Molbio H19 - kortere versie.pptx

# De genetische code en ontdekking Hier is een gedetailleerde studiehandleiding over de genetische code en de ontdekking ervan, opgesteld volgens uw specificaties. ## 1. De genetische code en ontdekking Dit onderwerp verkent de universele taal van het leven, de genetische code, die bepaalt hoe de sequentie van nucleotiden in DNA en RNA wordt vertaald naar de sequentie van aminozuren in eiwitten, en de historische ontdekkingen die hieraan ten grondslag liggen. ### 1.1 De aard van de genetische code De genetische code is een set regels die de volgorde van nucleotiden in RNA bepaalt, welke vervolgens de volgorde van aminozuren in een eiwit bepaalt. Deze code is cruciaal voor de expressie van genen en de synthese van eiwitten in alle levende organismen. #### 1.1.1 De 1 gen - 1 enzym / polypeptide hypothese * **Beadle en Tatum (begin jaren 1940):** Met hun experimenten op *Neurospora crassa* formuleerden zij de "1 gen - 1 enzym" hypothese. Ze toonden aan dat mutaties in genen leidden tot specifieke storingen in metabolische routes, wat suggereerde dat elk gen codeert voor één specifiek enzym. * **Pauling, Ingram en Yanofsky (begin jaren 1950):** * Pauling observeerde verschillen in hemoglobine bij patiënten met sikkelcelanemie. Dit leidde tot de hypothese dat een genetische afwijking kon resulteren in een ander aminozuursamenstelling van een eiwit. * Ingram analyseerde hemoglobine (wild type en sikkelcel) verder door trypsine-digestie en scheiding van peptiden via elektroforese en papierchromatografie. Hij toonde aan dat sikkelcelhemoglobine slechts één aminozuurverschil had met normaal hemoglobine. Dit versterkte de hypothese, leidend tot de "1 gen - 1 polypeptide" hypothese. * Yanofsky bevestigde dit verder met studies naar het tryptofaan synthase gen in bacteriën, waarbij mutaties in het gen direct correleerden met veranderingen in het tryptofaan synthase enzym (een polypeptide). #### 1.1.2 Het kraken van de genetische code De ontrafeling van de genetische code vereiste het begrijpen van hoe de vier nucleotiden (A, U, G, C in RNA) de twintig verschillende aminozuren konden specificeren. * **Crick en Brenner:** Zij stelden de hypothese op dat de genetische code een drievoudige code (codon) is. Door te muteren met proflavin (een intercallerend agens dat base-inserties of -deleties veroorzaakt) in T4 bacteriofagen, observeerden ze dat mutaties in drievoudige clusters konden worden "gereversed" (het wild-type fenotype hersteld). Dit suggereerde dat elke "letter" in de genetische code uit drie nucleotiden bestond. * De genetische code gebruikt dus drietallen nucleotiden, **codons**, om specifieke aminozuren aan te duiden. * De code is **niet overlappend**. Dit betekent dat een sequentie van nucleotiden slechts op één manier kan worden gelezen als opeenvolgende codons. Bijvoorbeeld, in de sequentie 5'-AUG GCA UAG-3', codeert AUG voor methionine, GCA voor alanine en UAG voor stop. Er is geen overlap tussen deze codons. > **Tip:** Hoewel de meeste coderende sequenties niet overlappend zijn, zijn overlappende genen wel ontdekt in bepaalde virussen en bacteriën, en ook in het menselijk genoom. * **Nirenberg, Matthaei, Khorana en anderen:** Zij hebben de code experimenteel gekraakt door gebruik te maken van cel-vrije eiwitsynthese systemen en synthetische RNA moleculen. * **Nirenberg en Matthaei (1961):** Gebruikten polynucleotide phosphorylase om synthetische RNA-homopolymeren te maken (bv. poly-U, poly-A, poly-C). Toen ze poly-U aan een cel-vrij systeem toevoegden, werd een polypeptide gesynthetiseerd dat uitsluitend uit het aminozuur fenylalanine bestond. Dit leidde tot de conclusie dat het codon **UUU** codeert voor fenylalanine. Op vergelijkbare wijze werden de codons **AAA** (lysine) en **CCC** (proline) bepaald. * **Khorana:** Synthetiseerde copolymeren (RNA met alternerende nucleotiden, bv. poly-AU) en korte RNA-moleculen van specifieke sequenties. Door deze te testen in cel-vrije systemen, kon hij codons voor andere aminozuren bepalen. Bijvoorbeeld, poly-AU resulteerde in een eiwit met alternerende isoleucine en histidine. * Door deze en verdere experimenten met copolymeren en korte RNA's, werd een compleet codonwoordenboek opgesteld. #### 1.1.3 Eigenschappen van de genetische code * **Drielettercode:** Elke aminozuur wordt gespecificeerd door een codon van drie nucleotiden. * **Dertig-drie letters en twintig woorden:** Er zijn 4 nucleotiden, dus $4^3 = 64$ mogelijke codons. Slechts 20 van deze codons coderen voor de standaard aminozuren. Drie codons fungeren als **stopcodons** (UAA, UAG, UGA) die de translatie beëindigen. * **Degeneratie:** De genetische code is **gedegenereerd**. Dit betekent dat meer dan één codon kan coderen voor hetzelfde aminozuur. Dit beschermt tegen mutaties, omdat een verandering in de derde positie van een codon vaak niet leidt tot een verandering in het aminozuur. Bijvoorbeeld, zowel CUU als CUC coderen voor leucine. > **Tip:** Hoewel de code gedegenereerd is, is er ook sprake van "codon usage bias", waarbij