B11 antilichamenTCRv2023 2.pptx

# Antilichamen en hun toepassingen Dit onderwerp verkent de diverse soorten antilichamen en hun cruciale rol in zowel diagnostische als therapeutische toepassingen binnen de geneeskunde. ### 1.1 Polyklonale antistoffen Polyklonale antistoffen zijn een mengsel van verschillende antilichamen die worden geproduceerd door meerdere B-celklonen. Ze worden doorgaans verkregen uit het serum van geïmmuniseerde individuen of donoren. Hoewel sommige antilichamen binnen dit mengsel gericht zijn tegen het specifieke antigeen van interesse, bevatten de meeste antilichamen in een polyklonaal preparaat diverse specificiteiten en richten ze zich op verschillende epitopen van een antigeen. Bovendien kunnen ze antistoffen van verschillende isotypes (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) bevatten. Polyklonale immunoglobulines, vaak verkregen uit gezonde volwassen donoren, bevatten antistoffen tegen veelvoorkomende pathogenen zoals herpesvirussen, influenza, rhinovirussen en adenovirussen. Ze zijn echter niet effectief tegen virussen zoals HCV, HBV en HIV, aangezien de donoren seronegatief zijn voor deze ziekteverwekkers. **Toepassingen:** * **Passieve immuniteit:** Leveren van tijdelijke bescherming tegen infecties. * **Behandeling van B-celdefecten:** Compenseren voor het gebrek aan eigen antistofproductie. * **Behandeling van auto-immuunziekten:** Moduleren van de immuunrespons. Specifieke immunoglobulines worden verkregen van hyperimmune of gevaccineerde donoren en zijn gericht tegen specifieke pathogenen. Voorbeelden zijn: * **Anti-D:** Gebruikt bij rhesus-negatieve zwangere vrouwen om hemolytische ziekte van de pasgeborene te voorkomen. * **Anti-HBV:** Toegediend na een prikaccident met bloed dat mogelijk HBV bevat. * **Antititanus:** Gebruikt bij wondbehandeling om infectie met tetanustoxine te voorkomen. * **Anti-rabiës:** Verleent bescherming na een beet van een verdacht dier en kan zelfs na blootstelling worden toegediend, in tegenstelling tot de meeste vaccins. * **Anti-CMV:** Preventie en behandeling van cytomegalovirusinfecties bij transplantatiepatiënten. **Voorbeeld van een specifieke toepassing:** > **Voorbeeld:** Anti-thymocyten globulines (ATG), vaak verkregen uit konijnenserum na immunisatie met humane thymuscellen, zijn polyklonale antilichamen die worden gebruikt bij transplantatie om de immuunrespons te onderdrukken en afstoting te voorkomen. ### 1.2 Monoklonale antistoffen Monoklonale antistoffen zijn kunstmatig geproduceerde, zeer specifieke antistoffen die door één enkele B-celklon worden gegenereerd. Dit betekent dat elke batch van een monoklonaal antistofpreparaat identiek is en bestaat uit slechts één type antistof dat één specifiek epitoop herkent. Ze worden geproduceerd via het hybridoomtechniek, waarbij B-cellen van een geïmmuniseerd individu worden gefuseerd met een maligne plasmacel (myeloomcel) die zelf geen antistoffen produceert. Het resulterende hybridoom is een snelgroeiende cel die het gewenste antistof produceert. **Kenmerken:** * **Hoge specificiteit:** Herkennen slechts één specifiek epitoop. * **Uniformiteit:** Elke productiebatch is identiek. * **Muis-gebaseerd:** Klassiek geproduceerd in muizen, maar ook humane monoklonale antistoffen zijn mogelijk. **Voorbeeld van een therapeutisch monoklonaal antistof:** > **Voorbeeld:** OKT3 is een monoklonaal antistof dat specifiek één epitoop op T-cellen herkent, namelijk de CD3-eiwitten die geassocieerd zijn met de T-celreceptor (TCR). ### 1.3 Gehumaniseerde monoklonale antistoffen Murine (muis-gebaseerde) monoklonale antistoffen kunnen bij menselijke toediening immuunreacties opwekken, wat hun effectiviteit vermindert. Om dit tegen te gaan, worden muriene antistoffen vermenselijkt met behulp van moleculaire technieken. **Typen vermenselijking:** * **Chimere antistoffen:** Bezitten de variabele domeinen (V_H en V_L) van de muis, terwijl de rest van het antistof (constante domeinen) humaan is. Deze worden gekozen op basis van gewenste eigenschappen, zoals binding aan Fc-receptoren voor NK-celactiviteit of complementactivatie. De benaming eindigt vaak op `-ximab`. * **Gehumaniseerde antistoffen:** Slechts de complementariteitsbepalende regio's (CDR1-3) van de zware en lichte ketens zijn afkomstig van de muis; de rest is humaan. De benaming eindigt vaak op `-zumab`. * **Humane monoklonale antistoffen:** Volledig humaan, maar technisch moeilijker te produceren. De benaming eindigt vaak op `-mumab`. **Voorbeeld van een behandeling met een gehumaniseerd antistof:** > **Voorbeeld:** Rituximab is een gehumaniseerd monoklonaal antistof dat bindt aan het CD20-eiwit op B-cellen. Het wordt gebruikt bij de behandeling van B-cel lymfomen en leukemieën. Door radioactieve moleculen aan dit antistof te koppelen, kunnen tumorcellen gericht vernietigd worden. ### 1.4 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA is een veelgebruikte en belangrijke techniek voor het meten of detecteren van specifieke eiwitten, waaronder virussen, antistoffen, hormonen en toxines. Het principe berust op een enzymatische reactie die een kleurverandering veroorzaakt wanneer het doelwit aanwezig is. **Werkingsprincipe:** 1. Een antigeen (bv. een deel van een virus) wordt op een plastic putje van een plaat gecoat. 2. Serum van de patiënt wordt toegevoegd. Als de patiënt antistoffen tegen het antigeen heeft, zullen deze binden. 3. Na wegwassen blijven alleen de gebonden antistoffen achter. 