2025-26. Klinische Genetica III.pdf

# Methoden voor het opsporen van genmutaties Dit document beschrijft de verschillende technieken die gebruikt worden om veranderingen in het DNA te identificeren, waaronder PCR, Sanger sequencing en Next-Generation Sequencing. ### 1.1 Algemene benadering van genmutatie-opsporing Het opsporen van genmutaties omvat typisch twee hoofdfasen [7](#page=7): 1. **Amplificatie van het te onderzoeken DNA:** Hierbij wordt gebruik gemaakt van technieken om specifieke DNA-segmenten te vermenigvuldigen [7](#page=7). 2. **Sequenering:** Het bepalen van de exacte volgorde van de nucleotiden (basen) in het geamplificeerde DNA [7](#page=7). De belangrijkste bron van DNA voor routinematige genoomdiagnostiek is bloed (EDTA). Andere bronnen, zoals wangborstels, chorionvlokken, amniocyten, embryobiopsies, huidbiopten, tumorbiopten, beenmerg- en "liquid biopsies" worden gebruikt voor specifieke diagnostische doeleinden [7](#page=7). ### 1.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR (Polymerase Chain Reaction) is een fundamentele laboratoriumtechniek die het mogelijk maakt om snel miljoenen kopieën van een specifiek DNA-segment te produceren. Dit proces, ook wel amplificatie genoemd, maakt gebruik van korte, synthetische DNA-fragmenten, 'primers', die specifiek aan het doel-DNA binden, en meerdere cycli van DNA-synthese [8](#page=8). #### 1.2.1 Toepassingen van PCR * **Genetische diagnostiek van Ziekte van Huntington (ZvH):** PCR wordt gebruikt om de lengte van het triplet-repeatexpansie in het *HTT*-gen te bepalen. De grootte van de PCR-producten, gescheiden door gel-elektroforese, is afhankelijk van het aantal CAG-repeats [15](#page=15). * **Detectie van triplet-repeatexpansies:** Standaard PCR is niet altijd toereikend voor grote expansies, zoals bij Fragiele X (FraX). Voor deze gevallen is een gemodificeerde methode, de 'triplet-primed PCR', ontwikkeld [23](#page=23). #### 1.2.2 Triplet-primed PCR De triplet-primed PCR-methode maakt gebruik van drie primers in één reactie. Twee primers binden buiten de repeatregio om het gehele gebied te amplificeren, vergelijkbaar met standaard PCR. De derde, een chimerische primer, bindt langs de repetitieve regio en genereert meerdere amplicons die in lengte verschillen met één repeat-motief. Dit resulteert in een "stutter"-patroon op elektroforese, waardoor de hoeveelheid full-length product voor grote allelen toeneemt en de nauwkeurige detectie van repeatnummers mogelijk wordt (#page=23, 24) [23](#page=23) [24](#page=24). **Belangrijke opmerking:** Triplet-primed PCR kan grote expansies detecteren, maar het maakt geen onderscheid tussen prematuraties en volledige mutaties, en het precieze aantal repeats kan niet altijd bepaald worden. PCR heeft ook beperkingen bij fragmenten met meer dan ongeveer 120 repeatgroottes [23](#page=23). #### 1.2.3 Typen mutaties gedetecteerd met PCR-gebaseerde methoden PCR, vaak in combinatie met andere technieken, kan verschillende typen genmutaties detecteren [25](#page=25): * **Veranderingen van 1 basepaar:** Nonsense mutaties, missense mutaties, splice site mutaties, frameshift mutaties [25](#page=25). * **Betrokkenheid van meerdere baseparen:** Deleties (in-frame of out-of-frame), duplicaties (in-frame of out-of-frame), trinucleotide expansies [25](#page=25). Deze mutaties kunnen leiden tot loss-of-function, gain-of-function, of invloed hebben op genexpressie [25](#page=25). ### 1.3 Sanger Sequencing Sanger sequencing is een klassieke methode voor het bepalen van de volgorde van DNA [27](#page=27). #### 1.3.1 Principe van Sanger sequencing De methode maakt gebruik van 'chain-terminating' dideoxynucleotides (ddNTPs). ddNTPs missen een hydroxylgroep, waardoor geen fosfodiësterbinding kan worden gevormd met de volgende nucleotide, wat resulteert in het stoppen van de ketenverlenging [27](#page=27). Het proces omvat een mix van: * Single-stranded template DNA [27](#page=27). * Radioactief gelabelde primers [27](#page=27). * DNA polymerase [27](#page=27). * Gewone deoxynucleotides (dNTPs) [27](#page=27). * Eén type ddNTP [27](#page=27). Na primerhybridisatie voegt DNA polymerase vrije bases toe. Wanneer een ddNTP wordt ingebouwd, stopt de ketengroei. De resulterende DNA-fragmenten van verschillende lengtes worden gescheiden door gel-elektroforese [27](#page=27). #### 1.3.2 Voordelen en nadelen van Sanger sequencing **Voordelen:** * Hoge sensitiviteit, beschouwd als de gouden standaard [29](#page=29). * Eenvoudige workflow [29](#page=29). * Relatief lange reads (ongeveer 700 bp) [29](#page=29). **Nadelen:** * Arbeidsintensief [29](#page=29). * Hoge kost per gesequeneerd nucleotide [29](#page=29). * Lage doorvoer (throughput) [29](#page=29). * Kan geen grote deleties/duplicaties en structurele genoomherschikkingen detecteren [29](#page=29). #### 1.3.3 Huidige toepassingen van Sanger sequencing * Diagnostiek van single-gene disorders of single-mutation disorders [29](#page=29). * Bevestiging van sequentievarianten geïdentificeerd door Next-Generation Sequencing (NGS) [29](#page=29). * "Opvullen" van genomische regio's die door NGS niet goed gecoverd zijn [29](#page=29). * Voorbeelden zijn de diagnostiek van achondroplasie door Sanger-sequencing van het *FGFR3*-gen en voor specifieke genen bij gehoorverlies of de diagnostische workflow van TAD (Thoracic Aortic Aneurysm and Dissection) (#page=69, 