01 inleiding & techniek 25-26 & notes.pdf

# Methoden voor het prepareren en observeren van cellen en weefsels ## 1. Inleiding tot het prepareren en observeren van cellen en weefsels Het prepareren en observeren van cellen en weefsels is essentieel om hun structuur en details zichtbaar te maken met licht- of elektronenmicroscopie, aangezien biologisch materiaal zelf te dik is en te weinig contrast biedt. Dit vereist specifieke histologische technieken, waaronder fixeren, inbedden, snijden en kleuren [42](#page=42) [7](#page=7). ### 1.1 Noodzaak van histologische technieken Biologisch materiaal is vaak te dik om lichtstralen of elektronen door te laten, wat waarneming bemoeilijkt. Daarnaast ontbreekt het aan voldoende contrastverhogende componenten om structuurdetails te kunnen waarnemen. Histologische technieken maken het mogelijk weefsels voldoende dun te snijden en contrast aan te brengen, zodat structuurdetails zichtbaar worden [42](#page=42). ### 1.2 Kerntechnieken in weefselpreparatie De hoofdtechnieken omvatten: * **Fixeren**: Het stabiliseren en conserveren van weefselstructuur [45](#page=45). * **Inbedden**: Het omwikkelen en doordringen van gefixeerd materiaal met een substantie die het snijdbaar maakt [46](#page=46). * **Snijden**: Het vervaardigen van dunne plakken (coupes) uit het ingebedde materiaal [48](#page=48). * **Kleuren/Contrasteren**: Het aanbrengen van zichtbaarheid aan weefselstructuren die anders transparant zouden zijn [63](#page=63). ## 2. Fixeren Fixeren dient om weefsels te bewaren met behoud van hun oorspronkelijke structuur, wat voornamelijk gebeurt door denaturatie van eiwitten. Afbraakenzymen worden actief zodra een weefsel uit zijn in-vivo situatie wordt gehaald, en fixatie stopt deze processen [45](#page=45). ### 2.1 Fixatiemethoden Er zijn twee hoofdbenaderingen voor fixatie: * **Chemische fixatieven**: Stoffen zoals formol (formaldehyde) voor lichtmicroscopie (LM) en glutaraldehyde of osmiumtetroxide (OSO4) voor elektronenmicroscopie (EM). Chemische fixatie kan eiwitten cross-linken (bijvoorbeeld met formaldehyde of glutaraldehyde) of neerslaan (precipiteren) (bijvoorbeeld met alcohol of aceton). Deze methode resulteert over het algemeen in een betere morfologie [45](#page=45). * **Bevriezen (koudefixatie)**: Het weefsel snel invriezen om enzymactiviteit te stoppen. Koudefixatie laat een snelle doorwerking van materiaal toe en bewaart epitopen beter voor immuunkleuringen. Dit wordt veel gebruikt in pathologielaboratoria voor snelle diagnoses van biopten [45](#page=45). ### 2.2 Artefacten bij fixatie Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in-vivo situatie worden artefacten genoemd. Dit kan leiden tot structuurveranderingen, zoals holtevorming rond cellen, of het verplaatsen van componenten [45](#page=45). ## 3. Inbedden Inbedden omvat het omwikkelen en doordringen van gefixeerd materiaal met een inbedmiddel. Dit inbedmiddel moet het weefsel volledig kunnen binnendringen en vervolgens hard worden, zodat het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken [46](#page=46). ### 3.1 Inbedmiddelen en het verwijderen van water Inbedmiddelen zijn doorgaans hydrofoob. Aangezien biologisch materiaal veel water bevat, is het noodzakelijk dit water te verwijderen voordat een hydrofoob inbedmiddel kan binnendringen. Dit gebeurt door dehydratatie in een stijgende reeks alcoholbaden (bijvoorbeeld 30%, 50%, 70%, 90% en absolute ethanol). Daarna volgt een 'clearing' stap met een substantie zoals tolueen, die mengbaar is met zowel alcohol als het inbedmiddel [43](#page=43) [46](#page=46) [47](#page=47). ### 3.2 Veelgebruikte inbedmiddelen * **Paraffine**: Een klassiek inbedmiddel voor LM, dat relatief zacht is. Het wordt verwarmd tot ongeveer 55°C, waarbij het smelt en in het weefsel kan indringen. Veel epitopen blijven bewaard bij deze temperatuur [48](#page=48). * **Harsen en plastics**: Deze zijn harder dan paraffine en maken coupes mogelijk tot ongeveer 60-70 nm dik, wat geschikt is voor EM. Polymerisatie van het hars vindt plaats bij hogere temperaturen (60-65°C). Harsen zijn minder geschikt voor immuunkleuringen omdat ze moeilijk uit het weefsel te verwijderen zijn [48](#page=48). ## 4. Snijden Snijden maakt het mogelijk om uit het harde, ingebedde materiaal dunne plakken (coupes) te verkrijgen die doordringbaar zijn voor licht of elektronen [48](#page=48). ### 4.1 Diktes van coupes * **Paraffine coupes**: Hebben een dikte van ongeveer 5-10 µm en zijn doorlaatbaar voor licht [43](#page=43) [48](#page=48). * **Hars/plastic coupes**: Kunnen een dikte hebben van ongeveer 70 nm en zijn doorlaatbaar voor elektronen [48](#page=48). ### 4.2 Microtomen en draagmateriaal Het snijden gebeurt met een microtoom [48](#page=48). * Voor LM worden stalen messen gebruikt [48](#page=48). * Voor EM worden glazen of diamanten messen gebruikt [48](#page=48). De verkregen coupes worden geplaatst op: * **Microscoopglaasjes** voor LM-analyse [43](#page=43) [48](#page=48). * **Metalen roosters (grids)** voor EM-analyse [48](#page=48). ## 5. Kleuren voor LM-observatie Wit licht bestaat uit een spectrum van golflengtes, en de contrasten in coupes zijn vaak laag. Kleurstoffen, meestal in waterige oplossingen, worden gebruikt om deze structuren zichtbaar te maken. Voor kleuring worden de coupes eerst gedeparaffineerd met tolueen [63](#page=63). ### 5.1 Hematoxyline en Eosine (H/E) kleuring Dit is de meestgebruikte routinematige kleuring en is al meer dan een eeuw essentieel voor weefselidentificatie en kankerdiagnose. De kleuring is gebaseerd op ionische binding tussen weefselcomponenten en kleurstoffen [64](#page=64) [65](#page=65). * **Hematoxyline**: Complex met aluminiumzouten is kationisch en werkt als een basische kleurstof. Het kleurt negatief geladen, basofiele celbestanddelen, zoals nucleïnezuren in de celkern, blauw of donker paars. De kernen vertonen variërende patronen van heterochromatinecondensatie die diagnostisch belangrijk zijn. Nucleoli worden met eosine gekleurd [64](#page=64) [65](#page=65). * **Eosine**: Is anionisch en werkt als een zure kleurstof. Het kleurt positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals eiwitten in het cytoplasma, roze. Cytoplasma en extracellulaire matrix kleuren variërend roze. Overvloedige polyribosomen kunnen het cytoplasma een blauwe gloed geven. De Golgi-zone kan zichtbaar zijn door afwezigheid van kleuring [64](#page=64) [65](#page=65). > **Tip:** Een beperking van hematoxylinekleuring is dat het onverenigbaar is met immunofluorescentie, maar het is nuttig voor seriële coupes waarop immunofluorescentie zal worden uitgevoerd. Hematoxyline kan ook dienen als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures met colorimetrische substraten [65](#page=65) [66](#page=66). ### 5.2 Specifieke kleurtechnieken Naast H/E zijn er andere kleurtechnieken: * **Indifferente kleurstoffen**: Kleuren vetten aan [68](#page=68). * **Immunohistochemische kleuring**: Kleurt specifieke bestanddelen aan op basis van antigen/antilichaambinding. Het antilichaam is voorzien van een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud. Voorbeelden zijn kleuring met Oil Red O voor vetcellen en kleuring met DAB voor microtubuli of connexine 43 [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70). * **Enzymkleuringen**: Tonen de activiteit van enzymen aan door gebruik te maken van een enzym-specifiek substraat. De reactie resulteert in een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de G6PD-kleuring met tetrazoniumzout, die G6PD-bevattende en G6PD-deficiënte erytrocyten onderscheidt [68](#page=68) [71](#page=71). ## 6. Preparatie en kleuring voor elektronenmicroscopie (EM) EM maakt gebruik van elektronen, die een veel kleinere golflengte hebben dan licht, wat hogere resoluties mogelijk maakt. De golflengte van zichtbaar licht varieert van 400 tot 800 nm. Objecten kleiner dan een kwart micron zijn niet waarneembaar met een lichtmicroscoop . ### 6.1 Technische complicaties en vereisten voor EM * **Vacuüm**: Elektronen worden gemakkelijk gestopt door gasmoleculen, waardoor EM-apparatuur een bijna absoluut vacuüm vereist . * **Elektronenbundel**: Hoogspanning is nodig om elektronen snelheid te geven, en elektrische en magnetische velden fungeren als lenzen om de bundel te manipuleren. Dit vereist aangepaste fixatie- en kleuringstechnieken . ### 6.2 Fixatie en kleuring voor TEM Voor Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) worden specifieke technieken gebruikt: * **Fixatie**: * Glutaraldehyde (bivalente crosslinker van NH2-groepen in eiwitten) . * Osmiumtetroxide (OSO4), een sterk oxidans dat lipiden en eiwitten stabiliseert . * **Kleuring (contrastering)**: Biologisch materiaal geeft van zichzelf weinig contrast in een TEM. Contrast wordt verkregen door verbindingen van zware metalen, die elektronen weerkaatsen en zich aan specifieke structuren binden, waardoor deze als donkere delen verschijnen. Lichtere vormen laten meer elektronen door . * **Negatieve kleuring**: Exclusie van deeltjes (bv. virusdeeltjes) van zware metalen zoals uranylacetaat en fosfowolframzuur . * **Schaduwtechnieken (shadowing)**: Schuine bestuiving met platina, goud, etc., gevolgd door preparaatversterking met een koolstoffilm . * **Kleuring van ultradunne secties**: Na fixatie worden coupes (50-100 nm dik) gekleurd met bijvoorbeeld uranylacetaat en lood. Gezien de dunte van de secties is expertise nodig voor correcte 3D-interpretatie. Dikke coupes zouden alle elektronen tegenhouden en een zwart beeld geven . --- # Celcultuurtechnieken en -omstandigheden Celcultuurtechnieken omvatten de methoden en omstandigheden die nodig zijn om cellen in vitro te laten groeien en onderhouden, variërend van historische orgaankweek tot moderne monolaag- en 3D-culturen [8](#page=8). ### 2.1 Historische Ontwikkelingen De geschiedenis van celcultuur begon met de ontwikkeling van 3D "Tissue Culture" (TC) door Harrison in 1907, waarbij zenuwen van kikkerembryo's werden gekweekt in lymfe op glasplaatjes. Later, in 1948, ontwikkelde Earle 2D monolaagcultures, die de 3D organen en weefsels simuleerden. Aanvankelijk bestonden monolaagcultures uit orgaanexplanten (primaire cultures) in groeimedia zoals EMEM. Vervolgens werden stabiele, geïmmortaliseerde cellijnen ontwikkeld, die afkomstig waren van tumoren of verkregen werden na selectie ('crisis') van cultures die anders verouderden en afstierven ('senescence'). Immortalisatie kan ook worden bereikt door de introductie van virale oncogenen [8](#page=8). ### 2.2 Stadia van Celcultivering Het proces van het maken van een cellijn uit een orgaan of tumor omvat meerdere stappen. Eerst wordt het weefsel enzymatisch behandeld. Vervolgens worden de cellen uitgroeien in een groeirecipiënt, zoals een petridish. Als een confluente laag cellen ontstaat, worden de cellen losgemaakt en gesplitst [9](#page=9). ### 2.3 Typische Celculturen Typische celculturen tonen monolaagculturen van epitheelcellen, waarbij kolonies ontstaan uit individuele cellen. Een vergroting toont de celranden, terwijl een lagere vergroting de kolonies laat zien die uit enkele cellen bestaan [10](#page=10). ### 2.4 Groeimedia ### 2.4.1 Minimum Essential Medium (MEM) MEM is een klassiek celmedium dat essentiële componenten bevat voor celgroei [11](#page=11): * Isotonische zouten, zoals het NaHCO3/H2CO3-buffersysteem dat ook in bloed aanwezig is [11](#page=11). * Een energiebron, doorgaans glucose [11](#page=11). * Essentiële aminozuren en vitamines die de cel niet zelf kan synthetiseren [11](#page=11). * Serum, dat vrijwel essentieel is, maar kan variëren in kwaliteit en duur zijn vanwege de natuurlijke oorsprong [11](#page=11). ### 2.4.2 Andere Klassieke Celmedia Naast MEM worden ook andere klassieke celmedia gebruikt, waaronder DMEM, M199, McCoy's en RPMI 1640. Voorbeelden van groeimedia in wetenschappelijke literatuur worden vaak vetgedrukt weergegeven [11](#page=11) [13](#page=13). ### 2.5 Cultuurcondities Om cellen in vitro vergelijkbaar te maken met de in vivo situatie, moeten de cultuurcondities juist zijn. Een belangrijke conditie is het groeien onder een atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Dit percentage CO2 ligt dicht bij dat van bloed en weefselvochten (in de atmosfeer is het slechts 0,03%) en is cruciaal voor het handhaven van een optimale pH van ongeveer 7,4 [11](#page=11). ### 2.6 Cultuurrecipiënten Verschillende soorten cultuurrecipiënten worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele opzet [12](#page=12). * **Gesloten flessen (voor in warme kamer):** Hierbij wordt CO2 toegevoegd voordat de fles wordt gesloten [12](#page=12). * **Open platen (voor in CO2 ovens):** Deze worden gebruikt in CO2-ovens [12](#page=12). * **Rollerflessen:** Deze bieden een groot oppervlak voor celgroei