12_Detectie_kweek_en_identificatie.pdf

# Algemene principes van diagnostiek in de medische microbiologie This section details the fundamental principles of medical microbiological diagnostics, encompassing sample management, various pathogen and immunity detection methods, and result interpretation [1](#page=1). ### 1.1 Inleiding The medical microbiological laboratory performs several crucial tasks in diagnosing infectious diseases. It investigates whether a patient has an infection, identifies the causative agent, and determines effective antimicrobial treatments. An essential part of this process involves advising on which samples to collect and how to handle them correctly. The lab employs a range of techniques, including microscopy, culturing and identification, antigen detection, molecular detection techniques, and serology to detect antibodies as evidence of infection. The antibiogram, while discussed separately in the context of antibiotics, is also vital for both individual treatment and community-level resistance surveillance. Some techniques, such as "fingerprinting" and virus culturing, are not performed routinely [4](#page=4). #### 1.1.1 De taken van het medisch microbiologisch/virologische labo The primary role of the medical microbiology lab is to assist physicians by answering key questions regarding a patient's health status. These questions typically revolve around the presence of an infection, the identification of the pathogen responsible, and the selection of appropriate antimicrobial agents. A critical aspect of the diagnostic process is the correct collection and preservation of samples [1](#page=1) [4](#page=4). #### 1.1.2 Microbiologische etiologie aantonen: met welke technieken? While some clinical presentations are highly suggestive of a specific infection and pathogen (e.g., typical measles), many diseases present with less typical symptoms, or the pathogen is not immediately obvious even with a clear clinical picture like pyelonephritis. Therefore, a systematic approach to microbiological diagnostics is necessary. The main techniques used to demonstrate microbiological etiology include [7](#page=7): 1. **Microscopy:** To identify specific visual characteristics of microorganisms [7](#page=7). 2. **Culturing:** Using simple media for bacteria and cell cultures for viruses and chlamydiae [7](#page=7). 3. **Non-culture detection:** This encompasses detecting antigens or genetic material (genome) [7](#page=7). 4. **Immune response assessment:** Serology (detecting antibodies) or skin tests [7](#page=7). ### 1.2 Directe detectie Direct detection methods aim to identify the pathogen or its components directly from a clinical sample [1](#page=1). #### 1.2.1 Microscopie Microscopy is a fundamental technique for the direct visualization of microorganisms, often aided by staining techniques like Gram staining. It can provide initial clues about the type and morphology of the suspected pathogen [1](#page=1) [7](#page=7). #### 1.2.2 Niet-microscopische methoden These methods encompass a range of techniques that do not rely on visual observation under a microscope but still aim for direct detection of the pathogen or its components. This category includes antigen detection and molecular detection techniques [1](#page=1) [4](#page=4). ### 1.3 Detectie na amplificatie This section covers methods where the target (e.g., microbial genetic material) is amplified to detectable levels, a crucial step for many modern diagnostic techniques [1](#page=1). #### 1.3.1 Basistechniek voor kweek van micro-organismen Culturing is a foundational technique for growing microorganisms from clinical samples. This process requires appropriate culture media and incubation conditions to allow microbial growth [2](#page=2). #### 1.3.2 Identificatie van de opgegroeide bacteriën Once bacteria have been cultured, they need to be identified to determine the specific causative agent [2](#page=2). ##### 1.3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie These methods rely on detecting specific enzymatic activities or antigenic properties of the cultured bacteria to identify them [2](#page=2). ##### 1.3.2.2 Identificatie met MaldiTOF massaspectrografie Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry is a rapid and accurate technique for identifying bacterial species based on their protein profiles [2](#page=2). #### 1.3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Some microorganisms are fastidious and require specialized culture conditions or media to grow, posing a challenge for routine laboratory diagnostics [2](#page=2). #### 1.3.