HfdstIB_Microscopie_1BAB&B2025NEW.pdf

# De basisprincipes van microscopie Dit deel van de studiehandleiding behandelt de fundamentele concepten van vergroting, resolutie en contrast, welke essentieel zijn voor het begrijpen van de mogelijkheden van microscopie. Deze principes gelden zowel voor lichtmicroscopie als elektronenmicroscopie [8](#page=8) [9](#page=9). ### 1.1 Vergroting Vergroting stelt ons in staat om objecten die kleiner zijn dan de limiet van het menselijk oog, die ongeveer 100 micrometer bedraagt, zichtbaar te maken. Het menselijk oog kan objecten scherpstellen van 20 cm tot 6 meter en de hoeveelheid invallend licht reguleren voor optimaal contrast in verschillende omstandigheden, maar kan niet verder vergroten dan de inherente limiet [10](#page=10). Het proces van vergroting wordt mogelijk gemaakt door lenzen [11](#page=11). #### 1.1.1 Lenzen en objectieven Lenzen vormen het "hart" van een microscoop. Objectieven zijn complexe lenzen, bestaande uit meerdere lenzen, en bevatten informatie over de vergroting, het oplossend vermogen en correcties voor sferische en chromatische aberraties [12](#page=12). Vergroting alleen is echter niet voldoende om fijne details van objecten te detecteren. Er is een objectief met een hoge resolutie nodig om fijne details te kunnen onderscheiden [13](#page=13). ### 1.2 Resolutie Resolutie, of oplossend vermogen, is de kortste afstand tussen twee punten die nog als afzonderlijke entiteiten kunnen worden onderscheiden. Het is het vermogen om fijne details in een object te onderscheiden [15](#page=15). #### 1.2.1 Fysische eigenschappen van licht en diffractie De beperking in resolutie wordt deels bepaald door de fysische eigenschappen van licht. Een lichtpuntje is geen perfect punt; dit komt door diffractie. Diffractie is het proces waarbij lichtgolven buigen na het passeren van een obstakel of een klein gaatje. Het concept van diffractie is cruciaal voor het begrijpen van resolutie [15](#page=15) [16](#page=16). Het beeld dat ontstaat na diffractie wordt het diffractiepatroon genoemd, ook wel de "point spread function" (PSF). De mate waarin we microscopische structuren van elkaar kunnen onderscheiden, hangt af van hoe deze diffractiepatronen zich gedragen bij nabijgelegen structuren. Overlappende structuren, ofwel veel diffractiepatronen die samenkomen, vereisen een goed oplossend vermogen om ze te kunnen scheiden [16](#page=16) [17](#page=17). #### 1.2.2 Het criterium van Abbe en numerieke apertuur De resolutie wordt bepaald door het criterium van Abbe. Een sleutelfactor hierin is de numerieke apertuur (NA) [18](#page=18). De numerieke apertuur (NA) vertegenwoordigt het vermogen van het objectief om licht te verzamelen en fijne details te onderscheiden. Het wordt bepaald door de apertuur (hoek) van de objectief lens [19](#page=19). Hoe hoger de NA van een objectief lens, hoe kleiner de waarde van `d` (de minimale oplosbare afstand) en hoe beter de resolutie. Het gebruik van immersie-olie tussen het objectief en het preparaat kan de NA verhogen [20](#page=20). ### 1.3 Contrast Contrast is essentieel om structuren zichtbaar te maken en te onderscheiden. Inspiratie hiervoor kan uit de natuur worden gehaald, waar contrast wordt gecreëerd door verschillen in kleur en intensiteit [22](#page=22) [23](#page=23). #### 1.3.1 Moleculaire hulpmiddelen voor contrast Verschillende moleculaire hulpmiddelen kunnen worden gebruikt om contrast te creëren [24](#page=24): * **Chromoforen:** Zorgen voor contrast in kleur en intensiteit. Dit wordt vaak bereikt door middel van kleuringen [24](#page=24). * **Fluoroforen:** Gebruikt in fluorescentiemicroscopie, zorgen voor contrast in kleur en intensiteit [24](#page=24). * **Zware metalen:** Gebruikt in elektronenmicroscopie, zorgen voor contrast in intensiteit [24](#page=24). > **Tip:** Hoewel helderveldmicroscopie, fluorescentiemicroscopie en elektronenmicroscopie verschillende methoden gebruiken, is het onderliggende principe van contrastcreatie vergelijkbaar [24](#page=24). --- # Overzicht van microscopietechnieken Dit overzicht presenteert de belangrijkste categorieën en technieken binnen zowel lichtmicroscopie als