bepaalde codons vaker worden gebruikt dan andere voor hetzelfde aminozuur, afhankelijk van het organisme en het gen. * **Niet overlappend:** Zoals eerder vermeld, wordt de sequentie van nucleotiden in een enkelvoudige leesraam gelezen. * **Eenduidig:** Elk codon specificeert slechts één aminozuur (of een stop). Er is geen ambiguïteit. * **Universeel:** De genetische code is grotendeels **universeel** onder alle levende organismen, van bacteriën tot mensen. Dit is sterk bewijs voor een gemeenschappelijke voorouder. Er zijn echter enkele bekende uitzonderingen: * **Mitochondriën:** In sommige mitochondriën hebben UGA en AGA andere betekenissen (respectievelijk tryptofaan en stop). * **Bepaalde bacteriën en eencelligen:** Kunnen afwijkende codes hebben, zoals CUG dat voor serine codeert in plaats van leucine. * **Speciale aminozuren:** * Selenocysteïne (aminozuur 21) wordt gecodeerd door een normaal stopcodon (UGA) in zowel prokaryoten als eukaryoten, maar vereist specifieke sequenties in het mRNA. * Pyrrolysine (aminozuur 22) wordt gecodeerd door een stopcodon (UAG) in sommige prokaryoten. ### 1.2 Hoofdrolspelers van de translatie De translatie is het proces waarbij de genetische informatie van mRNA wordt omgezet in een eiwitsequentie. Verschillende moleculen spelen hierin een sleutelrol. #### 1.2.1 Het ribosoom Ribosomen zijn de cellulaire machinerie voor eiwitsynthese. * **Structuur:** Bestaan uit twee dissocieerbare subeenheden: een grote en een kleine subeenheid. * **Prokaryotische ribosomen:** 70S (bestaan uit 30S en 50S subeenheden). * **Eukaryotische ribosomen:** 80S (bestaan uit 40S en 60S subeenheden). * **Locaties:** Ribosomen hebben specifieke plaatsen voor interactie met mRNA en tRNA: * **A-plaats (aminoacyl-tRNA-bindingsplaats):** Hier bindt het binnenkomende aminoacyl-tRNA. * **P-plaats (peptidyl-tRNA-bindingsplaats):** Hier bevindt zich het tRNA met de groeiende polypeptideketen. * **E-plaats (exit-plaats):** Hier verlaat het "lege" tRNA het ribosoom na het afstaan van zijn aminozuur. * **Ribozymen:** De peptidyl-transferase activiteit (vorming van peptidebindingen) wordt gekatalyseerd door rRNA in de grote subeenheid, wat aantoont dat ribosomen ook ribozymen zijn. #### 1.2.2 Transfer-RNA (tRNA) tRNA-moleculen fungeren als adapters tussen codons op mRNA en specifieke aminozuren. * **Structuur:** Kleine RNA-moleculen met een karakteristieke klaverbladstructuur, die in 3D een L-vorm aanneemt. Ze hebben een 3'-uiteinde met de sequentie -CCA waar het aminozuur covalent aan gebonden wordt. * **Functie:** Elk tRNA-molecuul heeft twee belangrijke regio's: * **Anticodon:** Een sequentie van drie nucleotiden die complementair is aan een specifiek codon op het mRNA. * **Aminoacyl-acceptor-arm:** Het uiteinde waar het corresponderende aminozuur wordt gebonden. * **Aminoacyl-tRNA:** Wanneer een aminozuur covalent is gebonden aan zijn tRNA, wordt het een aminoacyl-tRNA of "geladen" tRNA genoemd. Dit is een hoog-energetische binding. #### 1.2.3 Aminoacyl-tRNA synthetases Deze enzymen zijn essentieel voor het correct "laden" van tRNA-moleculen met de juiste aminozuren. * **Functie:** Katalyseren de vorming van de covalente esterbinding tussen een specifiek aminozuur en zijn corresponderende tRNA. Dit proces verloopt in twee stappen: 1. **Aminozuur activatie:** Het aminozuur reageert met ATP om een aminoacyl-adenylaat (aminoacyl~AMP) te vormen, waarbij pyrofosfaat (PPi) vrijkomt. $$ \text{aminozuur} + \text{ATP} \rightleftharpoons \text{aminoacyl}\sim\text{AMP} + \text{PP}_i $$ 2. **Aminozuur transfer:** De aminoacylgroep wordt overgedragen van aminoacyl~AMP naar de 2'- of 3'-hydroxylgroep van de ribose aan het 3'-uiteinde van het tRNA. $$ \text{aminoacyl}\sim\text{AMP} + \text{tRNA} \rightleftharpoons \text{aminoacyl}\sim\text{tRNA} + \text{AMP} $$ De totale reactie is: $$ \text{aminozuur} + \text{ATP} + \text{tRNA} \rightleftharpoons \text{aminoacyl}\sim\text{tRNA} + \text{AMP} + \text{PP}_i $$ De reactie wordt gedreven door de hydrolyse van PPi. * **Specificiteit:** Er zijn 20 verschillende aminoacyl-tRNA synthetases, één voor elk standaard aminozuur. Deze enzymen herkennen zowel het juiste aminozuur als het correcte tRNA-molecuul (vaak gebaseerd op anticodon en 3'-uiteinde sequenties). * **Kwaliteitscontrole:** Aminoacyl-tRNA synthetases hebben een "proeflees"-functie om fout geladen tRNA's te corrigeren. #### 1.2.4 Eiwitfactoren Verschillende eiwitfactoren faciliteren specifieke stappen van de translatie: * **Initiatiefactoren (IF / eIF):** Essentieel voor de start van de translatie. * **Elongatiefactoren (EF / eEF):** Betrokken bij het toevoegen van aminozuren aan de groeiende polypeptideketen. * **Release factoren (RF / eRF):** Noodzakelijk voor de beëindiging van de translatie. #### 1.2.5 mRNA structuur en types * **Prokaryoot mRNA:** Vaak **poly-cistronisch**, wat betekent dat één mRNA-molecuul codeert voor meerdere polypeptiden. Deze coderen vaak voor eiwitten met gerelateerde functies en vormen een **operon**. * **Eukaryoot mRNA:** Meestal **mono-cistronisch**, waarbij één mRNA-molecuul codeert voor één polypeptide. * **Initiatie:** Bij eukaryoten wordt het ribosoom meestal gerekruteerd via de 5'-cap van het mRNA. Soms kan rekrutering plaatsvinden via een **Internal Ribosome Entry Sequence (IRES)**. * **5'- en 3'-uiteinden associatie:** Bij eukaryoten associëren de 5'-cap en het poly(A)-staart aan het 3'-uiteinde van het mRNA tijdens de initiatie van de translatie, mogelijk gefaciliteerd door eiwitten zoals poly(A)-bindend proteïne (PABP) en eIF4G. ### 1.3 Mechanisme van de translatie De translatie verloopt in drie hoofdfasen: initiatie, elongatie en terminatie. #### 1.3.1 Initiatie Het proces start met de vorming van een initiatiecomplex dat het mRNA, het start-tRNA en de ribosomale subeenheden samenbrengt. * **Prokaryoten:** 1. Initiatiefactoren (IF1, IF3) binden aan de kleine ribosomale subeenheid (30S). 2. IF2, gebonden aan GTP, rekruteert de initiator fMet-tRNA (N-formylmethionine-tRNA). 3. Het mRNA bindt aan de 30S subeenheid, waarbij de **Shine-Dalgarno sequentie** (stroomopwaarts van het startcodon AUG) essentieel is voor de positionering van het ribosoom. 4. De grote ribosomale subeenheid (50S) bindt, wat leidt tot de hydrolyse van GTP door IF2 en de dissociatie van IF1 en IF3, waardoor het 70S initiatiecomplex wordt gevormd. Het initiator-tRNA bevindt zich nu in de P-plaats. * **Eukaryoten:** 1. Er worden meer initiatiefactoren (eIFs) gebruikt (ongeveer 12). 2. Een 43S pre-initiatiecomplex (40S subeenheid + eIFs + initiator Met-tRNA) wordt gevormd. 3. Het 5'-cap van het mRNA wordt herkend door eIF4E, die andere eIFs rekruteert (o.a. helicase eIF4A). 4. Het 43S PIC bindt aan het mRNA en scant dit tot het startcodon AUG, vaak in de buurt van de **Kozak-sequentie** (een consensussequentie die de herkenning van het startcodon vergemakkelijkt). 5. De grote subeenheid (60S) bindt, GTP wordt gehydrolyseerd en de overige eIFs dissociëren, wat leidt tot de vorming van het 80S initiatiecomplex. Het initiator-tRNA bevindt zich in de P-plaats. #### 1.3.2 Elongatie Dit is de fase waarin aminozuren sequentieel aan de groeiende polypeptideketen worden toegevoegd. Het proces omvat drie cyclische stappen: 1. **Binding van aminoacyl-tRNA:** Een nieuw aminoacyl-tRNA wordt naar de A-plaats van het ribosoom gebracht, gefaciliteerd door elongatiefactor Tu (EF-Tu) gebonden aan GTP (in prokaryoten) of eEF1α (in eukaryoten). Alleen het aminoacyl-tRNA met een anticodon dat correct paart met het mRNA-codon in de A-plaats, zorgt voor GTP-hydrolyse en blijft gebonden. 2. **Vorming van een peptidebinding:** Het aminozuur aan het tRNA in de P-plaats wordt covalent gebonden aan het aminozuur aan het tRNA in de A-plaats. Dit wordt gekatalyseerd door de peptidyl-transferase activiteit van het ribosomale rRNA. De groeiende polypeptideketen wordt overgedragen naar het tRNA in de A-plaats, waardoor een peptidyl-tRNA ontstaat. 3. **Translocatie:** Het ribosoom schuift één codon (3 nucleotiden) op langs het mRNA in de 5' naar 3' richting. Dit wordt gefaciliteerd door elongatiefactor G (EF-G) gebonden aan GTP (in prokaryoten) of eEF2 (in eukaryoten). Het lege tRNA in de P-plaats wordt naar de E-plaats verplaatst en verlaat het ribosoom, terwijl het peptidyl-tRNA in de A-plaats naar de P-plaats schuift. De A-plaats is nu vrij voor een nieuw aminoacyl-tRNA. > **Tip:** De wobble-basenparing (alternatieve basenparing op de derde positie van het codon) speelt een rol bij de herkenning van codons door tRNAs, wat verklaart waarom er minder tRNA-moleculen zijn dan 61. Inosine, een gemodificeerde base, in het anticodon kan met A, U of C paren. #### 1.3.3 Terminatie De translatie stopt wanneer het ribosoom een van de drie stopcodons (UAA, UAG, UGA) in de A-plaats bereikt. * **Rol van release factoren (RF / eRF):** Stopcodons worden niet herkend door aminoacyl-tRNA's, maar door specifieke eiwitten genaamd release factoren. Deze binden aan de A-plaats, wanneer een stopcodon aanwezig is. * **Hydrolyse van de peptidebinding:** De binding van release factoren induceert de hydrolyse van de esterbinding tussen de groeiende polypeptideketen en het tRNA in de P-plaats. De polypeptideketen komt vrij. * **Dissociatie van het ribosoom:** Na de vrijgave van de polypeptide, dissocieert het ribosoom in zijn subeenheden, en komen ook de mRNA en het lege tRNA vrij. Dit proces vereist ook GTP. #### 1.3.4 Energieverbruik tijdens translatie Translatie is een energetisch kostbaar proces dat energie vereist in de vorm van ATP en GTP hydrolyse: * **Initiatie:** Vereist de hydrolyse van GTP. * **Elongatie:** * Elk aminoacyl-tRNA wordt geladen door aminoacyl-tRNA synthetase (kost ATP). * De binding van aminoacyl-tRNA aan de A-plaats (kost GTP). * Translocatie (kost GTP). * Voor elk toegevoegd aminozuur worden dus meerdere hoog-energetische bindingen gehydrolyseerd. * **Terminatie:** Vereist de hydrolyse van GTP. ### 1.4 Mutatie en translatie Mutaties in het DNA kunnen leiden tot veranderingen in het mRNA, die op hun beurt de eiwitsequentie kunnen beïnvloeden. #### 1.4.1 