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek Interpreting results from bacteriological investigations requires an understanding of different sample types and the kinetics of the immune response [1](#page=1). ##### 1.3.4.1 Staaltypes The type of sample collected (e.g., blood, urine, sputum) significantly influences the interpretation of bacterial findings, as the presence of certain bacteria might be considered normal flora in one sample but indicative of infection in another [1](#page=1). ##### 1.3.4.2 Belang van aspect tijd (bij diagnose door kweek) The timing of sample collection in relation to the onset of symptoms and the kinetics of microbial growth and the immune response are crucial for accurate interpretation of culture results [1](#page=1). #### 1.3.5 Detectie na moleculaire amplificatie Molecular amplification techniques, such as Polymerase Chain Reaction (PCR), allow for the detection of microbial genetic material even when the organism is present in very low numbers or is difficult to culture [1](#page=1). ### 1.4 Serologie Serological methods detect the host's immune response to an infection, typically by identifying antibodies produced against the pathogen. This can be used to diagnose past or present infections [1](#page=1) [4](#page=4). > **Tip:** Effective interpretation of diagnostic results hinges on understanding the context, including the patient's clinical presentation, the specimen type, and the typical kinetics of both the infection and the immune response [1](#page=1). --- # Directe detectiemethoden Directe detectiemethoden maken het mogelijk pathogenen op te sporen zonder de noodzaak van in vitro amplificatie of cultuur, met name wanneer de kiem te klein, verborgen of zonder typisch voorkomen is. Deze methoden omvatten zowel microscopische technieken als niet-microscopische benaderingen zoals antigen- en genoomdetectie. Ze zijn vaak snel, eenvoudig uit te voeren en relatief goedkoop, hoewel de kost per individueel staal soms hoog kan zijn en de gevoeligheid van bepaalde tests beperkt kan zijn [15](#page=15) [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19) [20](#page=20). ### 2.1 Microscopie Microscopie is een fundamentele directe detectiemethode die gebruikmaakt van verschillende technieken om micro-organismen zichtbaar te maken [8](#page=8). #### 2.1.1 Gewone lichtmicroscopie Gewone lichtmicroscopie heeft een maximaal bereik van ongeveer 1000x vergroting, waardoor objecten kleiner dan één micron (0,2 µm) zichtbaar kunnen worden gemaakt [8](#page=8). * **Zonder fixatie en kleuring:** Deze methode kan worden gebruikt voor het aantonen van schimmels, parasieten, bij urineweginfecties, of als een 'wet stain' (nat preparaat) voor bijvoorbeeld vaginale uitstrijkjes [8](#page=8) [9](#page=9). * **Met fixatie en kleuring:** Voor een duidelijk beeld van bacteriën is een vergroting van 1000x en een gefixeerd en gekleurd preparaat noodzakelijk. De gramkleuring is de meest gebruikte kleuring in de bacteriologie. Bij deze kleuring wordt het materiaal eerst gekleurd met kristalviolet en gefixeerd met lugol, gevolgd door ontkleuring. Grampositieve bacteriën blijven blauw, terwijl andere bacteriën en cellen zichtbaar worden gemaakt met een rode tegenkleuring. Dit kleurverschil is te wijten aan de verschillende celwandsamenstellingen, met name de hoeveelheid peptidoglycaan [11](#page=11) [8](#page=8). * **Voorbeeld:** De gramkleuring van lumbaalvocht bij vermoeden van meningitis is een krachtig voorbeeld. Grampositieve diplokokken kunnen duiden op pneumokokken, wat leidt tot behandeling met ceftriaxone en de afwezigheid van secundaire gevallen. Gramnegatieve diplokokken wijzen op meningokokken, wat behandeling met een nauw spectrum penicilline of amoxicilline en preventieve maatregelen voor contactpersonen vereist. In de praktijk wordt vaak gestart met ceftriaxone, waarna de antibiotica aangepast kunnen worden na documentatie [12](#page=12). * **Beperkingen:** Virussen, mycoplasmata en chlamydiae zijn niet zichtbaar met deze technieken. Virussen kunnen indirect zichtbaar worden gemaakt door hun cytopathogeen effect op celculturen [8](#page=8). Andere kleuringsmethoden, zoals de zuurvaste kleuring (Ziehl-Neelsen of auramine), worden gebruikt voor het opsporen van zuurvaste bacteriën, met name mycobacteriën zoals *M. tuberculosis*. De auraminekleuring maakt gebruik van een fluorescerende molecule en wordt afgelezen op een fluorescentiemicroscoop, wat sneller en gevoeliger is. Het principe van de zuurvaste kleuring berust op intracellulaire kleurstoffen die niet te verwijderen zijn met een zuur-alcohol mengsel vanwege de mycolzuurmantel [14](#page=14). > **Tip:** De gramkleuring is snel (vaak dezelfde dag, soms binnen 15 minuten) en goedkoop, en biedt uitstekende aanduiding van de verwekker bij meningitis, hoewel bij andere monsters de informatie minder eenduidig kan zijn door de normale flora of niet-specifieke morfotypes. Het geeft ook inzicht in inflammatie (PMN) en staalkwaliteit (plaveiselcellen in sputum duiden op slechte kwaliteit). Een 'wet stain' is praktisch toepasbaar in de eerstelijnszorg, bijvoorbeeld voor het detecteren van de drie belangrijkste verwekkers van vaginitis [15](#page=15). #### 2.1.2 Fluorescentiemicroscopie Met fluorescentiemicroscopie kunnen micro-organismen (en weefsels) worden opgespoord die zijn aangekleurd met een antiserum of probe met een fluorescerende marker (bv. FISH - Fluorescent In Situ Hybridization) . Antigenen van bacteriën en virussen, al dan niet in weefsel, kunnen worden gedetecteerd door binding met antisera of probes, gemerkt met een fluorescerende kleurstof, via directe of indirecte immunofluorescentie [8](#page=8). > **Example:** Een endocervicaal uitstrijkje voor *Chlamydia trachomatis* kan met directe immunofluorescentie worden aangetoond [9](#page=9). #### 2.1.3 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopie is noodzakelijk voor het zichtbaar maken van virussen, maar wordt zelden gebruikt in de routinediagnostiek [8](#page=8). ### 2.2 Niet-microscopische methoden Niet-microscopische methoden worden ingezet wanneer lichtmicroscopie ontoereikend is, bijvoorbeeld bij te kleine, verborgen, of atypisch voorkomende kiemen. Deze methoden maken doorgaans gebruik van antilichaamgebaseerde technieken of nucleïnezuurhybridisatie (in situ) [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19). #### 2.2.1 Antigen detectie Antigen detectietesten zijn gericht op het aantonen van specifieke antigenen van pathogenen. * **Bacteriën:** * Voorbeelden zijn de pneumokokken- of legionella-antigentest op urine bij verdenking op pneumonie [16](#page=16). * Detectie van *C. difficile* toxine in feces bij typische diarree (langdurig, na antibioticagebruik, met specifieke geur en kleur) is een ander voorbeeld [16](#page=16). * **Virussen:** * Antigentesten in stoelgang voor rotavirus bij diarree bij kinderen [17](#page=17). * In respiratoire aspiraten/monsters voor respiratoir syncytiaal virus (RSV) bij bronchiolitis bij kinderen, en voor influenza bij seizoensgriep [17](#page=17). * In bloed, tijdens acute infectie om de vensterperiode te verkorten, zoals voor HBV S Ag en HIV p24 Ag [17](#page=17). * High-risk humaan papillomavirus (HPV) DNA in situ hybridisatie op cervicale specimen, bijvoorbeeld bij CIN3 [17](#page=17). * **Schimmels:** * Opsporing van galactomannan polysaccharide, een component van de celwand van *Aspergillus* spp., in serum [18](#page=18). > **Example:** Een antigen detectietest volgens het sandwich ELISA principe houdt in dat het antigeen wordt gevangen door een 'capture' antilichaam. Een tweede antilichaam, covalent gebonden aan een enzym, bindt vervolgens aan het antigeen. Detectie vindt plaats op basis van de enzymatische reactie met vorming van een gekleurd substraat, wat optisch wordt gedetecteerd [18](#page=18). * **Protozoa:** * Bij verdenking op malaria kan een sneltest voor *Plasmodium* spp. antigeen detectie in bloed worden uitgevoerd [19](#page=19). > **Example:** Een antigen detectietest volgens immunochromatografie werkt door bloed van de patiënt op een nitrocellulose strip aan te brengen. Met een buffer die een gelabeld detectieantilichaam (bv. met goudpartikels) bevat, wordt het mengsel richting detectielijntjes gestuwd. Bij aanwezigheid van antigeen wordt dit, samen met het gelabelde antilichaam, gevangen door een 'capture' antilichaam (eerste lijn van links). Als er geen antigeen aanwezig is, wordt het gelabelde antilichaam gevangen door een anti-antilichaam (tweede lijn van links, een positieve controle op de reagentia). De clustering van gelabelde antilichamen op een lijn maakt de goudpartikels zichtbaar, vergelijkbaar met het principe van een zwangerschapstest [19](#page=19). #### 2.2.2 Genoomdetectie Genoomdetectie methoden, zoals nucleïnezuur hybridisatie (in situ), kunnen ook worden gebruikt voor directe detectie [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19). > **Tip:** Niet-microscopische methoden zijn snel (zelfde dag, soms binnen minuten), eenvoudig en vereisen weinig opleiding. Ze zijn echter specifiek, wat betekent dat andere mogelijke oorzaken gemist kunnen worden. Per individueel staal kan de kostprijs vrij hoog zijn met veel afval [20](#page=20). --- # Detectiemethoden na amplificatie