H7 fysica

# Basisprincipes van microscopie: interferentie en diffractie Dit onderwerp behandelt de fundamentele fysische principes van interferentie en diffractie die essentieel zijn voor het begrijpen van microscopische technieken, met de focus op hoe golven zich gedragen en hoe dit wordt toegepast in optische instrumenten. ### 1.1 Interferentie Interferentie is een fenomeen dat optreedt wanneer twee of meer golven elkaar ontmoeten. De interactie van deze golven kan leiden tot een verandering in de amplitude van de resulterende golf [2](#page=2). #### 1.1.1 Constructieve interferentie Constructieve interferentie treedt op wanneer golven in fase zijn. Dit betekent dat de toppen van de ene golf samenvallen met de toppen van de andere, en de dalen samenvallen met de dalen. Mathematisch wordt dit beschreven door een faseverschil dat een veelvoud is van de golflengte $\lambda$ [2](#page=2) [3](#page=3). * Faseverschil: $n\lambda$ [3](#page=3). #### 1.1.2 Destructieve interferentie Destructieve interferentie treedt op wanneer golven in tegenfase zijn. Hierbij vallen de toppen van de ene golf samen met de dalen van de andere, wat leidt tot een reductie of eliminatie van de amplitude. Dit gebeurt wanneer het faseverschil een oneven veelvoud van een halve golflengte is [2](#page=2) [3](#page=3). * Faseverschil: $(2n+1)\frac{\lambda}{2}$ [3](#page=3). #### 1.1.3 Toepassing in microscopie Een specifieke toepassing van interferentie in de context van lichtgolven is te vinden bij het bepalen van de kleinste hoek waaronder destructieve interferentie optreedt. Dit is relevant voor het begrijpen van beeldvorming en resolutie in optische systemen [4](#page=4). * Formule voor de kleinste hoek van destructieve interferentie: $d\sin\theta = \frac{\lambda}{2}$ [4](#page=4). > **Tip:** Onthoud dat het faseverschil cruciaal is voor het bepalen of interferentie constructief of destructief is. ### 1.2 Diffractie Diffractie is het verschijnsel waarbij golven zich verbreden wanneer ze door een opening of langs een obstakel gaan. Dit effect is bijzonder merkbaar wanneer de afmeting van de opening of het obstakel vergelijkbaar is met de golflengte van de golf [5](#page=5). #### 1.2.1 Diffractie door een smalle spleet Wanneer een parallelle bundel licht door een smalle spleet gaat, treedt diffractie op, wat resulteert in een diffractiepatroon. Dit patroon bestaat uit heldere en donkere stroken [5](#page=5). * De hoek van de eerste donkere strook wordt gegeven door: $\sin\theta = \frac{\lambda}{W}$ [5](#page=5). * Hierin is $W$ de breedte van de spleet [5](#page=5). #### 1.2.2 Algemene formule voor diffractie De algemene formule voor de hoeken van de donkere stroken bij diffractie door een enkele spleet is: * $\sin\theta = n\frac{\lambda}{W}$ [6](#page=6). * Hierin staat $n$ voor het ordegetal van de donkere strook ($n=1, 2, 3, \dots$) [6](#page=6). > **Tip:** Het begrijpen van diffractie is fundamenteel voor het maximaliseren van de resolutie van microscopen, aangezien het de limiet stelt aan hoe fijnzinnig details waargenomen kunnen worden. --- # Onderscheidend vermogen en lensaberraties in lichtmicroscopie Dit deel van de studiehandleiding behandelt de fundamentele limieten van het onderscheidend vermogen in lichtmicroscopie, waaronder het criterium van Rayleigh en de impact van diffractie, evenals veelvoorkomende lensaberraties en hun correcties. ### 2.1 Onderscheidend vermogen Het onderscheidend vermogen van een microscoop wordt bepaald door de mate waarin deze twee nabijgelegen objecten nog als afzonderlijke entiteiten kan waarnemen. Dit fenomeen wordt beïnvloed door diffractie, het buigen van lichtgolven wanneer ze door een kleine opening passeren, zoals de apertuur van een objectief [7](#page=7). #### 2.1.1 De invloed van diffractie Wanneer licht door een smalle opening valt, ontstaat een circulair diffractiepatroon. Dit patroon bestaat uit een centraal maximum en concentrische minima. De hoek $\theta$ naar het eerste minimum wordt beschreven door de formule [7](#page=7): $$ \sin \theta = 1,22 \frac{\lambda}{D} $$ waarbij $\lambda$ de golflengte van het licht is en $D$ de diameter van de opening [7](#page=7). Wanneer twee puntvormige objecten dicht bij elkaar liggen, overlappen hun individuele diffractiepatronen. De mate van scheiding tussen deze objecten bepaalt of ze nog als afzonderlijk kunnen worden waargenomen [8](#page=8) [9](#page=9). #### 2.1.2 Criterium van Rayleigh Het criterium van Rayleigh stelt dat twee puntvormige objecten nog net van elkaar te onderscheiden zijn wanneer het centrale maximum van het diffractiepatroon van het ene object samenvalt met