4. Een tweede antilichaam, dat gericht is tegen humaan immunoglobuline en gekoppeld is aan een enzym, wordt toegevoegd. Dit bindt aan de patiënt-antistoffen. 5. Na opnieuw wegwassen wordt een substraat voor het enzym toegevoegd. Dit resulteert in een kleurverandering in de putjes waar het enzym-antistofcomplex aanwezig is. ELISA wordt gebruikt om de aanwezigheid van antistoffen tegen een bepaald antigeen te bepalen, wat duidt op een doorgemaakte infectie of immuniteit, maar niet noodzakelijk de actieve ziekte. > **Tip:** ELISA is een essentieel diagnostisch hulpmiddel in de microbiologie, naast PCR en kweek. ### 1.5 Flowcytometrie of FACS: fluorescentie-geactiveerde cel sortering Flowcytometrie, ook wel bekend als FACS, is een techniek die wordt gebruikt om cellen te kwantificeren en te onderscheiden op basis van hun celoppervlaktemerkers. Dit is cruciaal voor het tellen van celpopulaties zoals T-cellen, B-cellen en NK-cellen in bloed. **Werkingsprincipe:** 1. **Voorbehandeling:** Bloedmonsters worden gemengd met monoklonale antistoffen die gelabeld zijn met fluorescerende stoffen. Deze antistoffen zijn specifiek voor celoppervlakte-eiwitten (bv. anti-CD3 voor T-cellen, anti-CD20 voor B-cellen, anti-CD56 voor NK-cellen). Elke antistof heeft een andere kleur fluorocroom. 2. **Detectie:** De cellen passeren één voor één door een laserstraal. De laser exciteert de fluorescerende labels op de antistoffen, waardoor deze licht uitzenden in specifieke golflengtes. Detectoren vangen dit licht op. 3. **Analyse:** De verzamelde gegevens worden geanalyseerd om een meerdimensionale plot te creëren, waarbij elk punt een individuele cel vertegenwoordigt en de fluorescentie-intensiteit de expressie van de specifieke marker aangeeft. Hierdoor kunnen verschillende celpopulaties nauwkeurig worden geïdentificeerd en gekwantificeerd. **Voorbeeld van celidentificatie met flowcytometrie:** > **Voorbeeld:** Door het labelen van bloedcellen met anti-CD3, anti-CD20 en anti-CD56 antistoffen die respectievelijk rood, groen en blauw fluoresceren, kan een flowcytometer T-cellen, B-cellen en NK-cellen onderscheiden in een bloedmonster. CiteSeq en single-cell transcriptomics zijn geavanceerdere technieken die voortbouwen op flowcytometrie. Bij CiteSeq worden antistoffen gelabeld met oligonucleotiden, waardoor tot 250 antistoffen tegelijk kunnen worden geanalyseerd per cel. Single-cell transcriptomics omvat het afzonderlijk verpakken van cellen in druppeltjes voor RNA-sequencing, wat gedetailleerde informatie geeft over de transcriptoom-profielen van individuele cellen. ### 1.6 Diagnostiek: anemie door rode bloedcel destructie Anemie door destructie van rode bloedcellen kan optreden in verschillende situaties, met name bij pasgeborenen (hemolytische ziekte van de pasgeborene) en bij incompatibiliteit van bloedgroepen of rhesusfactoren tussen moeder en kind. * **Moeder-kind incompatibiliteit:** Wanneer een moeder antistoffen produceert tegen antigenen op de rode bloedcellen van haar kind (bv. rhesus-negatieve moeder met rhesus-positief kind), kunnen deze antistoffen via de placenta het kind bereiken en de rode bloedcellen van het kind aanvallen en vernietigen. Dit kan leiden tot icterus (geelzucht) door hemolyse. Ernstigere vormen komen voor bij rhesus- of Kell-incompatibiliteit. * **Diagnose:** De **directe coombs-test** op rode bloedcellen van het kind wordt gebruikt. Hierbij worden de rode bloedcellen van het kind geïncubeerd met een antilichaam tegen humaan IgG. Als er IgG-antistoffen op de rode bloedcellen van het kind gebonden zijn, zullen deze cellen aggregeren, wat wijst op een immuun-gemedieerde hemolyse. **Preventie van immunisatie:** Passieve immunisatie met anti-RhD antistoffen IgG bij rhesus-negatieve moeders voorkomt immunisatie door het kind. Dit werkt mogelijk via de expressie van inhibitoire Fc-receptoren op naïeve B-cellen, die de B-celactiviteit blokkeren bij binding van antistoffen met hogere affiniteit. Dit mechanisme kan ook van toepassing zijn bij de behandeling van auto-immuunziekten zoals idiopathische trombocytopenie (ITP) met gammaglobulines. ### 1.7 Passieve immunisatie Passieve immunisatie houdt in dat beschermende antistoffen rechtstreeks aan een individu worden toegediend, in plaats van het immuunsysteem zelf te stimuleren om antistoffen te produceren (actieve immunisatie via vaccinatie). Dit biedt onmiddellijke, maar tijdelijke, bescherming. **Toepassingen:** * **Bescherming tegen specifieke pathogenen:** Zoals hierboven vermeld bij anti-D, antititanus en anti-rabiës. * **Behandeling van immuundeficiënties:** Patiënten met een verzwakt immuunsysteem, bijvoorbeeld na transplantatie, kunnen vatbaar zijn voor reactivaties van virussen zoals CMV. Passieve immunisatie met CMV-specifieke antistoffen kan hierbij helpen, hoewel het bij intracellulaire pathogenen zoals CMV mogelijk niet volledig genezend is. ### 1.8 Antilichaam engineering Antilichaam engineering omvat technieken om de structuur en functie van antilichamen aan te passen voor therapeutische doeleinden. Dit maakt het mogelijk om antistoffen te creëren met verbeterde eigenschappen of nieuwe functionaliteiten. **Belangrijke structurele componenten van een Ig:** * **V_H en V_L domeinen:** De variabele domeinen die verantwoordelijk zijn voor antigenbinding. Samen vormen ze het Fv-fragment. * **C_H en C_L domeinen:** De constante domeinen die de effectorfuncties van het antilichaam mediëren. * **Fab fragment:** Bestaat uit een V_H, V_L, C_H1 en C_L domein; verantwoordelijk voor antigenbinding. * **F(ab')₂ fragment:** Twee Fab-fragmenten die verbonden zijn door disulfidebruggen. * **scFv (single-chain variable fragment):** Een geconstrueerd eiwit waarbij V_H en V_L domeinen via een flexibele peptideketen met elkaar verbonden zijn. Dit is een kleiner en vaak makkelijker te hanteren fragment. **Speciale antilichaamconstructies:** * **V_HH immunoglobulines:** Gevonden bij kamelen en lama's, deze bestaan uit één enkel V_H domein dat antigeen kan binden, zonder een V_L domein. Dit vereenvoudigt de productie. * **Bispecifieke antistoffen:** Deze antistoffen zijn ontworpen om tegelijkertijd twee verschillende antigenen te binden. Een veelvoorkomend voorbeeld is een antistof die enerzijds bindt aan een tumor-specifiek antigeen en anderzijds aan het CD3-complex op T-cellen. Dit type antistof, zoals de BiTE (Bispecific T cell Engager), kan T-cellen rekruteren naar tumorcellen voor gerichte celdoding. **Effector mechanismen van antilichamen in therapie:** * **Complementactivatie:** Hoewel effectief tegen bacteriën, is dit minder effectief tegen lichaamscellen door de aanwezigheid van inhibitoren. * **ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity):** NK-cellen herkennen het antilichaam op de doelcel via hun Fc-receptoren en induceren celdoding. * **ADCP (Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis):** Macrofagen herkennen de antistoffen op de doelcel en fagocyteren deze. Dit is een belangrijk mechanisme bij antistoffen zoals Rituximab (anti-CD20). ### 1.9 Transgene T celreceptoren Bij deze therapie worden T-cellen van een patiënt genetisch gemodificeerd om een tumor-specifieke T-celreceptor (TCR) tot expressie te brengen. Deze tumor-specifieke TCR's kunnen gericht zijn op antigenen die door het HLA-complex worden gepresenteerd. Een nadeel van deze aanpak is de HLA-afhankelijkheid, wat de toepasbaarheid beperkt. Transgene TCR's kunnen echter zowel cytoplasmatische als nucleaire antigenen targetten. ### 1.10 Chimere antigeen receptoren (CARs) CARs zijn een vorm van immuuntherapie waarbij T-cellen worden gemodificeerd om een kunstmatige receptor tot expressie te brengen die tumor-specifiek is. Een CAR bestaat typisch uit een single-chain variable fragment (scFv) dat een tumorantigeen herkent, gekoppeld aan een signaaltransducerende sequentie (vaak afkomstig van CD3). **Voordelen van CARs:** * **HLA-onafhankelijk:** CARs kunnen antigenen herkennen zonder de noodzaak van HLA-presentatie, wat ze breder toepasbaar maakt. * **Gericht op membraanantigenen:** Ze zijn effectief tegen antigenen die op het celoppervlak aanwezig zijn. **Generaties CARs:** * **Eerste generatie:** Bevatten alleen CD3-signalering. Deze cellen kunnen tumorcellen doden, maar hebben een beperkt overlevingsvermogen in vivo. * **Tweede generatie:** Bevatten naast CD3 ook een costimulerende sequentie (bv. CD28). Dit zorgt voor activatie, proliferatie en langdurig overleven van de gemodificeerde T-cellen, wat leidt tot een effectievere tumorbestrijding. **Uitdagingen en bijwerkingen:** * **"On target, off tumor" effecten:** Als het doelantigeen ook op gezonde cellen voorkomt (bv. CD20 op B-cellen), kan dit leiden tot toxiciteit. * **Cytokinestorm:** Een ernstige en potentieel dodelijke immuunreactie die gepaard gaat met de massale vrijlating van cytokines. Behandeling met anti-IL-6 antistoffen kan hierbij helpen. **Voorbeeld van CAR-T therapie:** > **Voorbeeld:** CAR-T celtherapie waarbij T-cellen van de patiënt worden gemodificeerd met een CAR gericht tegen CD19 (een B-cel marker) kan effectief zijn bij de behandeling van B-cel leukemieën en lymfomen. Na modificatie worden de T-cellen terug geïnfuseerd bij de patiënt. ### 1.11 Transfer van virale immuniteit Bij patiënten met immuundeficiënties, bijvoorbeeld na transplantatie, kan reactivatie van virussen zoals CMV optreden. Behandeling kan medicamenteus of via passieve immunisatie met specifieke antistoffen. Echter, bij intracellulaire pathogenen zoals CMV is transfer van virale immuniteit via CMV-specifieke T-cellen een effectievere benadering. **CMV-specifieke T-cel transfer:** * **Isolatie uit stamceldonor:** T-cellen worden geïsoleerd uit het stamcelmateriaal van een CMV-seropositieve donor. Dit kan gebeuren op basis van HLA-tetrameren (beperkt tot specifieke HLA-typen en CD8+ T-cellen) of op basis van IFN-γ productie na stimulatie met CMV-peptiden (geschikt voor alle patiënten en inclusief CD4+ T-cellen). * **Transplantatie:** Een relatief klein aantal van deze gemodificeerde T-cellen per kilogram lichaamsgewicht kan al genezend werken. > **Tip:** Het succes van T-celtherapie vereist vaak HLA-compatibiliteit tussen donor en ontvanger, en tolerantie van de patiënt voor de getransfereerde cellen, in tegenstelling tot antistoftherapie die minder restrictief is. --- # Celgebaseerde diagnostiek en therapie Dit deel behandelt technieken zoals flowcytometrie en ELISAs voor de analyse en kwantificatie van cellen en eiwitten, alsook de therapeutische modificatie van T-cellen, inclusief transgene T-celreceptoren en chimere antigeenreceptoren (CARs). ### 2.1 Diagnostische technieken #### 2.1.1 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ELISA is een fundamentele techniek voor het meten of detecteren van specifieke eiwitten, met brede toepassingen in diagnostiek. * **Principe:** 1. Een antigeen (bijvoorbeeld een deel van een virus) wordt op een plastic putje gecoat. 2. Serum van een patiënt wordt toegevoegd. Antistoffen in het serum kunnen aan het gecoate antigeen binden. 