01 inleiding & techniek 25-26 & notes.pdf-summary-pages-deleted.pdf

# Lichtmicroscopische technieken en kleuringsmethoden Lichtmicroscopie is een fundamentele techniek voor het visualiseren van cel- en weefselstructuren, waarbij verschillende optische principes en kleurstofmethoden worden toegepast om contrast en detail te genereren [27](#page=27). ### 1.1 Typen lichtmicroscopen Lichtmicroscopen variëren in hun ontwerp en toepassing, aangepast aan specifieke observatiebehoeften [27](#page=27). #### 1.1.1 Algemene lichtmicroscopen * **Histologie-microscoop:** Standaard microscoop voor het bestuderen van vaste weefselcoupes [27](#page=27). * **Discussie-microscoop:** Vaak uitgerust met digitale camera's om beelden vast te leggen en te delen [27](#page=27). * **Geïnverteerde lichtmicroscoop:** Ideaal voor de observatie van levende celculturen, waarbij de objectieven zich onder het preparaat bevinden [27](#page=27). #### 1.1.2 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen Deze microscopen zijn ontworpen om specimens met weinig inherent contrast, zoals levende cellen, zichtbaar te maken zonder ze te hoeven kleuren [28](#page=28). * **Fasecontrastmicroscopie:** Maakt gebruik van de faseverschuiving die licht ondergaat bij het passeren door het preparaat. Kleine faseveranderingen, veroorzaakt door verschillen in brekingsindex, worden omgezet in amplitudeveranderingen (licht/donker), wat resulteert in een zwart-wit beeld. Dit is een uitvinding van Zernike en wordt toegepast op ongekleurde, levende preparaten zoals celculturen of vriescoupes [28](#page=28). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski):** Benut de interferentie van doorvallend gepolariseerd licht om verschillen in optische dichtheid en brekingsindex te visualiseren. Het vereist gespecialiseerde prisma's en interferentiefilters [28](#page=28). * **Digitale microscopie:** Maakt gebruik van computerverwerking van beelden met ultragevoelige videocamera's. Deze techniek is dynamisch en maakt zowel real-time als time-lapse opnamen mogelijk [28](#page=28). * **(Fluorescentie)microscopen voor 'life cell imaging':** Worden verder besproken in de context van fluorescentietechnieken [28](#page=28). > **Tip:** Ongekleurde preparaten hebben vaak weinig contrast in een standaard klaarveldmicroscoop, wat de analyse bemoeilijkt. Fasecontrast- en DIC-microscopie bieden hier uitkomst door subtiele optische verschillen om te zetten in zichtbare contrastverschillen [28](#page=28). ### 1.2 Principes van contrastverhoging in lichtmicroscopie Contrast in lichtmicroscopie kan op twee manieren worden verhoogd [28](#page=28): 1. **Histologische kleuring:** Kleurstoffen absorberen specifieke golflengtes van het opvallende licht, wat leidt tot kleurvorming en zo het contrast verhoogt [28](#page=28). 2. **Benutten van optische dichtheidsverschillen:** In ongekleurde preparaten, hoewel transparant, bestaan er kleine verschillen in optische dichtheid. Deze verschillen veroorzaken faseverschuivingen in het licht, die door interferentie (positief of negatief) worden omgezet in een zwart-wit beeld in fasecontrast- of DIC-microscopen [28](#page=28). #### 1.2.1 Optische paden Het optische pad beschrijft de route die licht aflegt door de microscoop, wat verschilt tussen verschillende technieken [28](#page=28). * **Klaarveld-microscoop:** Standaard microscoop waarbij het licht direct door het preparaat schijnt [29](#page=29). * **Fasecontrast-microscoop:** Heeft een gespecialiseerde optische weg die faseverschuivingen omzet in zichtbaar contrast [29](#page=29). ### 1.3 Kleuringsmethoden Kleuren is essentieel om de transparante structuren in weefselcoupes zichtbaar te maken en onderscheid te kunnen maken tussen verschillende celcomponenten [29](#page=29). #### 1.3.1 Algemene principes van kleuring Wit licht bestaat uit een spectrum van golflengtes, wat de basis vormt voor kleur. Kleuringstechnieken maken gebruik van kleurstoffen, vaak in waterige oplossingen. Voor weefselcoupes die in paraffine zijn ingebed, is een deparaffinisatie stap (met tolueen) nodig voordat gekleurd kan worden. Het belangrijkste bindingsmechanisme bij histologische kleuringen is ionische binding, gebaseerd op elektrostatische aantrekking tussen tegengesteld geladen deeltjes in het weefsel en de kleurstof [29](#page=29). #### 1.3.2 Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring De H&E kleuring is een routinekleuring bij uitstek voor histologisch onderzoek vanwege de effectiviteit en breed toepasbare morfologische details [29](#page=29). * **Hematoxyline:** * Technisch gezien geen kleurstof op zichzelf; vereist een "beitsmiddel" (vaak metaalionen zoals aluminium) om aan het weefsel te hechten [30](#page=30). * In complex met aluminiumzouten is het kationisch (positief geladen) en werkt als een basische kleurstof [30](#page=30). * Reageert met negatief geladen, basofiele celbestanddelen, zoals nucleïnezuren in de celkern [30](#page=30). * Kleur: Blauw tot donkerpaars [30](#page=30). * Kernen tonen diagnostisch belangrijke patronen van heterochromatinecondensatie [30](#page=30). * **Eosine:** * Is anionisch (negatief geladen) en werkt als een zure kleurstof [30](#page=30). * Reageert met positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma [30](#page=30). * Kleur: Roze [30](#page=30). * Kleurt niet-specifiek eiwitten aan [30](#page=30). * Nucleoli worden met eosine gekleurd [30](#page=30). * Overvloedige polyribosomen geven het cytoplasma een blauwe gloed [30](#page=30). * De Golgi-zone kan zichtbaar worden door het gebrek aan kleuring naast de kern [30](#page=30). #### 1.3.3 Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring De PAS-kleuring kleurt vrije suikers aan. In het voorbeeld van de darmvillus kleurt het intervilleus slijm, gesecreteerd door slijmbekercellen, en de microvilli (borstelzoom) aan [30](#page=30). #### 1.3.4 Toepassingen en beperkingen van H&E H&E kleuring is essentieel voor het herkennen van weefseltypes en morfologische veranderingen, met name in de kankerdiagnose. De kleuring toont een breed scala aan cytoplasmatische, nucleaire en extracellulaire matrixkenmerken. Een beperking is dat H&E onverenigbaar is met immunofluorescentie. Hematoxyline, eventueel zonder eosine, kan nuttig zijn als tegenkleuring in immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken (bv. alkalische fosfatase of peroxidase) [30](#page=30). > **Voorbeeld:** Bij de analyse van een darmvillus met PAS en hematoxyline, wordt het slijm en de microvilli paars-blauw gekleurd door PAS, terwijl de kernen van de epitheelcellen donkerblauw kleuren door hematoxyline. De basaalmembranen worden aangegeven met pijlen [30](#page=30). ### 1.4 Artefacten in weefselpreparatie Het is belangrijk om op te merken dat veranderingen die optreden tijdens de preparatieprocedures, zoals fixatie, kunnen leiden tot artefacten, wat afwijkingen zijn van de werkelijke in-vivo situatie [25](#page=25). * **Voorbeeld artefact:** Een holte rond kraakbeencellen of de misplaatsing van componenten zoals glycogeen in een leverpreparaat zijn voorbeelden van artefacten. De grote wanorde in het onderste beeld van een carcinoom van het colon is een voorbeeld van hoe artefacten of weefselveranderingen de interpretatie kunnen beïnvloeden [25](#page=25). --- # Principes en toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie is een essentiële techniek die gebruikmaakt van fluorescerende moleculen om specifieke structuren of moleculen binnen biologische monsters zichtbaar te maken [31](#page=31). ### 2.1 Algemene principes van fluorescentiemicroscopie #### 2.1.1 Werkingsmechanisme Bij fluorescentiemicroscopie worden fluorescerende kleurstoffen, ook wel fluorochromen genoemd, ingezet. Deze fluorochromen hebben de eigenschap om licht van een specifieke golflengte te absorberen (excitatie) en vervolgens licht met een langere golflengte uit te zenden (emissie). Om de emissie waar te nemen, is het cruciaal dat de absorptiestraling, na doorgelaten te zijn door een excitatiefilter, effectief wordt tegengehouden door een barrièrefilter. Het excitatie- en emissiespectrum van een typisch fluorofoor, zoals fluoresceïne (of Alexa 488), illustreert dit principe, waarbij het emissiespectrum altijd bij een langere golflengte ligt dan het excitatiespectrum [31](#page=31). #### 2.1.2 Componenten van een epifluorescentiemicroscoop Een standaard epifluorescentiemicroscoop bestaat uit de volgende kerncomponenten: 1. **Excitatiebron**: Dit kan variëren van een kwikdamplamp (Hg) of xenonlamp (Xe) tot lasers [31](#page=31). 2. **Golflengtefilters in een filterkubus**: * **Excitatiefilter**: Verantwoordelijk voor het selecteren van de specifieke golflengte van het excitatielicht [31](#page=31). * **Dichroïsche spiegel (beamsplitter)**: Reflecteert het excitatielicht naar het monster en laat vervolgens het door het monster geëmitteerde licht door naar de detector [31](#page=31). * **Emissiefilter of stopfilter**: Blokkeert effectief het resterende excitatielicht en laat enkel het emissielicht door naar de detector [31](#page=31). 3. **Detector**: Dit kan direct het menselijk oog zijn, of een camera (digitaal of analoog) [31](#page=31). > **Tip:** Het nauwkeurig afstemmen van de excitatiefilters, dichroïsche spiegels en emissiefilters is van essentieel belang om optimale fluorescentiesignalen te verkrijgen en de achtergrondfluorescentie te minimaliseren [32](#page=32). #### 2.1.3 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) Naast de conventionele epifluorescentiemicroscopie, bestaat ook de confocale laser scanning microscopie (CLSM). CLSM maakt doorgaans gebruik van een laser als excitatiebron en biedt de mogelijkheid om optische secties van het monster te creëren. Dit resulteert in beelden met een verhoogde resolutie en aanzienlijk minder achtergrondruis [32](#page=32). ### 2.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie vindt brede toepassing voor het visualiseren, lokaliseren en kwantificeren van moleculen in zowel levende als gefixeerde cellen en weefsels [32](#page=32). #### 2.2.1 Ion-gevoelige kleurstoffen Deze specifieke klasse van kleurstoffen vertoont veranderingen in hun fluorescentie die direct afhankelijk zijn van de ionenconcentratie binnen de cel. Een prominent voorbeeld is Fura-2, dat ingezet wordt voor de kwantificatie van intracellulaire calciumionen (Ca²⁺). Veranderingen in de Ca²⁺-concentratie zijn cruciaal voor het sturen van diverse cellulaire processen, waaronder reacties op specifieke stimuli [32](#page=32). > **Example:** Het observeren van de Ca²⁺-gradiënt in een bewegende cel met behulp van Fura-2 kan diepgaande inzichten verschaffen in de richting en de onderliggende mechanismen van celmigratie [32](#page=32). #### 2.2.2 Immunofluorescentie microscopie Bij deze methode worden specifieke eiwitten gedetecteerd met behulp van antilichamen waaraan een fluorchroom is gekoppeld (geconjugeerd). Dit stelt onderzoekers in staat om de exacte locatie en distributie van specifieke eiwitten binnen gefixeerde cellen of weefsels te visualiseren [32](#page=32). #### 2.2.3 Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten Eiwitten kunnen genetisch gemodificeerd worden om gefuseerd te worden met fluorescente eiwitten, zoals Blue Fluorescent Protein (BFP) of Yellow Fluorescent Protein (YFP). Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke eiwitten in levende cellen te volgen en hun dynamiek in detail te bestuderen. Een breed scala aan fluorescente eiwitten is beschikbaar en kan in verschillende organismen tot expressie worden gebracht [32](#page=32). #### 2.2.4 Visualisatie van organellen Fluorescentiemicroscopie kan ook succesvol worden toegepast voor het markeren en visualiseren van specifieke organellen, zoals lysosomen en mitochondria in celculturen [33](#page=33). #### 2.2.5 Aankleuring van meerdere eiwitten De techniek biedt de mogelijkheid om twee of meer eiwitten simultaan aan te kleuren en te visualiseren, wat waardevolle inzichten kan opleveren in hun interacties of co-lokalisatie. Een illustratief voorbeeld is het visualiseren van cytoskelet-kabels (actine in groen) en hun 'voetjes' (vinculine in rood) om co-lokalisatie aan te tonen [33](#page=33). > **Tip:** Bij de analyse van beelden met meerdere fluorochromen, zoals driedubbele overlays, is het van cruciaal belang om de specifieke emissieprofielen van elke kleurstof te kennen. Dit helpt bij het minimaliseren van kruisinterferentie en het verfijnen van de interpretatie van de resultaten [33](#page=33). #### 2.2.6 Combinatie met andere microscopietechnieken Fluorescentiemicroscopie kan effectief worden gecombineerd met technieken zoals Differential Interference Contrast (DIC) of Nomarski microscopie. Deze combinatie stelt onderzoekers in staat om morfologische informatie (structuur) te integreren met fluorescentiedata, resulterend in samengestelde beelden (overlay-beelden) die een completer beeld van het monster geven. Voorbeelden hiervan zijn de combinatie van morfologie, kernen en mitochondria [33](#page=33). #### 2.2.7 Registratie in microscopen Klassieke epifluorescentiemicroscopen kunnen uitgerust zijn met digitale registratieapparatuur. Dit maakt directe registratie mogelijk, zonder de noodzaak van oculair observatie, wat de gevoeligheid verhoogt en kwantitatieve analyse faciliteert [33](#page=33). --- # Voorbereiding van biologisch materiaal voor elektronenmicroscopie De voorbereiding van biologisch materiaal voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een essentieel proces dat uit meerdere stappen bestaat om structuren zichtbaar te maken die van nature te klein zijn of te