Ppt2_PCR afgeleiden.pdf

# PCR technieken en toepassingen ## 1. Basisprincipes van PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek om specifiek een DNA fragment exponentieel te amplificeren. Dit geamplificeerde fragment wordt een amplicon genoemd. De amplificatie gebeurt door middel van 30-45 cycli. In elke cyclus ondergaat het DNA een reeks temperatuurveranderingen: denaturatie (95°C), annealing, en elongatie [4](#page=4) [5](#page=5). ### 1.1 Toepassingen van PCR PCR heeft zowel analytische als preparatieve toepassingen. Preparatief kan PCR gebruikt worden om amplicons aan te maken voor klonering of als probe in hybridisatie-experimenten [6](#page=6). ### 1.2 Afgeleide PCR-technieken Er bestaan diverse afgeleide PCR-technieken die de specificiteit, efficiëntie, of toepassingsmogelijkheden van de standaard PCR uitbreiden. Enkele belangrijke zijn: direct PCR, hot start PCR, touch-down PCR, nested PCR, RT-PCR, en multiplex PCR [7](#page=7). #### 1.2.1 Direct PCR Direct PCR maakt gebruik van het DNA direct uit 'levend' materiaal, wat tijd en kosten bespaart doordat er geen DNA-isolatie nodig is. Een potentieel nadeel is de aanwezigheid van PCR-inhibitoren in het monstermateriaal, wat opgevangen kan worden met speciale PCR mastermixen. Voorbeelden van direct PCR zijn Colony PCR en Single Cell PCR [8](#page=8). ##### 1.2.1.1 Colony PCR Colony PCR wordt toegepast bij de controle van genetische manipulaties bij bacteriën en bij microbiologisch onderzoek, zoals het screenen op antibioticumresistentie [9](#page=9). ##### 1.2.1.2 Single Cell PCR Single Cell PCR wordt gebruikt in technieken als in vitro fertilisatie en bij single cell genotypering [10](#page=10). #### 1.2.2 Technieken om PCR-specificiteit te verhogen De specificiteit van PCR kan verhoogd worden door middel van nested PCR, hot start PCR, en touch-down PCR [11](#page=11). ##### 1.2.2.1 Nested PCR Nested PCR is een tweestapsmethode die de specificiteit van de PCR aanzienlijk verhoogt. Hierbij wordt eerst een amplificatie uitgevoerd met een eerste set primers (Primerset 1), gevolgd door een tweede amplificatie van het product van de eerste reactie met een tweede, intern gelegen set primers (Primerset 2) . Dit is essentieel wanneer een geconserveerde sequentie geamplificeerd moet worden uit verschillende individuen, organismen, of genen binnen een genfamilie [13](#page=13) [14](#page=14). ##### 1.2.2.2 Hot start PCR Bij hot start PCR wordt het DNA polymerase pas geactiveerd na een initiële hittebehandeling (meestal 95°C) . Dit voorkomt de vorming van aspecifieke fragmenten door inhibitie van de reactie bij lagere temperaturen. Deze inhibitie kan bereikt worden door bijvoorbeeld het gebruik van antilichamen tegen het polymerase, covalente modificaties van het polymerase, of eiwitten die binden aan de primers [16](#page=16). ##### 1.2.2.3 Touch down PCR Touch down PCR varieert de annealingtemperatuur gedurende de PCR-cycli. De annealingtemperatuur begint hoog (gelijk aan de Tm van de primer) en wordt geleidelijk verlaagd over de cycli heen. Dit vermijdt aspecifieke binding van primers en de vorming van ongewenste producten [18](#page=18). #### 1.2.3 RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) RT-PCR is een techniek die de omzetting van RNA naar cDNA combineert met PCR-amplificatie van dit cDNA. Het wordt voornamelijk gebruikt voor de studie van genexpressie, waarbij de aan- of afwezigheid en de hoeveelheid van een bepaald mRNA-molecuul wordt bepaald [23](#page=23) [24](#page=24). ##### 1.2.3.1 Concept Genexpressie Genexpressie omvat het proces van promotoractiviteit, transcriptie van DNA naar prematuur mRNA, maturatie van mRNA, stabiliteit van mRNA (halfwaardetijd, miRNA/siRNA targeting), translatie naar eiwit, opvouwing, en post-translationele modificaties [22](#page=22). ##### 1.2.3.2 RT-stap: RNA naar cDNA De eerste stap in RT-PCR is de reverse transcriptie, waarbij RNA (vaak mRNA) wordt omgezet in cDNA met behulp van het enzym reverse transcriptase. cDNA is stabieler dan RNA