met relatief weinig medium [12](#page=12). Deze recipiënten worden geplaatst in een CO2-oven die de vereiste temperatuur en atmosfeer handhaaft [12](#page=12). ### 2.7 Oorsprong van Cellen en Cellijnen Cellen en cellijnen kunnen afkomstig zijn van andere laboratoria, zelf worden geïsoleerd (primaire cultures), of verkregen worden uit celbanken zoals ATCC (The American Type Culture Collection) of ECACC (The European Collection of Cell Cultures) [14](#page=14). ### 2.8 Groeisubstraten en -procedures Groeisubstraten zijn essentieel voor adherente celculturen en beschermen cellen tegen anoïkis (een vorm van geprogrammeerde celdood of apoptose). Ze zijn niet nodig voor circulerende bloedcellen of bepaalde tumorcellen [15](#page=15). #### 2.8.1 Materiaal van Groeisubstraten Diverse materialen worden gebruikt als groeisubstraat: * **Glas:** Een negatief geladen materiaal [15](#page=15). * **Voorbehandeld polystyreen:** Veelgebruikt in microplaten, flessen, multiplaten en rollerflessen [15](#page=15). * **Coatings:** Deze worden toegepast om specifieke interacties met de cellen te bevorderen: * **Poly-D-lysine:** Heeft een sterke positieve lading [15](#page=15). * **Collageen:** Een eiwit uit de Extracellulaire Matrix (ECM) [15](#page=15). * **Geconditioneerd milieu:** Kan continu worden gevormd door feedercelculturen, die geïnhibeerd zijn in celdeling maar wel metabolisme vertonen (bijvoorbeeld door gamma-stralen irradiatie) [15](#page=15). #### 2.8.2 Doel van Groeisubstraten Het substraat dient ter bescherming tegen anoïkis en is essentieel voor adherente celculturen. Het doel is om de in vitro-condities zo veel mogelijk te laten lijken op de in vivo-situatie, wat kan inhouden dat cellen op ECM-eiwitten worden gekweekt. Soms hebben cellen signalen of stoffen van omringende cellen nodig, wat nagebootst kan worden door het medium van de moedercultuur te gebruiken of door cellen op een feedercellaag te laten groeien [15](#page=15). ### 2.9 Interactie met de Micro-omgeving In vivo hebben cellen continu contact met hun micro-omgeving, zowel fysiek (tussen cellen of met de basaalmembraan/ECM) als via secretie van bijvoorbeeld groeifactoren. Dit contact kan aspecifiek zijn (fysieke interactie, adhesie en spreiding) of specifiek (functionele interactie met onderliggende cellen en ECM, leidend tot differentiatie-inductie). De basaalmembraan (BM) speelt bijvoorbeeld een rol in het polariseren en functioneel controleren van basale keratinocyten in de huid [16](#page=16). ### 2.10 Celdensiteits-afhankelijke Inhibitie Cellen in cultuur delen totdat ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Op dit punt treedt 'contactinhibitie' van celproliferatie op, deels door competitie voor mitogenen. Om de cultuur te behouden, kan vers medium worden toegevoegd om delingen te hervatten, of de cultuur kan efficiënter worden gesplitst in dochterculturen via een trypsine-EDTA procedure [17](#page=17). ### 2.11 Groei in 2D en 3D Culturen 2D monolaagcultures zijn de meest gangbare vorm, waarbij cellen zich uitspreiden over het substraat. Echter, bepaalde cellen, zoals tumorcellen, kunnen het vermogen van contactinhibitie hebben verloren en daardoor in 3D structuren groeien, bijvoorbeeld in dichte foci of sferoïden. 3D culturen proberen de in vivo omgeving beter na te bootsen. MDCK cellen, bijvoorbeeld, kunnen op filters groeien in een 2D cultuur of cysten vormen in een omgeving met de juiste extracellulaire componenten, wat de polarisatie van cellulaire eiwitten nabootst [10](#page=10) [18](#page=18) [19](#page=19). ### 2.12 Procedure van Celtransfer Celtransfer is essentieel voor het onderhouden en uitbreiden van celculturen. #### 2.12.1 Celtransfer van Suspensie- en Adherente Cellen * **Suspensiecultures:** De celtransfer gebeurt door eenvoudige verdunning, eventueel na zacht centrifugeren en heropname in vers medium [20](#page=20). * **Adherente cellen:** Celtransfer vindt plaats wanneer confluentie van de cel(mono)laag optreedt, gemiddeld om de 3 tot 7 dagen [20](#page=20). #### 2.12.2 Trypsine/EDTA Procedure voor Adherente Cellen De celtransfer van adherente cellen vereist de behandeling met trypsine/EDTA (TE) [20](#page=20). * **Trypsine:** Een maagprotease dat bij korte behandeling de oppervlakte-eiwitten van de cellen degradeert [20](#page=20). * **EDTA (ethyleendiaminetetra-acetaat):** Cheleert calcium- en magnesiumionen, wat intercellulaire adhesie en cel-substraat-binding interfereert [20](#page=20). In geschikte condities komen de cellen los van het substraat en van elkaar, en vormen een suspensie van levende, opgebolde cellen. Deze suspensie wordt idealiter monocellulair verkregen. Vervolgens wordt de suspensie 1 over 3 (voor 'normale' cellen) tot 1 over 30 (voor 'tumorale' cellen) uitverdund (uitgesplitst) en uitgezaaid in nieuwe recipiënten. Het resterende trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren, die van nature in het serum aanwezig zijn [20](#page=20). > **Tip:** Werk met cellen altijd in een laminaire flowbench om contaminatie te voorkomen [21](#page=21). ### 2.13 Stappen bij Celadhesie en -spreiding Na het losmaken en uitplaatsten van cellen vinden de volgende stappen bij celadhesie en -spreiding plaats [22](#page=22): 1. **Settling:** Cellen zakken uit onder invloed van gravitatie [22](#page=22). 2. **Initiële contact:** Cellen maken initieel contact met het substraat, met een minimaal adhesie-oppervlak omdat de cellen nog opgebold zijn [22](#page=22). 3. **Progressieve spreiding:** In de uren daarna ondergaan de cellen een proces van geleidelijke spreiding over het substraat. Dit proces vereist energie en cytoskelet-wijzigingen, wat leidt tot een vergroting van het celcontact-oppervlak en versterking van de cel-substraat-adhesie [22](#page=22). 