 Fase-contrast microscopie Conventionele lichtmicroscopie maakt gebruik van intensiteitsverschillen die ontstaan door absorptie van invallend licht, vaak na kleuring van het preparaat. Fase-contrast microscopie daarentegen maakt gebruik van intensiteitsverschillen die ontstaan door faseverschillen, veroorzaakt door variaties in de brekingsindex van verschillende structuren binnen het specimen [43](#page=43). Bij fase-contrast microscopie wordt een parallelle lichtbundel door een smalle spleet geleid. Een faseverschil van $\lambda/4$ ontstaat tussen het centrale maximum en het eerste diffractie maximum. Het licht van het centrale maximum wordt door een gecoate glasplaat geleid om de intensiteit op het niveau van het eerste diffractie maximum te brengen. Het licht van het eerste diffractie maximum ondergaat door de glasplaat een extra faseverschil van $\lambda/4$, wat leidt tot destructieve interferentie [44](#page=44). Een fase-contrast microscoop heeft een condensor met een fasering om een smalle opening te creëren, en een objectief met een faseplaatje. Dit type microscopie is uitermate geschikt voor het in beeld brengen van levende cellen. Een kenmerkend "halo"-effect kan optreden. Perfecte alignatie van de componenten is cruciaal [45](#page=45). Vergelijking van beelden: helderveld, donkerveld, fase-contrast [47](#page=47). #### 3.3.3 DIC microscopie DIC staat voor Differentieel Interferentie Contrast microscopie, ook wel Nomarski microscopie genoemd. Dit type microscopie maakt gebruik van gepolariseerd licht en prisma's [48](#page=48). Voordelen van DIC microscopie zijn het ontbreken van het halo-effect, een schaduw-effect dat een 3D-uiterlijk geeft, een betere resolutie dan fase-contrast, en de mogelijkheid om dikkere preparaten (>100 µm) in beeld te brengen [49](#page=49). #### 3.3.4 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van kleuring met fluorescente merkers, zoals fluoresceïne, die licht uitzenden na excitatie met een specifieke golflengte. Dit type microscopie maakt gebruik van twee filters: één voor het excitatielicht en één voor het emissielicht [50](#page=50). Het belang van beeldverwerking, met name wiskundige deconvolutie, is significant in fluorescentiemicroscopie om de sterkte van verstrooid licht buiten het focale vlak te reduceren [53](#page=53). #### 3.3.5 Gecombineerde systemen Het is mogelijk om systemen te combineren, zoals fase-contrast en fluorescentiemicroscopie [54](#page=54). --- # Geavanceerde microscopietechnieken en elektronmicroscopie Dit deel bespreekt geavanceerde microscopietechnieken die een aanzienlijk hoger oplossend vermogen bieden dan de klassieke lichtmicroscoop, met een focus op confocale microscopie, de principes van elektronmicroscopie (TEM en SEM), en scanning probe microscopen (STM en AFM) [55-65. ### 4.1 Confocale microscopie Confocale microscopie is een geavanceerde techniek die gebruikmaakt van een laserbundel die het preparaat afscant. Een cruciaal aspect is dat licht dat buiten het brandvlak valt, wordt tegengehouden door een plaat met een confocale apertuur. Dit stelt de microscopische evaluatie van dikkere weefselstukken mogelijk, met de optie voor driedimensionale reconstructies. Meestal wordt deze techniek toegepast in combinatie met fluorescentie. Het onderscheidend vermogen van de microscoop is 0.2 micrometer, met een maximale vergroting van 10^4, en het medium is lucht. De toepassing is voornamelijk op dood materiaal, waarbij een 3D beeld wordt verkregen [55](#page=55) [56](#page=56) [57](#page=57) [65](#page=65). ### 4.2 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie maakt gebruik van de deeltjes-golf dualiteit, waarbij aan bewegende deeltjes een golfkarakter wordt toegekend volgens de de Broglie golflengte: $$ \lambda = \frac{h}{m v} $$ Hierbij is $\lambda$ de golflengte, $h$ de constante van Planck, $m$ de massa van het deeltje en $v$ de snelheid. Dit principe leidt tot een veel groter oplossend vermogen in vergelijking met de lichtmicroscoop. Elektronen worden geproduceerd door een wolfraamkathode. De focussering gebeurt met elektromagnetische lenzen, die echter ook lensfouten vertonen. Voor betere contrastvorming worden preparaten gekleurd met elementen met een hoge atoomnummer (hoge Z-elementen), die sterke verstrooiing van elektronen veroorzaken [58](#page=58). Het medium waarin elektronenmicroscopie plaatsvindt, is een vacuüm, in tegenstelling tot