Samenvatting - Celbiologie - H1.docx

# Ontwikkeling en kwaliteit van celculturen Dit onderwerp beschrijft het proces van het creëren en onderhouden van stabiele cellijnen, inclusief de benodigde kweekmedia en omstandigheden, met een sterke focus op het waarborgen van de kwaliteit en integriteit van de celculturen. ### 1.1 Het creëren van stabiele cellijnen Voor wetenschappelijk onderzoek worden vaak stabiele cellijnen gebruikt. Dit zijn cellen die langdurig in een laboratorium gekweekt kunnen worden, consistent delen en een stabiel gedrag vertonen. Vaak zijn deze cellijnen afkomstig van tumorcellen, wat hen de eigenschap van immortaliteit (onbeperkte levensduur) verleent. Het proces van het maken van een stabiele cellijn omvat de volgende stappen: 1. **Enzymatische behandeling van weefsel:** Het oorspronkelijke weefsel wordt met enzymen behandeld om de cellen los te maken. 2. **Centrifugatie:** De losgemaakte cellen worden vervolgens gecentrifugeerd, waardoor ze naar de bodem van het buisje zakken. 3. **Uitzaaien in groeirecipiënt:** De cellen worden uitgeplaat in een geschikte kweekomgeving, zoals een petrischaal. ### 1.2 Kweekomstandigheden voor celgroei Om te kunnen groeien, hebben cellen specifieke omstandigheden nodig die zoveel mogelijk lijken op die in het lichaam. Dit wordt bereikt door middel van een celcultuur, die bestaat uit: * **Groeibodem (kweekmedium):** * **EMEM (Earle's Minimum Essential Medium):** Dit is een veelgebruikte basismix die bestaat uit: * Isotonische zouten: Zorgen voor een stabiele osmotische druk. * Een energiebron: Levert de benodigde energie voor celactiviteiten. * Aminozuren en vitamines: Essentiële bouwstenen en cofactoren voor celmetabolisme. * Serum: Vaak afkomstig van een kalf, bevat groeifactoren en andere essentiële componenten. * **Omgevingsfactoren:** * Vochtige, warme omgeving: Essentieel voor optimale celactiviteit. * Voldoende CO₂: Belangrijk voor het handhaven van de pH van het medium. #### 1.2.1 Celdeling en overbevolking Normale cellen delen zich totdat ze één laag hebben gevormd die de bodem van de petrischaal bedekt. Bij tumorcellen komt het echter vaak voor dat ze meerdere lagen gaan vormen. #### 1.2.2 Transfer (passage) van cellen Om te voorkomen dat de cellen te dicht op elkaar groeien en hun groei en gedrag beïnvloed wordt, moeten ze periodiek worden overgebracht naar een nieuwe petrischaal met vers medium. Dit proces heet passage of transfer. * **Adherente cellen:** Dit zijn cellen die zich hechten aan een oppervlak. Om ze los te maken, worden ze behandeld met enzymen om ze in suspensie te krijgen. * **Suspensieculturen:** Dit zijn cellen die vrij in het vloeibare kweekmedium zweven. ### 1.3 Kwaliteitsbewaking van celculturen Het waarborgen van de kwaliteit en integriteit van celculturen is cruciaal voor betrouwbare onderzoeksresultaten. Belangrijke aspecten hierbij zijn: * **Afwezigheid van mycoplasma:** Mycoplasma kan onopgemerkt de celgroei en het celgedrag beïnvloeden. Er moet dus getest worden op de aanwezigheid hiervan. * **Genetische stabiliteit:** De cellen in een cultuur moeten genetisch identiek zijn en deze identiteit behouden tijdens het kweken. * **Identificatie en contaminatie:** Het is essentieel om te weten met welke cellen men werkt en om contaminatie met andere celtypen te vermijden. Celculturen worden vaak ingevroren om hun samenstelling en staat te behouden voor toekomstig gebruik. ### 1.4 Stamcellen en hun relevantie Stamcellen zijn bijzondere cellen met het vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie tot diverse celtypen of weefsels. * **Soorten stamcellen:** * **Totipotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot alle celtypen van het organisme, inclusief de placenta. Dit zijn de cellen direct na de eerste celdeling. * **Pluripotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot vrijwel alle celtypen van het lichaam, maar niet tot de placenta. * **Multipotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot meerdere celtypen binnen een specifiek orgaansysteem, zoals bloedcellen. Voor onderzoek worden vaak pluripotente stamcellen gebruikt, die meestal worden verkregen uit embryo's van muizen of mensen. * **Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC):** Dit zijn volwassen cellen (bijvoorbeeld uit urine) die genetisch worden geherprogrammeerd tot pluripotente stamcellen. Dit is ethisch gezien een voordeligere optie omdat er geen embryo's voor nodig zijn. ### 1.5 Prepareren van cellen en weefsels voor observatie Om cellen en weefsels