4. **Sterke binding:** Cellen gaan een sterke binding aan met het substraat door dit laatste te modificeren met zelf aangemaakte ECM-moleculen [22](#page=22). Ondanks deze sterke adhesie kan een cel doorgaans migreren over het celoppervlak door tijdelijk de adhesie lokaal te inhiberen en elders op te bouwen [22](#page=22). ### 2.14 Speciale Apparatuur voor Celcultuur Voor celcultuur is speciale apparatuur vereist die steriele en gecontroleerde omstandigheden waarborgt [23](#page=23): * **Laminaire flowbench:** Deze unit zorgt voor een luchtstroom gefilterd door High Efficiency Particulate Air (HEPA) filters om contaminatie te voorkomen [23](#page=23). * **CO2-oven:** Een incubator die de temperatuur en de CO2-concentratie (essentieel voor pH-controle) nauwkeurig reguleert, eveneens voorzien van HEPA filters [23](#page=23). * **Opslag van ingevroren cellen:** Cellen kunnen langdurig worden opgeslagen in vloeibare stikstof (-196°C) [23](#page=23). ### 2.15 Voorbeelden van Celcultuur-experimenten Voorbeelden van celcultuur-experimenten illustreren de praktische toepassing van deze technieken. Een onderzoekscentrum voor celcultuur kan beschikken over meerdere laminaire flowbenches om het werk te faciliteren [24](#page=24) [25](#page=25). --- # Stamcellen en hun toepassingen Stamcellen zijn cellen met het unieke vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie, wat essentieel is voor ontwikkeling en herstel in organismen. ### 3.1 Definitie en eigenschappen van stamcellen Een stamcel wordt gedefinieerd als een cel die het vermogen heeft om zich voortdurend te delen en te differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen of weefsels. Stamcellen bezitten twee cruciale eigenschappen [27](#page=27): 1. **Zelfvernieuwing**: Het vermogen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te maken [28](#page=28). 2. **Differentiatie**: Het vermogen om te differentiëren en zo volwassen celtypen te vormen die organen en weefsels opbouwen [28](#page=28). #### 3.1.1 Totipotentie Totipotente stamcellen zijn cellen die het potentieel hebben om zich tot een volledig individu te ontwikkelen, inclusief de placenta. De bevruchte eicel in de eerste uren na bevruchting is totipotent [28](#page=28). #### 3.1.2 Pluripotentie Pluripotente stamcellen hebben de potentie om zich te ontwikkelen tot vele, maar niet alle, celtypen. De binnenste celmassa van een blastocyst, die zich ontwikkelt tot een foetus (maar zonder de placenta), bestaat uit pluripotente stamcellen. Na ongeveer 4 dagen celdeling na bevruchting, vormt de bevruchte eicel een blastocyst, een holle bal van ongeveer 140 cellen. De buitenste cellen van de blastocyst differentiëren tot de placenta, terwijl de binnenste celmassa de potentie heeft om een foetus te vormen [29](#page=29). #### 3.1.3 Multipotentie Multipotente stamcellen zijn cellen die zich tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen binnen een bepaalde cel- of weefsellijn kunnen ontwikkelen. Ze zijn dus beperkter in hun differentiatiepotentieel dan pluripotente stamcellen. Een voorbeeld hiervan zijn hemopoëtische stamcellen, die zich kunnen ontwikkelen tot verschillende soorten bloedcellen zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar niet tot andere celtypen buiten de bloedlijn [30](#page=30). ### 3.2 Aanmaak van stamcellen #### 3.2.1 Aanmaak van muizen embryonale stamcellen De aanmaak van muizen embryonale stamcellen (ES) omvat de isolatie van de binnenste celmassa (ICM) uit een muizen blastocyst. De ICM wordt vervolgens gekweekt op een feederlaag met groeifactoren. Na scheiding van de cellen (vaak door trypsinebehandeling) kunnen individuele cellen opnieuw worden uitgezaaid. Dit proces kan herhaald worden voor meerdere generaties, en door de cellen in te vriezen, kan de cellijn behouden blijven. Voor de kweek van muizen ES-cellen zijn Leukaemia inhibitory factor (LIF) en feeders essentieel [31](#page=31). #### 3.2.2 Aanmaak van humane embryonale stamcellen De aanmaak van humane embryonale stamcellen (hES) is ook beschreven, waarbij soortgelijke principes van isolatie en kweek worden gevolgd [32](#page=32). ### 3.3 Ethische overwegingen bij humane embryonale stamcellen Stamcelonderzoek, met name met embryonale stamcellen (ESCs), is ethisch beladen. Hoewel het onderzoek essentieel is voor het begrijpen van celontwikkeling, ziekten en medicijnwerking, is het gebruik van embryo's controversieel. Embryo's komen vaak uit IVF-trajecten, en de status van een embryo als een potentieel menselijk leven roept ethische vragen op [33](#page=33). Verschillende standpunten bestaan hierover: * Een minderheidsstandpunt beschouwt een embryo als een mens in het klein, en het vernietigen ervan voor onderzoek wordt als moord beschouwd, waardoor embryo-onderzoek strikt onaanvaardbaar is [33](#page=33). * Een ander standpunt is dat embryo-onderzoek acceptabel is, maar enkel op overgebleven embryo's uit IVF-cycli die anders weggegooid zouden worden. Het creëren van embryo's specifiek voor onderzoek is hierbij niet toegestaan [33](#page=33). * Het moment van embryo-gebruik is ook van belang; oudere embryo's worden meer als mens gezien. In België mag een embryo maximaal 12 dagen oud zijn voor onderzoek [33](#page=33). De algemene tendens in de westerse onderzoekswereld is om stamcelonderzoek met grote voorzichtigheid toe te staan. In Nederland is stamcelonderzoek toegestaan, maar onderworpen aan strikte wetgeving die het doel van het onderzoek, de methoden, het laboratorium en de kwalificaties van de onderzoeker reguleert [33](#page=33). ### 3.4 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) zijn een ethisch minder beladen alternatief voor embryonale stamcellen. Deze cellen worden gecreëerd door volwassen somatische cellen te herprogrammeren naar een pluripotente staat, vergelijkbaar met embryonale stamcellen. Dit proces maakt het mogelijk om pluripotente stamcellen te verkrijgen zonder het gebruik van embryo's [34](#page=34). ### 3.5 Toepassingen van stamcellen Stamcellen kunnen in vitro worden gekweekt om pluripotente stamcelpopulaties te genereren. Een veelbelovende toepassing is de creatie van organoïden, wat in feite in vitro gekweekte organen zijn, gemaakt vanuit stamcellen. Deze organoïden bieden mogelijkheden voor ziekteonderzoek, medicijnontwikkeling en potentieel voor regeneratieve geneeskunde [35](#page=35) [36](#page=36). --- # Microscopische technieken voor celanalyse Dit hoofdstuk beschrijft de principes, apparatuur en toepassingen van verschillende microscopische technieken die gebruikt worden voor celanalyse, met een focus op lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie. ### 4.1 Lichtmicroscopie Lichtmicroscopie maakt gebruik van zichtbaar licht om cellen en hun structuren te bestuderen. De resolutie, de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven, wordt begrensd door de golflengte van het licht en de kwaliteit van het objectief, en is doorgaans ongeveer 200 nm. Voor de analyse van celculturen worden preparaten vaak op dekglaasjes behandeld, terwijl