elektronenmicroscopie, met aandacht voor hun specifieke toepassingen en methodologieën [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ### 2.1 Lichtmicroscopie Lichtmicroscopie maakt gebruik van zichtbaar licht om beelden te creëren en omvat een breed scala aan technieken die verschillende aspecten van biologische structuren kunnen visualiseren [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). #### 2.1.1 Helderveldmicroscopie De basisvorm van lichtmicroscopie waarbij het specimen contrasteert met een heldere achtergrond [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). #### 2.1.2 Fasecontrastmicroscopie Deze techniek stelt gebruikers in staat om transparante specimens, zoals levende cellen, zichtbaar te maken door verschillen in brekingsindex om te zetten in helderheidsverschillen [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). #### 2.1.3 DIC-microscopie (Differentieel Interferentie Contrast) DIC-microscopie biedt een pseudo-3D-weergave van het specimen door interferentiepatronen te gebruiken die worden gegenereerd door licht dat door het monster gaat [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). #### 2.1.4 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende moleculen (fluorochroomen) die licht van een bepaalde golflengte absorberen en vervolgens licht van een langere golflengte uitzenden [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.1.4.1 Widefield microscopie (Breedveldmicroscopie) De meest basale vorm van fluorescentiemicroscopie, waarbij het hele veld van het specimen tegelijkertijd wordt verlicht [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.1.4.2 Confocale microscopie Confocale microscopie maakt gebruik van een speldepunt-apertuur om verstrooid licht van buiten het focusvlak te elimineren, wat resulteert in scherpere beelden en de mogelijkheid om optische coupes te maken [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.1.4.3 Live celbeeldvorming (Live cell imaging) Technieken die het mogelijk maken om dynamische biologische processen in levende cellen gedurende langere tijd te volgen [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.1.4.4 Lightsheet microscopie (Lichtbladmicroscopie) Bij deze techniek wordt het specimen verlicht door een dunne laag licht (een "lichtblad"), wat minimalisering van fototoxiciteit en snelle 3D-beeldvorming mogelijk maakt, vooral voor grotere monsters [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.1.4.5 Superresolutiemicroscopie Superresolutietechnieken overwinnen de diffractielimiet van lichtmicroscopie, waardoor structuren kleiner dan de golflengte van licht zichtbaar worden [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.1.4.6 Functionele microscopie Dit verwijst naar microscopische technieken die, naast structurele informatie, ook inzicht geven in de functionele activiteit van cellen of moleculen [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ### 2.2 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie gebruikt een bundel van elektronen in plaats van fotonen om beelden te genereren, wat resulteert in een veel hogere resolutie en vergroting dan lichtmicroscopie [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). #### 2.2.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Bij TEM wordt een dunne doorsnede van het monster doorboord door een elektronenbundel. De doorgelaten elektronen worden gedetecteerd om een beeld te vormen van de interne structuur van het monster [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). #### 2.2.2 Scannende elektronenmicroscopie (SEM) SEM scant het oppervlak van het monster met een elektronenbundel. Detectoren vangen de secundaire elektronen op die van het oppervlak worden gestoten, wat resulteert in beelden met een hoge resolutie van het oppervlaktemorfologie [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). #### 2.2.3 Volume EM (3D EM) Deze technieken maken het mogelijk om driedimensionale structuren te reconstrueren door een reeks tweedimensionale beelden te verwerven en deze samen te voegen [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.2.3.1 TEM-tomografie Een reconstructie van 3D-structuren verkregen door een