B11 antilichamenTCRv2023 2.pptx

# Antilichamen en T-celreceptoren in diagnostiek en behandeling Dit onderwerp bespreekt de diverse toepassingen van antilichamen en T-celreceptoren in zowel de diagnostiek als de behandeling van ziekten. ## 1. Antilichamen en T-celreceptoren in diagnostiek en behandeling ### 1.1 Polyklonale antistoffen Polyklonale antistoffen worden verkregen uit het serum van een geïmmuniseerd individu. Ze vertegenwoordigen een mengsel van antilichamen, waarbij slechts een deel gericht is tegen het specifieke antigen van interesse. Bovendien kunnen deze antistoffen verschillende isotypes bevatten (zoals IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) en gericht zijn tegen diverse epitopen van een antigen. Humane immuunglobulinepreparaten, verkregen uit gezonde donoren, bevatten antistoffen tegen veelvoorkomende pathogenen zoals rhinovirus, RSV en adenovirus. Ze bevatten echter geen antistoffen tegen pathogenen zoals HIV of HCV, aangezien de donoren seronegatief zijn. * **Toepassingen:** * Behandeling van B-celdefecten. * Behandeling van auto-immuunziekten. * **Specifieke immunoglobulines:** Afkomstig van hyperimmune of gevaccineerde donoren. * Anti-D: Preventie bij rhesusnegatieve zwangere vrouwen. * Anti-HBV: Profylaxe na een prikaccident. * Antitetanus: Wondbehandeling. * Anti-rabiës: Na beet van een verdacht dier (in combinatie met vaccinatie). * Anti-CMV: Profylaxe en behandeling bij transplantatiepatiënten. Polyklonale antistoffen worden ook gebruikt in de vorm van antithymocyteglobulines (ATG), die worden verkregen uit konijnserum na immunisatie met humane thymuscellen. ATG wordt ingezet bij transplantatie om de immuniteit te onderdrukken. ### 1.2 Monoklonale antistoffen Monoklonale antistoffen zijn een homogene populatie van antistoffen die slechts één specifiek epitoop binden. Ze worden geproduceerd door hybride cellen, ontstaan uit de fusie van B-cellen (uit een geïmmuniseerde muis of mens) en een myeloomcel (die zelf geen antistoffen produceert). Het resulterende hybridoom is een snelgroeiende cel die de gewenste antistof secreteert. Elk productiebatch van een monoklonaal antistofproduct is identiek. * **Voorbeeld:** OKT3 is een monoklonaal antistof dat een specifiek epitoop op CD3-eiwitten op T-cellen herkent. * **Productie:** De klassieke methode betreft het gebruik van muizen, maar ook humane monoklonale antistoffen kunnen worden ontwikkeld. ### 1.3 Gehumaniseerde monoklonale antistoffen Muizenantilichamen (murine antistoffen) kunnen bij mensen een immuunrespons oproepen, wat hun effectiviteit kan verminderen. Om dit te omzeilen, worden murienantilichamen 'vermenselijkt' middels moleculaire technieken: * **Chimere antistoffen:** Deze bevatten alleen het variabele domein van de muis (VH en VL). De constante delen zijn afkomstig van een humaan isotype, gekozen op basis van gewenste effecten zoals binding aan Fc-receptoren of complementactivatie. Endingen op "-ximab" duiden op chimere antistoffen. * **Gehumaniseerde antistoffen:** Hierbij zijn enkel de complementair-determinerende regio's (CDR's) van de muisantilichamen behouden; de rest van het antistof is humaan. Endingen op "-zumab" duiden op gehumaniseerde antistoffen. * **Humaan antistoffen:** Deze zijn volledig humaan, maar technisch uitdagender te produceren. Endingen op "-mumab" duiden op humane antistoffen. * **Andere aanduidingen:** "-cept" duidt op een fusie-eiwit tussen een receptor en het constante deel van een antistof. Deze antistoffen worden gebruikt voor de behandeling van ziekten zoals kanker, waarbij ze specifieke targets zoals CD20, HER2 of CD19 kunnen blokkeren (checkpoint blokkers, anti-cytokine therapieën zoals anti-IL1, anti-IL6, anti-TNF). ### 1.4 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA is een veelgebruikte en belangrijke methode voor het detecteren en kwantificeren van specifieke eiwitten, zoals virussen, antilichamen, hormonen of toxines. **Werkingsprincipe:** 1. Een specifiek antigeen wordt gecoat op de bodem van een plastic putje. 2. Het serum van de patiënt wordt toegevoegd. Als er specifieke antistoffen in het serum aanwezig zijn, zullen deze binden aan het gecoate antigeen. 3. Na wegwassen worden enkel de gebonden antistoffen achtergelaten. 4. Een secundair antilichaam, dat specifiek is voor humane immuunglobulines en gekoppeld is aan een enzym (bijvoorbeeld een geel driehoekje), wordt toegevoegd. Dit bindt aan de reeds gebonden antistoffen. 5. Na opnieuw wegwassen blijft enkel het enzym-gekoppelde secundaire antilichaam achter. 6. Toevoeging van een enzymsubstraat leidt tot een kleurreactie in de positieve putjes. ELISA is, naast PCR en kweek, een derde fundamenteel diagnostisch principe in de microbiologie. ### 1.5 Flowcytometrie of FACS (fluorescentie-geactiveerde cel sortering) Flowcytometrie wordt gebruikt om diverse celpopulaties, zoals T-cellen, B-cellen en NK-cellen in bloed, te kwantificeren en te karakteriseren. **Werkingsprincipe:** 1. **Voorbehandeling:** Ontstolde bloedmonsters worden gemengd met monoklonale antistoffen die gelabeld zijn met fluorescerende stoffen (elk met een verschillende kleur, bijvoorbeeld rood, groen, blauw). Deze antistoffen binden aan specifieke celoppervlaktemarkers (bijvoorbeeld anti-CD3 voor T-cellen, anti-CD20 voor B-cellen, anti-CD56 voor NK-cellen). 