het eerste minimum van het diffractiepatroon van het andere object [9](#page=9). Voor kleine hoeken, waar $\sin \theta \approx \theta$, kan de minimale hoek $\theta_{\min}$ worden uitgedrukt als: $$ \theta_{\min} = 1,22 \frac{\lambda}{D} $$ Deze minimale hoek definieert de kleinste afstand tussen twee punten die nog als gescheiden waargenomen kunnen worden [10](#page=10). De kleinste afstand $s$ tussen twee onderscheidbare punten, ook wel de resolutie genoemd, is gerelateerd aan de minimale hoek en de afstand van het object tot de lens. Voor een microscoop geldt een relatie waarbij de resolutie $s$ ongeveer evenredig is met de golflengte van het licht ($\lambda$) en omgekeerd evenredig met de numerieke apertuur ($NA = D/d$, waarbij $d$ de afstand van het object tot de lens is): $$ s \approx \frac{1,22 \lambda d}{D} $$ Aangezien voor een microscoop $d/D$ typisch groot is, kan de resolutie vereenvoudigd worden als $s \approx \lambda$. Dit benadrukt het belang van het gebruik van kortere golflengtes (bijvoorbeeld blauw licht of UV-licht) voor een hogere resolutie [11](#page=11). > **Tip:** Een hogere numerieke apertuur van de objectieflens verbetert het onderscheidend vermogen aanzienlijk. Dit kan bereikt worden door de diameter van de lens te vergroten of de afstand tot het object te verkleinen, bijvoorbeeld door middel van immersie-olie. ### 2.2 Lensaberraties Lensaberraties zijn imperfecties in lenzen die leiden tot vervormingen in het beeld, waardoor de scherpte en nauwkeurigheid van de microscopische waarneming afnemen. #### 2.2.1 Sferische aberratie Sferische aberratie treedt op omdat de focale lengte van de buitenste zones van een bolvormige lens verschilt van die van de centrale zones. Dit resulteert in een slechte focus, met name voor licht dat door de randen van de lens gaat [12](#page=12). * **Oplossing:** Om sferische aberratie te minimaliseren, kan een variabele apertuur worden gebruikt om de buitenste stralen af te snijden, waardoor alleen licht dat door de centrale, beter gefocuste delen van de lens gaat, wordt gebruikt [12](#page=12). #### 2.2.2 Chromatische aberratie Chromatische aberratie ontstaat door het verschijnsel dispersie: verschillende golflengtes van licht worden met verschillende hoeken gebroken wanneer ze door een lens gaan. Kortere golflengtes (zoals blauw licht) worden sterker gebroken dan langere golflengtes (zoals rood licht). Dit leidt tot een gekleurde halo rondom het object en een onscherp beeld, aangezien de verschillende kleuren niet op hetzelfde punt focussen [13](#page=13). * **Oplossing:** Chromatische aberratie wordt gecorrigeerd door het gebruik van samengestelde lenzen, ook wel achromatische of apochromatische lenzen genoemd. Deze lenzen bestaan uit meerdere elementen gemaakt van verschillende glassoorten met variërende brekingsindices, die ontworpen zijn om de dispersie van verschillende golflengtes te compenseren [13](#page=13). #### 2.2.3 Beeldvlakkromming Beeldvlakkromming (ook wel veldkromming genoemd) is een aberratie waarbij een object dat in een plat vlak ligt, wordt afgebeeld in een gekromd vlak. Dit betekent dat, zelfs als het centrum van het beeld scherp is, de randen onscherp kunnen zijn, of vice versa [14](#page=14). * **Oplossing:** Beeldvlakkromming wordt aangepakt door het gebruik van lenzensystemen in plaats van enkele lenzen. Lenzenstelsels, zoals die in aplanatische lenzen, worden geconstrueerd om dit effect te corrigeren [14](#page=14). --- # Componenten en werking van een lichtmicroscoop Dit onderwerp beschrijft de diverse onderdelen van een lichtmicroscoop, inclusief de lichtbron, condensor, objectief en oculair, met uitleg over de formules voor vergroting en een introductie tot verschillende microscopietypes. ### 3.1 Componenten van een lichtmicroscoop Een lichtmicroscoop bestaat uit verschillende essentiële componenten die samenwerken om vergrote beelden van specimens te produceren [15](#page=15). #### 3.1.1 Lichtbron De lichtbron, vaak een halogeenlamp, produceert zichtbaar licht dat door de microscoop wordt gebruikt om het specimen te verlichten. Het lichtspectrum van een halogeenlamp is afhankelijk van de dimming; bij sterk gedimd licht is er een sterkere aanwezigheid van geel/rood licht. Het is cruciaal om de juiste lichtsterkte te gebruiken en aangepaste filters toe te passen voor optimale beeldvorming [31](#page=31). #### 3.1.2 Condensor en diafragma De condensor is verantwoordelijk voor het gelijkmatig verdelen van het licht over het specimen. Hij focust een kegel van licht met uniforme intensiteit op het specimen. Het diafragma, een onderdeel van de condensor, regelt