TEM-monster onder verschillende hoeken te scannen [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.2.3.2 Serieel blokvlak (SBF) – SEM Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) is een techniek waarbij herhaaldelijk dunne lagen van een ingebed monster worden verwijderd en het oppervlak wordt gescand met SEM om opeenvolgende beelden te verkrijgen voor 3D-reconstructie [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ##### 2.2.3.3 Gefocuste ionenboon (FIB) – SEM Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) combineert de precisie van een gefocuste ionenbundel voor sequentieel afsnijden met SEM voor beeldvorming, wat leidt tot hoge resolutie 3D-reconstructies [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). ### 2.3 Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) CLEM combineert de functionele en lokalisatie-informatie van lichtmicroscopie met de hoge resolutie van elektronenmicroscopie om nauwkeurige correlaties te maken tussen cellulaire structuren en processen [85](#page=85). > **Tip:** Het kiezen van de juiste microscopietechniek hangt af van de aard van het specimen, de gewenste resolutie, en de specifieke biologische vraag die gesteld wordt [25](#page=25) [26](#page=26) [32](#page=32) [49](#page=49) [58](#page=58) [65](#page=65) [71](#page=71) [75](#page=75) [7](#page=7) [80](#page=80) [82](#page=82) [85](#page=85). --- # Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie is een krachtige techniek die gebruikmaakt van de eigenschappen van fluorescerende moleculen om structuren en processen binnen biologische monsters zichtbaar te maken met hoge specificiteit en gevoeligheid [33](#page=33). ### 3.1 Principes van fluorescentie Fluorescentie is een proces waarbij een molecuul (een fluorofoor) licht absorbeert bij een bepaalde golflengte en vervolgens licht uitzendt bij een langere golflengte. Dit fenomeen is gebaseerd op elektronische overgangen binnen het molecuul, zoals beschreven in het Jablonski-diagram. Wanneer een fluorofoor fotonen absorbeert, wordt een elektron naar een hogere energietoestand gebracht. Vervolgens valt het elektron terug naar de grondtoestand, waarbij de overtollige energie wordt uitgezonden als fluorescent licht. De energie van het geabsorbeerde foton is hoger dan die van het geëmitteerde foton, wat resulteert in een emissiegolflengte die langer is dan de excitatiegolflengte; dit verschil staat bekend als de Stokes-verschuiving [33](#page=33) [34](#page=34) [35](#page=35). Elke fluorofoor heeft een specifiek excitatiespectrum (de golflengten die het meest efficiënt worden geabsorbeerd) en emissiespectrum (de golflengten die het meest efficiënt worden uitgezonden). Deze spectra zijn kenmerkend voor de chemische structuur van de fluorofoor. Door fluoroforen met verschillende spectra te combineren, is het mogelijk om "multicolour" kleuringen uit te voeren, waarbij meerdere structuren tegelijkertijd in verschillende kleuren zichtbaar worden [36](#page=36). ### 3.2 Het creëren van fluorescerende monsters Om structuren of moleculen zichtbaar te maken met fluorescentiemicroscopie, wordt het monster voorzien van een fluorescerend label. Alleen de delen van het monster die dit label dragen, worden vervolgens gedetecteerd, waardoor de rest van de informatie, de context, onzichtbaar blijft. Er zijn verschillende methoden om monsters fluorescerend te maken [37](#page=37): * **Kleuring met fluorescerende kleurstoffen:** Specifieke fluorescerende kleurstoffen (fluoroforen) worden gebruikt die zich binden aan bepaalde structuren in zowel levende als gefixeerde monsters [37](#page=37). * **Immunokleuring met fluorescerende antilichamen:** Fluoroforen worden gekoppeld aan antilichamen die gericht zijn tegen een specifiek eiwit. Deze methode wordt doorgaans toegepast op gefixeerde monsters [37](#page=37). * **Genetische expressie van fluorescerende eiwitten:** Fluorescerende eiwitten worden genetisch gekoppeld aan het eiwit van interesse, waardoor deze eiwitten zelf gaan fluoresceren [37](#page=37). Voorbeelden van fluorescerende labels zijn DAPI (dat bindt aan DNA), anti-cytochroom C gekoppeld aan Alexa Fluor 633, en GFP-geëxtraheerde eiwitten