en kan daarom beter bewaard en verder verwerkt worden [25](#page=25) [29](#page=29). * **Template:** Zuiver totaal RNA of mRNA [30](#page=30). * **dNTPs:** dATP, dCTP, dGTP, dTTP [30](#page=30). * **Buffer:** Bevat onder andere Mg$^{2+}$ ] [30](#page=30). * **Primers:** Verschillende typen primers kunnen gebruikt worden: * Oligo (dT)$_N$: Bindt aan de poly-A-staart van mRNA [32](#page=32). * Anker Oligo (dT)$_N$: Vergelijkbaar met Oligo (dT)$_N$, bindt ook aan de poly-A-staart [32](#page=32). * Random primers (hexamers): Kunnen aan elk RNA binden [32](#page=32). * Sequentie-specifieke primers: Worden gebruikt in diagnostiek [32](#page=32). * **Enzyme:** Reverse transcriptase. Twee veelgebruikte enzymen zijn: * MMLV reverse transcriptase (Moloney Murine Leukemia Virus): Optimaal bij 37°C [31](#page=31). * AMV reverse transcriptase (Avian Myeloblastosis Virus): Optimaal bij 42°C [31](#page=31). Reverse transcriptase heeft RNA- en DNA-polymerase activiteit [31](#page=31). ##### 1.2.3.3 PCR-stap: cDNA amplificatie Het gevormde cDNA wordt vervolgens geamplificeerd met behulp van standaard PCR-technieken [25](#page=25). ##### 1.2.3.4 Methoden en Toepassingen * **One-step methode (2-primer methode):** Reverse transcriptie en PCR vinden plaats in één buisje . Geschikt voor het bepalen van virale titers van virussen met een RNA-genoom (bv. COVID RT-qPCR) ] [35](#page=35) [36](#page=36). * **Two-step methode (3-primer methode):** Reverse transcriptie en PCR zijn gescheiden stappen . Geschikt voor genexpressie-analyse. Hoewel de 2-primer methode kan worden toegepast met 3 primers en de 3-primer methode met 2 primers, wordt dit beperkt gebruikt [35](#page=35) [38](#page=38). ##### 1.2.3.5 Controle en Specificiteit Bij een two-step procedure zijn controles noodzakelijk, waaronder blanco reacties voor zowel de RT-stap als de PCR-stap. Om amplificatie van genomisch DNA te vermijden, worden bij de PCR-stap vaak exon-exon spanning primers gebruikt . Deze primers overspannen een sequentie die zowel in twee opeenvolgende exons ligt. Dit vermijdt ook de amplificatie van prematuur mRNA [39](#page=39) [41](#page=41) [42](#page=42). * **Oefening Vraag:** Bij gebruik van oligo(dT)$_N$ primers bestaat de mogelijkheid dat er cDNA afgeleid wordt van prematuur mRNA, omdat deze primers aan de poly-A-staart binden en prematuur mRNA ook een poly-A-staart heeft. Bij random hexamers is deze mogelijkheid nog groter, aangezien deze aan alle RNA binden [44](#page=44). ##### 1.2.3.6 Normalisatie bij RT-PCR Wijzigingen in de sterkte van de PCR-banden kunnen worden veroorzaakt door veranderingen in genexpressie, maar ook door artefacten zoals pipetteerfouten of solventinhibitie . Om deze artefacten te onderscheiden van werkelijke veranderingen in genexpressie, is normalisatie met referentiegenen noodzakelijk. Referentiegenen zijn genen die constitutief tot expressie komen en niet beïnvloed worden door de experimentele behandeling. Voorbeelden hiervan zijn GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) en -actin [45](#page=45) [46](#page=46) [48](#page=48). #### 1.2.4 Multiplex PCR Multiplex PCR maakt het mogelijk om in één enkele PCR-reactie meerdere primersets te gebruiken, gericht tegen verschillende DNA-templates . Dit kan worden toegepast om diverse deleties of duplicaties in een groot gen te detecteren, meerdere pathogenen tegelijk op te sporen, of een specifieke detectie met een interne controle te combineren. Belangrijk is dat de annealingtemperaturen, Mg$^{2+}$ en dNTP-concentraties optimaal zijn voor alle primers, en dat de primersets geen primerdimeren vormen en de amplicons voldoende verschillen in grootte [50](#page=50) [51](#page=51). * **Toepassingen:** * Detectie van 2 of meer targets in één RT-PCR (genexpressie en normalisatie) ] [52](#page=52). * PCR voor merkers, zoals de aan- of afwezigheid van micro-organismen of kanker-merkers [52](#page=52). * Opsporen van ziektekiemen [54](#page=54). #### 1.2.5 AFLP-PCR (Amplification Fragment Length Polymorphism PCR) AFLP-PCR is een techniek voor genotypering, bijvoorbeeld van een bacteriestam. Het proces omvat [60](#page=60): 1. Digestie van genomisch DNA met restrictie-enzymen [61](#page=61). 