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# Structure primaire des acides nucléiques Les acides nucléiques, qu'il s'agisse de l'ADN ou de l'ARN, sont des polymères dont les unités monomériques sont les nucléotides. La structure primaire de ces acides nucléiques se réfère à la séquence linéaire de ces nucléotides reliés entre eux [4](#page=4). ### 1.1 Les nucléotides : les briques élémentaires Un nucléotide est composé de trois éléments essentiels : * Une base azotée * Un sucre (ribose pour l'ARN, désoxyribose pour l'ADN) * Un ou plusieurs groupements phosphate Ces nucléotides sont les unités fondamentales qui transmettent l'information génétique. Ils jouent également un rôle crucial dans le métabolisme sous forme de di- et tri-phosphorylés, ainsi que dans la transmission de l'information cellulaire via l'AMPc et le GMPc [4](#page=4). #### 1.1.1 Les bases azotées Les bases azotées sont des composés hétérocycliques contenant de l'azote. Elles sont divisées en deux catégories principales: les purines et les pyrimidines [11](#page=11). ##### 1.1.1.1 Les purines Les purines sont des bases à double cycle. Les purines rencontrées dans les acides nucléiques sont l'adénine (A) et la guanine (G). L'adénine possède une fonction imino-amine, tandis que la guanine possède une fonction imino-amine et une fonction amide [12](#page=12) [13](#page=13) [14](#page=14) [15](#page=15). ##### 1.1.1.2 Les pyrimidines Les pyrimidines sont des bases à cycle simple. Les pyrimidines trouvées dans les acides nucléiques sont la cytosine (C), la thymine (T) et l'uracile (U). La cytosine possède une fonction imino-amine, tandis que la thymine (souvent appelée thymidine dans le contexte des nucléosides) présente une fonction imino-amine et une fonction amide. L'uracile est une autre pyrimidine importante, particulièrement dans l'ARN [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19) [26](#page=26). > **Tip:** Dans l'ADN, la thymine est présente, tandis que dans l'ARN, l'uracile remplace la thymine [26](#page=26). #### 1.1.2 Les sucres Les sucres présents dans les acides nucléiques sont des pentoses. * Dans l'ARN, le sucre est le **ribose**. Il s'agit d'un ribofuranose [20](#page=20) [21](#page=21) [22](#page=22) [23](#page=23). * Dans l'ADN, le sucre est le **désoxyribose**. Il diffère du ribose par l'absence d'un groupement hydroxyle (-OH) sur le carbone en position 2' du cycle [26](#page=26). > **Tip:** La présence d'une fonction -OH en 2' du sucre est l'une des différences cruciales entre l'ARN et l'ADN [26](#page=26). #### 1.1.3 Le groupement phosphate Le groupement phosphate est lié au carbone en position 5' du sucre. Les nucléotides peuvent exister sous forme mono-, di-, ou triphosphate, ce qui est essentiel pour leur rôle énergétique et de précurseurs dans la synthèse des acides nucléiques. Par exemple, le désoxyadénosine triphosphate est noté dATP [25](#page=25) [29](#page=29). ### 1.2 Nomenclature des acides nucléiques La nomenclature des acides nucléiques suit une logique basée sur la combinaison de la base azotée, du sucre et du nombre de phosphates. * **Nucléosides:** Base azotée + Sucre (ex: Adénosine, Guanosine, Thymidine, Cytidine, Uridine). Pour l'ADN, on utilise le préfixe "désoxy-" (ex: Désoxyadénosine) [24](#page=24) [27](#page=27) [28](#page=28). * **Nucléotides:** Nucléoside + Phosphate (ex: Adénylate, Guanylate, Thymidylate, Cytidylate, Uridylate). Pour l'ADN, on utilise le préfixe "désoxy-" (ex: Désoxyadénosine monophosphate, dAMP) [27](#page=27) [29](#page=29). * Les formes tri-phosphorylées sont importantes, comme le désoxyadénosine triphosphate (dATP) [25](#page=25) [29](#page=29). > **Example:** > * Base : Adénine > * Sucre : Ribose > * Nucléoside : Adénosine > * Nucléotide : Adénylate (ou AMP) > > * Base : Adénine > * Sucre : Désoxyribose > * Nucléoside : Désoxyadénosine > * Nucléotide : Désoxyadénylate (ou dAMP) Pour l'ARN, on notera les briques AMP, CMP, GMP et UMP (uridine monophosphate) [26](#page=26). ### 1.3 Différences structurelles et fonctionnelles entre ADN et ARN Bien que les briques qui composent l'ARN soient très semblables à celles de l'ADN, deux différences cruciales existent [26](#page=26): 1. Présence d'une fonction -OH en position 2' du sucre ribose dans l'ARN, là où l'ADN possède un hydrogène. 