zoals GFP-actine [38](#page=38). #### 3.2.1 Fluorescerende eiwitten Fluorescerende eiwitten, zoals het Groene Fluorescerende Eiwit (GFP) en Rode Fluorescerende Eiwitten (RFP) zoals dsRed, zijn belangrijke tools in de fluorescentiemicroscopie. GFP, oorspronkelijk geïsoleerd uit de *Aequorea victoria* kwal, is een eiwit van ongeveer 238 aminozuren en 30 kilodalton. De ontdekking en ontwikkeling ervan, met name door Roger Tsien, werd bekroond met de Nobelprijs voor Scheikunde in 2008. RFP's, zoals dsRed, zijn afkomstig uit koraalriffen. Door genetische modificaties kunnen eiwitten met nieuwe excitatie- en emissie-eigenschappen worden gecreëerd [39](#page=39). #### 3.2.2 Fluorescerende fusie-eiwitten Fluorescerende fusie-eiwitten worden tot expressie gebracht door de DNA-sequentie van een fluorescerend eiwit te koppelen aan de DNA-sequentie van het eiwit van interesse. Deze methode biedt diverse voordelen [40](#page=40): * Minder artefacten en aspecificiteit [40](#page=40). * Mogelijkheid om het fluorescerende construct tot expressie te brengen op specifieke locaties of in specifieke organen [40](#page=40). * Mogelijkheid om het eiwit van interesse te observeren in levende cellen of organismen [40](#page=40). Een voorbeeld hiervan is Drosophila Tau-GFP, dat wordt gebruikt om de lokalisatie en dynamiek van het tau-eiwit in levende cellen te bestuderen. Levende cellen kunnen zelfs meerdere fluorescerende fusie-eiwitten tot expressie brengen, wat complexe analyses mogelijk maakt [41](#page=41). ### 3.3 Widefield fluorescentiemicroscopie De widefield fluorescentiemicroscoop is een directe evolutie van de conventionele lichtmicroscoop, waarbij de witte lichtbron wordt vervangen door een fluorescente lichtbron (zoals een lamp of LED's). Het belangrijkste kenmerk van widefield microscopie zijn de optische filters die worden gebruikt om de gewenste excitatie- en emissiegolflengten te selecteren [42](#page=42) [43](#page=43). Een filterkubus bevat doorgaans drie componenten: een excitatie filter, een dichroïsche spiegel en een emissie filter. Het excitatie filter laat alleen de golflengten door die nodig zijn om de fluorofoor te exciteren. De dichroïsche spiegel reflecteert het excitatie licht naar het monster en laat het emissielicht, dat een langere golflengte heeft, door naar de detector. Het emissie filter blokkeert eventueel overgebleven excitatie licht en laat alleen het fluorescent licht door [43](#page=43) [44](#page=44) [45](#page=45) [46](#page=46) [47](#page=47). Bijvoorbeeld, voor GFP (excitatie rond 488 nm, emissie rond 510 nm), zou een filterset bestaan uit een excitatie filter dat 480/30 nm doorlaat, een dichroïsche spiegel rond 505 nm, en een emissie filter dat 535/30 nm doorlaat [45](#page=45) [46](#page=46). Het uiteindelijke beeld wordt verkregen door het monster te belichten, te filteren en de fluorescentie op te vangen met een camera (vaak zwart-wit). Meerdere beelden van verschillende fluoroforen (bijv. DAPI, GFP, mKers) kunnen vervolgens worden samengevoegd en eventueel van pseudo-kleuren worden voorzien om een gecombineerd beeld te creëren [48](#page=48). ### 3.4 Confocale fluorescentiemicroscopie Confocale microscopie is een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die een aanzienlijke verbetering biedt ten opzichte van widefield microscopie door het elimineren van onscherp licht [50](#page=50) [51](#page=51) [52](#page=52). #### 3.4.1 Werkingsprincipes Het kernprincipe van confocale microscopie is het gebruik van een pinhole (klein diafragma) in het objectief- en/of detectorvlak [54](#page=54). * **Scannende spiegels:** In plaats van het hele veld tegelijk te belichten, worden de beelden punt per punt opgebouwd met behulp van scannende spiegels die een laserstraal over het monster bewegen. Dit zorgt voor een toename in de precisie van beeldvorming [53](#page=53). * **Pinhole:** De pinhole is een cruciaal element. Alleen licht dat afkomstig is uit het brandpunt van het monster (en dus scherp is) kan door de pinhole naar de detector gaan. Licht dat afkomstig is van buiten het brandpunt (onscherp licht) wordt mechanisch geblokkeerd. Dit proces, bekend als "confocale optische