dikker materiaal zoals weefsels versneden wordt of speciale microscopen vereist. De effectieve resolutie wordt deels bepaald door de aard van het preparaat: gefixeerd en gekleurd materiaal voor detectie op basis van lichtabsorptie, of levend materiaal dat speciale technieken vereist vanwege het inherente lage contrast [52](#page=52). #### 4.1.1 Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop De meeste preparaten worden bekeken met doorvallend wit licht, wat leidt tot de term helder- of klaarveldmicroscopie (bright field). Een lichtmicroscoop (LM) bestaat uit optische en fijnmechanische componenten. De optiek omvat drie lenssystemen: de condensor, het objectief en de oculairen. De condensor bundelt het licht op het preparaat, wat samen met het objectief de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit bepaalt. Licht van een lichtbron wordt via een spiegel naar de condensor geleid, die het op het preparaat bundelt. Het objectief vormt een vergroot beeld dat door het oculair verder wordt vergroot en op het netvlies wordt geprojecteerd. Een prisma kan worden gebruikt om de lichtweg te buigen voor een comfortabelere positie voor de onderzoeker [53](#page=53). > **Tip:** Het type medium tussen het objectief en het preparaat (lucht, water, olie) beïnvloedt de resolutie; olie-immersieobjectieven bieden de hoogste resolutie [54](#page=54). Verschillende typen lichtmicroscopen zijn beschikbaar, waaronder de histologie-microscoop, de discussie-microscoop met digitale camera, en de geïnverteerde lichtmicroscoop die ideaal is voor het observeren van levende celculturen [56](#page=56). **Kleurtechnieken in de lichtmicroscopie:** * **HE-kleuring (Hematoxyline/Eosine):** Hematoxyline kleurt zure (basofiele) componenten zoals celkernen donkerblauw, terwijl eosine zure/eosinofiele stoffen zoals eiwitten roze kleurt. Deze kleuring wordt vaak gebruikt in de histologie [57](#page=57). * **PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff):** Kleurt vrije suikers, zoals het intervilleuze slijm en de microvilli van darmcellen [57](#page=57). > **Voorbeeld:** De kleuring van een darmvillus met PAS en hematoxyline toont het slijm op de microvilli (PAS-positief) en de celkernen (hematoxyline-positief). Een doorsnede van de dunne darm met HE-kleuring visualiseert structuren zoals villi, lamina propria, submucosa en crypten [57](#page=57) [58](#page=58). #### 4.1.2 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen Onggekleurde preparaten vertonen vaak weinig contrast, wat specifieke technieken vereist voor levende cellen. * **Fasecontrastmicroscopie:** Deze techniek, ontwikkeld door Zernike, maakt gebruik van faseverschuivingen veroorzaakt door kleine brekingsverschillen in het preparaat. Deze faseverschuivingen worden omgezet in amplitudeveranderingen (licht/donker), waardoor ongekleurde preparaten zoals levende celculturen of bevroren coupes zichtbaar worden. Het principe berust op het manipuleren van faseverschillen die ontstaan door afwijkende brekingsindices in het preparaat, wat resulteert in een zwart-wit beeld [59](#page=59) [60](#page=60). * **Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) Microscopie (Nomarski):** Gebruikt interferentie van gepolariseerd licht om contrast te genereren. Deze techniek vereist gespecialiseerde prisma's en interferentiefilters. DIC-microscopie benut eveneens de faseverschillen in het preparaat door interferentie, wat resulteert in een zwart-wit beeld [59](#page=59) [60](#page=60). > **Tip:** Beide technieken, fasecontrast en DIC, zijn uitermate geschikt voor het bestuderen van levende, ongekleurde cellen en kunnen dynamische processen gedetailleerd weergeven [62](#page=62). #### 4.1.3 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen, genaamd fluorochromen. Deze fluorochromen absorberen licht van een specifieke golflengte (excitatie) en zenden vervolgens licht uit van een langere golflengte (emissie) [72](#page=72) [73](#page=73). **Principe van Epifluorescentie:** 1. **Excitatiebron:** Meestal een kwikdamplamp, xenonlamp of LED's [74](#page=74). 2. **Golflengtefilters in een filterkubus:** * **Excitatiefilter:** Laat de excitatielichtgolflengte door [74](#page=74). * **Dichroïsche spiegel (beamsplitter):** Reflecteert excitatielicht naar het objectief en laat emissielicht door naar de detector [74](#page=74). * **Emissiefilter (stopfilter):** Blokkeert overgebleven excitatielicht en laat alleen het emissielicht door [73](#page=73) [74](#page=74). 3. **Detector:** Ogen of een camera (digitaal/analoog) [74](#page=74). Het excitatie- en emissiespectrum van een fluorofoor, zoals fluoresceïne (of Alexa 488), laat zien bij welke golflengtes absorptie en emissie plaatsvinden [73](#page=73). **Toepassingen van fluorescentiemicroscopie:** * **Kwantificeren van moleculen in cellen:** * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Hun fluorescentie is afhankelijk van de ionenconcentratie (bv. intracellulair Ca²⁺). Fura-2 is een voorbeeld van een Ca²⁺-gevoelige kleurstof [75](#page=75). * **Immunofluorescentie microscopie:** Detectie van specifieke eiwitten met behulp van antilichamen waaraan een fluorofoor is gekoppeld [75](#page=75). * **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Visualisatie van specifieke eiwitten in levende cellen [75](#page=75). * **Visualisatie van organellen:** Lysosomen en mitochondria kunnen worden aangekleurd in gecultiveerde cellen [76](#page=76). * **Visualisatie van specifieke eiwitten:** In gefixeerde cellen of weefsels [77](#page=77). * **Aankleuren van meerdere moleculen:** Twee verschillende eiwitten in een cel kunnen gelijktijdig worden gevisualiseerd [78](#page=78). * **Live Cell Imaging:** Inbouw van genen voor fluorescente eiwitten (bv. Blue Fluorescent Protein, Yellow Fluorescent Protein) maakt de visualisatie van dynamische processen in levende cellen mogelijk. Dubbele fluorescentie kan colocalisatie van verschillende structuren aantonen, zoals het cytoskelet en vinculine [79](#page=79). > **Tip:** Verschillende soorten fluorescente eiwitten zijn beschikbaar en kunnen tot expressie worden gebracht in gastheercellen [80](#page=80). Typische epifluorescentiemicroscopen variëren van klassieke opstellingen met digitale registratie tot systemen zonder oculairen voor directe registratie. Gecombineerde technieken, zoals overlay van DIC-beelden met fluorescentiebeelden, bieden uitgebreide informatie [81](#page=81) [82](#page=82). #### 4.1.4 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) CLSM is een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die een hogere resolutie en optische doorsneden mogelijk maakt [72](#page=72). **Principe van CLSM:** 1. Een laserstraal excitereert een specifiek punt in het preparaat [84](#page=84). 