en kweek Dit onderwerp behandelt de methoden voor het identificeren van micro-organismen na hun vermenigvuldiging (kweek) en via moleculaire amplificatietechnieken. ### 3.1 Kweek van micro-organismen Kweek van micro-organismen is een fundamentele techniek om ze te vermeerderen en vervolgens te identificeren. Dit proces vereist optimale omstandigheden voor groei, waaronder [21](#page=21): * **Voedingsbronnen:** Suikers, stikstofbronnen (zoals vlees- of plantendigsesten), buffers en mineralen zijn essentieel [21](#page=21). * **Temperatuur:** Een optimale temperatuur, vaak rond de 36 °C, is cruciaal [21](#page=21). * **Atmosferische condities:** Dit kan variëren van aerobe, anaerobe tot capnofiele (verhoogde CO2) omstandigheden, afhankelijk van het micro-organisme [21](#page=21). Na een aanpassingsperiode treedt een logaritmische toename van het aantal micro-organismen op, waardoor ze microscopisch zichtbaar worden [21](#page=21). #### 3.1.1 Basistechniek voor kweek Er worden verschillende soorten kweekbodems gebruikt: * **Vloeibare kweekbodems:** Deze worden voornamelijk gebruikt voor verder onderzoek naar de kenmerken van bacteriën en de aanwezigheid van groei wordt vastgesteld door troebeling [22](#page=22). * **Agarbodems:** Op deze bodems vormen individuele bacteriën zichtbare kolonies. Het aantal kolonies kan een indicatie geven van het aantal bacteriën (uitgedrukt in Kolonievormende Eenheden - KVE of CFU - per volume) en het uitzicht van de kolonies kan al een hint geven over de soort. Het uitstrijken van een staal in segmenten op agar maakt isolatie van afzonderlijke kolonies mogelijk, wat essentieel is voor identificatie. Resultaten worden vaak semikwantitatief gerapporteerd, waarbij groei in de eerste segmenten aangeduid wordt met '+' [22](#page=22). #### 3.1.2 Selectieve en differentiële bodems Specifieke stoffen kunnen aan kweekbodems worden toegevoegd om de kweek te optimaliseren: * **Verrijking:** Toevoegen van bijvoorbeeld bloed kan de groei van bepaalde soorten bevorderen en laat ook hemolyse zien [23](#page=23). * **Selectiviteit:** Stoffen die de groei van ongewenste micro-organismen onderdrukken, waardoor klinisch relevante soorten beter zichtbaar worden. Dit is essentieel voor het vinden van specifieke soorten in gemengde flora [23](#page=23). * **Differentiatie:** Het gebruik van pH-indicatoren of chromogene stoffen zorgt ervoor dat kolonies verschillende kleuren en uiterlijke kenmerken krijgen [23](#page=23). * **Antibiotica:** Deze kunnen worden toegevoegd om specifiek resistent geworden soorten op te sporen, zoals bij het screenen op MRSA [23](#page=23). Een belangrijk kenmerk dat bij sommige bacteriën, met name streptokokken, wordt waargenomen is **hemolyse van rode bloedcellen**. Dit kan β-hemolytisch (volledige lysis) of α-hemolytisch (gedeeltelijke lysis, vergroening) zijn, of niet-hemolytisch (γ-hemolytisch) [24](#page=24). ### 3.2 Identificatie van opgegroeide bacteriën Hoewel het uitzicht van kolonies een indicatie kan geven, is identificatie zelden volledig op basis hiervan. De identificatie van bacteriën berust op een combinatie van eigenschappen [25](#page=25): * **Morfologie:** Gramkleuring en celvorm [25](#page=25). * **Kolonie-eigenschappen:** Grootte, randen, kleur (pigment, indicator) en geur [25](#page=25). * **Fysiologische en biologische kenmerken:** * Afbraak en assimilatie van suikers, aminozuren, etc. [25](#page=25). * Groei onder specifieke omstandigheden van temperatuur, pH en zoutconcentratie [25](#page=25). * Profiel van kenmerkende metabolieten [25](#page=25). * Celwandsamenstelling [25](#page=25). * **Genetisch profiel:** Analyse van totaal DNA of ribosomaal RNA [25](#page=25). * **Serologische methoden:** Gebruik van specifieke antilichamen tegen typische antigenen [25](#page=25). #### 3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie Serologische methoden maken gebruik van de reactie van bacteriën met specifieke antilichamen. Agglutinatie met antilichamen, eventueel gebonden aan latexdeeltjes, kan leiden tot klontering en snelle identificatie of typering van bacteriën [26](#page=26). Enzymatische tests meten de activiteit van specifieke enzymen. Een voorbeeld is de urease test, waarbij de splitsing van ureum leidt tot alkalinisatie en een kleurverandering door een pH-indicator in de kweekbodem. Tegenwoordig worden deze enzymatische tests vaak uitgevoerd in geminiaturiseerde formats of door geautomatiseerde toestellen [26](#page=26). #### 3.2.2 Identificatie met MALDI-TOF massaspectrografie Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) Time-of-flight (TOF) massaspectrometrie is een