sectie", resulteert in een veel hogere resolutie en een vermindering van achtergrondruis. De optimale pinhole-grootte is afhankelijk van de golflengte van het licht en de numerieke apertuur (NA) van het objectief, en is gerelateerd aan de grootte van de Airy-schijf. Confocale microscopie kan resoluties bereiken van ongeveer 200 nanometer [53](#page=53) [54](#page=54). * **Gemotoriseerde stage (Z-stack acquisitie):** Confocale microscopen zijn vaak uitgerust met een gemotoriseerde stage die precieze Z-bewegingen mogelijk maakt. Hierdoor kunnen "Z-stacks" worden verkregen, wat betekent dat beelden op verschillende dieptes in het monster worden opgenomen. Deze Z-stacks maken 3D-reconstructies en analyse mogelijk met speciale beeldvormingssoftware [55](#page=55). #### 3.4.2 Voordelen en toepassingen Confocale microscopie biedt significante voordelen, waaronder: * Verbeterde resolutie en contrast [54](#page=54). * Mogelijkheid tot het verkrijgen van optische secties van het monster, wat cruciaal is voor het bestuderen van dikkere monsters [53](#page=53). * Creëren van gedetailleerde 3D-reconstructies van biologische structuren [55](#page=55). Voorbeelden van 3D-reconstructies met confocale microscopie omvatten de visualisatie van celadhesie-eiwitten zoals E-cadherine in gezonde versus zieke situaties, en de analyse van tight junctions in huid van kikkerembryo's [56](#page=56) [57](#page=57). ### 3.5 Live cell imaging Live cell imaging maakt het mogelijk om dynamische biologische processen in levende cellen gedurende langere perioden te observeren. Om cellen in leven te houden tijdens de microscopie, moet de omgeving van het monster nauwkeurig worden gecontroleerd [59](#page=59). #### 3.5.1 Opstelling voor live cell imaging Een typische opstelling voor live cell imaging vereist: * **Incubatiekamer:** Een verwarmde omgeving (37°C) en een gecontroleerde concentratie CO2 (5%) zijn essentieel om fysiologische omstandigheden te handhaven [59](#page=59). * **Verwarmde stage:** De microscopietage moet worden verwarmd om de temperatuur van het monster constant te houden [59](#page=59). * **Verwarmde objectieven:** Ook de objectieven kunnen verwarmd zijn om temperatuurgradiënten te minimaliseren [59](#page=59). #### 3.5.2 Snellere en minder fototoxische beeldvorming Confocale microscopen kunnen worden aangepast voor snellere beeldvorming met minder fototoxiciteit door gebruik te maken van de "Spinning Disk" configuratie. In plaats van een enkele laserstraal die over het monster scant, maakt een spinning disk microscoop gebruik van snel draaiende schijven met duizenden kleine gaatjes. Dit dispergeert het licht over het staal, waardoor meerdere punten tegelijkertijd worden belicht. Dit resulteert in een hogere beeldsnelheid en vermindert de totale hoeveelheid energie die per oppervlakte-eenheid wordt toegediend, wat leidt tot minder fototoxiciteit voor de levende cellen [60](#page=60). #### 3.5.3 Toepassingen van live cell imaging Live cell imaging is essentieel voor het bestuderen van diverse dynamische cellulaire processen, zoals: * **Intracellulaire bacteriële proliferatie:** Time-lapse films van 24 uur kunnen worden gemaakt om de groei en verspreiding van bacteriën binnen cellen te volgen [61](#page=61). * **Cell tracking:** Individuele cellen kunnen worden gevolgd om hun beweging, migratie en interacties te bestuderen [62](#page=62). * **Cell death processen:** Het observeren van de markers voor stress en celdood helpt bij het begrijpen van de mechanismen van geprogrammeerde celdood [63](#page=63). * **Intravitale beeldvorming:** Deze techniek maakt het mogelijk om fluorescentie in levende weefsels *in vivo* te observeren, bijvoorbeeld de interactie van immuuncellen in lymfeklieren onder astma-omstandigheden [64](#page=64). ### 3.6 Lightsheet microscopie Lightsheet microscopie (ook bekend als Selective Plane Illumination Microscopy - SPIM) is een geavanceerde techniek die zich onderscheidt door het gebruik van lichtvlakken om grote monsters in 3D af te beelden [66](#page=66). #### 3.6.1 Kenmerken van lightsheet microscopie De belangrijkste kenmerken van lightsheet microscopie zijn: * **Lichtvlakken:** Het monster