de atmosferische druk bij lichtmicroscopie. Dit is noodzakelijk omdat elektronen snel verstrooid zouden worden door gasmoleculen [60](#page=60). #### 4.2.1 Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) De Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) werkt door een bundel elektronen door een zeer dun preparaat te sturen. Hierbij worden de elektronen verstrooid door het materiaal, en de patronen die hieruit voortkomen, worden gedetecteerd om een beeld te vormen. De TEM heeft een onderscheidend vermogen van 1 nanometer en een maximale vergroting van 10^5. Het beeld is typisch 2D en de toepassing is op dood materiaal [59](#page=59) [60](#page=60) [65](#page=65). Een vergelijking tussen Lichtmicroscoop (LM) en TEM: | Kenmerk | Lichtmicroscoop (LM) | Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) | | :-------------------- | :------------------------ | :------------------------------------- | | Lichtbron | Sterke lamp | Elektronenkanon | | Lenzen | Bolle lenzen (glas) | EM lenzen (elektromagnetisch) | | Detector | Oog, camera | Fluorescent scherm, camera | | Focussering | Axiale beweging objectief | Aanpassing stroom EM lenzen | | Medium | Atmosfeerdruk | Vacuüm | | Onderscheidend vermogen | 0.2 micrometer | 1 nanometer | | Maximale vergroting | 10^3 | 10^5 | | Toepassing | Levend/dood materiaal | Dood materiaal | | Beeldvorming | 2D | 2D | #### 4.2.2 Scanning elektronenmicroscoop (SEM) De Scanning elektronenmicroscoop (SEM) wordt gebruikt voor het scannen van het oppervlak van een preparaat. In plaats van elektronen door het monster te sturen, wordt een elektronenbundel over het oppervlak van het preparaat gescand. De detectie van secundaire elektronen of teruggekaatste elektronen vormt het beeld. De SEM heeft een resolutie van 10 nanometer en een maximale vergroting van 2 x 10^4. Het biedt een 2D beeld dat echter een 3D-indruk kan geven van het oppervlak. De toepassing is voornamelijk voor oppervlaktestudies van dood materiaal [61](#page=61) [65](#page=65). ### 4.3 Scanning probe microscopen (SPM) Scanning probe microscopen (SPM) zijn gebaseerd op het mechanisch aftasten van een oppervlak met een fijne probe. Ze kunnen details tot 0.1 nanometer in 3D vastleggen. De opbouw omvat een probe die de uitwijking detecteert, vibratiestabilisatie en elektronische circuits die verbonden zijn met een computer. Er zijn twee hoofdtypen: de Scanning tunnel microscoop (STM) en de Atomic force microscoop (AFM) [62](#page=62). #### 4.3.1 Scanning tunnel microscoop (STM) De Scanning tunnel microscoop (STM) maakt gebruik van een piëzoëlektrische probe die over het oppervlak beweegt en de uitwijking detecteert. Een aangelegde spanning ($V$) over de probe genereert een tunnelstroom ($I$). Deze stroom is gerelateerd aan de afstand ($x$) tot het oppervlak volgens [63](#page=63): $$ I \sim V e^{-x} $$ Om een constante tunnelstroom te behouden, wordt de afstand bijgeregeld door de spanning te variëren. De STM is alleen toepasbaar op geleidende oppervlakken. Het onderscheidend vermogen is 0.1 nanometer met een maximale vergroting van 10^9. Het medium kan lucht, vloeistof of vacuüm zijn, en de toepassing is oppervlaktestudie met een 3D beeld [63](#page=63) [65](#page=65). #### 4.3.2 Atomic force microscoop (AFM) De Atomic force microscoop (AFM) werkt door het monster te bewegen ten opzichte van een scherpe probe die in contact is met een krachtsensor. De interatomaire krachten ($F$) tussen de probe en het monster worden gemeten, wat een perfect contact mogelijk maakt. De kracht is gerelateerd aan de afstand ($z$) door [64](#page=64): $$ F \sim -k z $$ Hierbij is $k$ een constante die de stijfheid van de cantilever beschrijft. AFM kan ook worden toegepast op niet-geleidende oppervlakken. Het onderscheidend vermogen is 0.1 nanometer met een maximale vergroting van 10^9. Het medium kan lucht, vloeistof of vacuüm zijn, en de toepassing is oppervlaktestudie met een 3D beeld [64](#page=64) [65](#page=65). ### 4.4 Overzicht van microscopietechnieken | Techniek | Onderscheidend vermogen | Max. vergroting | Medium | Biologische toepassing | Beeld | | :------------------ | :---------------------- | :-------------- | :------------------ | :---------------------------- | :--------- | | **LM** | | | | | | | Klassieke LM | 0.2 µm | 10³ | Lucht, vloeistof | Dood materiaal | 2D | | Fluorescentie LM | 0.2 µm | 10³ | Lucht | Dood materiaal | 2D | | Fasecontrast/DIC