01 inleiding & techniek 25-26 & notes.pdf

# Methoden voor het prepareren en observeren van cellen en weefsels Dit hoofdstuk behandelt de methoden die nodig zijn om cellen en weefsels zichtbaar te maken voor microscopisch onderzoek, met een focus op celcultuurtechnieken en de principes daarachter [7](#page=7). ### 1.1 Principes van cel- en weefselpreparatie Het doel van het prepareren van cellen en weefsels is om ze observeerbaar te maken onder een lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM). Biologisch materiaal laat echter weinig licht door en heeft van nature weinig contrast, wat fixeren, inbedden, snijden en kleuren of contrasteren noodzakelijk maakt [7](#page=7). ### 1.2 Celcultuur: geschiedenis en concepten Celcultuurtechnieken zijn essentieel geworden in biologisch onderzoek. Historisch gezien begon dit met "Tissue Culture" (TC) in 1907 door Harrison, waarbij zenuwen van kikkerembryo's in lymfe op een glasplaat werden gekweekt. Later, in 1948, ontwikkelde Earle 2D-monolaagcultures, die de 3D-structuur van organen en weefsels "simuleren" [8](#page=8). #### 1.2.1 Celtypen in cultuur * **Primaire culturen:** Ontstaan uit explantaten van organen of tumoren. Deze cellen hebben een beperkte levensduur [8](#page=8). * **Cellijnen:** Stabiele, vaak geïmmortaliseerde cellen met een potentieel onbeperkte levensduur. Deze kunnen afkomstig zijn van tumoren of verkregen worden na selectie ("crisis") van culturen die anders zouden verouderen ("senescence"). Immortalisatie kan ook bereikt worden door de introductie van virale oncogenen [8](#page=8). #### 1.2.2 Stadia van celcultivering Het proces om een cellijn te maken vanuit weefsel omvat verschillende stappen [9](#page=9): 1. Enzymatische behandeling van het weefsel om cellen te scheiden [9](#page=9). 2. Cellen laten uitzakken of centrifugeren naar de bodem [9](#page=9). 3. Cellen uitzaten in een groeirecipiënt, zoals een petrischaal [9](#page=9). 4. Overleven en uitgroeien van de cellen [9](#page=9). 5. Bij een confluente laag cellen, deze losmaken en splitsen voor verdere kweek [9](#page=9). #### 1.2.3 Typische celculturen Celculturen kunnen worden geobserveerd op verschillende vergrotingen. Bij hoge vergroting toont elk wit lijntje de celrand. Bij lage vergroting is te zien hoe een kolonie ontstaat uit een enkele cel en uit meerdere cellen bestaat [10](#page=10). ### 1.3 Groeisubstraten en -procedures #### 1.3.1 Groeisubstraten Groeisubstraten dienen als fysieke drager, maar beschermen cellen ook tegen anoïkis (een vorm van geprogrammeerde celdood of apoptose). Dit is essentieel voor adherente celculturen, wat de meeste celtypes betreft. Verschillende materialen kunnen als substraat dienen [15](#page=15): * Glas (negatief geladen) [15](#page=15). * Voorbehandeld polystyreen (gebruikt in microplaten, flessen, multiplaten, rollers, beads) [15](#page=15). * Coatings zoals poly-D-lysine (sterk positief geladen), collageen (een eiwit van de Extracellulaire Matrix - ECM), of geconditioneerd milieu gevormd door feedercelculturen [15](#page=15). #### 1.3.2 Procedures om in vivo condities na te bootsen Om de in vitro condities meer vergelijkbaar te maken met de in vivo situatie, kunnen cellen op eiwitten van de ECM worden gekweekt. Soms hebben cellen signalen of stoffen van omringende cellen nodig. Dit kan nagebootst worden door [15](#page=15): 1. Het gebruik van medium van een moedercultuur [15](#page=15). 2. Het kweken van cellen op een feedercellaag [15](#page=15). ### 1.4 Celgroeidichtheid en celtransfer #### 1.4.1 Celdichtheids-afhankelijke inhibitie Cellen in cultuur delen totdat ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Op dat punt treedt "contactinhibitie" van celproliferatie op, mede door concurrentie voor mitogenen. Door vers medium toe te voegen, kunnen delingen opnieuw beginnen. Efficiënter is het splitsen van de cultuur in dochterculturen, vaak met behulp van de trypsine-EDTA procedure [17](#page=17). #### 1.4.2 Groei in 2D en 3D culturen Tumorcellen kunnen het vermogen tot contactinhibitie verloren hebben, waardoor ze in dense foci of hoopjes kunnen groeien, zelfs in 3D. MDCK cellen (Madine-Darby Canine Kidney epitheelcellen) kunnen op een filter een 2D-cultuur vormen of, in de juiste omgeving, cysten vormen in 3D. Bij 3D-groei kunnen eiwitten zich apicaal of basolateraal in de cel plaatsen [18](#page=18) [19](#page=19). #### 1.4.3 Procedure van celtransfer Celtransfer vindt plaats om cellen te vermeerderen en te behouden [20](#page=20). * **Suspensiecultures:** Gebeurt door eenvoudige verdunning, eventueel na zacht centrifugeren en heropname in vers milieu [20](#page=20). * **Adherente cellen:** Celtransfer gebeurt wanneer de cel(mono)laag confluenter wordt, gemiddeld om de 3 tot 7 dagen [20](#page=20). * De cultuur wordt behandeld met trypsine/EDTA (TE) [20](#page=20). * Trypsine is een maagprotease dat oppervlakte-eiwitten degradeert bij korte behandeling [20](#page=20). * EDTA (ethyleendiaminetetra-acetaat) cheleert calcium en magnesium, wat de intercellulaire adhesie en cel-substraatbinding beïnvloedt [20](#page=20). * Onder geschikte condities komen de cellen los van het substraat en elkaar, en vormen een suspensie van levende, opgebolde cellen [20](#page=20). * Deze suspensie wordt optimaal geacht wanneer deze monocellulair is [20](#page=20). * De suspensie wordt vervolgens verdund (uitgesplitst) en uitgezaaid in nieuwe recipiënten. De verdunning varieert van 1 over 3 voor "normale" cellen tot 1 over 30 voor "tumorale" cellen [20](#page=20). * Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren, die natuurlijk aanwezig zijn in serum [20](#page=20). ### 1.5 Cellijnen en celbanken Cellen kunnen afkomstig zijn van andere laboratoria, eigen isolatie (primaire culturen), of celbanken. Bekende celbanken zijn ATCC (The American Type Culture Collection) en ECACC (The European Collection of Cell Cultures) [14](#page=14). ### 1.6 Observatietechnieken en apparatuur Cellen in cultuur kunnen worden geobserveerd met behulp van microscopie. Fluorescentiedye-gebaseerde methoden worden vaak gebruikt. Beeldacquisitie kan plaatsvinden op een confocale microscoop, bijvoorbeeld een Olympus FV300 FluoView systeem, met specifieke objectieven (zoals een 60x, 1.4 NA, PlanApo). Illuminatie kan worden verzorgd door een argon/krypton laser, met instelbare intensiteit en pixel dwell times. Cellen worden vaak waargenomen in een afgesloten flowkamer in specifieke groeimedia [13](#page=13). #### 1.6.1 Groeimedia voor celcultuur Voorbeelden van groeimedia die in wetenschappelijke literatuur worden vermeld, zijn onder andere EMEM (Earle's Minimum Essential Medium) en Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DME). Deze media worden vaak aangevuld met supplementen zoals fetaal kalfserum (FBS) of foetaal bovine serum (FBS), L-glutamine, antibiotica (penicilline, streptomycin), en buffers zoals Hepes [13](#page=13) [8](#page=8). #### 1.6.2 Immunofluorescentiemicroscopie Voor immunofluorescentie worden cellen, bijvoorbeeld humane osteosarcoom (U2OS) cellen, na plating op met fibronectine gecoate coverslips gefixeerd [13](#page=13). > **Tip:** Bij het werken met cellijnen is het belangrijk te onthouden dat zelfs "stabiele" cellijnen na verloop van passages kunnen veranderen [8](#page=8). > **Tip:** Bij celtransfer is het cruciaal om een monocellulaire suspensie te verkrijgen om aggregaten te vermijden [20](#page=20). --- # Apparatuur voor celcultuur Deze sectie beschrijft de essentiële apparatuur die gebruikt wordt voor celcultuur, met nadruk op de context van het werken met cellen in een laminaire flowbench en de verschillende stappen in celadhesie en -spreiding [21](#page=21) [22](#page=22). ### 2.1 Werken met cellen in een laminaire flowbench Een laminaire flowbench is een cruciale apparatuur voor celcultuurtechnieken, aangezien het een steriele werkomgeving biedt om contaminatie te voorkomen. De flowbench is uitgerust met een High Efficiency Particulate Air (HEPA) filter, dat de lucht steriliseert en beschermt tegen deeltjes, wat essentieel is voor het onderhouden van aseptische omstandigheden. In de context van celcultuurwerkzaamheden, zoals het hanteren van muisfibroblasten, is de flowbench de plaats waar de manipulatie van de cellen plaatsvindt onder gecontroleerde, steriele omstandigheden [21](#page=21) [22](#page=22) [23](#page=23). > **Tip:** Werk altijd met de laminaire flowbench aan, ook als u deze niet direct gebruikt, om de steriele luchtstroom te behouden. ### 2.2 Celadhesie en -spreiding Na het losmaken en uitplanten van cellen, vinden er verschillende stappen plaats die leiden tot celadhesie en -spreiding op het substraat. Dit proces omvat [22](#page=22): 1. **Sedimentatie:** De cellen zakken uit onder invloed van de zwaartekracht [22](#page=22). 2. **Initieel contact:** De cellen maken voor het eerst contact met het substraat. Op dit moment is het contactoppervlak minimaal, omdat de cellen nog een opgebolde vorm hebben [22](#page=22). 3. **Progressieve spreiding:** In de uren die volgen, verspreiden de cellen zich geleidelijk over het substraat. Dit proces vereist energie en veranderingen in het cytoskelet, wat leidt tot een groter contactoppervlak en een versterking van de adhesie aan het substraat [22](#page=22). 4. **Versterkte binding:** De cellen gaan een sterke binding aan met het substraat door de secretie van eigen aangemaakte extracellulaire matrix (ECM) moleculen [22](#page=22). Ondanks deze sterke cel-substraatsadhesie, kunnen cellen in staat zijn om te migreren over het celoppervlak door de adhesie tijdelijk en lokaal te inhiberen waar de cel loskomt, en elders de adhesie weer op te bouwen in de richting van de migratie [22](#page=22). > **Voorbeeld:** SEM-opnames tonen muisfibroblasten op verschillende tijdstippen na uitplating. Na 30 minuten zijn de cellen nog opgebold en hebben ze minimaal contact met het substraat. Na 24 uur zijn ze significant verspreid en hebben ze een groter contactoppervlak gevormd [22](#page=22). ### 2.3 Andere speciale apparatuur voor celcultuur Naast de laminaire flowbench zijn er nog andere belangrijke apparaten in een celcultuurfaciliteit: * **CO2-oven:** Deze incubatoren bieden een gecontroleerde omgeving met een specifieke temperatuur en CO2-concentratie, cruciaal voor celgroei. Ook deze zijn vaak uitgerust met een steriliserend HEPA-filter [23](#page=23). * **Opslag van ingevroren cellen:** Cellen kunnen worden ingevroren voor langdurige opslag, typisch in vloeibare stikstof bij -196°C [23](#page=23). De beschikbaarheid van deze gespecialiseerde apparatuur is essentieel voor succesvolle celkweek en onderzoek [23](#page=23). > **Fact:** De CTC core in The Core (UZ campus) beschikt over 17 flowbenches, wat de omvang van de faciliteit aangeeft [24](#page=24). --- # definities en eigenschappen van stamcellen Een stamcel is een cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren in verschillende andere soorten cellen of weefsels. Stamcellen beschikken over twee fundamentele eigenschappen: zelfvernieuwing en differentiatie [27](#page=27) [28](#page=28). ### 3.1 Zelfvernieuwing en differentiatie * **Zelfvernieuwing**: Dit is het vermogen van stamcellen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te produceren [28](#page=28). * **Differentiatie**: Dit is het proces waarbij stamcellen zich ontwikkelen tot volwassen celtypen die organen en weefsels vormen [28](#page=28). ### 3.2 Typen stamcellen op basis van potentie De potentie van een stamcel verwijst naar het vermogen om te differentiëren in verschillende celtypen. Er zijn verschillende niveiten van potentie: #### 3.2.1 Totipotente stamcellen Totipotente stamcellen hebben de hoogste differentiatiepotentie. Ze kunnen zich niet alleen ontwikkelen tot alle celtypen die een individu vormen, maar ook tot de cellen die de placenta vormen. De bevruchte eicel in de eerste uren na de bevruchting is totipotent [28](#page=28). > **Voorbeeld:** De bevruchte eicel deelt zich direct na de bevruchting, en ten minste één van deze vroege cellen is totipotent, met de mogelijkheid om zich te ontwikkelen tot een volledig organisme [28](#page=28). #### 3.2.2 Pluripotente stamcellen Pluripotente stamcellen kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen van het lichaam, maar niet tot de cellen die de placenta vormen [29](#page=29). > **Voorbeeld:** Ongeveer 4 dagen na de bevruchting, na meerdere delingscycli, vormen de totipotente cellen een holle bol genaamd de blastocyst. De cellen aan de buitenkant van de blastocyst differentiëren zich tot de cellen die de placenta vormen. De cellen binnenin de holle bal, de zogenaamde binnenste celmassa (ICM), zijn pluripotent. Ze kunnen zich niet ontwikkelen tot een foetus zonder de placenta, wat aangeeft dat hun potentie beperkter is dan die van totipotente cellen [29](#page=29). #### 3.2.3 Multipotente stamcellen Multipotente stamcellen zijn meer gespecialiseerde stamcellen. Ze hebben het potentieel om zich te ontwikkelen tot een beperkt aantal celtypen, meestal binnen een specifieke weefsellijn of orgaan [30](#page=30). > **Voorbeeld:** Hemopoëtische stamcellen zijn multipotent. Ze kunnen zich ontwikkelen tot verschillende soorten gespecialiseerde bloedcellen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar zijn beperkt tot de ontwikkeling van bloedcellen [30](#page=30). --- # ethische overwegingen rondom humane embryonale stamcellen Stamcelonderzoek, en in het bijzonder onderzoek met humane embryonale stamcellen, roept diverse ethische overwegingen op vanwege de oorsprong van deze cellen uit embryo's, wat in bepaalde kringen als gevoelig ligt [33](#page=33). ### 4.1 Het embryo als menselijk leven Verschillende standpunten bestaan over de status van een embryo en de ethische toelaatbaarheid van embryo-onderzoek [33](#page=33). #### 4.1.1 Het embryo als mens in het klein Een minderheidsperspectief stelt dat een embryo een mens in het klein is. Vanuit dit oogpunt wordt het vernietigen van een embryo voor onderzoek beschouwd als moord, waardoor embryo-onderzoek strikt onaanvaardbaar is [33](#page=33). #### 4.1.2 Toelaatbaarheid van embryo-onderzoek Een ander standpunt is dat embryo-onderzoek wel mogelijk is, maar uitsluitend op overgebleven embryo's uit IVF-cycli. De redenering hierbij is dat als embryo's toch al aanwezig zijn en niet voor voortplanting worden gebruikt, ze beter voor onderzoek ingezet kunnen worden dan vernietigd te worden. Het creëren van embryo's specifiek voor onderzoeksdoeleinden wordt echter niet als acceptabel beschouwd [33](#page=33). #### 4.1.3 Het belang van de leeftijd van het embryo Een cruciaal aspect in de ethische discussie is het moment waarop embryo's gebruikt worden. Hoe ouder een embryo, hoe meer het als een mens beschouwd wordt. In België geldt een maximumleeftijd van 12 dagen voor het gebruik van embryo's voor onderzoek [33](#page=33). ### 4.2 Algemene strekking en regelgeving De algemene tendens binnen de westerse onderzoekswereld is dat stamcelonderzoek acceptabel is, mits met de grootste voorzichtigheid. In Nederland is stamcelonderzoek toegestaan, maar is er strenge wetgeving die voorwaarden stelt aan het doel van het onderzoek, de gebruikte methodes, het laboratorium en zelfs de kwalificaties van de onderzoeker [33](#page=33). ### 4.3 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Een alternatief dat ethisch minder beladen is, betreft geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Deze cellen worden verkregen door somatische cellen te herprogrammeren tot een pluripotente staat, wat de noodzaak om embryo's te gebruiken omzeilt [34](#page=34). ### 4.4 Kwaliteitscontrole in celculturen Het werken met stamcellen, inclusief embryonale stamcellen, vereist strikte kwaliteitscontrole om de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van de celculturen te waarborgen. Twee belangrijke aspecten van kwaliteitscontrole zijn de detectie van contaminatie met micro-organismen en de detectie van contaminatie met vreemde cellen [37](#page=37). #### 4.4.1 Contaminatie met micro-organismen Celculturen kunnen gecontamineerd raken met micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en met name antibiotica-resistente mycoplasma's (PPLO). Mycoplasma's zijn parasitair, kunnen deels intracellulair leven, verstoren het cellulaire metabolisme (vaak door verzuring van het milieu) en zijn moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar. Methoden voor detectie omvatten cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA en PCR [37](#page=37). ##### 4.4.1.1 Effecten van mycoplasma contaminatie Mycoplasma contaminatie kan diverse effecten hebben op eukaryote cellen, waaronder veranderingen in eiwit-, RNA- en DNA-synthese, metabolisme en morfologie. Het kan leiden tot chromosomale aberraties, veranderingen in de celmembraansamenstelling, inductie of suppressie van immuunreacties, beïnvloeding van virusreplicatie en interferentie met biochemische en biologische assays. Mycoplasma kan ook de proliferatiekenmerken van cellen beïnvloeden en leiden tot totale degeneratie van de cultuur. Specifieke effecten op hybridoma's omvatten inhibitie van cel fusie, beïnvloeding van selectie van fusieproducten, interferentie met screening van antilichamen, productie van antilichamen tegen mycoplasma in plaats van het doelantigeen, en verminderde opbrengst van monoklonale antilichamen [38](#page=38). #### 4.4.2 Contaminatie met vreemde cellen Vreemde celcontaminatie is wijdverspreid. Veel "oudere" cellijnen blijken varianten te zijn van HeLa, een menselijke cervix-tumor lijn. Er zijn ook gevallen bekend waarbij "menselijke" cellijnen afkomstig bleken te zijn van muizen of ratten. Detectie hiervan kan via genetische fingerprinting en karyotypering [37](#page=37). #### 4.4.3 Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit De (genetische) zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen kunnen worden gemeten door middel van karyotypering, waarbij het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen worden bepaald [39](#page=39). ##### 4.4.3.1 Inherente genetische instabiliteit Gecultiveerde cellen vertonen vaak een inherente genetische instabiliteit, waarbij het genotype (chromosoomvorm en -aantal) met de tijd evolueert. Dit is niet te vermijden, maar wel te beperken door regelmatig terug te keren naar stock-cultures die ingevroren zijn met cryoprotectieve middelen zoals glycerol of DMSO in vloeibare stikstof bij -196°C [40](#page=40). --- # Fluorescentiemicroscopie technieken en toepassingen Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende moleculen om specifieke structuren in een monster te visualiseren, wat leidt tot een hogere sensitiviteit en specificiteit in vergelijking met andere microscopische technieken [81](#page=81) [82](#page=82). ### 5.1 Epifluorescentiemicroscopie Epifluorescentiemicroscopie is een klassieke opstelling waarbij het monster wordt belicht via de objectieflens, en de fluorescentie wordt geregistreerd zonder directe oculair observatie met een digitale detector. Dit maakt de combinatie van verschillende technieken mogelijk, zoals het overlayen van beelden verkregen met DIC (Nomarski) voor morfologie, een blauw fluorochroom voor kernen (DNA), en een rood fluochroom voor mitochondria [81](#page=81) [82](#page=82). #### 5.1.1 Voorbeelden van gecombineerde technieken Een voorbeeld van driedubbele fluorescentie is de aankleuring van endotheliale cellen van longarteriën van het rund. Hierbij worden cytoskelet-kabels (actine) in groen, mitochondria in rood, en DNA in blauw gekleurd met specifieke fluorescerende reagentia [83](#page=83). > **Tip:** Het combineren van verschillende fluorochromen met specifieke excitatatie- en emissiespectra maakt het mogelijk om meerdere structuren in één monster gelijktijdig te visualiseren [82](#page=82) [83](#page=83). ### 5.2 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) Het principe van de confocale laser scanning microscoop (CLSM) berust op het scannen van het monster met een laserstraal en het gebruik van een pinhole om het signaal te verbeteren. Een puntvormige lichtbron wordt gebruikt om het monster te exciteren. Het emissielicht wordt via de objectieflens naar een detector (vaak een Photomultiplier Tube - PMT) geleid [84](#page=84). > **Tip:** De pinhole is cruciaal omdat deze emissielicht dat niet afkomstig is uit het gewenste focale vlak (boven of onder de focus) blokkeert, waardoor de resolutie en het contrast significant verbeteren [84](#page=84). #### 5.2.1 Werking van de CLSM Bij CLSM wordt het monster optisch gescand in 3 dimensies (XYZ). Alleen emissielicht afkomstig van het scherpe focale vlak bereikt de detector. Een typische confocale laser scanning microscoop bestaat uit laserlichtbronnen, elektronische filters en een spiegelhuis [84](#page=84) [85](#page=85). #### 5.2.2 Vergelijking met conventionele fluorescentiemicroscopie Confocale microscopie biedt superieure beeldkwaliteit, met name in de Z-resolutie, vergeleken met conventionele fluorescentiemicroscopie. Echter, recente softwarematige bewerkingstechnieken, zoals deconvolutie-algoritmes, kunnen ook met conventionele digitale beelden acceptabele hoge resoluties realiseren. Confocale microscopie is beter geschikt voor time-lapse studies van dynamische processen dan conventionele methoden [86](#page=86) [87](#page=87). > **Example:** Confocale microscopie is uitermate geschikt voor het bestuderen van snelle cellulaire processen, zoals de beweging van organellen binnen een cel of de interactie tussen eiwitten in real-time [87](#page=87). --- # Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie is een softwarematige bewerking van conventionele digitale beelden die, door middel van specifieke algoritmes, in staat is om acceptabel hoge resoluties te verkrijgen. Dit staat tegenover confocale microscopie, die over het algemeen beter geschikt is voor time-lapse en analyse van dynamische processen [86](#page=86) [87](#page=87). ### 6.1 Werkingsprincipe van deconvolutie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie tracht de beeldvormingsfusie die optreedt in een microscoop te corrigeren. Wanneer licht door een object reist, wordt het uitgestraald in alle richtingen, wat resulteert in een verstrooiing van het lichtsignaal. Dit betekent dat een punt in het object niet als een scherp punt in het beeld verschijnt, maar als een uitgesmeerd vlekje, bekend als de *point spread function* (PSF). Deconvolutie-algoritmes proberen deze PSF te kwantificeren en vervolgens het oorspronkelijke beeld te reconstrueren door de effecten van de PSF wiskundig te verwijderen of te verminderen [88](#page=88). > **Tip:** In essentie probeert deconvolutie het beeld "scherper" te maken door de bijdrage van licht uit naburige punten te scheiden en terug te wijzen naar hun oorspronkelijke bron. #### 6.1.1 Algemene principes Het proces van deconvolutie kan worden beschouwd als het omgekeerde van het convolutieproces dat plaatsvindt tijdens de beeldvorming. Convolutie beschrijft hoe het oorspronkelijke signaal (de fluorescentie van het monster) wordt gemodificeerd door de optische en elektronische componenten van de microscoop om het uiteindelijke, gedegradeerde beeld te vormen [88](#page=88). * **Functie:** Het doel van deconvolutie is om het oorspronkelijke, scherpe beeld te herstellen door de PSF te gebruiken om de beeldvormingsfusie te corrigeren [88](#page=88). * **Iteratieve methoden:** Veelgebruikte deconvolutie-algoritmes zijn iteratief, wat betekent dat ze het beeld herhaaldelijk bewerken om de reconstructie te verbeteren totdat een bepaald criterium is bereikt. Deze methoden houden rekening met de natuurlijke beperkingen van beeldvorming, zoals ruis [88](#page=88). * **Beeldvormingsruis:** Ruis is een inherente eigenschap van digitale beelden en kan deconvolutie-algoritmes beïnvloeden. Het correct modelleren en hanteren van ruis is cruciaal voor succesvolle deconvolutie [88](#page=88). #### 6.1.2 Toepassingen en voordelen Deconvolutie kan significant bijdragen aan de beeldkwaliteit in fluorescentiemicroscopie, met name bij het analyseren van complexe structuren en dynamische biologische processen [86](#page=86). * **Verhoogde resolutie:** Het kan de effectieve resolutie van een conventionele microscoop verbeteren, waardoor fijne details zichtbaar worden die anders verborgen zouden blijven [86](#page=86). * **Verbeterd contrast:** Door het reduceren van verstrooid licht en achtergrondruis, verhoogt deconvolutie het contrast tussen het signaal en de achtergrond, wat de interpretatie van beelden vergemakkelijkt [88](#page=88). * **3D beeldvorming:** Het is bijzonder nuttig voor 3D-beeldvorming, omdat het helpt om de scherpte in de Z-richting (diepte) te herstellen, wat vaak een beperking is bij conventionele microscopen [88](#page=88). * **Verbeterde kwantificering:** Met scherpere en duidelijkere beelden is nauwkeurigere kwantificering van fluorescentiesignalen, celmorfologie en dynamische veranderingen mogelijk [88](#page=88). #### 6.1.3 Verschil met confocale microscopie Hoewel deconvolutie-fluorescentiemicroscopie vergelijkbare resultaten kan bereiken als confocale microscopie in termen van beeldkwaliteit, verschillen de onderliggende mechanismen. Confocale microscopie gebruikt een pinhole om onscherp licht van buiten het focusvlak te blokkeren, wat resulteert in een inherent verbeterde scherpte en de mogelijkheid om optische secties te maken. Deconvolutie, daarentegen, is een post-processing techniek die de beelddata *na* de acquisitie verwerkt [86](#page=86) [87](#page=87). > **Voorbeeld:** Een conventionele microscoop kan een beeld creëren dat er "wazig" uitziet, vooral in de diepte. Deconvolutie past vervolgens een algoritme toe op dit wazige beeld om het dichter bij de werkelijke structuur te brengen, terwijl een confocale microscoop probeert om alleen het scherpe licht uit het focusvlak op te vangen. ### 6.2 4D Live Cell Imaging 4D Live Cell Imaging is een geavanceerde techniek die de mogelijkheden van deconvolutie combineert met andere microscopische technieken om dynamische processen in levende cellen over tijd en in drie dimensies vast te leggen [89](#page=89). #### 6.2.1 Componenten van 4D Live Cell Imaging * **3D multi-kleur imaging:** Dit omvat het simultaan registreren van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies op meerdere posities. Dit maakt het mogelijk om de ruimtelijke distributie van meerdere moleculen tegelijk te bestuderen [89](#page=89). * **Time-lapse recording:** Hierbij worden processen gedurende een bepaalde periode vastgelegd, waarbij op regelmatige tijdstippen 3D beelden worden genomen. Deze beelden worden vervolgens samengevoegd tot een versnelde film, waardoor snelle biologische processen zichtbaar worden. Bijvoorbeeld, een opnametijd van 2 uur met opnames elke 60 seconden kan worden afgespeeld met 30 frames per seconde, wat resulteert in een sterk versnelde weergave van het proces [89](#page=89). #### 6.2.2 Opstelling voor 4D Live Cell Imaging Een typische opstelling voor 4D Live Cell Imaging vereist gespecialiseerde apparatuur om de delicate omstandigheden van levende cellen te handhaven en consistente beeldvorming te garanderen [90](#page=90). * **Incubatiekamer:** Essentieel voor het handhaven van een constante temperatuur en gasmengsel (bv. CO2) om de levensvatbaarheid van de cellen gedurende lange opnamesessies te waarborgen [90](#page=90). * **Geïnverteerde fluorescentiemicroscoop:** Een geïnverteerde microscoop wordt gebruikt omdat de objectieven zich onder het monster bevinden, wat de plaatsing van incubatie- en vloeistofsystemen vergemakkelijkt. Een gemotoriseerde voorwerptafel is nodig voor precieze positionering, en hoogwaardige objectieflenzen zijn cruciaal voor resolutie [90](#page=90). * **Digitale camera:** Een gevoelige digitale camera is vereist om zwakke fluorescentiesignalen efficiënt op te vangen en om snelle acquisitie mogelijk te maken voor time-lapse [90](#page=90). * **Trillingsvrije tafel:** Om bewegingsartefacten, die de resolutie en analyse van de beelden kunnen beïnvloeden, te minimaliseren [90](#page=90). * **Joystick voor Z-focus en XY-positionering:** Biedt de operator flexibiliteit en precisie bij het instellen van de focus en het navigeren door het monster [90](#page=90). * **Lampvoeding en computer:** Voor het aansturen van de verlichting en het uitvoeren van de complexe data-acquisitie en -verwerking [90](#page=90). > **Voorbeeld:** Muisfibroblasten kunnen worden opgenomen gedurende 8 uur met een time-lapse van elke 30 seconden, afgespeeld met 10 frames per seconde, om de dynamische processen van celbeweging en interactie te observeren [91](#page=91). --- # Voorbereiding van biologisch materiaal voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Het voorbereiden van biologisch materiaal voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) omvat een reeks stappen om structuren zichtbaar te maken die anders te klein of te weinig contrast zouden hebben . ### 7.1 Algemene beginselen van TEM-beeldvorming Bij TEM worden elektronen gebruikt die versneld worden. De golflengte van deze elektronen valt buiten het bereik van de gevoeligheid van het menselijk oog, waardoor een fluorescentiescherm of fotografische plaat nodig is voor beeldvorming. Beeldvorming ontstaat door elektronenstrooiing op de atomen van het doorstraalde weefsel. Dichte structuren absorberen elektronen, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten. Biologisch materiaal vertoont van nature weinig densiteitsverschillen, wat contrastverhoging noodzakelijk maakt . ### 7.2 Voorbewerkingstappen van biologisch materiaal Om biologisch materiaal geschikt te maken voor TEM, zijn diverse bewerkingstappen vereist . #### 7.2.1 Fixatie De eerste stap is fixatie, waarbij brokjes ruw materiaal (zoals weefsel of losse cellen) worden behandeld met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde. Het doel van fixatie is om fijne structuren zo intact mogelijk te behouden en de cellen doorlaatbaar te maken voor componenten in latere stappen . #### 7.2.2 Spoeling en contrastering ('kleuring') Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen. Voorbeelden hiervan zijn osmiumtetroxide, uranylacetaat of kaliumpermanganaat. Deze zware metalen binden zich specifiek aan bepaalde celregio's, zoals vetrijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern en eiwitrijke structuren zoals cytoskelet-elementen. Deze metaalverbindingen weerkaatsen elektronen, waardoor de hiermee gemerkte structuren in de elektronenmicroscoop als donkere plekken verschijnen. Dit proces wordt 'kleuren' genoemd, hoewel het in de elektronemicroscopie geen ware kleuren betreft. Het verhogen van densiteitsverschillen door middel van zware metalen leidt tot een toename van elektronenstrooiing