de apertuur van de condensor. De apertuur van de condensor moet zo ingesteld zijn dat deze 70-90% van het objectief belicht, om reflecties of resolutieverlies te voorkomen [15](#page=15) [32](#page=32). In donkerveldmicroscopie wordt de condensor gebruikt om te verhinderen dat de directe lichtbundel het objectief bereikt, door middel van een centrale lichtstop [33](#page=33). #### 3.1.3 Tafel voor specimen De tafel voor het specimen is in hoogte verstelbaar en dient voor het plaatsen van het preparaat. De hoogteverstelling is essentieel voor het scherpstellen van het beeld [15](#page=15). #### 3.1.4 Objectief Het objectief is het eerste vergrotende lenzensysteem in de microscoop. Het is gemonteerd op een roterende houder, waardoor verschillende objectieven gemakkelijk kunnen worden verwisseld. Objectieven bestaan uit samengestelde lenzen [15](#page=15). De numerieke apertuur (NA) van een objectief is gedefinieerd als $NA = n \sin\alpha$, waarbij $n$ de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het specimen is, en $\alpha$ de halve openingshoek van de lichtkegel is. De resolutie van een microscoop wordt bepaald door de golflengte van het licht ($\lambda$) en de numerieke apertuur, volgens de formule: $d = \frac{\lambda}{2 \cdot NA}$. De best mogelijke resolutie met een lichtmicroscoop is ongeveer 0.2 micrometer [34](#page=34). De formule voor de resolutie kan ook worden uitgedrukt als $d = \frac{1.22 \lambda}{NA_{condensor} + NA_{objectief}}$ of $d = \frac{0.61 \lambda}{NA}$ [34](#page=34). Er wordt onderscheid gemaakt tussen objectieven met en zonder immersieolie. Immersieolie wordt gebruikt om de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het specimen te verhogen, wat de numerieke apertuur en daarmee de resolutie verbetert [35](#page=35). #### 3.1.5 Oculair Het oculair, ook wel bekend als het ooglensysteem, is een vergrootglas dat het reeds vergrote beeld van het objectief verder vergroot. Het oculair biedt een beperkte vergroting, typisch rond de 10x. Sommige oculairs zijn uitgerust met een meetplaatje om lengtemetingen uit te voeren na ijking [15](#page=15) [41](#page=41). ### 3.2 Vergroting van de microscoop De totale vergroting van een lichtmicroscoop wordt verkregen door de vergroting van het objectief te vermenigvuldigen met de vergroting van het oculair [29](#page=29). #### 3.2.1 Vergroting van het objectief De vergroting van het objectief ($m_o$) wordt bepaald door de verhouding van de beeldafstand ($i_o$) tot de voorwerpafstand ($p_o$). Hierbij is de voorwerpafstand $p_o$ negatief en de beeldafstand $i_o$ en brandpuntsafstand $f_o$ positief. De dunne lensformule wordt hier toegepast [27](#page=27): $$ \frac{1}{p_o} + \frac{1}{i_o} = \frac{1}{f_o} $$ [27](#page=27). De vergroting van het objectief wordt gegeven door: $$ m_o = \frac{i_o}{p_o} $$ [27](#page=27). Omdat $p_o$ negatief is, wordt de formule voor de vergroting vaak geschreven als: $$ m_o = -\frac{i_o}{p_o} $$ [27](#page=27). Of, wanneer de tubuslengte ($d$) en brandpuntsafstand van het objectief ($f_o$) bekend zijn: $$ m_o = \frac{d}{f_o} $$ [27](#page=27). #### 3.2.2 Vergroting van het oculair Voor het oculair ($m_e$) zijn de voorwerpafstand ($p_e$) en de beeldafstand ($i_e$) vaak negatief, terwijl de brandpuntsafstand ($f_e$) positief is. De dunne lensformule voor het oculair is [28](#page=28): $$ \frac{1}{p_e} + \frac{1}{i_e} = \frac{1}{f_e} $$ [28](#page=28). De vergroting van het oculair wordt gegeven door: $$ m_e = \frac{i_e}{p_e} $$ [28](#page=28). Wanneer het beeld door het oculair gevormd wordt op het nabijheidspunt (N = 25 cm), is $i_e \approx -N$. De vergroting van het oculair wordt dan: $$ m_e = \frac{-N}{p_e} $$ [28](#page=28). Of, als benadering, de vergroting van het oculair wordt gegeven door: $$ m_e \approx \frac{N}{f_e} $$ [28](#page=28). #### 3.2.3 Totale vergroting De totale vergroting ($m$) van de microscoop is het product van de vergroting van het objectief ($m_o$) en de vergroting van het oculair ($m_e$): $$ m = m_o \cdot m_e $$ [29](#page=29). Wanneer $N$ de afstand van het nabijheidspunt (25 cm) is, kan de totale vergroting bij benadering worden uitgedrukt als: $$ m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ [29](#page=29). Een meer nauwkeurige benadering houdt rekening met de beeldafstand van het objectief ($i_o$): $$ m \approx \frac{i_o}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ [29](#page=29). Een nog nauwkeurigere formule, waarbij de relatie tussen de tubuslengte ($d$), de beeldafstand van het objectief ($i_o$) en de voorwerpafstand van het oculair ($p_e$) in acht wordt genomen ($d = i_o - p_e$): $$ m = -\frac{i_o}{f_o} \left(1 + \frac{N}{f_e}\right) $$ [29](#page=29). **Voorbeeld van vergrotingberekening:** Gegeven: brandpuntsafstand objectief $f_o$ = 5 mm, brandpuntsafstand oculair $f_e$ = 30 mm, tubuslengte $d$ = 230 mm. Bereken bij benadering de vergroting. De voorwerpafstand van het oculair ($p_e$) kan worden afgeleid uit de tubuslengte en de brandpuntsafstanden. De beeldafstand van het objectief ($i_o$) is ongeveer gelijk aan de tubuslengte ($d$) verminderd met de voorwerpafstand van het oculair ($p_e$). We hebben $d = i_o - p_e$. Uit de lensformule voor het objectief, met $i_o \approx d$, kunnen we $p_o$ berekenen: $$ \frac{1}{p_o} = \frac{1}{f_o} - \frac{1}{i_o} = \frac{1}{5 \text{ mm}} - \frac{1}{230 \text{ mm}} = \frac{230 - 5}{5 \cdot 230} = \frac{225}{1150} $$ $$ p_o \approx \frac{1150}{225} \approx 5.11 \text{ mm} $$ De vergroting van het objectief is dan: $$ m_o = \frac{i_o}{p_o} = \frac{230 \text{ mm}}{-5.11 \text{ mm}} \approx -45.0 $$ De vergroting van het oculair, met het beeld op het nabijheidspunt (N=250 mm), is: $$ m_e \approx \frac{N}{f_e} = \frac{250 \text{ mm}}{30 \text{ mm}} \approx 8.33 $$ De totale vergroting is dan: $$ m = m_o \cdot m_e \approx -45.0 \cdot 8.33 \approx -375 $$ De negatieve waarde geeft de omkering van het beeld aan. De vergroting is dus ongeveer 375x. Gebruikmakend van de benaderingsformule: $$ m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ $$ m \approx \frac{230 \text{ mm}}{5 \text{ mm}} \cdot \frac{250 \text{ mm}}{30 \text{ mm}} = 46 \cdot 8.33 \approx 383.18 $$ Dit is een benadering. Volgens de gegeven berekening op [30](#page=30): $i_o = d - p_e$ en $p_e = N$ voor het oog op het nabijheidspunt. De formules op lijken deze specifieke berekening te hanteren [30](#page=30): $i_o = 230 \text{ mm} - (250 \text{ mm} \cdot \frac{30 \text{ mm}}{30 \text{ mm}}) = 230 \text{ mm} - 250 \text{ mm} = -20 \text{ mm}$ (Dit is onlogisch, beeldafstand kan niet negatief zijn indien de lens in het midden is geplaatst) De formule $i_o = d+p_e$ wordt gebruikt in de bron: $i_o = 230 + 250 = 480$ mm (Dit is ook niet logisch) De berekening op pagina 30 lijkt de formules $e_{o}f_{o}N/i_{o}f_{e}$ te gebruiken voor de vergroting, met $i_o$ afgeleid uit de tubuslengte. Een correcte berekening voor de gegeven voorbeeld is: Brandpuntsafstand objectief ($f_o$) = 5 mm. Tubuslengte ($d$) = 230 mm. Nabijheidspunt ($N$) = 250 mm. Brandpuntsafstand oculair ($f_e$) = 30 mm. De beeldafstand van het objectief ($i_o$) is ongeveer gelijk aan de tubuslengte: $i_o \approx d = 230$ mm. De voorwerpafstand van het oculair ($p_e$) wordt afgeleid uit de tubuslengte en de brandpuntsafstand van het oculair, waarbij het beeld op het nabijheidspunt wordt gevormd. Echter, de vereenvoudigde formules op zijn [29](#page=29): $$ m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e} $$ $$ m \approx \frac{230}{5} \cdot \frac{250}{30} = 46 \cdot 8.33 \approx 383 $$ De berekening op pagina 30 lijkt de formule $m = \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ te gebruiken, met enigszins afwijkende waarden in de tussenstappen: $i_o = 230$ mm ( tubuslengte) $p_e = i_o - d = 230 - 230 = 0$? (Dit is fout) De correcte formule $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ geeft $m \approx \frac{230}{5} \cdot \frac{250}{30} \approx 383$ [29](#page=29) [30](#page=30). De berekening in het voorbeeld op is [30](#page=30): $i_o \approx d = 230$ mm $p_e \approx N - f_e = 250 - 30 = 220$ mm (Dit is de voorwerpafstand voor een beeld op afstand N) $m_e = N / p_e = 250 / 220 \approx 1.14$? (Dit klopt niet met de 10x typische vergroting) De berekening op lijkt de formule $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ te gebruiken [30](#page=30): $m \approx \frac{230}{5} \cdot \frac{250}{30} = 46 \cdot 8.33 = 383$ (ongeveer) De stappen op gebruiken echter [30](#page=30): $i_o = 230 \text{ mm} - 250 \text{ mm} = -20$ (Deze stap is incorrect en niet fysiek zinvol) $m \approx 30 \cdot 250 \cdot 20 / (30 \cdot 5) = 340 \cdot 30 \cdot 5 / 250 \cdot 20 = 30250 / 230$ (Deze berekeningen lijken niet te kloppen met de bekende formules.) Echter, als we de formule $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ toepassen: $m \approx \frac{230 \text{ mm}}{5 \text{ mm}} \cdot \frac{250 \text{ mm}}{30 \text{ mm}} = 46 \cdot 8.33 \approx 383$ [29](#page=29) [30](#page=30). De berekening op pagina 30 gebruikt $m \approx \frac{N f_o}{f_e}$ is ook niet correct. De formule gebruikt op is [30](#page=30): $m \approx \frac{d}{f_o} \cdot \frac{N}{f_e}$ $m \approx \frac{230}{5} \times \frac{250}{30} = 46 \times 8.33 = 383$ De tussenstap $20330250$ en $340305$ zijn verwarrend en lijken een andere aanpak te volgen. De directe toepassing van de formule op geeft echter een resultaat rond de 383 [29](#page=29). > **Tip:** Let goed op de correcte toepassing van de dunne lensformule en de definities van de verschillende afstanden bij het berekenen van de vergroting. De benaderingsformule is vaak voldoende voor examens. ### 3.3 Verschillende microscopietypes Naast de conventionele lichtmicroscoop zijn er diverse gespecialiseerde types die voor specifieke toepassingen worden gebruikt. #### 3.3.1 Invers microscoop Een invers microscoop wordt gebruikt wanneer het object te dik is om op een conventionele microscoop scherp te worden weergegeven. Bij dit type microscoop staan de lichtbron en de condensor boven het object, terwijl het objectief zich onder het object bevindt [42](#page=42). #### 3.3.2 Fase-contrast microscopie Conventionele lichtmicroscopie maakt gebruik van intensiteitsverschillen die ontstaan door absorptie van invallend licht, vaak na kleuring van het preparaat. Fase-contrast microscopie daarentegen maakt gebruik van intensiteitsverschillen die ontstaan door faseverschillen, veroorzaakt door variaties in de brekingsindex van verschillende structuren binnen het specimen [43](#page=43). Bij fase-contrast microscopie wordt een parallelle lichtbundel door een smalle spleet geleid. Een faseverschil van $\lambda/4$ ontstaat tussen het centrale maximum en het eerste diffractie maximum. Het licht van het centrale maximum wordt door een gecoate glasplaat geleid om de intensiteit op het niveau van het eerste diffractie maximum te brengen. Het licht van het eerste diffractie maximum ondergaat door de glasplaat een extra faseverschil van $\lambda/4$, wat leidt tot destructieve interferentie [44](#page=44). Een fase-contrast microscoop heeft een condensor met een fasering om een smalle opening te creëren, en een objectief met een faseplaatje. Dit type microscopie is uitermate geschikt voor het in beeld brengen van levende cellen. Een kenmerkend "halo"-effect kan optreden. Perfecte alignatie van de componenten is cruciaal [45](#page=45). Vergelijking van beelden: helderveld, donkerveld, fase-contrast [47](#page=47). #### 3.3.3 DIC microscopie DIC staat voor Differentieel Interferentie Contrast microscopie, ook wel Nomarski microscopie genoemd. Dit type microscopie maakt gebruik van gepolariseerd licht en prisma's [48](#page=48). Voordelen van DIC microscopie zijn het ontbreken van het halo-effect, een schaduw-effect dat een 3D-uiterlijk geeft, een betere resolutie dan fase-contrast, en de mogelijkheid om dikkere preparaten (>100 µm) in beeld te brengen [49](#page=49). #### 3.3.4 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van kleuring met fluorescente merkers, zoals fluoresceïne, die licht uitzenden na excitatie met een specifieke golflengte. Dit type microscopie maakt gebruik van twee filters: één voor het excitatielicht en één voor het emissielicht [50](#page=50). Het belang van beeldverwerking, met name wiskundige deconvolutie, is significant in fluorescentiemicroscopie om de sterkte van verstrooid licht buiten het focale vlak te reduceren [53](#page=53). #### 3.3.5 Gecombineerde systemen Het is mogelijk om systemen te combineren, zoals fase-contrast en fluorescentiemicroscopie [54](#page=54). --- # Geavanceerde microscopietechnieken en elektronmicroscopie Dit deel bespreekt geavanceerde microscopietechnieken die een aanzienlijk hoger oplossend vermogen bieden dan de klassieke lichtmicroscoop, met een focus op confocale microscopie, de principes van elektronmicroscopie (TEM en SEM), en scanning probe microscopen (STM en AFM) [55-65. ### 4.1 Confocale microscopie Confocale microscopie is een geavanceerde techniek die gebruikmaakt van een laserbundel die het preparaat afscant. Een cruciaal aspect is dat licht dat buiten het brandvlak valt, wordt tegengehouden door een plaat met een confocale apertuur. Dit stelt de microscopische evaluatie van dikkere weefselstukken mogelijk, met de optie voor driedimensionale reconstructies. Meestal wordt deze techniek toegepast in combinatie met fluorescentie. Het onderscheidend vermogen van de microscoop is 0.2 micrometer, met een maximale vergroting van 10^4, en het medium is lucht. De toepassing is voornamelijk op dood materiaal, waarbij een 3D beeld wordt verkregen [55](#page=55) [56](#page=56) [57](#page=57) [65](#page=65). ### 4.2 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie maakt gebruik van de deeltjes-golf dualiteit, waarbij aan bewegende deeltjes een golfkarakter wordt toegekend volgens de de Broglie golflengte: $$ \lambda = \frac{h}{m