observeerbaar te maken met lichtmicroscopen (LM) of elektronenmicroscopen (EM), moeten ze geprepareerd worden, met name door het maken van dunne coupes. #### 1.5.1 Fixatie Het proces van fixatie stabiliseert de cellen en weefsels om morfologische veranderingen tijdens verdere preparatie te voorkomen. * **Invriezen:** Een snelle methode, maar levert een minder gedetailleerd beeld op. * **Paraffine-inbedding:** Weefsel wordt gehydrateerd en vervolgens ondergedompeld in gesmolten paraffine, dat uithardt en het weefsel ondersteunt. * **Plastic of hars-inbedding:** Gebruikt voor elektronenmicroscopie, omdat paraffine hiervoor te zacht is. #### 1.5.2 Snijden (coupe maken) Na fixatie wordt het weefsel gesneden tot zeer dunne coupes. * **Voor EM:** Er worden extreem dunne coupes gemaakt met een diamantmes, omdat elektronen door het preparaat moeten kunnen gaan. * **Voor LM:** Dunner snijden gebeurt met een stalen mes. #### 1.5.3 Kleuring Kleuring is essentieel om structuren zichtbaar te maken, vooral voor lichtmicroscopie. * **Voor LM:** * **Hematoxyline-eosine (H&E):** Een standaardkleuring die veel structuren in het weefsel aankleurt. * **Oil red O:** Specifiek voor het aankleuren van vetcellen, omdat deze bij H&E wit blijven. * **Voor EM:** * Het preparaat wordt behandeld met zware metalen. Waar het metaal zich bindt, blokkeert het de doorgang van elektronen, wat resulteert in een contrastrijk beeld (witte gebieden op het beeld). * **Osmiumtetroxide (OsO₄):** Wordt vaak gebruikt voor contrastweergave in EM. ### 1.6 Soorten microscopen en technieken Verschillende microscopen bieden uiteenlopende mogelijkheden voor observatie, afhankelijk van de gewenste resolutie en het type onderzoek. #### 1.6.1 Lichtmicroscopen * **Resolutie:** De kleinste afstand tussen twee punten die nog als apart kunnen worden onderscheiden. * **Klaarveldmicroscoop:** Gebruikt licht dat door het preparaat schijnt. Vereist gekleurde, dus dode, cellen. Belangrijke onderdelen zijn de condensor (richt het licht) en het objectief (zorgt voor vergroting). * **Fasecontrastmicroscoop:** Stelt levende cellen zonder kleuring waar, door gebruik te maken van faseverschillen in licht. * **Differentieel interferentie-contrastmicroscoop (DIC-microscoop):** Een verbeterde versie van de fasecontrastmicroscoop, die eveneens levende cellen zonder kleuring observeert en een 3D-achtig beeld geeft. * **Fluorescentiemicroscoop:** Maakt gebruik van fluorochromen die licht absorberen en opnieuw uitzenden op een langere golflengte. Filters (excitatie- en barrièrefilters) zorgen ervoor dat alleen het fluorescerende licht wordt waargenomen. * **Confocale microscoop:** Gebruikt een laser om zeer dunne optische coupes te genereren, wat resulteert in scherpere beelden en de mogelijkheid om op verschillende dieptes te focussen. * **Spinning disk confocale microscoop:** Een nog scherpere variant van de confocale microscoop. * **Flowcytometer:** Een techniek om cellen te tellen en te analyseren terwijl ze in een vloeistofstroom passeren, gebaseerd op specifieke celkenmerken. #### 1.6.2 Elektronenmicroscopen Deze microscopen gebruiken elektronen en magneten in plaats van licht en lenzen, wat resulteert in een veel hogere resolutie. * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** Elektronen gaan door het dunne preparaat en worden opgevangen. * **Scanning-elektronenmicroscopie (SEM):** Elektronen worden weerkaatst door het preparaat en opgevangen, waardoor een gedetailleerd oppervlaktebeeld ontstaat. #### 1.6.3 Technieken met EM * **Vries-breek technologie:** Membranen worden bevroren en opengebroken om hun interne structuur beter zichtbaar te maken. * **Tomografie:** Een 3D-reconstructie van een object wordt gemaakt op basis van meerdere 2D-beelden vanuit verschillende hoeken. #### 1.6.4 Eiwitten in beeld brengen Eiwitten kunnen zichtbaar worden gemaakt door het aanbrengen van gouddeeltjes op antilichamen die specifiek aan de eiwitten binden. --- # Stamcellen en hun toepassingen Stamcellen zijn fundamentele cellen met het unieke vermogen tot continue deling en differentiatie, wat hen cruciaal maakt voor zowel ontwikkeling als weefselherstel. ### 2.1 Definities en typen stamcellen Een stamcel wordt gekenmerkt door twee kerncompetenties: * **Zelfvernieuwing:** Het vermogen om door celdeling identieke kopieën van zichzelf te produceren. * **Differentiatie:** Het vermogen om te ontwikkelen tot gespecialiseerde celtypen met specifieke functies. Er worden verschillende typen stamcellen onderscheiden op basis van hun differentiële