2. **Detectie:** De cellen passeren één voor één een laserstraal. De laser exciteert de fluorescerende labels op de antistoffen, waardoor ze licht van specifieke golflengtes uitzenden. Detectoren vangen dit uitgezonden licht op. 3. **Analyse:** De gegevens worden gevisualiseerd in een driedimensionale plot, waarbij elk punt een individuele cel vertegenwoordigt met zijn specifieke celoppervlaktefenotype. * **CiteSeq en single-cell transcriptomics:** * **CiteSeq:** Antilichamen zijn gelabeld met oligonucleotiden. Cellen worden individueel verwerkt en gesequenced, waardoor labelling met wel 250 antistoffen tegelijk mogelijk is. * **Single Cell Transcriptomics:** Cellen worden in afzonderlijke druppeltjes verpakt, waarna het RNA van elke cel wordt gesequenced. ### 1.6 Diagnostiek: anemie door rode bloedcel destructie In de context van moeder-kind immunologische incompatibiliteit kunnen antistoffen, met name van het IgG-type, de placenta passeren en binden aan cellen van de foetus. Dit kan leiden tot ernstige aandoeningen. * **HLA-antistoffen:** Hoewel genetische verschillen tussen moeder en kind normaal geen afstoting veroorzaken, kunnen anti-HLA-antistoffen gevormd worden. Deze kunnen, indien van het IgG-type, de placenta passeren en binden aan foetale cellen, maar veroorzaken doorgaans geen symptomen bij de foetus. * **Bloedgroepantistoffen (Anti-A/Anti-B):** Moeders van bloedgroep O kunnen spontaan anti-A en anti-B antistoffen produceren. Indien deze antistoffen (soms IgM, soms IgG) de placenta passeren, kunnen ze hemolyse van de rode bloedcellen van het kind veroorzaken, leidend tot geelzucht. * **Rhesus (RhD) en Kell incompatibiliteit:** Bij rhesusnegatieve moeders die een rhesuspositief kind dragen, kan de moeder antistoffen aanmaken, vooral na een eerste zwangerschap. Deze IgG-antistoffen, gericht tegen RhD-antigenen op rode bloedcellen en hun voorlopers, kunnen de rode bloedcellen van het kind afbreken. Dit leidt tot ernstige foetale hemolytische anemie. Kell-incompatibiliteit is zeldzamer maar kan nog ernstiger verlopen. **Diagnose:** * **Directe Coombs-test:** Op de rode bloedcellen van het kind. IgG-antistoffen agglutineren op zichzelf niet. Door toevoeging van een anti-IgG-antilichaam worden de met antistoffen beladen rode bloedcellen geagglutineerd. **Preventie van Hemolytische Anemie van de Pasgeborene (Anti-RhD antistoffen):** Toediening van anti-RhD IgG aan een rhesusnegatieve moeder voorkomt immunisatie door foetale cellen. Het werkingsmechanisme is gebaseerd op het binden van deze antistoffen aan naïeve B-cellen via een inhibitoir Fc-receptor (FcγRIIb). Wanneer deze receptor een antistof bindt met een hogere affiniteit dan de BCR (B-celreceptor), wordt de B-cel geblokkeerd, wat de vorming van anti-foetale antistoffen voorkomt. Dit mechanisme wordt mogelijk ook benut bij de behandeling van auto-immuunziekten zoals idiopathische trombopenie (ITP) met gammaglobulines. ### 1.7 Passieve immunisatie Passieve immunisatie is de directe toediening van antistoffen aan een individu om onmiddellijke bescherming te bieden. Dit kan bijvoorbeeld bij CMV-reactivatie na transplantatie. Hoewel CMV een intracellulair pathogeen is, kan passieve immunisatie met CMV-specifieke antistoffen nuttig zijn, omdat het gemakkelijk toe te dienen is en geen immuunreactie opwekt. Het is echter niet genezend. ### 1.8 Antilichaam engineering Antilichamen kunnen gemodificeerd worden om nieuwe therapeutische eigenschappen te verkrijgen. * **Structuur van een Ig:** Een typisch Ig-molecuul bestaat uit twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens. Het Fv-domein (fragment variable) is het kleinste antistofdeel dat nodig is voor antigenbinding en bestaat uit één VH en één VL domein, elk met 3 CDR's. * **Single Chain Fragment Variable (scFv):** Ontstaat door een flexibele peptideketen tussen de VL en VH domeinen te plaatsen. * **Fragment Antigen Binding (Fab):** Kan verkregen worden via enzymatische behandeling of recombinante technieken. * **F(ab')2 fragment:** Twee Fab-fragmenten verbonden door disulfidebruggen. * **VHH immunoglobulines (Camelid/Llama):** Deze immunoglobulines hebben een Fv-deel dat enkel uit één VH-domein bestaat, wat de productie vereenvoudigt (slechts één gen te klonen). * **Bispecifieke antistoffen:** Deze antistoffen hebben twee paar VH-VL-domeinen met verschillende specificiteiten. Een voorbeeld is een antistof gericht tegen een tumor-specifiek antigen en tegelijkertijd tegen het TCR/CD3-complex op T-cellen (bijv. BiTEs - Bispecific T-cell Engagers). Dit richt T-cellen op de tumor, wat leidt tot "redirected T-cell killing". **Effectorme mechanismen van Ig's:** * **Complementactivatie:** Kan leiden tot cellysis, maar is minder effectief tegen lichaamscellen door aanwezigheid van inhibitoren zoals DAF. * **ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity):** Gedood door NK-cellen. * **ADCP (Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis):** Fagocytose door macrofagen. * **FcγR-gemedieerde killing:** Cruciaal mechanisme bij antistoffen zoals Rituximab (anti-CD20), die B-cellymfomen en leukemieën behandelen. CD20-activatie induceert apoptose. Deze strategie wordt ook toegepast bij borstkanker (HER2). ### 1.9 Transgene T-celreceptoren Perifere T-cellen kunnen genetisch gemodificeerd worden om transgene T-celreceptoren (TCR's) te introduceren. * **Tumor-specifieke TCR:** Dit is een tweede receptor die specifiek gericht is op een tumor-antigeen. Deze therapie is vaak HLA-gerestricteerd, wat de praktische toepasbaarheid beperkt. TCR's kunnen cytoplasmatische of