2. Présence d'un noyau uracile (U) dans l'ARN à la place du noyau thymine (T) présent dans l'ADN. Ces différences entraînent des distinctions dans leurs structures, leurs fonctions et leur durée de vie. Les ARN peuvent adopter des structures complexes et posséder des activités enzymatiques (ribozymes) ou de régulation (riboswitches). Cependant, les ARNm et les ARN non structurés en général sont plus sensibles aux ribonucléases que l'ADN . --- # Structure spatiale et topologie de l'ADN L'ADN, au-delà de sa structure primaire en séquence de nucléotides, adopte des structures spatiales complexes et présente des propriétés topologiques essentielles à son organisation et à sa fonction [1](#page=1) [2](#page=2). ### 2.1 Structures spatiales de l'ADN #### 2.1.1 Règles de Chargaff et appariements de bases Les règles de Chargaff, établies à partir d'hydrolysats d'ADN analysés par chromatographie, ont révélé des relations quantitatives fondamentales entre les bases azotées. Elles stipulent que la quantité d'adénine (A) est égale à celle de thymine (T), et la quantité de guanine (G) est égale à celle de cytosine (C). Mathématiquement, cela s'exprime par [32](#page=32) [33](#page=33): $$A = T$$ $$G = C$$ $$A + G = T + C$$ La composition en bases de l'ADN est caractéristique de chaque organisme. Par exemple, chez l'homme, le rapport (A+T)/(G+C) est de 1,52. Ces observations, couplées aux données de diffraction aux rayons X ont fourni les indices nécessaires à l'élaboration de modèles d'hélice d'ADN [31](#page=31) [32](#page=32) [34](#page=34). La modélisation a permis de vérifier que deux bases azotées données pouvaient s'associer par liaisons hydrogène. Les appariements de bases de type Watson-Crick sont au cœur de la structure de la double hélice d'ADN. Ils impliquent [34](#page=34) [36](#page=36) [41](#page=41): * Un appariement entre l'adénine (A) et la thymine (T) via deux liaisons hydrogène ($A = T$) [44](#page=44). * Un appariement entre la guanine (G) et la cytosine (C) via trois liaisons hydrogène ($G \equiv C$) [43](#page=43) [44](#page=44). Ces appariements spécifiques garantissent la complémentarité des deux brins et sont cruciaux pour la réplication semi-conservative de l'ADN. Le "brin sens" et le "brin antisens" s'associent de manière antiparallèle, avec les extrémités 5' et 3' orientées dans des directions opposées [36](#page=36) [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41). #### 2.1.2 Les différentes formes d'ADN double-brin La structure la plus courante de l'ADN est la forme B [47](#page=47). * **ADN-B:** C'est de loin la structure la plus fréquente chez les organismes vivants. Il s'agit d'une double hélice tournant vers la droite, où les paires de bases sont disposées perpendiculairement au plan de l'axe de l'hélice. La structure B présente un grand sillon et un petit sillon, des zones importantes pour l'interaction avec des protéines. Le petit sillon a une largeur d'environ 12 Å et le grand sillon environ 22 Å [46](#page=46) [47](#page=47) [49](#page=49). * **ADN-A:** Cette forme est une hélice droite, relativement fréquente, mais plus courte et plus large que l'ADN-B. Les paires de bases sont inclinées de 19° par rapport au plan perpendiculaire à l'axe de l'hélice. L'ADN-A est retrouvé dans les milieux déshydratés [47](#page=47). * **ADN-Z:** Il s'agit d'une double hélice gauche dont le squelette présente une structure en zigzag. Les paires de bases sont également perpendiculaires à l'axe de l'hélice. Cette forme est rare et se caractérise par l'absence de grand et de petit sillon distincts. L'ADN-Z se forme préférentiellement sur des séquences riches en GC [47](#page=47). > **Tip:** La structure de la double hélice d'ADN est souple et peut varier localement, notamment en présence de séquences nucléotidiques particulières comme la succession de