72) [48](#page=48) [69](#page=69) [72](#page=72). ### 1.4 Next-Generation Sequencing (NGS) Next-Generation Sequencing (NGS) technieken maken gebruik van micro- en nanotechnologie om 'massive parallel sequencing' mogelijk te maken, met aanzienlijk lagere kosten en een gereduceerde benodigde hoeveelheid staal [30](#page=30). #### 1.4.1 Principe van NGS Het basisprincipe van NGS omvat random fragmentatie van het gehele DNA in miljoenen korte fragmenten ('short reads'). Deze fragmenten worden vervolgens gemapt tegen de Humane Reference Sequence. Door de overlappende 'short reads' aan elkaar te koppelen, wordt de volledige sequentie van het te onderzoeken DNA samengesteld [32](#page=32). #### 1.4.2 Voordelen en nadelen van NGS **Voordelen:** * Genoom-wijd toepasbaar [30](#page=30). * Detecteert puntmutaties, kleine deleties/duplicaties, CNVs, chromosomale herschikkingen en mosaicisme [30](#page=30). * Lage kost per gesequeneerd nucleotide [30](#page=30). * Hoge doorvoer (throughput) [30](#page=30). * Minder staal nodig [30](#page=30). * Maakt CNV-detectie mogelijk, wat Sanger niet kan [41](#page=41). **Nadelen:** * Complexe data-analyse [30](#page=30). * Hoge opslagbehoefte voor data [30](#page=30). #### 1.4.3 Nauwkeurigheid en dekking (Coverage) bij NGS NGS-technologieën hebben een hogere kans op sequeneringsfouten dan Sanger sequencing. Daarom is de 'read depth' of 'coverage depth' (het aantal reads dat een specifieke nucleotide dekt) cruciaal om te bepalen of een waargenomen afwijking een werkelijke verandering is of een fout. Voor het opsporen van puntmutaties is een coverage van minimaal 80x aanbevolen. Bepaalde regio's in het genoom worden niet altijd goed gesequeneerd; deze 'niet-gecoverde' regio's moeten mogelijk worden aangevuld met Sanger sequencing [34](#page=34) [35](#page=35). #### 1.4.4 Toepassingen en strategieën van NGS * **Whole Genome Sequencing (WGS):** Detecteert een groot aantal varianten, maar wordt nog niet routinematig in diagnostische settings gebruikt vanwege de complexiteit. De introductie in diagnostische centra wordt verwacht [42](#page=42). * **Aanrijking (Enrichment):** Dit is een proces om specifieke doelsequenties uit het volledige genoom te selecteren voor sequencing. Dit kan variëren van enkele genen tot het gehele exoom (Whole Exome Sequencing - WES) [43](#page=43). * **Voordelen van aanrijking:** Focust op relevante data, vermindert analysecomplexiteit, verkleint het risico op incidentele bevindingen, en verlaagt de sequencingkosten [43](#page=43). * **Panelanalyse en WES:** * **Whole Exome Sequencing (WES):** Sequenering van alle exonen van alle genen, inclusief flankerende regio's. Ongeveer 85% van alle mutaties bevindt zich in de 1-2% van het genoom die codeert voor eiwitten [44](#page=44). * **Targeted Resequencing van Genpanels:** Selectieve sequencing van specifieke genen of groepen genen die geassocieerd zijn met bepaalde aandoeningen (bv. Mendeliaanse aandoeningen - 'Mendelioom'). Voorbeelden zijn de analyse van genen geassocieerd met osteogenesis imperfecta (OI) of skeletdysplasieën (#page=49, 50) [44](#page=44) [49](#page=49) [50](#page=50) [58](#page=58). * **CNV-sequenering ('CNV-seq'):** NGS maakt de detectie van Copy Number Variations (CNVs) mogelijk, wat Sanger sequencing niet kan. 'Shallow whole genome sequencing' wordt hiervoor gebruikt en vervangt de aCGH voor de detectie van microdeleties/microduplicatiesyndromen. Dit is relevant in de diagnostische workflow voor ontwikkelingsachterstand (ID/GDD) [41](#page=41) [67](#page=67). #### 1.4.5 Omgaan met VUS (Variant of Unknown Significance) Bij NGS-onderzoek kunnen varianten worden geïdentificeerd waarvan de betekenis voor de genfunctie nog onbekend is; dit zijn 'variants of unknown or uncertain significance' (VUS). Voorbeelden zijn de identificatie van een missense variant in *COL1A1* bij Familie Lotte [59](#page=59) [60](#page=60). Om de pathogeniciteit van een VUS te bepalen, worden diverse methoden gebruikt (#page=61, 63) [61](#page=61) [63](#page=63): 1. **Segregatie-analyse:** Nagaan of de variant met het fenotype binnen de familie overerft. Bij Familie Lotte pleitte segregatie-analyse tegen de pathogeniciteit van de *COL1A1* variant, wat leidde tot herclassificatie als 'likely benign' [61](#page=61) [62](#page=62). 2. **Vergelijking met referentie sequenties:** Gebruik van publieke databases zoals GnomAD, ClinVar [63](#page=63). 3. **In silico predictieprogramma's:** Modelleren van het effect op eiwitfunctie (bv. Polyphen, SIFT) [63](#page=63). 4. **Literatuuronderzoek:** Nagaan of de variant en het fenotype al gepubliceerd zijn [63](#page=63). 5. **Functionele studies:** Indien beschikbaar [63](#page=63). 