nucleaire antigenen targetten. ### 1.10 Chimere antigeenreceptoren (CARs) CARs zijn genetisch gemodificeerde receptoren die een tweede receptor tot expressie brengen met eigenschappen van een antistof. * **Voordelen:** Ze zijn niet HLA-gerestricteerd, wat ze zeer praktisch maakt, maar kunnen enkel membraanantigenen targetten (zoals CD20, HER2). * **Structuur:** Een CAR bestaat typisch uit een extracellulair scFv-domein (VH en VL van een antistof) gekoppeld aan een transmembraanpeptide en een signaaltransducerende sequentie, vaak afgeleid van CD3. * **Generaties CARs:** * **Eerste generatie:** Bevatten enkel CD3-signalering. Ze kunnen tumorcellen doden, maar de T-cellen overleven niet goed *in vivo*. * **Tweede generatie:** Naast CD3-signalering bevatten ze ook costimulatoire domeinen (zoals CD28). Dit leidt tot activatie, proliferatie en cytokineproductie na antigenbinding, waardoor de T-cellen langdurig *in vivo* overleven en krachtige tumorbestrijders worden. Dit resulteert in een "on target, on tumor" effect. * **Bijwerkingen:** * "On target, off tumor" effecten: Wanneer het doelantigeen ook op gezonde cellen voorkomt (bijv. CD20 op gezonde B-cellen bij CAR-T therapie gericht op B-celkanker). * Cytokinestorm: Een potentieel dodelijke overmatige immuunreactie na infusie van CAR-T cellen. Behandeling met anti-IL6 antistoffen kan hierbij waardevol zijn. ### 1.11 Transfer van virale immuniteit Voor patiënten met immuundeficiëntie na transplantatie die lijden aan CMV-reactivatie, kan naast medicamenteuze behandeling, ook transfer van virale immuniteit worden overwogen. * **Passieve CMV-immunisatie:** Toediening van CMV-specifieke antistoffen biedt directe bescherming maar is niet genezend bij intracellulaire pathogenen. * **CMV-specifieke T-cel transfer:** * **Via stamceltransplantatie:** Vereist HLA-identieke donoren en is niet voor alle patiënten geschikt. * **Isolatie van CMV-specifieke T-cellen:** * **Op basis van HLA-tetrameren:** Bijvoorbeeld HLA-A2 met een immunodominant CMV-peptide. Voordeel is gemakkelijke isolatie, maar is beperkt tot HLA-A2+ patiënten en isoleert enkel CD8+ T-cellen. * **Op basis van IFN-γ productie na stimulatie met CMV-peptide:** Voordeel is dat zowel CD4+ als CD8+ T-cellen kunnen worden geïsoleerd en het is voor alle patiënten bruikbaar. Nadeel is de omslachtige celisolatie. Een paar duizend cellen per kilogram lichaamsgewicht kunnen reeds voldoende zijn voor genezing. Antistoffen kunnen van elke donor aan elke patiënt worden toegediend, terwijl T-cellen HLA-antigenen moeten delen voor optimale werking en tolerantie. --- # Monoklonale antistoffen en hun modificaties Dit onderwerp behandelt de productie, ontwikkeling en toepassingen van monoklonale antistoffen, inclusief verschillende varianten en hun therapeutische relevantie. ### 2.1 Productie en classificatie van monoklonale antistoffen Monoklonale antistoffen (mAbs) zijn een specifieke groep antilichamen die slechts één epitoop op een antigeen herkennen en binden. Ze worden geproduceerd door een enkele klonale populatie van B-cellen. #### 2.1.1 Klassieke productie (hybridoomtechniek) De klassieke methode voor de productie van monoklonale antistoffen, voornamelijk bij muizen, omvat de volgende stappen: * **Immunisatie:** Een dier (bv. muis) wordt geïmmuniseerd met het gewenste antigeen. * **Isolatie van B-cellen:** B-cellen worden geïsoleerd uit het beenmerg of de milt van het geïmmuniseerde dier. * **Fusie met myeloomcellen:** De geïsoleerde B-cellen worden gefuseerd met een maligne plasmacel (myeloomcel) die zelf geen antistoffen produceert. Dit resulteert in hybride cellen genaamd hybridoomcellen. * **Selectie van hybridoomcellen:** De hybridoomcellen zijn sneldelende cellen die de antistof produceren die door de oorspronkelijke B-cel werd aangemaakt. Specifieke selectiemethoden worden gebruikt om de gewenste hybridoomlijn die de specifieke antistof produceert, te isoleren. #### 2.1.2 Soorten monoklonale antistoffen en hun oorsprong Afhankelijk van de mate van humaan versus muizencomponenten worden monoklonale antistoffen geclassificeerd: * **Muriene antistoffen (suffix: -o- of -e-):** Deze antistoffen zijn volledig afkomstig van muizen. Bij toediening aan mensen kunnen ze immunogene reacties opwekken (het lichaam maakt antistoffen tegen deze "vreemde" antistoffen), wat hun therapeutische werkzaamheid kan beperken. * **Chimerische antistoffen (suffix: -xi-):** Bij deze antistoffen zijn de variabele regio's (V$_{H}$ en V$_{L}$ domeinen), die verantwoordelijk zijn voor antigenbinding, van muizenherkomst. De constante regio's zijn humaan. Dit vermindert de immunogeniciteit vergeleken met muriene antistoffen. De keuze van het humaan isotype hangt af van het gewenste effect, zoals Fc-receptorbinding of complementactivatie. * **Gehumaniseerde antistoffen (suffix: -zu-):** Bij deze variant zijn alleen de complementair-bepalende regio's (CDR's) van de variabele ketens afkomstig van muizen. De rest van de antistof (frame regions en constante regio's) is humaan. Dit resulteert in een nog verder gereduceerde immunogeniciteit. * **Humaan antistoffen (suffix: -u-):** Deze antistoffen zijn volledig humaan. Hoewel technisch moeilijker te produceren (door het ontbreken van opzettelijke immunisatie van muizen), bieden ze de laagste immunogeniciteit. * **Fusion-eiwitten (suffix: -cept):** Dit zijn geen pure antistoffen, maar eiwitten die ontstaan door de fusie van een receptor met het constante