Deel 8 Genanalyse in genetisch gemodificeerde cellen en organismen.docx

# Methoden voor genetische modificatie en genexpressie Dit onderwerp omvat technieken voor het aanmaken van genetisch gemodificeerde cellen en organismen, evenals methoden om genexpressie te manipuleren. ## 1. Methoden voor genetische modificatie en genexpressie ### 1.1 Targeted mutagenese Targeted mutagenese is een proces waarbij specifieke veranderingen in het DNA van een organisme worden aangebracht. Dit kan variëren van het volledig uitschakelen van een gen (knock-out) tot het precies vervangen van een DNA-sequentie (knock-in). #### 1.1.1 CRISPR/Cas technologie De CRISPR/Cas technologie is een krachtige tool voor genbewerking die oorspronkelijk afkomstig is uit bacteriële immuunsystemen. * **Adaptatie in bacteriën:** Bacteriofagen infecteren bacteriën. Het Cas-operon van de bacterie produceert Cas1-Cas2 enzymen die een stukje faag-DNA (protospacer) knippen en integreren in de CRISPR-array van de bacterie. Dit dient als een geheugen. Bij een nieuwe infectie bindt een crRNA (gemaakt uit de CRISPR-array) aan Cas9 of Cas13, die vervolgens het faag-DNA of RNA klieven. * **Toepassing in wetenschap:** In wetenschappelijke toepassingen wordt Cas9-enzym gekoppeld aan een single guide RNA (sgRNA). Dit complex bindt aan het doel-DNA, waarbij de Cas9 een dubbelstrengsbreuk (dsbreuk) maakt, typisch 3 basenparen stroomopwaarts van het PAM-motief (protospacer adjacent motif). De DNA-reparatie kan vervolgens via non-homologous end joining (NHEJ) verlopen, wat vaak leidt tot inactivatie van het gen, of via homology-directed repair (HDR) als een donor-DNA-template wordt aangeboden, wat precieze aanpassingen of inserties mogelijk maakt. **Cas-varianten en RNA-targeting:** Verschillende Cas-eiwitten zijn beschikbaar, elk met specifieke eigenschappen: * Cas9 maakt dsbreuken. * Cas12 produceert sticky ends na klieven. * Cas13 kan RNA targetten. De keuze van Cas-eiwit hangt af van het PAM-motief dat past bij de doelsequentie. **CRISPR-gebaseerde modificaties:** * **Base editing:** Deze techniek maakt gerichte enkele basenveranderingen mogelijk zonder een dsbreuk te veroorzaken. Het combineert een cytidine deaminase met dCas9 en een sgRNA. De deaminase deamineert een cytosine (C) naar uracil (U), wat vervolgens door het cel eigen DNA-reparatiesysteem wordt herkend als een thymine (T), wat resulteert in een C tot T transitie. * **Prime editing:** Dit is een meer geavanceerde techniek die kan worden beschouwd als een "tekstverwerker" voor DNA. Het maakt precisiewijzigingen mogelijk zonder dsbreuk en zonder de noodzaak van een donor-DNA-template. Het systeem werkt door: 1. Een Cas9-nickase die één streng van het DNA inknipt op de doelsequentie. 2. Een pegRNA (prime editing guide RNA) dat bindt en een nieuw DNA-sjabloon levert met de gewenste verandering (mismatch). 3. Een reverse transcriptase dat de nieuwe sequentie met de wijziging overschrijft. 4. De cel zelf voltooit het reparatieproces, inclusief het verwijderen van een flap met de oorspronkelijke sequentie. **Delivery van CRISPR-componenten:** Cas9 en het sgRNA kunnen op verschillende manieren worden afgeleverd: als eiwit, als vector, of als geassembleerde componenten. Bij therapeutische toepassingen kan het immuunsysteem reageren op het gRNA en Cas9/Cas12a, wat immuunonderdrukking kan vereisen bij herhaalde toediening. #### 1.1.2 Transgenese Transgenese omvat het introduceren van exogeen DNA (transgenen) in het genoom van een organisme. * **Pronucleaire micro-injectie:** Deze methode houdt in dat DNA direct in de pronuclei van een bevruchte eicel wordt geïnjecteerd. De gemodificeerde eicel wordt vervolgens geïmplanteerd in een pseudozwanger dier om de ontwikkeling te laten plaatsvinden. Nakomelingen kunnen vervolgens worden geanalyseerd op de aanwezigheid van het transgen. * **Genetisch gemodificeerde embryonale stamcellen (ES-cellen):** ES-cellen uit een blastocyst kunnen worden getransfecteerd met een donorvector die het gewenste transgen bevat. Na succesvolle integratie kunnen deze gemodificeerde ES-cellen worden ingebracht in een andere blastocyst om chimerische dieren te creëren, die vervolgens genetisch kunnen worden gezuiverd. **Transgenese in verschillende organismen:** * **Muis:** Gebruik van ES-cellen en Cre-lox recombinatie. * **Rat:** Geïnduceerde mutagense met ethylnitrosourea (ENU) en gebruik van ES-cellen. * **Drosophila (fruitvlieg):** Gebruik van P-elementen (een type transposon) en het GAL4-UAS systeem. Bij het GAL4-UAS systeem wordt een GAL4-gen gecombineerd met een weefselspecifieke enhancer (driver vlieg). Dit wordt gekruist met een vlieg die een UAS-sequentie gevolgd door het gen van interesse bevat. De nakomelingen zullen het gen van interesse tot expressie brengen in de weefsels waarin GAL4 actief is. * **Zebravissen:** Gebruik van de Tol2 transposon. Co-injectie van transposase mRNA en een donorplasmide met het Tol2-construct leidt tot integratie in het zebravissen genoom. #### 1.1.3 Homologe recombinatie Homologe recombinatie is een DNA-reparatiemechanisme dat wordt gebruikt om precieze genetische modificaties te bewerkstelligen. * **Werkwijze:** Een vector-DNA dat homologe regio's bevat die overeenkomen met de doelgenen wordt gebruikt. De vector kan een selectiemerker bevatten. * **Insertievectoren:** Lineariseren van de vector binnen een homologe regio leidt tot integratie van de gehele vector in het chromosoom, wat vaak resulteert in geninactivatie. * **Vervangingsvectoren:** Door dubbele homologe recombinatie worden interne sequenties van het chromosomale gen vervangen door sequenties uit de vector, wat precieze modificaties mogelijk maakt. #### 1.1.4 Cre-Lox recombinatie Het Cre-Lox recombinatiesysteem wordt gebruikt om chromosoomdeleties en conditionele knock-outs te bewerkstelligen. * **Werkwijze:** LoxP-sites worden flankerend aan een DNA-regio aangebracht, bijvoorbeeld via homologe recombinatie. Wanneer het Cre-recombinase-enzym tot expressie wordt gebracht, herkent het deze LoxP-sites en katalyseert recombinatie tussen hen, wat resulteert in het uitknippen van de DNA-sequentie daartussen. Dit is met name nuttig voor conditionele knock-outs, waarbij Cre-expressie wordt gestuurd door een weefsel-specifieke promotor, zodat het gen alleen in specifieke weefsels of op specifieke tijdstippen wordt uitgeschakeld. #### 1.1.5 Knock-out en knock-in strategieën * **Knock-out:** Dit betreft het volledig uitschakelen van de functie van een gen. Dit kan via NHEJ na een dsbreuk geïnduceerd door CRISPR, of via het gebruik van Cre-Lox om een gen te excideren. * **Conditionele knock-out:** Hierbij wordt de uitschakeling van een gen gereguleerd. Dit wordt bereikt door het gen te "floxen" (flankeren met LoxP-sites) en vervolgens Cre-recombinase tot expressie te brengen onder controle van een specifieke promotor (bv. weefsel-specifiek, inducerbaar). * **Knock-in:** Dit betekent het vervangen van een endogeen gen door een gewijzigde versie of een ander gen. Dit vereist meestal HDR, waarbij de nieuwe sequentie wordt geïntegreerd op de plaats van het oorspronkelijke gen. #### 1.1.6 Andere genbewerkingstechnieken Naast CRISPR/Cas zijn er andere technieken voor genbewerking: * **Zinc finger nucleases (ZFNs):** Combineren DNA-bindende zinkvingerdomeinen met een Fok1 restrictie-enzym dat dsbreuken maakt. * **Transcription activator like effector