v} $$ Hierbij is $\lambda$ de golflengte, $h$ de constante van Planck, $m$ de massa van het deeltje en $v$ de snelheid. Dit principe leidt tot een veel groter oplossend vermogen in vergelijking met de lichtmicroscoop. Elektronen worden geproduceerd door een wolfraamkathode. De focussering gebeurt met elektromagnetische lenzen, die echter ook lensfouten vertonen. Voor betere contrastvorming worden preparaten gekleurd met elementen met een hoge atoomnummer (hoge Z-elementen), die sterke verstrooiing van elektronen veroorzaken [58](#page=58). Het medium waarin elektronenmicroscopie plaatsvindt, is een vacuüm, in tegenstelling tot de atmosferische druk bij lichtmicroscopie. Dit is noodzakelijk omdat elektronen snel verstrooid zouden worden door gasmoleculen [60](#page=60). #### 4.2.1 Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) De Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) werkt door een bundel elektronen door een zeer dun preparaat te sturen. Hierbij worden de elektronen verstrooid door het materiaal, en de patronen die hieruit voortkomen, worden gedetecteerd om een beeld te vormen. De TEM heeft een onderscheidend vermogen van 1 nanometer en een maximale vergroting van 10^5. Het beeld is typisch 2D en de toepassing is op dood materiaal [59](#page=59) [60](#page=60) [65](#page=65). Een vergelijking tussen Lichtmicroscoop (LM) en TEM: | Kenmerk | Lichtmicroscoop (LM) | Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) | | :-------------------- | :------------------------ | :------------------------------------- | | Lichtbron | Sterke lamp | Elektronenkanon | | Lenzen | Bolle lenzen (glas) | EM lenzen (elektromagnetisch) | | Detector | Oog, camera | Fluorescent scherm, camera | | Focussering | Axiale beweging objectief | Aanpassing stroom EM lenzen | | Medium | Atmosfeerdruk | Vacuüm | | Onderscheidend vermogen | 0.2 micrometer | 1 nanometer | | Maximale vergroting | 10^3 | 10^5 | | Toepassing | Levend/dood materiaal | Dood materiaal | | Beeldvorming | 2D | 2D | #### 4.2.2 Scanning elektronenmicroscoop (SEM) De Scanning elektronenmicroscoop (SEM) wordt gebruikt voor het scannen van het oppervlak van een preparaat. In plaats van elektronen door het monster te sturen, wordt een elektronenbundel over het oppervlak van het preparaat gescand. De detectie van secundaire elektronen of teruggekaatste elektronen vormt het beeld. De SEM heeft een resolutie van 10 nanometer en een maximale vergroting van 2 x 10^4. Het biedt een 2D beeld dat echter een 3D-indruk kan geven van het oppervlak. De toepassing is voornamelijk voor oppervlaktestudies van dood materiaal [61](#page=61) [65](#page=65). ### 4.3 Scanning probe microscopen (SPM) Scanning probe microscopen (SPM) zijn gebaseerd op het mechanisch aftasten van een oppervlak met een fijne probe. Ze kunnen details tot 0.1 nanometer in 3D vastleggen. De opbouw omvat een probe die de uitwijking detecteert, vibratiestabilisatie en elektronische circuits die verbonden zijn met een computer. Er zijn twee hoofdtypen: de Scanning tunnel microscoop (STM) en de Atomic force microscoop (AFM) [62](#page=62). #### 4.3.1 Scanning tunnel microscoop (STM) De Scanning tunnel microscoop (STM) maakt gebruik van een piëzoëlektrische probe die over het oppervlak beweegt en de uitwijking detecteert. Een aangelegde spanning ($V$) over de probe genereert een tunnelstroom ($I$). Deze stroom is gerelateerd aan de afstand ($x$) tot het oppervlak volgens [63](#page=63): $$ I \sim V e^{-x} $$ Om een constante tunnelstroom te behouden, wordt de afstand bijgeregeld door de spanning te variëren. De STM is alleen toepasbaar op geleidende oppervlakken. Het onderscheidend vermogen is 0.1 nanometer met een maximale vergroting van 10^9. Het medium kan lucht, vloeistof of vacuüm zijn, en de toepassing is oppervlaktestudie met een 3D beeld [63](#page=63) [65](#page=65). #### 4.3.2 Atomic force microscoop (AFM) De Atomic force microscoop (AFM) werkt door het monster te bewegen ten opzichte van een scherpe probe die in contact is met een krachtsensor. De interatomaire krachten ($F$) tussen de probe en het monster worden gemeten, wat een perfect contact mogelijk maakt. De kracht is gerelateerd aan de afstand ($z$) door [64](#page=64): $$ F \sim -k z $$ Hierbij is $k$ een constante die de stijfheid van de cantilever beschrijft. AFM kan ook worden toegepast op niet-geleidende oppervlakken. Het onderscheidend vermogen is 0.1 nanometer met een maximale vergroting van 10^9. Het medium kan lucht, vloeistof of vacuüm zijn, en de toepassing is oppervlaktestudie met een 3D beeld [64](#page=64) [65](#page=65). ### 4.4 Overzicht van