LM | 0.2 µm | 10³ | Lucht | Levend materiaal | 2D | | Confocale LM | 0.2 µm | 10⁴ | Lucht | Dood materiaal | 3D | | **EM** | | | | | | | TEM | 1 nm | 10⁵ | Vacuüm | Dood materiaal | 2D | | SEM | 10 nm | 2x10⁴ | Vacuüm | Dood materiaal (oppervlak) | 2D (schijn 3D) | | **SPM** | | | | | | | STM | 0.1 nm | 10⁹ | Lucht, vloeistof, vacuüm | Oppervlaktestudie | 3D | | AFM | 0.1 nm | 10⁹ | Lucht, vloeistof, vacuüm | Oppervlaktestudie | 3D | > **Tip:** Bij het bestuderen van deze technieken is het belangrijk om niet alleen de principes te kennen, maar ook de specifieke voordelen en beperkingen van elke methode, evenals hun toepassingen in biologisch onderzoek. Let met name op het verschil in oplossend vermogen en de te scannen dimensie (2D vs. 3D). > **Voorbeeld:** De keuze tussen TEM en SEM hangt af van de vraag of men interne structuren (TEM) of de oppervlaktetopografie (SEM) van een monster wil bestuderen. Voor levende cellen zijn fasecontrast- of DIC-microscopen geschikter dan de meeste geavanceerde technieken die een vacuüm vereisen of het monster kunnen beschadigen. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Interferentie | Het verschijnsel waarbij twee of meer golven elkaar ontmoeten en hun amplitudes zich superponeren, wat leidt tot een nieuw golfpatroon. Dit kan constructief zijn (versterking) als de golven in fase zijn, of destructief (verzwakking) als ze in tegenfase zijn. | | Constructieve interferentie | Treedt op wanneer golven in fase zijn, wat betekent dat hun pieken en dalen samenvallen. Het faseverschil is een veelvoud van de golflengte ($\lambda$), dus $n\lambda$, waarbij $n$ een geheel getal is. Dit resulteert in een grotere amplitude. | | Destructieve interferentie | Treedt op wanneer golven in tegenfase zijn, wat betekent dat de piek van de ene golf samenvalt met het dal van de andere. Het faseverschil is een oneven veelvoud van een halve golflengte, dus $(2n+1)\lambda/2$, waarbij $n$ een geheel getal is. Dit kan leiden tot annulering van de golven. | | Faseverschil | Het verschil in fase tussen twee golven, uitgedrukt in graden, radialen of als een fractie van de golflengte. Dit is cruciaal voor het bepalen of interferentie constructief of destructief zal zijn. | | Faseverschil $n\lambda$ | Dit geeft aan dat de golven in fase zijn, leidend tot constructieve interferentie. ($n$ is een geheel getal.) | | Faseverschil $(2n+1)\lambda/2$ | Dit geeft aan dat de golven in tegenfase zijn, leidend tot destructieve interferentie. ($n$ is een geheel getal.) | | Diffractie | Het buigen en verspreiden van golven wanneer ze een obstakel passeren of door een opening gaan. Dit fenomeen is verantwoordelijk voor de vorming van patronen na het passeren van licht door een spleet of door optische elementen zoals lenzen. | | Diffractiepatroon | Het patroon van lichte en donkere banden of ringen dat ontstaat als gevolg van diffractie van licht. De intensiteitsverdeling in dit patroon hangt af van de golflengte van het licht en de afmetingen van de opening of het obstakel. | | Eerste donkere strook (bij diffractie door een spleet) | De eerste donkere lijn in een diffractiepatroon, die optreedt wanneer het licht dat door de spleet gaat, destructieve interferentie vertoont. De hoek waaronder dit gebeurt, wordt gegeven door de formule $sin(\theta) = \lambda/W$, waar $W$ de spleetbreedte is. | | Onderscheidend vermogen (resolutie) | Het vermogen van een microscoop om twee dicht bij elkaar liggende objecten als afzonderlijke entiteiten te onderscheiden. Dit wordt beperkt door diffractie en de golflengte van het gebruikte licht. | | Criterium van Rayleigh | Een criterium dat stelt dat twee puntvormige objecten nog net van elkaar onderscheiden kunnen worden wanneer het centrum van het diffractiepatroon van het ene object samenvalt met de eerste donkere ring van het diffractiepatroon van het andere object. | | Sferische aberratie | Een optische fout in lenzen waarbij lichtstralen die door verschillende delen van de lens gaan, niet op hetzelfde punt focussen. Dit resulteert in een minder scherp beeld, vooral in de buitenste zones van de lens. | | Chromatische aberratie | Een optische fout waarbij verschillende golflengten van licht verschillend worden gebroken door een lens, wat resulteert in kleurschifting in het beeld. Dit komt door de dispersie van licht in het glas. | | Beeldvlakkromming | Een lensfout waarbij een voorwerp dat in een