2. Ligatie van adapters met een bekende sequentie [61](#page=61). 3. PCR met primers die complementair zijn aan de adapters, plus één of twee extra nucleotiden [61](#page=61). 4. Analyse van de resultaten via (capillaire) gelelektroforese . Een voordeel is dat de sequentie van het PCR-target niet gekend hoeft te zijn ] [61](#page=61) [66](#page=66). #### 1.2.6 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD is een techniek waarbij willekeurige, korte primers (8-12 nucleotiden lang) worden gebruikt om genomisch DNA te amplificeren . De sequentie van het target hoeft niet bekend te zijn . Omdat genomen die voldoende verschillen in sequentie een verschillend bandenpatroon opleveren, kan RAPD gebruikt worden voor genotypering, bijvoorbeeld van bacteriestammen of infectiehaarden, en voor moleculaire fylogenie. Het wordt ook ingezet om de epidemiologie van nosocomiale infecties op te sporen. Beperkingen zijn gerelateerd aan de willekeurigheid van de primerbinding en de fragmentlengte. AP-PCR (Arbitrary Primed PCR) is een synoniem voor RAPD [69](#page=69) [70](#page=70) [71](#page=71) [73](#page=73). #### 1.2.7 VNTR-PCR (Variable Number of Tandem Repeats PCR) VNTR-PCR is een specifieke variant van multiplex PCR, gebruikt voor verwantschapsbepaling en forensische toepassingen. Het amplificeert VNTR-sequenties, die bestaan uit herhalingen van korte DNA-motieven (microsatellieten of STR's: <5 bp; minisatellieten of SSR: >5 bp) . Het aantal herhalingen verschilt sterk tussen individuen, waardoor een uniek DNA-profiel of fingerprint ontstaat . Wanneer multiplex PCR wordt toegepast op verschillende STR-loci, is de kans op een willekeurige match extreem klein (ongeveer $10^{-12}$ voor 15 loci gehanteerd door de FBI) . Interpretatie van resultaten omvat het berekenen van de frequentie van allelen en het omgaan met onvolledige of gemengde DNA-profielen ] [76](#page=76) [78](#page=78) [80](#page=80) [81](#page=81). #### 1.2.8 Methylation-Specific PCR (MSP) MSP is een PCR-reactie die afhankelijk is van DNA-methylatie. DNA-methylatie op CpG-eilanden is een epigenetische merker. MSP peilt naar de aanwezigheid van deze methylaties in een specifieke regio. Ongemethyleerde cytosines worden door bisulfietconversie omgezet in uracil, terwijl gemethyleerde 5-methylcytosines hier resistent tegen zijn [84](#page=84) [85](#page=85). ## 2. Overzicht van PCR-technieken Een uitgebreide lijst van PCR-technieken omvat onder andere: High-fidelity PCR, Direct PCR, Colony PCR, Single-cell PCR, Nested PCR, Hot start PCR, Touch down PCR, AFLP-PCR, RAPD, VNTR PCR, RFLP-PCR, AS-PCR, Real-time PCR (qPCR), Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR), Reverse transcriptase real time PCR (RT-qPCR), Droplet digital PCR, Multiplex PCR, Methylation-specific PCR (MSP), Long-range PCR, Solid phase PCR, In situ PCR, Fast-cycling PCR, Asymmetric PCR, Repetitive sequence-based PCR, Overlap extension PCR, Assemble PCR, Inter Sequence-specific PCR (ISSR), Ligation-mediated PCR, Miniprimer PCR, TAIL-PCR, Touch up PCR, NASBA, LAMP-PCR, 5’RACE, triplet primed- PCR (TP-PCR) ] [88](#page=88). --- # RT-PCR voor genexpressieanalyse en normalisatie Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) is een krachtige methode om de expressie van genen te bestuderen door de hoeveelheid messenger RNA (mRNA) te kwantificeren, waarbij normalisatie met referentiegenen cruciaal is voor betrouwbare resultaten [24](#page=24) [45](#page=45). ### 2.1 Concept genexpressie Genexpressie omvat een reeks stappen die leiden tot een functioneel eiwit, beginnend bij promotoractiviteit en transcriptie van DNA naar prematuur mRNA. Dit prematuur mRNA ondergaat maturatie tot matuur mRNA, waarbij intronen worden verwijderd. De stabiliteit van het mRNA, beïnvloed door factoren zoals microRNA's (miRNA's) en small interfering RNA's (siRNA's), is