en daarmee tot een toename van het contrast. Osmiumtetroxide (OsO4) kan reeds bij de fixatie worden toegevoegd en draagt bij aan het contrast van membranen. Veelgebruikte contrasteringsvloeistoffen bestaan uit uranylacetaat en loodcitraat . > **Tip:** Het gebruik van zware metalen is cruciaal voor zichtbaarheid, omdat deze elektronen absorberen of verstrooien, wat leidt tot een donkerder beeld op de detector . #### 7.2.3 Dehydratatie Om ultradunne coupes (60-90 nm dik) te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, moet het materiaal worden ingebed in kunsthars. Aangezien de meeste harsen hydrofoob zijn, is het noodzakelijk om al het water uit het monster te verwijderen. Dit gebeurt door middel van wasstappen met ethanol of aceton van oplopende concentraties . #### 7.2.4 Inbedding in hars en polymerisatie Na dehydratatie wordt het materiaal geleidelijk geïnfiltreerd met de nog niet-gepolymeriseerde hars. Het hars-doordrongen materiaal wordt in een houdertje geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule. Vervolgens vindt polymerisatie plaats, wat kan gebeuren door verhitting in een oven, met een magnetron, of door katalysatie met ultraviolet licht. Dit resulteert in harde, goed snijbare blokjes materiaal . #### 7.2.5 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden Om coupes met een dikte van ongeveer 70 nm te produceren, zijn speciale snijinstrumenten vereist, zoals messen van gekliefd puur glas of diamanten messen. Het snijden gebeurt met behulp van een ultramicrotoom . #### 7.2.6 Opvangen van coupes op een gridje Achter het snijvlak van de ultramicrotoom bevindt zich water dat zorgt voor smering van het snijvlak en het opvangen van de uiterst fragiele coupes. De coupes worden van het wateroppervlak "opgelepeld" op een zogenaamd gridje. Een gridje is een klein metaalschijfje (minder dan 5 mm) met een roosterpatroon . > **Example:** Een typische stap in het contrasteringsproces is het onderdompelen van de ultradunne secties op het gridje in oplossingen van uranylacetaat gevolgd door loodcitraat. Dit bindt zich aan specifieke moleculen in de cel en zorgt voor voldoende contrast voor TEM-analyse . --- # cryo-elektronen-tomografie voor 3D reconstructie Cryo-elektronen-tomografie (cryo-ET) is een techniek die wordt gebruikt om driedimensionale structuren van biologische objecten te reconstrueren door middel van een reeks tweedimensionale projecties die onder verschillende hoeken worden verkregen . ### 8.1 Principe van cryo-elektronen-tomografie De kern van cryo-ET is gebaseerd op het principe van tomografie, waarbij een object wordt gescand vanuit verschillende hoeken om een driedimensionale weergave te reconstrueren . #### 8.1.1 Verkrijgen van 2D projecties Bij cryo-ET wordt een object, meestal ingevroren in een dunne laag ijs om de natuurlijke staat te behouden, belicht met een elektronenbundel in een elektronenmicroscoop. De monstener wordt vervolgens geleidelijk gekanteld rond een as, en voor elke kantelhoek wordt een 2D projectie (een beeld) van het object opgenomen . #### 8.1.2 3D Reconstructie De reeks van 2D projecties, genomen onder verschillende hoeken, vormt de basis voor de 3D reconstructie. Dit gebeurt door middel van computeralgoritmen die de projecties analyseren en terugprojecteren naar een virtueel 3D beeld. Een groter aantal projecties met kleinere hoekverschuivingen resulteert in een nauwkeurigere reconstructie en vermindert artefacten die bekend staan als de 'missing-wedge' . > **Tip:** Hoe meer projecties er worden verkregen met kleine hoekverschuivingen, hoe gedetailleerder en nauwkeuriger de uiteindelijke 3D reconstructie zal zijn . #### 8.1.3 Toepassingen van cryo-ET Cryo-ET is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de architectuur van grote moleculaire complexen, zoals het nucleaire pore complex (NPC). Door verschillende exemplaren van hetzelfde complex te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt . > **Example:** Een voorbeeld van de toepassing van cryo-ET is de 3D reconstructie van een nucleair pore complex, wat essentieel is voor het transport van moleculen tussen de kern en het cytoplasma . ### 8.2 Vergelijking met andere speciale EM-technieken Cryo-ET is één van de speciale elektronenmicroscopietechnieken die gebruikt worden voor gedetailleerd celonderzoek. Andere technieken die in de documentatie worden genoemd zijn: * **Vries-breek (freeze-fracture):** Deze techniek wordt gebruikt om membraanstructuren te bestuderen door membranen te breken tussen hun binnenste en buitenste bladen. Het levert informatie over de locatie van eiwitten in het membraan . * **Vries-ets (freeze-etching):** Een uitbreiding op vries-breek, waarbij een dunne laag ijs wordt verwijderd door sublimatie onder vacuüm om meer 3D structuur te genereren . * **Serial block face-SEM (SBF-SEM) en Focused Ion Beam-SEM (FIB-SEM):** Bij deze technieken worden delen van het monster binnen de microscoop verwijderd met een ultramicrotoom of ionenlaser, waardoor opeenvolgende doorsneden kunnen worden bekeken . De keuze voor een specifieke techniek hangt af van het type structuur dat bestudeerd moet worden en de gewenste resolutie en dimensionaliteit van de analyse. Cryo-ET is uniek in zijn vermogen om 3D reconstructies te leveren van relatief intacte, bevroren biologische objecten . --- # De klassieke lichtmicroscoop De klassieke lichtmicroscoop, ook wel bekend als de helderveld- of klaarveldmicroscoop, maakt gebruik van doorvallend wit licht om preparaten te visualiseren, waarbij de resolutie voornamelijk wordt bepaald door het objectief en de golflengte van het licht [52](#page=52). ### 9.1 Algemene principes De resolutie van een lichtmicroscoop, de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven, is fundamenteel beperkt tot ongeveer 200 nanometer. Dit wordt beïnvloed door het objectief en de golflengte van het zichtbare licht, niet door het oculair. Celculturen kunnen vaak direct worden bekeken, terwijl dikker materiaal zoals weefsels en orgaanculturen eerst gefixeerd, ingebed (bijvoorbeeld in paraffine) en versneden moeten worden tot secties, of geanalyseerd met cryosecties van bevroren materiaal. Levende cellen vertonen doorgaans te weinig contrast voor standaard helderveldmicroscopie en vereisen speciale technieken. De effectieve resolutie wordt ook beïnvloed door de aard van het preparaat, zoals of het gefixeerd en gekleurd is voor detectie op basis van lichtabsorptie, of levend en daardoor met een lager contrast [52](#page=52). ### 9.2 Componenten en werking Een lichtmicroscoop bestaat uit optische en fijnmechanische onderdelen. De optiek is opgebouwd uit drie hoofdlenssystemen: de condensor, het objectief en de oculairen [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Lichtbron:** Produceert wit licht dat door een spiegel in de condensor wordt geleid [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Condensor:** Een lenssysteem dat het licht bundelt op het preparaat. De condensor speelt een cruciale rol in het bepalen van de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Objectief:** Dit is de lens die zich het dichtst bij het preparaat bevindt en een vergroot, eerste beeld vormt. Het heeft een korte tot zeer korte werkafstand [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Oculair:** Een lens die het door het objectief gevormde beeld verder vergroot en projecteert op het netvlies van de observator [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Prisma:** Dient om de lichtweg te buigen, waardoor een comfortabele observatiehouding mogelijk is [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). Het lichtpad begint bij de lichtbron, wordt gebundeld door de condensor op het preparaat, waarna het objectief een vergroot beeld vormt dat vervolgens door het oculair verder wordt vergroot. > **Tip:** De resolutie van een microscoop wordt niet alleen bepaald door de optische kwaliteit, maar ook door de golflengte van het gebruikte licht. Kortere golflengtes (zoals blauw licht) leiden theoretisch tot een hogere resolutie. ### 9.3 Factoren die de effectieve resolutie beïnvloeden * **Natuur van het preparaat:** Gefixeerde en gekleurde preparaten worden geanalyseerd op basis van lichtabsorptie, terwijl levende preparaten vaak te weinig contrast bieden [52](#page=52). * **Belichting:** De manier waarop het licht door de condensor op het preparaat wordt gebundeld, heeft directe invloed op de resolutie en beeldkwaliteit [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Gebruikte lenssystemen:** De kwaliteit en specificaties van zowel de condensor als het objectief zijn cruciaal voor het bereiken van de maximale resolutie [52](#page=52) [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). ### 9.4 Historische context De ontwikkeling van de lichtmicroscoop kent een snelle evolutie. In 1660 gebruikte Robert Hooke al een microscoop, waarna in de 19e en 20e eeuw verbeterde microscopen werden ontwikkeld. De tweede helft van de 20e eeuw zag de introductie van fluorescentiemicroscopie, digitale opnames en confocale technieken [51](#page=51). --- # Histologische technieken voor microscopisch onderzoek Histologische technieken maken cellen en weefsels zichtbaar onder een microscoop door ze dunner te snijden en het contrast te verhogen [42](#page=42). ### 10.1 Doel van histologische technieken Het hoofddoel van histologische technieken is om weefsels microscopisch observeerbaar te maken voor zowel lichtmicroscopie (LM) als elektronenmicroscopie (EM). Biologisch materiaal is vaak te dik om licht of elektronen door te laten en heeft van nature weinig contrast, wat gedetailleerde observatie bemoeilijkt. Histologische technieken zorgen voor [42](#page=42): * **Verdunnen van weefsels:** Zodat lichtstralen en elektronen erdoorheen kunnen dringen [42](#page=42). * **Verhogen van contrast:** Om structuurdetails zichtbaar te maken [42](#page=42). ### 10.2 De noodzaak van coupevorming Voor het waarnemen van subcellulaire details is het gebruik van dunne secties (coupes) essentieel. Procedure voor paraffinecoupes omvat het fixeren van een klein weefselstukje, dehydrateren, inbedden in vloeibare paraffine, snijden met een microtoom (0,5 – 50 μm), en het kleuren van de secties op een microscoopsglaasje [43](#page=43) [44](#page=44). ### 10.3 Fixeren Fixatie is het proces waarbij weefsels worden bewaard met behoud van hun oorspronkelijke structuur, door eiwitten te denatureren. Zonder fixatie worden afbraakenzymen, die na het wegnemen van weefsel uit de in-vivo situatie actief worden, niet gestopt [45](#page=45). #### 10.3.1 Methoden van fixatie * **Chemische fixatieven:** * Formol (voor LM) [45](#page=45). * Glutaraldehyde (voor EM) [45](#page=45). * Osmiumtetroxide ($OsO_4$) [45](#page=45). Chemische fixatieven werken door eiwitten te cross-linken (bv. formaldehyde, glutaraldehyde) of te precipiteren (bv. alcohol, aceton). Ze stoppen enzymreacties en behouden structurele componenten door cross-linking, waardoor weefselcomponenten bewaard blijven tijdens verdere histologische procedures [45](#page=45). * **Invriezen (koude fixatie):** Bevriezen is een methode die snel werkt en de epitopen beter bewaart voor immuunkleuringen. Dit wordt veel gebruikt in pathologie laboratoria voor snelle diagnoses van biopten en tumoren, soms zelfs tijdens operaties [45](#page=45). #### 10.3.2 Artefacten door fixatie Artefacten zijn veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in-vivo situatie. Dit kan een structuurverandering zijn (bv. een holte rond kraakbeencellen) of het op een andere plaats voorkomen van componenten (bv. glycogeendrift in leverpreparaten). Chemische fixatieven resulteren over het algemeen in een betere morfologie [45](#page=45). ### 10.4 Inbedden Inbedden is het omwikkelen en doordringen van gefixeerd materiaal met een inbedmiddel. Het inbedmiddel is een substantie die in het weefsel dringt, hard wordt, en het materiaal snijdbaar maakt in dunne plakken [46](#page=46). #### 10.4.1 Inbedmiddelen Veelgebruikte inbedmiddelen zijn paraffine, hars en plastics. Deze middelen zijn meestal hydrofoob [46](#page=46). #### 10.4.2 Dehydrateren en 'clearing' Omdat biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%) en inbedmiddelen hydrofoob zijn, moet het water eerst verwijderd worden. Dit gebeurt met een stijgende reeks alcoholbaden (30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Nadat het water is vervangen door alcohol, wordt tolueen gebruikt voor de 'clearing'-stap; tolueen is mengbaar met zowel alcohol als het hydrofobe inbedmiddel [47](#page=47). > **Tip:** Alternatieve inbedmiddelen, zoals hydrofobe harsen met hydrofiele groepen of hydrofiele inbedmiddelen, zijn minder stabiel en resulteren in inferieure morfologie [47](#page=47). ### 10.5 Snijden Door de hardheid van het inbedmateriaal kan het weefsel gesneden worden in dunne plakken [48](#page=48). #### 10.5.1 Snijdikte en toepassingen * **Paraffine:** Produceert coupes van ongeveer 5-10 μm dik, wat geschikt is voor LM omdat het lichtdoorlatend is. Veel epitopen blijven bij de verhitting tot 55°C bewaard [48](#page=48). * **Hars en plastics:** Zijn harder en laten coupes toe tot 60-70 nm dik, wat geschikt is voor EM omdat deze coupes doorlaatbaar zijn voor elektronen. Polymerisatie van hars gebeurt bij 60-65 °C. Harsen zijn minder geschikt voor immuunkleuringen omdat ze moeilijk uit het weefsel te verwijderen zijn [48](#page=48). #### 10.5.2 Gereedschap en plaatsing van coupes Het snijden van ingebed, hard materiaal gebeurt met een **microtoom** [48](#page=48). * **LM microtomem:** Gebruiken stalen messen [48](#page=48). * **EM microtomem:** Gebruiken glazen of diamanten messen [48](#page=48). Coupes voor LM-analyse worden aangebracht op **glazen draagglasjes**. Coupes voor EM-analyse worden geplaatst op **metalen (koper, nikkel) roostertjes** die grids worden genoemd [48](#page=48). > **Example:** Een patholoog wil snel een biopt analyseren tijdens een operatie. Hiervoor wordt het weefsel snel gefixeerd door invriezen en daarna in een microtoom gesneden om onmiddellijk onder de microscoop bekeken te kunnen worden voor een snelle diagnose [45](#page=45). --- # Histologische kleurtechnieken voor weefselanalyse Histologische kleurtechnieken zijn essentieel voor het visualiseren van weefselstructuren en het diagnosticeren van pathologische afwijkingen door specifieke cellulaire en extracellulaire componenten aan te kleuren [65](#page=65). ### 11.1 Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) De Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) is een fundamentele en wijdverbreide kleuringstechniek die al meer dan een eeuw wordt gebruikt voor weefselanalyse en kankerdiagnose [65](#page=65). #### 11.1.1 Werkingsprincipe van H&E * **Hematoxyline:** Dit kleurt nucleïnezuren diep blauw-paars aan door een complexe reactie die nog niet volledig is begrepen. Het laat gedetailleerde intranucleaire structuren zien, zoals condensatiepatronen van heterochromatine, die diagnostisch van groot belang zijn [65](#page=65). * **Eosine:** Dit kleurt eiwitten roze aan. In een typische coupe kleuren de kernen blauw, terwijl het cytoplasma en de extracellulaire matrix variërend roze gekleurd zijn. Nucleoli worden door eosine gekleurd. Overvloedig polyribosomen in het cytoplasma kunnen leiden tot een duidelijke blauwe gloed. De Golgi-zone kan worden geïdentificeerd door een