Puntmutaties (verandering van 1 nucleotide) * **Missense mutatie:** Een verandering in één nucleotide resulteert in een codon dat codeert voor een ander aminozuur. Dit kan leiden tot een verandering in de eiwitfunctie. Een bekend voorbeeld is sikkelcelanemie, waar een A->U substitutie in het b-globine gen leidt tot de vervanging van glutaminezuur (GAA) door valine (GUA). * **Nonsense mutatie:** Een verandering in één nucleotide creëert een stopcodon (bv. UAA, UAG, UGA) in het mRNA. Dit leidt tot de premature beëindiging van de translatie, wat resulteert in een verkort, meestal niet-functioneel eiwit. * **Nonstop mutatie:** Een mutatie die leidt tot het verwijderen van een stopcodon. De translatie gaat dan door tot een ander, vaak verder gelegen, stopcodon of totdat het ribosoom van het mRNA valt. * **Stille (silent) mutatie:** Een verandering in één nucleotide die resulteert in een ander codon, maar dit nieuwe codon codeert voor hetzelfde aminozuur (vanwege de degeneratie van de genetische code). Deze mutaties hebben geen effect op de aminozuursequentie. #### 1.4.2 Inserties en deleties (indels) * **Frameshift mutaties:** De insertie of deletie van één of meerdere nucleotiden die geen veelvoud van drie is, verschuift het leesraam van het mRNA. Dit verandert de codering van alle codons na de mutatie, wat meestal leidt tot een drastisch ander eiwit en vaak een vroegtijdig stopcodon. #### 1.4.3 Cel-mechanismen voor het omgaan met mRNA-afwijkingen Cellen hebben mechanismen om te reageren op mRNA's met afwijkingen: * **Nonsense suppressor tRNAs:** Sommige mutaties in tRNA-genen kunnen resulteren in tRNA's met een anticodon dat een stopcodon herkent en een aminozuur inbrengt. Dit kan een nonsense mutatie "onderdrukken" en een volledig (maar vaak gemuteerd) eiwit produceren. * **Nonsense-mediated mRNA decay (NMD):** Dit is een kwaliteitscontrolemechanisme dat transcripten met premature stopcodons (PTCs) detecteert en afbreekt. Tijdens de translatie, wanneer een ribosoom een stopcodon tegenkomt dat zich vóór een Exon Junction Complex (EJC) bevindt, wordt het mRNA gemarkeerd voor afbraak. * **Nonstop mRNA decay:** Een mechanisme dat transcripten zonder stopcodon detecteert. In eukaryoten wordt dit gedaan door de rekrutering van een ribonuclease-complex naar de A-plaats wanneer het einde van het mRNA wordt bereikt zonder een stopcodon. In prokaryoten kan een tmRNA (transfer-messenger RNA) binden en de toevoeging van een kort signaalsequentie katalyseren die het eiwit afbreekt. ### 1.5 Post-translationele processing Na de translatie ondergaan veel eiwitten nog modificaties die essentieel zijn voor hun uiteindelijke functie, structuur en lokalisatie. #### 1.5.1 Moleculaire chaperons * **Functie:** Deze eiwitten helpen bij het correct vouwen van nieuw gesynthetiseerde polypeptiden en bij het herstellen van misgevouwen eiwitten. Ze binden aan hydrofobe regio's van ongevouwen of misgevouwen eiwitten om aggregatie te voorkomen en de juiste 3D-structuur te bevorderen. Voorbeelden zijn hsp70 en het GroEL/GroES-complex. * **Andere functies:** Chaperons kunnen ook helpen bij de assemblage van eiwitcomplexen en bij het transport van eiwitten naar organellen zoals mitochondriën en chloroplasten. #### 1.5.2 Chemische modificaties Covalente toevoeging van chemische groepen aan aminozuren na translatie. Deze modificaties zijn vaak omkeerbaar en spelen een cruciale rol in de regulatie van eiwitactiviteit. * **Fosforylering:** Toevoeging van een fosfaatgroep aan Serine, Threonine of Tyrosine residuen. Gekatalyseerd door kinasen, omgekeerd door fosfatasen. * **Acetylering:** Toevoeging van een acetylgroep aan Lysine residuen. * **Methylering:** Toevoeging van een methylgroep aan Lysine of Arginine residuen. * **Glycosylering:** Binding van suikermoleculen. * **O-linked glycosylering:** Binding van suiker aan de zuurstof van Serine of Threonine. * **N-linked glycosylering:** Binding van suiker aan het stikstofatoom van Asparagine. #### 1.5.3 Proteolytische processing * Verwijdering van aminozuren, vaak vanaf het N-terminus, inclusief het initiële methionine. * Klieving van inactieve precursor-eiwitten (pro-eiwitten) tot hun actieve vorm (bv. insuline). #### 1.5.4 Proteïne splicing * Een proces waarbij interne sequenties (inteïnen) uit een polypeptide worden verwijderd en de buitenste sequenties (extiënen) aan elkaar worden gezet, resulterend in een matuur eiwit. > **Voorbeeld:** De post-translationele processing van insuline omvat de verwijdering van N-terminale aminozuren, de vorming van zwavelbruggen, en de verwijdering van interne aminozuren uit een precursor-polypeptide (pro-insuline) om het functionele insuline te vormen. --- # Eiwitsynthese: translatie en mechanismen Eiwitsynthese, ook wel translatie genoemd, is het proces waarbij de genetische informatie opgeborgen in mRNA wordt omgezet in een functioneel eiwit. ### 2.1 De genetische code De genetische code vormt de basis voor translatie. Het is een set regels die bepaalt hoe de sequentie van nucleotiden in mRNA wordt vertaald naar de