nucleases (TALENs):** Vergelijkbaar met ZFNs, maar gebruiken TAL-eiwitdomeinen voor DNA-binding. ### 1.2 Moleculaire schakelaars voor genexpressie Moleculaire schakelaars maken het mogelijk om genexpressie te reguleren in termen van tijd en plaats. * **Tet-on/Tet-off systeem:** Dit systeem is gebaseerd op de Tet-repressor van E. coli. * **Tet-on:** Een gemuteerde Tet-repressor bindt met doxycycline (of tetracycline). Zonder doxycycline is het gen stilgelegd; met doxycycline kan het gen worden geactiveerd. * **Tet-off:** Een normale Tet-repressor bindt met doxycycline. Zonder doxycycline is het gen actief; met doxycycline wordt het gen stilgelegd. * **Oestrogeen receptor / Tamoxifen-inducible:** Een fusie-eiwit van de oestrogeenreceptor (ER-X) wordt gebonden gehouden door Hsp90. Bij toevoeging van tamoxifen of oestrogeen laat de ER-X het Hsp90 los, kan naar de kern translokeren en genexpressie activeren. ### 1.3 Vectoren voor genoverdracht Vectoren worden gebruikt om genetisch materiaal in cellen of organismen te introduceren. * **Transiënte constructen:** Deze constructen zijn tijdelijk aanwezig in de cel en worden niet permanent in het genoom geïntegreerd. Ze bevatten vaak promotoren voor in vitro transcriptie (bv. U6, T7) en expressie-cassettes voor Cas9 en gRNA. * **Stabiele constructen:** * **Lenti-iCas9-neo:** Een lentivirale vector die stabiele integratie in het genoom mogelijk maakt. Bevat elementen voor integratie en selectiemerker. * **Adeno-associated virus (AAV) vector:** Een veelgebruikte vector voor genoverdracht, die relatief veilig is en in veel celtypen kan worden ingebracht. #### 1.3.1 Niet-virale vectoren Naast virale vectoren zijn er ook niet-virale methoden voor genoverdracht: * **Fysieke methoden:** Micro-injectie, elektroporatie. * **Chemische methoden:** Gebruik van celpenetrerende peptiden (bv. Cas9-CCP/NLS), lipofectie (bv. LNP), of goudnanodeeltjes (AuNP). ### 1.4 Toepassingen van genetische modificatie * **Stamcellen en organoïden:** CRISPR kan worden gebruikt om aanpassingssites in te bouwen in stamcellen (bv. iPSC's) of organoïden. Dit is nuttig voor het creëren van isogene celmodellen of voor therapeutische toepassingen. * **CRISPR screening:** Genome-wide CRISPR-Cas9 screenings in bijvoorbeeld zoogdiercellen maken het mogelijk om de functie van duizenden genen te bestuderen door met een bibliotheek van gRNAs de genen te targetten. Na blootstelling aan een selectie (bv. een medicijn), wordt genomisch DNA geëxtraheerd en geanalyseerd om te bepalen welke genen cruciaal waren voor de respons. * **Therapeutisch versus reproductief kloneren:** Kloneren kan zowel voor therapeutische doeleinden (bv. het creëren van weefsels) als voor reproductieve doeleinden (het creëren van genetisch identieke organismen) worden gebruikt. * **Induced pluripotent stem cells (iPSCs):** Fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd tot pluripotente stamcellen door expressie van specifieke transcriptiefactoren (bv. Yamanaka factoren zoals Oct4, Sox2, Klf4 en c-myc, vaak in combinatie met Nanog). ### 1.5 Vergelijking van genbewerkingstechnieken | Techniek | Voordelen | Nadelen | | :--------- | :--------------------------------------------------------------------- | :--------------------------------------------------------------------- | | **ZFN** | Permanent, overerfbaar, site-specifiek | Niet voor elk DNA-triplet, off-targets, kostbaar | | **TALEN** | Goedkoper dan ZFN, permanent, overerfbaar, site-specifiek | Niet voor elk DNA-triplet, off-targets | | **CRISPR** | Permanent, overerfbaar, multiplexing mogelijk | Off-targets, PAM-sites beperken targetselectie, NLS nodig voor kern | > **Tip:** Bij het interpreteren van de resultaten van genetische modificatie is het belangrijk om rekening te houden met de mogelijkheid van off-target effecten, met name bij CRISPR-systemen. Verdere validatie met methoden zoals allelspecifieke PCR is cruciaal. > **Tip:** Het onderscheid tussen spontane mutaties (die ontstaan tijdens celcyclus of door transposonen) en geïnduceerde mutaties (door chemische mutagenen of straling) is belangrijk voor het begrijpen van de oorsprong van genetische veranderingen. Insertiemutaties door transposons of retrovirussen zijn ook een belangrijke categorie. --- # CRISPR-technologie en genetische bewerkingen Dit onderdeel behandelt de CRISPR/Cas-technologie en diverse genetische modificatietechnieken, inclusief hun werking en toepassingen. ## 2. CRISPR-technologie en genetische bewerkingen De CRISPR/Cas-technologie heeft de mogelijkheden voor gerichte genetische modificatie revolutionair veranderd. Het systeem maakt gebruik van een gids-RNA (sgRNA) dat zich bindt aan een specifieke DNA-sequentie, waarna het Cas-enzym (meestal Cas9) een dubbelstrengs breuk (dsbreuk) in het DNA veroorzaakt. Dit proces wordt gevolgd door natuurlijke DNA-herstelmechanismen van de cel, namelijk Non-Homologous End Joining (NHEJ) of Homology-Directed Repair (HDR). ### 2.1 Werking van CRISPR/Cas #### 2.1.1 CRISPR-adaptatie in bacteriën Het CRISPR-systeem is oorspronkelijk een adaptief immuunsysteem van bacteriën tegen virussen (bacteriofagen). 1. Wanneer een bacterie wordt geïnfecteerd, knipt het Cas1-Cas2 complex een stuk van het virus-DNA (protospacer) en integreert dit in het CRISPR-array van de bacterie. 2. Het CRISPR-array wordt getranscribeerd tot crRNA, dat door structurele elementen in hairpins wordt gevouwen. 3. Cas9 (of Cas13 voor RNA-targeting) bindt aan deze hairpins en kan vervolgens, indien nodig, het virale DNA (of RNA) herkennen en doorklieven. #### 2.1.2 CRISPR-interferentie in de wetenschap In de wetenschappelijke toepassing wordt het CRISPR/Cas-systeem aangepast voor gerichte genmodificatie. 1. Het Cas9-enzym wordt gekoppeld aan een enkel gids-RNA (sgRNA). 2. Het sgRNA leidt Cas9 naar de specifieke doel-DNA-sequentie. 3. Cas9 maakt een dsbreuk, meestal 3 basenparen stroomopwaarts van een Protospacer Adjacent Motif (PAM). 4. De cel herstelt de breuk via NHEJ, wat vaak leidt tot inserties of deleties (indel) en geninactivatie (knock-out), of via HDR, waarbij een opgegeven donor-DNA-sjabloon kan worden gebruikt om precieze veranderingen aan te brengen, zoals een gen-insertie (knock-in) of substitutie. > **Tip:** Het PAM-motief is cruciaal voor de herkenning door Cas9. Als het PAM-motief niet past, kunnen Cas9-varianten van andere bacteriële soorten worden gebruikt. #### 2.1.3 Protospacer Adjacent Motif (PAM) Het PAM is een korte DNA-sequentie die direct naast de protospacer ligt en essentieel is voor de herkenning door het Cas-eiwit. Zonder het juiste PAM-motief kan Cas9 de doel-DNA-sequentie niet efficiënt binden en knippen. #### 2.1.4 Verschillende Cas-enzymen * **Cas9:** Maakt een stompe breuk (blunt end) in het DNA. * **Cas12 (ook bekend als Cpf1):** Produceert sticky ends, wat voordelig kan zijn voor HDR. * **Cas13:** Specifiek voor het targetten van enkelstrengs RNA (ssRNA), waardoor RNA-modificaties mogelijk worden. #### 2.1.5 Levering van CRISPR/Cas componenten De componenten van het CRISPR/Cas-systeem (Cas9-eiwit, gids-RNA) kunnen op verschillende manieren in cellen worden gebracht: * Als eiwit en RNA (transiënte expressie). * Via vectoren (bijvoorbeeld lentivirale vectoren, AAV-vectoren) voor stabiele integratie of langdurige expressie. * Als complexe van eiwit en RNA. > **Tip:** Immuunreacties tegen het gRNA en het Cas-eiwit kunnen de effectiviteit van CRISPR-therapie beperken, vooral bij herhaalde toediening. ### 2.2 Geavanceerde CRISPR-technologieën Naast de standaard CRISPR/Cas9-technologie zijn er recentelijk geavanceerdere varianten ontwikkeld. #### 2.2.1 Base editing Base editing maakt gerichte single-nucleotide veranderingen mogelijk zonder dsbreuk te veroorzaken. * **Werking:** Een gemodificeerd Cas9-enzym (Cas9-nickase, dat slechts één streng knipt) wordt gecombineerd met een cytidine deaminase en een sgRNA. * De cytidine deaminase deamineert een cytosine (C) naar uracil (U) in de doel-DNA-sequentie. * Tijdens het natuurlijke DNA-herstelproces wordt de U vervolgens als thymine (T) gerepliceerd, wat resulteert in een C-naar-T of G-naar-A transiteren op de tegenoverliggende streng. #### 2.2.2 Prime editing Prime editing wordt ook wel de "tekstverwerker van DNA" genoemd en biedt nog meer flexibiliteit dan base editing. Het kan ook grote indel-mutaties en substituties creëren zonder dsbreuk of donor-DNA. * **Werking:** 1. Een Cas9-nickase creëert een enkele nick in de DNA-streng op de doel-locatie. 