6. **Aanmaken en bestuderen van specifieke cellulaire en/of diermodellen:** [63](#page=63). #### 1.4.6 Evolutie en kosten De evolutie van short-read naar long-read sequencing is gaande. Momenteel kan het volledige humane genoom in enkele uren gesequeneerd worden voor minder dan 1000 dollars [36](#page=36) [39](#page=39). #### 1.4.7 Diagnostische Workflows * **Ontwikkelingsachterstand (ID/GDD):** De diagnostische workflow kan CNV-sequencing omvatten [67](#page=67). * **Gehoorverlies:** Kan aanvankelijk worden onderzocht met Sanger sequencing van een specifiek gen, maar een gerichte genpanelanalyse via NGS (>120 genen) is een veelgebruikte methode [69](#page=69). * **TAD (Thoracic Aortic Aneurysm and Dissection):** Naast Sanger sequencing van specifieke genen, wordt een gerichte genpanelanalyse via NGS ingezet [72](#page=72). > **Tip:** Bij het interpreteren van NGS-resultaten is het essentieel om rekening te houden met de coverage depth om valse positieven te minimaliseren en om een systematische aanpak te volgen bij het beoordelen van VUS, zoals segregatie-analyse en databases. --- # Erfelijke aandoeningen door triplet repeat expansies Erfelijke aandoeningen door triplet repeat expansies worden veroorzaakt door een onstabiele toename van het aantal herhalingen van drie nucleotiden in het DNA, wat leidt tot diverse pathologische gevolgen [2](#page=2). ### 2.1 Algemene principes van triplet repeat expansies Triplet repeat expansies vallen onder de categorie van mutaties waarbij meerdere baseparen betrokken zijn. Deze expansies kunnen leiden tot [25](#page=25) [3](#page=3): * Een abnormale hoeveelheid van een proteïne (te weinig of te veel) [2](#page=2). * Een verstoring van de functie van een proteïne, resulterend in loss-of-function of gain-of-function mechanismen [25](#page=25) [3](#page=3). * Een verstoring van het expressiepatroon van een proteïne [2](#page=2). Deze dynamische mutaties kunnen door opeenvolgende generaties heen toenemen in aantal repeats, wat leidt tot anticipatie. Dit manifesteert zich als een toename van de ernst van de aandoening en een jongere leeftijd van aanvang in opeenvolgende generaties [14](#page=14). ### 2.2 Ziekte van Huntington (ZvH) #### 2.2.1 Oorzaak en overerving De ziekte van Huntington is een autosomaal dominante aandoening. De oorzaak is een heterozygote CAG triplet repeat expansie in exon 1 van het HTT gen, dat codeert voor het Huntingtin-proteïne [13](#page=13). #### 2.2.2 Pathomechanisme Het pathomechanisme berust op een toxische gain-of-function door de vorming van Huntingtin-inclusies in de neuronen [13](#page=13). #### 2.2.3 Genotype-fenotype correlatie Er is een duidelijke correlatie tussen het aantal CAG-repeats en de fenotypische expressie: * **10-26 CAGs:** Normaal allel [13](#page=13). * **27-35 CAGs:** Intermediair allel. Dragers van dit allel ontwikkelen geen symptomen, maar de volgende generatie heeft een verhoogd risico op expansie [13](#page=13). * **36-39 CAGs:** Gereduceerde penetrantie. Er is een verhoogd risico op de ziekte, maar de persoon kan asymptomatisch blijven [13](#page=13). * **> 40 CAGs:** Volledige penetrantie, resulterend in de ziekte van Huntington met een leeftijd van aanvang in de volwassenheid [13](#page=13). * **> 70 repeats:** Juveniele vorm van de ziekte van Huntington [13](#page=13). #### 2.2.4 Dynamische aard en transmissie Triplet repeat expansies zijn dynamische mutaties, wat betekent dat het aantal repeats door opeenvolgende generaties kan toenemen. Uitzonderlijk kan er ook retractie (inkrimping) van het aantal repeats optreden. Bij de ziekte van Huntington vindt de expansie voornamelijk plaats via paternele transmissie [14](#page=14). ### 2.3 Fragiel X syndroom Het fragiel X syndroom is de meest frequente erfelijke oorzaak van X-gebonden verstandelijke beperking bij jongens [17](#page=17). #### 2.3.1 Overerving en prevalentie Het syndroom wordt X-gebonden dominant overgeërfd en heeft een prevalentie van ongeveer 1 op 4000 jongens [17](#page=17). #### 2.3.2 Klinische kenmerken De diagnose wordt primair gesteld op basis van klinische kenmerken, die kunnen variëren: * Mentale retardatie [17](#page=17). * Faciale dysmorfieën: langwerpig gelaat, grote oren, prominente kin en ogivaal verhemelte [17](#page=17). * Macro-orchidie [17](#page=17). * Gedragsstoornissen, vooral bij jonge kinderen [17](#page=17). Het "fragiele site" is een locatie waar het chromatine tijdens de meiose niet adequaat condenseert [17](#page=17). #### 2.3.3 Moleculaire basis Het syndroom wordt veroorzaakt door het FMR1 gen (Fragile-X Mental Retardation-1), gelegen op Xq27.3. De mutatie betreft een expanderende CGG triplet repeat in de 5' UTR van het FMR1 gen, in de promotorregio [18](#page=18). * **Normale allelen:** 6-54 CGG repeats [18](#page=18). * **Premutatie allelen:** 55-200 CGG repeats. Deze kunnen leiden tot FXTAS (Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome, vooral bij mannen) en FXPOI (Fragile X-associated Premature Ovarian Insufficiency, bij vrouwen) [18](#page=18) [21](#page=21). * **Full mutatie allelen:** Meer dan 200 CGG repeats [18](#page=18). #### 2.3.4 Methylatie en genexpressie Overmatige methylatie van cytosines in de FMR1 promotor leidt tot inactivatie van het gen en dus afwezigheid van genexpressie. De mate van methylatie correleert met de ernst van de mentale retardatie. Mannen vertonen altijd het fragiel X syndroom, terwijl vrouwen een variërende mate van milde tot matige mentale retardatie kunnen ervaren (30% met MR, 50-70% met een IQ < 85) [18](#page=18). #### 2.3.5 Instabiliteit en transmissie De CGG repeats zijn meiotisch en mitotisch instabiel. De meiotische instabiliteit treedt alleen op na maternele transmissie, in tegenstelling tot de ZvH. Expansie van een premutatie naar een volledige mutatie vindt voornamelijk plaats bij vrouwelijke draagsters. De kans op expansie van een premutatie correleert met het aantal CGG repeats [19](#page=19). Mannelijke premutatie-dragers geven de premutatie door aan al hun dochters zonder verdere expansie; dit worden "normal transmitting males" genoemd. De "Sherman paradox" beschrijft de