sequentie van aminozuren in een eiwit. * **Eigenschappen van de genetische code:** * **Codon:** Drie opeenvolgende nucleotiden in mRNA vormen een codon, dat codeert voor een specifiek aminozuur of een stopsignaal. * **Niet-overlappend:** Codons worden sequentieel gelezen; een nucleotide behoort slechts tot één codon. * **Gedegenereerd:** Meer dan één codon kan coderen voor hetzelfde aminozuur. Dit zorgt voor redundantie en bescherming tegen mutaties. * **Eenduidig:** Elk codon codeert voor slechts één specifiek aminozuur of stop. * **Universeel:** De code is grotendeels universeel over alle organismen, met enkele uitzonderingen (bv. in mitochondriën en bepaalde micro-organismen). * **Ontdekking van de genetische code:** * De hypothese van "één gen - één enzym" (Beadle & Tatum) en later "één gen - één polypeptide" (Pauling, Ingram & Yanofsky) legde de link tussen genen en eiwitten. * Experimenten met proflavin door Crick & Brenner suggereerden dat de code uit triplets bestaat. * Nirenberg & Matthaei, en Khorana kraakten de code door synthetische RNA's te gebruiken in celvrije systemen. ### 2.2 Hoofdrolspelers van de translatie Verschillende moleculen en structuren zijn essentieel voor het translatieproces. * **Ribosomen:** * De "eiwitfabrieken" van de cel. * Bestaande uit twee subeenheden: een kleine (bv. 30S in prokaryoten) en een grote (bv. 50S in prokaryoten). In eukaryoten zijn dit 40S en 60S subeenheden. De complete ribosomen zijn 70S (prokaryoten) en 80S (eukaryoten). * Bevatten rRNA (ribosomaal RNA) en eiwitten. * Hebben drie belangrijke bindingsplaatsen voor tRNA: * **A-plaats (aminoacyl-plaats):** Waar het inkomende aminoacyl-tRNA bindt. * **P-plaats (peptidyl-plaats):** Waar het tRNA met de groeiende polypeptideketen gebonden is. * **E-plaats (exit-plaats):** Waar lege tRNAs het ribosoom verlaten. * **tRNA (transfer RNA):** * Kleine RNA-moleculen die dienen als adapters. * Elk tRNA molecuul herkent een specifiek codon op het mRNA via zijn anticodon. * Draagt het corresponderende aminozuur aan het 3'-uiteinde (CCA-sequentie). * De binding tussen aminozuur en tRNA is een hoog-energetische esterbinding. * **Aminoacyl-tRNA synthetases:** * Enzymen die elk specifiek aminozuur koppelen aan het juiste tRNA. * Ze herkennen zowel het aminozuur als het specifieke tRNA (via anticodon en 3'-uiteinde). * Dit proces vereist ATP en omvat twee stappen: aminozuuractivatie en aminozuurtransfer. * De reactie wordt gedreven door de hydrolyse van pyrofosfaat ($PP_i$). * Formule: `aminozuur + ATP + tRNA` $\longrightarrow$ `aminoacyl-tRNA + AMP + $PP_i$` * **mRNA (messenger RNA):** * Draagt de genetische code van DNA naar het ribosoom. * In prokaryoten zijn mRNA's vaak polycistronisch (coderen voor meerdere polypeptiden). * In eukaryoten zijn mRNA's meestal monocistronisch (coderen voor één polypeptide). Eukaryotisch mRNA heeft een 5'-cap en een poly-A-staart die belangrijk zijn voor initiatie en stabiliteit. * **Translatiefactoren:** * Eiwitten die helpen bij initiatie (IFs), elongatie (EFs) en terminatie (RFs) van de translatie. * Gebruiken GTP als energiebron. ### 2.3 Mechanisme van de translatie Translatie verloopt in drie hoofdfasen: initiatie, elongatie en terminatie. * **Initiatie:** * **Prokaryoten:** 1. De kleine ribosomale subeenheid (30S) bindt aan het mRNA, geholpen door initiatiefactoren (IFs) en GTP. 2. De Shine-Dalgarno sequentie op het mRNA (stroomopwaarts van het startcodon AUG) is cruciaal voor de herkenning door het 16S rRNA van de kleine subeenheid. 3. De initiator tRNA, geladen met N-formylmethionine (fMet), bindt aan het startcodon AUG op de P-plaats van de 30S subeenheid. 4. De grote ribosomale subeenheid (50S) bindt, waarbij GTP wordt gehydrolyseerd, en vormt het 70S initiatiecomplex. IF1 en IF2/GDP laten los. * **Eukaryoten:** 1. Een 43S pre-initiatiecomplex (40S subeenheid, initiator methionyl-tRNAiMet, eIFs) wordt gevormd. 2. De 5'-cap van het mRNA wordt herkend door eIF4E, wat leidt tot de rekutering van het 43S complex. 3. Het ribosoom scant het mRNA tot het startcodon AUG vindt, vaak in de Kozak-sequentie (ACC AUG G). 4. De 60S subeenheid bindt, GTP wordt gehydrolyseerd, en het 80S initiatiecomplex wordt gevormd. 5. Associatie van de 5'- en 3'-uiteinden van het mRNA (via PABP en eIF4G) speelt een rol bij de initiatie. * **Elongatie:** Dit proces herhaalt zich voor elk aminozuur dat aan de polypeptideketen wordt toegevoegd. 1. **Binding van aminoacyl-tRNA:** Een nieuw aminoacyl-tRNA bindt aan de A-plaats, herkend door elongatiefactoren (bv. EF-Tu*GTP in prokaryoten) en door correcte codon-anticodon paring. GTP wordt gehydrolyseerd, waardoor de factor loslaat. 