gedeelte van een antistof. #### 2.1.3 Suffixen en hun betekenis De suffixen in de naamgeving van monoklonale antistoffen geven hun oorsprong of aard aan: * `-ximab`: Chimeer (bv. Rituximab) * `-zumab`: Gehumaniseerd (bv. Trastuzumab) * `-mumab`: Humaan (bv. Adalimumab) * `-cept`: Fusie-eiwit (bv. Etanercept) > **Tip:** Onthoud de suffixen goed, ze geven cruciale informatie over de herkomst en mogelijke immunogeniciteit van het antistofpreparaat. ### 2.2 Toepassingen van monoklonale antistoffen Monoklonale antistoffen hebben een breed scala aan toepassingen in diagnostiek en therapie, met name in de oncologie en auto-immuunziekten. #### 2.2.1 Therapeutische toepassingen Monoklonale antistoffen kunnen op verschillende manieren therapeutisch effect sorteren: * **Neutralisatie van cytokinen of groeifactoren:** Antistoffen die gericht zijn tegen ontstekingsbevorderende moleculen zoals TNF-alfa, IL-1, IL-6 of IL-23 kunnen worden gebruikt bij auto-immuunziekten (bv. reumatoïde artritis, psoriasis). * **Cytotoxiciteit induceren:** * **Antilichaam-afhankelijke cel-gemedieerde cytotoxiciteit (ADCC):** Antistoffen binden aan tumorcellen en activeren NK-cellen, die vervolgens de tumorcel doden. * **Complementafhankelijke cytotoxiciteit (CDC):** Antistoffen kunnen het complementsysteem activeren, wat leidt tot lysis van de doelcel. Dit is echter minder effectief tegen lichaamscellen vanwege de aanwezigheid van natuurlijke complementinhibitoren. * **Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP):** Macrophages fagocyteren de met antistoffen opsoniseerde tumorcellen. Dit is een belangrijk mechanisme bij antistoffen zoals Rituximab (anti-CD20). * **Blokkeren van celoppervlaktereceptoren:** Antistoffen kunnen receptoren op celoppervlakken blokkeren, waardoor celgroei of signaaltransductie wordt geremd. Voorbeelden zijn antistoffen gericht tegen CD20 op B-cellen (wat leidt tot apoptose van B-cellen) of HER2 op borstkankercellen. * **T-cel engagers (bispecifieke antistoffen):** Deze antistoffen hebben twee bindingsplaatsen: één voor een tumorantigeen en één voor het CD3-complex op T-cellen. Dit heroriënteert T-cellen naar de tumorcellen, waardoor de tumor wordt aangevallen ("redirected T-cells"). Een voorbeeld hiervan is Blinatumomab (anti-CD19). #### 2.2.2 Engineering van antilichamen en hun fragmenten Om de therapeutische eigenschappen van antistoffen te optimaliseren, worden verschillende modificaties en fragmenten gebruikt: * **Fragment antigen binding (Fab):** Bestaat uit de variabele (V$_{H}$ en V$_{L}$) en de eerste constante regio van een antistof. Het behoudt de antigenbindingscapaciteit. * **Single-chain variable fragment (scFv):** Een genetisch gemanipuleerd fragment waarbij de V$_{H}$ en V$_{L}$ domeinen covalent aan elkaar zijn gekoppeld. * **F(ab')$_{2}$ fragment:** Twee Fab-fragmenten die met elkaar verbonden zijn door disulfidebruggen. * **V$_{HH}$ immunoglobulines (Camelids):** Antilichamen van kamelen en lama's hebben een unieke structuur waarbij het Fv-domein alleen uit een V$_{H}$ domein bestaat (V$_{HH}$). Dit maakt de productie van specifieke antistoffen eenvoudiger. * **Bispecifieke antistoffen:** Antistoffen die twee verschillende antigenen kunnen binden, vaak gebruikt om T-cellen te richten op tumorcellen. #### 2.2.3 Chimere antigeenreceptoren (CARs) CARs zijn kunstmatige receptoren die op T-cellen kunnen worden tot expressie gebracht om ze te richten op tumorcellen. * **Eerste generatie CARs:** Bevatten een extracellulair scFv-gedeelte gekoppeld aan de CD3-signaleringssequentie. Ze kunnen tumorcellen doden, maar hebben een beperkt overlevingsvermogen *in vivo*. * **Tweede generatie CARs:** Naast de CD3-sequentie bevatten ze ook een costimulatoire sequentie (bv. CD28 of 4-1BB). Dit zorgt voor activatie, proliferatie en langdurige overleving van de T-cellen na antigenbinding. > **Tip:** CAR-T therapie is een krachtige vorm van immuuntherapie, maar kan gepaard gaan met ernstige neveneffecten zoals een cytokinestorm, die intensieve zorg vereist en behandeld kan worden met anti-IL6 antistoffen. ### 2.3 Monoklonale antistoffen in diagnostiek Monoklonale antistoffen zijn essentieel voor diverse diagnostische technieken: #### 2.3.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA is een veelgebruikte methode om de aanwezigheid van specifieke eiwitten (bv. antigenen, antistoffen, hormonen) in een monster te detecteren en te kwantificeren. Het principe berust op de specifieke binding van antistoffen aan antigenen, waarbij een enzymgekoppeld antilichaam zorgt voor een detecteerbare kleurreactie na toevoeging van een substraat. #### 2.3.2 Flowcytometrie (fluorescentie-geactiveerde cel sortering) Flowcytometrie maakt gebruik van gelabelde monoklonale antistoffen om cellen te identificeren, te kwantificeren en te sorteren op basis van hun celoppervlaktemarkers. Cellen worden, gelabeld met fluorescerende antistoffen (bv. gericht tegen CD3, CD20, CD56), één voor één door een laserstraal geleid. De fluorescentie die wordt uitgezonden, wordt gedetecteerd, waardoor een gedetailleerd profiel van de celpopulatie kan worden verkregen. #### 2.3.3 Detectie van rode bloedcelantistoffen Bij de diagnose van hemolytische ziekten, zoals hemolytische ziekte van de pasgeborene (bv. door rhesus-incompatibiliteit), worden monoklonale antistoffen gebruikt in de directe Coombs-test. Hierbij wordt een anti-humaan IgG antistof toegevoegd aan rode bloedcellen van de