observatie dat de dochter van een gezonde mannelijke drager een grotere kans heeft op zonen met fragiel X dan de moeder van deze gezonde drager [19](#page=19). ### 2.4 Premutaties in FMR1: FXTAS en FXPOI #### 2.4.1 FXTAS FXTAS is een late-onset neurodegeneratieve aandoening die vooral mannen treft. Het wordt veroorzaakt door een CGG repeat expansie in de premutation range (55-200) in het FMR1 gen. Klinische kenmerken zijn variabel en kunnen cerebellaire ataxie, intentietremor, frontale "executive" dysfunctie, hersenatrofie, mild parkinsonisme, perifere neuropathie, psychiatrische symptomen (depressie, angst, agitatie) en autonome dysfunctie omvatten [21](#page=21). #### 2.4.2 FXPOI FXPOI (premature ovarian insufficiency) wordt gemeld bij 20-25% van de vrouwelijke premutatie-draagsters. Omgekeerd heeft circa 2-15% van de vrouwen met POI een premutatie in FMR1. Klinische kenmerken zijn POI, onregelmatige menstruaties, subfertiliteit, verhoogde FSH-waarden en vroegtijdige menopauze [21](#page=21). ### 2.5 Diagnostiek De diagnostiek van erfelijke aandoeningen door triplet repeat expansies kan bestaan uit technieken zoals (triplet-primed) PCR en PCR gevolgd door sequencing. Voor patiënten met een vermoeden van een genetische oorzaak van verstandelijke beperking, zoals in het geval van Oscar (30 maanden), wordt vaak een uitgebreide diagnostische flow gevolgd, beginnend met karyotypering, triplet repeat PCR voor fragiel X, en eventueel CNV-analyse (arrayCGH). Indien deze resultaten negatief zijn, kan een breder genpanel of whole exome sequencing (WES) worden overwogen [25](#page=25) [65](#page=65). > **Tip:** Bij verdenking op een erfelijke aandoening met verstandelijke beperking is het cruciaal om de uitgebreide diagnostische mogelijkheden, van basis genetische tests tot meer gespecialiseerde panels, te overwegen. De genetische basis is in ongeveer 50% van de gevallen van verstandelijke beperking aanwezig [66](#page=66). --- # Diagnostische workflows voor specifieke genetische aandoeningen Hieronder volgt een gedetailleerde studiehandleiding over diagnostische workflows voor specifieke genetische aandoeningen, gebaseerd op de verstrekte documentatie. ## 3 Diagnostische workflows voor specifieke genetische aandoeningen Dit hoofdstuk belicht de stappen die worden doorlopen in de diagnostische procedure voor verschillende genetische ziekten, met een focus op de inzet van moleculaire technieken. ### 3.1 Ziekte van Huntington (ZvH) De ziekte van Huntington is een neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door een triade van motorische, cognitieve en psychiatrische symptomen. De prevalentie in Europa is ongeveer 1 op 10.000. De gemiddelde leeftijd van aanvang is tussen de 35 en 45 jaar, met een prodromale fase die tot 15 jaar voor de klinische onset kan beginnen. De ziekte heeft een mediane overlevingstijd van 15-20 jaar na het begin van de symptomen [11](#page=11) [12](#page=12). #### 3.1.1 Moleculaire oorzaak en genotype-fenotype correlatie De oorzaak van de ziekte van Huntington is een heterozygote CAG triplet repeat expansie in exon 1 van het HTT gen. Dit is een autosomaal dominante aandoening waarbij een toxische gain-of-function van het Huntingtin-eiwit in neuronen centraal staat. Er is een duidelijke genotype-fenotype correlatie [13](#page=13): * 10-26 CAGs: Normaal allel [13](#page=13). * 27-35 CAGs: Intermediair allel, geen symptomen, maar verhoogd risico voor volgende generatie [13](#page=13). * 36-39 CAGs: Gereduceerde penetrantie, verhoogd risico maar kan asymptomatisch blijven [13](#page=13). * > 40 CAGs: Volledige penetrantie, leidt tot de ziekte met een aanvang op volwassen leeftijd [13](#page=13). * > 70 repeats: Juveniele vorm van de ziekte [13](#page=13). Triplet repeat expansies zijn dynamische mutaties die door opeenvolgende generaties kunnen toenemen, wat leidt tot anticipatie: een toename van ernst en een jongere leeftijd van aanvang in opeenvolgende generaties. Deze expansie vindt voornamelijk plaats via paternele transmissie [14](#page=14). #### 3.1.2 Diagnostiek van de ziekte van Huntington De genetische diagnose van de ziekte van Huntington wordt gesteld via Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR-producten worden gescheiden op basis van grootte (moleculair gewicht) middels gel-elektroforese. Het is belangrijk op te merken dat triplet repeat expansies niet worden gedetecteerd door standaard Next-Generation Sequencing (NGS) gen panel tests of Whole Exome Sequencing (WES) [15](#page=15). > **Tip:** De dynamische aard van triplet repeat expansies is cruciaal voor het begrijpen van anticipatie en de mogelijkheid van grotere expansies in opeenvolgende generaties. ### 3.2 Fragiel X syndroom Het fragiel X syndroom is de meest frequente erfelijke oorzaak van X-gebonden verstandelijke beperking bij jongens. Het wordt gekenmerkt door mentale retardatie, specifieke faciale kenmerken (langwerpig gelaat, grote oren, prominente kin), ogivaal verhemelte en macro-orchidie bij mannen. Gedragsstoornissen zijn frequent bij jonge kinderen [17](#page=17). #### 3.2.1 Moleculaire basis Het syndroom wordt veroorzaakt door een expansie van CGG repeats in de 5' UTR van het FMR1 gen op chromosoom X [18](#page=18). * Normale allelen: 6-54 CGG repeats [18](#page=18). * Premutatie allelen: 55-200 CGG repeats, geassocieerd met Fragile X-associated Tremor/Ataxia Syndrome (FXTAS) bij mannen