weinig contrast bieden voor beeldvorming [14](#page=14). ### 7.1 Algemene beginselen van TEM-beeldvorming TEM maakt gebruik van versnelde elektronen voor beeldvorming. Omdat de golflengte van deze elektronen buiten het bereik van het menselijk oog valt, is voor detectie een fluoresentiescherm of fotografische plaat nodig. Beeldvorming in TEM is gebaseerd op elektronenstrooiing op de atomen van het doorstraalde weefsel; dichtere structuren absorberen meer elektronen en verschijnen donkerder, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten en lichter verschijnen. Biologisch materiaal vertoont echter van nature weinig densiteitsverschillen, wat contrastverhoging noodzakelijk maakt [14](#page=14). ### 7.2 Voorbewerkingstappen van biologisch materiaal Verschillende bewerkingsstappen zijn vereist om biologisch materiaal geschikt te maken voor TEM [14](#page=14). #### 7.2.1 Fixatie De eerste stap is fixatie, waarbij kleine stukjes ruw materiaal (zoals weefsel of losse cellen) worden behandeld met chemische stoffen, zoals glutaaraldehyde. Het doel is om de fijne structuren zo intact mogelijk te houden en de cellen doorlaatbaar te maken voor componenten die in latere stappen worden gebruikt [14](#page=14). #### 7.2.2 Spoeling en contrastering ('kleuring') Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen. Veelgebruikte contrasteringsmiddelen zijn osmiumtetroxide, uranylacetaat en kaliumpermanganaat. Deze zware metalen binden zich specifiek aan bepaalde celregio's, zoals vetrijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern en eiwitrijke structuren zoals cytoskelet-elementen. Deze metaalverbindingen weerkaatsen elektronen, waardoor de gemerkte structuren in de elektronenmicroscoop als donkere plekken verschijnen; dit proces wordt 'kleuren' genoemd, hoewel het geen echte kleuren betreft. Het verhogen van densiteitsverschillen door middel van zware metalen leidt tot een toename van elektronenstrooiing en daarmee tot een toename van het contrast. Osmiumtetroxide kan al tijdens de fixatie worden toegevoegd en draagt bij aan het contrast van membranen. Veelgebruikte contrasteringsvloeistoffen bestaan uit uranylacetaat en loodcitraat [15](#page=15). > **Tip:** Het gebruik van zware metalen is cruciaal voor zichtbaarheid, omdat deze elektronen absorberen of verstrooien, wat leidt tot een donkerder beeld op de detector [15](#page=15). > **Example:** Een typische stap in het contrasteringsproces is het onderdompelen van de ultradunne secties op het gridje in oplossingen van uranylacetaat gevolgd door loodcitraat. Dit bindt zich aan specifieke moleculen in de cel en zorgt voor voldoende contrast voor TEM-analyse [16](#page=16). #### 7.2.3 Dehydratatie Om ultradunne coupes (60-90 nm dik) te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, moet het materiaal worden ingebed in kunsthars. Aangezien de meeste harsen hydrofoob zijn, is het noodzakelijk om al het water uit het monster te verwijderen. Dit gebeurt door middel van wasstappen met ethanol of aceton van oplopende concentraties [15](#page=15). #### 7.2.4 Inbedding in hars en polymerisatie Na dehydratatie wordt het materiaal geleidelijk geïnfiltreerd met de nog niet-gepolymeriseerde hars. Het hars-doordrongen materiaal wordt in een houdertje geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule. Vervolgens vindt polymerisatie plaats, wat kan gebeuren door verhitting in een oven, met een magnetron, of door katalysatie met ultraviolet licht. Dit resulteert in harde, goed snijbare blokjes materiaal [15](#page=15). #### 7.2.5 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden Om coupes met een dikte van ongeveer 70 nm te produceren, zijn speciale snijinstrumenten vereist, zoals messen van gekliefd puur glas of diamanten messen. Het snijden gebeurt met behulp van een ultramicrotoom [15](#page=15). #### 7.2.6 Opvangen van coupes op een gridje Achter het snijvlak van de ultramicrotoom bevindt zich water dat zorgt voor smering van het snijvlak en het opvangen van de uiterst fragiele coupes. De coupes worden van het wateroppervlak "opgelepeld" op een zogenaamd gridje. Een gridje is een klein metaalschijfje (minder dan 5 mm) met een roosterpatroon [15](#page=15). ### 8 Cryo-elektronen-tomografie voor 3D reconstructie Cryo-elektronen-tomografie (cryo-ET) is een techniek die wordt gebruikt om driedimensionale structuren van biologische objecten te reconstrueren door middel van een reeks tweedimensionale projecties die onder verschillende hoeken worden verkregen [16](#page=16). #### 8.1 Principe van cryo-elektronen-tomografie De kern van cryo-ET is gebaseerd op het principe van tomografie, waarbij een object wordt gescand vanuit verschillende hoeken om een driedimensionale weergave te reconstrueren [16](#page=16). ##### 8.1.1 Verkrijgen van 2D projecties Bij cryo-ET wordt een object, meestal ingevroren in een dunne laag ijs om de natuurlijke staat te behouden, belicht met een elektronenbundel in een elektronenmicroscoop. Het monster wordt vervolgens geleidelijk gekanteld rond een as, en voor elke kantelhoek wordt een 2D projectie (een beeld) van het object opgenomen [16](#page=16). ##### 8.1.2 3D Reconstructie De reeks van 2D projecties, genomen onder verschillende hoeken, vormt de basis voor de 3D reconstructie. Dit gebeurt door middel van computeralgoritmen die de projecties analyseren en terugprojecteren naar een virtueel 3D beeld. Een groter aantal projecties met kleinere hoekverschuivingen resulteert in een nauwkeurigere reconstructie en vermindert artefacten die bekend staan als de 'missing-wedge' [16](#page=16). > **Tip:** Hoe meer projecties er worden verkregen met kleine hoekverschuivingen, hoe gedetailleerder en nauwkeuriger de uiteindelijke 3D reconstructie zal zijn [16](#page=16). ##### 8.1.3 Toepassingen van cryo-ET Cryo-ET is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de architectuur van grote moleculaire complexen, zoals het nucleaire pore complex (NPC). Door verschillende exemplaren van hetzelfde complex te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt [16](#page=16). > **Example:** Een voorbeeld van de toepassing van cryo-ET is de 3D reconstructie van een nucleair pore complex, wat essentieel is voor het transport van moleculen tussen de kern en het cytoplasma [17](#page=17). #### 8.2 Vergelijking met andere speciale EM-technieken Cryo-ET is één van de speciale elektronenmicroscopietechnieken die gebruikt worden voor gedetailleerd celonderzoek. Andere technieken die in de documentatie worden genoemd zijn [17](#page=17): * **Vries-breek (freeze-fracture):** Deze techniek wordt gebruikt om membraanstructuren te bestuderen door membranen te breken tussen hun binnenste en buitenste bladen. Het levert informatie over de locatie van eiwitten in het membraan [17](#page=17). * **Vries-ets (freeze-etching):** Een uitbreiding op vries-breek, waarbij een dunne laag ijs wordt verwijderd door sublimatie onder vacuüm om meer 3D structuur te genereren [17](#page=17). * **Serial block face-SEM (SBF-SEM) en Focused Ion Beam-SEM (FIB-SEM):** Bij deze technieken worden delen van het monster binnen de microscoop verwijderd met een ultramicrotoom of ionenlaser, waardoor opeenvolgende doorsneden kunnen worden bekeken [17](#page=17). De keuze voor een specifieke techniek hangt af van het type structuur dat bestudeerd moet worden en de gewenste resolutie en dimensionaliteit van de analyse. Cryo-ET is uniek in zijn vermogen om 3D reconstructies te leveren van relatief intacte, bevroren biologische objecten [17](#page=17). --- # Histologische technieken voor microscopisch onderzoek Histologische technieken maken cellen en weefsels zichtbaar onder een microscoop door ze dunner te snijden en het contrast te verhogen [19](#page=19). ### 4.1 Doel van histologische technieken Het hoofddoel van histologische technieken is om weefsels microscopisch observeerbaar te maken voor zowel lichtmicroscopie (LM) als elektronenmicroscopie (EM). Biologisch materiaal is van nature te dik en heeft weinig contrast voor gedetailleerde observatie. Histologische technieken zorgen voor het verdunnen van weefsels, zodat lichtstralen en elektronen erdoorheen kunnen dringen, en voor het verhogen van het contrast om structuurdetails zichtbaar te maken [19](#page=19). ### 4.2 De noodzaak van coupevorming Voor het waarnemen van subcellulaire details is het gebruik van dunne secties (coupes) essentieel. De procedure voor paraffinecoupes omvat fixeren, dehydrateren, inbedden in vloeibare paraffine, snijden met een microtoom (0,5 – 50 μm), en het kleuren van de secties op een microscoopsglaasje [19](#page=19). ### 4.3 Fixeren Fixatie is het proces waarbij weefsels worden bewaard met behoud van hun oorspronkelijke structuur, door eiwitten te denatureren. Zonder fixatie worden afbraakenzymen, die na het wegnemen van weefsel actief worden, niet gestopt [19](#page=19). #### 4.3.1 Methoden van fixatie * **Chemische fixatieven:** Dit zijn stoffen die eiwitten cross-linken, zoals formaldehyde en glutaraldehyde, of precipiteren, zoals alcohol en aceton. Ze stoppen enzymreacties en behouden structurele componenten door cross-linking, waardoor weefselcomponenten bewaard blijven tijdens verdere histologische procedures. Voorbeelden zijn formol (voor LM) en glutaraldehyde of osmiumtetroxide (voor EM) [19](#page=19). * **Invriezen (koude fixatie):** Bevriezen is een snelle methode die de epitopen beter bewaart voor immuunkleuringen. Het wordt veel gebruikt in pathologielaboratoria voor snelle diagnoses van biopten en tumoren, soms zelfs tijdens operaties [19](#page=19). #### 4.3.2 Artefacten door fixatie Artefacten zijn veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in-vivo situatie. Dit kan een structuurverandering zijn (bv. een holte rond kraakbeencellen) of het op een andere plaats voorkomen van componenten (bv. glycogeendrift in leverpreparaten). Chemische fixatieven resulteren over het algemeen in een betere morfologie [20](#page=20) [23](#page=23). ### 4.4 Inbedden Inbedden is het omwikkelen en doordringen van gefixeerd materiaal met een inbedmiddel. Het inbedmiddel is een substantie die in het weefsel dringt, hard wordt, en het materiaal snijdbaar maakt in dunne plakken [20](#page=20). #### 4.4.1 Inbedmiddelen Veelgebruikte inbedmiddelen zijn paraffine, hars en plastics. Deze middelen zijn meestal hydrofoob [20](#page=20). #### 4.4.2 Dehydrateren en 'clearing' Omdat biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%) en inbedmiddelen hydrofoob zijn, moet het water eerst verwijderd worden. Dit gebeurt met een stijgende reeks alcoholbaden (30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Nadat het water is vervangen door alcohol, wordt tolueen gebruikt voor de 'clearing'-stap; tolueen is mengbaar met zowel alcohol als het hydrofobe inbedmiddel [20](#page=20) [24](#page=24). > **Tip:** Alternatieve inbedmiddelen, zoals hydrofobe harsen met hydrofiele groepen of hydrofiele inbedmiddelen, zijn minder stabiel en resulteren in inferieure morfologie [20](#page=20). ### 4.5 Snijden Door de hardheid van het inbedmateriaal kan het weefsel gesneden worden in dunne plakken [20](#page=20) [24](#page=24). #### 4.5.1 Snijdikte en toepassingen * **Paraffine:** Produceert coupes van ongeveer 5-10 μm dik, wat geschikt is voor LM omdat het lichtdoorlatend is. Veel epitopen blijven bij de verhitting tot 55°C bewaard [20](#page=20) [24](#page=24). * **Hars en plastics:** Zijn harder en laten coupes toe tot 60-70 nm dik, wat geschikt is voor EM omdat deze coupes doorlaatbaar zijn voor elektronen. Polymerisatie van hars gebeurt bij 60-65 °C. Harsen zijn minder geschikt voor immuunkleuringen omdat ze moeilijk uit het weefsel te verwijderen zijn [20](#page=20) [24](#page=24). > **Tip:** De dikte van de coupes is direct gerelateerd aan de penetratie van de stralen (licht of elektronen) van de microscoop, wat essentieel is voor het waarnemen van structuren op verschillende schalen [24](#page=24). > **Voorbeeld:** Het waarnemen van subcellulaire organellen vereist ultradunne coupes (70 nm) gemaakt van hars-ingebed weefsel voor EM, terwijl de morfologie van celkernen en weefselstructuren goed zichtbaar is met dikkere coupes (5-10 µm) van paraffine-ingebed weefsel voor LM [24](#page=24). #### 4.5.2 Gereedschap en plaatsing van coupes Het snijden van ingebed, hard materiaal gebeurt met een microtoom [21](#page=21) [24](#page=24). * **LM microtomen:** Gebruiken stalen messen [21](#page=21) [24](#page=24). * **EM microtomen:** Gebruiken glazen of diamanten messen [21](#page=21) [24](#page=24). Coupes voor LM-analyse worden aangebracht op glazen draagglasjes. Coupes voor EM-analyse worden geplaatst op metalen (koper, nikkel) roostertjes die grids worden genoemd [21](#page=21) [24](#page=24). > **Voorbeeld:** Een patholoog wil snel een biopt analyseren tijdens een operatie. Hiervoor wordt het weefsel snel gefixeerd door invriezen en daarna in een microtoom gesneden om onmiddellijk onder de microscoop bekeken te kunnen worden voor een snelle diagnose [21](#page=21). ### 4.6 Histologische kleurtechnieken voor weefselanalyse Histologische kleurtechnieken zijn essentieel voor het visualiseren van weefselstructuren en het diagnosticeren van pathologische afwijkingen door specifieke cellulaire en extracellulaire componenten aan te kleuren [21](#page=21). #### 4.6.1 Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) De Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) is een fundamentele en wijdverbreide kleuringstechniek die al meer dan een eeuw wordt gebruikt voor weefselanalyse en kankerdiagnose [21](#page=21). ##### 4.6.1.1 Werkingsprincipe van H&E * **Hematoxyline:** Dit kleurt nucleïnezuren diep blauw-paars aan door een complexe reactie die nog niet volledig is begrepen. Het laat gedetailleerde intranucleaire structuren zien, zoals condensatiepatronen van heterochromatine, die diagnostisch van groot belang zijn [21](#page=21). * **Eosine:** Dit kleurt eiwitten roze aan. In een typische coupe kleuren de kernen blauw, terwijl het cytoplasma en de extracellulaire matrix variërend roze gekleurd zijn. Nucleoli worden door eosine gekleurd. Overvloedig polyribosomen in het cytoplasma kunnen leiden tot een duidelijke blauwe gloed. De Golgi-zone kan worden geïdentificeerd door een gebrek aan kleuring naast de kern [21](#page=21). ##### 4.6.1.2 Voordelen en beperkingen van H&E * **Voordelen:** * Werkt goed met diverse fixatieven [22](#page=22). * Visualiseert een breed scala aan cytoplasmatische, nucleaire en extracellulaire matrixkenmerken [22](#page=22). * Onthult structurele informatie met specifieke functionele implicaties [22](#page=22). * **Beperkingen:** * Onverenigbaar met immuunfluorescentie. Hoewel H&E onverenigbaar is met immuunfluorescentie, kan een seriële doorsnede gekleurd met H&E nuttig zijn ter oriëntatie voor immuunfluorescentie. Hematoxyline, vaak zonder eosine, kan worden gebruikt als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken [22](#page=22). #### 4.6.2 Specifieke kleurtechnieken Naast H&E zijn er diverse specifieke kleurtechnieken die gericht zijn op het visualiseren van verschillende weefselcomponenten of functies [22](#page=22). ##### 4.6.2.1 Indifferente kleurstoffen Indifferente kleurstoffen zijn technieken die specifiek vetten aankleuren. Een voorbeeld hiervan is Oil Red O, dat wordt gebruikt om vetcellen aan te kleuren [22](#page=22). ##### 4.6.2.2 Immunohistochemische kleuring Immunohistochemische kleuringen maken gebruik van antilichaam-antigeenbinding om specifieke bestanddelen in weefsels aan te kleuren. Het antilichaam wordt gelabeld met een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud. Een voorbeeld hiervan is de kleuring met DAB (diaminobenzidine) om specifieke structuren zoals microtubuli of connexine 43 in muishartweefsel aan te tonen [22](#page=22). ##### 4.6.2.3 Enzymkleuringen Enzymkleuringen demonstreren de activiteit van specifieke enzymen. Dit wordt bereikt door het gebruik van een substraat dat specifiek is voor het enzym; de reactie produceert een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de kleuring voor glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten met behulp van de tetrazoniumzoutmethode, die onderscheid maakt tussen erytrocyten met en zonder G6PD-activiteit [22](#page=22). > **Tip:** Het begrijpen van de basisprincipes van elke kleuringstechniek, inclusief het doelwit, het reactiemechanisme en de verwachte resultaten, is cruciaal voor accurate weefselinterpretatie [23](#page=23). > **Voorbeeld:** Bij de analyse van een weefselcoupe met H&E kleuring, zullen de kernen blauw zijn en het cytoplasma roze. Als de kernen echter onregelmatige, sterk gecondenseerde chromatinepatronen vertonen, kan dit duiden op maligniteit. Wanneer een Oil Red O kleuring wordt toegepast, zullen vetvacuolen in de cellen rood oplichten. Bij immunohistochemische kleuringen, zoals met DAB, kan specifieke eiwitexpressie worden gevisualiseerd als een bruine neerslag op de locatie van het eiwit [23](#page=23). --- # Elektronenmicroscopie en driedimensionale reconstructie Dit onderwerp behandelt de principes van elektronenmicroscopie (EM), inclusief transmissie- (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM), de noodzakelijke preparatie- en kleurtechnieken, en diverse methoden voor driedimensionale (3D) reconstructie uit 2D-beelden, evenals de interpretatieproblematiek die hierbij komt kijken. ### 5.1 Elektronenmicroscopie: principes en technieken Elektronenmicroscopie (EM) maakt gebruik van een bundel elektronen in plaats van licht om beelden te genereren, wat resulteert in een aanzienlijk hogere resolutie dan lichtmicroscopie. Dit komt door de veel kleinere golflengte van elektronen vergeleken met zichtbaar licht. Twee hoofdtypen EM zijn Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) [37](#page=37). #### 5.1.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Bij TEM wordt een bundel elektronen door een ultradun preparaat gestuurd. Elektronen worden verstrooid door zware atoomkernen in het preparaat, wat leidt tot een beeld op een fluorescerend scherm. De resolutie van TEM kan tot 1 nanometer bedragen [37](#page=37). * **Principe:** Een elektronenkanon genereert een elektronenbundel die door elektromagnetische lenzen wordt gefocust op een ultradun monster. De doorgelaten elektronen worden gedetecteerd om een beeld te vormen [37](#page=37). * **Technische vereisten:** Een vacuümomgeving is essentieel om interactie van elektronen met gasmoleculen te voorkomen, en hoogspanning is nodig voor de elektronenbundel om de hoge resolutie te bereiken [37](#page=37). #### 5.1.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) SEM wordt ingezet om het oppervlak van objecten in beeld te brengen. Hierbij scant een elektronenbundel het preparaat lijn per lijn, waarbij secundaire elektronen worden gegenereerd. Deze worden gedetecteerd om een driedimensionaal beeld te construeren. SEM is geschikt voor grotere en dikkere preparaten die vaak met een zwaar metaal zijn gecoat [38](#page=38). ### 5.2 Preparatie- en kleurtechnieken voor EM Biologisch materiaal vertoont van zichzelf weinig contrast in een TEM, waardoor speciale preparatie- en kleurtechnieken nodig zijn om structuren zichtbaar te maken [38](#page=38). * **Fixatie:** Materiaal wordt gestabiliseerd met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde en osmiumtetroxide om structuren te behouden en het preparaat voor te bereiden op verdere stappen [38](#page=38). * **Kleuring:** Verbindingen van zware metalen, zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat en loodcitraat, worden gebruikt om structuren met hogere densiteit donkerder te laten verschijnen. Dit verhoogt het contrast door verschillen in elektronenverstrooiing [38](#page=38). * **Negatieve kleuring:** Het monster wordt geïncubeerd met een metaalzout dat het specimen niet opneemt, waardoor het specimen wit afsteekt tegen een zwarte achtergrond. Dit wordt vaak toegepast voor virusdeeltjes of macromoleculen [38](#page=38). * **Shadowing (schaduwwerping):** Het preparaat wordt onder een schuine hoek bestoven met een metaal (bv. platina, goud). Dit creëert een driedimensionaal effect door de schaduwen die de metaaldeeltjes werpen; rotary shadowing wordt gebruikt voor nucleïnezuren [38](#page=38). * **Dehydratatie en Inbedding:** Water wordt verwijderd en het materiaal wordt ingebed in kunsthars om ultradunne secties te kunnen snijden [38](#page=38). * **Ultradun snijden:** Met een ultramicrotoom worden secties van 50-100 nm dik gesneden en op een gridje opgevangen [38](#page=38). ### 5.3 Driedimensionale reconstructie Driedimensionale reconstructie is de techniek om een 3D-beeld te construeren uit een reeks 2D-beelden, verkregen door opeenvolgende coupes of verschillende focusvlakken [36](#page=36). #### 5.3.1 Celcultuur als model Celcultuurtechnieken, die al sinds het begin van de 20e eeuw bestaan, vormen de basis voor veel 3D-reconstructiepreparaten [36](#page=36). * **2D Monolaagcultures:** Simuleren organen/weefsels, maar missen de complexe 3D-interacties [36](#page=36). * **3D Cultures:** Kunnen cysten vormen met specifieke apicaal/basolaterale eiwitverdeling, wat de in vivo omgeving beter nabootst [36](#page=36). #### 5.3.2 Beeldvormingstechnieken voor 3D Reconstructie Hoewel de directe documentatie van 3D reconstructietechnieken beperkt is in de verstrekte tekst, is het principe gebaseerd op het verkrijgen van een serie overlappende 2D-beelden [36](#page=36). * **Seriële coupes:** Het snijden van opeenvolgende dunne plakken van een weefsel of celaggregaat. Elk beeld wordt digitaal uitgelijnd en samengevoegd tot een 3D-model [36](#page=36). * **Confocale microscopie:** Maakt het mogelijk om beelden op verschillende focusdieptes te verzamelen, die gestapeld kunnen worden voor 3D-reconstructie [36](#page=36). #### 5.3.3 Interpretatieproblematiek De tweedimensionale aard van TEM-sneden kan leiden tot interpretatieproblemen bij het reconstrueren van driedimensionale structuren [38](#page=38). * **Artefacten:** Manipulaties tijdens preparatie (fixatie, inbedden, snijden) kunnen artefacten veroorzaken [37](#page=37). * **Verlies van informatie:** Bij het snijden van seriële coupes kan informatie verloren gaan of vervormd worden [37](#page=37). * **Uitlijning:** Het nauwkeurig uitlijnen van opeenvolgende 2D-beelden is cruciaal en technisch uitdagend [37](#page=37). * **Resolutiebeperkingen:** De resolutie van de microscoop bepaalt de fijnheid van de details in de reconstructie [37](#page=37). * **Verschillende doorsneden van dezelfde structuur:** Complexe, kronkelende structuren kunnen in verschillende ultradunne secties zeer uiteenlopende tweedimensionale vormen vertonen [38](#page=38). > **Tip:** Het is cruciaal om te beseffen dat een enkele TEM-sectie slechts een 'plakje' van een driedimensionaal object is. Het extrapoleren naar 3D vereist zorgvuldigheid [38](#page=38). #### 5.3.4 Technieken voor Driedimensionale Reconstructie Om de beperkingen van 2D-beelden te overwinnen, zijn diverse 3D-reconstructietechnieken ontwikkeld. * **Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET):** Genereert 3D-reconstructies door een serie 2D-projecties te maken terwijl het monster of de detector rond een as wordt gekanteld. Het principe is gebaseerd op Fourier-analyse van terugprojecties. Dit is zeer geschikt voor de ultrastructuur van subcellulaire componenten en macromoleculaire complexen. Hoe meer projecties met kleinere hoekverschuivingen, hoe nauwkeuriger de reconstructie en hoe minder 'missing-wedge' artefacten [39](#page=39). * **Serial Block Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM):** Geavanceerde EM-methoden voor 3D-reconstructies [39](#page=39). * **SBF-SEM:** Verwijdert ultradunne secties van het monster in de microscoop met een ultramicrotoom, terwijl het resterende 'blokfront' wordt gescand. In de vacuümkamer van de SEM wordt gebruik gemaakt van een diamantmes om dunne lagen van het blok te verwijderen [39](#page=39) [41](#page=41). * **FIB-SEM:** Gebruikt een ionenlaser om materiaal weg te nemen en het monster te structureren, gevolgd door SEM-analyse. Een focused ion beam wordt gebruikt om lagen van het monster te verwijderen [39](#page=39) [41](#page=41). * **Vries-breek en Vries-ets technieken:** Voornamelijk gebruikt voor gedetailleerde studie van membraanstructuren [39](#page=39). * **Vries-breek (Freeze-fracture):** Cellulaire membranen worden gebroken, meestal tussen de binnenste en buitenste leaflet van de dubbellaag, wat de eiwitten en eiwitaggregaten in de membraan onthult [39](#page=39). * **Vries-ets (Freeze-etching):** Na vries-breken wordt een dunne laag ijs verwijderd door sublimatie onder vacuüm, wat meer 3D-structuur genereert. Visualisatie gebeurt na bestuiving met zware atomen in TEM of SEM [39](#page=39). > **Tip:** De keuze van de EM-techniek hangt af van of men de interne structuur (TEM, Cryo-ET), het oppervlak (SEM) of membraanstructuren (Vries-breek) wil bestuderen [40](#page=40). ### 5.4 Voorbeelden van TEM- en SEM-analyse * **TEM-analyse van tracheaal epitheel:** Toont twee celtypes: cellen met lange cilia (geciliëerde cellen) en mucus-producerende cellen. Geciliëerde cellen bevatten veel mitochondriën en glad ER, terwijl mucus-producerende cellen veel ruw ER, een uitgebreid Golgi-apparaat en mucus-gevulde secretiedruppels hebben. De cilia zijn begrensd door een dubbelbladig biologisch membraan [40](#page=40). * **SEM-analyse van tracheaal epitheel:** Bevestigt de aanwezigheid van cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak. Voor SEM-analyse worden monsters geleidend gemaakt door ze met een sputter coater van een dun laagje goud of goud/palladium te voorzien. De vergroting in dit specifieke geval is ongeveer 4000x [40](#page=40). * **TEM-analyse van collageenvezels:** Gedetailleerd zichtbaar gemaakt door bestuiving met platina, waardoor het karakteristieke repetitiepatroon op de vezel zichtbaar is [40](#page=40). * **TEM-analyse van virusdeeltjes:** Virussen zoals het coronavirus en poliovirus kunnen worden geanalyseerd met negatieve kleuring of schaduwwerping [40](#page=40). * **TEM-analyse van dierlijke cellen:** Toont details zoals kernen, mitochondriën, lysosomen en endoplasmatisch reticulum met hoge resolutie, waardoor de ultrastructuur van cellen gedetailleerd kan worden bestudeerd [40](#page=40). * **Detectie van specifieke eiwitten met behulp van TEM:** TEM kan gebruikt worden voor de detectie van specifieke eiwitten met behulp van antilichamen die specifiek binden aan doelwit-eiwitten. Een voorbeeld hiervan is een antilichaam tegen een capsid-eiwit voor HIV-partikels die vanuit een cel uitboeren (budding) [40](#page=40). > **Tip:** SBF-SEM en FIB-SEM zijn cruciaal voor het verkrijgen van driedimensionale reconstructies van complexe structuren door opeenvolgende beelden van dunne plakjes te combineren [41](#page=41). --- # Methoden voor het prepareren en observeren van cellen en weefsels Dit gedeelte van de studiehandleiding behandelt de methoden die nodig zijn om cellen en weefsels zichtbaar te maken voor microscopisch onderzoek, met een specifieke focus op celcultuurtechnieken en de principes die hieraan ten grondslag liggen, evenals diverse microscopische observatietechnieken [1](#page=1). ### 1.1 Principes van cel- en weefselpreparatie Het primaire doel van cel- en weefselpreparatie is om biologisch materiaal observeerbaar te maken onder een lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM). Aangezien biologisch materiaal van nature weinig licht doorlaat en een laag inherent contrast heeft, zijn technieken als fixatie, inbedding, snijden en kleuring of contrastverhoging essentieel [1](#page=1). ### 1.2 Celcultuur: geschiedenis en concepten Celcultuurtechnieken zijn fundamenteel geworden voor biologisch onderzoek. De geschiedenis gaat terug tot 1907 met Harrison's "Tissue Culture" (TC), waarbij zenuwen van kikkerembryo's in lymfe werden gekweekt. In 1948 ontwikkelde Earle 2D-monolaagcultures die de 3D-structuur van organen en weefsels simuleren [1](#page=1). #### 1.2.1 Celtypen in cultuur * **Primaire culturen:** Deze ontstaan uit explantaten van organen of tumoren en hebben een beperkte levensduur [1](#page=1). * **Cellijnen:** Dit zijn stabiele, vaak geïmmortaliseerde cellen met een potentieel onbeperkte levensduur. Ze kunnen afkomstig zijn van tumoren of verkregen worden na selectie ("crisis") van verouderende culturen ("senescence"). Immortalisatie kan ook worden bereikt door de introductie van virale oncogenen [1](#page=1). #### 1.2.2 Stadia van celcultivering Het proces om een cellijn te creëren vanuit weefsel omvat de volgende stappen [1](#page=1): 1. Enzymatische behandeling van het weefsel om cellen te scheiden. 