potentieel: #### 2.1.1 Totipotente stamcellen * Totipotente stamcellen zijn de meest veelzijdige stamcellen. * Ze hebben het vermogen om zich niet alleen te delen en te differentiëren tot alle celtypen van het lichaam, maar ook tot de cellen die de placenta vormen. * De cellen die ontstaan direct na de eerste celdelingen van een bevruchte eicel zijn totipotent. #### 2.1.2 Pluripotente stamcellen * Pluripotente stamcellen kunnen zich ontwikkelen tot elk celtype van de drie kiemlagen (ectoderm, mesoderm, endoderm), waaruit alle weefsels en organen van het volwassen organisme ontstaan. * Ze kunnen echter geen placenta vormen. * Embryonale stamcellen, die doorgaans afkomstig zijn van vroege embryo's, zijn vaak pluripotente stamcellen. #### 2.1.3 Multipotente stamcellen * Multipotente stamcellen zijn beperkter in hun differentiële vermogen. * Ze kunnen zich differentiëren tot een beperkt aantal celtypen, meestal binnen een specifieke weefsel- of orgaansysteem. * Een voorbeeld hiervan zijn hematopoëtische stamcellen, die zich kunnen ontwikkelen tot de verschillende bloedceltypen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar niet tot bijvoorbeeld zenuwcellen. ### 2.2 Herkomst van stamcellen voor onderzoek Voor onderzoek worden stamcellen doorgaans verkregen uit: * **Muisembryo's:** Deze zijn een veelgebruikte bron voor het verkrijgen van pluripotente stamcellen vanwege de relatieve eenvoud van isolatie en kweek. * **Humane embryo's:** Stamcellen uit humane embryo's bieden de mogelijkheid om menselijke celtypen en ziekten te bestuderen. Het gebruik hiervan is echter ethisch omstreden. ### 2.3 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) vormen een ethisch aantrekkelijker alternatief voor embryonale stamcellen. * **Creatieproces:** iPSC worden gegenereerd door volwassen somatische cellen (bijvoorbeeld huid- of urinecellen) te behandelen met specifieke factoren die de cellen "herprogrammeren" naar een pluripotente staat. * **Voordelen:** * **Ethische voordelen:** Het gebruik van iPSC vermijdt de ethische bezwaren die gepaard gaan met het gebruik van embryo's. * **Patiënt-specifiek:** iPSC kunnen worden gegenereerd uit cellen van een specifieke patiënt, waardoor ze ideaal zijn voor het bestuderen van ziekten in een laboratoriumomgeving en voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde therapieën. * **Model voor ziekten:** iPSC kunnen worden gebruikt om ziekten *in vitro* te modelleren en de effectiviteit van medicijnen te testen. > **Tip:** Het begrijpen van de verschillen tussen totipotente, pluripotente en multipotente stamcellen is cruciaal voor het beoordelen van hun potentiële toepassingen in regeneratieve geneeskunde en onderzoek. > **Voorbeeld:** Multipotente stamcellen in het beenmerg kunnen zich differentiëren tot alle typen bloedcellen. Dit is essentieel voor de bloedaanmaak, maar deze stamcellen kunnen zich niet differentiëren tot bijvoorbeeld neuronen. --- # Preparatietechnieken voor cel- en weefselobservatie Deze sectie beschrijft de essentiële stappen die nodig zijn om cellen en weefsels geschikt te maken voor microscopische observatie, met speciale aandacht voor fixatie, snijden en kleuren, zowel voor licht- als elektronenmicroscopie. ### 3.1 Algemene principes voor observatie Cellen en weefsels moeten geprepareerd worden omdat ze te dik zijn voor licht of elektronen om er gemakkelijk doorheen te dringen. Dit prepareren omvat het maken van dunne coupes. Voor onderzoek worden vaak stabiele cellijnen gebruikt, dit zijn cellen die langdurig in een laboratorium kunnen worden gekweekt, consistent delen en stabiel gedrag vertonen. Deze cellijnen zijn vaak afkomstig van tumorcellen en zijn geïmmortaliseerd, wat betekent dat ze een onbeperkte levensduur hebben. #### 3.1.1 Creëren van een stabiele cellijn Het proces omvat de volgende stappen: * **Enzymatische behandeling:** Het weefsel wordt behandeld met enzymen. * **Centrifugatie:** De cellen zakken uit en worden naar de bodem gecentrifugeerd. * **Uitzaaien:** De cellen worden uitgeplaatst in een groeirecipiënt, zoals een petrischaal. * **Kweek:** De cellen groeien in een geschikte celcultuuromgeving die de omstandigheden in het lichaam zo goed mogelijk nabootst. Het kweekmedium, zoals EMEM (Earle's Minimum Essential Medium), bevat isotonische zouten, een energiebron, aminozuren, vitamines en serum. * **Incubatie:** De cellen worden gekweekt in een vochtige, warme omgeving met voldoende koolstofdioxide ($CO_2$). Normale cellen delen tot er één laag is gevormd. Bij tumorcellen kunnen