plusieurs bases A (>4), qui peut induire une courbure de la double hélice. Ces variations structurelles sont importantes pour les interactions avec des protéines [48](#page=48). #### 2.1.3 Reconnaissance protéine-ADN Les sillons de la double hélice d'ADN, particulièrement le grand sillon, sont des sites clés pour la reconnaissance par des protéines spécifiques. Des indices tels que les accepteurs (A) et donneurs (D) de liaisons hydrogène, ainsi que les groupements méthyl (M), permettent d'établir des codes de reconnaissance entre les protéines et l'ADN [49](#page=49). ### 2.2 Topologie de l'ADN La topologie de l'ADN concerne la manière dont la molécule est enroulée et ses propriétés géométriques dans l'espace [50](#page=50) [57](#page=57). #### 2.2.1 Molécules d'ADN circulaires La plupart des chromosomes bactériens sont circulaires. Les plasmides, éléments épigénétiques auto-réplicatifs des bactéries, sont également circulaires. L'ADN de certains virus, comme le SV40, et des bactériophages (linéaire dans la particule virale, circulaire lors de l'infection chez E. coli) peut aussi être circulaire [51](#page=51) [58](#page=58). #### 2.2.2 Notion de topoisomères Deux molécules d'ADN de séquences de bases identiques peuvent différer par le nombre de tours que forme l'un des brins autour de l'autre brin. Les isomères résultants, qui ne diffèrent que par leur nombre d'enlacements, sont appelés topoisomères. Il existe différents états de topoisomérie [53](#page=53): * **État relâché:** Torsion minimale, conformation la plus stable [53](#page=53). * **États surenroulés :** * **Surenroulement positif:** Le nombre d'enroulements augmente [53](#page=53). * **Surenroulement négatif:** Le nombre d'enlacements a diminué. Cela peut favoriser la séparation locale des deux brins d'ADN [53](#page=53). > **Example:** Un chromosome bactérien circulaire nativement RELAXÉ a un certain nombre de tours (par exemple, Lk0). Si ce même ADN est compacté sans modification de sa séquence ou de sa longueur, il peut adopter un état SUREMENT ENROULÉ (positif) ou DÉSÉROULÉ (négatif), chacun ayant un nombre de tours différent (Lk1, Lk2) par rapport à Lk0. Ces formes sont des topoisomères. #### 2.2.3 Les topoisomérases Les topoisomérases sont des enzymes essentielles qui modifient le nombre d'enlacements des molécules d'ADN. Elles sont capables d'introduire ou d'éliminer des supertours dans la double hélice d'ADN [54](#page=54). * **Topoisomérase I:** Aussi appelées enzymes relachantes ou hélicases. Elles catalysent le désenroulement de l'ADN par clivage d'un seul brin d'ADN, supprimant ainsi les supertours négatifs et ramenant l'ADN surenroulé à un état relâché. Cette activité ne nécessite pas d'apport d'énergie [54](#page=54). * **Topoisomérase II (gyrases):** Elles coupent de manière transitoire les deux brins d'ADN. Elles sont capables de créer des supertours, tant positifs que négatifs. Ces enzymes nécessitent un apport d'énergie sous forme d'ATP, qui est transducteur en énergie potentielle tensionnelle [54](#page=54). > **Tip:** Le rôle des topoisomérases est crucial car l'ADN est très enchevêtré au niveau du noyau. Les topoisomérases déroulent l'ADN, permettant ainsi l'accès aux informations génétiques qu'il contient [54](#page=54). L'ADN bactérien, organisé en boucles d'environ 40 000 paires de bases clampées à leur base par des protéines, est également sujet à des modifications topologiques qui peuvent être visualisées comme des chromosomes relâchés ou surenroulés. Ces boucles sont topologiquement équivalentes à des molécules circulaires [58](#page=58) [59](#page=59). --- # Structure de l'ADN dans la cellule et organisation chromosomique Ce sujet explore comment l'ADN est structuré et organisé au sein des cellules, en examinant les différences entre les chromosomes bactériens et eucaryotes, ainsi que les mécanismes de compaction de l'ADN [1](#page=1) [2](#page=2) [50](#page=50) [57](#page=57). ### 3.1 Le chromosome bactérien Les chromosomes bactériens sont généralement circulaires et constituent la forme principale de