en Premature Ovarian Insufficiency (POI) bij vrouwen [18](#page=18) [20](#page=20) [21](#page=21). * Full mutatie allelen: > 200 CGG repeats, leidend tot het fragiel X syndroom [18](#page=18). Overmatige methylatie van cytosines in de FMR1 promotor leidt tot inactivatie en afwezigheid van genexpressie. De mate van methylatie correleert met de ernst van de mentale retardatie. Mannen met een full mutatie vertonen altijd het fragiel X syndroom, terwijl bij vrouwen de ernst kan variëren [18](#page=18). #### 3.2.2 Dynamiek van premutaties en de "Sherman paradox" CGG repeats zijn meiotisch en mitotisch instabiel. Meiotische instabiliteit treedt op bij maternele transmissie, waarbij een premutatie kan expanderen naar een volledige mutatie. Mannelijke premutatie-dragers geven de premutatie door aan hun dochters zonder expansie. De "Sherman paradox" beschrijft de observatie dat dochters van een gezonde mannelijke drager een grotere kans hebben op zonen met Fragiel X syndroom dan de moeder van die mannelijke drager [19](#page=19). #### 3.2.3 Diagnostiek van het fragiel X syndroom Voor de diagnostiek wordt vaak gebruik gemaakt van een gemodificeerde PCR-methode, genaamd triplet-primed PCR. Deze methode kan grote expansies opsporen, maar laat niet altijd onderscheid maken tussen premutaties en full mutaties, noch het precieze aantal repeats bepalen. Standaard PCR werkt minder goed voor fragmenten met meer dan 120 repeat sizes, terwijl full mutaties bij Fragiel X tot meer dan 1000 CGG repeats kunnen bevatten [23](#page=23). ### 3.3 Diverse mutatietypes en diagnostische methoden Genetische aandoeningen kunnen veroorzaakt worden door verschillende soorten mutaties, variërend van veranderingen van één basepaar (nonsense, missense, splice site, frameshift) tot betrokkenheid van meerdere baseparen (deleties, duplicaties, trinucleotide expansies). Deze mutaties kunnen leiden tot loss-of-function, gain-of-function of invloed hebben op genexpressie. De diagnostiek kan gebruik maken van PCR, PCR met sequencing, en triplet-primed PCR, afhankelijk van het type mutatie [25](#page=25). ### 3.4 Next-Generation Sequencing (NGS) en toepassingen NGS heeft de mogelijkheden voor genetische diagnostiek aanzienlijk uitgebreid [41](#page=41). #### 3.4.1 Copy Number Variation (CNV) sequencing NGS maakt het mogelijk om CNVs (Copy Number Variants) op te sporen via CNV-sequenering, ook wel 'shallow whole genome sequencing' genoemd. Deze techniek vervangt steeds vaker array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) voor de detectie van microdeletie- en microduplicatiesyndromen [41](#page=41). #### 3.4.2 Big Data en WGS NGS-technieken genereren grote hoeveelheden data. Whole Genome Sequencing (WGS) detecteert miljoenen single nucleotide varianten en honderdduizenden kleine insertie/deletie varianten. Hoewel WGS nog niet standaard in de diagnostiek wordt gebruikt vanwege de complexiteit, wordt de introductie in diagnostische centra verwacht [42](#page=42). #### 3.4.3 DNA-aanrijking en gerichte analyse Aanrijking ("enrichment") is het selecteren van specifieke DNA-sequenties uit het gehele genoom die gesequenced moeten worden. Dit kan variëren van enkele genen tot het gehele exoom (Whole Exome Sequencing, WES). Voordelen hiervan zijn [43](#page=43): * Enkel relevante data [43](#page=43). * Minder complexe analyse (geen non-coding DNA) [43](#page=43). * Geen risico op onverwachte bevindingen [43](#page=43). * Lagere sequencingkosten [43](#page=43). #### 3.4.4 Panelanalyse en WES Toepassingen van NGS met aanrijking omvatten targeted resequencing van genpanels (variërend van enkele genen tot alle genen geassocieerd met mendeliaanse aandoeningen, ook wel 'mendelioom' genoemd) en WES. Ongeveer 85% van alle mutaties bevindt zich in de 1-2% van het genoom die codeert voor eiwitten [44](#page=44). ### 3.5 Achondroplasie Achondroplasie is de meest frequente vorm van erfelijke, niet-proportionele kleine gestalte. Het wordt gekenmerkt door disproportionele kleine gestalte, craniofaciale kenmerken (groot hoofd, midface hypoplasie) en musculoskeletale kenmerken (rhizomelische verkorting van ledematen, trident handconfiguratie, genu vara) [46](#page=46) [47](#page=47). #### 3.5.1 Overerving en oorzaak Achondroplasie is een autosomaal dominante aandoening. Meer dan 80% van de patiënten heeft ouders met een normale gestalte, wat duidt op een de novo mutatie die geassocieerd is met gevorderde paternele leeftijd bij conceptie. De aandoening wordt in >99% van de gevallen veroorzaakt door een specifieke Glycine naar Arginine substitutie in het FGFR3 gen (c.1138G>A; p.G380R) [47](#page=47). #### 3.5.2 Diagnostiek van achondroplasie De labodiagnostiek van achondroplasie kan worden uitgevoerd middels Sanger-sequencing van het specifieke exon van het FGFR3 gen waarin de meest voorkomende mutatie zich bevindt. Dit kan de diagnose van achondroplasie bevestigen [48](#page=48). ### 3.6 Skeletdysplasieën Skeletdysplasieën vormen een groep van meer dan 450 verschillende aandoeningen die veroorzaakt worden door mutaties in diverse genen. Er is vaak klinische overlap tussen deze aandoeningen. Meestal worden ze veroorzaakt door puntmutaties of kleine deleties, en in minder dan 5% van de gevallen door CNVs [49](#page=49). #### 3.6.1 Diagnostiek van skeletdysplasieën De labodiagnostiek voor skeletdysplasieën kan plaatsvinden middels NGS targeted gene panel analyse, waarbij