ook een kritische stap. Vervolgens wordt het matuur mRNA vertaald naar een eiwit, dat post-translationele modificaties kan ondergaan, waarna de eiwitstabiliteit en activiteit worden bepaald [22](#page=22) [40](#page=40). ### 2.2 RT-PCR principe RT-PCR staat voor Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction. Het proces bestaat uit twee hoofdfasen [23](#page=23) [25](#page=25): 1. **Reverse Transcriptie (RT):** RNA, doorgaans matuur mRNA, wordt omgezet in complementair DNA (cDNA) met behulp van het enzym reverse transcriptase. Dit is een cruciale stap omdat cDNA stabieler is dan RNA en beter geschikt voor opslag en verdere analyse [25](#page=25) [26](#page=26) [29](#page=29). 2. **Polymerase Chain Reaction (PCR):** Het gevormde cDNA dient als template voor de PCR, waarbij specifieke DNA-sequenties worden geamplificeerd tot detecteerbare hoeveelheden [25](#page=25). #### 2.2.1 Materialen voor de RT-stap De reverse transcriptie vereist de volgende componenten [30](#page=30): * **Template:** Zuiver totaal RNA of mRNA [30](#page=30). * **dNTPs:** Een mengsel van dATP, dCTP, dGTP en dTTP [30](#page=30). * **Buffer:** Een bufferoplossing die essentiële ionen, zoals $\text{Mg}^{2+}$, bevat [30](#page=30). * **Primer:** Een primer die de reverse transcriptase initieert [30](#page=30). * **Enzyme:** Reverse transcriptase [30](#page=30). * **dH2O:** Vrij van contaminanten [30](#page=30). #### 2.2.2 Enzymen voor reverse transcriptase Er zijn verschillende reverse transcriptase-enzymen beschikbaar, waaronder: * **MMLV reverse transcriptase (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase):** Optimaal bij $37^{\circ}\text{C}$ voor 1 uur [31](#page=31). * **AMV reverse transcriptase (Avian Myeloblastosis Virus):** Optimaal bij $42^{\circ}\text{C}$ voor 1 uur [31](#page=31). Reverse transcriptase bezit zowel RNA-polymerase- als DNA-polymerase-activiteit [31](#page=31). #### 2.2.3 Primers voor de RT-stap De keuze van de primer in de RT-stap is cruciaal en kan variëren [32](#page=32): * **Oligo (dT)N:** Bindt aan de poly-A-staart van matuur mRNA [32](#page=32). * **Anker Oligo (dT)N:** Bindt eveneens aan de poly-A-staart [32](#page=32). * **Random priming (hexamers):** Primers van zes nucleotiden die willekeurig op al het RNA kunnen binden [32](#page=32). * **Sequentie-specifieke primers:** Worden gebruikt voor diagnostische toepassingen [32](#page=32). #### 2.2.4 Methoden van RT-PCR RT-PCR kan worden uitgevoerd met verschillende methoden wat betreft het aantal primers en de stappen: * **2-primer methode (One-step methode):** Alle reactanten (RNA, reverse transcriptase, PCR-enzymen en primers) worden in één buisje gemengd. Deze methode is nuttig voor het bepalen van virale titers van virussen met een RNA-genoom, zoals bij COVID RT-qPCR [35](#page=35) [36](#page=36) [37](#page=37). * **3-primer methode (Two-step methode):** De reverse transcriptie en PCR worden in aparte stappen uitgevoerd. Eerst wordt cDNA gesynthetiseerd, waarna een deel van dit cDNA wordt gebruikt voor de PCR. Deze methode wordt voornamelijk toegepast voor genexpressieanalyse. Hoewel beide methoden kunnen worden gebruikt, kan de one-step methode een hogere kans op aspecifieke amplicons met zich meebrengen [35](#page=35) [38](#page=38). #### 2.2.5 Controle in de two-step procedure Bij de two-step procedure zijn controles essentieel om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen [39](#page=39): * **RT-stap controle:** Inclusief stalen en een blanco (zonder RNA) [39](#page=39). * **PCR-stap controle:** Inclusief stalen, de blanco van de RT-stap, en een blanco PCR (zonder cDNA) [39](#page=39). #### 2.2.6 Keuze van primers voor de PCR-stap Voor een specifieke RT-PCR van matuur mRNA zijn de primers voor de PCR-stap van belang [40](#page=40): * **Exon-exon spanning primers:** Deze primers worden ontworpen om over de grens van twee aangrenzende exons te springen. Dit heeft twee belangrijke voordelen [41](#page=41) [42](#page=42): * **Vermijden van amplificatie van genomisch