2. Een speciaal ontworpen prime editing gRNA (pegRNA) bindt aan het doel-DNA en levert tegelijkertijd een DNA-sjabloon dat de gewenste wijziging bevat. 3. Een reverse transcriptase, gekoppeld aan het Cas9-eiwit, schrijft de nieuwe sequentie van het sjabloon naar het gemodificeerde DNA. 4. Dit resulteert in een "flap" in de DNA-streng die de nieuwe sequentie bevat. 5. Cellulaire mismatch repair mechanismen verwerken deze flap, wat leidt tot de permanente integratie van de edit. #### 2.2.3 CRISPR-geassocieerde transposases Transposases zijn enzymen die mobiele genetische elementen (transposons) kunnen verplaatsen. CRISPR-geassocieerde transposases combineren de precisie van CRISPR-targeting met de insertiecapaciteit van transposases om genetisch materiaal efficiënt in het genoom te integreren. ### 2.3 Toepassingen van CRISPR-technologie De CRISPR-technologie heeft brede toepassingen in onderzoek en potentieel in de therapie. #### 2.3.1 Genetische modificatie van cellen en organismen * **Knock-out en knock-in:** Precieze inactivatie of modificatie van genen in cellijnen, stamcellen en modelorganismen zoals muizen, zebravis en *Drosophila*. * **Cellulaire reprogrammering:** Inductie van pluripotente stamcellen (iPSC) met behulp van vectoren die de Yamanaka factoren (Oct4, Sox2, Klf4 en c-myc) tot expressie brengen. * **Organoïde-ontwikkeling:** Genetische modificatie van stamcellen die vervolgens worden gedifferentieerd tot 3D-organoïden voor onderzoek naar orgaanontwikkeling en ziekten. #### 2.3.2 Therapeutische toepassingen CRISPR-technologie wordt onderzocht voor de behandeling van genetische ziekten door specifieke genmutaties te corrigeren. #### 2.3.3 CRISPR-screening Genome-wide CRISPR-Cas9 screening in zoogdiercellen maakt het mogelijk om de functie van duizenden genen systematisch te onderzoeken. Door cellen te combineren met een bibliotheek van gRNA's die elk een ander gen targetten, kan worden bepaald welke genen essentieel zijn voor bepaalde processen, bijvoorbeeld onder selectiedruk (zoals een medicijn). ### 2.4 Alternatieve en complementaire technieken voor genetische modificatie Naast CRISPR zijn er andere technieken voor gen-editing en transgenese. #### 2.4.1 Zinc Finger Nucleases (ZFNs) * **Werking:** ZFNs bestaan uit een DNA-bindend zinkvinger-domein en een DNA-splitsend Fok1-enzym. Meerdere zinkvingers binden aan specifieke DNA-sequenties, waarna het Fok1-domein een dsbreuk veroorzaakt. * **Voordelen:** Permanent en overerfbaar. * **Nadelen:** Ontwerp is complex en niet voor elk DNA-triplet is een geschikte zinkvinger beschikbaar. Er is een risico op off-target effecten. #### 2.4.2 Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) * **Werking:** Vergelijkbaar met ZFNs, maar gebruiken TAL-eiwit domeinen voor DNA-binding, gekoppeld aan het Fok1-enzym. Twee TALENs binden aan tegenoverliggende DNA-strengen rond de doel-site, waardoor het Fok1-domein een dsbreuk veroorzaakt. * **Voordelen:** Goedkoper dan ZFNs, permanent en overerfbaar. * **Nadelen:** Net als ZFNs kunnen ze off-targets veroorzaken en is het niet altijd eenvoudig om sequenties te targetten. #### 2.4.3 Homologe Recombinatie (HR) * **Werking:** Maakt gebruik van DNA-sequenties die sterk lijken op het doelgen om selectieve integratie of vervanging van genen mogelijk te maken. Dit kan via insertievectoren of vervangingsvectoren. * **Toepassing:** Precisiegenmodificatie, zoals het vervangen van endogene genen door een reporter-gen of het inbouwen van specifieke mutaties. #### 2.4.4 Cre-Lox recombinatie * **Werking:** Een recombinatiesysteem dat wordt gebruikt voor chromosoomdeleties en conditionele knock-outs. LoxP-sites worden via homologe recombinatie aan weerszijden van een doelgen geplaatst. De Cre recombinase katalyseert vervolgens de recombinatie tussen deze LoxP-sites, waardoor het DNA ertussen wordt uitgeknipt. * **Conditionele knock-outs:** Kan worden gecombineerd met weefsel-specifieke promotoren om genexpressie of inactivatie alleen in specifieke weefsels of op specifieke tijdstippen te laten plaatsvinden. #### 2.4.5 Transgenese-methoden * **Pronucleaire micro-injectie:** DNA wordt direct in de pronuclei van een bevruchte eicel geïnjecteerd. * **Genetisch gemodificeerde embryonale stamcellen (ES):** ES-cellen worden genetisch gemodificeerd en vervolgens geïnjecteerd in een blastocyst om transgene muizen te creëren. * **P-element insertie (*Drosophila*):** Random integratie van DNA via een P-element transposon. * **UAS-GAL4 systeem (*Drosophila*):** Een krachtig systeem voor weefsel-specifieke genexpressie, waarbij GAL4 (gestuurd door een weefsel-specifieke promotor) de expressie van een gen onder controle van een UAS-promotor activeert. * **Tol2 transposon (zebravissen):** Een DNA-transposon dat gebruikt wordt voor genoomintegratie in zebravissen. * **Retrovirussen en Lentivirussen:** Kunnen worden gebruikt om genetisch materiaal in het genoom van de gastheercel te integreren. * **Adeno-associated virus (AAV) vectoren:** Veilige en efficiënte virale vectoren voor gentherapie en onderzoek. #### 2.4.6 Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) iPSC's worden gecreëerd door somatische cellen te reprogrammeren met behulp van specifieke transcriptiefactoren (Yamanaka factoren: Oct4, Sox2, Klf4, c-myc). Deze iPSC's kunnen vervolgens worden gedifferentieerd tot diverse celtypen. ### 2.5 Geïnduceerde genexpressie (moleculaire schakelaars) Om genexpressie op afstand te controleren, worden moleculaire schakelaars gebruikt: * **Tet-on/Tet-off systeem:** Gebaseerd op de bacteriële tetracycline-regulator. * **Tet-on:** Het gen wordt geactiveerd in de aanwezigheid van tetracycline of doxycycline. * **Tet-off:** Het gen wordt geactiveerd in de afwezigheid van tetracycline of doxycycline. * **Oestrogeen receptor / Tamoxifen-inducible systeem:** Een fusie-eiwit van de oestrogeenreceptor en een activatiedomein is inactief zolang het gebonden is aan Hsp90. Toevoeging van tamoxifen of oestrogeen leidt tot dissociatie van Hsp90 en translocatie naar de kern, waardoor genexpressie wordt geïnduceerd. ### 2.6 Vectoren voor genetische modificatie Verschillende soorten vectoren worden gebruikt voor de levering van genetisch materiaal: * **Lentivirale vectoren:** Kunnen stabiele integratie in het genoom bewerkstelligen, zelfs in