patiënt. Indien deze cellen beladen zijn met IgG-antistoffen, zullen ze agglutineren, wat duidt op de aanwezigheid van IgG op het celoppervlak. ### 2.4 Modificaties en nieuwe ontwikkelingen * **CiteSeq:** Antistoffen gelabeld met oligonucleotiden voor single-cell analyse en transcriptomics, waardoor tot wel 250 antistoffen tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd. * **Single cell transcriptomics:** Techniek waarbij RNA van individuele cellen wordt gesequeneerd, vaak in combinatie met antilichaambinding voor cellulaire fenotypering. ### 2.5 Preventie van immunisatie Passieve immunisatie met anti-RhD-antistoffen bij rhesus-negatieve moeders is een effectieve strategie om hemolytische ziekten van de pasgeborene te voorkomen. De toediening van deze antistoffen voorkomt dat de moeder immuun wordt tegen het RhD-antigeen van het foetale bloed dat in haar circulatie terechtkomt. Dit is een vorm van immunomodulatie waarbij een inhibitoire Fc-receptor op B-cellen wordt geactiveerd. --- # Diagnostische technieken gebaseerd op antilichamen Dit gedeelte behandelt de principes en toepassingen van immunologische technieken zoals ELISA en flowcytometrie voor de detectie en kwantificering van moleculen en de analyse van cellen. ### 3.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA is een fundamentele techniek voor het meten of detecteren van specifieke eiwitten, en vormt de basis voor diverse diagnostische methoden. Het kan worden gebruikt voor onder andere virusdetectie, antilichaamdetectie, specifieke antilichaamdetectie, hormoonmetingen en toxinedetectie. **Werkingsprincipe van een indirecte ELISA (voorbeeld: detectie van antistoffen tegen HBV):** 1. **Antigeen coating:** Een specifieke antigeen (bijvoorbeeld HBsAg voor Hepatitis B) wordt aan de wand van een plastic putje in een ELISA-plaat gecoat. 2. **Toevoegen van patiëntenserum:** Serum van de patiënt wordt toegevoegd. Als de patiënt beschermd is tegen HBV of hiervan hersteld is, zullen er antistoffen in het serum aanwezig zijn die aan het gecoate antigeen binden. 3. **Wassen:** Na een incubatieperiode wordt de plaat gewassen om ongebonden serumcomponenten te verwijderen. Alleen de antistoffen die aan het antigeen gebonden zijn, blijven achter. 4. **Detectie met enzym-gelabeld antilichaam:** Een secundair antilichaam, dat specifiek is voor humane immunoglobulines en gekoppeld is aan een enzym (bijvoorbeeld een geel driehoekje in de illustratie), wordt toegevoegd. Dit secundaire antilichaam bindt aan de reeds gebonden patiënt-antilichamen. 5. **Wassen:** De plaat wordt opnieuw gewassen om ongebonden enzym-gelabelde antilichamen te verwijderen. 6. **Substraat toevoeging:** Een specifiek substraat voor het enzym wordt toegevoegd. Als het enzym aanwezig is (door binding van het secundaire antilichaam), zal een kleurreactie optreden. De positieve putjes kleuren, terwijl de negatieve putjes kleurloos blijven. ELISA is, naast PCR en kweek, een derde belangrijke diagnostische testprincipe in de microbiologie. ### 3.2 Flowcytometrie (FACS - Fluorescentie-geactiveerde cel sortering) Flowcytometrie, ook wel FACS genoemd, is een techniek die wordt gebruikt voor het kwantificeren en analyseren van cellen, zoals T-cellen, B-cellen en NK-cellen in bloed, gebaseerd op de detectie van celoppervlaktemarkers. **Werkingsprincipe:** 1. **Voorbehandeling:** Bloed wordt voorbehandeld door monoklonale antistoffen, gelabeld met fluorescerende stoffen, toe te voegen. Deze antistoffen zijn specifiek gericht tegen celoppervlakte-eiwitten (bijvoorbeeld anti-CD3 voor T-cellen, anti-CD20 voor B-cellen, anti-CD56 voor NK-cellen). Elk antilichaam is gelabeld met een fluorescerende stof die bij excitatie een specifieke kleur uitzendt (bijvoorbeeld rood, groen, blauw). 2. **Binding:** De gelabelde antistoffen binden selectief aan de corresponderende celtypen in het bloed. 3. **Detectie en analyse:** De cellen passeren één voor één door een laserstraal. De laser exciteert de fluorescerende labels op de antistoffen, waardoor deze licht uitzenden in specifieke golflengtes. Detectoren vangen dit uitgezonden licht op. 4. **Visualisatie:** De verkregen data wordt vaak weergegeven in een driedimensionale plot, waarbij elk punt een individuele cel vertegenwoordigt en de positie van het punt informatie geeft over de fluorescentie (en dus de expressie van de celoppervlaktemarkers). **Geavanceerde toepassingen van flowcytometrie:** * **CiteSeq:** Antistoffen zijn hierbij gelabeld met oligonucleotiden. Cellen worden sequentieel verwerkt en gesequeneerd, wat de labelling met honderden antistoffen tegelijk mogelijk maakt. * **Single-cell transcriptomics:** Cellen worden individueel verpakt in druppeltjes, waarna het RNA van elke cel wordt gesequeneerd. Dit levert gedetailleerde informatie op over de genetische expressie van individuele cellen. ### 3.3 Diagnostiek van hemolytische anemie door rode bloedcel destructie Deze vorm van anemie kan worden veroorzaakt door de aanmaak van antistoffen tegen rode bloedcellen, met name tijdens zwangerschappen waarbij de bloedgroepen van moeder en kind niet compatibel zijn (bijvoorbeeld Rhesus-incompatibiliteit). **Mechanisme:** * Bij een Rhesus-negatieve moeder met een Rhesus-positief kind kunnen antistoffen (meestal IgG) worden gevormd tegen het Rhesus D-antigeen. * Deze antistoffen kunnen bij een volgende zwangerschap de placenta passeren en binden aan de rode bloedcellen van het kind. * De rode