2. **Vorming van een peptidebinding:** Het aminozuur op de P-plaats wordt overgedragen naar het aminozuur op de A-plaats, waardoor een peptidebinding ontstaat. Dit wordt gekatalyseerd door het rRNA in de grote subeenheid (peptidyl-transferase activiteit; ribozym). De energie komt uit de hoog-energetische esterbinding van het aminoacyl-tRNA. 3. **Translocatie:** Het ribosoom schuift één codon op in de 5' naar 3' richting. Het tRNA dat nu op de P-plaats zit (met de groeiende keten) komt op de P-plaats, het lege tRNA op de P-plaats komt op de E-plaats en verlaat het ribosoom. De A-plaats is weer vrij voor een nieuw aminoacyl-tRNA. Dit proces wordt geholpen door elongatiefactoren (bv. EF-G*GTP in prokaryoten) en vereist GTP-hydrolyse. * **Terminatie:** * Wanneer een stopcodon (UAA, UAG, UGA) in de A-plaats komt, wordt dit herkend door release factoren (eiwitten, geen tRNA's). * Release factoren binden aan de A-plaats, wat leidt tot hydrolyse van de esterbinding tussen de polypeptideketen en het tRNA op de P-plaats. * De polypeptide wordt vrijgegeven. * GTP wordt gehydrolyseerd om het ribosoom te dissociëren in zijn subeenheden, klaar voor een nieuwe ronde van translatie. ### 2.4 Energievereisten van translatie Translatie is een energie-intensief proces. Er zijn verschillende stappen waarbij energie wordt verbruikt, voornamelijk in de vorm van ATP en GTP: * **Initiatie:** Vereist de hydrolyse van meerdere fosfoanhydridebindingen (3 in prokaryoten, 4 in eukaryoten). * **Elongatie:** Voor elke aminozuurincorporatie worden ten minste 4 energierijke fosfoanhydridebindingen gehydrolyseerd (2 GTP voor aminoacyl-tRNA binding, 1 GTP voor translocatie, plus energie voor de vorming van aminoacyl-tRNA). * **Terminatie:** Vereist GTP-hydrolyse voor de dissociatie van het ribosoom. * **Aminoacyl-tRNA synthese:** Vereist ATP voor de activatie van het aminozuur. > **Tip:** De energieverbruik per aminozuur is significant, wat de efficiëntie en nauwkeurigheid van eiwitsynthese onderstreept. Een polypeptide van 100 aminozuren kan al snel meer dan 2920 kcal/mol aan energie kosten enkel voor de elongatiestap. ### 2.5 Moleculaire chaperons en correcte vouwing Na de translatie moeten polypeptiden de juiste driedimensionale structuur aannemen om functioneel te zijn. * **Moleculaire chaperons:** Eiwitten die de correcte vouwing van polypeptiden bevorderen en misvouwing voorkomen. * Ze binden aan hydrofobe regio's van ongevouwen of misgevouwen eiwitten. * Voorbeelden zijn Hsp70 en GroEL/GroES (een "kooi"-structuur). * Ze helpen ook bij de assemblage van eiwitcomplexen en transport. ### 2.6 Mutatie en translatie Mutaties in het DNA kunnen leiden tot veranderingen in het mRNA en uiteindelijk in het eiwit. * **Puntmutaties (verandering van één nucleotide):** * **Missense mutatie:** Leidt tot de codering van een ander aminozuur. * **Nonsense mutatie:** Creëert een prematuur stopcodon, wat leidt tot een verkort eiwit. * **Nonstop mutatie:** Verwijdering van het stopcodon, wat leidt tot translatie die doorgaat tot een ander stopcodon of het einde van het mRNA, met een verlengd eiwit. * **Stille (silent) mutatie:** Verandering in het codon die niet resulteert in een verandering van aminozuur (vanwege de gedegenereerdheid van de code). * **Indels (inserties of deleties):** * Insertie of deletie van één of meerdere nucleotiden. * Als het aantal ingevoegde/verwijderde nucleotiden geen veelvoud is van drie, ontstaat een **frameshift mutatie**, die de leesraam van het mRNA verschuift en de sequentie van alle daaropvolgende aminozuren verandert. * **Mechanismen voor genoomkwaliteitscontrole:** * **Nonsense-gemedieerde mRNA afbraak (NMD):** mRNA's met prematuur stopcodons worden herkend en afgebroken. * **Nonstop mRNA decay:** mRNA's zonder stopcodon worden afgebroken. * **Suppressor tRNAs:** Sommige mutaties in tRNA-genen kunnen leiden tot tRNAs die een stopcodon herkennen en zo een aminozuur aanbieden, waardoor de translatie doorgaat. ### 2.7 Post-translationele processing Na translatie ondergaan veel eiwitten modificaties om functioneel te worden. * **Verwijderen van het eerste aminozuur:** Vaak wordt het initiatiemethionine verwijderd. * **Proteolytische processing:** Grote precursor-eiwitten worden geknipt tot actieve, kleinere eiwitten (bv. insuline). * **Chemische modificaties:** * **Fosforylering:** Toevoeging van een fosfaatgroep (op Ser, Thr, Tyr). * **Acetylering:** Toevoeging van een acetylgroep (op Lys). * **Methylering:** Toevoeging van een methylgroep (op Lys, Arg). * **Glycosylering:** Toevoeging van suikergroepen (N-linked op Asn, O-linked op Ser/Thr). * **Vorming van zwavelbruggen:** Disulfidebruggen tussen cysteïneresiduen stabiliseren de eiwitstructuur. * **Proteïne splicing:** Zeldzaam proces waarbij interne sequenties (inteïnen) uit een polypeptide worden geknipt en de externe sequenties (exteïnen) aan elkaar worden gezet. --- # Mutatie en post-translationele processen Dit onderwerp bespreekt hoe mutaties de eiwitsynthese beïnvloeden en introduceert de cruciale post-translationele processen die eiwitten ondergaan om hun uiteindelijke functie te verkrijgen. ## 3.4 Mutatie en translatie Mutaties kunnen verschillende effecten hebben op de translatie en de daaropvolgende eiwitstructuur en -functie. De aard van de mutatie bepaalt het uiteindelijke gevolg. ### 3.4.1 Puntmutaties Puntmutaties, waarbij slechts één nucleotide is veranderd, kunnen diverse uitkomsten hebben: * **Missense