delende en niet-delende cellen. * **Adeno-associated virus (AAV) vectoren:** Worden veel gebruikt in gentherapie vanwege hun lage immunogeniciteit en vermogen om verschillende weefsels te targetten. * **Plasmiden:** Kunnen worden gebruikt voor transiënte of stabiele expressie, afhankelijk van de promotor en integratie-methoden. * **Niet-virale vectoren:** * **Fysieke methoden:** Micro-injectie, elektroporatie. * **Chemische methoden:** Lipofectie (met lipidenanopartikels, LNP), celpenetrerende peptiden (CCP), gouden nanopartikels (AuNP). ### 2.7 Voorbeelden van CRISPR-constructen * **Transiënte constructen:** Bevatten doorgaans een U6 promotor voor gRNA-expressie en een CMV of T7 promotor voor Cas9-expressie. Vaak voorzien van tags zoals GFP voor detectie. * **Stabiele constructen (bv. Lenti-iCas9-neo):** Ontworpen voor langdurige expressie, inclusief selectiemerker-genen (bv. neomycine-resistentie). ### 2.8 Belangrijke begrippen en technieken in genetische modificatie * **Wildtype:** Het oorspronkelijke, niet-gemodificeerde organisme. * **Knock-out:** Volledige inactivatie van een gen. * **Conditionele knock-out:** Geninactivatie die plaatsvindt onder specifieke omstandigheden (weefsel, tijd). * **Knock-in:** Vervanging van een bestaand gen met een ander gen of sequentie. * **Homology-mediated end joining (HMEJ):** Een DNA-herstelmechanisme dat gebruikt wordt voor precieze genmodificaties. * **CRISPR screening:** Genome-wide methoden om genfuncties te ontrafelen. * **Reproductief versus therapeutisch kloneren:** Reproductief kloneren creëert een genetisch identiek individu, terwijl therapeutisch kloneren gericht is op het verkrijgen van stamcellen voor regeneratieve geneeskunde. * **NHEJ (Non-Homologous End Joining):** Een snel, maar vaak onnauwkeurig DNA-herstelmechanisme dat leidt tot indel-mutaties. * **HDR (Homology-Directed Repair):** Een nauwkeuriger herstelmechanisme dat gebruik maakt van een homologe sjabloon voor herstel, ideaal voor knock-ins. > **Tip:** De keuze van de CRISPR-Cas variant en de leveringsmethode hangt af van het specifieke experiment, het celtype, en de gewenste mate van precisie en stabiliteit van de modificatie. > **Voorbeeld:** Het pRosa26-DEST systeem kan worden gebruikt om een cDNA gecontroleerd tot expressie te brengen in een muis, waarbij de expressie pas start na Cre-recombinatie op de pRosa26 locus. Dit maakt geconditioneerde genexpressie mogelijk. --- # Transgenese in modelorganismen Dit onderwerp behandelt de diverse methoden voor het creëren van transgene modelorganismen, waaronder de specifieke technieken en systemen die worden gebruikt in organismen zoals Drosophila, zebravis en muizen. ### 3.1 Algemene principes van transgenese Transgenese is het proces waarbij genetisch materiaal van het ene organisme in een ander organisme wordt gebracht om nieuwe eigenschappen te introduceren. Dit is cruciaal voor het bestuderen van genfuncties en het ontwikkelen van ziekte-modellen. ### 3.2 Transgenese in muizen Muizen zijn een belangrijk modelorganisme voor transgenese vanwege hun genetische verwantschap met mensen en hun snelle reproductiecyclus. Verschillende methoden worden gebruikt: #### 3.2.1 Pronucleaire micro-injectie Deze techniek omvat het injecteren van een DNA-construct in de pronuclei van een bevruchte eicel. * **Procedure:** 1. Vrouwelijke en mannelijke muizen worden samengezet. 2. Bevruchte eicellen worden geïsoleerd. 3. Het DNA-construct wordt in de mannelijke pronucleus geïnjecteerd. 4. De gemodificeerde eicellen worden teruggeplaatst in een pseudogeen draagmoeder. 5. Nakomelingen worden gescreend op de aanwezigheid van het transgen via PCR en data-analyse. #### 3.2.2 Genetisch gemodificeerde embryonale stamcellen (ES-cellen) ES-cellen kunnen worden genetisch gemodificeerd in vitro en vervolgens worden geïntegreerd in een vroege embryo om transgene muizen te genereren. * **Procedure:** 1. Muisembryo's (blastocysten) worden geïsoleerd. 2. De binnenste celmassa wordt verwijderd en de cellen worden gedissocieerd met trypsine. 3. De gedissocieerde ES-cellen worden gekweekt op een voedingslaag (vaak Mouse Embryonic Fibroblasts, MEF). 4. **Targeted mutagenese via homologe recombinatie:** * **Insertievectoren:** Het vector-DNA, dat een selectiemerker bevat en omgeven is door homoloog DNA van het doelgen, wordt gelineariseerd binnen de homologe regio. De gehele vector integreert in het chromosoom, wat leidt tot inactivering van het gen. * **Vervangingsvectoren:** Het vector-DNA bevat homologie met het doelgen en de nieuwe sequentie die het gen moet vervangen. Na gelinearisering buiten de homologe regio, zorgt dubbele homologe recombinatie voor vervanging van de interne sequenties van het chromosomale gen door de sequenties uit de vector. Dit resulteert in een precieze modificatie. 5. De gemodificeerde ES-cellen worden geïnjecteerd in een blastocyste, die vervolgens in een draagmoeder wordt geplaatst. Chimerische muizen ontstaan, die vervolgens gekruist kunnen worden voor kiemlijntransmissie van de modificatie. #### 3.2.3 Cre-Lox recombinatie voor conditionele knock-outs en deleties Het Cre-Lox systeem maakt selectieve verwijdering van DNA-sequenties mogelijk, wat essentieel is voor conditionele genmodificatie. * **Werking:** 1. LoxP-sites worden via homologe recombinatie aan weerszijden van het te verwijderen gen aangebracht (floxed gen). 2. Expressie van Cre-recombinase katalyseert de recombinatie tussen de LoxP-sites. 3. Het DNA tussen de LoxP-sites wordt als een circulair fragment uitgeknipt en gaat verloren tijdens celdeling (omdat het geen centromeer heeft). 4. Dit systeem kan weefsel-specifiek worden geactiveerd door Cre-expressie te koppelen aan een weefsel-specifieke promotor, resulterend in een conditionele knock-out. #### 3.2.4 Geïnduceerde genexpressie (moleculaire schakelaars) Systemen die genexpressie reguleren in respons op een extern signaal maken het mogelijk om genexpressie te controleren in tijd en ruimte. * **Tet-on/Tet-off systeem:** Gebaseerd op de tetracycline-regulator (TetR) van E. coli. * **Tet-on:** In afwezigheid van tetracycline of doxycycline bindt een gemuteerde TetR aan het tetO-element, waardoor het gen stil wordt gelegd. Bij toevoeging van tetracycline bindt dit aan TetR, waardoor TetR niet meer kan binden aan tetO en transcriptie kan plaatsvinden. * **Tet-off:** In afwezigheid van tetracycline of doxycycline bindt de normale TetR aan het tetracycline-responsieve element (TRE), waardoor transcriptie plaatsvindt. Bij toevoeging van tetracycline bindt TetR hieraan en kan het niet meer aan de TRE binden, waardoor het gen stil wordt gelegd. * **Oestrogeen receptor / Tamoxifen-inducible systeem:** Gebruikt een fusie-eiwit van de oestrogeenreceptor (ER) en een activatiedomein (X), ER-X. * In afwezigheid van tamoxifen of oestrogeen is ER-X gebonden aan Hsp90. * Bij toevoeging van tamoxifen of oestrogeen laat ER-X Hsp90 los, migreert naar de kern en activeert transcriptie. #### 3.2.5 Knock-in technieken Bij knock-in wordt een specifiek gen vervangen door een ander gen of wordt een nieuw gen geïntroduceerd op een specifieke locatie. * **Procedure:** 1. Een targetvector wordt ontworpen met homologe sequenties van het doelgen, de nieuwe sequentie die geïntroduceerd moet worden, een selectiemerker en LoxP-sites. 2. Homologe recombinatie in ES-cellen vervangt de endogene sequentie door het knock-in construct. 