wordt belicht met dunne, sheet-achtige lichtvlakken, wat in tegenstelling staat tot de punt- of veldverlichting van andere microscopen [66](#page=66). * **Type monsters:** Deze techniek is uitermate geschikt voor het afbeelden van relatief grote monsters zoals kleine organen, tumoren, embryo's, insecten en planten [66](#page=66). * **Monster preparatie:** Voor lightsheet microscopie is vaak clearing (het transparant maken van het monster) noodzakelijk, gevolgd door fluorescente labeling [66](#page=66). * **Voordelen:** Lightsheet microscopie maakt snelle 3D-imaging van grote monsters mogelijk met een hoge snelheid voor 3D-reconstructie. Een significant voordeel is dat er geen onscherp licht wordt gegenereerd, omdat de belichting en detectie in loodrechte richtingen plaatsvinden [66](#page=66). #### 3.6.2 Voorbeelden Lightsheet microscopie wordt gebruikt voor het afbeelden van hele organismen en gedetailleerde 3D-structuren. De techniek is cruciaal voor het bestuderen van ontwikkelingsbiologie en de ruimtelijke organisatie van weefsels op grotere schaal [67](#page=67). --- # Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie wordt gebruikt om structuren te bestuderen die kleiner zijn dan 100 nanometer. Het principe berust op het golfkarakter van elektronen, met een veel kleinere golflengte dan licht, waardoor een hogere resolutie mogelijk is [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70). ### 4.1 Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) De transmissie elektronenmicroscopie (TEM) maakt gebruik van een elektronenbundel die door een extreem dun staal wordt gestuurd, vergelijkbaar met hoe licht door een preparaat gaat in een lichtmicroscoop [72](#page=72). * **Principe en resolutie:** TEM biedt vergrotingen tot 1.000.000x en een resolutie tot 0,2 nm, wat significant beter is dan confocale microscopie (200 nm) [72](#page=72). * **Staalkwalificaties:** Het staal moet zeer dun zijn (50-100 nm) om elektronen door te laten. Weefsels worden geplastificeerd en met diamanten messen in dunne coupes gesneden [73](#page=73). * **Contrast en kleuring:** Contrast wordt verkregen door het aanbrengen van zware metalen, zoals osmium, dat zich bindt aan lipiden. Lipide-rijke structuren verschijnen donkerder in het beeld omdat ze minder elektronen doorlaten naar de detector. Het beeld geeft de volledige context van alle structuren in het staal weer [73](#page=73). * **Resolutie en vergroting:** De resolutie ligt rond de 2 nm, met een vergroting van ongeveer 13.000x, en insets tot 100.000x [74](#page=74). * **Toepassing:** TEM-analyse van epitheel van de trachea toont twee celtypes: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen (gobletcellen) [74](#page=74). > **Tip:** TEM is uitermate geschikt voor het bestuderen van ultrastructuren en intracellulaire informatie [79](#page=79). ### 4.2 Scanning elektronenmicroscopie (SEM) Scanning elektronenmicroscopie (SEM) focust op het oppervlak van een staal en de topografische informatie die daaruit voortkomt. * **Staalkwalificaties:** Een staal wordt gefixeerd en gedroogd. Om contrast te detecteren, wordt een dunne laag goud of platina van enkele nanometers op het staaloppervlak aangebracht. Er zijn geen coupes nodig [76](#page=76). * **Principe:** Een elektronenstraal scant het oppervlak van het staal. Voor elk punt wordt het aantal secundaire of teruggekaatste elektronen gedurende een bepaalde tijd gemeten. Het beeld wordt punt voor punt en lijn voor lijn opgebouwd, waarbij grijswaarden de hoeveelheid gedetecteerde elektronen weergeven [76](#page=76). * **Informatie:** Het beeld geeft topografische informatie weer [76](#page=76) [79](#page=79). * **Toepassing:** SEM-beelden van longepitheelweefsel kunnen cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen (gobletcellen) tonen [78](#page=78). > **Tip:** SEM is ideaal voor het bestuderen van oppervlaktestructuren en topografie van monsters [79](#page=79). ### 4.3 Vergelijking TEM en SEM Hoewel beide methoden 2D-beelden produceren, verschillen ze fundamenteel in het type informatie dat ze verschaffen [79](#page=79). * **TEM:** Biedt intracellulaire informatie [79](#page=79). * **SEM:** Levert