meerdere lagen ontstaan. Om verdere cultuur mogelijk te maken, worden cellen overgebracht naar een nieuwe petrischaal. Adherente cellen, die vastgehecht zijn aan een oppervlak, worden behandeld om suspensiecultures te vormen, waarbij cellen vrij in het medium zweven. #### 3.1.2 Kwaliteit van celculturen Belangrijke aspecten voor de kwaliteit van celculturen zijn: * **Mycoplasma-vrij:** Aanwezigheid van mycoplasma kan het gedrag van cellen beïnvloeden. * **Genetische stabiliteit:** Cellen moeten genetisch identiek blijven en gelijk zijn aan elkaar. * **Identificatie en contaminatie:** Het is cruciaal om te weten met welke cellen men werkt en contaminatie met andere celtypen te voorkomen. Celculturen worden ingevroren om hun samenstelling en staat te bewaren. ### 3.2 Stamcellen Stamcellen zijn cellen die het vermogen hebben om zich continu te delen en te differentiëren tot verschillende cel- of weefseltypen. #### 3.2.1 Soorten stamcellen * **Totipotente stamcellen:** Kunnen zichzelf kopiëren en differentiëren tot alle celtypen van een organisme, inclusief de placenta. Dit zijn de cellen na de eerste celdeling. * **Pluripotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot bijna alle celtypen van het lichaam. * **Multipotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot meerdere verwante celtypen binnen één orgaansysteem, zoals bloedcellen die kunnen differentiëren tot rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen. Voor experimenten worden stamcellen meestal verkregen uit muizen- of humane embryo's en zijn dit vaak pluripotente stamcellen. #### 3.2.2 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) iPSC's worden gecreëerd uit volwassen menselijke cellen (bijvoorbeeld uit urine) die vervolgens worden behandeld om pluripotente stamcellen te worden. Dit is ethisch aantrekkelijker omdat er geen embryo's voor nodig zijn. ### 3.3 Prepareren van weefsels voor observatie Omdat weefsels dik zijn, moeten ze dun gesneden worden om observatie onder de microscoop mogelijk te maken. Dit preparatieproces bestaat uit drie hoofdfasen: fixatie, snijden en kleuren. #### 3.3.1 Fixatie Fixatie dient om biologische structuren te stabiliseren en te behouden en de degradatie van weefsel te voorkomen. Er zijn verschillende methoden: * **Invriezen:** Een snelle methode die minder gedetailleerd beeld geeft. * **Paraffine-inbedding:** Het weefsel wordt gehydrateerd en vervolgens ondergedompeld in vloeibaar paraffine (een soort kaarsvet), dat uithardt. * **Plastic of hars-inbedding:** Dit wordt voornamelijk gebruikt voor elektronenmicroscopie (EM) omdat paraffine hiervoor te zacht is. #### 3.3.2 Snijden Na fixatie wordt het weefsel gesneden tot zeer dunne coupes. * **Elektronenmicroscopie (EM):** Er wordt extreem dun gesneden, met een diamantmes, omdat elektronen door het preparaat moeten kunnen dringen. * **Lichtmicroscopie (LM):** Er wordt gesneden met een stalen mes. #### 3.3.3 Kleuring Kleuring introduceert contrast in de preparaten, waardoor structuren zichtbaar worden. * **Lichtmicroscopie (LM):** Standaardkleuringen zijn hematoxyline-eosine. Voor specifieke cellen, zoals vetcellen die bij hematoxyline-eosine wit blijven, kan "oil red O" gebruikt worden. * **Elektronenmicroscopie (EM):** Het preparaat wordt behandeld met zware metalen. Waar deze metalen zich hechten, wordt de doorgang van elektronen geblokkeerd, wat resulteert in een wit gebied op het beeld. Osmiumtetroxide ($OsO_4$) wordt vaak gebruikt om contrast te verhogen. ### 3.4 Verschillende soorten microscopen #### 3.4.1 Lichtmicroscopen * **Resolutie:** De kleinste afstand tussen twee punten waarbij deze nog steeds als afzonderlijk waargenomen kunnen worden. * **Klaarveldmicroscoop:** * **Condensor:** Richt het licht op het preparaat. * **Objectief:** Zorgt voor initiële vergroting en is verwisselbaar. * **Oculair:** Zorgt voor verdere vergroting en is vast. * Het preparaat moet gekleurd zijn, wat betekent dat de cellen meestal dood zijn. * **Fasecontrastmicroscoop:** Cellen hoeven niet gekleurd te zijn en kunnen levend worden bekeken door verschillen in brekingsindex te benutten. * **Differentieel interferentie-contrast (DIC) microscoop:** Een verbeterde versie van de fasecontrastmicroscoop, die ook levende, ongekleurde cellen bestudeert en een driedimensionaal effect geeft. * **Fluorescentiemicroscoop:** * Maakt gebruik van fluorochromen die fluoresceren wanneer ze worden geëxciteerd door specifieke golflengtes licht. * **Excitatie filter:** Laat alleen licht van een specifieke golflengte