bloedcellen van het kind worden vervolgens gefagocyteerd door macrofagen in de milt, wat leidt tot hemolyse en anemie. **Diagnose:** * De **directe Coombs-test** is hierbij essentieel. Bij deze test worden de rode bloedcellen van het kind direct onderzocht. * Als er IgG-antistoffen aan de rode bloedcellen gebonden zijn, zullen deze op zichzelf niet agglutineren. * Na toevoeging van een anti-IgG antilichaam (bijvoorbeeld konijn-anti-humaan IgG), zullen de rode bloedcellen wel agglutineren, wat de aanwezigheid van gebonden antistoffen bevestigt. **Preventie van hemolytische ziekte van de pasgeborene:** * Passieve immunisatie met anti-RhD antistoffen bij Rhesus-negatieve zwangere vrouwen, vlak voor en na de bevalling, voorkomt de aanmaak van allo-antistoffen tegen het RhD-antigeen van het kind. Dit mechanisme is gebaseerd op het blokkeren van B-cel activiteit via inhibitore Fc-receptoren. ### 3.4 Toepassingen van antilichamen in de diagnostiek en therapie Antilichamen, zowel polyklonaal als monoklonaal, spelen een cruciale rol in diagnostische technieken en therapeutische benaderingen. #### 3.4.1 Polyklonale antistoffen * **Productie:** Gemaakt uit serum van een geïmmuniseerd individu of dier. * **Samenstelling:** Een mengsel van antilichamen gericht tegen verschillende antigenen of epitopen van een specifiek antigeen. Ze kunnen van verschillende isotypes (bv. IgG1, IgG2) zijn. * **Gebruik:** * Algemene immunoglobulinepreparaten (uit gezonde donoren) bevatten antistoffen tegen frequent voorkomende pathogenen. * Specifieke immunoglobulines (van hyperimmune/gevaccineerde donoren) worden gebruikt voor passieve immunisatie, bijvoorbeeld anti-D, anti-HBV, anti-tetanus, anti-rabiës en anti-CMV. #### 3.4.2 Monoklonale antistoffen * **Productie:** Geproduceerd door één enkele B-cel klone, vaak via hybridoomtechnologie (fusie van B-cellen met myeloomcellen). * **Samenstelling:** Bevatten slechts één type antistof dat specifiek één epitoop bindt. Productiebatches zijn daardoor consistent. * **Vermenselijking:** Murine (muis) monoklonale antistoffen kunnen bij mensen immunogene reacties oproepen. Om dit te vermijden, worden ze 'vermenselijkt': * **Chimere antistoffen:** Het variabele deel (V$_H$ en V$_L$) is van muis, de rest is humaan. * **Gehumaniseerde antistoffen:** Alleen de complementair bepalende regio's (CDR's) van de variabele domeinen zijn van muis; de rest is humaan. * **Humaane monoklonale antistoffen:** Technisch moeilijker te produceren omdat gerichte immunisatie van mensen niet mogelijk is. * **Nomenclatuur:** Einde van de naam geeft de oorsprong aan: * `-iximab`: chimere antistof * `-zumab`: gehumaniseerde antistof * `-mumab`: humaan * `-cept`: fusie-eiwit (receptor-constant deel antistof) * **Doelen:** Gericht tegen specifieke celoppervlaktemarkers (bv. CD20, HER2, CD19), checkpoints, of cytokines (bv. IL-1, IL-6, TNF). #### 3.4.3 Antilichaam engineering Dit omvat modificaties van antilichamen om hun functionaliteit te verbeteren of nieuwe toepassingen mogelijk te maken. * **Fragmenten:** * **Fv (fragment variable):** Kleinste deel voor antigenbinding, bestaat uit V$_H$ en V$_L$. * **scFv (single-chain fragment variable):** Een Fv fragment met een flexibele peptideketen. * **Fab (fragment antigen binding):** Kan enzymatisch verkregen worden. * **F(ab')$_2$ fragment:** Twee Fab fragmenten verbonden door cystinebruggen. * **V$_{\text{H}}$H immunoglobulines (bij kameel/lama):** V$_{H}$ domein zonder V$_{L}$ domein, vereenvoudigt genetische klonering. * **Bispecifieke antistoffen:** Hebben twee verschillende bindingspecificiteiten. * **BiTEs (Bispecific T cell Engagers):** Binden tegelijkertijd aan een tumor-specifiek antigeen en aan het CD3-complex op T-cellen, waardoor T-cellen gericht worden op de tumorcel ("redirected T cells"). Dit induceert tumorceldodende activiteit. #### 3.4.4 T-cel engineering voor therapie T-cellen kunnen genetisch gemodificeerd worden om tumorspecifieke receptoren tot expressie te brengen. * **Transgene TCR (T-celreceptor):** Expressie van een tumorspecifieke TCR. Deze therapie is vaak HLA-afhankelijk en kan cytoplasmatische of nucleaire antigenen targetten. * **CAR (Chimere Antigeen Receptor):** Een synthetische receptor met eigenschappen van een antistof. * **Werkingsprincipe:** Bestaat uit een scFv (variabel deel van een antistof) dat een tumorantigeen bindt, gekoppeld aan een transmembraanpeptide en een signaaltransducerende sequentie (bv. CD3). * **Eerste generatie CARs:** Bevatten alleen CD3 signalering. Kunnen tumorcellen doden, maar overleven en prolifereren slecht in vivo. * **Tweede generatie CARs:** Bevatten naast CD3 signalering ook costimulatoire sequenties (bv. CD28). Dit leidt tot activatie, proliferatie en langdurige overleving van de T-cel, wat ze tot krachtige effectorcellen maakt. * **Voordelen CARs:** Niet HLA-afhankelijk, kunnen membranaire antigenen targetten. * **Nadelen CARs:** * **"On target, off tumor" effect:** Het doelantigeen kan ook op gezonde cellen voorkomen (bv. CD20 op gezonde B-cellen bij behandeling van B-cel lymfomen). * **Cytokine storm:** Na infusie kan een levensbedreigende reactie optreden, behandeld met bv. anti-IL6 antistoffen. ### 3.5 Overige diagnostische en therapeutische toepassingen * **Half-life extending (HLE):** Modificaties om de verblijftijd van antistoffen in het lichaam te verlengen. * **Overdracht van virale immuniteit:** * **Passieve immunisatie:** Toediening van CMV-specifieke