een aanrijking plaatsvindt van alle bekende genen geassocieerd met skeletdysplasie of een specifieke selectie daarvan [50](#page=50). ### 3.7 Osteogenesis Imperfecta (OI) Osteogenesis Imperfecta (OI) is een aandoening die gekenmerkt wordt door botfragiliteit met multiple fracturen door laag-energetisch trauma of spontaan. Andere kenmerken kunnen zijn: relatief kleine gestalte, blauwe sclerae, hypermobiliteit, gehoorverlies, dentinogenesis imperfecta en een driehoekig gelaat [53](#page=53). #### 3.7.1 Moleculaire basis van OI OI wordt voornamelijk veroorzaakt door aberrante productie van collageen type I, dat is opgebouwd uit COL1A1 en COL1A2 genen. Glycine speelt een cruciale rol in het triple helix domein van collageen; elke derde aminozuur is een glycine. Substitutie van glycine door een ander aminozuur verstoort de helixstructuur, wat leidt tot OI [54](#page=54). Er zijn twee belangrijke mechanismen die kunnen leiden tot OI: * **Dominant-negatieve mutaties:** Deze produceren een abnormaal genproduct dat interfereert met de functie van het normale wild-type allel [55](#page=55). * **Haplo-insufficiëntie:** Dit treedt op wanneer de totale hoeveelheid genproduct (eiwit) ongeveer de helft is van de normale hoeveelheid, wat onvoldoende is voor een normale celfunctie. Mutaties die een prematuur terminatiecodon introduceren (nonsense, frameshift) kunnen leiden tot nonsense-mediated decay van het mRNA [56](#page=56). #### 3.7.2 Genotype-fenotype correlatie en diagnostiek Er is een genotype-fenotype correlatie bij OI; glycine substituties leiden vaak tot ernstigere vormen van OI, terwijl de introductie van een prematuur terminatiecodon (PTC) in COL1A1 doorgaans mildere vormen veroorzaakt. 85% van de gevallen van OI wordt veroorzaakt door mutaties in COL1A1 en COL1A2, terwijl de overige 15% door andere genen wordt veroorzaakt. De labodiagnostiek omvat NGS targeted gene panel analyse van genen geassocieerd met OI [57](#page=57) [58](#page=58). #### 3.7.3 Interpretatie van genetische varianten Na identificatie van een variant, zoals een niet-glycine missense variant in COL1A1 (bv. p.Arg312Cys), is het van belang de pathogeniciteit na te gaan. Dit kan gebeuren door [59](#page=59): 1. **Segregatie-analyse:** Nagaan of de variant samen met het fenotype overerft binnen de familie. Als de variant niet segregeert met het fenotype, kan deze geherclassificeerd worden als 'likely benign'. Cave: non-penetrantie moet in acht worden genomen [61](#page=61) [62](#page=62). 2. Vergelijking met referentie sequenties in publieke databases (bv. Gnomad, Clinvar) [63](#page=63). 3. In silico predictieprogramma's die het effect op eiwitfunctie modelleren (bv. Polyphen, SIFT) [63](#page=63). 4. Literatuuronderzoek naar gepubliceerde gevallen en geassocieerde fenotypes [63](#page=63). 5. Functionele studies [63](#page=63). 6. Aanmaken en bestuderen van specifieke cellulaire en/of diermodellen [63](#page=63). Een variant waarvan de betekenis voor de functie of homeostase van een organisme niet bekend is, wordt geclassificeerd als een 'variant of unknown or uncertain significance' (VUS) [60](#page=60). ### 3.8 Diagnostische workflows voor specifieke syndromen #### 3.8.1 Verstandelijke beperking/vertraagde ontwikkeling Bij een verdenking op verstandelijke beperking of vertraagde ontwikkeling (Global Developmental Delay/Intellectual Deficit) is er vaak een genetische component. De diagnostische workflow kan beginnen met een karyotypering, triplet-primed PCR voor Fragiel X en CNV-sequencing (arrayCGH). Indien deze tests normaal uitvallen, kan verder onderzoek met een uitgebreid genpanel (bv. > 1200 genen) of WES geïndiceerd zijn. De prevalentie van GDD/ID in de algemene bevolking is ongeveer 1,5-2% [65](#page=65) [66](#page=66). #### 3.8.2 Gehoorsverlies Ongeveer 50% van het congenitale gehoorsverlies of gehoorsverlies op kinderleeftijd is genetisch bepaald. Dit kan syndromaal zijn (geassocieerd met andere aandoeningen zoals Osteogenesis Imperfecta) of niet-syndromaal. De diagnostiek kan starten met Sanger-sequencing van een specifiek gen, of een targeted gen panel analyse (NGS) met meer dan 120 genen geassocieerd met gehoorsverlies [68](#page=68) [69](#page=69). #### 3.8.3 Thoracaal aorta aneurysma (TAD) Thoracale aorta aandoeningen kunnen syndromaal (bv. Marfan syndroom, Loeys-Dietz syndroom) of niet-syndromaal zijn. Bij niet-syndromale patiënten wordt in ongeveer 30% van de gevallen een mutatie gevonden in gekende genen, zeker bij jong optreden of familiale voorkomen. De diagnostiek kan bestaan uit Sanger-sequencing van een specifiek gen of een targeted gen panel analyse (NGS) met genen zoals ACTA2, COL3A1, FBN1, en TGFBR1/2 [70](#page=70) [72](#page=72). > **Voorbeeld:** Bij de familie Peter werd de verdenking op de ziekte van Huntington gesteld op basis van de symptomen (depressie, geheugenstoornissen, ongecontroleerde bewegingen) en familiale anamnese. Dit leidde tot genetische diagnostiek middels PCR gericht op de CAG repeat expansie in het HTT gen [10](#page=10) [15](#page=15) [9](#page=9). > **Voorbeeld:** Bij de familie Lotte met een geschiedenis van multiple fracturen en slechte tanden werd osteogenesis imperfecta (OI) vermoed. De diagnostiek omvatte NGS targeted panel analyse, waarbij een variant in COL1A1 werd geïdentificeerd. De pathogeniciteit werd verder onderzocht middels segregatie-analyse [51](#page=51) [59](#page=59) [61](#page=61) [62](#page=62). --- # Variantclassificatie en pathogeniciteitsbepaling Deze sectie behandelt de classificatie van genetische varianten en de methoden om hun pathogeniciteit, oftewel hun vermogen om ziekte te veroorzaken, vast te stellen. ### 4.1 Concepten van varianten en hun effecten * **Dominant-negatieve mutatie**: Dit zijn mutaties die coderen voor de productie van een abnormaal genproduct dat interfereert met de functie van het normale (wild-type) allel. Een voorbeeld hiervan is bij collageen I, dat bestaat uit twee alpha1-ketens en één alpha2-keten [55](#page=55). * **Haplo-insufficiëntie**: Hierbij is de totale hoeveelheid genproduct (eiwit) die door de cel wordt aangemaakt, ongeveer de helft van de normale hoeveelheid, wat onvoldoende is om een normale celfunctie te garanderen. Dit kan bijvoorbeeld optreden bij mutaties die een prematuur termination codon (PTC) introduceren, zoals nonsense- of frameshift-mutaties, welke leiden tot nonsense-mediated decay van het mRNA met de PTC [56](#page=56). * **Genotype-fenotype correlatie**: De relatie tussen het genetische profiel (genotype) en de waarneembare kenmerken (fenotype) is complex. Voorbeelden zoals osteogenesis imperfecta (OI) illustreren dit, waarbij glycine substituties en de introductie van een PTC in COL1A1 kunnen leiden tot ernstige of mildere vormen van OI [57](#page=57). ### 4.2 Classificatie van genetische varianten * **Variant of unknown or uncertain significance (VUS)**: Een variant van een gen die is geïdentificeerd met behulp van een genetische test, waarvan de betekenis voor de functie of de homeostase van een organisme nog onbekend is. Bijvoorbeeld, na Next-Generation Sequencing (NGS) van een OI-genpanel of een skeletdysplasie genpanel, kan een niet-glycine missense variant in COL1A1, zoals p.Arg312Cys, worden geïdentificeerd, waarbij het effect op de eiwitfunctie initieel niet bekend is [59](#page=59) [60](#page=60) [63](#page=63). > **Tip:** Het correct classificeren van varianten, met name VUS, is cruciaal voor de klinische interpretatie en patiëntenzorg. ### 4.3 Methodes voor pathogeniciteitsbepaling Wanneer een variant wordt geïdentificeerd, zoals de niet-glycine missense variant p.Arg312Cys in COL1A1, zijn er verschillende methoden om de pathogeniciteit ervan te onderzoeken [61](#page=61) [63](#page=63). * **1. Segregatie-analyse**: Dit omvat het nagaan of de geïdentificeerde variant zich binnen een familie samen met het fenotype overerft [61](#page=61). * Indien de variant samen met het fenotype wordt overerfd, is dit een argument *pro* pathogeniciteit [61](#page=61). * Indien de variant niet samen met het fenotype wordt overerfd, is dit een argument *contra* pathogeniciteit [61](#page=61). * **Cave**: Non-penetrantie kan de interpretatie van segregatie-analyse compliceren. > **Voorbeeld**: In de familie Lotte leidde segregatie-analyse voor de p.Arg312Cys variant tot een resultaat dat tegen pathogeniciteit pleitte. Hierdoor werd de variant geherclassificeerd als 'likely benign' (klasse 2), wat impliceert dat het niet de oorzaak was van het fenotype in deze familie [62](#page=62). * **2. Vergelijking met referentie sequenties in publieke databases**: Dit houdt in dat de frequentie van de variant in algemene populaties wordt vergeleken met behulp van databases zoals GnomAD en ClinVar. Een hoge frequentie in de algemene populatie suggereert vaak dat de variant benign is [63](#page=63). * **3. In silico predictieprogramma's**: Deze programma's, zoals PolyPhen en SIFT, modelleren het effect van een variant op de eiwitfunctie en voorspellen de mogelijke pathogeniciteit [63](#page=63). * **4. Literatuuronderzoek**: Nagaan of de variant en het geassocieerde fenotype reeds in de wetenschappelijke literatuur zijn gepubliceerd [63](#page=63). * **5. Functionele studies**: Indien beschikbaar, kunnen experimentele studies die de functie van het eiwit onderzoeken, inzicht geven in de impact van de variant [63](#page=63). * **6. Aanmaken en bestuderen van specifieke cellulaire en/of diermodellen**: In sommige gevallen kunnen specifieke modellen worden ontwikkeld om de effecten van een variant verder te onderzoeken [63](#page=63). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Genmutatie | Een permanente verandering in de sequentie van het DNA. Dit kan variëren van kleine veranderingen in een enkele DNA-basis tot grote veranderingen die een heel chromosoom aantasten. | | Chromosomale afwijking | Een verandering in het aantal of de structuur van chromosomen. Dit kan numeriek zijn (bv. trisomie) of structureel (bv. deletie, duplicatie, translocatie). | | Puntmutatie | Een verandering in één enkele nucleotide base in het DNA. Dit kan leiden tot een nonsense-, missense- of silent mutatie. | | Trinucleotide expansie | Een type mutatie waarbij een reeks van drie nucleotiden herhaald wordt. Wanneer het aantal herhalingen toeneemt, kan dit leiden tot genetische aandoeningen. | | Deletie | Het verlies van een deel van een chromosoom of een deel van een DNA-sequentie. Deleties kunnen klein (een paar basenparen) of groot (een heel gen of deel van een chromosoom) zijn. | | Duplicatie | Het verdubbelen van een deel van een chromosoom of een deel van een DNA-sequentie. Dit kan leiden tot genetische onevenwichtigheden en gezondheidsproblemen. | | Loss-of-function | Een type mutatie die resulteert in een verminderde of afwezige