door om het preparaat te belichten. * **Barrière filter:** Laat alleen uitgezonden fluorescente licht van specifieke golflengtes door. * Geabsorbeerd licht wordt met een langere golflengte uitgezonden. * **Confocale microscoop:** * Gebruikt een laser om het preparaat punt voor punt te scannen. * Beeldvorming vindt plaats in een dun optisch vlak, wat resulteert in scherpere beelden en de mogelijkheid om op verschillende dieptes te focussen. * **Spinnende schijf confocale microscoop:** Biedt nog scherpere beelden dan een standaard confocale microscoop. * **Flowcytometer:** Een techniek om microscopisch kleine deeltjes in een vloeistofstroom te tellen en te analyseren, vaak om cellen te scheiden op basis van specifieke eigenschappen. #### 3.4.2 Elektronenmicroscopen * Maakt gebruik van elektronen en magneten in plaats van licht en lenzen, wat resulteert in een veel hogere resolutie. * Preparaten worden vaak behandeld met zware metalen voor contrast. * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** Elektronen gaan door het dunne preparaat heen, worden opgevangen en vormen een beeld van de interne structuur. * **Scanning-elektronenmicroscopie (SEM):** Elektronen worden weerkaatst door het oppervlak van het preparaat, wat resulteert in een driedimensionaal beeld van het oppervlak. #### 3.4.3 Technieken met elektronenmicroscopie * **Vries-breek technologie:** Membranen worden bevroren en vervolgens opengebroken om de structuur ervan beter te kunnen bestuderen. * **Tomografie:** Creëert een driedimensionaal beeld door een reeks tweedimensionale beelden vanuit verschillende hoeken samen te voegen. #### 3.4.4 Eiwitten in beeld brengen Gouddeeltjes kunnen worden aangebracht op antilichamen, die specifiek aan eiwitten binden, om zo de locatie van specifieke eiwitten in het preparaat aan te duiden. --- # Verschillende soorten microscopen en hun toepassingen Dit onderwerp vergelijkt lichtmicroscopen, inclusief klaverveld, fasecontrast, DIC, fluorescentie en confocale microscopie, met elektronenmicroscopen, zoals TEM en SEM, en bespreekt hun principes, resolutie en specifieke toepassingen. ### 4.1 Introductie tot microscopie in celbiologie Cellen en weefsels worden geprepareerd om observeerbaar te maken met behulp van lichtmicroscopen (LM) of elektronenmicroscopen (EM). Voor onderzoek worden meestal stabiele cellijnen gebruikt, die langdurig in het laboratorium gekweekt kunnen worden, consistent delen en een voorspelbaar gedrag vertonen. Deze cellijnen zijn vaak afkomstig van tumorcellen en zijn geïmmortaliseerd, wat een onbeperkte levensduur betekent. #### 4.1.1 Ontwikkeling en kweek van stabiele cellijnen Het maken van een stabiele cellijn omvat enzymatische behandeling van weefsel, gevolgd door centrifugeren om de cellen te verzamelen. Deze cellen worden vervolgens uitgeplaat in een groeirecipiënt, zoals een petrischaal, waar ze groeien onder omstandigheden die zo goed mogelijk lijken op die in het lichaam. Het kweekmedium, zoals EMEM (Earle's Minimum Essential Medium), bevat isotonische zouten, een energiebron, aminozuren, vitamines en serum. Cellijnen worden gekweekt in een vochtige, warme omgeving met voldoende CO2. Normale cellen stoppen met delen zodra ze één laag vormen, terwijl tumorcellen zich vaak in meerdere lagen verspreiden. Om dit te beheren, worden cellen getransfereerd naar nieuwe petrischalen. Adherente cellen, die vastgehecht zijn aan een oppervlak, kunnen worden behandeld om suspensiecultures (vrij zwevende cellen) te vormen. #### 4.1.2 Kwaliteit van celculturen Essentieel voor betrouwbaar onderzoek is de afwezigheid van mycoplasma in celculturen, aangezien dit het celgedrag kan beïnvloeden. Daarnaast moeten de cellen genetisch identiek blijven en moet de identiteit van de gebruikte celsoorten bekend zijn om contaminatie te vermijden. Celculturen kunnen worden ingevroren om hun samenstelling en staat te behouden. #### 4.1.3 Stamcellen Stamcellen zijn cellen die zich continu kunnen delen en differentiëren tot verschillende cel- en weefseltypes. Er zijn verschillende soorten stamcellen: * **Totipotente stamcellen:** Kunnen zichzelf kopiëren en differentiëren tot alle celtypes die organen en weefsels vormen, inclusief de placenta. Dit zijn de cellen na de eerste celdeling. * **Pluripotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot bijna alle celtypen in het lichaam. * **Multipotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot meerdere verwante celtypen binnen één orgaansysteem (bijvoorbeeld bloedcellen die zich kunnen ontwikkelen tot rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen). Stamcellen voor experimenteel gebruik worden vaak verkregen uit muizen- of humane embryo's en zijn meestal pluripotente stamcellen. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) kunnen worden gemaakt van menselijke cellen (bijvoorbeeld uit urine) die vervolgens worden behandeld om pluripotente eigenschappen te verkrijgen, wat een ethisch voordelig alternatief biedt. ### 4.2 Prepareren van cellen en weefsels voor observatie Omdat weefsels dik zijn en licht of elektronen moeilijk doordringen, worden ze geprepareerd door middel van snijden in dunne coupes. #### 4.2.1 Fixatie Fixatie stabiliseert de cellulaire structuur. Er zijn drie hoofdmethoden: 1. **Invriezen:** Snel maar geeft minder gedetailleerde beelden. 2. **Paraffine:** Weefsel wordt gehydrateerd en ondergedompeld in vloeibaar kaarsvet dat uithardt. 3. **Plastic of hars:** Gebruikt voor elektronenmicroscopie, omdat paraffine te zacht is. #### 4.2.2 Snijden Voor EM wordt dunner gesneden met een diamantmes, zodat elektronen het preparaat kunnen passeren. Voor LM wordt een stalen mes gebruikt. #### 4.2.3 Kleuren * **Voor LM:** Standaard kleuring is hematoxyline-eosine. Voor specifieke toepassingen, zoals het zichtbaar maken van vetcellen, wordt Oil Red O gebruikt, omdat deze cellen wit blijven met hematoxyline-eosine. * **Voor EM:** Het preparaat wordt behandeld met zware metalen. Waar het metaal zich hecht, kunnen elektronen niet doordringen, wat contrast creëert. Osmiumtetroxide (OsO4) wordt vaak toegevoegd voor extra contrast. ### 4.3 Verschillende soorten lichtmicroscopen Lichtmicroscopen gebruiken licht om beelden te vergroten. * **Resolutie:** De kleinste afstand tussen twee punten waarbij deze nog steeds als afzonderlijk kan worden waargenomen. #### 4.3.1 Klaarveldmicroscoop Dit is de meest basale lichtmicroscoop. * **Condensor:** Concentreert het licht op het preparaat. * **Objectief:** Zorgt voor initiële vergroting en is verwisselbaar. * **Oculair:** Biedt verdere vergroting en is vast. * Het preparaat moet meestal gekleurd zijn, waardoor de cellen overleden zijn. #### 4.3.2 Fasecontrastmicroscoop Deze microscoop maakt het mogelijk om ongekleurde, levende cellen te bekijken. Het principe berust op het omzetten van faseverschillen (veroorzaakt door verschillende brekingsindices in de cel) in helderheidsverschillen, waardoor structuren zichtbaar worden. #### 4.3.3 Differentieel interferentie-contrast (DIC) microscoop DIC-microscopie is een geavanceerdere techniek dan fasecontrastmicroscopie en maakt eveneens de observatie van levende, ongekleurde cellen mogelijk. Het creëert een driedimensionaal ogend beeld door interferentie van lichtpaden, waardoor zeer gedetailleerde beelden van cellulaire structuren verkregen worden. #### 4.3.4 Fluorescentiemicroscoop Deze microscoop maakt gebruik van fluorochromen, stoffen die fluoresceren. Wanneer licht van een specifieke golflengte (excitatie) op het preparaat schijnt, absorberen de fluorochromen dit licht en zenden het weer uit op een langere golflengte (emissie). * **Excitatie filter:** Laat alleen licht van de gewenste excitatiegolflengte door. * **Barrière filter:** Laat alleen het emissielicht van de fluorochromen door, waardoor achtergrondverlichting wordt onderdrukt. #### 4.3.5 Confocale microscoop Een confocale microscoop maakt gebruik van een laser en een pinhole om een beeld te verkrijgen van slechts één dun optisch vlak van het preparaat. Dit resulteert in een veel scherper beeld dan bij een conventionele lichtmicroscoop. Door beelden van verschillende dieptes te combineren, kan een 3D-reconstructie worden gemaakt. De spinning disk confocale microscoop is een nog scherpere variant. #### 4.3.6 Flowcytometrie Flowcytometrie is een techniek voor het tellen en analyseren van microscopisch kleine deeltjes in een stromende vloeistof. Cellen kunnen hierbij worden gescheiden en geanalyseerd op basis van specifieke eigenschappen. ### 4.4 Verschillende soorten elektronenmicroscopen Elektronenmicroscopen gebruiken elektronen in plaats van licht en magneten in plaats van lenzen, wat resulteert in een significant hogere resolutie dan lichtmicroscopen. Zware metalen worden aangebracht op het preparaat om contrast te genereren. #### 4.4.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Bij TEM gaan de elektronen door het preparaat heen, waarna ze worden opgevangen en het beeld wordt gevormd. Dit levert gedetailleerde beelden van de interne structuur van cellen en weefsels op. #### 4.4.