microscopietechnieken | Techniek | Onderscheidend vermogen | Max. vergroting | Medium | Biologische toepassing | Beeld | | :------------------ | :---------------------- | :-------------- | :------------------ | :---------------------------- | :--------- | | **LM** | | | | | | | Klassieke LM | 0.2 µm | 10³ | Lucht, vloeistof | Dood materiaal | 2D | | Fluorescentie LM | 0.2 µm | 10³ | Lucht | Dood materiaal | 2D | | Fasecontrast/DIC LM | 0.2 µm | 10³ | Lucht | Levend materiaal | 2D | | Confocale LM | 0.2 µm | 10⁴ | Lucht | Dood materiaal | 3D | | **EM** | | | | | | | TEM | 1 nm | 10⁵ | Vacuüm | Dood materiaal | 2D | | SEM | 10 nm | 2x10⁴ | Vacuüm | Dood materiaal (oppervlak) | 2D (schijn 3D) | | **SPM** | | | | | | | STM | 0.1 nm | 10⁹ | Lucht, vloeistof, vacuüm | Oppervlaktestudie | 3D | | AFM | 0.1 nm | 10⁹ | Lucht, vloeistof, vacuüm | Oppervlaktestudie | 3D | > **Tip:** Bij het bestuderen van deze technieken is het belangrijk om niet alleen de principes te kennen, maar ook de specifieke voordelen en beperkingen van elke methode, evenals hun toepassingen in biologisch onderzoek. Let met name op het verschil in oplossend vermogen en de te scannen dimensie (2D vs. 3D). > **Voorbeeld:** De keuze tussen TEM en SEM hangt af van de vraag of men interne structuren (TEM) of de oppervlaktetopografie (SEM) van een monster wil bestuderen. Voor levende cellen zijn fasecontrast- of DIC-microscopen geschikter dan de meeste geavanceerde technieken die een vacuüm vereisen of het monster kunnen beschadigen. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Interferentie | Het verschijnsel waarbij twee of meer golven elkaar ontmoeten en hun amplitudes zich superponeren, wat leidt tot een nieuw golfpatroon. Dit kan constructief zijn (versterking) als de golven in fase zijn, of destructief (verzwakking) als ze in tegenfase zijn. | | Constructieve interferentie | Treedt op wanneer golven in fase zijn, wat betekent dat hun pieken en dalen samenvallen. Het faseverschil is een veelvoud van de golflengte ($\lambda$), dus $n\lambda$, waarbij $n$ een geheel getal is. Dit resulteert in een grotere amplitude. | | Destructieve interferentie | Treedt op wanneer golven in tegenfase zijn, wat betekent dat de piek van de ene golf samenvalt met het dal van de andere. Het faseverschil is een oneven veelvoud van een halve golflengte, dus $(2n+1)\lambda/2$, waarbij $n$ een geheel getal is. Dit kan leiden tot annulering van de golven. | | Faseverschil | Het verschil in fase tussen twee golven, uitgedrukt in graden, radialen of als een fractie van de golflengte. Dit is cruciaal voor het bepalen of interferentie constructief of destructief zal zijn. | | Faseverschil $n\lambda$ | Dit geeft aan dat de golven in fase zijn, leidend tot constructieve interferentie. ($n$ is een geheel getal.) | | Faseverschil $(2n+1)\lambda/2$ | Dit geeft aan dat de golven in tegenfase zijn, leidend tot destructieve interferentie. ($n$ is een geheel getal.) | | Diffractie | Het buigen en verspreiden van golven wanneer ze een obstakel passeren of door een opening gaan. Dit fenomeen is verantwoordelijk voor de vorming van patronen na het passeren van licht door een spleet of door optische elementen zoals lenzen. | | Diffractiepatroon | Het patroon van lichte en donkere banden of ringen dat ontstaat als gevolg van diffractie van licht. De intensiteitsverdeling in dit patroon hangt af van de golflengte van het licht en de afmetingen van de opening of het obstakel. | | Eerste donkere strook (bij diffractie door een spleet) | De eerste donkere lijn in een diffractiepatroon, die optreedt wanneer het licht dat door de spleet gaat, destructieve interferentie vertoont. De hoek waaronder dit gebeurt, wordt gegeven door de formule $sin(\theta) = \lambda/W$, waar $W$ de spleetbreedte is. | | Onderscheidend vermogen (resolutie) | Het vermogen van een microscoop om twee dicht bij elkaar liggende objecten als afzonderlijke entiteiten te onderscheiden. Dit wordt beperkt door diffractie en de golflengte van het gebruikte licht. | | Criterium van Rayleigh | Een criterium dat stelt dat twee puntvormige objecten nog net van elkaar onderscheiden kunnen worden wanneer het centrum van het diffractiepatroon van het ene object samenvalt met de eerste donkere ring van het diffractiepatroon van het andere object. | | Sferische aberratie | Een optische fout in lenzen waarbij lichtstralen die door verschillende delen van de lens gaan, niet op hetzelfde punt focussen. Dit resulteert in een minder scherp beeld, vooral in de buitenste zones van de lens. | | Chromatische aberratie | Een optische fout waarbij verschillende golflengten van