gebrek aan kleuring naast de kern [65](#page=65). #### 11.1.2 Voordelen en beperkingen van H&E * **Voordelen:** * Werkt goed met diverse fixatieven [65](#page=65). * Visualiseert een breed scala aan cytoplasmatische, nucleaire en extracellulaire matrixkenmerken [65](#page=65). * Onthult structurele informatie met specifieke functionele implicaties [65](#page=65). * **Beperkingen:** * Onverenigbaar met immunofluorescentie [65](#page=65). * Hoewel H&E onverenigbaar is met immunofluorescentie, kan een seriële doorsnede gekleurd met H&E nuttig zijn ter oriëntatie voor immunofluorescentie [65](#page=65). * Hematoxyline, vaak zonder eosine, kan worden gebruikt als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken [66](#page=66). ### 11.2 Specifieke kleurtechnieken Naast H&E zijn er diverse specifieke kleurtechnieken die gericht zijn op het visualiseren van verschillende weefselcomponenten of functies [68](#page=68). #### 11.2.1 Indifferente kleurstoffen Indifferente kleurstoffen zijn technieken die specifiek vetten aankleuren. Een voorbeeld hiervan is Oil Red O, dat wordt gebruikt om vetcellen aan te kleuren [68](#page=68) [69](#page=69). #### 11.2.2 Immunohistochemische kleuring Immunohistochemische kleuringen maken gebruik van antilichaam-antigeenbinding om specifieke bestanddelen in weefsels aan te kleuren. Het antilichaam wordt gelabeld met een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud. Een voorbeeld hiervan is de kleuring met DAB (diaminobenzidine) om specifieke structuren zoals microtubuli of connexine 43 in muishartweefsel aan te tonen [68](#page=68) [70](#page=70). #### 11.2.3 Enzymkleuringen Enzymkleuringen demonstreren de activiteit van specifieke enzymen. Dit wordt bereikt door het gebruik van een substraat dat specifiek is voor het enzym; de reactie produceert een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de kleuring voor glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten met behulp van de tetrazoniumzoutmethode, die onderscheid maakt tussen erytrocyten met en zonder G6PD-activiteit [68](#page=68) [71](#page=71). > **Tip:** Het begrijpen van de basisprincipes van elke kleuringstechniek, inclusief het doelwit, het reactiemechanisme en de verwachte resultaten, is cruciaal voor accurate weefselinterpretatie. > **Example:** Bij de analyse van een weefselcoupe met H&E kleuring, zullen de kernen blauw zijn en het cytoplasma roze. Als de kernen echter onregelmatige, sterk gecondenseerde chromatinepatronen vertonen, kan dit duiden op maligniteit. Wanneer een Oil Red O kleuring wordt toegepast, zullen vetvacuolen in de cellen rood oplichten. Bij immunohistochemische kleuringen, zoals met DAB, kan specifieke eiwitexpressie worden gevisualiseerd als een bruine neerslag op de locatie van het eiwit. --- # Snijden van weefselcoupes voor microscopie Het snijden van weefselcoupes is een essentiële stap om subcellulaire details waar te nemen middels microscopie, waarbij de aard van het inbedmiddel en het type microscopie de dikte van de coupe bepalen [43](#page=43). ### 12.1 Principes van weefselpreparatie voor microscopie #### 12.1.1 Fixatie Fixatie is cruciaal om de oorspronkelijke structuur van weefsels te bewaren door eiwitten te denatureren en zo afbraakprocessen, veroorzaakt door endogene enzymen na weefselontname, te stoppen [45](#page=45). * **Mechanisme:** Chemische fixatieven zoals formol (voor lichtmicroscopie - LM) en glutaraldehyde of OSO4 (voor elektronenmicroscopie - EM) cross-linken eiwitten of slaan ze neer. Bevriezen is een alternatieve methode [45](#page=45). * **Doel:** Naast het stoppen van enzymactiviteit, behouden fixatieven structurele componenten en voorkomen ze veranderingen die afwijken van de in-vivo situatie, wat men artefacten noemt [45](#page=45). * **Vergelijking methoden:** Chemische fixatieven bieden over het algemeen een betere morfologie, terwijl koude fixatie sneller materiaal verwerking toelaat en epitopen beter bewaart voor immuunkleuringen. Bevriezen wordt vaak toegepast in pathologie laboratoria voor snelle diagnoses, zelfs tijdens operaties [45](#page=45). #### 12.1.2 Inbedden Inbedden omvat het omwikkelen en doordringen van gefixeerd materiaal met een substantie die het weefsel hard maakt, waardoor het snijdbaar wordt in dunne plakken (coupes). Deze inbedmiddelen, zoals paraffine, hars of plastics, zijn doorgaans hydrofoob [46](#page=46) [47](#page=47). * **Noodzaak van ontwatering:** Omdat biologisch materiaal tot 60% water bevat en de meeste inbedmiddelen hydrofoob zijn, moet water eerst verwijderd worden. Dit gebeurt met een stijgende reeks alcoholbaden (30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol) [47](#page=47). * **‘Clearing’:** Na ontwatering met alcohol wordt tolueen gebruikt, een substantie die mengbaar is met zowel alcohol als het inbedmiddel, om de laatste restjes alcohol te vervangen [47](#page=47). #### 12.1.3 Snijden (Coupering) Het harde inbedmateriaal maakt het mogelijk om het weefsel in dunne plakken te snijden [48](#page=48). * **Paraffine coupes:** Deze zijn typisch 5 tot 10 micrometer dik en zijn doorlaatbaar voor licht, waardoor ze geschikt zijn voor lichtmicroscopie (LM). Paraffine wordt verwarmd tot 55°C om te smelten en in het weefsel te dringen, waarbij veel epitopen behouden blijven [48](#page=48). * **Hars en plastic coupes:** Deze zijn dunner, tot ongeveer 60-70 nanometer dik, en doorlaatbaar voor elektronen, wat ze geschikt maakt voor elektronenmicroscopie (EM). Polymerisatie van hars vindt plaats bij 60-65°C, en de moeilijkheid om hars uit het weefsel te verwijderen, maakt het minder geschikt voor immuunkleuringen vergeleken met paraffine [48](#page=48). * **Microtoom:** Het snijden van het ingebedde, harde materiaal gebeurt met een microtoom. Microtomen voor paraffine coupes gebruiken stalen messen, terwijl die voor hars en plastic glazen of diamanten messen gebruiken [48](#page=48). * **Draagvlakken:** Coupes voor LM worden op glazen draag glaasjes geplaatst. Coupes voor EM worden aangebracht op metalen (koper, nikkel) roostertjes die grids genoemd worden [48](#page=48). > **Tip:** De dikte van de coupes is direct gerelateerd aan de penetratie van de stralen (licht of elektronen) van de microscoop, wat essentieel is voor het waarnemen van structuren op verschillende schalen [43](#page=43) [48](#page=48). > **Voorbeeld:** Het waarnemen van subcellulaire organellen vereist ultradunne coupes (70 nm) gemaakt van hars-ingebed weefsel voor EM, terwijl de morfologie van celkernen en weefselstructuren goed zichtbaar is met dikkere coupes (5-10 µm) van paraffine-ingebed weefsel voor LM [43](#page=43) [48](#page=48). #### 12.1.4 Kleuring (Impliciet vermeld) Na het snijden worden de coupes gekleurd om structuren zichtbaar te maken voor microscopische observatie. Hoewel de details van kleuring buiten het bestek van dit specifieke onderwerp vallen, is het een noodzakelijke stap na het snijden voor LM-analyse. H&E (hematoxyline en eosine) is een veelgebruikte kleuring voor LM-coupes [43](#page=43) [44](#page=44). * **Artefacten:** Het is belangrijk om op te merken dat veranderingen die optreden tijdens de preparatieprocedures, zoals fixatie, kunnen leiden tot artefacten, wat afwijkingen zijn van de werkelijke in-vivo situatie [45](#page=45). * **Voorbeeld artefact:** Een holte rond kraakbeencellen of de misplaatsing van componenten zoals glycogeen in een leverpreparaat zijn voorbeelden van artefacten. De grote wanorde in het onderste beeld van een carcinoom van het colon is een voorbeeld van hoe artefacten of weefselveranderingen de interpretatie kunnen beïnvloeden [44](#page=44) [45](#page=45). --- # elektronenmicroscopie (em) technieken Elektronenmicroscopie (EM) technieken maken het mogelijk structuren te visualiseren met een veel hogere resolutie dan lichtmicroscopie door gebruik te maken van elektronen in plaats van fotonen. Dit opent deuren naar de studie van structuren op nanometer- en zelfs atomair niveau [98](#page=98). ### 13.1 Algemene principes van elektronenmicroscopie In tegenstelling tot lichtmicroscopie, die glaslenzen gebruikt, maakt elektronenmicroscopie gebruik van elektromagnetische magneten als lenzen om de elektronenbundel te sturen. Om te voorkomen dat de elektronen worden gestopt door bijvoorbeeld gasmoleculen, vereist EM een hoog vacuüm. Om de elektronen voldoende snelheid te geven, wordt er gewerkt met hoge spanningen [98](#page=98). #### 13.1.1 Principe van beeldvorming Bij EM worden elektronen gebruikt die het monster bombarderen voor beeldvorming. Er is een bron (elektronenkanon) en lenzen (elektromagnetische) die de bundel concentreren en scherpstellen [98](#page=98). #### 13.1.2 Vergroting en resolutie Met elektronenmicroscopen kunnen structuren zichtbaar worden gemaakt die zo klein zijn als 1 nanometer. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) kan vergrotingen tot wel 600.000 en meer bereiken met een scheidend vermogen van 3 nanometer, hoewel theoretisch kleiner mogelijk is [98](#page=98) [99](#page=99). ### 13.2 Typen elektronenmicroscopie Globaal wordt er onderscheid gemaakt tussen twee hoofdtypen elektronenmicroscopie: Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM) en Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) [99](#page=99). #### 13.2.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) TEM wordt voornamelijk gebruikt om de *binnenkant* van objecten, zoals weefsels, cellen en virussen, te bestuderen [99](#page=99). * **Principe:** Het beeld wordt gevormd doordat zware atomen in ultradunne preparaten de elektronen uit de bundel verstrooien. Het beeld wordt gevisualiseerd op een fluorescerend scherm [100](#page=100) [99](#page=99). * **Resolutie:** TEM heeft een resolutie van ongeveer 1 nanometer [99](#page=99). * **Preparatie:** Biologisch materiaal geeft van zichzelf weinig contrast in een TEM. Daarom worden speciale fixatie- en kleuringstechnieken toegepast . * **Fixatie:** Meestal wordt er gefixeerd met glutaaraldehyde (een bivalente crosslinker voor NH2-groepen, vooral in eiwitten) en osmiumtetroxide (een sterk oxidans dat lipiden en eiwitten stabiliseert) . * **Kleuring:** Om contrast te creëren, wordt het materiaal blootgesteld aan verbindingen van zware metalen, zoals osmium, dat elektronen weerkaatst en zich bindt aan specifieke structuren. Structuren die zich aan deze 'kleurstoffen' binden, verschijnen donker, terwijl structuren met minder affiniteit lichter zichtbaar zijn. Gebruikte kleurstoffen zijn onder andere uranylacetaat en lood . * **Ultradunne secties:** Voor TEM zijn ultradunne secties van 50-100 nanometer nodig. Vanwege de dunte van de coupes is expertise nodig voor een correcte 3-dimensionale interpretatie . * **Specifieke technieken voor TEM:** * **Negatieve kleuring:** Hierbij worden virusdeeltjes of andere deeltjes omgeven door zwaar metaal (bv. uranylacetaat, fosfowolfraamzuur). Het specimen neemt de kleur niet op en is daardoor wit tegen een zwarte achtergrond . * **Shadowing (schaduwbestuiving):** Dit gebeurt door schuine bestuiving met een zwaar metaal zoals platina of goud. Dit creëert een reliëf dat het driedimensionale aspect van het specimen zichtbaar maakt . * **Rotary shadowing:** Een specifieke vorm waarbij het specimen onder een zeer lage hoek op een roterend specimen wordt bestoven met metaal, vaak gebruikt voor het visualiseren van nucleïnezuren . #### 13.2.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) SEM wordt gebruikt om het *oppervlak* van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen in beeld te brengen [99](#page=99). * **Principe:** Een elektronenbundel scant het preparaat lijn per lijn. Hierbij worden secundaire elektronen uit het preparatoppervlak gegenereerd, die worden gedetecteerd, versterkt en computer-matig verwerkt tot een 3-dimensionaal beeld [100](#page=100) [99](#page=99). * **Preparatie:** Het preparaat mag groter en dikker zijn dan bij TEM, maar moet wel worden gecoat met een zwaar metaal [99](#page=99). * **Beeld:** SEM levert een driedimensionaal beeld op [100](#page=100) [99](#page=99). ### 13.3 Voordelen van elektronenmicroscopie Het belangrijkste voordeel van elektronenmicroscopen is dat de golflengte van elektronen veel kleiner is dan die van zichtbaar licht (400-800 nm). Hierdoor kunnen objecten worden waargenomen die kleiner zijn dan de golflengte van licht, tot op het niveau van individuele atomen . ### 13.4 Technische complicaties en vereisten * **Vacuüm:** Absolute vacuüm is noodzakelijk . * **Hoogspanning:** Vereist voor het versnellen van elektronen . * **Elektromagnetische lenzen:** Nodig om de elektronenstraal te manipuleren . * **Aangepaste preparatietechnieken:** Fixatie en kleuring moeten aangepast zijn aan de vereisten van vacuüm en elektronenbundels . --- # Lichtmicroscopische technieken en kleuringsmethoden Lichtmicroscopie is een fundamentele techniek voor het visualiseren van cel- en weefselstructuren, waarbij verschillende optische principes en kleurstofmethoden worden toegepast om contrast en detail te genereren [56](#page=56). ### 14.1 Typen lichtmicroscopen Lichtmicroscopen variëren in hun ontwerp en toepassing, aangepast aan specifieke observatiebehoeften. #### 14.1.1 Algemene lichtmicroscopen * **Histologie-microscoop:** Standaard microscoop voor het bestuderen van vaste weefselcoupes [56](#page=56). * **Discussie-microscoop:** Vaak uitgerust met digitale camera's om beelden vast te leggen en te delen [56](#page=56). * **Geïnverteerde lichtmicroscoop:** Ideaal voor de observatie van levende celculturen, waarbij de objectieven zich onder het preparaat bevinden [56](#page=56). #### 14.1.2 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen Deze microscopen zijn ontworpen om specimens met weinig inherent contrast, zoals levende cellen, zichtbaar te maken zonder ze te hoeven kleuren. * **Fasecontrastmicroscopie:** Maakt gebruik van de faseverschuiving die licht ondergaat bij het passeren door het preparaat. Kleine faseveranderingen, veroorzaakt door verschillen in brekingsindex, worden omgezet in amplitudeveranderingen (licht/donker), wat resulteert in een zwart-wit beeld. Dit is een uitvinding van Zernike en wordt toegepast op ongekleurde, levende preparaten zoals celculturen of vriescoupes [59](#page=59) [60](#page=60). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski):** Benut de interferentie van doorvallend gepolariseerd licht om verschillen in optische dichtheid en brekingsindex te visualiseren. Het vereist gespecialiseerde prisma's en interferentiefilters [59](#page=59) [60](#page=60). * **Digitale microscopie:** Maakt gebruik van computerverwerking van beelden met ultragevoelige videocamera's. Deze techniek is dynamisch en maakt zowel real-time als time-lapse opnamen mogelijk [59](#page=59). * **(Fluorescentie)microscopen voor 'life cell imaging':** Worden verder besproken in de context van fluorescentietechnieken [59](#page=59). > **Tip:** Ongekleurde preparaten hebben vaak weinig contrast in een standaard klaarveldmicroscoop, wat de analyse bemoeilijkt. Fasecontrast- en DIC-microscopie bieden hier uitkomst door subtiele optische verschillen om te zetten in zichtbare contrastverschillen [59](#page=59) [60](#page=60). ### 14.2 Principes van contrastverhoging in lichtmicroscopie Contrast in lichtmicroscopie kan op twee manieren worden verhoogd: 1. **Histologische kleuring:** Kleurstoffen absorberen specifieke golflengtes van het opvallende licht, wat leidt tot kleurvorming en zo het contrast verhoogt [60](#page=60). 