2. Cellen laten uitzakken of centrifugeren naar de bodem. 3. Cellen uitzetten in een groeirecipiënt, zoals een petrischaal. 4. Overleven en uitgroeien van de cellen. 5. Bij een confluente laag cellen, deze losmaken en splitsen voor verdere kweek. #### 1.2.3 Typische celculturen Celculturen kunnen op verschillende vergrotingen worden geobserveerd. Hoge vergrotingen tonen celranden, terwijl lage vergrotingen de ontwikkeling van kolonies uit enkele cellen illustreren [2](#page=2). ### 1.3 Groeisubstraten en -procedures #### 1.3.1 Groeisubstraten Groeisubstraten bieden niet alleen een fysieke drager, maar beschermen cellen ook tegen anoïkis (een vorm van geprogrammeerde celdood). Dit is cruciaal voor adherente celculturen. Verschillende materialen kunnen als substraat dienen [2](#page=2): * Glas (negatief geladen) [2](#page=2). * Voorbehandeld polystyreen (gebruikt in microplaten, flessen, multiplaten, rollers, beads) [2](#page=2). * Coatings zoals poly-D-lysine (sterk positief geladen), collageen (een eiwit van de extracellulaire matrix - ECM), of geconditioneerd milieu gevormd door feedercelculturen [2](#page=2). #### 1.3.2 Procedures om in vivo condities na te bootsen Om in vitro condities meer te laten lijken op de in vivo situatie, kunnen cellen worden gekweekt op ECM-eiwitten. Soms hebben cellen signalen of stoffen van omringende cellen nodig, wat nagebootst kan worden door het gebruik van medium van een moedercultuur of door cellen te kweken op een feedercellaag [2](#page=2). ### 1.4 Celgroeidichtheid en celtransfer #### 1.4.1 Celdichtheids-afhankelijke inhibitie Cellen in cultuur delen zich tot ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Op dit punt treedt "contactinhibitie" van celproliferatie op, mede door concurrentie voor mitogenen. Toevoeging van vers medium kan delingen opnieuw doen starten, maar het splitsen van de cultuur in dochterculturen, vaak via de trypsine-EDTA procedure, is efficiënter [2](#page=2). #### 1.4.2 Groei in 2D en 3D culturen Tumorcellen kunnen het vermogen tot contactinhibitie verloren hebben, wat leidt tot groei in dense foci of hoopjes, zelfs in 3D. MDCK-cellen (Madine-Darby Canine Kidney epitheelcellen) kunnen op een filter een 2D-cultuur vormen of, in de juiste omgeving, cysten in 3D. Bij 3D-groei kunnen eiwitten apicaal of basolateraal in de cel worden geplaatst [3](#page=3). #### 1.4.3 Procedure van celtransfer Celtransfer dient ter vermeerdering en behoud van cellen [3](#page=3). * **Suspensiecultures:** Dit gebeurt door eenvoudige verdunning, eventueel na zacht centrifugeren en heropname in vers milieu [3](#page=3). * **Adherente cellen:** Celtransfer vindt plaats wanneer de cel(mono)laag confluenter wordt, doorgaans elke 3 tot 7 dagen. De cultuur wordt behandeld met trypsine/EDTA (TE). Trypsine is een maagprotease dat oppervlakte-eiwitten degradeert bij korte behandeling. EDTA (ethyleendiaminetetra-acetaat) cheleert calcium en magnesium, wat intercellulaire adhesie en cel-substraatbinding beïnvloedt. Onder geschikte condities komen de cellen los van het substraat en elkaar, en vormen een monocellulaire suspensie. Deze suspensie wordt vervolgens verdund (uitgesplitst) en uitgezaaid in nieuwe recipiënten met een verdunning van 1:3 tot 1:30, afhankelijk van het celtype. Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren in serum [3](#page=3). > **Tip:** Bij celtransfer is het cruciaal om een monocellulaire suspensie te verkrijgen om aggregaten te vermijden [4](#page=4). ### 1.5 Cellijnen en celbanken Cellen kunnen afkomstig zijn van andere laboratoria, eigen isolatie (primaire culturen), of celbanken zoals ATCC (The American Type Culture Collection) en ECACC (The European Collection of Cell Cultures) [3](#page=3). > **Tip:** Bij het werken met cellijnen is het belangrijk te onthouden dat zelfs "stabiele" cellijnen na verloop van passages kunnen veranderen [4](#page=4). ### 1.6 Observatietechnieken en apparatuur Cellen in cultuur worden geobserveerd met behulp van microscopie, vaak met fluorescentiedye-gebaseerde methoden. Beeldacquisitie kan plaatsvinden op een confocale microscoop met specifieke objectieven en illuminatie door een argon/krypton laser. Cellen worden vaak waargenomen in een afgesloten flowkamer in specifieke groeimedia [4](#page=4). #### 1.6.1 Groeimedia voor celcultuur Voorbeelden van groeimedia zijn EMEM (Earle's Minimum Essential Medium) en Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DME). Deze worden vaak aangevuld met supplementen zoals foetaal kalfserum (FBS), L-glutamine, antibiotica (penicilline, streptomycin) en buffers zoals Hepes [4](#page=4). #### 1.6.2 Immunofluorescentiemicroscopie Voor immunofluorescentie worden cellen, bijvoorbeeld humane osteosarcoom (U2OS) cellen, na plating op met fibronectine gecoate coverslips gefixeerd [4](#page=4). #### Apparatuur voor celcultuur Deze sectie beschrijft de essentiële apparatuur voor celcultuur, met nadruk op de laminaire flowbench en de stappen in celadhesie en -spreiding [4](#page=4). ##### 2.1 Werken met cellen in een laminaire flowbench Een laminaire flowbench is cruciaal voor celcultuurtechnieken omdat het een steriele werkomgeving biedt om contaminatie te voorkomen. De flowbench is uitgerust met een High Efficiency Particulate Air (HEPA) filter dat de lucht steriliseert en beschermt tegen deeltjes [5](#page=5). > **Tip:** Werk altijd met de laminaire flowbench aan, ook als u deze niet direct gebruikt, om de steriele luchtstroom te behouden [5](#page=5). ##### 2.2 Celadhesie en -spreiding Na het losmaken en uitplanten van cellen vinden stappen plaats die leiden tot celadhesie en -spreiding op het substraat [5](#page=5): 1. **Sedimentatie:** Cellen zakken uit onder invloed van de zwaartekracht. 2. **Initieel contact:** Cellen maken contact met het substraat met een minimaal contactoppervlak vanwege hun opgebolde vorm. 3. **Progressieve spreiding:** In de uren die volgen, verspreiden de cellen zich geleidelijk, wat energie en veranderingen in het cytoskelet vereist, leidend tot een groter contactoppervlak en versterkte adhesie. 4. **Versterkte binding:** Cellen gaan een sterke binding aan met het substraat door de secretie van eigen extracellulaire matrix (ECM) moleculen [5](#page=5). Ondanks sterke cel-substraatsadhesie kunnen cellen migreren door tijdelijk lokale adhesie te inhiberen en elders weer op te bouwen [5](#page=5). > **Voorbeeld:** SEM-opnames tonen muisfibroblasten na uitplating. Na 30 minuten zijn de cellen nog opgebold met minimaal contact. Na 24 uur zijn ze significant verspreid en hebben ze een groter contactoppervlak gevormd [5](#page=5). ##### 2.3 Andere speciale apparatuur voor celcultuur Naast de laminaire flowbench zijn er andere belangrijke apparaten in een celcultuurfaciliteit: * **CO2-oven:** Incubatoren die een gecontroleerde omgeving met specifieke temperatuur en CO2-concentratie bieden, cruciaal voor celgroei. Deze zijn vaak uitgerust met een steriliserend HEPA-filter [6](#page=6). * **Opslag van ingevroren cellen:** Cellen kunnen worden ingevroren voor langdurige opslag, typisch in vloeibare stikstof bij -196°C [6](#page=6). > **Feit:** De CTC core in The Core (UZ campus) beschikt over 17 flowbenches, wat de omvang van de faciliteit aangeeft [6](#page=6). ### 3 Definities en eigenschappen van stamcellen Een stamcel is een cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren in verschillende andere soorten cellen of weefsels. Stamcellen beschikken over twee fundamentele eigenschappen: zelfvernieuwing en differentiatie [6](#page=6). #### 3.1 Zelfvernieuwing en differentiatie * **Zelfvernieuwing:** Het vermogen van stamcellen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te produceren [6](#page=6). * **Differentiatie:** Het proces waarbij stamcellen zich ontwikkelen tot volwassen celtypen die organen en weefsels vormen [6](#page=6). #### 3.2 Typen stamcellen op basis van potentie De potentie van een stamcel verwijst naar het vermogen om te differentiëren in verschillende celtypen. Er zijn verschillende niveaus van potentie [6](#page=6): ##### 3.2.1 Totipotente stamcellen Totipotente stamcellen hebben de hoogste differentiatiepotentie. Ze kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen van een individu en tot de cellen die de placenta vormen. De bevruchte eicel in de eerste uren na bevruchting is totipotent [7](#page=7). > **Voorbeeld:** De bevruchte eicel deelt zich direct na bevruchting, en ten minste één van deze vroege cellen is totipotent, met de mogelijkheid om zich te ontwikkelen tot een volledig organisme [7](#page=7). ##### 3.2.2 Pluripotente stamcellen Pluripotente stamcellen kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen van het lichaam, maar niet tot de cellen die de placenta vormen. Ongeveer 4 dagen na bevruchting vormen de totipotente cellen een holle bol, de blastocyst. De cellen aan de buitenkant differentiëren zich tot placenta-cellen, terwijl de cellen binnenin, de binnenste celmassa (ICM), pluripotent zijn [7](#page=7). > **Voorbeeld:** Ongeveer 4 dagen na de bevruchting, na meerdere delingscycli, vormen de totipotente cellen een holle bol genaamd de blastocyst. De cellen aan de buitenkant van de blastocyst differentiëren zich tot de cellen die de placenta vormen. De cellen binnenin de holle bal, de zogenaamde binnenste celmassa (ICM), zijn pluripotent. Ze kunnen zich niet ontwikkelen tot een foetus zonder de placenta, wat aangeeft dat hun potentie beperkter is dan die van totipotente cellen [7](#page=7). ##### 3.2.3 Multipotente stamcellen Multipotente stamcellen zijn meer gespecialiseerde stamcellen die zich kunnen ontwikkelen tot een beperkt aantal celtypen, meestal binnen een specifieke weefsellijn of orgaan [7](#page=7). > **Voorbeeld:** Hemopoëtische stamcellen zijn multipotent. Ze kunnen zich ontwikkelen tot verschillende soorten gespecialiseerde bloedcellen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar zijn beperkt tot de ontwikkeling van bloedcellen [7](#page=7). ### 4 Ethische overwegingen rondom humane embryonale stamcellen Stamcelonderzoek, met name dat met humane embryonale stamcellen, roept diverse ethische overwegingen op vanwege de oorsprong uit embryo's [7](#page=7). #### 4.1 Het embryo als menselijk leven Verschillende standpunten bestaan over de status van een embryo en de ethische toelaatbaarheid van embryo-onderzoek [7](#page=7). ##### 4.1.1 Het embryo als mens in het klein Een minderheidsperspectief stelt dat een embryo een mens in het klein is. Vanuit dit oogpunt wordt het vernietigen van een embryo voor onderzoek beschouwd als moord, waardoor embryo-onderzoek strikt onaanvaardbaar is [8](#page=8). ##### 4.1.2 Toelaatbaarheid van embryo-onderzoek Een ander standpunt is dat embryo-onderzoek mogelijk is, maar uitsluitend op overgebleven embryo's uit IVF-cycli. De redenering is dat als embryo's toch al aanwezig zijn en niet voor voortplanting worden gebruikt, ze beter voor onderzoek ingezet kunnen worden dan vernietigd te worden. Het creëren van embryo's specifiek voor onderzoeksdoeleinden wordt echter niet als acceptabel beschouwd [8](#page=8). ##### 4.1.3 Het belang van de leeftijd van het embryo Een cruciaal aspect in de ethische discussie is het moment waarop embryo's gebruikt worden. Hoe ouder een embryo, hoe meer het als een mens beschouwd wordt. In België geldt een maximumleeftijd van 12 dagen voor het gebruik van embryo's voor onderzoek [8](#page=8). #### 4.2 Algemene strekking en regelgeving De algemene tendens binnen de westerse onderzoekswereld is dat stamcelonderzoek acceptabel is, mits met de grootste voorzichtigheid. In Nederland is stamcelonderzoek toegestaan, maar er is strenge wetgeving die voorwaarden stelt aan het doel van het onderzoek, de gebruikte methodes, het laboratorium en de kwalificaties van de onderzoeker [8](#page=8). #### 4.3 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Een ethisch minder beladen alternatief betreft geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Deze cellen worden verkregen door somatische cellen te herprogrammeren tot een pluripotente staat, wat de noodzaak om embryo's te gebruiken omzeilt [8](#page=8). #### 4.4 Kwaliteitscontrole in celculturen Het werken met stamcellen, inclusief embryonale stamcellen, vereist strikte kwaliteitscontrole om de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen te waarborgen. Twee belangrijke aspecten zijn de detectie van contaminatie met micro-organismen en met vreemde cellen [8](#page=8). ##### 4.4.1 Contaminatie met micro-organismen Celculturen kunnen gecontamineerd raken met bacteriën, gisten, schimmels en met name antibiotica-resistente mycoplasma's (PPLO). Mycoplasma's zijn parasiterend, kunnen deels intracellulair leven, verstoren het cellulaire metabolisme (vaak door verzuring) en zijn moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar. Detectiemethoden omvatten cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA en PCR [9](#page=9). ###### 4.4.1.1 Effecten van mycoplasma contaminatie Mycoplasma contaminatie kan diverse effecten hebben op eukaryote cellen, waaronder veranderingen in eiwit-, RNA- en DNA-synthese, metabolisme en morfologie. Het kan leiden tot chromosomale aberraties, veranderingen in celmembraansamenstelling, inductie of suppressie van immuunreacties, beïnvloeding van virusreplicatie en interferentie met biochemische en biologische assays. Mycoplasma kan ook de proliferatiekenmerken van cellen beïnvloeden en leiden tot totale degeneratie van de cultuur. Specifieke effecten op hybridoma's omvatten inhibitie van cel fusie, beïnvloeding van selectie van fusieproducten, interferentie met screening van antilichamen, productie van antilichamen tegen mycoplasma in plaats van het doelantigeen, en verminderde opbrengst van monoklonale antilichamen [9](#page=9). ##### 4.4.2 Contaminatie met vreemde cellen Vreemde celcontaminatie is wijdverspreid. Veel "oudere" cellijnen blijken varianten te zijn van HeLa. Er zijn ook gevallen bekend waarbij "menselijke" cellijnen afkomstig bleken te zijn van muizen of ratten. Detectie hiervan kan via genetische fingerprinting en karyotypering [9](#page=9). ##### 4.4.3 Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit De (genetische) zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen kunnen worden gemeten door middel van karyotypering, waarbij het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen worden bepaald [9](#page=9). ###### 4.4.3.1 Inherente genetische instabiliteit Gecultiveerde cellen vertonen vaak een inherente genetische instabiliteit, waarbij het genotype (chromosoomvorm en -aantal) met de tijd evolueert. Dit is niet te vermijden, maar wel te beperken door regelmatig terug te keren naar stock-cultures die ingevroren zijn met cryoprotectieve middelen zoals glycerol of DMSO in vloeibare stikstof bij -196°C [9](#page=9). ### 5 Fluorescentiemicroscopie technieken en toepassingen Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende moleculen om specifieke structuren in een monster te visualiseren, wat leidt tot een hogere sensitiviteit en specificiteit vergeleken met andere microscopische technieken [9](#page=9). #### 5.1 Epifluorescentiemicroscopie Epifluorescentiemicroscopie is een klassieke opstelling waarbij het monster wordt belicht via de objectieflens, en de fluorescentie wordt geregistreerd zonder directe oculair observatie met een digitale detector. Dit maakt de combinatie van verschillende technieken mogelijk, zoals het overlayen van beelden verkregen met DIC (Nomarski) voor morfologie, een blauw fluorochroom voor kernen (DNA), en een rood fluorochroom voor mitochondria [10](#page=10). ##### 5.1.1 Voorbeelden van gecombineerde technieken Een voorbeeld van driedubbele fluorescentie is de aankleuring van endotheliale cellen van longarteriën van het rund. Hierbij worden cytoskelet-kabels (actine) in groen, mitochondria in rood, en DNA in blauw gekleurd met specifieke fluorescerende reagentia [10](#page=10). > **Tip:** Het combineren van verschillende fluorochromen met specifieke excitatatie- en emissiespectra maakt het mogelijk om meerdere structuren in één monster gelijktijdig te visualiseren [10](#page=10). #### 5.2 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) Het principe van de confocale laser scanning microscoop (CLSM) berust op het scannen van het monster met een laserstraal en het gebruik van een pinhole om het signaal te verbeteren. Een puntvormige lichtbron wordt gebruikt om het monster te exciteren. Het emissielicht wordt via de objectieflens naar een detector (vaak een Photomultiplier Tube - PMT) geleid [10](#page=10). > **Tip:** De pinhole is cruciaal omdat deze emissielicht dat niet afkomstig is uit het gewenste focale vlak (boven of onder de focus) blokkeert, waardoor de resolutie en het contrast significant verbeteren [10](#page=10). ##### 5.2.1 Werking van de CLSM Bij CLSM wordt het monster optisch gescand in 3 dimensies (XYZ). Alleen emissielicht afkomstig van het scherpe focale vlak bereikt de detector. Een typische confocale laser scanning microscoop bestaat uit laserlichtbronnen, elektronische filters en een spiegelhuis [10](#page=10). ##### 5.2.2 Vergelijking met conventionele fluorescentiemicroscopie Confocale microscopie biedt superieure beeldkwaliteit, met name in de Z-resolutie, vergeleken met conventionele fluorescentiemicroscopie. Recente softwarematige bewerkingstechnieken, zoals deconvolutie-algoritmes, kunnen echter ook met conventionele digitale beelden acceptabele hoge resoluties realiseren. Confocale microscopie is beter geschikt voor time-lapse studies van dynamische processen dan conventionele methoden [11](#page=11). > **Voorbeeld:** Confocale microscopie is uitermate geschikt voor het bestuderen van snelle cellulaire processen, zoals de beweging van organellen binnen een cel of de interactie tussen eiwitten in real-time [11](#page=11). ### 6 Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie is een softwarematige bewerking van conventionele digitale beelden die, door middel van specifieke algoritmes, in staat is om acceptabel hoge resoluties te verkrijgen. Dit staat tegenover confocale microscopie, die over het algemeen beter geschikt is voor time-lapse en analyse van dynamische processen [11](#page=11). #### 6.1 Werkingsprincipe van deconvolutie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie tracht de beeldvormingsfusie die optreedt in een microscoop te corrigeren. Wanneer licht door een object reist, wordt het uitgestraald in alle richtingen, wat resulteert in verstrooiing van het lichtsignaal. Een punt in het object verschijnt hierdoor als een uitgesmeerd vlekje, de _point spread function (PSF)_. Deconvolutie-algoritmes proberen deze PSF te kwantificeren en vervolgens het oorspronkelijke beeld te reconstrueren door de effecten van de PSF wiskundig te verwijderen of te verminderen [11](#page=11). > **Tip:** In essentie probeert deconvolutie het beeld "scherper" te maken door de bijdrage van licht uit naburige punten te scheiden en terug te wijzen naar hun oorspronkelijke bron [11](#page=11). ##### 6.1.1 Algemene principes Het proces van deconvolutie kan worden beschouwd als het omgekeerde van het convolutieproces dat plaatsvindt tijdens de beeldvorming [11](#page=11). * **Functie:** Het doel van deconvolutie is om het oorspronkelijke, scherpe beeld te herstellen door de PSF te gebruiken om de beeldvormingsfusie te corrigeren [12](#page=12). * **Iteratieve methoden:** Veelgebruikte deconvolutie-algoritmes zijn iteratief, wat betekent dat ze het beeld herhaaldelijk bewerken om de reconstructie te verbeteren totdat een bepaald criterium is bereikt. Deze methoden houden rekening met de natuurlijke beperkingen van beeldvorming, zoals ruis [12](#page=12). * **Beeldvormingsruis:** Ruis is een inherente eigenschap van digitale beelden en kan deconvolutie-algoritmes beïnvloeden. Het correct modelleren en hanteren van ruis is cruciaal voor succesvolle deconvolutie [12](#page=12). ##### 6.1.2 Toepassingen en voordelen Deconvolutie kan significant bijdragen aan de beeldkwaliteit in fluorescentiemicroscopie, met name bij het analyseren van complexe structuren en dynamische biologische processen [12](#page=12). * **Verhoogde resolutie:** Het kan de effectieve resolutie van een conventionele microscoop verbeteren, waardoor fijne details zichtbaar worden die anders verborgen zouden blijven [12](#page=12). * **Verbeterd contrast:** Door het reduceren van verstrooid licht en achtergrondruis, verhoogt deconvolutie het contrast tussen het signaal en de achtergrond, wat de interpretatie van beelden vergemakkelijkt [12](#page=12). * **3D beeldvorming:** Het is bijzonder nuttig voor 3D-beeldvorming, omdat het helpt om de scherpte in de Z-richting (diepte) te herstellen, wat vaak een beperking is bij conventionele microscopen [12](#page=12). * **Verbeterde kwantificering:** Met scherpere en duidelijkere beelden is nauwkeurigere kwantificering van fluorescentiesignalen, celmorfologie en dynamische veranderingen mogelijk [12](#page=12). ##### 6.1.3 Verschil met confocale microscopie Hoewel deconvolutie-fluorescentiemicroscopie vergelijkbare resultaten kan bereiken als confocale microscopie in termen van beeldkwaliteit, verschillen de onderliggende mechanismen. Confocale microscopie gebruikt een pinhole om onscherp licht van buiten het focusvlak te blokkeren, wat resulteert in een inherent verbeterde scherpte en de mogelijkheid om optische secties te maken. Deconvolutie, daarentegen, is een post-processing techniek die de beelddata _na_ de acquisitie verwerkt [12](#page=12). > **Voorbeeld:** Een conventionele microscoop kan een beeld creëren dat er "wazig" uitziet, vooral in de diepte. Deconvolutie past vervolgens een algoritme toe op dit wazige beeld om het dichter bij de werkelijke structuur te brengen, terwijl een confocale microscoop probeert om alleen het scherpe licht uit het focusvlak op te vangen [12](#page=12). #### 6.2 4D Live Cell Imaging 4D Live Cell Imaging is een geavanceerde techniek die de mogelijkheden van deconvolutie combineert met andere microscopische technieken om dynamische processen in levende cellen over tijd en in drie dimensies vast te leggen [13](#page=13). ##### 6.2.1 Componenten van 4D Live Cell Imaging * **3D multi-kleur imaging:** Dit omvat het simultaan registreren van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies op meerdere posities. Dit maakt het mogelijk om de ruimtelijke distributie van meerdere moleculen tegelijk te bestuderen [13](#page=13). * **Time-lapse recording:** Hierbij worden processen gedurende een bepaalde periode vastgelegd, waarbij op regelmatige tijdstippen 3D beelden worden genomen. Deze beelden worden vervolgens samengevoegd tot een versnelde film, waardoor snelle biologische processen zichtbaar worden. Een opnametijd van 2 uur met opnames elke 60 seconden kan worden afgespeeld met 30 frames per seconde, wat resulteert in een sterk versnelde weergave [13](#page=13). ##### 6.2.2 Opstelling voor 4D Live Cell Imaging Een typische opstelling voor 4D Live Cell Imaging vereist gespecialiseerde apparatuur [13](#page=13): * **Incubatiekamer:** Essentieel voor het handhaven van een constante temperatuur en gasmengsel (bv. CO2) om de levensvatbaarheid van de cellen gedurende lange opnamesessies te waarborgen [13](#page=13). * **Geïnverteerde fluorescentiemicroscoop:** Gebruikt omdat de objectieven zich onder het monster bevinden, wat de plaatsing van incubatie- en vloeistofsystemen vergemakkelijkt. Een gemotoriseerde voorwerptafel en hoogwaardige objectieflenzen zijn cruciaal [13](#page=13). * **Digitale camera:** Een gevoelige digitale camera is vereist om zwakke fluorescentiesignalen efficiënt op te vangen en snelle acquisitie voor time-lapse mogelijk te maken [13](#page=13). * **Trillingsvrije tafel:** Om bewegingsartefacten te minimaliseren [13](#page=13). * **Joystick voor Z-focus en XY-positionering:** Biedt flexibiliteit en precisie bij het instellen van de focus en het navigeren door het monster [13](#page=13). * **Lampvoeding en computer:** Voor het aansturen van de verlichting en het uitvoeren van complexe data-acquisitie en -verwerking [13](#page=13). > **Voorbeeld:** Muisfibroblasten kunnen worden opgenomen gedurende 8 uur met een time-lapse van elke 30 seconden, afgespeeld met 10 frames per seconde, om de dynamische processen van celbeweging en interactie te observeren [14](#page=14). ### 7 Voorbereiding van biologisch materiaal voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Het voorbereiden van biologisch materiaal voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) omvat een reeks stappen om structuren zichtbaar te maken die anders te klein of met te weinig contrast zouden zijn [14](#page=14). #### 7.1 Algemene beginselen van TEM-beeldvorming Bij TEM worden versnelde elektronen gebruikt. De golflengte van deze elektronen valt buiten het bereik van het menselijk oog, waardoor een fluorescentiescherm of fotografische plaat nodig is voor beeldvorming. Beeldvorming ontstaat door elektronenstrooiing op de atomen van het doorstraalde weefsel. Dichte structuren absorberen elektronen, terwijl minder dichte structuren elektronen doorlaten. Biologisch materiaal vertoont van nature weinig densiteitsverschillen, wat contrastverhoging noodzakelijk maakt [14](#page=14). #### 7.2 Voorbewerkingstappen van biologisch materiaal Om biologisch materiaal geschikt te maken voor TEM, zijn diverse bewerkingstappen vereist [14](#page=14). ##### 7.2.1 Fixatie De eerste stap is fixatie, waarbij brokjes ruw materiaal (zoals weefsel of losse cellen) worden behandeld met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde. Het doel is om fijne structuren zo intact mogelijk te behouden en de cellen doorlaatbaar te maken voor componenten in