topografische of oppervlakte-informatie [79](#page=79). ### 4.4 Elektronenmicroscopie voor Volume (3D EM) Naast 2D-beeldvorming kan elektronenmicroscopie ook worden ingezet voor het reconstrueren van driedimensionale structuren. #### 4.4.1 TEM-tomografie TEM-tomografie is gebaseerd op hetzelfde principe als klassieke TEM, maar maakt driedimensionale reconstructies mogelijk. Aangezien een volledige 360° rotatie van het staal mechanisch niet altijd haalbaar is, worden gekantelde aanzichten van het staal (tot 60°) vastgelegd. Deze beelden worden vervolgens tomografisch berekend en gereconstrueerd om een 3D-beeld te verkrijgen. De resolutie van TEM-tomografie kan oplopen tot 20 nm [81](#page=81). #### 4.4.2 Serial blockface (SBF) – SEM Serial blockface (SBF) – SEM is een techniek voor 3D elektronenmicroscopie van cellen en weefsels. Hierbij wordt een in plastic ingebed staal herhaaldelijk gesneden met een diamantmes (coupes van 20 nm dik) en vervolgens gescand met een elektronenbundel. Deze methode levert gedetailleerde 3D-beelden van cellen en weefsels, waardoor wetenschappers complexe cellulaire architecturen met hoge resolutie in drie dimensies kunnen visualiseren [83](#page=83). > **Voorbeeld:** SBF-SEM kan worden gebruikt om de ultrastructuur van pollenkorrels binnen een helmknop in 3D te bestuderen [84](#page=84). --- # Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is een techniek die de voordelen van zowel lichtmicroscopie als elektronenmicroscopie combineert om gedetailleerde analyse van biologische monsters mogelijk te maken. Deze methode resulteert in een overlay van een fluorescentiebeeld met een elektronenmicroscoopbeeld, waardoor de specifieke lokalisatie van moleculen of structuren die in de lichtmicroscopie zijn gelabeld, kan worden gecombineerd met de hoge resolutie van elektronenmicroscopie [85](#page=85) [86](#page=86). ### 5.1 Het principe van CLEM CLEM wordt vaak omschreven als het benutten van "het beste van twee werelden" [86](#page=86). * **Voordelen van lichtmicroscopie (LM) in CLEM:** * Mogelijkheid tot specifieke labeling van moleculen en structuren, bijvoorbeeld met fluorescentie-eiwitten [86](#page=86). * Gemakkelijke interpretatie van beelden [86](#page=86). * Kwantificering van gelabelde structuren is mogelijk [86](#page=86). * **Nadelen van lichtmicroscopie (LM) in CLEM:** * Beperkte resolutie, waardoor fijne structuren niet zichtbaar zijn [86](#page=86). * Onbekende structuren in "het donker" blijven onzichtbaar [86](#page=86). * **Voordelen van elektronenmicroscopie (EM) in CLEM:** * Superieure resolutie, die zeer gedetailleerde structuren onthult [86](#page=86). * Biedt een uitgebreid overzicht van de celmorfologie [86](#page=86). * **Nadelen van elektronenmicroscopie (EM) in CLEM:** * Moeilijke interpretatie van beelden zonder specifieke labeling [86](#page=86). * Vereist doorgaans gefixeerd materiaal, waardoor dynamische processen niet geobserveerd kunnen worden [86](#page=86). ### 5.2 Werkwijze en vereisten voor CLEM De kern van CLEM-experimenten ligt in de opeenvolgende beeldvorming, waarbij eerst met lichtmicroscopie en vervolgens met elektronenmicroscopie wordt gescand. Om de beelden nauwkeurig te kunnen overlappen, zijn er specifieke vereisten [87](#page=87): #### 5.2.1 Merktekens (fiducials) Voor een accurate overlay van de lichtmicroscoop- en elektronenmicroscoopbeelden zijn referentiepunten, ook wel "merktekens" of "fiducials" genoemd, essentieel. Deze merktekens helpen bij het uitlijnen van de microscoopdata uit beide modaliteiten [87](#page=87). > **Tip:** Deze merktekens kunnen verschillende vormen aannemen, zoals microscopische deeltjes of specifieke structuren in het monster die zowel in LM als EM zichtbaar zijn. #### 5.2.2 Laserbranding Een specifieke methode om merktekens te creëren is door middel van laserbranding. Hierbij wordt met een laser gericht op het monster in de lichtmicroscoop, waardoor kleine, herkenbare markeringen ontstaan. Deze markeringen dienen vervolgens als referentiepunten voor de uitlijning in de elektronenmicroscoop [87](#page=87) [88](#page=88). #### 5.2.3 Beeldvorming tussen volumes CLEM kan worden uitgevoerd door beeldvorming tussen volumes, wat betekent dat er opeenvolgend beelden worden gemaakt met verschillende microscopietechnieken. Dit kan variëren van confocale microscopie op volumetrisch niveau tot elektronenmicroscopie op volumetrisch niveau [87](#page=87). > **Voorbeeld:** Men kan eerst een 3D-reconstructie van fluorescentie-gelabelde eiwitclusters maken met confocale microscopie, en vervolgens de locatie van deze clusters identificeren in een 3D-reconstructie verkregen met seriële doorsneden in de elektronenmicroscoop. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Vergroting | Het proces waarbij de schijnbare grootte van een object wordt vergroot, wat essentieel is om structuren te kunnen zien die kleiner zijn dan wat het blote oog kan waarnemen. Lenzen in de microscoop worden gebruikt om dit effect te creëren. | | Resolutie (Oplossend vermogen) | Het vermogen van een microscoop om twee afzonderlijke punten als zodanig te kunnen onderscheiden. Een hogere resolutie betekent dat kleinere afstanden zichtbaar gemaakt kunnen worden, waardoor fijnere details van een object zichtbaar worden. | | Contrast | Het verschil in intensiteit of kleur tussen verschillende delen van een monster, wat nodig is om structuren te kunnen waarnemen. Zonder voldoende contrast kunnen objecten samenvloeien en onzichtbaar worden voor de waarnemer. | | Numerieke Apertuur (NA) | Een maat voor het vermogen van een objectief lens om licht te verzamelen en fijne details te onderscheiden. Een hogere NA, vaak verkregen door immersie vloeistoffen te gebruiken, leidt tot een betere resolutie. | | Diffractie | Het buigen van lichtgolven wanneer ze een obstakel passeren of door een kleine opening gaan. Dit fenomeen is fundamenteel voor het begrijpen van de grenzen van de resolutie in lichtmicroscopie. | | Chromofoor | Een molecuul dat een bepaalde golflengte van licht absorbeert en daardoor kleur vertoont. Chromoforen worden vaak gebruikt als kleurstoffen om structuren in biologische monsters zichtbaar te maken. | | Fluorofoor | Een molecuul dat fluorescentie vertoont, wat betekent dat het licht van een bepaalde golflengte absorbeert en vervolgens licht van een langere golflengte uitzendt. Dit maakt gerichte detectie van specifieke moleculen mogelijk. | | Fluorescentie | Het proces waarbij een stof licht absorbeert en vervolgens licht van een langere golflengte uitzendt. Dit fenomeen wordt veel gebruikt in de microscopie om specifieke structuren of moleculen te visualiseren. | | Jablonski-diagram | Een schematische weergave van de elektronische toestanden van een molecuul, zoals een fluorofoor, en de processen van absorptie en emissie van fotonen die optreden. Het helpt bij het begrijpen van de mechanismen achter fluorescentie. | | Widefield microscopie | Een type fluorescentiemicroscopie waarbij het hele monster tegelijkertijd wordt verlicht. Dit is een eenvoudigere en snellere methode, maar kan last hebben van onscherp licht van buiten het focusvlak. | | Confocale microscopie | Een geavanceerde techniek van fluorescentiemicroscopie die een pinhole gebruikt om onscherp licht te blokkeren, wat resulteert in optische secties en een verbeterde resolutie, vooral voor 3D-beeldvorming. | | Pinhole | Een klein diafragma dat in confocale microscopie wordt gebruikt om ongewenst, onscherp licht uit de focusvlakken te filteren. Dit verbetert de beeldkwaliteit en de resolutie aanzienlijk. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een elektronenmicroscopietechniek waarbij een bundel elektronen door een ultradun staal wordt gestuurd. Het creëert beelden met zeer hoge resolutie die de interne ultrastructuur van cellen en weefsels tonen. | | Scanning elektronenmicroscopie (SEM) | Een elektronenmicroscopietechniek die het oppervlak van een staal scant met een elektronenbundel. Het produceert gedetailleerde topografische beelden van het monsteroppervlak. | | Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) | Een methode die beelden van lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie combineert om de voordelen van beide te benutten. Specifieke fluorescentie-etikettering kan worden gekoppeld aan de hoge resolutie van EM-beelden. |