antistoffen kan helpen bij transplantatiepatiënten, maar is niet altijd curatief bij intracellulaire pathogenen. * **CMV-specifieke T-cel transfer:** Kan curatief zijn, maar vereist HLA-identieke donoren en is technisch complexer dan antistoftransfer. Isolatie kan gebeuren op basis van HLA-tetrameren (beperkt tot specifieke HLA-typen) of IFN-$\gamma$ productie (bruikbaar voor alle patiënten, maar omslachtiger). > **Tip:** Bij het bestuderen van antilichaamgebaseerde diagnostische technieken is het essentieel om het principe van antigen-antilichaam interactie te begrijpen, en hoe deze interactie wordt gedetecteerd en gekwantificeerd door middel van enzymen, fluorescentie of celbinding. --- # Therapieën met gemodificeerde T-cellen Dit onderwerp verkent de modificatie van T-cellen met transgenen T-celreceptoren (TCRs) en chimerische antigeenreceptoren (CARs) voor gerichte tumortherapie, inclusief de mechanismen, voordelen en risico's zoals cytokine storm. ### 4.1 Introductie tot T-celtherapie met gemodificeerde receptoren Perifere bloed T-cellen beschikken over een eigen T-celreceptor (TCR) en zijn doorgaans CD4 of CD8 positief. Deze cellen kunnen genetisch gemodificeerd worden om specifieke antigenen te herkennen, hetzij via transgene T-celreceptoren of chimerische antigeenreceptoren. ### 4.2 Transgene T-celreceptoren (TCRs) Transgene TCR-therapie behelst de expressie van een kunstmatige, tumor-specifieke TCR. Een belangrijk kenmerk van deze therapie is dat de herkenning van antigenen vaak HLA-afhankelijk is. Een veelvoorkomende beperking is de HLA-restrictie, bijvoorbeeld met HLA-A2, wat de toepasbaarheid kan beperken. TCRs kunnen zowel cytoplasmatische als nucleaire antigenen targetten. ### 4.3 Chimerische antigeenreceptoren (CARs) Chimerische antigeenreceptoren (CARs) zijn kunstmatige receptoren die eigenschappen van antistoffen combineren met signaaltransducerende domeinen. #### 4.3.1 Structuur en mechanisme van CARs Een typische CAR bestaat uit een extracellulair deel, een zogenaamd single-chain variable fragment (scFv), dat de variabele regio's van de zware en lichte keten van een antistof bevat. Dit scFv is gericht tegen een specifiek tumor-antigeen en is verbonden met een flexibel peptide. Het voordeel van CARs is dat de antigeenherkenning niet HLA-gerestricteerd is en dat ze membraan-gebonden antigenen kunnen waarnemen. Het extracellulaire deel is gekoppeld aan een transmembraan peptide, gevolgd door een intracellulair signaaltransducerend domein. #### 4.3.2 Generaties CARs * **Eerste generatie CARs:** Deze bevatten voornamelijk het CD3 signaaltransducerende sequentie. Hoewel ze tumorcellen kunnen doden, hebben ze een beperkt overlevingsvermogen *in vivo* en daardoor een lage activiteit. * **Tweede generatie CARs:** Deze tweede generatie CARs zijn verbeterd door de toevoeging van een costimulatoir domein, zoals CD28 of 4-1BB, naast de CD3 signalering. Bij antigeenbinding wordt hierdoor zowel TCR signalering als costimulatie geïnduceerd. Dit leidt tot activatie, proliferatie en cytokinesecretie van de T-cellen, waardoor ze effectiever zijn in het doden van tumorcellen en langer *in vivo* kunnen overleven. > **Tip:** De toevoeging van costimulatoire domeinen in tweede generatie CARs is cruciaal voor de proliferatie en het langdurige overleven van de gemodificeerde T-cellen, wat resulteert in een krachtigere antitumorale respons. #### 4.3.3 "On target, off tumor" effecten en complicaties De tumor dodende werking van CAR-T therapie wordt aangeduid als een "on target, on tumor" effect. Echter, er kan ook sprake zijn van een "on target, off tumor" neveneffect. Dit treedt op wanneer het getargete antigen ook aanwezig is op gezonde cellen. Een klassiek voorbeeld is het targeten van CD20, dat ook voorkomt op gezonde B-cellen, wat kan leiden tot de eliminatie van deze cellen. Een ernstige en potentieel dodelijke complicatie na de infusie van CAR-T cellen is een **cytokine storm**. Dit is een overmatige immuunrespons gekenmerkt door de massale vrijlating van cytokinen. > **Tip:** Bij een cytokine storm is intensieve medische zorg vereist. Behandeling met anti-IL-6 antistoffen kan waardevol zijn in de beheersing van deze complicatie. #### 4.3.4 Voorbeelden van CAR-T toepassingen CAR-T celtherapie wordt met name ingezet bij de behandeling van hematologische maligniteiten, zoals B-cel lymfomen en leukemieën die CD20-positief zijn. Ook bij solide tumoren, zoals borstkanker gericht tegen HER2, wordt deze technologie onderzocht. #### 4.3.5 Technologische aspecten van CAR-T * **scFv:** De single-chain variable fragment (scFv) vormt het antigeenbindende deel van de CAR. * **Costimulatory domains:** Domeinen zoals CD28 en 4-1BB verlenen de T-cel extra activatiesignalen, cruciaal voor proliferatie en overleving. * **LAT (Linker for activation of T cells) en ZAP70 (ζ chain-associated protein kinase 70 kDa):** Dit zijn intracellulaire signaalmoleculen die betrokken zijn bij de T-cel activatiecascade na binding van de CAR aan het antigeen. * **MHC-onafhankelijke herkenning:** CARs targetten antigenen zonder de noodzaak van Major Histocompatibility Complex (MHC) presentatie, wat de toepasbaarheid vergroot. * **Endogene TCR expressie:** Standaard T-cellen behouden hun endogene TCR expressie, tenzij dit actief wordt onderdrukt. > **Example:** Blinatumomab is een voorbeeld van een bispecifieke T-cel engager (BiTE) die, hoewel geen traditionele CAR, de principes van T-cel