licht verschillend worden gebroken door een lens, wat resulteert in kleurschifting in het beeld. Dit komt door de dispersie van licht in het glas. | | Beeldvlakkromming | Een lensfout waarbij een voorwerp dat in een plat vlak ligt, wordt afgebeeld in een gekromd vlak, wat leidt tot vervorming van het beeld. | | Condensor | Een optisch onderdeel in een microscoop dat licht bundelt en focusseert op het te observeren preparaat. Het regelt de gelijkmatige verdeling van licht en de apertuur van de lichtbundel. | | Objectief | Het primaire lenzensysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het preparaat bevindt. Het creëert een eerste, vergroot, reëel beeld van het object. | | Oculair | Het lenzensysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het oog van de waarnemer bevindt. Het vergroot het reële beeld gecreëerd door het objectief, waardoor een virtueel, vergroot beeld ontstaat. | | Tubuslengte ($d$) | De afstand tussen het optische centrum van het objectief en het optische centrum van het oculair in een microscoop. Dit is een standaard specificatie die de vergroting beïnvloedt. | | Dunne lensformule | Een wiskundige relatie die de relatie beschrijft tussen de voorwerpafstand ($p$), de beeldafstand ($i$) en de brandpuntsafstand ($f$) van een lens: $1/f = 1/p + 1/i$. | | Vergroting ($m$) | De verhouding tussen de grootte van het beeld en de grootte van het voorwerp. In microscopie wordt de totale vergroting verkregen door het product van de vergroting van het objectief en het oculair. | | Numerieke Apertuur (NA) | Een maat voor het vermogen van een optisch systeem om licht te verzamelen. Bij microscopen bepaalt de NA de resolutie en de lichtopbrengst van het objectief. Het wordt berekend als $NA = n \cdot \sin(\alpha)$, waarbij $n$ de brekingsindex van het medium is en $\alpha$ de halve openingshoek van de kegel van licht. | | Immersieolie | Een speciale olie met een hoge brekingsindex die tussen het objectief en het preparaat wordt aangebracht. Dit verhoogt de Numerieke Apertuur (NA) van het objectief, waardoor een hogere resolutie mogelijk is. | | Fase-contrast microscopie | Een techniek die de verschillen in brekingsindex van verschillende delen van een preparaat omzet in verschillen in intensiteit, waardoor transparante structuren zichtbaar worden zonder kleuring. | | DIC microscopie (Differentieel Interferentie Contrast) | Ook bekend als Nomarski microscopie, deze techniek gebruikt gepolariseerd licht om kleine hoogteverschillen op een preparaat zichtbaar te maken, wat een 3D-achtig schaduweffect geeft en geen halo-effect vertoont. | | Fluorescentiemicroscopie | Een techniek die gebruikmaakt van fluorescentie, waarbij specifieke moleculen in een preparaat licht van een bepaalde golflengte absorberen en vervolgens licht van een langere golflengte uitzenden. Dit vereist specifieke filters voor excitatie- en emissielicht. | | Confocale microscoop | Een optische microscoop die een laserstraal gebruikt om een preparaat punt voor punt af te tasten. Licht buiten het brandvlak wordt tegengehouden door een confocale apertuur, wat resulteert in optische secties en 3D-reconstructies van dikkere monsters. | | Elektronenmicroscoop | Een microscoop die elektronenbundels in plaats van licht gebruikt om een beeld te vormen. Dit maakt een veel hogere resolutie mogelijk dan bij lichtmicroscopie vanwege de veel kortere de Broglie-golflengte van elektronen. | | Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM) | Een type elektronenmicroscoop waarbij een elektronenbundel door een ultradun monster wordt gestuurd. Beelden worden gevormd op basis van de verstrooiing en transmissie van de elektronen, wat resulteert in een 2D-beeld met zeer hoge resolutie. | | Scanning Elektronenmicroscoop (SEM) | Een type elektronenmicroscoop waarbij een gefocusseerde elektronenbundel het oppervlak van een monster aftast. Het beeld wordt gevormd door de detectie van secundaire elektronen of andere deeltjes die worden uitgezonden vanaf het oppervlak, wat voornamelijk 3D-achtige oppervlaktebeelden oplevert. | | Scanning Tunnelmicroscoop (STM) | Een type scanning probe microscoop die gebruikmaakt van de kwantummechanische tunneling van elektronen tussen een scherpe metalen probe en een geleidend monster. Het meet de afstand met extreem hoge resolutie (tot atomaire schaal). | | Atomic Force Microscoop (AFM) | Een type scanning probe microscoop die de interatomaire krachten meet tussen een scherpe probe aan een cantilever en het oppervlak van het monster. Het kan oppervlaktopografie op atomair niveau afbeelden, zowel voor geleidende als niet-geleidende materialen. |