plat vlak ligt, wordt afgebeeld in een gekromd vlak, wat leidt tot vervorming van het beeld. | | Condensor | Een optisch onderdeel in een microscoop dat licht bundelt en focusseert op het te observeren preparaat. Het regelt de gelijkmatige verdeling van licht en de apertuur van de lichtbundel. | | Objectief | Het primaire lenzensysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het preparaat bevindt. Het creëert een eerste, vergroot, reëel beeld van het object. | | Oculair | Het lenzensysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het oog van de waarnemer bevindt. Het vergroot het reële beeld gecreëerd door het objectief, waardoor een virtueel, vergroot beeld ontstaat. | | Tubuslengte ($d$) | De afstand tussen het optische centrum van het objectief en het optische centrum van het oculair in een microscoop. Dit is een standaard specificatie die de vergroting beïnvloedt. | | Dunne lensformule | Een wiskundige relatie die de relatie beschrijft tussen de voorwerpafstand ($p$), de beeldafstand ($i$) en de brandpuntsafstand ($f$) van een lens: $1/f = 1/p + 1/i$. | | Vergroting ($m$) | De verhouding tussen de grootte van het beeld en de grootte van het voorwerp. In microscopie wordt de totale vergroting verkregen door het product van de vergroting van het objectief en het oculair. | | Numerieke Apertuur (NA) | Een maat voor het vermogen van een optisch systeem om licht te verzamelen. Bij microscopen bepaalt de NA de resolutie en de lichtopbrengst van het objectief. Het wordt berekend als $NA = n \cdot \sin(\alpha)$, waarbij $n$ de brekingsindex van het medium is en $\alpha$ de halve openingshoek van de kegel van licht. | | Immersieolie | Een speciale olie met een hoge brekingsindex die tussen het objectief en het preparaat wordt aangebracht. Dit verhoogt de Numerieke Apertuur (NA) van het objectief, waardoor een hogere resolutie mogelijk is. | | Fase-contrast microscopie | Een techniek die de verschillen in brekingsindex van verschillende delen van een preparaat omzet in verschillen in intensiteit, waardoor transparante structuren zichtbaar worden zonder kleuring. | | DIC microscopie (Differentieel Interferentie Contrast) | Ook bekend als Nomarski microscopie, deze techniek gebruikt gepolariseerd licht om kleine hoogteverschillen op een preparaat zichtbaar te maken, wat een 3D-achtig schaduweffect geeft en geen halo-effect vertoont. | | Fluorescentiemicroscopie | Een techniek die gebruikmaakt van fluorescentie, waarbij specifieke moleculen in een preparaat licht van een bepaalde golflengte absorberen en vervolgens licht van een langere golflengte uitzenden. Dit vereist specifieke filters voor excitatie- en emissielicht. | | Confocale microscoop | Een optische microscoop die een laserstraal gebruikt om een preparaat punt voor punt af te tasten. Licht buiten het brandvlak wordt tegengehouden door een confocale apertuur, wat resulteert in optische secties en 3D-reconstructies van dikkere monsters. | | Elektronenmicroscoop | Een microscoop die elektronenbundels in plaats van licht gebruikt om een beeld te vormen. Dit maakt een veel hogere resolutie mogelijk dan bij lichtmicroscopie vanwege de veel kortere de Broglie-golflengte van elektronen. | | Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM) | Een type elektronenmicroscoop waarbij een elektronenbundel door een ultradun monster wordt gestuurd. Beelden worden gevormd op basis van de verstrooiing en transmissie van de elektronen, wat resulteert in een 2D-beeld met zeer hoge resolutie. | | Scanning Elektronenmicroscoop (SEM) | Een type elektronenmicroscoop waarbij een gefocusseerde elektronenbundel het oppervlak van een monster aftast. Het beeld wordt gevormd door de detectie van secundaire elektronen of andere deeltjes die worden uitgezonden vanaf het oppervlak, wat voornamelijk 3D-achtige oppervlaktebeelden oplevert. | | Scanning Tunnelmicroscoop (STM) | Een type scanning probe microscoop die gebruikmaakt van de kwantummechanische tunneling van elektronen tussen een scherpe metalen probe en een geleidend monster. Het meet de afstand met extreem hoge resolutie (tot atomaire schaal). | | Atomic Force Microscoop (AFM) | Een type scanning probe microscoop die de interatomaire krachten meet tussen een scherpe probe aan een cantilever en het oppervlak van het monster. Het kan oppervlaktopografie op atomair niveau afbeelden, zowel voor geleidende als niet-geleidende materialen. |