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) Bij SEM worden de elektronen gereflecteerd door het oppervlak van het preparaat. De gereflecteerde elektronen worden opgevangen om een beeld te vormen van het oppervlak van het monster. Dit resulteert in beelden met een hoge resolutie en een grote scherptediepte, waardoor het oppervlak van structuren gedetailleerd zichtbaar wordt. #### 4.4.3 Technieken met elektronenmicroscopie * **Vries-breek technologie:** Membranen worden opengebroken door invriezing en vervolgens mechanisch te breken. Dit onthult de architectuur van membraancomponenten. * **Tomografie:** Een 3D-representatie van een object wordt gecreëerd door een reeks 2D-afbeeldingen te maken vanuit verschillende hoeken en deze te reconstrueren. #### 4.4.4 Visualisatie van eiwitten Eiwitten kunnen worden zichtbaar gemaakt door goudbolletjes aan antilichamen te koppelen. Deze antilichamen binden specifiek aan de eiwitten van interesse, waardoor hun locatie in het preparaat kan worden aangetoond. --- # Geavanceerde technieken en beeldvorming van eiwitten Dit onderwerp introduceert specifieke elektronenmicroscooptechnieken en methoden voor het visualiseren van eiwitten met behulp van antilichamen en goudbolletjes. ### 5.1 Technieken voor structurele analyse met elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie (EM) maakt gebruik van elektronen en magneten in plaats van licht en lenzen, wat resulteert in een significant hogere resolutie in vergelijking met lichtmicroscopie (LM). Dit maakt gedetailleerdere structurele analyses mogelijk. #### 5.1.1 Vries-breek technologie De vries-breek technologie is een methode die wordt toegepast om membranen in detail te bestuderen. * **Principe:** Het weefsel wordt eerst ingevroren. Vervolgens wordt er met een hard materiaal tegen het bevroren materiaal geslagen, waardoor de membranen openbreken. Dit proces maakt de interne structuur van membranen beter zichtbaar. #### 5.1.2 Tomografie Tomografie is een techniek die wordt gebruikt om objecten in drie dimensies (3D) weer te geven. * **Principe:** Een 3D-reconstructie wordt verkregen door een reeks tweedimensionale (2D) beelden van verschillende hoeken van hetzelfde object te combineren. Dit stelt onderzoekers in staat om de ruimtelijke organisatie van cellulaire structuren te bestuderen. ### 5.2 Visualisatie van eiwitten Eiwitten kunnen op verschillende manieren worden gevisualiseerd om hun locatie en functie in cellen te bestuderen. #### 5.2.1 Gebruik van antilichamen en goudbolletjes Een veelgebruikte methode voor eiwitvisualisatie combineert antilichamen met goudbolletjes. * **Principe:** Specifieke antilichamen worden gebruikt die zich binden aan het eiwit van interesse. Deze antilichamen worden vervolgens gemerkt met kleine goudbolletjes. Omdat gouddeeltjes elektronen verstrooien, worden ze zichtbaar in de elektronenmicroscoop. Door de positie van de goudbolletjes te detecteren, kan nauwkeurig worden bepaald waar het specifieke eiwit zich in de cel bevindt. > **Tip:** Deze techniek is cruciaal voor het lokaliseren van eiwitten binnen complexe cellulaire structuren en het begrijpen van eiwitinteracties. De grootte van de goudbolletjes kan variëren, wat mogelijkheden biedt voor het markeren van meerdere eiwitten tegelijkertijd in dezelfde cel. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Celcultuur | Een methode om cellen of weefsels buiten het lichaam te kweken onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden, waarbij de omstandigheden zo veel mogelijk de in vivo omgeving nabootsen. | | Stabiele cellijn | Een populatie cellen die in het laboratorium langdurig kan worden gekweekt, consistent deelt, en waarvan het gedrag voorspelbaar en constant blijft gedurende de kweek. | | Geïmmortaliseerd | Cellen die de natuurlijke beperking van celdeling hebben overwonnen en daardoor een potentieel onbeperkte levensduur hebben in kweek, vaak door genetische modificatie of afkomstig te zijn van tumorweefsel. | | Groeirecipient | Een laboratoriumcontainer, zoals een petrischaal of kweekfles, die gebruikt wordt om cellen te huisvesten en te kweken in een geschikt kweekmedium. | | Kweekmedium | Een speciaal samengestelde vloeistof die alle essentiële voedingsstoffen, zouten, vitamines, aminozuren en groeifactoren bevat die nodig zijn voor de groei en het onderhoud van cellen in vitro. | | Isotonische zouten | Zouten die, wanneer opgelost in water, een oplossing creëren met dezelfde osmotische druk als cellen, wat essentieel is om te voorkomen dat cellen uitdrogen