3. Na wegwassen blijven alleen gebonden antistoffen achter. 4. Een detectie-antilichaam, gekoppeld aan een enzym, wordt toegevoegd. Dit bindt aan de humane antistoffen. 5. Na een tweede wasstap wordt een enzymsubstraat toegevoegd. Indien het detectie-antilichaam aanwezig is (en dus de patiënt antistoffen heeft tegen het antigeen), vindt een kleurreactie plaats. * **Toepassing:** ELISA wordt gebruikt om de aanwezigheid van antistoffen tegen een bepaald antigeen (ziekte) in serum te detecteren, maar niet direct om de ziekte zelf aan te tonen. #### 2.1.2 Flowcytometrie (Fluorescence-Activated Cell Sorting - FACS) Flowcytometrie is cruciaal voor de kwantificatie van cellen zoals T-cellen, B-cellen en NK-cellen in bloed. * **Principe:** 1. **Voorbehandeling:** Ontstolled bloed wordt behandeld met monoklonale antistoffen, gelabeld met fluorescerende stoffen. Deze antistoffen zijn specifiek voor celoppervlaktemerkers (bv. anti-CD3 voor T-cellen, anti-CD20 voor B-cellen, anti-CD56 voor NK-cellen). De gebruikte antistoffen hebben elk een andere fluorescerende kleur. 2. **Detectie:** De cellen passeren één voor één een laserstraal. De laser exciteert de fluorescerende labels op de antistoffen, waardoor licht wordt uitgezonden. 3. **Analyse:** Detectoren vangen het uitgezonden licht op. Dit resulteert in een multi-dimensionale plot waarbij elk punt een individuele cel representeert, gekarakteriseerd door zijn fluorescerende signatuur (en dus celtype). * **CiteSeq en Single Cell Transcriptomics:** * **CiteSeq:** Hierbij zijn antistoffen gelabeld met oligonucleotiden. Cellen worden individueel verwerkt en gesequeneerd, waardoor labelling met tot 250 verschillende antistoffen tegelijk mogelijk is. * **Single Cell Transcriptomics:** Cellen worden verpakt in afzonderlijke druppeltjes, waarna het RNA van elke cel wordt gesequeneerd. Dit biedt gedetailleerde inzichten in de cellulaire populaties en hun expressieprofielen, bijvoorbeeld om naïeve en geheugen B-cellen te onderscheiden. ### 2.2 Therapeutische toepassingen van antilichamen en T-cellen #### 2.2.1 Antilichamen als therapie * **Polyklonale antistoffen:** Een mengsel van antistoffen afkomstig uit serum van geïmmuniseerde individuen. Ze bevatten antistoffen tegen diverse pathogenen en antigenen. Gebruikt bij B-cel defecten en auto-immuunziekten. * **Monoklonale antistoffen:** Artificieel geproduceerde, zeer specifieke antistoffen die slechts één epitoop herkennen. * **Muriene (muizen) antistoffen:** Kunnen immuunreacties opwekken bij mensen. * **Vermenselijkte monoklonale antistoffen:** Ontworpen om immunogeniciteit te verminderen. * **Chimere:** Combineren muizen V$_H$ en V$_L$ domeinen met humaan constante deel. Aanduiding eindigt op "-ximab". * **Gehumaniseerd:** Slechts de complementair bepalende regio's (CDR's) zijn van muizenherkomst; de rest is humaan. Aanduiding eindigt op "-zumab". * **Humaan:** Volledig humaan. Aanduiding eindigt op "-mumab". * **Antilichaam engineering:** * **Fragmenten:** Gebruik van specifieke delen van antistoffen zoals Fv, scFv (single-chain variable fragment), Fab of F(ab')$_2$ fragmenten voor therapeutische doeleinden. Deze kleinere fragmenten kunnen voordelen bieden qua penetratie en toxiciteit. * **Bispecifieke antistoffen:** Kunnen twee verschillende antigenen binden, bijvoorbeeld een tumor-specifiek antigeen en een T-cel receptor/CD3 complex. Dit leidt tot "redirected T cells" die de tumor herkennen en aanvallen. BiTE (Bispecific T cell Engager) is een voorbeeld. * **Half-life extending (HLE):** Koppelen van technologieën om de biologische halfwaardetijd van antistoffen te verlengen. * **Effectormechanismen van Ig:** * Complementactivatie (minder effectief tegen lichaamscellen). * Antistof-afhankelijke celulaire cytotoxiciteit (ADCC) door NK-cellen. * Antistof-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) door macrofagen. * FcR $\gamma$ gemedieerde killing door macrofagen, een belangrijk mechanisme bij bv. Rituximab (anti-CD20). #### 2.2.2 T-cel gemodificeerde therapieën T-cellen kunnen genetisch gemodificeerd worden om tumorspecifieke reactiviteit te verkrijgen. * **Transgene T-celreceptoren (TCR):** Expressie van een extra, tumor-specifieke TCR op de T-cel. Deze therapie is vaak HLA-afhankelijk, wat de praktische toepasbaarheid beperkt. TCRs kunnen intracellulaire antigenen targetten. * **Chimere antigeenreceptoren (CARs):** * **Structuur:** Een CAR bestaat uit een extracellulair scFv-deel (afkomstig van een antistof) dat bindt aan een tumorantigeen zonder HLA-restrictie. Dit is verbonden met een transmembraan peptide en intracellulaire signaaltransducerende sequenties, typisch van CD3 $\zeta$. * **Generaties:** * **Eerste generatie CARs:** Bevatten alleen de CD3 $\zeta$ signaalsequentie. Ze kunnen tumorcellen doden, maar hebben een beperkte overleving en activiteit in vivo. * **Tweede generatie CARs:** Bevatten naast CD3 $\zeta$ ook een costimulatoire sequentie (bv. CD28 of 4-1BB). Dit zorgt voor T-cel activatie, proliferatie en langdurige overleving na antigenbinding. * **Derde/Vierde generatie CARs:** Bevatten meerdere costimulatoire domeinen voor verdere verbetering van de activiteit. * **Voordelen:** Niet HLA-gebonden, kunnen membraanantigenen targetten. * **Nadelen:** * "On target, off tumor" effect: Binding aan antigenen op gezonde cellen (bv. CD20 op B-cellen). * "On target, on tumor" effect: Tumordoding. * Risico op cytokine storm na infusie van CAR-T cellen, wat levensbedreigend kan zijn en intensieve zorg vereist (behandeling met