mutaties:** Een verandering in het codon resulteert in de codering voor een ander aminozuur. Een klassiek voorbeeld hiervan is sikkelcelanemie, waarbij een enkele basenverandering in het bèta-globine gen leidt tot de vervanging van glutaminezuur (Glu) door valine (Val). * **Nonsense mutaties:** Een puntmutatie creëert een stopcodon in het mRNA, wat resulteert in een vroegtijdige beëindiging van de translatie en een verkort, vaak niet-functioneel eiwit. * **Nonstop mutaties:** Deze mutaties verwijderen een stopcodon, waardoor de translatie doorgaat tot er een ander stopcodon wordt bereikt, wat leidt tot een verlengd eiwit. * **Stille (silent) mutaties:** Een verandering in het codon leidt tot de codering voor hetzelfde aminozuur, dankzij de redundantie van de genetische code. Hierdoor heeft de mutatie geen waarneembaar effect op de aminozuursequentie. ### 3.4.2 Inserties en deleties (Indels) Inserties (toevoeging van nucleotiden) en deleties (verwijdering van nucleotiden) kunnen leiden tot een **frameshift** (leesraamverschuiving). Als het aantal ingevoegde of verwijderde nucleotiden geen veelvoud is van drie, verschuift het leesraam voor de rest van het mRNA. Dit verandert alle codons na de mutatie, wat leidt tot een compleet andere aminozuursequentie en meestal tot een niet-functioneel eiwit. ### 3.4.3 Reactie van de cel op nonsense en nonstop mutaties Cellen hebben mechanismen ontwikkeld om met mRNA's die voortijdig stopcodons of juist geen stopcodons bevatten om te gaan: * **Nonsense suppressor tRNAs:** Dit zijn speciale tRNAs die een stopcodon kunnen herkennen en een aminozuur kunnen inbrengen. Dit resulteert in de synthese van een volledig eiwit, maar met mogelijk één (gemuteerd) aminozuur op de plaats van het oorspronkelijke stopcodon. * **Nonsense-mediated mRNA decay (NMD):** Dit is een kwaliteitscontrolesysteem dat mRNA's met voortijdige stopcodons (premature termination codons - PTCs) detecteert en afbreekt. Dit voorkomt de synthese van potentieel schadelijke verkorte eiwitten. Een belangrijk aspect is de associatie van stopcodons met Exon Junction Complexes (EJCs); een stopcodon dat optreedt vóór het laatste EJC signaleert NMD. * **Nonstop mRNA decay:** Transcripten die geen stopcodon bevatten, worden ook afgebroken. In eukaryoten gebeurt dit via de rekrutering van een eiwitcomplex met ribonuclease-activiteit naar de A-site. In prokaryoten is dit proces vergelijkbaar, maar maakt gebruik van tmRNA, dat een klein aantal aminozuren aan het groeiende polypeptide toevoegt, inclusief een signaal voor afbraak. > **Tip:** Het onderscheid tussen de afloop van een nonsense mutatie (geen suppressor tRNA, wel NMD vs. geen NMD) en de introductie van een nonsense suppressor tRNA is cruciaal voor het voorspellen van het uiteindelijke eiwitproduct. ## 3.5 Post-translationele processen Na de synthese op het ribosoom ondergaan veel eiwitten modificaties om hun uiteindelijke structuur en functie te voltooien. Deze post-translationele modificaties zijn divers en essentieel voor de eiwitactiviteit. ### 3.5.1 Proteolytische verwerking Sommige eiwitten worden gesynthetiseerd als inactieve precursors die vervolgens door specifieke proteasen worden geknipt om de actieve vorm te verkrijgen. * **Verwijdering van de initiële methionine:** Het eerste aminozuur, methionine, wordt vaak verwijderd na translatie. * **Klieving van pro-peptiden:** Veel eiwitten, zoals hormonen (bv. insuline) en enzymen (bv. spijsverteringsenzymen), worden gesynthetiseerd als grotere, inactieve precursor-vormen (pro-eiwitten of pre-pro-eiwitten) die vervolgens worden geknipt. Bij insuline worden bijvoorbeeld de C-peptide en de N-terminale signaalsequentie verwijderd. ### 3.5.2 Chemische modificaties Covalente toevoeging van chemische groepen aan aminozuurresiduen kan de eiwitactiviteit, stabiliteit, lokalisatie of interacties beïnvloeden. Deze modificaties zijn vaak omkeerbaar. * **Fosforylering:** Toevoeging van een fosfaatgroep aan de hydroxyl (-OH) groep van serine (Ser), threonine (Thr) of tyrosine (Tyr) residuen. Dit wordt gekatalyseerd door eiwitkinasen en verwijderd door eiwitfosfatases. * **Acetylering:** Toevoeging van een acetylgroep aan de amino (-NH$_{2}$) groep van lysine (Lys) residuen. Gekatalyseerd door acetyltransferases en verwijderd door deacetylases. * **Methylering:** Toevoeging van een methylgroep (-CH$_{3}$) aan de amino groep van Lys of arginine (Arg) residuen. Gekatalyseerd door methyltransferases en verwijderd door demethyltransferases. * **Glycosylering:** Binding van een suikermolecuul aan het eiwit. * **O-linked glycosylering:** Binding via het zuurstofatoom van Ser of Thr. * **N-linked glycosylering:** Binding via het stikstofatoom van asparagine (Asn) residuen. Dit gebeurt meestal in het endoplasmatisch reticulum. ### 3.5.3 Proteïne splicing Een intrigerend post-translationeel proces waarbij bepaalde interne sequenties (inteïnen) zichzelf uit een polypeptideketen knippen, waarna de buitenste sequenties (exteïnen) aan elkaar worden geligeerd. Dit leidt tot een functioneel