2. **Benutten van optische dichtheidsverschillen:** In ongekleurde preparaten, hoewel transparant, bestaan er kleine verschillen in optische dichtheid. Deze verschillen veroorzaken faseverschuivingen in het licht, die door interferentie (positief of negatief) worden omgezet in een zwart-wit beeld in fasecontrast- of DIC-microscopen [60](#page=60). #### 14.2.1 Optische paden Het optische pad beschrijft de route die licht aflegt door de microscoop, wat verschilt tussen verschillende technieken [61](#page=61). * **Klaarveld-microscoop:** Standaard microscoop waarbij het licht direct door het preparaat schijnt [61](#page=61) [62](#page=62). * **Fasecontrast-microscoop:** Heeft een gespecialiseerde optische weg die faseverschuivingen omzet in zichtbaar contrast [61](#page=61). ### 14.3 Kleuringsmethoden Kleuren is essentieel om de transparante structuren in weefselcoupes zichtbaar te maken en onderscheid te kunnen maken tussen verschillende celcomponenten [63](#page=63). #### 14.3.1 Algemene principes van kleuring * Wit licht bestaat uit een spectrum van golflengtes, wat de basis vormt voor kleur [63](#page=63). * Kleuringstechnieken maken gebruik van kleurstoffen, vaak in waterige oplossingen [63](#page=63). * Voor weefselcoupes die in paraffine zijn ingebed, is een deparaffinisatie stap (met tolueen) nodig voordat gekleurd kan worden [63](#page=63). * Het belangrijkste bindingsmechanisme bij histologische kleuringen is ionische binding, gebaseerd op elektrostatische aantrekking tussen tegengesteld geladen deeltjes in het weefsel en de kleurstof [64](#page=64). #### 14.3.2 Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring De H&E kleuring is een routinekleuring bij uitstek voor histologisch onderzoek vanwege de effectiviteit en breed toepasbare morfologische details [64](#page=64) [65](#page=65). * **Hematoxyline:** * Technisch gezien geen kleurstof op zichzelf; vereist een "beitsmiddel" (vaak metaalionen zoals aluminium) om aan het weefsel te hechten [64](#page=64). * In complex met aluminiumzouten is het kationisch (positief geladen) en werkt als een **basische kleurstof** [64](#page=64). * Reageert met negatief geladen, **basofiele** celbestanddelen, zoals nucleïnezuren in de celkern [64](#page=64). * Kleur: Blauw tot donkerpaars [64](#page=64) [65](#page=65). * Kernen tonen diagnostisch belangrijke patronen van heterochromatinecondensatie [65](#page=65). * **Eosine:** * Is anionisch (negatief geladen) en werkt als een **zure kleurstof** [64](#page=64). * Reageert met positief geladen, **acidofiele** componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma [64](#page=64). * Kleur: Roze [64](#page=64) [65](#page=65). * Kleurt niet-specifiek eiwitten aan [65](#page=65). * Nucleoli worden met eosine gekleurd [65](#page=65). * Overvloedige polyribosomen geven het cytoplasma een blauwe gloed [65](#page=65). * De Golgi-zone kan zichtbaar worden door het gebrek aan kleuring naast de kern [65](#page=65). #### 14.3.3 Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring * De PAS-kleuring kleurt vrije suikers aan [57](#page=57). * In het voorbeeld van de darmvillus kleurt het intervilleus slijm, gesecreteerd door slijmbekercellen, en de microvilli (borstelzoom) aan [57](#page=57). #### 14.3.4 Toepassingen en beperkingen van H&E * H&E kleuring is essentieel voor het herkennen van weefseltypes en morfologische veranderingen, met name in de kankerdiagnose [65](#page=65). * De kleuring toont een breed scala aan cytoplasmatische, nucleaire en extracellulaire matrixkenmerken [65](#page=65). * Een beperking is dat H&E onverenigbaar is met immunofluorescentie [65](#page=65). * Hematoxyline, eventueel zonder eosine, kan nuttig zijn als tegenkleuring in immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken (bv. alkalische fosfatase of peroxidase) [65](#page=65) [66](#page=66). > **Voorbeeld:** Bij de analyse van een darmvillus met PAS en hematoxyline, wordt het slijm en de microvilli paars-blauw gekleurd door PAS, terwijl de kernen van de epitheelcellen donkerblauw kleuren door hematoxyline. De basaalmembranen worden aangegeven met pijlen [57](#page=57). > **Voorbeeld:** Een doorsnede van de dunne darm (small intestine) van een muis gekleurd met H&E toont de villi, lamina propria, submucosa en crypten, met duidelijke differentiatie tussen celkernen (blauw) en cytoplasma (roze). Slijmbekercellen zijn herkenbaar door hun roze uiterlijk [58](#page=58). --- # Principes en toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie is een techniek die gebruikmaakt van fluorescerende moleculen om specifieke structuren of moleculen in biologische monsters zichtbaar te maken [72](#page=72) [73](#page=73). ### 15.1 Algemene principes van fluorescentiemicroscopie #### 15.1.1 Werkingsmechanisme Bij fluorescentiemicroscopie worden fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen genaamd, gebruikt. Deze fluorochromen absorberen licht met een bepaalde golflengte (excitatie) en zenden vervolgens licht uit met een langere golflengte (emissie). De absorptiestraling, doorgelaten door een excitatiefilter, moet worden tegengehouden door een barrièrefilter om de emissiestraling te kunnen waarnemen [73](#page=73). Het excitatie- en emissiespectrum van een typisch fluorofoor, zoals fluoresceïne (of Alexa 488), illustreert dit principe, waarbij het emissiespectrum altijd een langere golflengte heeft dan het excitatiespectrum [73](#page=73). #### 15.1.2 Componenten van een epifluorescentiemicroscoop Een typische epifluorescentiemicroscoop bestaat uit de volgende componenten [74](#page=74): 1. **Excitatiebron:** Dit kan een kwikdamplamp (Hg), een xenonlamp (Xe) of lasers zijn [72](#page=72) [74](#page=74). 2. **Golflengtefilters in een filterkubus:** * **Excitatiefilter:** Selecteert de golflengte van het excitatielicht [74](#page=74). * **Dichroïsche spiegel (beamsplitter):** Reflecteert het excitatielicht naar het monster en laat het emissielicht door naar de detector [74](#page=74). * **Emissiefilter of stopfilter:** Blokkeert het excitatielicht en laat het emissielicht door [74](#page=74). 3. **Detector:** Dit kunnen de ogen of een camera (digitaal/analoog) zijn [74](#page=74). #### 15.1.3 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) Naast conventionele epifluorescentie is er ook confocale laser scanning microscopie (CLSM). CLSM gebruikt doorgaans een laser als exciterende lichtbron en maakt het mogelijk om optische secties van het monster te verkrijgen, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en minder achtergrondruis [72](#page=72). > **Tip:** Het nauwkeurig afstemmen van de excitatiefilters, dichroïsche spiegels en emissiefilters is cruciaal voor het verkrijgen van optimale fluorescentiesignalen en het minimaliseren van achtergrondfluorescentie. ### 15.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie wordt breed ingezet voor het visualiseren, lokaliseren en kwantificeren van moleculen in (levende) cellen en weefsels [74](#page=74). #### 15.2.1 Ion-gevoelige kleurstoffen Deze kleurstoffen veranderen hun fluorescentie afhankelijk van de ionenconcentratie in de cel. Een bekend voorbeeld is Fura-2, dat wordt gebruikt om intracellulaire calciumionen (Ca2+) te meten. Veranderingen in Ca2+-concentratie kunnen belangrijke cellulaire processen sturen, zoals responsen op stimuli [74](#page=74). > **Example:** Het observeren van de Ca2+-gradient in een bewegende cel met Fura-2 kan inzicht geven in de richting en de mechanismen van celmigratie [74](#page=74). #### 15.2.2 Immunofluorescentie microscopie Bij deze techniek worden specifieke eiwitten gedetecteerd met behulp van antilichamen waaraan een fluorchroom is gekoppeld (geconjugeerd). Dit maakt het mogelijk om de locatie en distributie van specifieke eiwitten in gefixeerde cellen of weefsels te visualiseren [74](#page=74) [77](#page=77). #### 15.2.3 Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten Eiwitten kunnen genetisch gemodificeerd worden om te fuseren met fluorescente eiwitten, zoals Blue Fluorescent Protein (BFP) of Yellow Fluorescent Protein (YFP). Hierdoor kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden gevolgd en hun dynamiek bestudeerd worden. Diverse soorten fluorescente eiwitten zijn beschikbaar, die tot expressie gebracht kunnen worden in verschillende organismen [75](#page=75) [78](#page=78) [79](#page=79). #### 15.2.4 Visualisatie van organellen Fluorescentiemicroscopie kan ook worden gebruikt om specifieke organellen te markeren en te visualiseren. Voorbeelden hiervan zijn lysosomen en mitochondria in gecultiveerde cellen [75](#page=75). #### 15.2.5 Aankleuring van meerdere eiwitten De techniek maakt het mogelijk om twee of meer eiwitten tegelijkertijd aan te kleuren en te visualiseren, wat inzichten kan verschaffen in hun interacties of co-lokalisatie. Het visualiseren van cytoskelet-kabels (actine in groen) en hun 'voetjes' (vinculine in rood) kan bijvoorbeeld co-lokalisatie aantonen [77](#page=77) [78](#page=78). #### 15.2.6 Combinatie met andere microscopietechnieken Fluorescentiemicroscopie kan gecombineerd worden met technieken zoals Differential Interference Contrast (DIC) of Nomarski microscopie om morfologische informatie (structuur) te integreren met fluorescentiedata. Dit leidt tot samengestelde beelden (overlay-beelden) die een completer beeld geven van het monster, zoals de combinatie van morfologie, kernen en mitochondria [81](#page=81). > **Tip:** Bij het analyseren van beelden met meerdere fluorochromen, zoals driedubbele overlays, is het essentieel om de specifieke emissieprofielen van elke kleurstof te kennen om kruisinterferentie te minimaliseren en de interpretatie te verfijnen [81](#page=81). #### 15.2.7 Registratie in microscopen Klassieke epifluorescentiemicroscopen kunnen uitgerust zijn met digitale registratieapparatuur, waarbij de registratie direct plaatsvindt zonder de noodzaak van oculair observatie. Dit verbetert de gevoeligheid en maakt kwantitatieve analyse mogelijk [80](#page=80). --- # Interpretatieproblematiek van TEM-beelden en driedimensionale reconstructie De interpretatieproblematiek van TEM-beelden en driedimensionale reconstructie omvat de uitdagingen en technieken die gepaard gaan met het visualiseren en reconstrueren van driedimensionale structuren op basis van tweedimensionale microscopische beelden. ### 16.1 Prepareren en observeren van cellen en weefsels Het primaire doel van preparatietechnieken is om cellen en weefsels geschikt te maken voor observatie onder een lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM). Biologisch materiaal biedt van nature weinig contrast en laat weinig licht of elektronen door, wat specifieke procedures noodzakelijk maakt [42](#page=42) [7](#page=7). #### 16.1.1 Belang van histologische technieken Histologische technieken zijn essentieel om weefsels voldoende dun te snijden voor de doorgang van licht of elektronen en om contrast te creëren voor het waarnemen van structuurdetails [42](#page=42). **Methodes voor preparatie omvatten:** * Fixeren [45](#page=45) [7](#page=7). * Inbedden en snijden [46](#page=46) [7](#page=7). * Kleuren of contrasteren [7](#page=7). > **Tip:** Het prepareren van weefsel voor microscopische analyse kan artefacten introduceren, wat de interpretatie van beelden kan beïnvloeden [45](#page=45). #### 16.1.2 Fixeren Fixeren dient om de oorspronkelijke structuur van weefsels te bewaren door eiwitten te denatureren en zo afbraakprocessen te stoppen [45](#page=45). * **Chemische fixatieven:** * Formol (voor LM) [45](#page=45). * Glutardialdehyde (voor EM) [45](#page=45). * OsO$_4$ [45](#page=45). * **Invriezen:** Een alternatieve methode die snelle verwerking mogelijk maakt en epitopen goed bewaart, vaak gebruikt in pathologische laboratoria voor snelle diagnoses [45](#page=45). #### 16.1.3 Inbedden en snijden Na fixatie moet het materiaal worden doordrongen en omwikkeld met een inbedmiddel om het snijdbaar te maken in dunne plakken. Inbedmiddelen zijn doorgaans hydrofoob en vereisen eerst een dehydratatie van het weefsel met alcohol, gevolgd door een 'clearing'-stap met tolueen, dat mengbaar is met zowel alcohol als het inbedmiddel [46](#page=46) [47](#page=47). * **Inbedmiddelen:** * Paraffine: Gebruikt voor lichtmicroscopie (LM), resulteert in coupes van 5-10 µm [48](#page=48). * Harsen en plastics: Gebruikt voor elektronenmicroscopie (EM), laat coupes tot 70 nm toe [48](#page=48). Het snijden gebeurt met een **microtoom**: * Voor LM: Met een stalen mes [48](#page=48). * Voor EM: Met een glazen of diamantmes [48](#page=48). Coupes voor LM worden op glazen draagglas geplaatst, terwijl coupes voor EM op metalen roosters (grids) worden geplaatst [48](#page=48). #### 16.1.4 Kleuren of contrasteren Kleuringen verhogen het contrast in weefsels door specifieke moleculen aan te kleuren, waardoor structuren beter zichtbaar worden [60](#page=60). * **HE-kleuring (Hematoxyline-Eosine):** Hematoxyline kleurt zure (basofiele) componenten zoals kernen, terwijl eosine eosinofiele/acidofiele stoffen (zoals eiwitten) roze aankleurt [57](#page=57). * **PAS (Periodic Acid Schiff):** Kleurt vrije suikers, zoals in slijmbekercellen en microvilli [57](#page=57). ### 16.2 Microscopische observatietechnieken De ontwikkeling van microscopen heeft een revolutie teweeggebracht in de celbiologie, met name de lichtmicroscoop en de elektronenmicroscoop. #### 16.2.1 Lichtmicroscopie (LM) * **Resolutie:** De effectieve resolutie van een lichtmicroscoop wordt beperkt tot ongeveer 200 nm door het objectief en de golflengte van zichtbaar licht [52](#page=52). * **Klaarveldmicroscoop:** Het klassieke type microscoop dat gebruik maakt van doorvallend wit licht. Het bestaat uit een condensor (bundelt licht op preparaat), een objectief (vormt vergroot beeld) en oculair (navergroting) [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). * **Specialere lichtmicroscopen:** * **Fasecontrastmicroscopie:** Maakt gebruik van faseverschuivingen van licht door verschillen in optische dichtheid van het preparaat om contrast te creëren, ideaal voor levende, ongekleurde cellen [59](#page=59) [60](#page=60) [61](#page=61). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie:** Gebruikt gepolariseerd licht en interferentie om contrast te genereren, ook geschikt voor levende cellen [59](#page=59). * **Digitale microscopie:** Gebruikt ultragevoelige videocamera's en computerverwerking voor dynamische beelden (real-time en time-lapse) [59](#page=59). * **Fluorescentiemicroscopie:** Gebruikt fluorescent gekleurde moleculen om specifieke structuren zichtbaar te maken, belangrijk voor 'live cell imaging' [51](#page=51) [59](#page=59). * **Geïnverteerde lichtmicroscoop:** Ideaal voor de observatie van levende celculturen, omdat de objectieven zich onder het preparaat bevinden [56](#page=56). > **Tip:** De preparaatkwaliteit (bv. gefixeerd en gekleurd vs. levend) beïnvloedt de effectieve resolutie en de waarneembare details [52](#page=52). #### 16.2.2 Elektronenmicroscopie (EM) Voor EM worden ultradunne coupes (70 nm) gesneden van in hars of plastic ingebed materiaal. Dit maakt visualisatie van subcellulaire structuren met een veel hogere resolutie mogelijk dan met LM [48](#page=48). ### 16.3 Driedimensionale Reconstructie Driedimensionale reconstructie is de techniek om een driedimensionaal beeld te construeren uit een reeks van tweedimensionale beelden, verkregen door opeenvolgende coupes of door verschillende focusvlakken van een microscoop. #### 16.3.1 Celcultuur als model Celcultuurtechnieken, die al sinds het begin van de 20e eeuw bestaan (bv. "3D Tissue Culture" door Harrison in 1907), vormen de basis voor veel preparaten. Hoewel vaak met 2D monolaagcultures wordt gewerkt, zijn er ook methodes om 3D structuren te nabootsen of te creëren [19](#page=19) [8](#page=8). * **2D Monolaagcultures:** Simuleren organen/weefsels maar missen de complexe 3D interacties [8](#page=8). * **3D Cultures:** Kunnen cysten vormen met specifieke apicaal/basolaterale eiwitverdeling, wat de in vivo omgeving beter nabootst. Tumorcellen kunnen bijvoorbeeld in 3D groeien als ze hun contactinhibitie verloren hebben [18](#page=18) [19](#page=19). #### 16.3.2 Beeldvormingstechnieken voor 3D Reconstructie Hoewel de directe documentatie van 3D reconstructie technieken beperkt is in de verstrekte tekst (pagina's 1-61), is het principe gebaseerd op het verkrijgen van een serie van overlappende 2D beelden. * **Seriële coupes:** Het snijden van opeenvolgende dunne plakken van een weefsel of celaggregaat. Elke coupe wordt microscopisch bekeken en de beelden worden vervolgens digitaal uitgelijnd en samengevoegd om een 3D model te reconstrueren [43](#page=43) [48](#page=48). * **Confocale microscopie:** Maakt het mogelijk om beelden op verschillende focusdieptes te verzamelen binnen een monster. Deze beelden kunnen worden gestapeld om een 3D reconstructie te maken. De tekst vermeldt het gebruik van een confocaal systeem met photomultiplier tubes [13](#page=13). #### 16.3.3 Interpretatieproblematiek * **Artefacten:** Manipulaties tijdens preparatie (fixatie, inbedden, snijden) kunnen artefacten veroorzaken die de interpretatie van de werkelijke structuur bemoeilijken [45](#page=45). * **Verlies van informatie:** Bij het snijden van seriële coupes kan informatie verloren gaan of worden vervormd, wat de nauwkeurigheid van de 3D reconstructie kan beïnvloeden. * **Uitlijning:** Het nauwkeurig uitlijnen van opeenvolgende 2D beelden is cruciaal voor een correcte 3D reconstructie en kan technisch uitdagend zijn. * **Resolutiebeperkingen:** De resolutie van de gebruikte microscoop beperkt de fijnheid van de details die in de 3D reconstructie kunnen worden waargenomen. De tekst legt de nadruk op de preparatie- en observatiemethoden die *aanleiding geven* tot de beelden die uiteindelijk voor 3D reconstructie gebruikt kunnen worden, maar de specifieke methodologieën voor de reconstructie zelf worden niet uitgebreid behandeld binnen de gegeven pagina's. --- Dit hoofdstuk bespreekt de interpretatieproblematiek van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beelden en de technieken voor driedimensionale reconstructie. TEM-beelden bieden uitzonderlijke resolutie, maar de interpretatie ervan kan complex zijn door de aard van de preparaten en de gebruikte technieken. Driedimensionale reconstructie technieken zijn essentieel om de ware structuur van cellen en weefsels te begrijpen op basis van tweedimensionale sneden. ### 16.1 Elektronenmicroscopie: Principes en Technieken Elektronenmicroscopie (EM) gebruikt een bundel elektronen in plaats van licht om beelden te vormen, wat resulteert in aanzienlijk hogere resoluties. Dit komt doordat de golflengte van elektronen veel kleiner is dan die van zichtbaar licht, waardoor kleinere structuren waargenomen kunnen worden. Twee hoofdtypen EM zijn Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) [98](#page=98) [99](#page=99). #### 16.1.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Bij TEM wordt een elektronenbundel door een ultradun preparaat gestuurd. De elektronen worden verstrooid door zware atoomkernen in het preparaat, wat resulteert in een beeld op een fluorescerend scherm. De resolutie van TEM kan tot 1 nanometer bedragen [98](#page=98) [99](#page=99). * **Principe:** Een elektronenkanon genereert een bundel elektronen die door elektromagnetische lenzen wordt geconcentreerd en gefocust op een ultradun monster. De doorgelaten elektronen worden gedetecteerd om een beeld te vormen [98](#page=98). * **Technisch vereisten:** Hoge resolutie vereist een vacuümomgeving om interactie van elektronen met gasmoleculen te voorkomen en hoogspanning voor de elektronenbundel . #### 16.1.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) SEM wordt gebruikt om het oppervlak van objecten in beeld te brengen. Een elektronenbundel scant het preparaat lijn per lijn, waarbij secundaire elektronen worden gegenereerd. Deze worden gedetecteerd om een driedimensionaal beeld te construeren. SEM is geschikt voor grotere en dikkere preparaten, die vaak met een zwaar metaal zijn gecoat [99](#page=99). ### 16.2 Preparatie- en Kleurtechnieken voor EM Biologisch materiaal vertoont van zichzelf weinig contrast in een TEM, waardoor speciale preparatie- en kleurtechnieken noodzakelijk zijn om structuren zichtbaar te maken . * **Fixatie:** Materiaal wordt gefixeerd met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde en osmiumtetroxide om structuren te stabiliseren en het preparaat toegankelijk te maken voor volgende stappen . * **Kleuring:** Verbindingen van zware metalen, zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat en loodcitraat, worden gebruikt om structuren met een hogere densiteit donkerder te laten verschijnen in het beeld. Deze techniek is geen ware kleuring in de zin van kleur, maar verhoogt het contrast door verschillen in elektronenverstrooiing . * **Negatieve kleuring:** Het monster wordt geïncubeerd met een metaalzout, dat de specimen zelf niet opneemt, waardoor het specimen wit is tegen een zwarte achtergrond. Dit wordt vaak gebruikt voor virusdeeltjes of macromoleculen . * **Shadowing (schaduwwerping):** Het preparaat wordt bestoven met een metaal (bv. platina, goud) onder een schuine hoek. Dit creëert een driedimensionaal effect door de schaduwen die de metaaldeeltjes werpen. Rotary shadowing wordt gebruikt voor nucleïnezuren . * **Dehydratatie en Inbedding:** Water wordt verwijderd en het materiaal wordt ingebed in kunsthars om ultradunne secties te kunnen snijden . * **Ultradun snijden:** Met behulp van een ultramicrotoom worden secties van 50-100 nm dik gesneden. Deze coupes worden op een gridje opgevangen . ### 16.3 Interpretatieproblematiek van TEM-beelden De tweedimensionale aard van TEM-sneden kan leiden tot interpretatieproblemen bij het reconstrueren van driedimensionale structuren . * **Verschillende doorsneden van dezelfde structuur:** Een complexe, kronkelende structuur kan in verschillende ultradunne secties zeer uiteenlopende tweedimensionale vormen vertonen . > **Tip:** Het is cruciaal om te beseffen dat een enkele TEM-sectie slechts een 'plakje' van een driedimensionaal object is. Het extrapoleren naar 3D vereist zorgvuldigheid. * **Reconstructie uit opeenvolgende secties:** Om een nauwkeurige 3D-reconstructie te verkrijgen, is het vaak nodig om tijdrovend opeenvolgende secties te stapelen en te analyseren . ### 16.4 Technieken voor Driedimensionale Reconstructie Om de beperkingen van tweedimensionale beelden te overwinnen, zijn er verschillende technieken ontwikkeld voor driedimensionale reconstructie. #### 16.4.1 Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) Cryo-ET maakt 3D-reconstructies mogelijk door een serie 2D-projecties te genereren terwijl het monster of de detector rond een as wordt gekanteld . * **Principe:** Het principe is gebaseerd op Fourier-analyse van terugprojecties om een virtueel 3D-beeld van het originele object te reconstrueren. Hoe meer projecties met kleinere hoekverschuivingen, hoe nauwkeuriger de reconstructie en hoe minder 'missing-wedge' artefacten . * **Toepassing:** Deze techniek is zeer geschikt voor het bestuderen van de ultrastructuur van subcellulaire componenten en macromoleculaire complexen, zoals nucleaire pore complexen (NPC's) . #### 16.4.2 Serial Block Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) Deze technieken behoren tot de geavanceerde EM-methoden die driedimensionale reconstructies mogelijk maken. * **SBF-SEM:** Hierbij wordt het monster in de microscoop met een ultramicrotoom in ultradunne secties verwijderd, terwijl tegelijkertijd het resterende 'blokfront' wordt gescand . * **FIB-SEM:** Gebruikt een ionenlaser om materiaal weg te nemen en het monster te structureren, gevolgd door SEM-analyse om 3D-beelden te verkrijgen . #### 16.4.3 Vries-breek en Vries-ets technieken Deze technieken worden voornamelijk gebruikt om membraanstructuren gedetailleerd te bestuderen . * **Vries-breek (Freeze-fracture):** Cellulaire membranen worden door de toepassing van een diepgekoeld mes gebroken, meestal tussen de binnenste en buitenste leaflet van de dubbellaag. Dit onthult de eiwitten en eiwitaggregaten in de membraan . * **Vries-ets (Freeze-etching):** Na het vries-breken wordt een dunne laag ijs verwijderd door sublimatie onder vacuüm, wat meer 3D-structuur genereert dan alleen vries-breek. De visualisatie gebeurt na bestuiving met zware atomen in TEM of SEM . > **Tip:** De keuze van de EM-techniek hangt af van of men de interne structuur (TEM, Cryo-ET), het oppervlak (SEM) of membraanstructuren (Vries-breek) wil bestuderen. ### 16.5 Voorbeelden van TEM- en SEM-analyse * **TEM-analyse van tracheaal epitheel:** Toont twee celtypes: cellen met lange cilia (geciliëerde cellen) en mucus-producerende cellen. Geciliëerde cellen bevatten veel mitochondriën en glad ER, terwijl mucus-producerende cellen veel ruw ER, een uitgebreid Golgi-apparaat en mucus-gevulde secretiedruppels hebben. De cilia zelf zijn begrensd door een dubbelbladige biologische membraan . * **SEM-analyse van tracheaal epitheel:** Bevestigt de aanwezigheid van cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak . * **TEM-analyse van collageenvezels:** Gedetailleerd zichtbaar gemaakt door bestuiving met platina, waar het karakteristieke repetitiepatroon op de vezel zichtbaar is . * **TEM-analyse van virusdeeltjes:** Virussen zoals het coronavirus en poliovirus kunnen worden geanalyseerd met negatieve kleuring of schaduwwerping . * **TEM-analyse van dierlijke cellen:** Toont details zoals kernen, mitochondriën, lysosomen en endoplasmatisch reticulum met hoge resolutie, waardoor de ultrastructuur van cellen gedetailleerd kan worden bestudeerd . --- Dit onderwerp bespreekt de interpretatie van Transmission Electron Microscopy (TEM) beelden, de detectie van specifieke moleculen binnen deze beelden, en technieken voor driedimensionale reconstructie uit grotere volumes. ### 16.1 Interpretatie van celstructuren in TEM-beelden Scanning Electron Microscopy (SEM) analyse van epitheel van de trachea toont twee celtypes: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak. Voor SEM-analyse worden monsters geleidend gemaakt door ze met een sputter coater van een dun laagje goud of goud/palladium te voorzien. De vergroting in dit specifieke geval is ongeveer 4000x . ### 16.2 Detectie van specifieke eiwitten met behulp van TEM TEM kan worden gebruikt voor de detectie van specifieke eiwitten binnen celstructuren. Dit wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van antilichamen die specifiek binden aan doelwit-eiwitten. Een voorbeeld hiervan is een antilichaam tegen een capsid-eiwit, dat specifiek is voor een HIV-partikel dat vanuit een cel uitboert (budding) . ### 16.3 Analyse van grotere volumes met SBF-SEM en FIB-SEM Serial block-face SEM (SBF-SEM) en Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM) zijn technieken die analyse van grotere volumes mogelijk maken. Deze methoden verwijderen dunne lagen van het monster in de vacuümkamer van de SEM . * **SBF-SEM:** Maakt gebruik van een diamantmes om dunne lagen van het blok te verwijderen . * **FIB-SEM:** Gebruikt een focused ion beam om lagen van het monster te verwijderen . Deze technieken zijn cruciaal voor het verkrijgen van driedimensionale reconstructies van complexe structuren door opeenvolgende beelden van dunne plakjes te combineren. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Celcultuur | Een techniek waarbij cellen buiten hun natuurlijke omgeving, in een laboratorium, worden gekweekt. Dit kan variëren van het kweken van cellen uit een stukje weefsel (primaire culturen) tot het gebruik van stabiele cellijnen met een potentieel onbeperkte levensduur. | | Monolaagcultuur | Een kweekmethode waarbij cellen zich verspreiden en een enkele laag vormen op het groeioppervlak. Dit wordt vaak bereikt door cellen in een geschikt medium te plaatsen, waarna ze zich delen totdat ze een continue laag vormen, bekend als confluente monolaag. | | Cellijn | Een populatie van cellen die afkomstig is van een enkele cel en die in staat is om zich onbeperkt te delen in cultuur. Cellijnen kunnen afkomstig zijn van tumoren (geïmmortaliseerd) of verkregen worden door selectie na veroudering van primaire culturen. | | Immortalisatie | Het proces waarbij cellen het vermogen krijgen om zich onbeperkt te delen, wat resulteert in een cellijn met een potentieel oneindige levensduur. Dit kan optreden bij tumorcellen of geïnduceerd worden door genetische manipulatie of selectie. | | Senescence | Een proces van celveroudering waarbij cellen stoppen met delen na een bepaald aantal passages. Dit is een natuurlijke beperking van de levensduur van de meeste primaire celculturen. | | Groeisubstraat | Een fysieke drager waarop cellen kunnen groeien en zich hechten in cultuur. Dit substraat beschermt de cellen tegen anoïkis (een vorm van geprogrammeerde celdood) en is essentieel voor adherente celculturen. | | Anoïkis | Een vorm van geprogrammeerde celdood (apoptose) die optreedt wanneer cellen hun contact met het extracellulaire matrix of omliggende cellen verliezen. Groeisubstraten helpen dit te voorkomen. | | Contactinhibitie | Het fenomeen waarbij cellen in cultuur stoppen met delen wanneer ze een confluente laag vormen en elkaar raken. Dit wordt veroorzaakt door competitie voor groeifactoren en signalen tussen de cellen. | | Trypsine-EDTA | Een veelgebruikte oplossing voor het losmaken van adherente cellen van het groeioppervlak en van elkaar. Trypsine breekt oppervlakte-eiwitten af, terwijl EDTA calcium- en magnesiumionen cheleert, wat intercellulaire adhesie verstoort. | | Confluentie | De toestand waarbij een celcultuur het groeioppervlak volledig bedekt met een laag cellen. Op dit punt stoppen de meeste cellen met delen vanwege contactinhibitie. | | Extracellulaire Matrix (ECM) | Een complex netwerk van macromoleculen, zoals eiwitten en polysachariden, dat buiten de cellen wordt uitgescheiden en structurele ondersteuning en signaleringsfuncties biedt. Cellen kunnen op ECM-componenten groeien om de in vivo omgeving na te bootsen. | | Spheroid-vorming | De vorming van driedimensionale celaggregaten die lijken op kleine bolletjes. Dit kan optreden in celculturen, met name in collageengels, en bootst de structuur van weefsels na. | | Term | Definitie | | Laminaire flowbench | Een werkstation dat een gecontroleerde, steriele omgeving creëert door middel van een luchtstroom die stofdeeltjes en micro-organismen verwijdert, essentieel voor celcultuurwerkzaamheden om contaminatie te voorkomen. | | HEPA filter | Een High Efficiency Particulate Air filter dat zeer effectief