latere stappen [14](#page=14). ##### 7.2.2 Spoeling en contrastering ('kleuring') Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen. Voorbeelden hiervan zijn osmiumtetroxide, uranylacetaat of kaliumpermanganaat. Deze zware metalen binden zich specifiek aan bepaalde celregio's, zoals vetrijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern en eiwitrijke structuren zoals cytoskelet-elementen. Deze metaalverbindingen weerkaatsen elektronen, waardoor de hiermee gemerkte structuren in de elektronenmicroscoop als donkere plekken verschijnen. Dit proces wordt 'kleuren' genoemd, hoewel het in de elektronenmicroscopie geen ware kleuren betreft. Het verhogen van densiteitsverschillen door middel van zware metalen leidt tot een toename van elektronenstrooiing en daarmee tot een toename van het contrast. Osmiumtetroxide (OsO4) kan reeds bij de fixatie worden toegevoegd en draagt bij aan het contrast van membranen. Veelgebruikte contrasteringsvloeistoffen bestaan uit uranylacetaat en loodcitraat [15](#page=15). > **Tip:** Het gebruik van zware metalen is cruciaal voor zichtbaarheid, omdat deze elektronen absorberen of verstrooien, wat leidt tot een donkerder beeld op de detector [15](#page=15). ##### 7.2.3 Dehydratatie Om ultradunne coupes (60-90 nm dik) te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, moet het materiaal worden ingebed in kunsthars. Aangezien de meeste harsen hydrofoob zijn, is het noodzakelijk om al het water uit het monster te verwijderen. Dit gebeurt door middel van wasstappen met ethanol of aceton van oplopende concentraties [15](#page=15). ##### 7.2.4 Inbedding in hars en polymerisatie Na dehydratatie wordt het materiaal geleidelijk geïnfiltreerd met de nog niet-gepolymeriseerde hars. Het hars-doordrongen materiaal wordt in een houdertje geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule. Vervolgens vindt polymerisatie plaats, wat kan gebeuren door verhitting in een oven, met een magnetron, of door katalysatie met ultraviolet licht. Dit resulteert in harde, goed snijbare blokjes materiaal [15](#page=15). ##### 7.2.5 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden Om coupes met een dikte van ongeveer 70 nm te produceren, zijn speciale snijinstrumenten vereist, zoals messen van gekliefd puur glas of diamanten messen. Het snijden gebeurt met behulp van een ultramicrotoom [15](#page=15). ##### 7.2.6 Opvangen van coupes op een gridje Achter het snijvlak van de ultramicrotoom bevindt zich water dat zorgt voor smering van het snijvlak en het opvangen van de uiterst fragiele coupes. De coupes worden van het wateroppervlak "opgelepeld" op een zogenaamd gridje. Een gridje is een klein metaalschijfje (minder dan 5 mm) met een roosterpatroon [15](#page=15). > **Voorbeeld:** Een typische stap in het contrasteringsproces is het onderdompelen van de ultradunne secties op het gridje in oplossingen van uranylacetaat gevolgd door loodcitraat. Dit bindt zich aan specifieke moleculen in de cel en zorgt voor voldoende contrast voor TEM-analyse [16](#page=16). ### 8 Cryo-elektronen-tomografie voor 3D reconstructie Cryo-elektronen-tomografie (cryo-ET) is een techniek die wordt gebruikt om driedimensionale structuren van biologische objecten te reconstrueren door middel van een reeks tweedimensionale projecties die onder verschillende hoeken worden verkregen [16](#page=16). #### 8.1 Principe van cryo-elektronen-tomografie De kern van cryo-ET is gebaseerd op het principe van tomografie, waarbij een object wordt gescand vanuit verschillende hoeken om een driedimensionale weergave te reconstrueren [16](#page=16). ##### 8.1.1 Verkrijgen van 2D projecties Bij cryo-ET wordt een object, meestal ingevroren in een dunne laag ijs om de natuurlijke staat te behouden, belicht met een elektronenbundel in een elektronenmicroscoop. Het monster wordt vervolgens geleidelijk gekanteld rond een as, en voor elke kantelhoek wordt een 2D projectie (een beeld) van het object opgenomen [16](#page=16). ##### 8.1.2 3D Reconstructie De reeks van 2D projecties, genomen onder verschillende hoeken, vormt de basis voor de 3D reconstructie. Dit gebeurt door middel van computeralgoritmen die de projecties analyseren en terug projecteren naar een virtueel 3D beeld. Een groter aantal projecties met kleinere hoekverschuivingen resulteert in een nauwkeurigere reconstructie en vermindert artefacten die bekend staan als de 'missing-wedge' [16](#page=16). > **Tip:** Hoe meer projecties er worden verkregen met kleine hoekverschuivingen, hoe gedetailleerder en nauwkeuriger de uiteindelijke 3D reconstructie zal zijn [16](#page=16). ##### 8.1.3 Toepassingen van cryo-ET Cryo-ET is bijzonder nuttig voor het bestuderen van de architectuur van grote moleculaire complexen, zoals het nucleaire pore complex (NPC). Door verschillende exemplaren van hetzelfde complex te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt [16](#page=16). > **Voorbeeld:** Een voorbeeld van de toepassing van cryo-ET is de 3D reconstructie van een nucleair pore complex, wat essentieel is voor het transport van moleculen tussen de kern en het cytoplasma [17](#page=17). #### 8.2 Vergelijking met andere speciale EM-technieken Cryo-ET is één van de speciale elektronenmicroscopietechnieken die gebruikt worden voor gedetailleerd celonderzoek. Andere technieken die in de documentatie worden genoemd zijn [17](#page=17): * **Vries-breek (freeze-fracture):** Deze techniek wordt gebruikt om membraanstructuren te bestuderen door membranen te breken tussen hun binnenste en buitenste bladen, en levert informatie over de locatie van eiwitten in het membraan [17](#page=17). * **Vries-ets (freeze-etching):** Een uitbreiding op vries-breek, waarbij een dunne laag ijs wordt verwijderd door sublimatie onder vacuüm om meer 3D structuur te genereren [17](#page=17). * **Serial block face-SEM (SBF-SEM) en Focused Ion Beam-SEM (FIB-SEM):** Bij deze technieken worden delen van het monster binnen de microscoop verwijderd met een ultramicrotoom of ionenlaser, waardoor opeenvolgende doorsneden kunnen worden bekeken [17](#page=17). De keuze voor een specifieke techniek hangt af van het type structuur dat bestudeerd moet worden en de gewenste resolutie en dimensionaliteit van de analyse. Cryo-ET is uniek in zijn vermogen om 3D reconstructies te leveren van relatief intacte, bevroren biologische objecten [17](#page=17). ### 9 De klassieke lichtmicroscoop De klassieke lichtmicroscoop, ook wel bekend als de helderveld- of klaarveldmicroscoop, maakt gebruik van doorvallend wit licht om preparaten te visualiseren, waarbij de resolutie voornamelijk wordt bepaald door het objectief en de golflengte van het licht [17](#page=17). #### 9.1 Algemene principes De resolutie van een lichtmicroscoop, de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven, is fundamenteel beperkt tot ongeveer 200 nanometer. Dit wordt beïnvloed door het objectief en de golflengte van het zichtbare licht, niet door het oculair. Celculturen kunnen vaak direct worden bekeken, terwijl dikker materiaal zoals weefsels en orgaanculturen eerst gefixeerd, ingebed (bijvoorbeeld in paraffine) en versneden moeten worden tot secties, of geanalyseerd met cryosecties van bevroren materiaal. Levende cellen vertonen doorgaans te weinig contrast voor standaard helderveldmicroscopie en vereisen speciale technieken. De effectieve resolutie wordt ook beïnvloed door de aard van het preparaat, zoals of het gefixeerd en gekleurd is voor detectie op basis van lichtabsorptie, of levend en daardoor met een lager contrast [17](#page=17). --- ## 6. Methoden voor het prepareren en observeren van cellen en weefsels Dit onderwerp behandelt de fundamentele technieken en principes die nodig zijn om cellen en weefsels zodanig te prepareren en observeren dat hun structurele details zichtbaar worden onder een microscoop. ### 6.1 Principes van weefselpreparatie voor microscopie Het voorbereiden van biologisch materiaal voor microscopisch onderzoek is essentieel omdat het van nature weinig contrast biedt en te dik is om licht of elektronen door te laten. Histologische technieken hebben als doel weefsels dunner te maken en het contrast te verhogen, zodat structuurdetails zichtbaar worden onder zowel lichtmicroscopie (LM) als elektronenmicroscopie (EM) [19](#page=19). #### 6.1.1 Fixatie Fixatie is de eerste cruciale stap om de oorspronkelijke structuur van weefsels te behouden. Dit proces stopt afbraakprocessen die na het verwijderen van weefsel uit het lichaam actief worden door endogene enzymen. Chemische fixatieven denatureren eiwitten, bijvoorbeeld door ze te cross-linken (zoals formaldehyde en glutaraldehyde) of te precipiteren (zoals alcohol en aceton). Voor LM wordt vaak formol gebruikt, terwijl glutaraldehyde en osmiumtetroxide (O$_4$) gangbaar zijn voor EM. Een alternatieve methode is invriezen (koude fixatie), wat snel werkt en epitopen goed bewaart voor immuunkleuringen, en vaak wordt toegepast voor snelle diagnoses in pathologielaboratoria [19](#page=19) [34](#page=34). **Artefacten door fixatie:** Artefacten zijn veranderingen die optreden tijdens de preparatie en afwijken van de in-vivo situatie, zoals holtes rond kraakbeencellen of de misplaatsing van componenten zoals glycogeen. Chemische fixatieven geven over het algemeen een betere morfologie dan invriezen [20](#page=20) [23](#page=23) [25](#page=25) [34](#page=34). #### 6.1.2 Inbedden Inbedden is het proces waarbij gefixeerd materiaal wordt doordrongen en omwikkeld met een substantie (inbedmiddel) die het weefsel hard maakt en zo snijdbaar maakt in dunne plakken. Omdat biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%) en de meeste inbedmiddelen hydrofoob zijn, is ontwatering noodzakelijk. Dit gebeurt via een stijgende reeks alcoholbaden (30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Na ontwatering wordt tolueen gebruikt voor de 'clearing'-stap, omdat tolueen mengbaar is met zowel alcohol als het hydrofobe inbedmiddel [20](#page=20) [23](#page=23) [24](#page=24). **Inbedmiddelen:** Gangbare inbedmiddelen zijn paraffine, hars en plastics. Hydrofobe harsen met hydrofiele groepen of puur hydrofiele inbedmiddelen zijn minder stabiel en resulteren in mindere morfologie [20](#page=20) [24](#page=24). #### 6.1.3 Snijden (Coupering) Het harde inbedmateriaal maakt het mogelijk om het weefsel in dunne plakken (coupes) te snijden, wat essentieel is voor het waarnemen van subcellulaire details [19](#page=19) [23](#page=23). **Snijdikte en toepassingen:** * **Paraffine coupes:** Ongeveer 5-10 micrometer dik, geschikt voor LM vanwege lichtdoorlatendheid [20](#page=20) [24](#page=24). * **Hars en plastic coupes:** Tot 60-70 nanometer dik, geschikt voor EM omdat ze doorlaatbaar zijn voor elektronen [20](#page=20) [24](#page=24). **Gereedschap en plaatsing:** Het snijden gebeurt met een microtoom. Microtomen voor LM gebruiken stalen messen, terwijl die voor EM glazen of diamanten messen gebruiken. Coupes voor LM worden op glazen draagglasjes geplaatst, en voor EM op metalen (koper, nikkel) roostertjes genaamd grids [21](#page=21) [24](#page=24). > **Tip:** De dikte van de coupes is direct gerelateerd aan de penetratie van de stralen (licht of elektronen) van de microscoop, wat essentieel is voor het waarnemen van structuren op verschillende schalen [24](#page=24). > **Voorbeeld:** Het waarnemen van subcellulaire organellen vereist ultradunne coupes (70 nm) gemaakt van hars-ingebed weefsel voor EM, terwijl de morfologie van celkernen en weefselstructuren goed zichtbaar is met dikkere coupes (5-10 µm) van paraffine-ingebed weefsel voor LM [24](#page=24). #### 6.1.4 Kleuring Hoewel de details van kleuring buiten het bestek van dit specifieke onderwerp vallen, is het een noodzakelijke stap na het snijden voor LM-analyse om structuren zichtbaar te maken en contrast te creëren. Wit licht, bestaande uit een spectrum van golflengtes, vormt de basis voor kleur. Het belangrijkste bindingsmechanisme is ionische binding, gebaseerd op elektrostatische aantrekking tussen het weefsel en de kleurstof. Voor weefselcoupes in paraffine is deparaffinisatie (met tolueen) nodig voor het kleuren [25](#page=25) [29](#page=29) [30](#page=30). ### 6.2 Histologische kleurtechnieken Histologische kleurtechnieken zijn essentieel voor het visualiseren van weefselstructuren en het diagnosticeren van pathologische afwijkingen door specifieke cellulaire en extracellulaire componenten aan te kleuren [21](#page=21). #### 6.2.1 Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) H&E is een fundamentele en wijdverbreide kleuringstechniek die al meer dan een eeuw wordt gebruikt voor weefselanalyse en kankerdiagnose [21](#page=21) [29](#page=29). * **Werkingsprincipe:** * **Hematoxyline:** Hecht aan nucleïnezuren (DNA, RNA) door een complexe reactie, resulterend in een diep blauw-paarse kleur. Het laat gedetailleerde intranucleaire structuren zien. Technisch gezien is het geen kleurstof op zichzelf en vereist het een beitsmiddel (bv. aluminiumzouten) om te hechten; in dit complex is het kationisch (positief geladen) en werkt het als een basische kleurstof [21](#page=21) [30](#page=30). * **Eosine:** Kleurt eiwitten roze aan door reactie met positief geladen componenten, zoals amino-groepen in cytoplasmatische eiwitten. Het is anionisch (negatief geladen) en werkt als een zure kleurstof. Nucleoli worden met eosine gekleurd, en overvloedig polyribosomen kunnen het cytoplasma een blauwe gloed geven. De Golgi-zone kan zichtbaar worden door een gebrek aan kleuring naast de kern [21](#page=21) [30](#page=30). * **Voordelen en beperkingen:** * **Voordelen:** Werkt goed met diverse