relatief nieuwe en veelgebruikte techniek in diagnostische laboratoria [27](#page=27). * **Voordelen:** * **Universaliteit:** Identificatie is mogelijk zonder voorkennis van de bacteriegroep, in tegenstelling tot klassieke strategieën [27](#page=27). * **Snelheid:** Resultaten zijn vaak binnen 24 uur beschikbaar, wat een tijdwinst van minstens een dag oplevert vergeleken met klassieke methoden die een overnachtkweek vereisen. Dit voordeel is nog groter voor 'moeilijke' soorten [27](#page=27). * **Principe:** Een kleine hoeveelheid gekweekte bacterie wordt gemengd met een matrix en gefragmenteerd met een laser in vacuüm. De eiwitfragmenten vliegen door een buis en worden gescheiden op basis van hun massa-tot-lading-verhouding (Time of Flight). Het resulterende 'piekenpatroon' wordt vergeleken met een database van referentiële spectra voor identificatie (#page=28, page=29) [28](#page=28) [29](#page=29). ### 3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen vereisen specifieke of aangepaste kweekomstandigheden: * **Anaeroben:** Vereisen een kweekomgeving zonder zuurstof zelfs tijdens transport [31](#page=31) [32](#page=32). * **Trage groeiers of niet op klassieke bodems:** * **Mycobacteriën:** Groei kan enkele weken duren [31](#page=31). * **Mycoplasmata:** Vormen microscopische kolonies op speciale media [31](#page=31). * **Chlamydia:** Kunnen alleen op cellijnen worden gekweekt. De bacterie groeit in glycogeenhoudende inclusies die met lugolkleuring zichtbaar worden [31](#page=31) [33](#page=33). * **(Bijna) onkweekbare bacteriën:** Sommige zijn alleen in een gastheer te kweken (bv. *Mycobacterium leprae* in gordeldieren) of helemaal niet in vitro [31](#page=31). * **Schimmels en gisten:** Kunnen groeien op bacteriële media, maar hebben soms specifieke selectieve bodems nodig. Hun groei kan trager zijn dan die van bacteriën [31](#page=31). * **Virussen:** Zijn obligate intracellulaire parasieten en vereisen specifieke cellijnen voor kweek (#page=31, page=33. Detectie kan via cytopathogeen effect of immunodetectie/hybridisatie. Veel virussen worden tegenwoordig vervangen door moleculaire detectiemethoden vanwege de complexiteit, kosten en bewerkelijkheid van de kweek [31](#page=31) [33](#page=33). * **Protozoa:** Zijn over het algemeen niet kweekbaar voor routine diagnostiek [31](#page=31). ### 3.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek De interpretatie van kweekresultaten is cruciaal en wordt geleid door de klinische vraag. Het is niet de bedoeling om alle bacteriën in een staal te identificeren, omdat veel commensalen aanwezig kunnen zijn [34](#page=34). * **Strategie:** De kweek- en identificatietechnieken worden afgestemd op de klinische vraag. Alleen klinisch relevante pathogenen worden gerapporteerd [34](#page=34). #### 3.4.1 Staaltypes en interpretatie De interpretatie hangt sterk af van het type staal en de locatie waar het is afgenomen: * **Type 1:** Afkomstig van plaatsen zonder normale flora (bv. bloed, gewrichtsvocht, pleuravocht). Een gevonden bacterie is hierdoor vrijwel altijd een pathogeen. Voorzorgsmaatregelen bij afname, zoals aseptisch werken en desinfectie, zijn essentieel. Huidbewoners die hier gevonden worden, zijn meestal contaminanten, hoewel dit bij verzwakte patiënten of met protheses een probleem kan zijn [36](#page=36). * **Hemocultuur:** Een bijzondere vorm van Type 1. Het is een kostbaar staal dat met grote zorg moet worden afgenomen. Een grote hoeveelheid kweekbodem en bloed wordt gebruikt om ook lage aantallen bacteriën te detecteren. Contaminanten in een hemocultuur kunnen het echte pathogeen maskeren [36](#page=36). * **Type 2:** Afkomstig van plaatsen zonder normale flora, maar die een zone met normale flora passeren (bv. sputum uit de keel, urine uit de urethra). Desinfectie helpt hier beperkt. Maatregelen bij afname, transport en verwerking zijn gericht op het maximaliseren van het aantal 'witte bollen' (pathogenen) en minimaliseren van 'zwarte bollen' (contaminanten). Kwantitatieve kweken en snelle transport zijn belangrijk. Indicatoren voor de kwaliteit van de afname zijn het aantal plaveiselcellen (veel betekent speekselcontaminatie) en voor infectie het aantal neutrofielen [37](#page=37). * **Type 3:** Monstereen met potentiële pathogenen te midden van bestaande commensale flora (bv. feces, keeluitstrijkje, fistel, wond, vagina). Het is cruciaal om de potentiële pathogenen te kennen en selectieve bodems te gebruiken. Soms is kwantificering belangrijk, zoals bij *Candida*-infecties. Screening op multiresistente stammen (bv. MRSA) valt hier ook onder, met als doel voorbereiding op infectie of