2. Het emissielicht van dit punt gaat door een pinhole (klein gat) [84](#page=84). 3. De pinhole blokkeert emissielicht dat afkomstig is van boven of onder het gefocuste vlak, waardoor alleen licht uit het scherpe vlak wordt doorgelaten naar de detector (bv. een fotomultiplicatorbuis - PMT) [84](#page=84). 4. Het monster wordt punt voor punt afgetast (scannen), waardoor een 3D beeld van de fluorescentie-emissie kan worden opgebouwd [84](#page=84). > **Tip:** CLSM elimineert onscherpte van licht dat buiten het focale vlak wordt gegenereerd, wat resulteert in scherpere beelden en een hogere optische resolutie in de Z-richting vergeleken met conventionele epifluorescentie [85](#page=85) [86](#page=86). CLSM is beter geschikt voor time-lapse opnamen en analyse van dynamische processen [87](#page=87). #### 4.1.5 Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie Deconvolutie is een computermatige bewerking die onscherpte uit conventionele digitale beelden verwijdert, wat leidt tot zeer aanvaardbare hoge resoluties. Door softwarematige correctie van de optische aberraties kan de beeldkwaliteit aanzienlijk worden verbeterd [86](#page=86) [87](#page=87). #### 4.1.6 4D Live Cell Imaging Deze techniek combineert snelle 3D multi-kleuren imaging met time-lapse opnames om dynamische processen in levende cellen over tijd te bestuderen [88](#page=88). * **3D Multi-kleuren Imaging:** Simultane registratie van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies [88](#page=88). * **Time-lapse Recording:** Registratie van processen over een bepaalde periode, waarbij op vaste tijdspunten 3D beelden worden genomen bij verschillende golflengtes. De beelden worden geassembleerd tot een versnelde film [88](#page=88). De opstelling voor 4D live cell imaging omvat typisch een incubatiekamer, een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop, een digitale camera, en een trillingsvrije tafel [90](#page=90). > **Voorbeeld:** Time-lapse microscopie van muisfibroblasten gedurende 8 uur, met opnames elke 30 seconden, resulteert in een film van 10 frames per seconde. 3D fluorescentie kan worden gebruikt voor stack building van cellensferoïden, resulterend in een "movie" door de stapel van beelden [91](#page=91) [92](#page=92). #### 4.1.7 Virtuele microscopie Virtuele microscopie is een digitaal alternatief voor conventionele microscopie, waarbij cel- en weefselpreparaten in hoge resolutie worden ingescand om een gedigitaliseerd beeld op een computerscherm te verkrijgen. Gebruikers kunnen navigeren en zoomen binnen het digitale beeld, wat een simulatie van klassieke microscopie biedt [96](#page=96). #### 4.1.8 Flowcytometrie Flowcytometrie is een techniek voor het tellen en bestuderen van microscopisch kleine deeltjes, zoals cellen, in een vloeistofstroom. De techniek is gebaseerd op lichtverstrooiing en fluorescentie. Individuele cellen, gelabeld met fluorescerende stoffen, passeren een laserstraal. Door de fluorescentie en lichtverstrooiing te meten, kan de hoeveelheid en het type cellen in een monster worden bepaald [97](#page=97). ### 4.2 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopie (EM) gebruikt een bundel elektronen in plaats van licht om beelden te genereren, wat een significant hogere resolutie mogelijk maakt, tot op de nanometer schaal [98](#page=98). #### 4.2.1 Principes van Elektronenmicroscopie In EM fungeert een elektronenkanon als de elektronenbron, en elektromagnetische lenzen (magneetspoelen) buigen de elektronenbundel af, vergelijkbaar met glaslenzen in lichtmicroscopen. Voor beeldvorming worden de elektronen gebombardeerd op het monster. Biologisch materiaal vertoont van nature weinig densiteitsverschillen, wat contrastering met zware metalen noodzakelijk maakt om de beelden zichtbaar te maken door verhoogde elektronenstrooiing [98](#page=98). #### 4.2.2 Typen Elektronenmicroscopie Er wordt onderscheid gemaakt tussen transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM) [99](#page=99). * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** * **Principe:** Gebaseerd op elektronenverstrooiing op zware atoomkernen in ultradunne preparaten die in hoog vacuüm worden doorstraald [99](#page=99). * **Resolutie:** Tot ongeveer 1 nm [99](#page=99). * **Beeldvorming:** Bundelvorming door elektromagneten; beeldvorming op een fluorescerend scherm [98](#page=98) [99](#page=99). * **Toepassing:** Voornamelijk voor het bestuderen van de interne structuur van objecten zoals cellen, weefsels en virussen [99](#page=99). * **Scanning-elektronenmicroscopie (SEM):** * **Principe:** Het preparaat, dat dikker mag zijn maar gecoat moet zijn met een zwaar metaal, wordt afgescand met een elektronenbundel. Terugkaatsing van elektronen en generatie van secundaire elektronen worden gedetecteerd, resulterend in een computer-gegenereerd 3D beeld [99](#page=99). * **Resolutie:** Kan structuren tot 1 nm zichtbaar maken [99](#page=99). * **Toepassing:** Voor het in beeld brengen van oppervlaktestructuren van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen. Monsters moeten geleidend gemaakt worden door coating met goud of goud/palladium [99](#page=99). > **Tip:** Bij TEM worden zware atomen in ultradunne secties de elektronenbundel doen strooien, terwijl bij SEM een scanner de elektronenbundel lijn per lijn over het preparaat beweegt en secundaire elektronen worden gedetecteerd [100](#page=100). #### 4.2.3 Staalbereiding voor TEM Voor TEM is nauwkeurige staalbereiding cruciaal: 1. **Fixatie:** Materiaal wordt gefixeerd met chemische stoffen (bv. glutaaraldehyde) om structuren intact te houden en doorlaatbaarheid te bevorderen . 2. **Spoeling en 'kleuring':** Na fixatie wordt het materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen (bv. osmiumtetroxide, uranylacetaat) die elektronen weerkaatsen, waardoor gemerkte structuren donker verschijnen . 3. **Dehydratatie:** Water wordt verwijderd via stappen met toenemende ethanol- of acetonconcentraties . 4. **Inbedding in hars:** Het materiaal wordt geïnfiltreerd met kunsthars en vervolgens gepolymeriseerd om harde, snijdbare blokjes te verkrijgen . 