DNA:** Genomisch DNA bevat intronen, terwijl matuur mRNA deze mist. Primers die een exon-exon overspanning vereisen, zullen geen genomisch DNA amplificeren. * **Vermijden van amplificatie van prematuur mRNA:** Prematuur mRNA bevat nog intronen, en primers ontworpen om over een exon-exon grens te springen, zullen dit niet efficiënt amplificeren. #### 2.2.7 Oefening met primerkeuze * Bij het werken met oligo(dT)N primers is er een mogelijkheid op de aanwezigheid van cDNA afgeleid van prematuur mRNA, aangezien de poly-A-staart ook in prematuur mRNA aanwezig kan zijn [44](#page=44). * Bij het werken met random hexamers is er eveneens een mogelijkheid op de aanwezigheid van cDNA afgeleid van prematuur mRNA, omdat deze primers op alle RNA-moleculen kunnen binden, inclusief prematuur mRNA [44](#page=44). ### 2.3 Noodzaak van normalisatie in RT-PCR De analyse van RT-PCR resultaten, vaak uitgevoerd via gelelektroforese, waarbij de sterkte van een band de hoeveelheid amplicon weergeeft, kan worden beïnvloed door factoren buiten de genexpressie zelf. Veranderingen in bandsterkte kunnen duiden op een werkelijke stijging of daling van mRNA door beïnvloeding van genexpressie, maar ook op artefacten veroorzaakt door menselijke fouten, zoals het morsen van een deel van het monster of inhibitie van de PCR door oplosmiddelen [45](#page=45) [46](#page=46). #### 2.3.1 Referentiegenen voor normalisatie Om deze artefacten te corrigeren en de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen, is normalisatie met behulp van referentiegenen noodzakelijk. Een referentiegen is een gen dat constitutief (standvastig) tot expressie komt en niet wordt beïnvloed door de experimentele behandeling. Deze genen coderen vaak voor structurele elementen of essentiële basale celmechanismen [46](#page=46). > **Tip:** Het correct identificeren en valideren van geschikte referentiegenen is cruciaal voor een betrouwbare genexpressieanalyse. #### 2.3.2 Voorbeelden van referentiegenen Veelgebruikte referentiegenen zijn onder andere [48](#page=48): * **Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH):** Een enzym dat een rol speelt in de glycolyse [48](#page=48). * **Beta-actine ($\beta$-actin):** Een cytoskeletproteïne betrokken bij celmotiliteit en celstructuur [48](#page=48). #### 2.3.3 Invloed van artefacten op referentiegenen Een pipetteerfout die leidt tot minder staal in de PCR-reactie zal de signaalsterkte van zowel het doelwitgen als het referentiegen beïnvloeden. Door de hoeveelheid van het doelwitgen te normaliseren ten opzichte van de hoeveelheid van het referentiegen, kunnen deze artefacten worden gecorrigeerd [49](#page=49). ### 2.4 Toepassingen van RT-PCR #### 2.4.1 Multiplex RT-PCR Multiplex RT-PCR maakt de analyse van meerdere genen tegelijkertijd mogelijk. Vroeger werd banddensitometrie gebruikt om genexpressie te berekenen met de formule: Genexpressie = BD Doelwit / (BD Ref1 * BD Ref2), waarbij BD staat voor banddensiteit. Tegenwoordig wordt kwantitatieve PCR (qPCR) veelvuldig toegepast voor een nauwkeurigere analyse [55](#page=55). #### 2.4.2 RNA-stabiliteitsbepaling RT-PCR kan ook worden gebruikt om de stabiliteit van RNA te bepalen. Dit omvat het meten van de transcriptie en degradatie van RNA, hetzij natuurlijk, hetzij geïnduceerd door factoren zoals miRNA's. Door enzymen die de aanmaak van mRNA regelen te stoppen, kan de afbraaksnelheid van mRNA worden gevolgd [56](#page=56). ##### 2.4.2.1 RNA-polymerase inhibitoren Verschillende inhibitoren kunnen worden gebruikt om de transcriptie te stoppen, zoals alpha-aminitine (traag), Actinomycin D (snel maar niet specifiek genoeg), CDK9 inhibitoren, en Triptolide (snelle en specifieke degradatie van RNA-Pol II) ] [57](#page=57). ##### 2.4.2.2 Experimenteel ontwerp voor RNA-stabiliteitsanalyse Een onderzoeker die de halfwaardetijd van een mRNA wil bepalen onder invloed van een drug X, kan het volgende experiment opzetten [58](#page=58): * Behandeling van cellen met drug X of een controlebehandeling. * Stoppen van de