3. Succesvolle integratie wordt geselecteerd. 4. De gemodificeerde ES-cellen worden gebruikt om chimerische muizen te genereren, die vervolgens worden gekruist voor kiemlijntransmissie. #### 3.2.6 pRosa26-DEST systeem Dit systeem maakt gecontroleerde expressie van cDNA mogelijk na Cre-recombinatie, door insertie op de genetisch stabiele Rosa26-locus. ### 3.3 Transgenese in Drosophila (fruitvlieg) Drosophila is een modelorganisme met efficiënte transgenese methoden. #### 3.3.1 P-element insertie Het P-element, een DNA-transposon, kan worden gebruikt om willekeurig DNA in het genoom te integreren. De expressie kan echter variëren door positionele effecten. Het P-element codeert voor transposase, dat de "cut and paste" activiteit mogelijk maakt. #### 3.3.2 Integratie plasmiden met UAS-GAL4 systeem Dit systeem maakt gerichte genexpressie mogelijk. * **Componenten:** 1. **Driver vlieg:** Bevat het GAL4 gen, dat dicht bij een weefsel-specifieke enhancer ligt. 2. **Vector vlieg:** Bevat een Upstream Activating Sequence (UAS) sequentie, waaraan GAL4 bindt, gevolgd door het gen dat tot expressie moet komen (YFG). LoxP-sites en een attB-site voor integratie met phiC31 integrase kunnen aanwezig zijn. * **Procedure:** 1. De twee vliegenlijnen worden gekruist. 2. De nakomelingen waarbij GAL4 en UAS-YFG worden gecombineerd, zullen het YFG tot expressie brengen in de weefsels waar GAL4 actief is. ### 3.4 Transgenese in zebravis Zebravissen zijn nuttig voor transgenese, vooral in de embryo-fase vanwege hun transparantie. #### 3.4.1 Tol2 transposon systeem Het Tol2-transposon is een DNA-transposon dat kan worden gebruikt voor genoomintegratie. * **Procedure:** 1. Transposase mRNA en een donor-plasmide met het Tol2-construct worden co-geïnjecteerd in zebravisembryo's. 2. Het transposase knipt het Tol2-construct uit het plasmide en injecteert het in het genoom. 3. De verkregen individuen kunnen mozaïek zijn. Kruising met wildtype vissen zorgt voor stabiele transmissie. * **Voorbeeld:** Tol2 wordt gebruikt om GFP-expressie te induceren in het ruggenmerg van zebravisembryo's. #### 3.4.2 Conditional gene trapping Dit combineert genverstoring met de expressie van een reportergen, vergelijkbaar met methoden in Drosophila. ### 3.5 Nieuwe CRISPR-gebaseerde technologieën CRISPR/Cas technologie heeft de mogelijkheden voor genoommodificatie revolutionair veranderd. #### 3.5.1 CRISPR/Cas9 en gerelateerde systemen * **Basisprincipe:** Het Cas9-enzym, geleid door een single guide RNA (sgRNA), maakt een dubbelstrengs breuk (dsbreuk) in het DNA op een specifieke locatie, 3 basenparen upstream van een Protospacer Adjacent Motif (PAM). DNA-reparatie vindt plaats via Non-Homologous End Joining (NHEJ) wat vaak leidt tot mutaties (knock-out) of via Homology-Directed Repair (HDR) wanneer een donor-DNA met homologe sequenties wordt aangeboden, wat gericht genoom-editing (knock-in) mogelijk maakt. * **Adaptatie in bacteriën:** Bacteriofagen injecteren hun DNA in bacteriën, waar Cas1-Cas2 enzymen stukken faag-DNA als protospacers integreren in het CRISPR-array van de gastheer. Bij een volgende infectie leidt dit tot matuatie van CRISPR-RNA's (crRNA's) en binding van Cas9 of Cas13 aan faag-DNA voor interferentie. * **Cas enzymen:** Verschillende Cas-eiwitten bestaan, zoals Cas9 dat dsDNA knipt en Cas13 dat RNA target. De keuze van het Cas-enzym kan afhangen van het PAM-motief. Cas12 produceert "sticky ends" na knippen, in tegenstelling tot de "blunt ends" van Cas9. #### 3.5.2 Base editing Base editing maakt het mogelijk om specifieke DNA-basen te veranderen zonder dsbreuk te induceren. * **Werking:** Een cytidine deaminase wordt gekoppeld aan een dCas9 (niet-knippend Cas9) en een sgRNA. De deaminase deamineert een target C naar een U (uracil). De cel herstelt vervolgens de uracil, wat leidt tot een C naar T transpiratie. #### 3.5.3 Prime editing Dit is een geavanceerdere CRISPR-gebaseerde techniek die DNA kan veranderen zonder dsbreuk en zonder donor-DNA, vergelijkbaar met een "tekstverwerker" voor DNA. * **Werking:** 1. Een Cas9-nickase maakt een enkele nick in één DNA-streng op de doel-locatie. 2. Een pegRNA bindt en levert een sjabloon met een mismatch die de gewenste edit bevat. 3. Een reverse transcriptase schrijft de nieuwe sequentie met de wijziging. 4. De cel herstelt de flap (flap repair), waardoor de edit permanent wordt. #### 3.5.4 Toepassingen in stamcellen en organoïden CRISPR/Cas kan worden gebruikt voor target-specifieke knock-in in stamcellen, zoals induced pluripotent stem cells (iPSCs), en voor het creëren van isogene lijnen en organoïden. #### 3.5.5 Delivery van CRISPR/Cas componenten De componenten van CRISPR/Cas (Cas9-eiwit, vector, guide RNA) kunnen samen of apart worden afgeleverd. Levering kan plaatsvinden via virale vectoren (bv. AAV), niet-virale vectoren (bv. lipofectie, nanodeeltjes) of fysieke methoden (bv. micro-injectie, elektroporatie). Er bestaat ook het risico op immuunreacties tegen gRNA en Cas9/Cas12a. #### 3.5.6 CRISPR-geassocieerde transposases Deze systemen gebruiken transposases om DNA te knippen en te inserten, wat een alternatieve methode voor genoommodificatie biedt. #### 3.5.7 Nieuwe Cas-varianten en RNA-targeting Er worden continu nieuwe Cas-varianten ontwikkeld met verbeterde specificiteit en een breder scala aan toepassingen, inclusief RNA-targeting met Cas13. ### 3.6 Andere genoommodificatietechnieken #### 3.6.1 Zinc finger nucleases (ZFNs) en Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) Deze technieken maken gebruik van eiwitdomeinen die specifiek aan DNA binden, gekoppeld aan een nuclease domein (meestal Fok1) dat dsbreuken induceert. * **Werking:** 1. De ZFNs of TALENs binden aan de doel-DNA-sequentie. 2. Het Fok1-domein dimeriseert en maakt een dsbreuk. 3. Reparatie via NHEJ leidt tot geninactivatie (knock-out). 4. Reparatie via HDR met een donor-DNA kan gericht genoom-editing (knock-in) mogelijk maken. * **Voordelen/nadelen:** ZFNs en TALENs bieden permanente en erfgoede modificaties, maar de engineering van de DNA-bindende domeinen kan complex zijn en off-target effecten kunnen optreden. ### 3.7 Reproductief versus therapeutisch kloneren * **Therapeutisch kloneren:** Het creëren van embryo's voor de productie van stamcellen, die gebruikt kunnen worden voor regeneratieve geneeskunde. * **Reproductief kloneren:** Het creëren van een genetisch identiek organisme. Dit proces omvat het transplanteren van een celkern in een eicel waarvan de eigen kern is verwijderd. Het Dolly-experiment is hiervan een bekend voorbeeld. ### 3.8 Tools voor analyse en screening * **CRISPR screening:** Genome-wide CRISPR-Cas9 screenings in zoogdiercellen maken het mogelijk om genfuncties op grote schaal te identificeren. Hierbij worden cellen blootgesteld aan Cas9 en een bibliotheek van gRNA's, gevolgd door selectie met een specifieke drug. Genomisch DNA wordt geëxtraheerd en geanalyseerd om de gRNA's te identificeren die geassocieerd zijn met overleving of andere fenotypes. * **p2A peptide:** Wordt gebruikt voor de scheiding van meerdere eiwitten die vanuit één transcript worden geproduceerd, zoals de Yamanaka factoren voor het genereren van iPSCs. * **Virale vectoren (bv. AAV, lentivirus):** Worden gebruikt voor stabiele genoomintegratie en lange-termijn expressie. * **Niet-virale vectoren:** Fysieke methoden (micro-injectie, elektroporatie) en chemische methoden (lipofectie, celpenetrerende peptiden, gouden nanodeeltjes) bieden alternatieven voor genoommodificatie. ### 3.9 Tabeloverzicht van technieken | Techniek | Voordelen | Nadelen | | :------------------------ | :----------------------------------------------------------------------- | :------------------------------------------------------------------------------ | | ZFN | Permanent, overerfbaar, site-specifiek | Beperkte DNA-triplet beschikbaarheid, off-targets, kostprijs | | TALEN | Goedkoper dan ZFN, permanent, overerfbaar, site-specifiek | Beperkte DNA-triplet beschikbaarheid, off-targets | | CRISPR | Permanent, overerfbaar, multiplexing | Off-targets, PAM-afhankelijkheid, vereist NLS (Nuclear Localization Signal) | | Tol2 transposon (zebravis) | Efficiënte integratie, kan leiden tot stabiele lijnen | Kan mozaïcisme veroorzaken, willekeurige integratie | | P-element (Drosophila) | Eenvoudig te introduceren | Willekeurige integratie, variabele expressie door positionele effecten | | UAS-GAL4 (Drosophila) | Gerichte expressie, weefsel-specifiek | Vereist kruising van twee lijnen, positionele effecten kunnen nog optreden | | Tet-on/Tet-off | Induceerbare expressie, temporele controle | Vereist tetracycline/doxycycline, afhankelijkheid van transcriptiefactoren | | ER/Tamoxifen-inducible | Induceerbare expressie, temporele controle | Vereist tamoxifen/oestrogeen, afhankelijkheid van chaperone eiwitten | | Pronucleaire micro-injectie | Eenvoudig voor introductie van transgenen in muizen | Lage efficiëntie, willekeurige integratie, potentieel voor meerdere kopieën | | ES cel gemodificeerde cellen | Gerichte genmodificatie (KO/KI), creëren van chimerische muizen | Arbeidsintensief, vereist specifieke kweekomstandigheden | > **Tip:** Bij het bestuderen van transgenese in modelorganismen is het essentieel om de specifieke voordelen en beperkingen van elke techniek te begrijpen in relatie tot het onderzoeksdoel. Denk na over hoe de efficiëntie, specificiteit en het type modificatie (knock-out, knock-in, expressie) verschillen per methode en organisme. --- # Toepassingen van genetische modificatie en bewerking Dit onderwerp verkent de diverse toepassingen van genetische modificatie en bewerkingstechnieken, variërend van therapeutische toepassingen, kloneren, stamcelonderzoek tot screeningmethoden. ### 4.1 Targeted mutagenese en genoom bewerking Targeted mutagenese maakt het mogelijk om specifieke veranderingen aan te brengen in het genoom van een organisme. Dit kan leiden tot de creatie van genetisch gemodificeerde cellen en organismen met gewenste eigenschappen of om de functie van specifieke genen te bestuderen. #### 4.1.1 SSN-technologieën De eerste generatie SSN-technologieën (Site-Specific Nucleases) omvatten methoden zoals Zinc Finger Nucleases (ZFNs) en Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs). * **Zinc finger nucleases (ZFNs)**: Deze technologie combineert DNA-bindende zinkvinger domeinen met een DNA-splitsend domein, meestal afkomstig van het Fok1 enzym. ZFNs creëren een dubbelstrengs breuk (dsbreuk) in het DNA op een specifieke locatie. Het natuurlijke DNA-herstelmechanisme van de cel kan vervolgens worden gebruikt om genen uit te schakelen (via Non-Homologous End Joining, NHEJ) of om nieuwe DNA-sequenties in te voegen (via Homology-Directed Repair, HDR), wat leidt tot geninsertie of -vervanging (knock-in). * **Transcription activator-like effector nucleases (TALENs)**: TALENs werken vergelijkbaar met ZFNs door een DNA-bindend domein te combineren met het Fok1 restrictie-enzym. Twee TALENs binden aan tegenoverliggende DNA-strengen rond de doelwitlocatie, waardoor de Fok1 domeinen samenkomen en een dsbreuk veroorzaken. Net als bij ZFNs, kan de cel het DNA herstellen via NHEJ of HDR. #### 4.1.2 CRISPR-Cas technologie CRISPR-Cas is een recentere en veelzijdigere technologie voor genoom bewerking. Het systeem is oorspronkelijk een adaptief immuunsysteem in bacteriën tegen virussen. * **Adaptatie in bacteriën**: Wanneer een bacteriofaag een bacterie infecteert, knipt het Cas1-Cas2 complex een stuk van het faag-DNA (protospacer) en integreert dit in het CRISPR-array van de bacterie. Dit array wordt vervolgens omgezet in crRNA's. Bij een nieuwe infectie bindt Cas9 aan een crRNA en het faag-DNA, wat leidt tot een ds- of ss-breuk in het faag-DNA. * **Gebruik in wetenschap**: In de wetenschap wordt het Cas9-enzym gekoppeld aan een single guide RNA (sgRNA). Het Cas9-sgRNA complex bindt aan het doelwit-DNA, 3 basen vóór een Protospacer Adjacent Motif (PAM), en veroorzaakt een dsbreuk. Het herstel kan plaatsvinden via NHEJ of HDR. * **Protospacer Adjacent Motif (PAM)**: Een korte sequentie die naast de protospacer in het doelwit-DNA aanwezig moet zijn voor Cas9-herkenning. De selectie van PAM-sequenties is afhankelijk van het specifieke Cas-eiwit. * **sgRNA**: Een synthetisch RNA dat zowel de functie van crRNA als tracrRNA combineert, waardoor het Cas9-eiwit naar de specifieke DNA-locatie wordt geleid. #### 4.1.3 CRISPR-gebaseerde varianten en toepassingen * **Base editing**: Deze technologie maakt het mogelijk om individuele DNA-basen te veranderen zonder een dsbreuk te veroorzaken. * **Werking**: Een gemodificeerd Cas9-enzym (nickase dat slechts één streng breekt) wordt gecombineerd met een cytidine deaminase en een sgRNA. De deaminase deamineert een doelwit-cytidine (C) naar uracil (U), wat door de cel wordt herkend als thymine (T) tijdens DNA-replicatie, resulterend in een C tot T mutatie. * **Prime editing**: Dit is een geavanceerdere CRISPR-gebaseerde techniek die vergelijkbaar is met een "tekstverwerker" voor DNA. Het kan verschillende soorten mutaties aanbrengen, waaronder inserties en deleties, zonder dsbreuk en zonder het gebruik van donor-DNA. * **Werking**: Een Cas9-nickase, geassocieerd met een reverse transcriptase, gebruikt een pegRNA (primer-binding site en reverse transcriptase-binding site) als sjabloon om de gewenste sequentie te schrijven. De cel herstelt vervolgens de 'flap' met de mismatch. * **RNA targeting**: CRISPR-Cas-systemen, met name Cas13-varianten, kunnen ook RNA targetten, wat nieuwe mogelijkheden biedt voor genregulatie en de studie van RNA-functies. * **CRISPR-geassocieerde transposases**: Deze combineren de precisie van CRISPR met de insertiemogelijkheden van transposases om DNA in het genoom te integreren. #### 4.1.4 Implementatie van genoom bewerking De delivery van CRISPR-Cas componenten (Cas9-eiwit, DNA-vector, gRNA) naar cellen kan op verschillende manieren gebeuren: * **Als eiwit, vector of guide RNA, samen of apart**: Dit bepaalt de duur van de expressie en de efficiëntie van de levering. * **Virale vectoren (bv. AAV)**: Deze bieden een efficiënte manier om genetisch materiaal in cellen te brengen, maar kunnen immuunreacties opwekken. * **Niet-virale vectoren**: * **Fysieke methoden**: Micro-injectie en elektroporatie. * **Chemische methoden**: Lipofectie met lipide nanodeeltjes (LNP) of gouden nanodeeltjes (AuNP), en het gebruik van cel-penetrerende peptiden (bv. Cas9-CCP/NLS). #### 4.1.5 Immuunreacties en uitdagingen * **Immuunrespons tegen gRNA en Cas9/Cas12a**: Herhaalde toediening van CRISPR-componenten kan leiden tot een immuunrespons, wat de effectiviteit van de therapie kan verminderen. ### 4.2 Genetisch gemodificeerde organismen Genetische modificatie wordt op grote schaal toegepast in diverse organismen, van bacteriën