anti-IL6 antistoffen kan waardevol zijn). #### 2.2.3 Diagnostiek en therapie van anemie door rode bloedcel destructie Dit betreft met name hemolytische ziekten bij pasgeborenen, vaak gerelateerd aan bloedgroep-incompatibiliteit. * **Mechanisme:** Bij incompatibiliteit tussen moeder en kind (bv. Rhesus-factor of ABO-bloedgroep), kan de moeder antistoffen aanmaken tegen rode bloedcellen van het kind. Deze IgG-antistoffen kunnen de placenta passeren en leiden tot hemolyse (afbraak van rode bloedcellen) bij de foetus/pasgeborene, met geelzucht (icterus) tot gevolg. * **Diagnostiek:** * **Directe Coombs test:** Op de rode bloedcellen van het kind wordt een anti-humane IgG-antilichaam toegevoegd. Als er IgG aan de rode bloedcellen gebonden is, aggregeren de cellen. * **Passieve immunisatie (preventie):** Toediening van anti-RhD IgG aan Rh-negatieve moeders voorkomt immunisatie en daarmee hemolytische ziekte bij volgende zwangerschappen. Het werkingsmechanisme kan berusten op het blokkeren van naïeve B-cellen via inhibitoire Fc-receptoren. #### 2.2.4 Transfer van virale immuniteit * **Context:** Patiënten met immuundeficiëntie (bv. na transplantatie) zijn vatbaar voor reactivatie van virussen zoals CMV. * **Behandeling:** * **Medicatie:** Antivirale middelen. * **Passieve CMV-immunisatie:** Toediening van CMV-specifieke antistoffen van een donor. Dit is gemakkelijk, maar niet genezend omdat CMV intracellulair is. * **CMV-specifieke T-cel transfer:** Transfusie van T-cellen die specifiek CMV-antigenen herkennen. * **Voordelen:** Potentieel genezend, kan worden toegepast bij alle patiënten, vereist slechts duizenden cellen. * **Nadelen:** Vereist HLA-identieke donoren of tolerantie, wat de toepasbaarheid kan beperken. * **Isolatie methoden:** * Gebaseerd op HLA-tetrameren: Selecteert specifieke T-cellen gebonden aan een gemodificeerd HLA-molecuul dat een CMV-peptide presenteert. Voordeel: gemakkelijke isolatie. Nadeel: beperkt tot specifieke HLA-types (bv. HLA-A2+) en isoleert vaak enkel CD8+ T-cellen. * Gebaseerd op IFN-$\gamma$ productie: Cellen worden gestimuleerd met CMV-peptiden, en de producerende cellen worden geïsoleerd. Voordeel: isoleert zowel CD4+ als CD8+ T-cellen, breder toepasbaar. Nadeel: omslachtiger celisolatie. > **Tip:** Bij celtherapieën met T-cellen is de HLA-matching cruciaal voor de effectiviteit en tolerantie van de getransfereerde cellen, tenzij de therapie inherente HLA-onafhankelijk is (zoals bij CARs). > **Tip:** Bij de interpretatie van flowcytometrie is het belangrijk om de correcte combinatie van celoppervlaktemerkers te gebruiken om specifieke celpopulaties te identificeren. Verschillende fluorescentiekanalen worden ingezet, en de analyse gebeurt op basis van de intensiteit en het aantal geëmitteerde fotonen. --- # Specifieke immunologische toepassingen Dit onderwerp behandelt specifieke toepassingen van immunologie, met een focus op diagnostische methoden en therapeutische strategieën zoals passieve immunisatie en de diagnose van anemie door rode bloedceldestructie. ### 3.1 Passieve immunisatie en immunoglobuline-therapie Passieve immunisatie berust op de toediening van reeds gevormde antistoffen, meestal in de vorm van geïsoleerde immunoglobulines. Deze antistoffen, doorgaans van het IgG-type, worden verkregen uit het serum van donoren. #### 3.1.1 Polyvalente en specifieke immunoglobulines * **Polyvalente immunoglobulines:** Deze worden gezuiverd uit het bloed van gezonde volwassen donoren en bevatten antistoffen tegen een breed scala aan veelvoorkomende pathogenen, zoals herpesvirussen, influenza, rhinovirussen en adenovirussen. Ze bieden bescherming tegen deze agentia maar niet tegen pathogenen zoals HCV, HBV of HIV, omdat de donoren hiervoor seronegatief zijn. * **Toepassingen:** Worden gebruikt bij patiënten met B-celdefecten en auto-immuunziekten. * **Specifieke immunoglobulines (hyperimmune globulines):** Deze worden verkregen uit hyperimmune of gevaccineerde donoren en bevatten antistoffen met een specifieke affiniteit voor bepaalde antigenen. * **Voorbeelden:** * **Anti-D:** Toegediend aan rhesus-negatieve zwangere vrouwen om hemolytische ziekte van de pasgeborene te voorkomen. * **Anti-HBV:** Gebruikt na een prikaccident met bloed van een hepatitis B-positieve donor. * **Antitetanus:** Gebruikt bij wondbehandeling na mogelijke tetanusinfectie. * **Anti-rabiës:** Essentieel na de beet van een verdacht dier, vaak in combinatie met vaccinatie, omdat het de enige vaccinatie is die na blootstelling kan worden toegediend om de verspreiding via zenuwbanen te stoppen. * **Anti-CMV:** Gebruikt voor profylaxe en behandeling van patiënten na transplantatie. #### 3.1.2 Monoklonale antistoffen Monoklonale antistoffen zijn specifiek, omdat ze slechts één type antistof produceren die één exact epitoop herkent. Ze worden geproduceerd door hybrideoma-technologie, waarbij B-cellen van een geïmmuniseerd individu (vaak een muis) worden gefuseerd met gemaligniseerde myeloomcellen. * **Productie:** Na immunisatie van een muis met bijvoorbeeld humane thymuscellen, worden milt-B-cellen geïsoleerd en gefuseerd met myeloomcellen die zelf geen antistoffen secreteren. De resulterende hybrideoma's delen snel en produceren de gewenste antistoffen. * **Voorbeeld:** OKT3, een monoklonaal antistof dat een specifiek epitoop op de CD3-eiwitten van T-celreceptoren herkent. * **Voordeel:** Elk productbatch bevat identiek hetzelfde antistof, wat zorgt voor consistentie. #### 3.1.3 Gehumaniseerde en chimeere monoklonale