transcriptie met een transcriptie-inhibitor na een bepaalde tijd (bijvoorbeeld 1 uur), of geen inhibitor toevoegen (controle). * Afname van monsters op verschillende tijdstippen gedurende 48 uur (bv. 15 min, 30 min, 1 uur, 2 uur, 4 uur, 8 uur, 24 uur, 48 uur). * Analyse van de mRNA-hoeveelheden via RT-PCR. * Het wordt aangeraden om in dit soort experimenten een RT-qPCR te gebruiken voor een hogere gevoeligheid en kwantificatie [58](#page=58). --- # VNTR-PCR en forensische toepassingen Dit onderwerp behandelt de techniek van VNTR-PCR, inclusief de verschillende types herhaalsequenties zoals micro- en minisatellieten, en de essentiële rol ervan in forensisch onderzoek en verwantschapsbepaling door middel van DNA-profilering. ### 3.1 Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) Variable Number of Tandem Repeats (VNTRs), ook wel minisatellieten genoemd, zijn niet-coderende DNA-sequenties die bestaan uit herhalingen van een korte DNA-sequentie, typisch langer dan 5 basenparen en 10 tot 60 basenparen lang. Deze sequenties kunnen meer dan duizend keer verspreid over het genoom voorkomen. Naast VNTRs worden ook microsatellieten, ook wel Short Tandem Repeats (STRs) of Short Sequence Repeats (SSRs) genoemd, onderscheiden. Deze bestaan uit kortere herhalingen, minder dan 5 basenparen (vaak 1-4 basenparen) en worden 10 tot 100 keer herhaald [59](#page=59). #### 3.1.1 Toepassingen van VNTRs VNTRs zijn cruciaal voor toepassingen zoals vaderschapsonderzoek en forensisch onderzoek. Wanneer een multiplex PCR wordt uitgevoerd voor verschillende STR-loci, wordt de kans dat twee individuen hetzelfde bandenpatroon vertonen extreem klein, wat effectieve identificatie van individuen mogelijk maakt [59](#page=59) [76](#page=76). ### 3.2 VNTR-PCR VNTR-PCR is een specifieke variant van multiplex PCR gevolgd door capillaire elektroforese. Het principe berust op de amplificatie van VNTR-sequenties, wat resulteert in PCR-producten van verschillende lengtes. Dit maakt de techniek geschikt voor verwantschapsbepaling en forensische toepassingen [76](#page=76). #### 3.2.1 DNA-profielen en fingerprinting VNTR-loci, zoals gehanteerd door het FBI, vormen de basis voor een DNA-profiel of fingerprint. De gemiddelde kans op een willekeurige match voor dergelijke profielen is ongeveer $10^{-12}$ [78](#page=78). #### 3.2.2 Interpretatie van VNTR-PCR resultaten De interpretatie van VNTR-PCR resultaten omvat verschillende aspecten: * **Manier van noteren:** Loci worden genoteerd met een notatie zoals (A1/A2), bijvoorbeeld vWA (17/18) [79](#page=79). * **Analytische en stochastische drempelwaarden:** Deze waarden zijn belangrijk voor het correct interpreteren van de resultaten, met name bij zwakke signalen of stotterende patronen. De stochastische drempelwaarde is cruciaal voor het betrouwbaar interpreteren van lage hoeveelheden DNA [79](#page=79). * **Berekende frequentie (voorkomenskans):** Deze wordt berekend op basis van bekende populatiegenetica door de voorkomen van verschillende allelen te vermenigvuldigen [80](#page=80). * **Onvolledige enkelvoudige DNA profielen:** Deze kunnen ontstaan door slechte DNA-kwaliteit, wat leidt tot geen reactie op alle loci. De bewijskracht van dergelijke profielen hangt af van de zeldzaamheid van de gevonden allelen [80](#page=80). * **DNA mengprofielen:** Deze ontstaan wanneer DNA afkomstig is van meerdere individuen [80](#page=80). * **Piekhoogteratio (Major/minor ratio):** Dit is een belangrijke parameter bij de interpretatie van mengprofielen, waarbij de relatieve hoogtes van de pieken inzicht geven in de bijdrage van elk individu [81](#page=81). #### 3.2.3 Geavanceerde systemen Moderne systemen, zoals het AmpFISTR NGM DNA-data analyse systeem, gebruiken tot wel 15 loci voor analyse [81](#page=81). > **Tip:** Begrijpen van de analytische, stotter- en stochastische drempelwaarden is essentieel voor het nauwkeurig interpreteren van DNA-profielen, vooral bij lage DNA-hoeveelheden of complexe mengprofielen. ### 3.3 Forensische toepassingen en