5. **Trimming en ultradun snijden:** Coupes van 60-90 nm dikte worden gesneden met speciale messen (glas of diamant) op een ultramicrotoom . 6. **Opvang op gridje:** Defragiele coupes worden opgevangen op een metalen gridje . > **Voorbeeld:** Negatieve kleuring met zware metalen, zoals koper grids met kaliumfosfowolfraamzuur, laat structuren zoals het coronavirus wit afsteken tegen een zwarte achtergrond. Shadow casting, waarbij het monster onder een schuine hoek wordt bestoven met metaal, helpt bij het visualiseren van oppervlaktestructuren van virussen en macromoleculen. Collageen kan worden geanalyseerd door bestuiving met platina, waarbij het karakteristieke repetitiepatroon zichtbaar wordt . TEM-analyse van ultradunne secties van dierlijke cellen, zoals pancreascellen, toont organellen zoals de kern, mitochondria, lysosomen en het endoplasmatisch reticulum met hoge resolutie . #### 4.2.4 Interpretatieproblematiek van TEM-beelden Het interpreteren van TEM-beelden kan uitdagend zijn, aangezien verschillende doorsneden van eenzelfde driedimensionale, kronkelige structuur sterk uiteenlopende tweedimensionale beelden kunnen opleveren. Nauwkeurige 3D reconstructies vereisen daarom vaak de stapeling van consequutieve secties of benaderingen zoals SEM en cryo-elektronen-tomografie . #### 4.2.5 Speciale EM-technieken * **Vries-breek (Freeze-fracture) en Vries-ets (Freeze-etching):** * **Vries-breek:** Cellulaire membranen worden gebroken tussen de binnen- en buitenbladen, wat inzicht geeft in membraanstructuren en eiwitverdeling. Dit levert informatie op over de 'vloeibaar mozaïekmodel' van membranen . * **Vries-ets:** Een dunne laag ijs wordt verwijderd door sublimatie onder vacuüm, wat meer 3D structuur genereert . Beide technieken vereisen visualisatie na bestuiving met zware atomen in TEM of SEM . * **Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET):** * **Principe:** 3D reconstructie van een object gebaseerd op een serie 2D projecties verkregen door het monster of de detector rond een as te kantelen. De reconstructie gebeurt door Fourier analyse van terugprojecties . * **Toepassing:** Maakt gedetailleerde 3D reconstructies mogelijk, bijvoorbeeld van nucleaire pore complexen (NPC's) . * **SBF-SEM & FIB-SEM:** Serial block face scanning electron microscopy en focused ion beam scanning electron microscopy gebruiken ultramicrotomen of ionenlasers om sequentieel materiaal te verwijderen tijdens de microscopie, wat 3D reconstructies mogelijk maakt . #### 4.2.6 Toepassingen van SEM en TEM op specifieke weefsels * **Epitheel van de trachea (luchtpijp):** * **SEM:** Toont twee celtypes met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak. De monsters worden gecoat met goud of goud/palladium voor geleidbaarheid . * **TEM:** Visualiseert gedetailleerd de cilia (longitudinaal, schuin, dwars), microvilli, celkernen, mitochondria, glad en ruw endoplasmatisch reticulum, Golgi-apparaat en secretiedruppels. Het epitheel rust op een basaal membraan met bindweefsel . #### 4.2.7 Detectie van specifieke eiwitten met TEM Antilichamen, specifiek tegen eiwitten zoals het capsid-eiwit van HIV, kunnen in combinatie met TEM worden gebruikt om de lokalisatie van deze eiwitten aan te tonen, bijvoorbeeld tijdens budding vanuit een cel . --- # Kwaliteitscontrole en contaminatie in celculturen Celculturen kunnen worden gecontamineerd door micro-organismen of vreemde cellen, wat de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van de cultuur kan beïnvloeden [37](#page=37). ### 5.1 Contaminatie met micro-organismen Micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en met name antibiotica-resistente mycoplasma's vormen een significant probleem in celculturen vanwege hun snelle groei in rijke groeimedia [37](#page=37). #### 5.1.1 Mycoplasma contaminatie Mycoplasma's (ook wel PPLO, pleuropneumonia-like organisms, genoemd) zijn parasitair, kunnen deels intracellulair leven en verstoren het cellulair metabolisme, vaak merkbaar door overmatige verzuring van het medium. Ze zijn moeilijk detecteerbaar met standaardmethoden en nog moeilijker te elimineren [37](#page=37). **Effecten van mycoplasma contaminatie op eukaryote cellen:** * Veranderingen in de niveaus van eiwit-, RNA- en DNA-synthese [38](#page=38). * Alteratie van cellulair metabolisme [38](#page=38). * Inductie van chromosomale aberraties (numeriek en structureel) [38](#page=38). * Verandering in de samenstelling van het celmembraan (expressie van oppervlakteantigenen en receptoren) [38](#page=38). * Alteratie van celmorfologie [38](#page=38). * Inductie (of inhibitie) van lymfocytenactivatie [38](#page=38). * Inductie (of suppressie) van cytokinenexpressie [38](#page=38). * Verhoging (of verlaging) van viruspropagatie [38](#page=38). * Interferentie met diverse biochemische en biologische assays [38](#page=38). * Invloed op signaaltransductie [38](#page=38). * Bevordering van cellulaire transformatie [38](#page=38). * Alteratie van proliferatiekenmerken (groei, vitaliteit) [38](#page=38). * Totale degeneratie en verlies van de cultuur [38](#page=38). **Specifieke effecten op hybridoomcellen:** * Inhibitie van cel fusie [38](#page=38). * Invloed op de selectie van fusieproducten [38](#page=38). * Interferentie bij screening van monoklonale antigeenreactiviteit [38](#page=38). * Productie van monoklonale antistoffen tegen mycoplasma in plaats van tegen het doelspecifieke antigen [38](#page=38). * Verminderde opbrengst van monoklonale antistoffen [38](#page=38). * Conservering van hybridoomcellen (minder direct schadelijk dan bij andere celtypen) [38](#page=38). > **Tip:** Mycoplasma's zijn de meest voorkomende en hardnekkige contaminanten in celculturen, en de symptomen zijn vaak subtiel maar verstrekkend [37](#page=37). ### 5.2 Contaminatie met vreemde cellen Contaminatie met vreemde cellen is wijdverspreider dan vaak wordt toegegeven. Veel "oudere" cellijnen blijken varianten te zijn van bekende cellijnen, zoals HeLa (afgeleid van humaan cervix-tumorweefsel). Soms blijken "menselijke" cellijnen daadwerkelijk van muis- of rattenoorsprong te zijn. Detectie van dergelijke contaminaties kan worden uitgevoerd met genetische fingerprinting en karyotypering [37](#page=37). ### 5.3 Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen De (genetische) zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kan worden beoordeeld met methoden zoals karyotypering. Karyotypering bepaalt het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen [39](#page=39). ### 5.4 Inherente genetische instabiliteit Het genotype van gecultiveerde cellen, gereflecteerd door chromosoomvorm en -aantal, is vaak intrinsiek genetisch instabiel en neigt te evolueren. Deze instabiliteit is niet volledig te vermijden, maar kan worden beperkt door regelmatig terug te keren naar stock-cultures die zijn ingevroren in vloeibare stikstof op -196°C met behulp van anti-kristallijne cryoprotectiva zoals glycerol of DMSO [40](#page=40). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Celbiologie (Cytologie) | De wetenschappelijke studie van cellen, hun structuur, functies, processen en interacties. | | Lichtmicroscoop (LM) | Een microscoop die zichtbaar licht gebruikt om beelden van objecten te vergroten, met een typische resolutie tot ongeveer 200 nanometer. | | Elektronenmicroscoop (EM) | Een microscoop die een bundel elektronen gebruikt om beelden te genereren, wat resulteert in een veel hogere resolutie dan lichtmicroscopie, tot op atomair niveau. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij de elektronen door een ultradun preparaat gaan, wat gedetailleerde beelden van de interne structuur van cellen en weefsels oplevert. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij een elektronenbundel over het oppervlak van een preparaat scant, wat gedetailleerde beelden van de oppervlaktestructuur oplevert. | | Celcultuur | Het kweken van cellen of weefsel buiten het lichaam, in een gecontroleerde kunstmatige omgeving (in vitro). | | Monolaagcultuur | Een cultuurtechniek waarbij cellen zich verspreiden en een enkele laag vormen op het kweekoppervlak. | | Cellijn | Een populatie van cellen die afkomstig is van een enkele oorsprong en in de cultuur kan worden voortgeplant. | | Groeimedium | Een vloeibare of semi-vaste substantie die essentiële voedingsstoffen bevat om de groei en het overleven van cellen in cultuur te ondersteunen. | | Fixeren | Een proces waarbij biologisch materiaal wordt behandeld om cellulaire structuren te stabiliseren en afbraakprocessen te voorkomen, vaak door eiwitten te denatureren. | | Inbedden | Het doordringen van gefixeerd biologisch materiaal met een substantie (zoals paraffine of hars) die hard wordt en het materiaal snijdbaar maakt in dunne coupes. | | Microtoom | Een instrument dat gebruikt wordt om zeer dunne coupes van biologisch materiaal te snijden voor microscopisch onderzoek. | | Kleuren (histologie) | Het gebruik van kleurstoffen om specifieke celcomponenten of weefselstructuren zichtbaar te maken en contrast te creëren in microscopische preparaten. | | Hematoxyline en Eosine (H&E) | Een veelgebruikte histologische kleuring waarbij hematoxyline de celkernen blauw kleurt en eosine het cytoplasma en de extracellulaire matrix roze kleurt. | | Stamcel | Een ongedifferentieerde cel die het vermogen heeft zich te delen om meer van zichzelf te produceren (zelfvernieuwing) en zich te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen. | | Totipotente stamcel | Een stamcel die het vermogen heeft om zich te ontwikkelen tot een volledig organisme, inclusief de placenta. | | Pluripotente stamcel | Een stamcel die zich kan ontwikkelen tot alle celtypen van het lichaam, maar niet tot de placenta. | | Multipotente stamcel | Een stamcel die zich kan ontwikkelen tot een beperkt aantal specifieke celtypen binnen een bepaalde weefsellijn. | | Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) | Somatische cellen die genetisch zijn herprogrammeerd om pluripotente stamcellen te worden, vergelijkbaar met embryonale stamcellen. | | Organoïde | Een 3D-structuur die wordt gekweekt uit stamcellen en de functie en structuur van een specifiek orgaan nabootst. | | Contaminatie | De aanwezigheid van ongewenste micro-organismen (zoals bacteriën, schimmels, mycoplasma's) of vreemde cellen in een celcultuur. | | Karyotypering | Een techniek die het aantal en de morfologie van chromosomen in individuele cellen analyseert, gebruikt voor kwaliteitscontrole van celculturen. | | Fasecontrastmicroscopie | Een lichtmicroscopische techniek die verschillen in optische dichtheid en faseverschuiving van licht benut om ongekleurde, levende cellen zichtbaar te maken. | | Differentieel Interferentie Contrast (DIC) microscopie | Een geavanceerde microscopische techniek die het contrast verhoogt door interferentie van gepolariseerd licht, waardoor driedimensionale beelden van levende monsters worden verkregen. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopische techniek die gebruikmaakt van fluorescerende moleculen (fluorochromen) om specifieke structuren of moleculen in cellen of weefsels aan te lichten en te visualiseren. | | Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM) | Een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die een laserbundel gebruikt om optische secties van een monster te scannen, wat resulteert in beelden met een hoge resolutie en minder achtergrondfluorescentie. | | Immunohistochemie | Een techniek die antilichamen gebruikt om specifieke antigenen (eiwitten) in weefselcoupes of cellen te detecteren en te lokaliseren, vaak gevisualiseerd met enzymatische reacties of fluorescentie. | | Enzymkleuringen | Technieken die de activiteit van specifieke enzymen in cellen of weefsels aantonen door het gebruik van substraten die bij de enzymatische reactie een waarneembaar product vormen. | | Flowcytometrie | Een techniek voor het analyseren en sorteren van microscopisch kleine deeltjes, zoals cellen, in een stromende vloeistof op basis van hun lichtverstrooiing en fluorescentie-eigenschappen. | | Vries-breektechniek | Een speciale EM-techniek waarbij cellen of weefsels worden bevroren en gebroken, waardoor de membraanstructuren worden blootgelegd voor analyse. | | Cryo-elektronen-tomografie | Een 3D-reconstructietechniek die gebruikmaakt van een serie 2D-projecties van een bevroren monster, gemaakt onder verschillende hoeken, om de driedimensionale structuur van cellulaire componenten te reconstrueren. | | SBF-SEM en FIB-SEM | Geavanceerde SEM-technieken (Serial Block-Face SEM en Focused Ion Beam SEM) die het mogelijk maken om grotere volumes van biologisch materiaal met hoge resolutie te analyseren door opeenvolgende lagen te verwijderen. |