functie van een eiwit. Dit kan komen door verminderde productie, een defect eiwit of een snellere afbraak. | | Gain-of-function | Een type mutatie die resulteert in een toegenomen of nieuwe functie van een eiwit. Dit kan leiden tot abnormale celactiviteit en ziekte. | | Nonsense mutatie | Een puntmutatie die een codon verandert in een stopcodon, wat leidt tot de premature beëindiging van de eiwitsynthese. Dit resulteert in een verkort en vaak niet-functioneel eiwit. | | Missense mutatie | Een puntmutatie die leidt tot de vervanging van één aminozuur door een ander in het resulterende eiwit. De effecten variëren van minimaal tot significant, afhankelijk van de betrokken aminozuren. | | Splice site mutatie | Een mutatie die plaatsvindt op de grenzen tussen intronen en exonen, waardoor de correcte splicing van mRNA wordt verstoord. Dit kan leiden tot de inbouw van intronen of het overslaan van exonen. | | Frameshift mutatie | Een mutatie die wordt veroorzaakt door de insertie of deletie van een aantal nucleotiden dat geen veelvoud van drie is. Dit verschuift het leesraam van het mRNA, wat leidt tot een compleet andere aminozuursequentie vanaf het punt van de mutatie. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Een moleculair-biologische techniek die gebruikt wordt om specifieke DNA-fragmenten te amplificeren (vermenigvuldigen) in vitro, zodat er voldoende materiaal is voor analyse. | | Sequenering | Een techniek die gebruikt wordt om de exacte volgorde van nucleotiden (A, T, C, G) in een DNA-molecuul te bepalen. | | Genomisch DNA (gDNA) | Het DNA dat zich in de celkern bevindt en het complete genetische materiaal van een organisme bevat. | | Triplet-primed PCR | Een gemodificeerde PCR-techniek die speciaal is ontworpen om de detectie en kwantificatie van triplet repeat expansies te verbeteren. | | Sanger sequencing | Een methode voor DNA-sequencing die gebruikmaakt van keten-terminerende dideoxynucleotiden om DNA-fragmenten van verschillende lengtes te produceren, die vervolgens worden gescheiden en geanalyseerd. | | Next-Generation Sequencing (NGS) | Een groep van snelle DNA-sequencing technologieën die massaal parallel sequentie mogelijk maken tegen lagere kosten en met een hogere doorvoer dan Sanger sequencing. | | CNV (Copy Number Variation) | Een verschil in het aantal kopieën van een DNA-segment dat ten minste 1 kilobase lang is. Dit omvat deleties en duplicaties van grotere DNA-regio's. | | Whole Genome Sequencing (WGS) | Een techniek waarbij het volledige genoom van een organisme wordt gesequeneerd, inclusief zowel coderende als niet-coderende regio's. | | Whole Exome Sequencing (WES) | Een techniek waarbij alleen de exonen, de coderende delen van genen, van het genoom worden gesequeneerd. Dit is nuttig omdat de meeste bekende ziekteveroorzakende mutaties in exonen voorkomen. | | Targeted gene panel analysis | Een vorm van NGS waarbij specifiek een geselecteerde groep genen wordt gesequeneerd, die relevant zijn voor een bepaalde aandoening of groep van aandoeningen. | | Variant of unknown significance (VUS) | Een genetische variant die is geïdentificeerd, maar waarvan de klinische betekenis nog niet is vastgesteld. De implicatie voor de gezondheid van een individu is onbekend. | | Dominant-negatieve mutatie | Een type mutatie waarbij het gemuteerde eiwitproduct de functie van het normale eiwitproduct (van het niet-gemuteerde allel) interfereert of blokkeert, zelfs als er nog een functioneel eiwit aanwezig is. | | Haplo-insufficiëntie | Een genetische aandoening die ontstaat wanneer één functionele kopie van een gen niet voldoende is om een normale fenotypische uitdrukking te garanderen. De cel produceert dan slechts de helft van de benodigde hoeveelheid eiwit. | | Segregatie-analyse | Een methode om de overerving van een genetische variant binnen een familie te bestuderen en te bepalen of de variant correleert met het voorkomen van een specifieke aandoening in die familie. | | Prenataal onderzoek | Genetische tests uitgevoerd tijdens de zwangerschap om genetische afwijkingen bij de foetus op te sporen. | | Pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) | Genetische tests uitgevoerd op embryo's die zijn gecreëerd via in-vitrofertilisatie (IVF) voordat ze worden teruggeplaatst in de baarmoeder. | | Autoimmuunziekte | Een aandoening waarbij het immuunsysteem van het lichaam gezonde cellen en weefsels aanvalt. | | Osteogenesis imperfecta (OI) | Een groep erfelijke bindweefselaandoeningen die gekenmerkt worden door botfragiliteit en verhoogd risico op fracturen, vaak veroorzaakt door defecten in collageen type I. | | Dentinogenesis imperfecta | Een aangeboren stoornis van de tandontwikkeling die vaak voorkomt bij patiënten met osteogenesis imperfecta, gekenmerkt door abnormale kleur en structuur van het dentine. | | Collaagene | Een groep eiwitten die structurele ondersteuning bieden aan weefsels zoals huid, botten, pezen en kraakbeen. Collageen type I is het meest voorkomende type en essentieel voor botsterkte. | | Syndromaal | Verwijst naar een aandoening die deel uitmaakt van een syndroom, een combinatie van symptomen die samen voorkomen en wijzen op een specifieke diagnose. | | Niet-syndromaal | Verwijst naar een aandoening die niet geassocieerd is met een specifiek syndroom, maar vaak een geïsoleerd symptoom betreft, zoals geïsoleerd gehoorverlies of verstandelijke beperking. |