vaderschapsbepaling VNTR-PCR heeft significante toepassingen in forensisch onderzoek en vaderschapsbepaling [76](#page=76). #### 3.3.1 Voorbeelden van toepassingen * **Forensische toepassing:** VNTR-PCR kan worden gebruikt om sporenmateriaal (zoals bloed, speeksel, haar) te analyseren en te vergelijken met bekende profielen, wat kan leiden tot identificatie van verdachten of uitsluiting [82](#page=82). * **Vaderschapsbepaling:** Door het vergelijken van DNA-profielen van een kind met potentiële vaders, kan met hoge waarschijnlijkheid een biologische vader worden geïdentificeerd of uitgesloten [83](#page=83). > **Example:** Bij een misdaadscène wordt DNA-materiaal aangetroffen. Door middel van VNTR-PCR kan een uniek DNA-profiel worden gegenereerd. Dit profiel kan vervolgens worden vergeleken met DNA-profielen van verdachten, waardoor een koppeling kan worden gelegd of juist kan worden uitgesloten. Op dezelfde manier kan bij een vaderschapstest het DNA-profiel van een kind worden vergeleken met dat van de moeder en de vermeende vader om de biologische relatie te bevestigen [82](#page=82) [83](#page=83). --- # DNA-methylatie en Methylspecifieke PCR Dit onderwerp introduceert DNA-methylatie als een epigenetische merker en de detectie ervan middels methylspecifieke PCR [84](#page=84). ### 4.1 DNA-methylatie als epigenetische merker DNA-methylatie, specifiek op CpG-eilanden, functioneert als een belangrijke epigenetische merker. Deze merkers hebben de eigenschap om overerfbaar te zijn [84](#page=84). ### 4.2 Methylspecifieke pcr (msp) Methylspecifieke PCR (MSP) is een PCR-reactie die specifiek afhangt van de aanwezigheid van DNA-methylatie. Het primaire doel van MSP is om de locatie van deze methylaties binnen een specifieke DNA-regio te achterhalen, waarbij de omringende sequentie reeds bekend is [84](#page=84). #### 4.2.1 Principe van bisulfietconversie in msp Het succes van MSP is gebaseerd op de chemische behandeling van DNA met natriumbisulfiet [85](#page=85). * **Ongemethyleerde cytosines:** Deze worden tijdens de bisulfietconversie omgezet in uracils [85](#page=85). * **Gemethyleerde cytosines (5-methylcytosines):** Deze zijn resistent tegen de bisulfietconversie en blijven intact als cytosines [85](#page=85). Deze selectieve conversie creëert sequentieverschillen tussen gemethyleerd en ongemethyleerd DNA, die vervolgens kunnen worden gedetecteerd door PCR. #### 4.2.2 Toepassing van msp Door gebruik te maken van primers die specifiek ontworpen zijn om te binden aan de sequentie na bisulfietbehandeling, kan worden bepaald of een bepaald DNA-fragment gemethyleerd is. Er worden doorgaans twee sets primers gebruikt: een set die specifiek is voor de gemethyleerde sequentie en een set die specifiek is voor de ongemethyleerde sequentie [86](#page=86). > **Tip:** De gevoeligheid van MSP kan geoptimaliseerd worden door de juiste primerontwerpstrategieën toe te passen, rekening houdend met de specifieke sequentie na bisulfietconversie. > **Voorbeeld:** Een bedrijf wil de methylatiestatus van een tumor-suppressorgen in tumorweefsel onderzoeken. Met behulp van MSP kan bepaald worden of de promotorregio van dit gen hypergemethyleerd is, wat kan leiden tot genstilte. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Amplicon | Het fragment DNA dat cyclisch en exponentieel wordt geproduceerd tijdens een Polymerase Chain Reaction (PCR). | | PCR | Polymerase Chain Reaction, een moleculair-biologische techniek om specifieke DNA-fragmenten exponentieel te vermenigvuldigen. | | Direct PCR | Een PCR-techniek die direct op "levend" biologisch materiaal wordt uitgevoerd, zonder voorafgaande DNA-isolatie, wat tijd en kosten bespaart. | | Colony PCR | Een type direct PCR dat wordt toegepast bij de controle van genetische manipulatie van bacteriën of voor microbiologische screening, zoals op antibioticumresistentie. | | Single Cell PCR | Een direct PCR-techniek die gebruikt wordt in technieken zoals in vitro fertilisatie en voor single-cell genotypering, waarbij PCR op een