isolatie van de patiënt [38](#page=38). #### 3.4.2 Communicatie en pre-analytische kwaliteit Essentieel voor alle stalen is **communicatie** met de microbioloog, zeker als er afwijkende verwachtingen zijn op basis van reisgeschiedenis, specifieke blootstellingen, immuunsuppressie of ongebruikelijke symptomen. De **pre-analytische kwaliteit** van stalen (correct afgenomen, bewaard en getransporteerd) is fundamenteel voor betrouwbare resultaten [38](#page=38). ### 3.5 Belang van tijd bij diagnose door kweek Microbiologische onderzoeken, met name kweekgebaseerde, zijn tijdrovend [39](#page=39). * **Gewone bacteriën:** Kweek en identificatie duren doorgaans 24-48 uur (overnachtkweek plus 1-2 dagen voor identificatie). Een antibiogram voegt hier nog eens 48 uur aan toe. Globaal kan de diagnose 2 tot 5 dagen duren, afhankelijk van de complexiteit [39](#page=39). * **Virussen, mycobacteriën, mycoplasmata, anaeroben:** Deze vereisen vaak meer tijd en complexere methoden, waarbij alternatieve (non-culture) technieken de voorkeur kunnen hebben [39](#page=39). ### 3.6 Detectie na moleculaire amplificatie Moleculaire amplificatietechnieken, met name (reverse transcriptie-) PCR, spelen een steeds grotere rol [40](#page=40). * **Kenmerken:** Vaak kwantitatief, vereist staalvoorbereiding en strenge voorzorgsmaatregelen om moleculaire contaminatie te voorkomen. De technologie evolueert naar automatisering, waardoor ook urgente analyses mogelijk worden [40](#page=40). * **Toepassingsgebied:** Zeer breed, van bacteriën tot virussen, schimmels, protozoa en wormen (#page=40, page=41) [40](#page=40) [41](#page=41). * **Specificiteit en gevoeligheid:** Zeer hoog, wat zowel een voor- als een nadeel kan zijn [40](#page=40). * **Combinatie met sequencing:** Kan worden toegepast voor verdere typering [40](#page=40). #### 3.6.1 Toepassingen van moleculaire amplificatie * **Bacteriën:** * Aantonen van aanwezigheid (bv. 16S RNA gen PCR) [41](#page=41). * Detectie van moeilijk kweekbare organismen (bv. mycobacteriën) [41](#page=41). * Detectie van resistentiegenen (na kweek) [41](#page=41). * Typering van stammen (bv. in ziekenhuishygiëne) [41](#page=41). * Onderzoeken van de diversiteit van flora (bv. microbioom) [41](#page=41). * **Virussen:** * Direct op staal, aantonen en kwantificeren (bv. HIV, CMV, HSV, HBV) [41](#page=41). * Typeren van virale varianten (genotypes) of resistentiebepaling [41](#page=41). * **Schimmels:** * Direct op staal (bv. respiratoir), aantonen van aanwezigheid (bv. *Aspergillus fumigatus*) [41](#page=41). * **Protozoa:** * Direct op staal (biopten, feces, bloed), aantonen van aanwezigheid (bv. toxoplasmose, amoebiase, *Plasmodium falciparum*) [41](#page=41). * **Wormen:** * Direct op staal (feces, serum), aantonen van aanwezigheid (bv. nematoden, filariasen, schistosomiase) [41](#page=41). --- # Serologische diagnostiek Serologische diagnostiek is een methode om antilichamen, zoals IgM en IgG, in serum of ander lichaamsvocht op te sporen, wat kan duiden op een voorgaand of huidig contact met een pathogeen [42](#page=42). ### 4.1 Principes van serologische diagnostiek #### 4.1.1 Basisprincipes en methoden Serologisch onderzoek is gebaseerd op de detectie van specifieke antistoffen in patiëntmateriaal. De meeste methoden zijn gebaseerd op het ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) principe en kunnen binnen enkele uren resultaten opleveren. Deze tests detecteren indirect een vroeg contact met een pathogeen, maar geven op zichzelf geen informatie over de huidige aanwezigheid van het pathogeen in het lichaam. Echter, voor antistofproductie is een functioneel immuunsysteem vereist, wat niet het geval is bij patiënten met bijvoorbeeld SCID. Antilichamen zijn stabiel in vitro; serum dat weken in de koelkast wordt bewaard, is nog bruikbaar, en ingevroren monsters kunnen jarenlang worden gebruikt voor serologische tests [42](#page=42) [43](#page=43). #### 4.1.2 Antistofklassen en hun betekenis * **IgM antistoffen:** Deze wijzen meestal op een recente infectie. Ze worden doorgaans binnen één week na infectie detecteerbaar, pieken binnen twee weken, en worden vaak na enkele maanden weer negatief [43](#page=43). * **Vensterperiode (window phase):** Voordat diagnostische tests positief worden, kan de infectie al wel zijn opgetreden en kan de patiënt infectieus zijn voor anderen. Dit wordt de vensterperiode genoemd. Men tracht deze te verkorten door gevoeliger tests te gebruiken, zoals PCR naast serologie, hoewel een vensterperiode altijd blijft bestaan. Bijvoorbeeld, na een HIV-infectie is PCR binnen ongeveer tien dagen positief, terwijl serologie