retargeting toepast door gericht te zijn tegen CD19 op tumorcellen en CD3 op T-cellen. Dit resulteert in het "omleiden" van T-cellen naar de tumor voor killing. ### 4.4 Voordelen en beperkingen van T-celtherapie met gemodificeerde receptoren **Voordelen:** * **Gerichte antitumorale activiteit:** Zowel transgene TCRs als CARs maken T-cellen specifiek voor tumorantigenen, wat leidt tot een gerichte aanval op kankercellen. * **Potentieel voor langdurige remissie:** Met name tweede generatie CAR-T cellen kunnen zich vermenigvuldigen en langdurige immuniteit bieden. * **Flexibiliteit:** De moleculaire engineering maakt het mogelijk om T-cellen aan te passen aan diverse tumoren en antigenen. **Beperkingen en risico's:** * **Immunogeniciteit van xenogene componenten:** Muizen-afgeleide antistoffen in vroege CAR-constructies konden immuunreacties opwekken bij patiënten. * **HLA-restrictie (bij TCRs):** Beperkt de toepasbaarheid tot patiënten met specifieke HLA-typen. * **"On target, off tumor" toxiciteit:** Het risico op schade aan gezonde weefsels die het doelantigeen tot expressie brengen. * **Cytokine storm:** Een potentieel levensbedreigende overmatige immuunreactie. * **Productiecomplexiteit en kosten:** De productie van gepersonaliseerde T-celtherapieën is complex en kostbaar. * **Moeilijkheden met intratumorale penetratie en overleving:** Vooral bij solide tumoren kan het lastig zijn voor T-cellen om de tumor effectief te infiltreren en daar te overleven. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Immunoglobulines | Immuunglobulines, ook wel gammaglobulines genoemd, zijn opgezuiverde antistoffen van het IgG-type, afkomstig uit het bloed van donoren. Ze kunnen polyvalent zijn (bevatten antistoffen tegen veelvoorkomende pathogenen) of specifiek (bijvoorbeeld tegen toxines of specifieke antigenen zoals Anti-D). | | Polyklonale antistoffen | Dit zijn antistoffen die worden geproduceerd uit het serum van een geïmmuniseerd individu. Ze vormen een mengsel van antilichamen die gericht zijn tegen verschillende antigenen van interesse en mogelijk ook tegen andere, niet-relevante antigenen. Ze kunnen ook verschillende isotypes en epitopen herkennen. | | Monoklonale antistoffen | Monoklonale antistoffen zijn een homogene populatie van antistoffen die alle exact hetzelfde antigeen-bindende epitop herkennen. Ze worden geproduceerd door een enkele klonale cel populatie, vaak verkregen via hybridomen, en bestaan uit één zware en één lichte keten. | | Chimerische antistoffen | Chimerische antistoffen zijn genetisch gemodificeerde antistoffen die delen van zowel menselijke als muizenantilichamen bevatten. Typisch hebben ze het variabele deel (VH en VL domein) van muizenantilichamen en het constante deel van humane antilichamen, wat de immunogeniciteit vermindert. | | Gehumaniseerde antistoffen | Bij gehumaniseerde antistoffen zijn slechts de complementaire bepalende regio's (CDR's) van de muizenantilichamen behouden, terwijl de rest van de antistofhumane oorsprong is. Dit resulteert in een nog grotere reductie van immunogeniciteit vergeleken met chimerische antistoffen. | | ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) | ELISA is een veelzijdige techniek die gebruikt wordt om de aanwezigheid of concentratie van specifieke eiwitten, antilichamen of antigenen in een monster te detecteren. Het maakt gebruik van antilichamen gelabeld met een enzym dat een kleurreactie veroorzaakt na toevoeging van een substraat. | | Flowcytometrie (FACS) | Flowcytometrie, ook bekend als Fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS), is een techniek die gebruikt wordt om fysieke en chemische kenmerken van individuele cellen te meten terwijl ze door een laserstraal stromen. Cellen kunnen worden gekwantificeerd en gesorteerd op basis van fluorescerende markers. | | Passieve immunisatie | Passieve immunisatie is een vorm van immuniteit die wordt verkregen door de toediening van antistoffen, bijvoorbeeld verkregen uit het serum van een donor. Deze antistoffen bieden onmiddellijke bescherming maar de immuniteit is tijdelijk omdat het lichaam zelf geen antistoffen produceert. | | Antilichaam engineering | Antilichaam engineering is het proces van het modificeren van antistoffen om hun eigenschappen te verbeteren of nieuwe functies te creëren. Dit kan variëren van het creëren van chimerische of gehumaniseerde antistoffen tot het ontwerpen van bispecifieke antistoffen of fragmenten met specifieke therapeutische doelen. | | Transgene T-celreceptoren (TCRs) | Transgene T-celreceptoren zijn kunstmatig ingebrachte T-celreceptoren die een hogere specificiteit en affiniteit hebben voor tumorantigenen. Deze gemodificeerde T-cellen kunnen gericht tumorcellen herkennen en elimineren, maar zijn vaak afhankelijk van HLA-restrictie. | | Chimerische antigeen receptoren (CARs) | Chimerische antigeen receptoren zijn kunstmatig ontworpen receptoren die extracellulaire antigeen-bindende domeinen combineren met intracellulaire signaaldomeinen van T-cellen. Ze stellen T-cellen in staat tumorantigenen te herkennen op een MHC-onafhankelijke manier, wat een voordeel is voor de therapie. | | Cytokine storm | Een cytokine storm is een ernstige, potentieel dodelijke immuunreactie die wordt gekenmerkt door een massale en ongecontroleerde afgifte van pro-inflammatoire cytokines door immuuncellen. Dit kan optreden na bepaalde therapieën zoals CAR-T celtherapie en vereist intensieve medische zorg. |