antistoffen Murine (muizen) monoklonale antistoffen kunnen immunogeniciteit opwekken bij mensen, waardoor hun werkzaamheid afneemt. Om dit te omzeilen, worden ze aangepast: * **Chimere antistoffen:** Combineren de variabele regio's (VH en VL) van muizenantistoffen met de constante regio's van humane antistoffen. De keuze van het humane isotype hangt af van gewenste eigenschappen zoals Fc-receptorbinding (NK-activiteit) of complementactivatie. * **Gehumaniseerde antistoffen:** Verder geoptimaliseerd, waarbij enkel de complementair-determinerende regio's (CDR's) van de muisantilichamen behouden blijven, terwijl de rest van het antistofhumane oorsprong is. * **Humane monoklonale antistoffen:** Deze zijn technisch moeilijker te produceren, omdat directe immunisatie van mensen om antistoffen te genereren niet ethisch of praktisch is. **Terminologie:** * `-ximab`: Chimeer * `-zumab`: Gehumaniseerd * `-mumab`: Humaan * `-cept`: Fusie-eiwit tussen een receptor en het constante deel van een antistof. #### 3.1.4 Toepassingen van monoklonale antistoffen Monoklonale antistoffen hebben diverse therapeutische toepassingen: * **Kankertherapie:** * **Gerichte therapie:** Antilichamen gericht tegen specifieke tumorantigenen, zoals CD20 op B-cellen (bv. Rituximab), HER2 op borstkankercellen, of CD19. * **Radiotherapie:** Antilichamen kunnen worden gelabeld met radioactieve isotopen om kankercellen te vernietigen. * **Antilichaam-gemedieerde celdoding:** Dit kan plaatsvinden via verschillende mechanismen: * **Complementactivatie:** Hoewel minder effectief tegen lichaamscellen vanwege de aanwezigheid van inhibitoren zoals DAF. * **ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity):** Gemedieerd door NK-cellen. * **ADCP (Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis):** Gemedieerd door macrofagen via Fc-receptoren. Dit is een belangrijk mechanisme bij bijvoorbeeld Rituximab, mede doordat CD20-activatie apoptose kan induceren. * **Checkpoint blokkers:** Remmen immuunsuppressieve signalen, waardoor T-cellen de tumor kunnen aanvallen. * **Bispecifieke antistoffen:** Deze antistoffen hebben twee bindingsplaatsen, bijvoorbeeld één gericht tegen een tumorantigeen en één tegen het CD3-complex op T-cellen (bv. BiTEs - Bispecific T cell Engagers). Dit "herprogrammeert" T-cellen om tumorcellen te doden, door ze naar de tumor te leiden. * **Auto-immuunziekten en ontstekingsziekten:** * **Anti-cytokine therapie:** Antistoffen gericht tegen pro-inflammatoire cytokines zoals IL-1, IL-6, TNF of IL-23 kunnen ontstekingsprocessen onderdrukken. Dit is nuttig bij aandoeningen zoals idiopathische trombopenie (ITP). * **Behandeling van auto-immuunziekten:** Gebruik van gammaglobulines kan een therapeutisch effect hebben, mogelijk via blokkade van inhibitore Fc-receptoren op naïeve B-cellen. * **Transplantatie:** Anti-thymocytenglobulines (ATG) zijn polyklonale antistoffen, vaak afkomstig van konijnen na immunisatie met humane thymuscellen, en worden gebruikt om de immuunrespons te onderdrukken. #### 3.1.5 Antibody engineering Moleculaire technieken maken het mogelijk om antistoffen te modificeren voor verbeterde therapeutische eigenschappen: * **Fragmenten:** * **Fv-domein:** Het kleinste deel dat nodig is voor antigenbinding, bestaande uit VH en VL. * **scFv (single chain variable fragment):** Een Fv-fragment waarbij VH en VL verbonden zijn door een flexibele peptideketen. * **Fab (fragment antigen binding):** Verkregen via enzymatische behandeling of recombinant. * **F(ab')2 fragment:** Twee Fab-fragmenten verbonden door disulfidebruggen. * **VHH-immunoglobulines:** Afkomstig van kameelachtigen, deze bestaan uit slechts één VH-domein, wat genetische manipulatie vereenvoudigt. * **Bispecifieke antistoffen:** Zoals eerder genoemd, met twee verschillende specificiteiten, bijvoorbeeld gericht op een tumorantigeen en het CD3-complex. * **Half-life extending (HLE):** Koppeling aan structuren zoals HLE kan de verblijftijd van antistoffen in het lichaam verlengen door te voorkomen dat ze snel worden uitgescheiden via de glomerulus. ### 3.2 Diagnostiek van anemie door rode bloedceldestructie Hemolytische ziekten bij pasgeborenen, ook wel icterus neonatorum genoemd, treden op wanneer antistoffen van de moeder de rode bloedcellen van het kind aantasten, wat leidt tot hemolyse. #### 3.2.1 Resusfactor (Rh) en ABO-incompatibiliteit * **Resus-incompatibiliteit:** Een rhesus-negatieve moeder die een rhesus-positief kind draagt, kan antistoffen (meestal IgG) aanmaken, vooral bij een volgende zwangerschap of na bloedcontact. Deze IgG-antilichamen kunnen de placenta passeren en de rode bloedcellen van het kind aantasten (RhD), wat leidt tot hemolyse en geelzucht. Dit kan ernstige gevolgen hebben voor de foetus of pasgeborene. Preventie, zoals het toedienen van anti-D immunoglobuline aan de moeder, is cruciaal. * **ABO-incompatibiliteit:** Moeders met bloedgroep O kunnen spontaan anti-A en anti-B antistoffen (soms IgG) produceren. Deze kunnen de placenta passeren en, hoewel meestal minder ernstig dan Rh-incompatibiliteit, geelzucht veroorzaken door hemolyse van rode bloedcellen van het kind. #### 3.2.2 Kell-incompatibiliteit Kell-incompatibiliteit is zeldzamer maar kan ernstigere gevolgen hebben dan Rh-incompatibiliteit. Antistoffen tegen Kell-bloedgroepantigenen kunnen de rode bloedcellen van de foetus aanvallen. #### 3.2.3 Diagnose: de directe Coombs-test * **Principe:** De directe Coombs-test wordt gebruikt om IgG-antilichamen op het oppervlak van de rode