is in het verwijderen van kleine deeltjes, waaronder bacteriën en virussen, uit de luchtstroom binnen de laminaire flowbench en CO2-ovens om steriliteit te waarborgen. | | CO2-oven | Een incubatietoestel dat een gecontroleerde omgeving met een specifieke temperatuur en een verhoogde concentratie koolstofdioxide ($CO_2$) biedt, noodzakelijk voor de groei en het onderhoud van veel celtypen in cultuur. | | Celadhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat, zoals een kweekbodem of een ander celoppervlak, wat een cruciale stap is voor celoverleving, groei en differentiatie. | | Celspreiding | Het proces waarbij cellen zich na initiële adhesie progressief over het substraat verspreiden, wat gepaard gaat met veranderingen in het cytoskelet en een vergroting van het celcontactoppervlak. | | Celmigratie | Het vermogen van een cel om zich over een oppervlak te verplaatsen, wat wordt gefaciliteerd door het tijdelijk remmen van adhesie op één locatie en het opbouwen van nieuwe adhesie in de bewegingsrichting. | | Vloeibare stikstof | Een cryogeen vloeistof met een extreem lage temperatuur van -196°C, gebruikt voor de langdurige opslag van cellen en biologische monsters om hun levensvatbaarheid te behouden. | | Stamcel | Een cel met het vermogen om zich voortdurend te delen en te differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen of weefsels. | | Zelfvernieuwing | Het vermogen van stamcellen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te maken, waardoor de populatie stamcellen behouden blijft. | | Differentiatie | Het proces waarbij een minder gespecialiseerde cel, zoals een stamcel, verandert in een meer gespecialiseerd celtype dat een specifieke functie in het lichaam kan uitvoeren. | | Totipotente stamcellen | Stamcellen die de potentie hebben om zich te ontwikkelen tot een volledig organisme, inclusief de placenta en de foetus. Dit geldt voor de eerste cellen na bevruchting. | | Pluripotente stamcellen | Stamcellen die de potentie hebben om zich te ontwikkelen tot alle celtypen van het lichaam, maar niet tot de placenta. De cellen van de binnenste celmassa van een blastocyst zijn pluripotent. | | Multipotente stamcellen | Stamcellen die de potentie hebben om zich te ontwikkelen tot een beperkt aantal verschillende celtypen, meestal binnen een specifieke weefsellijn. Hemopoëtische stamcellen zijn een voorbeeld, die zich ontwikkelen tot verschillende bloedceltypen. | | Blastocyst | Een holle bal van ongeveer 140 stamcellen die ontstaat uit de bevruchte eicel na meerdere delingscycli, ongeveer 4 dagen na de bevruchting. | | Binnenste celmassa (ICM) | De groep cellen binnenin de blastocyst die zich zal ontwikkelen tot de foetus. Deze cellen zijn pluripotent. | | Humane embryonale stamcellen | Cellen afkomstig uit vroege embryo's, die het potentieel hebben om te differentiëren tot verschillende celtypen en die gebruikt worden in wetenschappelijk onderzoek naar celontwikkeling en ziekten. | | In vitro | Een proces dat plaatsvindt buiten het levende organisme, typisch in een laboratoriumomgeving zoals een reageerbuis of kweekfles. | | Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) | Volwassen cellen die genetisch zijn herprogrammeerd om zich te gedragen als embryonale stamcellen, waardoor ze zich tot elk celtype kunnen ontwikkelen zonder ethische bezwaren rondom embryo's. | | Contaminatie | De aanwezigheid van ongewenste micro-organismen (zoals bacteriën, gisten, schimmels) of vreemde cellen in een celkweek, wat de resultaten van het onderzoek kan beïnvloeden. | | Mycoplasma's | Een type bacterie dat cellen kan besmetten, vaak parasitair en deels intracellulair, wat leidt tot verstoringen in het cellulaire metabolisme en moeilijk detecteerbaar is. | | Karyotypering | Een techniek die wordt gebruikt om het aantal en de structuur van chromosomen in individuele cellen te analyseren, wat helpt bij het beoordelen van de genetische zuiverheid en stabiliteit van celculturen. | | Genetische instabiliteit | De neiging van gecultiveerde cellen om hun genetische samenstelling, zoals het aantal en de vorm van chromosomen, te veranderen gedurende het kweekproces, wat de betrouwbaarheid van het onderzoek kan beïnvloeden. | | Cryoprotectief | Een stof, zoals glycerol of DMSO, die wordt toegevoegd aan cellen om ze te beschermen tegen schade tijdens het invriesproces, door de vorming van ijskristallen te voorkomen. | | Epifluorescentiemicroscoop | Een klassieke opstelling voor fluorescentiemicroscopie waarbij de excitatie- en emissielichtpaden gescheiden zijn, wat resulteert in een beeld dat wordt gevormd door het totale fluorescente licht dat door het monster wordt uitgestraald. | | Confocaal laser scanning microscoop (CLSM) | Een geavanceerde microscopietechniek die een laserstraal gebruikt om het monster punt voor punt optisch af te tasten, waarbij een pinhole wordt ingezet om strooilicht te elimineren en alleen licht uit het scherpe vlak naar de detector te laten gaan, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en contrast. | | Pinhole | Een kleine opening die in de emissiepad van een confocale microscoop wordt geplaatst om te voorkomen dat emissielicht van buiten het gewenste focale vlak de detector bereikt, wat bijdraagt aan de optische sectie en verbeterde resolutie. | | Optische aftasting | Het proces waarbij een confocale microscoop het monster systematisch scant met een laserstraal, punt voor punt, om een digitaal beeld op te bouwen door de fluorescentie-emissie van elk punt te detecteren. | | Deconvolutie-algoritmes | Softwarematige bewerkingen die worden toegepast op conventionele digitale microscoopbeelden om de effecten van optische aberraties en strooilicht te corrigeren, waardoor de resolutie en de beeldkwaliteit aanzienlijk worden verbeterd. | | Fluorochroom | Een chemische stof die fluorescentie vertoont wanneer deze wordt geëxciteerd door licht van een specifieke golflengte, en die wordt gebruikt om specifieke structuren of moleculen in biologische monsters zichtbaar te maken. | | DIC (Differentieel Interferentie Contrast) | Een microscopietechniek die wordt gebruikt om morfologische details van transparante monsters zichtbaar te maken door interferentiepatronen te creëren op basis van brekingsindexverschillen, vaak gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie voor overlay-beelden. | | Time lapse microscopie | Een techniek waarbij een reeks beelden van een levend monster over een langere periode wordt opgenomen, waardoor dynamische processen zoals celbeweging of intracellulaire veranderingen kunnen worden geanalyseerd. Confocale microscopie is hierbij vaak beter geschikt. | | Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie | Een techniek waarbij softwarematige bewerkingen, genaamd deconvolutie-algoritmes, worden toegepast op conventionele digitale beelden om een hogere resolutie te verkrijgen. Dit proces helpt bij het verbeteren van de beeldkwaliteit door het verwijderen van onscherpte die veroorzaakt wordt door optische aberraties. | | Conventionele fluorescentiemicroscoop | Een type microscoop dat fluorescentie gebruikt om beelden te genereren, maar waarbij de beelden na acquisitie softwarematige bewerkingen vereisen om de resolutie te verbeteren. Deze microscopen zijn vaak minder geavanceerd dan confocale of deconvolutie-systemen wat betreft inherente beeldkwaliteit. | | Confocale microscopie | Een geavanceerde microscopietechniek die een punt van licht gebruikt om een beeld te scannen, waardoor alleen licht uit het brandpunt wordt gedetecteerd. Dit resulteert in beelden met een hogere resolutie en minder achtergrondruis, wat het beter geschikt maakt voor het analyseren van dynamische processen. | | 4D Live Cell Imaging | Een geavanceerde microscopietechniek die de combinatie maakt van snelle 3D-multi-kleuren imaging met time-lapse opnames. Dit maakt het mogelijk om de dynamische processen in levende cellen over tijd, in drie ruimtelijke dimensies en met meerdere fluorescentiekanalen, te bestuderen. | | 3D multi kleur imaging | Het simultaan registreren van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies van een monster. Dit stelt onderzoekers in staat om de ruimtelijke distributie van meerdere moleculen of structuren binnen een cel of weefsel tegelijkertijd te visualiseren. | | Time lapse recording | De registratie van processen gedurende een welbepaalde periode, waarbij op vaste tijdspunten telkens een beeld wordt genomen. Deze beelden worden vervolgens geassembleerd tot een versnelde film om snelle biologische gebeurtenissen zichtbaar te maken. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een techniek die gebruik maakt van een bundel elektronen om een beeld te vormen van een preparaat. De elektronen gaan door het preparaat heen, waarbij de interactie met de atomen van het materiaal leidt tot beeldvorming. | | Fixatie | Het proces waarbij biologische structuren in cellen en weefsels chemisch worden vastgelegd om hun oorspronkelijke vorm en integriteit te behouden, en om ze doorlaatbaar te maken voor de volgende voorbereidingsstappen. | | Zware metalen | Verbindingen van elementen met een hoge atoommassa die worden gebruikt om biologisch materiaal te "kleuren" in TEM. Deze metalen binden zich aan specifieke celcomponenten en verhogen de elektronenstrooiing, waardoor deze structuren donkerder verschijnen in het microscopische beeld. | | Dehydratatie | Het proces waarbij water uit het biologische monster wordt verwijderd. Dit is noodzakelijk omdat de kunstharsen die gebruikt worden voor het inbedden hydrofoob zijn, en water de infiltratie en polymerisatie van de hars zou verstoren. | | Inbedding in hars | Het proces waarbij biologisch materiaal wordt doordrenkt met een vloeibare kunsthars die vervolgens wordt uitgehard (gepolymeriseerd). Dit creëert een stabiel blok dat ultradun gesneden kan worden voor microscopisch onderzoek. | | Ultradun snijden | Het proces van het snijden van extreem dunne secties (typisch 60-90 nm dik) van het ingebedde biologische materiaal met behulp van een ultramicrotoom en speciale messen, zoals glas- of diamanten messen. | | Gridje | Een klein metalen schijfje (minder dan 5 mm in diameter) met een roosterpatroon, waarop de ultradunne coupes worden opgevangen. Dit gridje wordt vervolgens in de elektronenmicroscoop geplaatst. | | Contrasteren | Het proces waarbij de zichtbaarheid van structuren in biologisch materiaal wordt verbeterd door het gebruik van zware metalen. Deze metalen verhogen de dichtheid van de structuren, wat leidt tot meer elektronenstrooiing en dus een hoger contrast in het TEM-beeld. | | Elektronenstrooiing | Het proces waarbij elektronen van richting veranderen wanneer ze interageren met de atomen van het preparaat. Dichte structuren strooien meer elektronen, wat resulteert in een donkerder beeld, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten en lichter verschijnen. | | Cryo-elektronen-tomografie | Een techniek die 3D reconstructies van objecten mogelijk maakt door een serie van 2D projecties te verzamelen terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld. De reconstructie wordt verkregen door middel van Fourieranalyse van terugprojecties. | | 3D reconstructie | Het proces waarbij een driedimensionaal beeld van een object wordt opgebouwd uit een reeks tweedimensionale projecties of sneden. Dit wordt bereikt door geavanceerde computeralgoritmen toe te passen op de verzamelde data. | | 2D projecties | Tweedimensionale beelden die worden verkregen door een object vanuit verschillende hoeken te belichten met elektronen. Deze projecties vormen de basis voor de uiteindelijke 3D reconstructie. | | Fourieranalyse | Een wiskundige methode die wordt gebruikt om een signaal (in dit geval de 2D projecties) te ontbinden in zijn samenstellende frequenties. Dit is essentieel voor het reconstrueren van het originele 3D object uit de projecties. | | Terugprojectie | Het proces waarbij de informatie uit de 2D projecties wordt teruggevoerd naar een virtueel 3D beeld. Dit gebeurt iteratief om de meest nauwkeurige representatie van het object te verkrijgen. | | Artefacten (door missende wiggen) | Beeldvervormingen of onnauwkeurigheden die ontstaan in de 3D reconstructie doordat er geen projecties zijn verzameld over bepaalde hoeken. Dit wordt ook wel de "missing-wedge" artefact genoemd. | | Nucleair pore complex (NPC) | Een grote moleculaire machine die de nucleaire envelop doordringt en de passage van moleculen tussen de kern en het cytoplasma reguleert. Cryo-elektronen-tomografie wordt gebruikt om de structuur ervan in hoge resolutie te bestuderen. | | Slijmzwam (Dictyostelium discoideum) | Een modelorganisme dat vaak wordt gebruikt in celbiologisch onderzoek. De kern van deze slijmzwam, inclusief structuren zoals het nucleair pore complex, kan worden geanalyseerd met cryo-elektronen-tomografie. | | Ruw endoplasmatisch reticulum (RER) | Een netwerk van membranen binnen eukaryote cellen dat betrokken is bij de eiwitsynthese en -vouwing. De structuur ervan kan gedetailleerd worden onderzocht met behulp van cryo-elektronen-tomografie. | | Golgi-apparaat | Een organel in eukaryote cellen dat verantwoordelijk is voor het modificeren, sorteren en verpakken van eiwitten en lipiden voor secretie of aflevering aan andere organellen. De driedimensionale architectuur is bestudeerbaar met deze techniek. | | Resolutie | De kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven door een microscoop. De resolutie van een lichtmicroscoop wordt beperkt door het objectief en de golflengte van het zichtbaar licht. | | Lichtmicroscoop (LM) | Een microscoop die gebruikmaakt van zichtbaar licht om beelden van objecten te vergroten. De klassieke lichtmicroscoop wordt ook wel helderveld- of klaarveldmicroscoop genoemd. | | Klaarveldmicroscoop (Bright field) | Een type lichtmicroscoop waarbij het preparaat wordt belicht met doorvallend wit licht, wat resulteert in een helder beeld met donkere structuren. | | Objectief | Een van de drie lenssystemen in een lichtmicroscoop dat zich dicht bij het preparaat bevindt en een vergroot beeld vormt. Het objectief bepaalt mede de resolutie van de microscoop. | | Oculair (Eyepiece) | Een van de drie lenssystemen in een lichtmicroscoop dat het door het objectief gevormde beeld verder vergroot en op het netvlies van de waarnemer projecteert. | | Condensor | Een lenssysteem in een lichtmicroscoop dat het licht van de lichtbron bundelt op het preparaat. De condensor beïnvloedt de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit. | | Preparaten | Materiaal dat wordt onderzocht onder de microscoop. Dit kan variëren van celcultures op dekglaasjes tot versneden weefsels of orgaanculturen. | | Inbedding (Paraffine) | Een techniek waarbij weefselmonsters worden ondergedompeld in gesmolten paraffine om ze te ondersteunen en te stabiliseren, zodat ze in dunne secties kunnen worden versneden voor microscopisch onderzoek. | | Cryosecties | Dunne plakjes van bevroren biologisch materiaal die worden gemaakt met behulp van een cryostaat. Deze methode maakt het mogelijk om weefsels te analyseren zonder fixatie of inbedding in paraffine. | | Lichtabsorptie | Het proces waarbij een stof bepaalde golflengtes van licht opneemt. In de klaarveldmicroscopie worden preparaten vaak gekleurd om structuren te creëren die licht absorberen, waardoor ze zichtbaar worden. | | Prisma | Een