individuele cel wordt uitgevoerd. | | Nested PCR | Een PCR-techniek die bestaat uit twee opeenvolgende PCR-stappen met verschillende sets primers om de specificiteit van de amplificatie te verhogen. | | Hot Start PCR | Een PCR-methode waarbij het DNA-polymerase-enzym pas geactiveerd wordt na een hittebehandeling, wat de vorming van aspecifieke fragmenten bij lagere temperaturen voorkomt. | | Touch Down PCR | Een PCR-techniek waarbij de annealingtemperatuur door de cycli heen geleidelijk wordt verlaagd, beginnend bij een hoge temperatuur, om de specificiteit van primerbinding te verhogen. | | RT-PCR | Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, een techniek die begint met RNA en dit omzet in cDNA met reverse transcriptase, gevolgd door PCR om het cDNA te amplificeren. | | Genexpressie | Het proces waarbij de informatie in een gen wordt gebruikt om een functioneel product, meestal een eiwit, te synthetiseren. | | mRNA | Messenger RNA, een molecuul dat de genetische code van DNA naar het ribosoom transporteert voor eiwitsynthese. | | cDNA | Complementair DNA, een DNA-molecuul dat gesynthetiseerd wordt op basis van een RNA-mal met behulp van reverse transcriptase. | | Transcriptomics | Het vakgebied dat zich bezighoudt met de studie van transcriptomen, de volledige sets van RNA-moleculen die door een cel of populatie van cellen worden geproduceerd onder specifieke omstandigheden. | | Normalisatie (in RT-PCR) | Een procedure in RT-PCR waarbij de gemeten genexpressieniveaus worden gecorrigeerd met behulp van de expressieniveaus van één of meerdere referentiegenen om artefacten te minimaliseren. | | Referentiegen | Een gen dat constitutief tot expressie komt en waarvan de expressie niet wordt beïnvloed door de experimentele condities, gebruikt voor normalisatiedoeleinden in genexpressie-analyses. | | Multiplex PCR | Een PCR-reactie die meerdere sets primers bevat in één reactiebuisje, waardoor meerdere DNA-templates tegelijkertijd kunnen worden geamplificeerd. | | AFLP-PCR | Amplification Fragment Length Polymorphism-PCR, een techniek voor genotypering die genetische variatie detecteert door fragmentlengteverschillen na restrictie-digest en PCR. | | RAPD | Random Amplified Polymorphic DNA, een PCR-gebaseerde techniek die willekeurige primers gebruikt om polymorfismen in het DNA te detecteren, vaak gebruikt voor genotypering van bacteriën. | | VNTR-PCR | Variable Number of Tandem Repeats PCR, een methode die gebruikmaakt van repetitieve DNA-sequenties waarvan het aantal herhalingen varieert tussen individuen, veelal toegepast in forensisch onderzoek en vaderschapsbepaling. | | Microsatelliet (STR) | Een korte tandem repeat (STR) is een sequentie van DNA, bestaande uit 1 tot 6 basenparen, die meer dan eens herhaald wordt. | | Minisatelliet (SSR) | Een minisatelliet (SSR) is een sequentie van DNA, bestaande uit meer dan 6 basenparen, die meer dan eens herhaald wordt. | | DNA-methylatie | Een epigenetische modificatie waarbij een methylgroep wordt toegevoegd aan een DNA-molecuul, wat de genexpressie kan beïnvloeden zonder de DNA-sequentie te veranderen. | | Methylspecifieke PCR (MSP) | Een PCR-techniek die afhangt van DNA-methylatie en wordt gebruikt om de aanwezigheid of afwezigheid van methylaties op specifieke locaties in het genoom te detecteren. | | Epigenetische merker | Een chemische modificatie aan DNA of bijbehorende eiwitten die de genexpressie beïnvloedt, maar niet de onderliggende DNA-sequentie verandert. | | Elektroforese | Een techniek die wordt gebruikt om biomoleculen, zoals DNA, RNA en eiwitten, te scheiden op basis van hun grootte en lading door een elektrisch veld toe te passen. | | Capillaire gelelektroforese | Een methode van elektroforese die gebruikmaakt van dunne capillairen gevuld met een scheidingsmedium om biomoleculen te scheiden, wat leidt tot elektroferogrammen. | | Elektroferogram | Een grafische weergave van de resultaten van elektroforese, waarbij de gescheiden componenten worden gedetecteerd en weergegeven als pieken. |