fixatieven, visualiseert een breed scala aan cytoplasmatische, nucleaire en extracellulaire matrixkenmerken, en onthult structurele informatie met functionele implicaties [22](#page=22) [30](#page=30). * **Beperkingen:** Onverenigbaar met immunofluorescentie. Hematoxyline kan echter als tegenkleuring gebruikt worden in immunohistochemische of hybridisatieprocedures met colorimetrische substraten [22](#page=22) [30](#page=30). > **Voorbeeld:** Bij de analyse van een weefselcoupe met H&E kleuring, zullen de kernen blauw zijn en het cytoplasma roze. Als de kernen echter onregelmatige, sterk gecondenseerde chromatinepatronen vertonen, kan dit duiden op maligniteit [23](#page=23). #### 6.2.2 Specifieke kleurtechnieken Naast H&E zijn er diverse specifieke kleurtechnieken voor het visualiseren van verschillende weefselcomponenten of functies [22](#page=22). * **Indifferenten kleurstoffen:** Kleuren specifiek vetten aan. Een voorbeeld is Oil Red O, dat vetcellen aankleurt [22](#page=22). > **Voorbeeld:** Wanneer een Oil Red O kleuring wordt toegepast, zullen vetvacuolen in de cellen rood oplichten [23](#page=23). * **Immunohistochemische kleuring:** Maakt gebruik van antilichaam-antigeenbinding om specifieke bestanddelen aan te kleuren. Het antilichaam is gelabeld met een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud. DAB (diaminobenzidine) is een voorbeeld van een kleurstof die specifieke structuren zoals microtubuli of connexine 43 kan aantonen als een bruine neerslag [22](#page=22) [23](#page=23). * **Enzymkleuringen:** Demonstreren de activiteit van specifieke enzymen door middel van een substraat dat door het enzym wordt omgezet in een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de kleuring voor glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten met behulp van de tetrazoniumzoutmethode [22](#page=22). * **Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring:** Kleurt vrije suikers aan. In een darmvillus kleurt het intervilleus slijm en de microvilli (borstelzoom) aan [30](#page=30). > **Voorbeeld:** Bij de analyse van een darmvillus met PAS en hematoxyline, wordt het slijm en de microvilli paars-blauw gekleurd door PAS, terwijl de kernen van de epitheelcellen donkerblauw kleuren door hematoxyline [30](#page=30). > **Tip:** Het begrijpen van de basisprincipes van elke kleuringstechniek, inclusief het doelwit, het reactiemechanisme en de verwachte resultaten, is cruciaal voor accurate weefselinterpretatie [23](#page=23). ### 6.3 Elektronenmicroscopie (EM) technieken Elektronenmicroscopie (EM) maakt het mogelijk structuren te visualiseren met een veel hogere resolutie dan lichtmicroscopie door gebruik te maken van elektronen in plaats van fotonen, waardoor de studie van structuren op nanometer- en zelfs atomair niveau mogelijk wordt [25](#page=25). #### 6.3.1 Algemene principes van elektronenmicroscopie In tegenstelling tot lichtmicroscopie die glaslenzen gebruikt, maakt EM gebruik van elektromagnetische magneten als lenzen om de elektronenbundel te sturen. Een hoog vacuüm is noodzakelijk om te voorkomen dat elektronen worden gestopt door gasmoleculen, en er wordt gewerkt met hoge spanningen om de elektronen voldoende snelheid te geven [25](#page=25). * **Principe van beeldvorming:** Elektronen bombarderen het monster, en de interactie ervan wordt gebruikt voor beeldvorming. Er is een elektronenkanon als bron en elektromagnetische lenzen voor het sturen en scherpstellen van de bundel [25](#page=25). * **Vergroting en resolutie:** Met EM kunnen structuren tot 1 nanometer zichtbaar worden gemaakt. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) kan vergrotingen tot wel 600.000 bereiken met een scheidend vermogen van 3 nanometer, hoewel theoretisch kleinere waarden mogelijk zijn [25](#page=25). #### 6.3.2 Typen elektronenmicroscopie Er worden twee hoofdtypen onderscheiden: Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM) en Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) [26](#page=26). * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** * **Gebruik:** Bestudeert de binnenkant van objecten zoals weefsels, cellen en virussen [26](#page=26). * **Principe:** Het beeld wordt gevormd door de verstrooiing van elektronen door zware atomen in ultradunne preparaten [26](#page=26). * **Resolutie:** Ongeveer 1 nanometer [26](#page=26). * **Preparatie:** Biologisch materiaal heeft van zichzelf weinig contrast, dus speciale fixatie- en kleuringstechnieken zijn nodig [26](#page=26). * **Fixatie:** Meestal met glutaaraldehyde en osmiumtetroxide [26](#page=26). * **Kleuring:** Om contrast te creëren, wordt het materiaal blootgesteld aan verbindingen van zware metalen (bv. osmium, uranylacetaat, lood) die elektronen weerkaatsen en zich binden aan specifieke structuren [26](#page=26). * **Ultradunne secties:** 50-100 nanometer dik, wat expertise vereist voor driedimensionale interpretatie [26](#page=26). * **Specifieke technieken voor TEM:** * **Negatieve kleuring:** Virusdeeltjes worden omgeven door zwaar metaal; het specimen neemt de kleur niet op en is wit tegen een zwarte achtergrond [26](#page=26). * **Shadowing (schaduwbestuiving):** Schuine bestuiving met zwaar metaal (bv. platina, goud) creëert een reliëf voor driedimensionaal zicht [26](#page=26). * **Rotary shadowing:** Een vorm van shadowing waarbij het specimen onder lage hoek op een roterende drager wordt bestoven met metaal, vaak gebruikt voor nucleïnezuren [26](#page=26). * **Scanning-elektronenmicroscopie (SEM):** * **Gebruik:** Brengt het oppervlak van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen in beeld [26](#page=26). * **Principe:** Een elektronenbundel scant het preparaat lijn per lijn, waarbij secundaire elektronen van het oppervlak worden gedetecteerd, versterkt en computer-matig verwerkt tot een driedimensionaal beeld [27](#page=27). * **Preparatie:** Het preparaat mag groter en dikker zijn dan bij TEM, maar moet gecoat worden met een zwaar metaal [27](#page=27). * **Beeld:** Levert een driedimensionaal beeld op [27](#page=27). #### 6.3.3 Voordelen van elektronenmicroscopie Het belangrijkste voordeel is de veel kleinere golflengte van elektronen vergeleken met zichtbaar licht, waardoor objecten kleiner dan de golflengte van licht, tot op atomaire schaal, waargenomen kunnen worden [27](#page=27). #### 6.3.4 Technische complicaties en vereisten * Absoluut vacuüm is noodzakelijk [27](#page=27). * Hoogspanning is vereist voor het versnellen van elektronen [27](#page=27). * Elektromagnetische lenzen zijn nodig om de elektronenstraal te manipuleren [27](#page=27). * Aangepaste preparatietechnieken (fixatie en kleuring) zijn vereist [27](#page=27). ### 6.4 Lichtmicroscopische technieken en kleuringsmethoden Lichtmicroscopie is een fundamentele techniek voor het visualiseren van cel- en weefselstructuren, waarbij verschillende optische principes en kleurstofmethoden worden toegepast om contrast en detail te genereren [27](#page=27) [28](#page=28). #### 6.4.1 Typen lichtmicroscopen * **Algemene lichtmicroscopen:** * **Histologie-microscoop:** Standaard voor vaste weefselcoupes [27](#page=27). * **Discussie-microscoop:** Vaak uitgerust met digitale camera's voor beeldopname en -deling [27](#page=27). * **Geïnverteerde lichtmicroscoop:** Ideaal voor levende celculturen, met objectieven onder het preparaat [27](#page=27). * **Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen:** Ontworpen om specimens met weinig inherent contrast zichtbaar te maken zonder kleuring [28](#page=28). * **Fasecontrastmicroscopie:** Zet kleine faseveranderingen, veroorzaakt door verschillen in brekingsindex, om in amplitudeveranderingen (licht/donker). Geschikt voor ongekleurde, levende preparaten zoals celculturen of vriescoupes [28](#page=28). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski):** Benut de interferentie van doorvallend gepolariseerd licht om verschillen in optische dichtheid en brekingsindex te visualiseren. Vereist gespecialiseerde prisma's en interferentiefilters [28](#page=28). * **Digitale microscopie:** Gebruikt computerverwerking van beelden met ultragevoelige videocamera's, maakt real-time en time-lapse opnamen mogelijk [28](#page=28). > **Tip:** Ongekleurde preparaten hebben vaak weinig contrast in een standaard klaarveldmicroscoop. Fasecontrast- en DIC-microscopie bieden hier uitkomst door subtiele optische verschillen om te zetten in zichtbare contrastverschillen [28](#page=28). #### 6.4.2 Principes van contrastverhoging in lichtmicroscopie Contrast kan op twee manieren worden verhoogd: 1. **Histologische kleuring:** Kleurstoffen absorberen specifieke golflengtes, wat leidt tot kleurvorming en contrastverhoging [28](#page=28). 2. **Benutten van optische dichtheidsverschillen:** Kleine verschillen in optische dichtheid in ongekleurde preparaten veroorzaken faseverschuivingen in licht, die door interferentie worden omgezet in een zwart-wit beeld in fasecontrast- of DIC-microscopen [28](#page=28). * **Optische paden:** Het pad dat licht aflegt, verschilt tussen technieken zoals de klaarveld-microscoop en de fasecontrast-microscoop [29](#page=29). #### 6.4.3 Kleuringsmethoden (Herhaling van 6.2.1 en 6.2.2) Kleuren is essentieel om transparante structuren zichtbaar te maken en onderscheid te maken tussen celcomponenten. H&E is een routinekleuring bij uitstek voor histologisch onderzoek [29](#page=29). > **Voorbeeld:** Een doorsnede van de dunne darm (small intestine) van een muis gekleurd met H&E toont de villi, lamina propria, submucosa en crypten, met duidelijke differentiatie tussen celkernen (blauw) en cytoplasma (roze). Slijmbekercellen zijn herkenbaar door hun roze uiterlijk [31](#page=31). ### 6.5 Principes en toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie gebruikt fluorescerende moleculen (fluorochromen) om specifieke structuren of moleculen in biologische monsters zichtbaar te maken [31](#page=31). #### 6.5.1 Algemene principes van fluorescentiemicroscopie * **Werkingsmechanisme:** Fluorochromen absorberen licht met een bepaalde golflengte (excitatie) en zenden licht uit met een langere golflengte (emissie). Het excitatie- en emissiespectrum van een fluorofoor illustreert dit principe [31](#page=31). * **Componenten van een epi-fluorescentiemicroscoop:** 1. **Excitatiebron:** Kwikdamplamp, xenonlamp of lasers [31](#page=31). 2. **Golflengtefilters in een filterkubus:** Excitatiefilter, dichroïsche spiegel (beamsplitter), emissiefilter of stopfilter [31](#page=31). 3. **Detector:** Ogen of een camera [31](#page=31). * **Confocale laser scanning microscopie (CLSM):** Gebruikt een laser als exciterende lichtbron en maakt optische secties mogelijk, wat leidt tot beelden met hogere resolutie en minder achtergrondruis [32](#page=32). > **Tip:** Het nauwkeurig afstemmen van de excitatiefilters, dichroïsche spiegels en emissiefilters is cruciaal voor optimale fluorescentiesignalen en minimale achtergrond [32](#page=32). #### 6.5.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Breed ingezet voor het visualiseren, lokaliseren en kwantificeren van moleculen in (levende) cellen en weefsels [32](#page=32). * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Veranderen fluorescentie afhankelijk van ionenconcentratie (bv. Fura-2 voor intracellulaire calciumionen) [32](#page=32). > **Voorbeeld:** Het observeren van de Ca2+-gradient in een bewegende cel met Fura-2 kan inzicht geven in de mechanismen van celmigratie [32](#page=32). * **Immunofluorescentie microscopie:** Detecteert specifieke eiwitten met fluorescerend gelabelde antilichamen om hun locatie en distributie te visualiseren [32](#page=32). * **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Genetisch gemodificeerde eiwitten fuseren met fluorescente eiwitten (bv. BFP, YFP) om specifieke eiwitten in levende cellen te volgen en hun dynamiek te bestuderen [32](#page=32). * **Visualisatie van organellen:** Specifieke organellen (lysosomen, mitochondria) kunnen worden gemarkeerd en gevisualiseerd [33](#page=33). * **Aankleuring van meerdere eiwitten:** Maakt gelijktijdige aankleuring en visualisatie van twee of meer eiwitten mogelijk om interacties of co-lokalisatie te bestuderen [33](#page=33). * **Combinatie met andere microscopietechnieken:** Combinatie met technieken zoals DIC/Nomarski integreert morfologische informatie met fluorescentiedata (overlay-beelden) [33](#page=33). > **Tip:** Bij het analyseren van beelden met meerdere fluorochromen, is het essentieel de specifieke emissieprofielen te kennen om kruisinterferentie te minimaliseren [33](#page=33). * **Registratie in microscopen:** Klassieke epi-fluorescentiemicroscopen kunnen digitale registratieapparatuur hebben voor verbeterde gevoeligheid en kwantitatieve analyse zonder oculair observatie [33](#page=33). ### 6.6 Interpretatieproblematiek van TEM-beelden en driedimensionale reconstructie De interpretatie van TEM-beelden en driedimensionale reconstructie omvat de uitdagingen en technieken voor het visualiseren en reconstrueren van driedimensionale structuren uit tweedimensionale microscopische beelden [33](#page=33). #### 6.6.1 Belang van histologische technieken Histologische technieken zijn essentieel om weefsels dun genoeg te snijden voor de doorgang van licht of elektronen en om contrast te creëren voor het waarnemen van structuurdetails. Methodes omvatten fixeren, inbedden en snijden, en kleuren of contrasteren [33](#page=33). > **Tip:** Het prepareren van weefsel kan artefacten introduceren die de interpretatie van beelden kunnen beïnvloeden [33](#page=33). #### 6.6.2 Fixeren, inbedden en snijden Deze stappen zijn cruciaal voor het bewaren van de oorspronkelijke structuur en het verkrijgen van snijbare materialen. Fixatie stopt afbraakprocessen inbedden met middelen zoals paraffine of harsen maakt dun snijden mogelijk na ontwatering en clearing en het snijden gebeurt met een microtoom. Paraffine leidt tot LM-coupes (5-10 µm), terwijl harsen en plastics worden gebruikt voor EM-coupes (tot 70 nm) [33](#page=33) [34](#page=34). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Kleuring | Een proces waarbij kleurstoffen worden gebruikt om structuren in weefselcoupes zichtbaar te maken en onderscheid te kunnen maken tussen verschillende celcomponenten, wat essentieel is voor microscopische observatie. | | Artefact | Een afwijking die optreedt tijdens preparatieprocedures, zoals fixatie, en die niet overeenkomt met de werkelijke in-vivo situatie van het specimen. | | Elektronenmicroscopie (EM) | Een techniek die elektronen gebruikt in plaats van fotonen om structuren te visualiseren met een veel hogere resolutie dan lichtmicroscopie, waardoor studies op nanometer- en atomair niveau mogelijk worden. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een type elektronenmicroscopie dat voornamelijk wordt gebruikt om de binnenkant van objecten, zoals weefsels en cellen, te bestuderen door de verstrooiing van elektronen door ultradunne preparaten. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie dat wordt gebruikt om het oppervlak van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen in beeld te brengen door een elektronenbundel over het preparaat te scannen. | | Fasecontrastmicroscopie | Een lichtmicroscopische techniek die faseverschuivingen in licht, veroorzaakt door verschillen in brekingsindex, omzet in amplitudeveranderingen (licht/donker) om ongekleurde, levende preparaten zichtbaar te maken. | | Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie (Nomarski) | Een lichtmicroscopische techniek die interferentie van doorvallend gepolariseerd licht benut om verschillen in optische dichtheid en brekingsindex te visualiseren, met behulp van gespecialiseerde prisma's. | | Histologische kleuring | Een methode waarbij kleurstoffen worden gebruikt om weefselstructuren te accentueren door specifieke golflengtes van licht te absorberen, wat leidt tot kleurvorming en verhoogd contrast. | | Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring | Een veelgebruikte histologische kleuring waarbij hematoxyline (basisch, kleurt kernen blauw/paars) en eosine (zuur, kleurt cytoplasma roze) worden gebruikt om morfologische details in weefselcoupes zichtbaar te maken. | | Basofiele celbestanddelen | Celcomponenten die een negatieve lading hebben en daardoor positief geladen kleurstoffen, zoals hematoxyline, aantrekken en opnemen, resulterend in een blauwe of paarse kleur. | | Acidofiele componenten | Celcomponenten die een positieve lading hebben en daardoor negatief geladen kleurstoffen, zoals eosine, aantrekken en opnemen, resulterend in een roze kleur. | | Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring | Een kleuringstechniek die specifiek vrije suikers en koolhydraten aankleurt, vaak gebruikt om slijm en microvilli zichtbaar te maken. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopische techniek die gebruikmaakt van fluorescerende moleculen, ook wel fluorochromen genoemd, om specifieke structuren of moleculen in biologische monsters zichtbaar te maken door middel van excitatie- en emissielicht. | | Fluorochroom | Een fluorescerende kleurstof die licht van een bepaalde golflengte absorbeert en vervolgens licht met een langere golflengte uitzendt, waardoor het zichtbaar wordt onder een fluorescentiemicroscoop. | | Excitatie | Het proces waarbij een fluorofoor fotonen absorbeert met een specifieke golflengte, wat leidt tot de overgang van het molecuul naar een hogere energietoestand. | | Emissie | Het proces waarbij een geëxciteerd fluorofoor fotonen uitzendt met een langere golflengte dan de geabsorbeerde excitatiefotonen, waardoor het fluorescerende licht wordt geproduceerd. | | Excitatiefilter | Een optisch component in een fluorescentiemicroscoop dat specifiek de golflengte van het licht selecteert dat nodig is om een fluorofoor te exciteren. | | Barrièrefilter (Emissiefilter) | Een optisch component dat het invallende excitatielicht blokkeert en alleen het langere golflengte emissielicht doorlaat naar de detector, waardoor het fluorescerende signaal zichtbaar wordt. | | Epifluorescentiemicroscoop | Een type fluorescentiemicroscoop waarbij de excitatiebron en de detector zich aan dezelfde kant van het preparaat bevinden, en waarbij een dichroïsche spiegel wordt gebruikt om het excitatielicht naar het monster te leiden en het emissielicht te reflecteren. | | Dichroïsche spiegel (Beamsplitter) | Een speciale spiegel die het excitatielicht reflecteert naar het monster en tegelijkertijd het emissielicht doorlaat naar de detector, essentieel voor de werking van een epifluorescentiemicroscoop. | | Confocale laser scanning microscopie (CLSM) | Een geavanceerde fluorescentietechniek die een laser als exciterende lichtbron gebruikt en het mogelijk maakt om optische secties van een monster te verkrijgen, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en minder achtergrondruis. | | Ion-gevoelige kleurstoffen | Fluorescerende moleculen waarvan de fluorescentie-eigenschappen veranderen in reactie op de concentratie van specifieke ionen, zoals calciumionen ($Ca^{2+}$), in een cel. | | Immunofluorescentie microscopie | Een techniek die antilichamen gebruikt die zijn gekoppeld aan fluorochromen om de locatie en distributie van specifieke eiwitten in cellen of weefsels te visualiseren. | | Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten | Een methode waarbij eiwitten genetisch worden gemodificeerd om te fuseren met fluorescerende eiwitten, zoals BFP of YFP, waardoor hun dynamiek in levende cellen kan worden gevolgd. | | Mycoplasma | Parasitaire micro-organismen die deels intracellulair kunnen leven, het cellulaire metabolisme verstoren en moeilijk detecteerbaar en elimineerbaar zijn, wat diverse effecten kan hebben op eukaryote cellen. | | Karyotypering | Een techniek om het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen te bepalen, gebruikt voor het meten van genetische zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen. | | Epifluorescentiemicroscopie | Een klassieke fluorescentiemicroscoopopstelling waarbij het monster via de objectieflens wordt belicht en de fluorescentie wordt geregistreerd door een digitale detector, wat de combinatie van verschillende technieken mogelijk maakt. | | Pinhole | Een cruciaal onderdeel in een confocale microscoop dat emissielicht blokkeert dat niet afkomstig is uit het gewenste focale vlak, wat resulteert in een verbeterde resolutie en contrast. | | Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie | Een softwarematige bewerkingstechniek die conventionele digitale beelden verwerkt om de beeldvormingsfusie die optreedt in een microscoop te corrigeren, waardoor een hogere resolutie en scherpte worden verkregen. | | Point spread function (PSF) | De uitgesmeerde vlek die ontstaat wanneer een punt in het object niet als een scherp punt in het beeld verschijnt door lichtverstrooiing, en die door deconvolutie-algoritmes wordt gekwantificeerd om het oorspronkelijke beeld te reconstrueren. | | 4D Live Cell Imaging | Een geavanceerde techniek die deconvolutie combineert met andere microscopische methoden om dynamische processen in levende cellen vast te leggen in drie dimensies en over tijd. | | Fixatie | De eerste stap in de voorbereiding van biologisch materiaal voor TEM, waarbij chemische stoffen zoals glutaaraldehyde worden gebruikt om fijne structuren intact te houden en cellen doorlaatbaar te maken voor latere stappen. | | Contrastering ('kleuring') | Een stap in de TEM-voorbereiding waarbij het materiaal wordt behandeld met verbindingen van zware metalen (zoals osmiumtetroxide, uranylacetaat) die zich binden aan specifieke celregio's en elektronen weerkaatsen, waardoor deze structuren donkerder verschijnen in het beeld. | | Term | Definitie | | Coupevorming | Het proces van het snijden van gefixeerd en ingebed weefsel in dunne secties, ook wel coupes genoemd, die essentieel zijn voor het waarnemen van subcellulaire details onder de microscoop. | | Inbedden | Het omwikkelen en doordringen van gefixeerd weefsel met een substantie, zoals paraffine of hars, die het materiaal hard maakt en het mogelijk maakt om het in dunne plakken te snijden voor microscopisch onderzoek. | | Microtoom | Een instrument dat wordt gebruikt om ingebed, hard materiaal, zoals weefsel, in zeer dunne plakken (coupes) te snijden, essentieel voor zowel licht- als elektronenmicroscopie. | | Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) | Een fundamentele en wijdverbreide kleuringstechniek die hematoxyline gebruikt om nucleïnezuren diep blauw-paars aan te kleuren en eosine om eiwitten roze aan te kleuren, waardoor cellulaire en extracellulaire structuren zichtbaar worden voor weefselanalyse. | | Immunohistochemische kleuring | Een techniek die gebruikmaakt van antilichaam-antigeenbinding om specifieke bestanddelen in weefsels aan te kleuren, waarbij het antilichaam gelabeld is met een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud om de locatie en expressie van bepaalde moleculen te visualiseren. | | Artefacten | Veranderingen die tijdens de preparatie van weefsels ontstaan en afwijken van de in-vivo situatie, zoals structurele veranderingen of het op een andere plaats voorkomen van componenten, die de interpretatie van microscopische beelden kunnen beïnvloeden. | | Clearing | Een stap in de weefselpreparatie waarbij tolueen wordt gebruikt om de laatste restjes alcohol te vervangen na dehydratatie, waardoor het weefsel mengbaar wordt met het hydrofobe inbedmiddel en het snijden mogelijk wordt. | | Lichtmicroscopie (LM) | Een microscopietechniek die licht gebruikt om beelden te vergroten, waarbij paraffinecoupes van ongeveer 5-10 μm dik geschikt zijn vanwege hun lichtdoorlatendheid. | | Driedimensionale reconstructie | Een techniek die een driedimensionaal beeld construeert uit een reeks van tweedimensionale beelden, verkregen door opeenvolgende coupes of verschillende focusvlakken van een microscoop. | | Seriële coupes | Het proces van het snijden van opeenvolgende dunne plakken van een weefsel of celaggregaat, waarbij elke coupe microscopisch wordt bekeken en de beelden digitaal worden uitgelijnd om een 3D-model te reconstrueren. | | Confocale microscopie | Een beeldvormingstechniek die het mogelijk maakt om beelden op verschillende focusdieptes binnen een monster te verzamelen, die vervolgens kunnen worden gestapeld om een 3D-reconstructie te maken. | | Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) | Een techniek voor 3D-reconstructie die een serie 2D-projecties genereert door het monster of de detector rond een as te kantelen, gebaseerd op Fourier-analyse van terugprojecties. | | Serial Block Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) | Een geavanceerde EM-methode waarbij het monster in de microscoop met een ultramicrotoom in ultradunne secties wordt verwijderd, terwijl tegelijkertijd het resterende 'blokfront' wordt gescand voor 3D-reconstructie. | | Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) | Een geavanceerde EM-methode die een ionenlaser gebruikt om materiaal weg te nemen en het monster te structureren, gevolgd door SEM-analyse om 3D-beelden te verkrijgen. | | Vries-breek (Freeze-fracture) | Een techniek die wordt gebruikt om cellulaire membranen te bestuderen door ze te breken, meestal tussen de binnenste en buitenste leaflet van de dubbellaag, om eiwitten en eiwitaggregaten te onthullen. | | Vries-ets (Freeze-etching) | Een techniek die na vries-breken wordt toegepast, waarbij een dunne laag ijs wordt verwijderd door sublimatie onder vacuüm om meer 3D-structuur te genereren dan alleen vries-breek. | | Primaire culturen | Cellen die direct afkomstig zijn uit weefsel (explantaten van organen of tumoren) en een beperkte levensduur hebben in een laboratoriumomgeving. | | Cellijnen | Stabiele, vaak geïmmortaliseerde cellen die een potentieel onbeperkte levensduur hebben in cultuur, verkregen uit tumoren of na selectie van verouderende culturen. | | Anoïkis | Een vorm van geprogrammeerde celdood (apoptose) die optreedt wanneer cellen hun contact met het groeistroma verliezen, wat wordt voorkomen door groeistromata. | | Contactinhibitie | Het fenomeen waarbij cellen in cultuur stoppen met delen wanneer ze een confluente tweedimensionale laag vormen, vaak als gevolg van competitie voor groeifactoren en fysiek contact. | | Trypsine-EDTA procedure | Een methode die wordt gebruikt om adherente cellen los te maken van het substraat en van elkaar, waarbij trypsine oppervlakte-eiwitten degradeert en EDTA de celadhesie beïnvloedt. | | Laminaire flowbench | Een gespecialiseerde werkbank die een steriele omgeving creëert met behulp van HEPA-filters en een constante luchtstroom, essentieel voor het voorkomen van contaminatie tijdens celcultuurwerkzaamheden. | | Celadhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat, wat begint met sedimentatie en initieel contact, gevolgd door progressieve spreiding en versterkte binding door secretie van ECM-moleculen. | | Cryo-elektronen-tomografie (cryo-ET) | Een techniek die wordt gebruikt om driedimensionale structuren van biologische objecten te reconstrueren door middel van een reeks tweedimensionale projecties verkregen onder verschillende hoeken van bevroren monsters. |