l'ADN chromosomique chez les procaryotes comme *E. Coli*. Bien qu'il n'y ait pas de noyau chez les bactéries, l'ADN est localisé dans une région appelée nucléoïde. Le chromosome bactérien est compacté et organisé en boucles d'environ 40 000 paires de bases (pb), qui sont ancrées à leur base par des protéines. Ces boucles, au nombre d'environ une centaine, sont topologiquement équivalentes à des molécules circulaires. Les plasmides sont également des éléments génétiques autonomes retrouvés chez les bactéries. L'ADN de certains virus, comme le SV40, est également circulaire [51](#page=51) [58](#page=58). > **Exemple:** Le chromosome bactérien d'*E. Coli* mesure environ 4,2 millions de paires de bases et est circulaire [58](#page=58). ### 3.2 Les chromosomes des cellules eucaryotes Chez les eucaryotes, l'ADN est organisé en chromosomes linéaires. Chez l'homme, le génome haploïde contient environ 3 milliards de paires de bases réparties sur 23 chromosomes. La taille de ces chromosomes varie de 50 à 260 millions de paires de bases. Cela signifie qu'une cellule diploïde doit empaqueter près de deux mètres d'ADN dans un noyau dont le diamètre est de 5 à 7 micromètres. Pour réaliser cette compaction extrême, l'ADN s'associe à des protéines basiques appelées histones. Chaque chromosome eucaryote est constitué d'une seule molécule d'ADN bicaténaire linéaire. Une cellule eucaryote contient environ 6 picogrammes (pg) d'ADN, associés à une masse de protéines au moins équivalente. La consistance du noyau eucaryote est décrite comme ressemblant à celle d'un gel [61](#page=61). > **Tip:** L'association de l'ADN avec les histones est fondamentale pour la compaction de l'ADN dans le noyau eucaryote [61](#page=61). L'ADN des eucaryotes peut être localisé dans différentes parties de la cellule: dans le noyau, dans les mitochondries, et chez les plantes, dans les chloroplastes [9](#page=9). ### 3.3 Les nucléosomes Les nucléosomes sont l'unité fondamentale de l'organisation de la chromatine eucaryote. Ils sont formés par un octamère d'histones autour duquel s'enroule l'ADN. Les histones H3 et H4 sont hautement conservées et existent en solution sous forme de tétramères, de même que les histones H2A et H2B. Ces deux tétramères s'associent pour former l'octamère d'histones. L'ADN s'enroule ensuite autour de cet octamère sur environ 147 paires de bases, formant pratiquement deux supertours d'hélice dans un super-enroulement gauche. L'histone H4 est remarquable par sa conservation extrême à travers les espèces, contenant notamment 14 résidus d'arginine et 11 résidus de lysine [65](#page=65) [66](#page=66). #### 3.3.1 Structure chromatinienne d'ordre supérieur La compaction de l'ADN se poursuit au-delà du nucléosome. L'histone H1 se fixe à l'ADN dit "internucléosomique", qui relie les nucléosomes entre eux. Cette histone H1 peut se lier à l'ADN soit à une extrémité du nucléosome, soit au milieu des 147 paires de bases associées au nucléosome. Les séries de nucléosomes forment ensuite des structures plus complexes, telles que la fibre de 30 nanomètres, qui représente un second niveau de compaction de l'ADN. Deux modèles décrivent cette structure: le modèle du solénoïde, où la fibre forme une superhélice contenant environ 6 nucléosomes par tour, et le modèle du zig-zag. L'histone H1 est essentielle pour la formation de la structure en solénoïde [68](#page=68) [69](#page=69) [70](#page=70). Les queues amino-terminales des histones jouent également un rôle dans la formation de la fibre de 30 nm, participant à la stabilisation de cette structure par interaction avec les nucléosomes adjacents. Une compaction encore plus importante de l'ADN implique la formation de grandes boucles dans l'ADN nucléosomal. La fibre de 30 nm forme des boucles d'environ 40 à 90 paires de bases qui sont maintenues ensemble à leur base par la matrice nucléaire, impliquant la topoisomérase II et les protéines SMC. Ceci représente un troisième niveau de compaction de l'ADN [71](#page=71) [72](#page=72). > **Tip:** La structure de la chromatine est