bloedcellen van het kind te detecteren. * **Uitvoering:** Rode bloedcellen van het kind worden gewassen. Vervolgens wordt een anti-humaan IgG-antilichaam (vaak konijn-anti-humaan IgG) toegevoegd. * **Positieve test:** Als er IgG-antilichamen op de rode bloedcellen van het kind gebonden zijn, zal het toegevoegde anti-humaan IgG een kruisbinding veroorzaken, leidend tot agglutinatie (vorming van een "koek"). * **Interpretatie:** Agglutinatie duidt op de aanwezigheid van antistoffen gemedieerde hemolyse. > **Tip:** De directe Coombs-test is essentieel voor het diagnosticeren van hemolytische ziekten bij pasgeborenen veroorzaakt door antistofgemedieerde destructie van rode bloedcellen. ### 3.3 Transfer van virale immuniteit Bij patiënten met immuundeficiëntie, bijvoorbeeld na transplantatie, kan reactivatie van virussen zoals Cytomegalovirus (CMV) optreden. #### 3.3.1 Passieve CMV-immunisatie * **CMV-specifieke antistoffen:** De toediening van CMV-specifieke antistoffen is de eenvoudigste benadering. Deze zijn gemakkelijk toe te dienen, veroorzaken geen immuunreactie en zijn bruikbaar voor alle patiënten. * **Beperking:** Omdat CMV een intracellulair pathogeen is, zijn antistoffen minder effectief in het genezen van de infectie, maar kunnen ze wel de replicatie controleren. #### 3.3.2 CMV-specifieke T-cel transfer * **Principe:** De overdracht van specifieke T-cellen die in staat zijn CMV te bestrijden. * **Uitdagingen:** T-celtransfers vereisen HLA-identieke donoren, waardoor het niet voor iedereen toepasbaar is. De cellen moeten ook tolerant zijn voor de ontvangende gastheer. * **Isolatie van CMV-specifieke T-cellen:** * **Op basis van HLA-tetrameren:** Isolatie van T-cellen (bijvoorbeeld CD8+) die herkennen via specifieke HLA-moleculen (bv. HLA-A2) en een immunodominant CMV-peptide. Dit is efficiënt maar beperkt tot patiënten met die specifieke HLA-typering. * **Op basis van IFN-$\gamma$ productie:** Isolatie van T-cellen (zowel CD4+ als CD8+) die interferon-gamma (IFN-$\gamma$) produceren na stimulatie met CMV-peptiden. Dit is omslachtiger maar breder toepasbaar. * **Effectiviteit:** Slechts enkele duizenden cellen per kilogram lichaamsgewicht kunnen voldoende zijn voor genezing. > **Voorbeeld:** Een patiënt na een stamceltransplantatie is immuungecompromitteerd en vatbaar voor CMV-reactivatie. Het isoleren van CMV-specifieke T-cellen van een CMV-seropositieve stamceldonor en deze transfunderen naar de patiënt kan de infectie effectief bestrijden. ### 3.4 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA is een fundamentele techniek voor het detecteren en kwantificeren van eiwitten, waaronder virussen, antistoffen, hormonen en toxines. * **Principe:** Maakt gebruik van de specificiteit van antigeen-antilichaamreacties, gekoppeld aan een enzymatische kleurreactie voor detectie. * **Typische opzet (sandwich ELISA):** 1. Een antigeen (bv. HBsAg van Hepatitis B) wordt gebonden aan de wand van een microtiterplaatputje. 2. Serum van de patiënt wordt toegevoegd. Indien antistoffen tegen het antigeen aanwezig zijn, binden deze. 3. Na uitwassen wordt een detectie-antilichaam (bv. anti-humaan Ig) gekoppeld aan een enzym toegevoegd. Dit bindt aan de reeds gebonden antistoffen. 4. Na opnieuw uitwassen wordt een substraat voor het enzym toegevoegd. Dit resulteert in een kleurverandering in positieve putjes. * **Toepassing:** Kan worden gebruikt om te bepalen of een patiënt antistoffen heeft tegen een bepaalde ziekteverwekker (indicatie van doorgemaakte infectie of vaccinatie), maar niet om de actieve ziekte zelf direct aan te tonen (waarvoor PCR of kweek vaak nodig is). ### 3.5 Flowcytometrie (FACS) Flowcytometrie, of Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), is een techniek om cellen te kwantificeren, karakteriseren en sorteren op basis van hun oppervlakte- of intracellulaire antigenen. * **Principe:** Cellen worden individueel gemarkeerd met fluorescent gelabelde monoklonale antistoffen die specifiek binden aan bepaalde celpopulaties (bv. T-cellen, B-cellen, NK-cellen). * **Detectie:** De gelabelde cellen passeren één voor één een laserstraal. De fluorescentie van de gebonden antistoffen exciteert, en het uitgezonden licht wordt gedetecteerd. Meerdere detectoren vangen verschillende golflengten op, waardoor gelijktijdige analyse van meerdere celmarkers mogelijk is. * **Resultaat:** Er wordt een plot gegenereerd waarbij elke cel als een punt wordt voorgesteld, gekarakteriseerd door zijn fluorescentieprofiel. Dit maakt het mogelijk om celpopulaties te identificeren en te kwantificeren (bv. de verhouding tussen CD4+ en CD8+ T-cellen). * **CiteSeq en Single Cell Transcriptomics:** Geavanceerde methoden die antistoffen koppelen aan unieke oligonucleotide-codes (CiteSeq) of RNA-sequencing van individuele cellen (Single Cell Transcriptomics) mogelijk maken, om zo een zeer gedetailleerd beeld te krijgen van celpopulaties en hun transcriptieprofielen. > **Voorbeeld:** Flowcytometrie kan worden gebruikt om de aantallen T-cellen, B-cellen en NK-cellen in het bloed van een patiënt te bepalen door gebruik te maken van antistoffen tegen specifieke celmarkers zoals CD3 (T-cellen), CD20 (B-cellen) en CD56 (NK-cellen), elk gelabeld met een verschillende fluorochroom. ### 3.6 Genetisch gemodificeerde T-cellen voor therapie T-cellen kunnen genetisch worden gemodificeerd om hun specificiteit en antitumorale activiteit te verbeteren. #### 3.6.1 Transgene T-celreceptoren (TCRs) * **Principe:** T-cellen worden genetisch aangepast