of opzwellen. | | Adherente cellen | Cellen die de eigenschap hebben om zich vast te hechten aan een oppervlak, zoals de bodem van een kweekfles of petrischaal, alvorens ze zich delen. | | Suspensieculturen | Cellen die niet aan een oppervlak hechten, maar vrij rondzweven in het vloeibare kweekmedium, vaak in de vorm van losse cellen of kleine aggregaten. | | Microplasma | Een type bacterie dat cellen kan infecteren zonder deze direct te doden, maar wel hun gedrag en groei kan beïnvloeden, wat de betrouwbaarheid van experimenten kan ondermijnen. | | Stamcel | Een ongedifferentieerde cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen door mitose en zich te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen en weefsels. | | Totipotente stamcel | De vroegste vorm van stamcellen die het volledige potentieel heeft om te ontwikkelen tot alle celtypen van een organisme, inclusief de extra-embryonale weefsels. | | Pluripotente stamcel | Stamcellen die zich kunnen differentiëren tot alle celtypen van de drie kiemlagen (ectoderm, mesoderm, endoderm), maar niet tot de placenta. | | Multipotente stamcel | Stamcellen die zich kunnen differentiëren tot een beperkt aantal celtypen binnen een specifieke weefsel of orgaansysteem, zoals hematopoëtische stamcellen. | | Fixatie | Een proces waarbij biologisch materiaal wordt behandeld met chemicaliën of fysieke methoden om de cellulaire structuur te stabiliseren en te voorkomen dat deze degradeert na het verwijderen uit het levende organisme. | | Paraffine | Een wasachtige substantie die wordt gebruikt om weefselmonsters te infiltreren en te ondersteunen, waardoor ze dun gesneden kunnen worden voor microscopische analyse. | | Coupes | Dun gesneden plakjes van weefsel of cellen die worden gemaakt om onder een microscoop te kunnen bekijken, waardoor doorsneden van structuren zichtbaar worden. | | Resolutie | Het vermogen van een microscoop om twee dicht bij elkaar gelegen punten als afzonderlijke entiteiten te onderscheiden; een hogere resolutie betekent dat kleinere details zichtbaar zijn. | | Condensor | Een optisch onderdeel in een microscoop dat licht verzamelt en focust op het preparaat, wat cruciaal is voor een heldere en gelijkmatige verlichting. | | Objectief | De lens in een microscoop die zich het dichtst bij het preparaat bevindt en de eerste vergroting van het beeld verzorgt. | | Oculair | De lens in een microscoop waar de waarnemer doorheen kijkt; het oculair vergroot het beeld dat door het objectief wordt geproduceerd. | | Fasecontrastmicroscoop | Een type lichtmicroscoop dat biologische monsters zichtbaar maakt door verschillen in brekingsindex te benutten, waardoor transparante structuren zonder kleuring zichtbaar worden. | | Differentieel interferentie-contrastmicroscoop (DIC) | Een geavanceerde microscooptechniek die optische differentiële interferentie gebruikt om een pseudo-3D-effect te creëren, waardoor structuren met een hoog contrast en hoge resolutie zichtbaar worden, zelfs bij levende cellen. | | Fluorochroom | Een fluorescerende kleurstof die specifieke moleculen of structuren in een cel of weefsel kan binden en licht uitzendt bij excitatie met een bepaalde golflengte. | | Confocale microscoop | Een type fluorescerende microscoop die een laser gebruikt om het preparaat punt voor punt te scannen en een scherp beeld te produceren door alleen licht uit een specifiek focusvlak door te laten. | | Flowcytometrie | Een techniek die wordt gebruikt om de fysieke en chemische kenmerken van individuele cellen of deeltjes in een vloeistofstroom te meten en te sorteren. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een elektronenmicroscoop die elektronenbundels door een extreem dun monster stuurt om een gedetailleerd tweedimensionaal beeld te produceren van de interne structuur. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een elektronenmicroscoop die een monster scant met een geconcentreerde elektronenbundel en de weerkaatste of secundaire elektronen detecteert om een gedetailleerd driedimensionaal beeld van het oppervlak te verkrijgen. | | Vries-breek technologie | Een techniek die wordt gebruikt om biologische membranen te openbreken door bevriezing en vervolgens een breuk te induceren, waardoor de binnenste structuren van de membraan bloot komen te liggen voor analyse. | | Tomografie | Een beeldvormende techniek die een reeks tweedimensionale beelden van een object onder verschillende hoeken creëert, die vervolgens worden gecombineerd om een driedimensionale reconstructie te genereren. |