hiérarchique, passant du nucléosome à la fibre de 30 nm, puis à des structures encore plus condensées impliquant des boucles d'ADN fixées à la matrice nucléaire [68](#page=68) [71](#page=71) [73](#page=73). #### 3.3.2 Hétérochromatine et euchromatine La chromatine peut exister sous deux formes principales: l'hétérochromatine et l'euchromatine. L'hétérochromatine se caractérise par un marquage dense et une apparence condensée, tandis que l'euchromatine présente un marquage faible et une structure plus ouverte. En termes d'expression génique, l'hétérochromatine est associée à un faible taux d'expression génique, alors que l'euchromatine correspond à des régions avec un niveau d'expression génique élevé. Dans les deux cas, l'ADN est condensé en nucléosomes; la différence réside dans l'assemblage de ces nucléosomes en structures plus complexes [74](#page=74). Pour qu'un gène puisse être transcrit, la chromatine ne peut pas être aussi condensée qu'en métaphase; elle adopte alors une structure d'euchromatine. Les boucles chromosomiques restent attachées à un réseau protéique fibreux, la matrice nucléaire. Les gènes en cours de transcription, qui représentent environ 10% du génome, conservent une structure nucléosomique, mais celle-ci est modifiée, soit par un départ transitoire d'histones, soit par des modifications de l'état des histones, comme l'acétylation des lysines. L'hétérochromatine, quant à elle, reste condensée et n'est pas transcrite [75](#page=75). --- # Méthodes d'étude et techniques moléculaires appliquées à l'ADN et l'ARN Ce chapitre détaille les propriétés physico-chimiques des acides nucléiques ainsi que les méthodes clés d'analyse et de manipulation de l'ADN et de l'ARN, incluant l'électrophorèse, les enzymes de restriction, les blots, le séquençage, et la PCR. ### 4.1 Propriétés physico-chimiques des acides nucléiques Les propriétés des acides nucléiques sont déterminantes pour leur analyse et leur manipulation. #### 4.1.1 Solubilité et viscosité Les ARN sont peu solubles dans l'eau mais se dissolvent dans des solutions salines diluées (10 mmol/l de NaCl). Les sels de sodium de l'ADN sont solubles, mais leurs solutions sont très visqueuses. L'ajout d'éthanol en grand volume (2 à 2,5 fois) provoque la précipitation de l'ADN, car cela diminue la constante diélectrique du milieu, favorisant ainsi les interactions ioniques et hydrogène entre les macromolécules [77](#page=77). #### 4.1.2 Comportement en fonction du pH À pH acide, les régions d'appariement riches en A=T sont dénaturées, tandis que celles riches en GC résistent plus longtemps. Un pH acide a tendance à rompre les liaisons hydrogène. À pH alcalin, les régions appariées sont également dénaturées en monobrins. Pour l'ARN, une exposition prolongée à un milieu alcalin entraîne une hydrolyse irréversible [78](#page=78). #### 4.1.3 Absorption dans l'ultraviolet L'absorption maximale des acides nucléiques se situe à 260 nm, ce qui est utilisé pour leur dosage. Le rapport d'absorbance à 260 nm sur l'absorbance à 280 nm ($A_{260}/A_{280}$) est utilisé pour évaluer la pureté des acides nucléiques; un rapport entre 1,8 et 2,1 indique une bonne pureté [79](#page=79). #### 4.1.4 Dénaturation de l'ADN La dénaturation de l'ADN est l'étape où la double hélice se sépare en deux brins simples. Ce processus est réversible par renaturation, à condition que les conditions soient favorables [81](#page=81). ##### 4.1.4.1 Température de fusion (Tm) La température de fusion (Tm) est la température à laquelle 50% de l'ADN est dénaturé en brins simples. La densité optique à 260 nm augmente lors de la dénaturation de l'ADN bicaténaire en ADN monocaténaire [80](#page=80) [82](#page=82). * **Facteurs influençant la Tm :** * **Composition en bases:** Plus la proportion de paires G+C est élevée, plus la Tm est haute, car les liaisons G≡C sont plus fortes que les liaisons A=T. La formule approximative est: $Tm = 69,3 + 0,41(\%G+C)$. Par exemple, un ADN avec 50% de G+C a une Tm d'environ 69,8°C, tandis qu'un ADN avec 66% de G+C a une Tm d'environ 96,4°C [83](#page=83) [84](#page=84). * **Concentration saline:** Une diminution de la concentration saline déstabilise la double hélice et diminue la Tm [84](#page=84). * **Longueur du fragment:** Les fragments plus courts ont une Tm plus basse [84](#page=84). ### 4.2 Méthodes d'étude des acides nucléiques Diverses techniques permettent d'analyser et de caractériser l'ADN et l'ARN. #### 4.2.1 Électrophorèse sur gel d'agarose L'électrophorèse sur gel d'agarose est une technique fondamentale pour séparer les fragments d'ADN ou d'ARN en fonction de leur taille. Les acides nucléiques, chargés négativement, migrent vers l'anode dans un champ électrique [87](#page=87) [89](#page=89). * **Principe:** Les molécules d'acides nucléiques migrent à travers la matrice poreuse du gel. Les fragments plus petits traversent le gel plus rapidement que les fragments plus grands, permettant ainsi leur séparation [89](#page=89). * **Visualisation:** L'ajout d'un agent intercalant fluorescent, comme le bromure d'éthidium, permet de visualiser les bandes d'ADN sous lumière UV. L'intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN [92](#page=92). * **Marqueurs de taille:** Des marqueurs de taille (ADN ladders) de tailles connues sont utilisés comme référence pour estimer la taille des fragments analysés [92](#page=92) [94](#page=94). * **Applications:** L'électrophorèse est utilisée après des analyses par restriction pour identifier des fragments d'ADN [92](#page=92). #### 4.2.2 Enzymes de restriction Les enzymes de restriction sont des nucléases qui coupent l'ADN à des sites de reconnaissance spécifiques, généralement des séquences palindromiques de 4 à 6 paires de bases [97](#page=97). * **Reconnaissance:** Elles reconnaissent des séquences palindromiques, c'est-à-dire des séquences qui se lisent de la même manière dans les deux sens (ex: "Madam I'm Adam") [97](#page=97). * **Types de coupures:** Elles peuvent produire des bouts cohésifs (collants ou "sticky ends") ou des bouts droits ("blunt ends") [97](#page=97). #### 4.2.3 Méthodes d'hybridation Les méthodes d'hybridation exploitent la capacité des brins d'acides nucléiques à s'apparier spécifiquement avec des séquences complémentaires. * **Southern blot:** Utilisé pour détecter des séquences d'ADN spécifiques dans un échantillon [98](#page=98). * **Northern blot:** Utilisé pour détecter des séquences d'ARN spécifiques dans un échantillon [98](#page=98). #### 4.2.4 Séquençage d'ADN Le séquençage permet de déterminer l'ordre précis des nucléotides dans une molécule d'ADN. ##### 4.2.4.1 Technique de Sanger (Séquençage par terminaison de chaîne) Développée par Frederick Sanger, cette technique utilise des didésoxyribonucléotides (ddNTP) marqués au lieu des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP) . * **Principe:** Lors de la synthèse d'un nouveau brin d'ADN par une ADN polymérase, l'incorporation d'un ddNTP, qui manque du groupe 3'-OH nécessaire à l'élongation, entraîne l'arrêt aléatoire de la synthèse. Ceci génère une série de fragments de différentes tailles, chacun se terminant par le ddNTP incorporé . * **Matériel requis :** * Fragment d'ADN à séquencer (matrice) . * Amorce (oligonucléotide complémentaire à l'extrémité 3' du fragment) . * Les 4 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) . * ADN polymérase . * Un des nucléotides est marqué (historiquement au $^{32}$P) . * **Déroulement :** 1. **Réactions:** Traditionnellement, quatre réactions sont préparées, chacune contenant les réactifs de base plus un des quatre ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) . 2. **Électrophorèse:** Les fragments générés sont séparés par électrophorèse sur un gel d'acrylamide, qui offre une haute résolution. Les fragments les plus courts migrent plus rapidement . 