en planten tot dieren, voor zowel fundamenteel onderzoek als biotechnologische doeleinden. #### 4.2.1 Aanmaak van transgene dieren * **Pronuclear micro-injection**: DNA wordt direct in de pronuclei van een bevruchte eicel gespoten. De eicel wordt vervolgens geïmplanteerd in een pseudogene muis, en de nakomelingen worden gescreend op de aanwezigheid van het transgene DNA. * **Genetisch gemodificeerde embryonale stamcellen (ES)**: ES-cellen worden geïsoleerd uit een blastocyste, genetisch gemodificeerd in vitro, en vervolgens teruggeplaatst in een blastocyste. Chimerische muizen worden geboren, waarvan de nakomelingen de transgene modificatie kunnen overerven. * **CRISPR-Cas in embryo's**: Genetische bewerking kan direct in embryo's worden uitgevoerd, wat leidt tot snellere creatie van gemodificeerde diermodellen. #### 4.2.2 Kloneren * **Therapeutisch versus reproductief kloneren**: Kloneren houdt in dat een genetisch identieke kopie van een organisme wordt gemaakt. Reproductief kloneren resulteert in een volledig organisme, terwijl therapeutisch kloneren wordt gebruikt om stamcellen te genereren voor medische toepassingen. Bij het Dolly-experiment werd de kern van een somatische cel in een geëucleëerd ei ingebracht. #### 4.2.3 Conditionele expressie * **Tet-on/Tet-off systemen**: Deze systemen maken gebruik van een tetracycline-reguleerbaar repressor (TetR) en een tetracycline-responsief element (TRE) om de genexpressie te reguleren. In Tet-on systemen wordt genexpressie geactiveerd in de afwezigheid van tetracycline/doxycycline, en onderdrukt in de aanwezigheid ervan. Bij Tet-off systemen is het omgekeerd. * **Oestrogeen receptor / Tamoxifen-inducible systemen**: Een fusie-eiwit van de oestrogeenreceptor (ER) en een activatiedomein (X) wordt door Hsp90 inactief gehouden. Bij toevoeging van tamoxifen of oestrogeen, laat ER-X Hsp90 los, migreert naar de kern, en activeert genexpressie. #### 4.2.4 Klonen en knock-out/knock-in technologieën * **Knock-out (KO)**: Het volledig uitschakelen van een gen, vaak door het in te voegen met een selectiemerker en dit vervolgens uit te knippen via Cre-Lox recombinatie. * **Conditionele knock-out (cKO)**: Genexpressie wordt uitgeschakeld in specifieke weefsels of op specifieke tijdstippen door Cre-recombinase te laten coderen onder controle van een weefsel-specifieke promotor. * **Knock-in (KI)**: Het vervangen van een endogeen gen door een gewenste sequentie, vaak met behulp van homologe recombinatie in ES-cellen. Dit kan ook gebruikt worden om tags of reportergenen te introduceren. * **pRosa26-DEST systeem**: Een systeem om cDNA gecontroleerd tot expressie te brengen in muizen na Cre-recombinatie. * **Cre-Lox recombinatie**: Een systeem dat gebruikt wordt voor chromosoomdeleties en conditionele knock-outs. LoxP-sites worden aan weerszijden van het te verwijderen DNA-segment aangebracht. Bij expressie van Cre-recombinase wordt het DNA tussen de LoxP-sites uitgeknipt. #### 4.2.5 Transgenese in specifieke modelorganismen * **Drosophila (fruitvlieg)**: * **P-element insertie**: Wijsgerige integratie van DNA in het genoom via het P-element transposon, wat kan leiden tot variabele expressie door positionele effecten. * **Integratie plasmiden**: Transgenen kunnen specifiek in het genoom worden geïntegreerd door vooraf een "landing site" te integreren. * **UAS-GAL4 systeem**: Dit systeem maakt gebruik van een activator (GAL4) die bindt aan een Upstream Activating Sequence (UAS) om genexpressie te reguleren. Door GAL4 te koppelen aan weefsel-specifieke enhancers, kan genexpressie in specifieke weefsels worden gestuurd. * **Zebrafish**: * **Tol2 transposon**: Een DNA-transposon dat gebruikt wordt voor genoomintegratie. Co-injectie van transposase mRNA met een donorplasmide met de Tol2-construct leidt tot integratie in het zebravissen genoom. * **Conditional gene trapping**: Combineert het verstoren van genexpressie met de expressie van een reportergen. #### 4.2.6 Stamcelonderzoek en organoiden * **Induced pluripotent stem cells (iPSC)**: Somatische cellen (bv. fibroblasten) kunnen worden herprogrammeerd tot pluripotente stamcellen door expressie van specifieke factoren (bv. Yamanaka factoren: Oct4, Sox2, Klf4, c-myc - OSKM, en Nanog). * **Gebruik van vectoren in stamcellen**: Reprogramming vectoren en virale vectoren (bv. Lentivirale vectoren) worden gebruikt om genen in iPSC's in te brengen voor reprogramming of genetische modificatie. * **Organoiden**: Deze driedimensionale celculturen bootsen de structuur en functie van organen na en worden vaak gegenereerd uit iPSC's. Target site specifieke knock-in technologieën met CRISPR worden gebruikt om organoiden te modificeren. ### 4.3 Screeningmethoden Genetische modificatie en bewerkingstechnieken bieden krachtige tools voor genomische screening. * **CRISPR screening**: Genome-wide CRISPR-Cas9 screenings in mammalian cells worden uitgevoerd door cellen bloot te stellen aan Cas9 en een bibliotheek van lentivirale gRNA's. Na toediening van een drug (selectie) wordt genomisch DNA geëxtraheerd en geanalyseerd om genen te identificeren die essentieel zijn voor de overleving of respons op de drug. ### 4.4 Overige methoden en toepassingen * **Homologe recombinatie (HR)**: Een proces dat gebruik maakt van DNA-sequenties die sterk lijken op het doelgen om vector-DNA in het chromosoom te integreren. Het kan worden gebruikt voor geninactivatie (insertievectoren) of genvervanging (vervangingsvectoren). * **Retrotransposons en DNA-transposons**: Mobiele genetische elementen die door "copy-paste" (retrotransposons, vereisen reverse transcriptase) of "cut-and-paste" (DNA-transposons) mechanismen in het genoom kunnen worden geïntegreerd, wat leidt tot insertiemutaties. * **Chemical-mediates mutagenese (bv. ENU)**: Chemische mutagene agentia kunnen worden gebruikt om willekeurige mutaties te induceren in een genoom, wat nuttig kan zijn voor het identificeren van genen die betrokken zijn bij specifieke fenotypes. * **NHEJ (Non-Homologous End Joining)**: Een DNA-reparatiemechanisme dat leidt tot de aan elkaar koppeling van gebroken DNA-uiteinden, vaak met kleine inserties of deleties, wat resulteert in geninactivatie. * **HDR (Homology-Directed Repair)**: Een DNA-reparatiemechanisme dat, indien een sjabloon-DNA aanwezig is, nauwkeurige DNA-veranderingen mogelijk maakt, zoals het inbrengen van specifieke sequenties. > **Tip:** Bij het ontwerpen van experimenten met genetische modificatie is het cruciaal om rekening te houden met mogelijke off-target effecten van nucleases zoals CRISPR-Cas, ZFNs en TALENs. > **Tip:** De keuze van de vector en de leveringsmethode is essentieel voor de efficiëntie van genetische modificatie. Factoren zoals celtype, gewenste expressieduur en immuunrespons moeten worden overwogen. > **Tip:** De Tet-on/Tet-off en oestrogeen receptor/tamoxifen-inducible systemen bieden krachtige controle over genexpressie, waardoor ze onmisbaar zijn voor het bestuderen van de dynamische rol van genen. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Mutagenese | Het proces van het introduceren van mutaties in het genetisch materiaal van een organisme, wat kan leiden tot veranderingen in het genoom. Dit kan zowel spontaan als geïnduceerd gebeuren door chemische stoffen of straling. | | Targetted mutagenese | Een specifieke vorm van mutagenese waarbij de mutaties gericht worden aangebracht op een bepaalde locatie in het genoom van een organisme, vaak met behulp van moleculaire technieken zoals CRISPR/Cas. | | Transgene dieren | Dieren waarin genetisch materiaal van een andere soort of gemodificeerd materiaal is ingebracht en dat stabiel is geïntegreerd in hun genoom, waardoor nieuwe eigenschappen kunnen worden verkregen. | | Geïnduceerd genexpressie | Het proces waarbij de expressie van een specifiek gen kunstmatig wordt geactiveerd of onderdrukt, vaak met behulp van moleculaire schakelaars die reageren op externe prikkels zoals medicatie. | | Conditionele expressie | Een vorm van genexpressie waarbij een gen alleen tot uiting komt in specifieke weefsels, op bepaalde tijdstippen, of onder specifieke omstandigheden, wat nauwkeurige controle over genactiviteit mogelijk maakt. | | Knock-out | Een genetische modificatie waarbij een specifiek gen volledig wordt uitgeschakeld of gedeactiveerd, waardoor de functie ervan in het organisme wordt geëlimineerd voor onderzoeksdoeleinden. | | Knock-in | Een genetische modificatie waarbij een specifiek gen wordt vervangen door een ander gen, een gemodificeerd gen, of een stuk DNA dat een bepaalde functie toevoegt, wat resulteert in een veranderde genetische eigenschap. | | CRISPR/Cas technologie | Een revolutionaire genbewerkingstechnologie die gebruikmaakt van het CRISPR-eiwitcomplex en Cas-enzymen om specifieke DNA-sequenties in het genoom te knippen en te bewerken, met toepassingen variërend van genoomonderzoek tot gentherapie. | | Base editing | Een precisiegenbewerkingstechniek binnen het CRISPR-systeem die een enkele DNA-base (zoals C naar T of A naar G) verandert zonder een dubbelstrengs breuk in het DNA te veroorzaken, waardoor gericht genetische modificaties mogelijk zijn. | | Prime editing | Een geavanceerde CRISPR-gebaseerde techniek die DNA kan veranderen zonder dubbelstrengs breuken en zonder dat er donor-DNA nodig is, vergelijkbaar met een tekstverwerker voor DNA, waardoor precieze DNA-editie mogelijk is. | | Stamcellen | Ongedifferentieerde cellen die het potentieel hebben om te differentiëren tot verschillende gespecialiseerde celtypen en die zichzelf kunnen vernieuwen, cruciaal voor weefselregeneratie en ontwikkelingsonderzoek. | | Organoiden | Miniatuur, vereenvoudigde versies van organen die in vitro worden gekweekt uit stamcellen, die de structuur en functie van hun in vivo tegenhangers nabootsen en gebruikt worden voor onderzoeksdoeleinden. | | Homologe recombinatie | Een DNA-reparatiemechanisme waarbij een dubbelstrengs breuk wordt hersteld met behulp van een homoloog DNA-molecuul als sjabloon, wat vaak wordt benut bij genetische modificatie om specifieke genen te vervangen of te integreren. | | Cre-Lox recombinatie | Een recombinatiesysteem dat gebruikmaakt van het Cre-enzym en LoxP-sites om specifieke DNA-sequenties uit te knippen of om te keren, vaak gebruikt voor het creëren van conditionele knock-outs en chromosoomdeleties. | | Pronuclear micro-injection | Een techniek waarbij genetisch materiaal (bv. DNA) direct in de pronuclei van een bevruchte eicel wordt geïnjecteerd, vaak gebruikt voor de creatie van transgene dieren door snelle integratie in het genoom. | | Genetisch gemodificeerde embryonale stamcellen (ES) | Embryonale stamcellen die genetisch zijn bewerkt in een laboratorium en die vervolgens kunnen worden gebruikt om genetisch gemodificeerde organismen te creëren, door ze in een vroeg embryo te integreren. | | Tet-on/Tet-off systeem | Een inductie-systeem voor genexpressie dat afhankelijk is van tetracycline; Tet-on activeert genexpressie in aanwezigheid van tetracycline, terwijl Tet-off genexpressie onderdrukt in aanwezigheid van tetracycline. | | Oestrogeen receptor / Tamoxifen-inducible | Een inductie-systeem voor genexpressie waarbij een gen wordt geactiveerd door de toevoeging van tamoxifen of oestrogeen, die een gefuseerd oestrogeenreceptor-eiwit activeren en translocatie naar de celkern induceren. | | Knock-out (KO) | Het volledig uitschakelen van de functie van een specifiek gen, vaak door deletie of inactivatie, om de rol van dit gen in biologische processen te bestuderen. | | Conditionele knock-out (cKO) | Een knock-out van een gen die plaatsvindt onder specifieke omstandigheden, zoals in bepaalde weefsels of op bepaalde tijdstippen, wat preciezere analyse van genfuncties mogelijk maakt. | | Knock-in (KI) | Het inbrengen van een nieuw gen of een gemodificeerd gen op een specifieke locatie in het genoom, ter vervanging van het oorspronkelijke gen, om de functie te bestuderen of een nieuwe eigenschap toe te voegen. | | Zinc finger nucleases (ZFNs) | Genbewerkingstools die bestaan uit DNA-bindende zinkvinger domeinen en een DNA-splitsend domein, gebruikt om dubbelstrengs breuken op specifieke locaties in het genoom te creëren ter bevordering van gen-editing. | | Transcription activator like effector nucleases (TALENs) | Genbewerkingstools die lijken op ZFNs maar gebruikmaken van TAL-eiwitdomeinen voor DNA-binding, gecombineerd met een FokI-nuclease domein om dubbelstrengs breuken te induceren voor gen-editing. | | Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) | Een adaptief immuunsysteem in bacteriën dat wetenschappers hebben omgevormd tot een veelzijdige genbewerkingstechnologie (CRISPR/Cas) voor het nauwkeurig bewerken van DNA. | | Protospacer adjacent motif (PAM) | Een korte DNA-sequentie die direct naast de protospacer (het doel-DNA-segment) in het CRISPR-array van bacteriën voorkomt en essentieel is voor de herkenning en binding van Cas-enzymen. | | sgRNA (single guide RNA) | Een enkel molecuul RNA dat zowel de spacer-sequentie (die complementair is aan het doel-DNA) als de scaffold-sequentie (voor binding aan het Cas-eiwit) bevat, gebruikt in CRISPR/Cas9-systemen. | | NHEJ (Non-homologous end joining) | Een DNA-reparatiemechanisme dat dubbelstrengs breuken repareert door de uiteinden direct aan elkaar te verbinden, wat vaak resulteert in inserties of deleties (indels) en geninactivatie. | | HDR (Homology-directed repair) | Een DNA-reparatiemechanisme dat dubbelstrengs breuken herstelt met behulp van een homoloog DNA-sjabloon, wat nauwkeurige genetische modificaties zoals knock-ins mogelijk maakt. | | Virale vectoren | Virusdeeltjes die zijn aangepast om genetisch materiaal af te leveren in doelcellen, gebruikt in gentherapie en genoommodificatie vanwege hun efficiëntie in celtransductie. | | Niet-virale vectoren | Alternatieve methoden voor het afleveren van genetisch materiaal in cellen die geen gebruik maken van virussen, waaronder fysieke methoden (bv. micro-injectie, elektroporatie) en chemische methoden (bv. liposomen, nanopartikels). | | Therapeutisch kloneren | Het creëren van genetisch identieke cellen of weefsels van een patiënt, waarbij een kern van een somatische cel wordt ingebracht in een geënucleëerde eicel, met als doel regeneratieve geneeskunde. | | Reproductief kloneren | Het creëren van een genetisch identiek organisme door middel van celkernoverplanting, waarbij de kern van een somatische cel wordt ingebracht in een geënucleëerde eicel, die vervolgens uitgroeit tot een nieuw organisme. | | Induced pluripotent stamcellen (iPSC) | Somatische cellen die genetisch zijn herprogrammeerd tot een pluripotente staat, vergelijkbaar met embryonale stamcellen, waardoor ze kunnen differentiëren tot elk celtype en waardevol zijn voor onderzoek en therapie. |