om een tumor-specifieke T-celreceptor (TCR) tot expressie te brengen. * **Beperking:** Deze therapie is vaak HLA-afhankelijk, wat de toepasbaarheid beperkt. TCRs kunnen zowel cytoplasmatische als nucleaire antigenen targetten. #### 3.6.2 Chimere antigeenreceptoren (CARs) * **Principe:** T-cellen worden uitgerust met een chimere antigeenreceptor (CAR), die eigenschappen van een antistof (scFv) combineert met intracellulaire signaaldomeinen. * **Voordelen:** CARs targetten oppervlakte-antigenen onafhankelijk van HLA, wat een breed toepassingsgebied biedt. * **Generaties CARs:** * **Eerste generatie:** Bevatten een signaaldomein (bv. CD3$\zeta$) dat tumorcellysis kan induceren, maar de CAR-T-cellen hebben een beperkt overlevingsvermogen in vivo. * **Tweede generatie:** Naast het CD3$\zeta$-domein bevatten ze ook een costimulatoir domein (bv. CD28 of 4-1BB). Dit leidt tot verbeterde activatie, proliferatie en langdurig overleven van de CAR-T-cellen, wat resulteert in een effectievere antitumorale respons. * **"On target, off tumor" effecten:** Een belangrijk neveneffect is dat CARs kunnen binden aan antigenen die ook op gezonde cellen voorkomen, wat kan leiden tot toxiciteit (bv. bij targeting van CD20 op gezonde B-cellen). * **Cytokinestorm:** Een ernstige, potentieel dodelijke reactie na CAR-T-celtherapie, veroorzaakt door een massale vrijgave van cytokines. Behandeling met anti-IL6 antistoffen kan hierbij waardevol zijn. > **Voorbeeld:** Bij de behandeling van B-cellymfomen kunnen patiënten hun eigen T-cellen worden afgenomen, genetisch worden aangepast om CARs te produceren die CD19 op tumorcellen herkennen, en vervolgens worden teruggeïnfuseerd. --- --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Immunoglobulines | Immuunglobulines, ook wel gammaglobulines genoemd, zijn opgezuiverde antilichamen van het IgG-type die afkomstig zijn uit het bloed van donoren en worden gebruikt voor passieve immunisatie. | | Polyklonale antistoffen | Een mengsel van antilichamen dat wordt geproduceerd door verschillende B-celklonen in reactie op meerdere antigenen of epitopen van een enkel antigeen. Ze worden verkregen uit het serum van geïmmuniseerde individuen. | | Monoklonale antistoffen | Antilichamen die worden geproduceerd door één enkele B-celklon, waardoor ze zeer specifiek zijn voor één enkel epitoop op een antigeen. Ze worden vaak geproduceerd via hybridoma-technologie. | | Gehumaniseerde monoklonale antistoffen | Monoklonale antistoffen waarbij de variabele domeinen van muizenantilichamen zijn vervangen door menselijke variabele domeinen, om immunogeniteit bij menselijke patiënten te verminderen. Alleen de complementair bepalende regio's (CDR's) van de muis blijven behouden. | | Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) | Een laboratoriumtest die wordt gebruikt om de aanwezigheid van een specifiek eiwit, antigeen of antistof in een monster te detecteren en kwantificeren, vaak door een enzymgekoppeld antilichaam dat een kleurreactie produceert. | | Flowcytometrie (FACS) | Een techniek die wordt gebruikt om fysieke en chemische kenmerken van deeltjes, meestal cellen, te meten en te sorteren. Celllen passeren een laserstraal en worden gedetecteerd op basis van hun fluorescentie, die wordt veroorzaakt door gelabelde antistoffen die aan specifieke celoppervlaktemoleculen binden. | | Passieve immunisatie | De overdracht van beschermende antistoffen van een geïmmuniseerd individu of dier naar een niet-geïmmuniseerd individu. Dit biedt onmiddellijke bescherming, maar is van tijdelijke aard omdat de antistoffen niet worden geproduceerd door het lichaam zelf. | | Antilichaam engineering | Het proces van het aanpassen van antilichamen met behulp van biotechnologische methoden om hun therapeutische eigenschappen, zoals specificiteit, affiniteit, stabiliteit of effectormecanismen, te verbeteren. | | Transgene T-celreceptoren (TCR) | T-cellen die genetisch gemodificeerd zijn om een extra, vaak tumor-specifieke, T-celreceptor tot expressie te brengen, waardoor hun specificiteit voor kankercellen wordt vergroot. | | Chimere antigeenreceptoren (CARs) | Kunstmatig ontworpen receptoren die op T-cellen worden geïntroduceerd om hen in staat te stellen kankercellen te herkennen en te bestrijden op een manier die onafhankelijk is van het MHC-molecuul. Ze combineren de antigeenbindende capaciteit van een antistof met signaaltransductiedomeinen. | | Cytokine storm | Een potentieel dodelijke overmatige immuunrespons gekenmerkt door de massale vrijlating van pro-inflammatoire cytokines, wat kan leiden tot orgaanfalen. Dit kan optreden na bepaalde immuuntherapieën, zoals CAR-T celtherapie. | | Hemolytische ziekte van de pasgeborene | Een aandoening waarbij antistoffen van de moeder de rode bloedcellen van de foetus of pasgeborene afbreken, wat leidt tot anemie en geelzucht. Dit kan optreden bij bloedgroep- of Rhesus-incompatibiliteit tussen moeder en kind. | | Epitopen | Specifieke delen van een antigeen waaraan antilichamen of T-celreceptoren binden. Een antigeen kan meerdere verschillende epitopen bevatten. | | Hybridoom | Een hybride cel die ontstaat door de fusie van een B-cel (antilichaam producerende cel) en een myeloomcel (kankercel). Hybridoma's zijn in staat om specifiek antilichaam te produceren en onbeperkt te delen. | | Fc receptor | Receptoren op het oppervlak van immuuncellen, zoals macrofagen en NK-cellen, die binden aan het Fc-deel van antilichamen, wat leidt tot effectorfuncties zoals fagocytose of cellyse. |