gemiddeld pas na drie weken positief wordt [43](#page=43). * **IgG antistoffen:** Deze worden meestal pas na meer dan één week detecteerbaar en zijn vaak levenslang detecteerbaar, hoewel dit varieert afhankelijk van de infectie [43](#page=43). * **Titerbepaling:** Serologisch onderzoek kan kwalitatief (positief of negatief) of kwantitatief ('titer') gebeuren. Vooral voor IgG kan een titerbepaling nuttig zijn. Bijvoorbeeld, als twee opeenvolgende monsters, genomen met minimaal twee weken ertussen, een viervoudige toename in antilichaamconcentratie laten zien, kan dit wijzen op een recente infectie. IgG en eventueel IgM titers kunnen ook stijgen bij reactivatie van een latente infectie [43](#page=43). #### 4.1.3 Specifieke aspecten en uitdagingen * **Polyklonale activatie:** IgM-titers tegen diverse antigenen kunnen stijgen bij een infectie met EBV (Epstein-Barr virus). Dit komt door polyklonale activatie veroorzaakt door het virus, dat B-cellen infecteert. Hierdoor kan een patiënt positief worden in verschillende IgM-tests, bijvoorbeeld tegen virussen waarmee de patiënt in het verleden in contact is gekomen [44](#page=44). * **Affiniteitsbepaling:** Soms wordt de affiniteit van aanwezige IgG's bepaald, bijvoorbeeld bij CMV-seropositiviteit bij een zwangere vrouw [44](#page=44). * **Vals-negatieve resultaten:** Dit kan voorkomen bij patiëntengroepen die moeilijker antistoffen vormen, zoals neonaten, zeer ouderen en immuungecompromitteerden [44](#page=44). * **Vals-positieve resultaten:** Dit kan optreden bij patiëntengroepen die antistoffen "passief" hebben verkregen. Dit geldt voor neonaten (transplacentair en via moedermelk, detecteerbaar tot zes maanden na de geboorte) en na transfusies met plasma dat antistoffen bevat (zoals plaatjes of virus-geïnactiveerd plasma) of na toediening van immunoglobulines [44](#page=44). > **Tip:** Begrijpen van de dynamiek van IgM en IgG detectie is cruciaal voor het interpreteren van serologische tests, met name rond de vensterperiode en de mogelijke interpretatie van titerveranderingen. ### 4.2 Toepassingsgebieden van serologische diagnostiek #### 4.2.1 Diagnose van infectieziekten * **Virussen:** Serologie is vooral nuttig voor virale infecties, gezien de vaak chronische aard van deze infecties en de directe link tussen de aanwezigheid van het kiem en de ziekte [45](#page=45). * **Bacteriën:** Het nut bij bacteriële infecties is beperkter, maar het wordt wel ingezet bij de diagnostiek van syfilis en de ziekte van Lyme (Borrelia burgdorferi). Ook voor de serotypering van bacteriële stammen in laboratoria is het gespecialiseerd [45](#page=45). * **Andere pathogenen:** Serologie wordt ook toegepast voor meer gespecialiseerde diagnostiek van andere pathogenen [45](#page=45). #### 4.2.2 Screening en monitoring * **Dragerschap:** Serologie wordt gebruikt voor het screenen naar dragers van infectieziekten zoals HIV, HBV en HCV [45](#page=45). * **Vaccinatiestatus:** Het kan worden ingezet voor het opvolgen van de vaccinatiestatus, zoals bij HBV [45](#page=45). #### 4.2.3 Individuele diagnostiek en preventie * **Doorgemaakte infecties:** Voor de individuele diagnostiek van doorgemaakte infecties, inclusief mogelijke intracerebrale infecties met behulp van lumbaal vocht, kunnen hoge lokale antistoftiters wijzen op lokale productie [45](#page=45). * **Preventie:** Serologische tests zijn belangrijk voor preventieve doeleinden, zoals CMV- en Toxoplasma-serologie voor zwangere vrouwen [45](#page=45). ### 4.3 Voordelen en beperkingen #### 4.3.1 Voordelen * **Snel en kosteneffectief:** Serologische tests zijn over het algemeen snel en goedkoop [45](#page=45). * **Specificiteit en gevoeligheid:** Voor de belangrijkste pathogenen zijn deze tests doorgaans zeer specifiek en gevoelig [45](#page=45). * **Stabiliteit:** Antilichamen zijn stabiel in vitro [42](#page=42). * **Strategie:** Voor elke infectie of diagnostische vraagstelling bestaat er een specifieke strategie voor serologische tests, waarbij soms een combinatie van tests nodig is, eventueel samen met de detectie van het agens of delen ervan [45](#page=45). #### 4.3.2 Belangrijkste beperking * **Indirecte aanwijzing:** De belangrijkste beperking is dat serologie een indirecte aanwijzing is van een vroeg contact met een pathogeen, zonder informatie te geven over de actuele aanwezigheid van het pathogeen. Dit is echter geen probleem bij pathogenen die per definitie nagenoeg nooit uit het lichaam worden geëlimineerd, zoals HIV [45](#page=45). > **Voorbeeld:** Een serologisch profiel bij een hepatitis B virusinfectie met spontane genezing toont duidelijke verschillen in antigen- en antilichaamtiters over de tijd, inclusief IgM en IgG. Ook is te zien dat de infectieuze periode (HBsAg-positief) de symptomen (geelzucht) voorafgaat. Met DNA PCR kan het virus 1-2 weken voor HBsAg in serum worden aangetoond [44](#page=44). > **Tip:** Denk bij serologie altijd aan het klinische beeld van de patiënt en combineer de resultaten met andere diagnostische methoden indien nodig. Houd rekening met de immunologische status van de patiënt. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Diagnostiek | Het proces van het identificeren van een ziekte of aandoening door middel van observatie en onderzoek van symptomen, lichamelijke kenmerken en laboratoriumresultaten. | | Staalafname | Het proces van het verzamelen van biologisch materiaal, zoals bloed, urine of weefsel, dat nodig is voor diagnostisch onderzoek. | | Staalbewaring | De correcte opslag en behandeling van verzameld biologisch materiaal om de integriteit en bruikbaarheid voor diagnostische doeleinden te behouden. | | Pathogeen | Een micro-organisme (zoals een bacterie, virus, schimmel of parasiet) dat in staat is ziekte te veroorzaken bij een gastheer. | | Immuniteit | De toestand waarin een organisme weerstand biedt tegen ziekteverwekkers of schadelijke stoffen door middel van natuurlijke afweer mechanismen of verworven weerstand. | | Microscopie | Het gebruik van microscopen om objecten te vergroten die te klein zijn om met het blote oog te zien, zoals cellen en micro-organismen. | | Gramkleuring | Een differentiële kleuringstechniek die bacteriën classificeert in grampositieve (paars) en gramnegatieve (roze) op basis van hun celwandstructuur. | | Kweek | Een laboratoriummethode waarbij micro-organismen worden gekweekt in een gecontroleerde omgeving op specifieke voedingsbodems om hun groei en identificatie mogelijk te maken. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Een moleculaire techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-fragmenten exponentieel te vermenigvuldigen, waardoor zelfs kleine hoeveelheden detecteerbaar worden. | | ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) | Een veelzijdige test die antilichamen of antigenen detecteert door gebruik te maken van een enzymatische reactie die een kleurverandering veroorzaakt. | | Natuurlijke flora | De verzameling micro-organismen die normaal gesproken op en in het menselijk lichaam leven zonder ziekte te veroorzaken. | | Kinetiek van de immuunreactie | De tijdsgebonden ontwikkeling en verandering van de immuunrespons na blootstelling aan een antigeen, inclusief de opkomst en afname van verschillende immuuncomponenten. | | Antigeen | Een stof die een immuunrespons kan opwekken, meestal door de productie van antilichamen. | | Antilichaam | Een eiwit (immunoglobuline) dat door het immuunsysteem wordt geproduceerd als reactie op de aanwezigheid van een specifiek antigeen. | | Cytopathogeen effect | Veranderingen in cellen, veroorzaakt door de replicatie van een virus, die zichtbaar zijn onder de microscoop. | | MaldiTOF massaspectrografie | Een techniek die eiwitfragmenten van micro-organismen analyseert op basis van hun massa-ladingsverhouding om ze snel te identificeren. | | Moleculaire amplificatie | Een proces dat gericht is op het verhogen van de hoeveelheid van een specifiek nucleïnezuursegment, vaak door middel van PCR, om detectie te vergemakkelijken. | | Serologie | Het diagnostisch onderzoek van bloedserum voor de aanwezigheid van antilichamen of antigenen die wijzen op een infectie of een immuunrespons. | | Vensterperiode (window phase) | De periode tussen de initiële infectie met een pathogeen en het moment waarop diagnostische tests (zoals serologische tests) betrouwbaar positief zijn. | | Kweekbare micro-organismen | Micro-organismen die in staat zijn te groeien en zich te vermenigvuldigen onder specifieke laboratoriumomstandigheden op kunstmatige voedingsbodems. | | Obligate parasiet | Een organisme dat niet kan overleven of reproduceren zonder een levende gastheercel te infecteren. | | Commensaal | Een micro-organisme dat normaal gesproken op of in een gastheer leeft zonder ziekte te veroorzaken, en soms zelfs gunstige effecten heeft. | | Hemolyse | Het afbreken van rode bloedcellen, wat een kenmerk kan zijn van bepaalde bacteriële infecties en wordt waargenomen op bloedagar media. | | DNA-PCR | Een specifieke vorm van PCR die wordt gebruikt om DNA te detecteren en te amplificeren, bijvoorbeeld voor de identificatie van bacteriën of virussen. | | RNA-PCR | Een vorm van PCR die wordt gebruikt om RNA te detecteren en te amplificeren, zoals bij de detectie van virussen met een RNA-genoom. |