optisch element dat wordt gebruikt om de lichtweg in een microscoop te buigen. Dit maakt een comfortabelere kijkpositie voor de onderzoeker mogelijk. | | Fixeren | Het proces waarbij weefsels worden behandeld om hun oorspronkelijke structuur te behouden door eiwitten te denatureren. Dit stopt afbraakprocessen door enzymen en zorgt ervoor dat cel- en weefselcomponenten behouden blijven voor verdere histologische procedures. | | Inbedden | Het proces waarbij gefixeerd weefsel wordt omwikkeld en doordrongen met een substantie die hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken (coupes) die geschikt zijn voor microscopisch onderzoek. | | Microtoom | Een instrument dat wordt gebruikt om ingebed, hard materiaal in zeer dunne plakken (coupes) te snijden. Er zijn verschillende typen microtomen, uitgerust met stalen, glazen of diamanten messen, afhankelijk van het inbedmiddel en het type microscopie. | | Artefacten | Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in vivo situatie. Dit kan leiden tot structurele veranderingen of het op een andere plaats voorkomen van componenten in het weefselpreparaat. | | Secties (coupes) | Zeer dunne plakken van weefsel die gesneden worden na fixatie en inbedding. Deze secties zijn essentieel om voldoende dun te zijn zodat lichtstralen of elektronen erdoorheen kunnen dringen voor microscopische observatie. | | Inbedmiddel | Een substantie die wordt gebruikt om gefixeerd weefsel te doordringen en te verharden, waardoor het mogelijk wordt om dunne coupes te snijden. Veelgebruikte inbedmiddelen zijn paraffine, harsen en plastics. | | Denaturatie | Een proces waarbij de driedimensionale structuur van een eiwit wordt veranderd, wat leidt tot verlies van zijn oorspronkelijke functie. In de histologie wordt denaturatie van eiwitten gebruikt om weefselafbraak te stoppen en de structuur te behouden. | | Hydrofoob | Een eigenschap van stoffen die water afstoten. Veel inbedmiddelen die in de histologie worden gebruikt, zijn hydrofoob en vereisen daarom dat het weefsel eerst wordt ontwaterd. | | Dehydrateren | Het proces waarbij water uit biologisch materiaal wordt verwijderd. In de histologie wordt dit meestal gedaan met behulp van een reeks alcoholbaden van oplopende concentraties om het weefsel voor te bereiden op inbedding met hydrofobe middelen. | | Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) | Een veelgebruikte histologische kleuring die al meer dan een eeuw essentieel is voor het identificeren van weefseltypes en morfologische veranderingen, met name in de kankerdiagnose. Hematoxyline kleurt nucleïnezuren diep blauw-paars, terwijl eosine eiwitten roze kleurt, waardoor kernen blauw en cytoplasma en extracellulaire matrix roze worden. | | Nucleïnezuren | Moleculen zoals DNA en RNA die de genetische informatie van een cel bevatten. In de H&E kleuring worden deze door hematoxyline diep blauw-paars gekleurd, wat belangrijk is voor het beoordelen van intranucleaire details en heterochromatinecondensatie. | | Cytoplasma | Het deel van een cel dat zich buiten de celkern bevindt, inclusief de organellen en het cytosol. In de H&E kleuring kleurt het cytoplasma roze door de binding van eosine aan eiwitten, en kan het een blauwe gloed vertonen bij overvloedige polyribosomen. | | Extracellulaire matrix | Een complex netwerk van macromoleculen buiten de cellen, dat structurele ondersteuning biedt en celactiviteiten reguleert. In de H&E kleuring wordt de extracellulaire matrix roze gekleurd door eosine. | | Heterochromatine | Een dicht opeengepakte vorm van chromatine die minder toegankelijk is voor transcriptie. De patronen van heterochromatinecondensatie, gekleurd door hematoxyline, zijn diagnostisch van groot belang bij het beoordelen van celtypen en kankers. | | Nucleoli | Dense structuren binnen de celkern die betrokken zijn bij de synthese van ribosomen. In de H&E kleuring worden nucleoli gekleurd met eosine. | | Immunofluorescentie | Een techniek die antilichamen gebruikt die gelabeld zijn met fluorescerende moleculen om specifieke antigenen in weefsels of cellen te detecteren. Hematoxylinekleuring is onverenigbaar met immunofluorescentie. | | Immunohistochemische kleuring | Een techniek die antilichamen gebruikt om specifieke antigenen in weefsels aan te tonen. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, enzym of ander label dat zichtbaar wordt gemaakt. | | Colorimetrische substraten | Stoffen die door een enzymatische reactie worden omgezet in een gekleurd product, waardoor de aanwezigheid en activiteit van het enzym zichtbaar wordt. Deze worden gebruikt in immunohistochemische en hybridisatieprocedures. | | Indifferente kleurstoffen | Kleurstoffen die niet-specifiek bepaalde componenten in het weefsel aankleuren, zoals vetten. | | Enzymkleuringen | Technieken die de activiteit van specifieke enzymen in weefsels aantonen door gebruik te maken van een voor het enzym specifiek substraat, wat resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag. | | Tetrazoniumzoutmethode | Een specifieke methode die gebruikt wordt voor enzymkleuringen, zoals de kleuring van glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten. | | Denaturatie van eiwitten | Een proces waarbij de driedimensionale structuur van eiwitten wordt veranderd, waardoor hun biologische functie verloren gaat. In de context van weefselpreparatie stopt dit enzymatische afbraakprocessen. | | Chemische fixatieven | Stoffen die worden gebruikt om weefsels te fixeren door eiwitten te cross-linken of te precipiteren, waardoor de cellulaire en weefselstructuren behouden blijven voor verdere histologische procedures. Voorbeelden zijn formol en glutaraldehyde. | | Ontwateren | Het verwijderen van water uit biologisch materiaal, vaak met behulp van een reeks alcoholbaden met oplopende concentraties, om de penetratie van hydrofobe inbedmiddelen mogelijk te maken. | | Clearing | Een stap in het inbedproces waarbij een substantie (zoals tolueen) wordt gebruikt die mengbaar is met zowel de alcohol die het weefsel heeft ontwaterd als met het hydrofobe inbedmiddel, om de overgang te vergemakkelijken. | | Coupes | De dunne plakken weefsel die worden gesneden met behulp van een microtoom, bedoeld voor observatie onder een microscoop. De dikte varieert afhankelijk van het type microscopie (licht- of elektronenmicroscopie). | | Lichtmicroscopie (LM) | Een microscopische techniek die gebruikmaakt van zichtbaar licht om structuren te vergroten en te observeren. Weefselcoupes voor LM zijn doorgaans dikker (5-10 µm) en worden op glazen draagglasjes geplaatst. | | Elektronenmicroscopie (EM) | Een microscopische techniek die gebruikmaakt van een bundel elektronen om structuren te vergroten en te observeren, waardoor veel hogere resoluties worden bereikt dan met LM. Coupes voor EM zijn extreem dun (ongeveer 70 nm) en worden op metalen roosters (grids) geplaatst. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij een elektronenbundel over het oppervlak van een monster wordt gescand. De detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen genereert een driedimensionaal beeld van het oppervlak van het monster. | | Elektromagnetische lenzen | Componenten in een elektronenmicroscoop die, in plaats van glazen lenzen in een lichtmicroscoop, elektromagnetische velden gebruiken om de elektronenbundel te focussen en te sturen, wat essentieel is voor het creëren van een scherp beeld. | | Vacuüm | Een omgeving met een zeer lage druk, die essentieel is voor elektronenmicroscopie omdat elektronen gemakkelijk worden gestopt of afgebogen door gasmoleculen. Hoog vacuüm zorgt ervoor dat de elektronenbundel ongehinderd het monster kan bereiken. | | Negatieve kleuring | Een preparatietechniek voor elektronenmicroscopie waarbij het monster wordt omgeven door een zwaarmetaal-oplossing. Het zware metaal sluit bepaalde structuren uit, waardoor deze als lichte gebieden tegen een donkere achtergrond verschijnen, wat de morfologie van bijvoorbeeld virusdeeltjes zichtbaar maakt. | | Shadow casting (schaduwbestuiving) | Een preparatietechniek waarbij een monster onder een schuine hoek wordt bestoven met verdampt metaal. Dit creëert een "schaduw" achter de uitstekende structuren, wat helpt bij het visualiseren van driedimensionale details en de oriëntatie van moleculen. | | Ultradunne secties | Zeer dunne plakjes van biologisch materiaal (typisch 50-100 nm dik) die worden gesneden voor transmissie-elektronenmicroscopie. Deze dunheid is noodzakelijk om de elektronenbundel door het monster te laten passeren en een beeld te vormen. | | Lichtmicroscoop | Een instrument dat licht gebruikt om beelden van kleine objecten te vergroten, zoals cellen en weefsels, waardoor structuren zichtbaar worden die met het blote oog niet te zien zijn. | | Geïnverteerde lichtmicroscoop | Een type lichtmicroscoop waarbij de objectieven zich onder het monster bevinden en de lichtbron erboven, wat ideaal is voor de observatie van levende celculturen in hun kweekmedia. | | Discussiemicroscoop | Een lichtmicroscoop die is uitgerust met een digitale camera, waardoor beelden kunnen worden vastgelegd, opgeslagen en gedeeld voor analyse en discussie tussen onderzoekers. | | PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff) | Een histologische kleuringstechniek die vrije suikers en koolhydraten in weefselcoupes aankleurt, vaak resulterend in een roze tot paarse kleur, wat nuttig is voor het identificeren van slijm en glycogeen. | | Hematoxyline | Een basische kleurstof die, vaak in combinatie met een beitsmiddel zoals aluminiumzouten, negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern aankleurt, wat resulteert in een blauwe tot donkerpaarse kleur. | | Eosine | Een zure kleurstof die positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel aankleurt, zoals eiwitten in het cytoplasma, wat resulteert in een roze kleur. | | HE-kleuring (Hematoxyline en Eosine) | Een veelgebruikte histologische kleuringstechniek die hematoxyline en eosine combineert om verschillende weefselstructuren zichtbaar te maken; kernen kleuren blauw en cytoplasma en extracellulaire matrix roze. | | Villus (darmvlok) | Een vingerachtige uitstulping aan de binnenkant van de dunne darm die de absorptie van voedingsstoffen verhoogt; in HE-kleuring zijn de kernen van de epitheelcellen blauw en het cytoplasma roze. | | Microvilli (borstelzoom) | Kleine, haarachtige uitsteeksels aan het apicale oppervlak van epitheelcellen, met name in de darm, die het oppervlak voor absorptie vergroten; deze kunnen worden aangekleurd met PAS-kleuring. | | Basale membraan | Een dunne laag extracellulaire matrix die epitheel- en endotheelcellen scheidt van het onderliggende bindweefsel; deze kan zichtbaar worden gemaakt met specifieke kleuringen of door contrastverschillen. | | Fasecontrastmicroscopie | Een lichtmicroscopische techniek die kleine faseverschuivingen van licht, veroorzaakt door brekingsverschillen in het preparaat, omzet in amplitudeveranderingen (licht/donker), waardoor ongekleurde preparaten, zoals levende cellen, zichtbaar worden. | | Differentieel interferentie-contrastmicroscopie (DIC of Nomarski) | Een techniek die gebruikmaakt van gepolariseerd licht en speciale prisma's om verschillen in optische dichtheid en brekingsindex binnen een preparaat te detecteren, wat resulteert in een beeld met reliëfachtige details, vooral nuttig voor levende, ongekleurde cellen. | | Epifluorescentie | Een methode binnen de fluorescentiemicroscopie waarbij het preparaat wordt geactiveerd met excitatielicht van korte golflengte, waarna de fluorochroom in het preparaat emissielicht uitzendt van een langere golflengte. Dit kan conventioneel gebeuren met een lamp of via confocale laser scanning microscopie. | | Confocale laser scanning microscopie (CLSM) | Een geavanceerde techniek binnen de fluorescentiemicroscopie die gebruikmaakt van een laser als exciterende lichtbron om zeer scherpe beelden te verkrijgen. Door een punt-voor-punt scanning en het gebruik van een pinhole wordt achtergrondfluorescentie onderdrukt, wat resulteert in verbeterde resolutie en optische secties. | | Excitatie spectrum | Het bereik van golflengten van licht dat een fluorofoor kan absorberen om in een geëxciteerde toestand te komen. Dit spectrum bepaalt welke golflengte van licht nodig is om fluorescentie op te wekken. | | Emissiespectrum | Het bereik van golflengten van licht dat een fluorofoor uitzendt nadat het geëxciteerd is. De emissiegolflengte is altijd langer dan de excitatiegolflengte, een fenomeen dat bekend staat als Stokes-verschuiving. | | Barrièrefilter (Stopfilter) | Een filter dat wordt gebruikt in de fluorescentiemicroscopie om het excitatielicht te blokkeren en alleen het emissielicht van de fluorochroom door te laten naar de detector. Dit is essentieel om een helder beeld van de fluorescentie te verkrijgen. | | Dichroïsche spiegel (Beamsplitter) | Een speciaal optisch component dat in fluorescentiemicroscopen wordt gebruikt om het excitatielicht naar het preparaat te reflecteren en tegelijkertijd het emissielicht door te laten naar de detector. Het scheidt de twee lichtpaden efficiënt. | | Immunofluorescentie microscopie | Een techniek die gebruikmaakt van antilichamen, waaraan een fluorochroom is gekoppeld, om specifieke eiwitten of antigenen in cellen of weefsels te detecteren en te visualiseren. De fluorescentie lokaliseert de doelmoleculen. | | Fluorescente eiwitten | Eiwitten die zelf fluorescentie vertonen, zoals Green Fluorescent Protein (GFP) en zijn varianten. Ze kunnen genetisch worden gekoppeld aan andere eiwitten om hun lokalisatie en dynamiek in levende cellen te bestuderen. | | Colocalisatie | Het verschijnsel waarbij twee of meer verschillende fluorescerende signalen (afkomstig van verschillende fluorochromen of fluorescente eiwitten) zich in dezelfde regio van een cel of weefsel bevinden. Dit duidt op een mogelijke functionele interactie tussen de gelokaliseerde moleculen. | | Celbiologie (Cytologie) | De tak van de biologie die zich bezighoudt met de studie van cellen, hun structuur, functies, en levensprocessen. | | Snijden (Coupes) | Het proces van het maken van dunne plakjes (coupes) van ingebed weefsel met behulp van een microtoom, zodat licht of elektronen erdoorheen kunnen dringen voor observatie onder een microscoop. | | Kleuren (Contrastverhoging) | Het aanbrengen van kleurstoffen op weefselcoupes om specifieke structuren of componenten zichtbaar te maken en het contrast te verhogen, wat essentieel is voor observatie onder een lichtmicroscoop. | | Klaarveldmicroscopie (Helderveldmicroscopie) | Een standaard lichtmicroscopietechniek waarbij doorvallend wit licht wordt gebruikt om het specimen te belichten, wat resulteert in een beeld waarbij de structuren donkerder zijn dan de achtergrond. | | Differentieel Interferentie-Contrast microscopie (DIC of Nomarski) | Een geavanceerde lichtmicroscopietechniek die gebruik maakt van gepolariseerd licht en interferentie om zeer gedetailleerde beelden te genereren met een pseudo-3D-effect, vooral nuttig voor levende, ongekleurde preparaten. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopietechniek die gebruik maakt van fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen) die licht absorberen bij een bepaalde golflengte en dit weer uitzenden bij een langere golflengte, waardoor specifieke moleculen of structuren zichtbaar worden. |