eiwit met een andere structuur dan het oorspronkelijke translaat. ### 3.5.4 Vorming van zwavelbruggen (disulfide bonds) De vorming van covalente bindingen tussen de sulfhydryl (-SH) groepen van twee cysteïne (Cys) residuen. Deze bindingen stabiliseren de tertiaire en quaternaire structuur van eiwitten, met name voor eiwitten die buiten de cel functioneren. Bij insuline worden bijvoorbeeld zwavelbruggen gevormd tussen de A- en B-ketens. ### 3.5.5 Moleculaire chaperons en vouwing Moleculaire chaperons zijn eiwitten die helpen bij de correcte driedimensionale vouwing van andere eiwitten, zowel tijdens als na de translatie. Ze voorkomen aggregatie van ongevouwen of misgevouwen eiwitten en kunnen zelfs helpen bij het herstellen van de vouwing. Voorbeelden zijn heat-shock proteïnen (Hsp70) en het GroEL/GroES complex, dat functioneert als een 'kooi' voor eiwitvouwing. Ze spelen ook een rol bij de assemblage van eiwitcomplexen en transport door membranen. > **Tip:** Post-translationele modificaties zijn cruciaal voor de diversiteit en specificiteit van eiwitfuncties in de cel. Het begrijpen hiervan is essentieel voor veel gebieden binnen de biologie en geneeskunde. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Genetische code | Het systeem dat nucleotidenreeksen in genen vertaalt naar aminozuursequenties in eiwitten, waarbij triplets van nucleotiden (codons) overeenkomen met specifieke aminozuren of stopsequenties. | | Translatie | Het proces waarbij de genetische informatie, gecodeerd in messenger-RNA (mRNA), wordt gebruikt om een specifieke sequentie van aminozuren te synthetiseren, wat resulteert in de vorming van een eiwit. | | Ribosoom | Een complex moleculair apparaat dat voorkomt in alle levende cellen en dat verantwoordelijk is voor eiwitsynthese; het is opgebouwd uit ribosomaal RNA (rRNA) en eiwitten en bestaat uit een grote en een kleine subeenheid. | | tRNA (transfer RNA) | Kleine RNA-moleculen die een cruciale rol spelen bij translatie door specifieke aminozuren te binden en deze aan het groeiende polypeptide te leveren, gebaseerd op de complementariteit van hun anticodon met het mRNA-codon. | | Anticodon | Een triplet van nucleotiden op een tRNA-molecuul dat complementair is aan een specifiek codon op een mRNA-molecuul, waardoor de juiste aminozuurtoevoeging tijdens de eiwitsynthese wordt gegarandeerd. | | Codon | Een sequentie van drie nucleotiden in DNA of RNA die codeert voor een specifiek aminozuur of een stopsignaal tijdens de translatie. | | Aminozuur | De bouwsteen van eiwitten; er zijn twintig standaard aminozuren die worden gebruikt in de biologische eiwitsynthese, elk met een unieke chemische eigenschap. | | Wobble basenparing | Een flexibele basenparing die optreedt aan de derde positie van een codon en de eerste positie van een anticodon, waardoor een enkel tRNA-molecuul meerdere gerelateerde codons kan herkennen. | | Aminoacyl-tRNA synthetase | Enzymen die verantwoordelijk zijn voor het correct koppelen van een specifiek aminozuur aan het corresponderende tRNA-molecuul, een proces dat essentieel is voor de nauwkeurigheid van de eiwitsynthese. | | Initiatiefactoren | Proteïnen die een rol spelen bij het initiëren van translatie door de binding van het mRNA en het initiatie-tRNA aan het kleine ribosomale subeenheid te faciliteren. | | Elongatiefactoren | Proteïnen die het proces van elongatie (verlenging) van het polypeptide tijdens translatie ondersteunen, zoals het binden van aminoacyl-tRNA's en het faciliteren van peptidebindingvorming. | | Release factoren | Proteïnen die het einde van translatie herkennen door te binden aan stopcodons op het mRNA, wat leidt tot beëindiging van de eiwitsynthese en vrijlating van het polypeptide. | | Mutatie | Een permanente verandering in de DNA-sequentie van een organisme; dit kan variëren van puntmutaties (verandering van één nucleotide) tot grotere chromosomale veranderingen. | | Frameshift mutatie | Een type mutatie veroorzaakt door de insertie of deletie van een aantal nucleotiden dat geen veelvoud van drie is, wat resulteert in een verandering van het leesraam en vaak een niet-functioneel eiwit. | | Post-translationele modificaties | Chemische veranderingen die optreden op een eiwit na de initiële translatie, die de functie, structuur, lokalisatie of stabiliteit van het eiwit kunnen beïnvloeden. | | Moleculaire chaperons | Eiwitten die de correcte vouwing van andere eiwitten helpen bevorderen, voorkomen van aggregatie en assisteren bij eiwittransport, zonder zelf deel uit te maken van het uiteindelijke functionele eiwit. | | Proteolytische processing | Een post-translationele modificatie waarbij een polypeptide wordt geknipt door proteasen om een actief eiwit te vormen, bijvoorbeeld door het verwijderen van een signaalsequentie of het splitsen van een groter precursor-eiwit. | | Glycosylering | Een post-translationele modificatie waarbij een koolhydraatgroep (glycaan) covalent wordt gebonden aan een eiwit, wat de eiwitvouwing, stabiliteit, cellulaire interacties en signalering kan beïnvloeden. |