3. **Détection et lecture:** Après électrophorèse, le gel est exposé à un film photographique (autoradiographie) pour détecter les fragments marqués. La séquence est lue de bas en haut du gel (du fragment le plus court au plus long) . * **Évolution de la technique :** * **Marquage des ddNTP:** Utilisation de ddNTP marqués avec des fluorophores, permettant une réaction unique . * **Automatisation:** Développement de séquenceurs en gel plat, puis de séquenceurs capillaires, qui automatisent le processus de séparation et de détection par laser. L'enregistrement des données produit un chromatogramme . * **Séquençage du génome humain:** Initialement un projet coûteux (environ 3 milliards de dollars) et long (13 ans), il est aujourd'hui réalisable en un jour pour moins de 1000 dollars grâce aux avancées technologiques et informatiques . #### 4.2.5 PCR (Polymerase Chain Reaction) La PCR est une technique permettant d'amplifier spécifiquement un fragment d'ADN double brin de quelques centaines de paires de bases à plusieurs kilobases . * **Principe:** La PCR repose sur des cycles répétés de trois étapes: dénaturation de l'ADN, hybridation des amorces, et extension par une ADN polymérase thermorésistante . * **Composants du milieu réactionnel :** * Matrice d'ADN (cible) . * Enzyme: Taq polymérase (ou autre polymérase thermorésistante) . * Amorces (oligonucléotides 5' et 3') . * dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) . * Tampon spécifique (contenant MgCl2, un cofacteur essentiel pour la polymérase) . * **Amorces :** * Deux oligonucléotides synthétiques, chacun complémentaire d'une des extrémités de la région à amplifier . * Leur séquence est connue, permettant de cibler spécifiquement la région d'intérêt . * Elles doivent être spécifiques, stables, et compatibles entre elles (Tm proches) . * La stabilité de l'extrémité 3' est importante pour l'initiation de la polymérisation, avec une préférence pour un G ou un C . * Il faut éviter les auto-hybridation (self-dimers), les dimères entre amorces (dimers), et les structures en épingles à cheveux (hairpins) . * **Détermination de la Tm des amorces:** La Tm dépend de la longueur et de la composition en bases des amorces. La règle de Wallace donne une approximation: $Tm = 4 \cdot (n_G + m_C) + 2 \cdot (p_A + q_T)$, où n, m, p, et q sont le nombre de G, C, A, et T respectivement. La température d'hybridation est généralement 5 à 10°C en dessous de la Tm la plus basse des deux amorces . * **Conditions réactionnelles :** * **ADN cible:** Pas nécessairement purifié; peut provenir d'un lysat cellulaire. La concentration ne doit pas être trop élevée . * **dNTP:** Leur concentration doit être supérieure au Km de la polymérase, typiquement autour de 200 µM pour chaque dNTP . * **MgCl2:** Essentiel pour l'activité de la polymérase; sa concentration doit être optimisée . * **Taille des fragments amplifiés:** Généralement de 1 à 2 Kb . * **Nombre de cycles:** 20 à 30 cycles, permettant d'obtenir $2^{20}$ à $2^{30}$ copies du fragment d'ADN ciblé . * **Étapes d'un cycle de PCR :** 1. **Dénaturation (91-96°C):** Séparation des deux brins de l'ADN matrice . 2. **Hybridation ou "annealing" (50-65°C):** Les amorces s'hybrident sur leurs séquences complémentaires sur les brins d'ADN matrice . 3. **Extension ou élongation (72°C):** L'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN complémentaire en utilisant l'amorce comme point de départ et l'ADN matrice comme modèle, dans le sens 5' vers 3' . * **"Hot start":** Certaines polymérases nécessitent un chauffage initial pour devenir actives, ce qui peut améliorer la spécificité en évitant l'amplification non désirée à basse température . * **Glossaire utile :** * **Taq polymérase:** Polymérase isolée de *Thermus aquaticus*, thermorésistante . * **Processivité:** Vitesse de la polymérase sur l'ADN; pour la Taq polymérase, environ 1 kilobase par minute . * **Fidélité:** Tendance d'une polymérase à faire peu d'erreurs; la Taq polymérase a une fidélité d'environ 1 erreur pour 1 million de paires de bases . * **Tm:** Température d'hybridation ou de fusion . * **PCR positive:** Visualisation d'une bande unique de la taille attendue sur un gel d'agarose . * **"Smear":** Traînée sur le gel indiquant une PCR non spécifique . ### 4.3 L'ARN L'ARN (acide ribonucléique) est une macromolécule essentielle à la vie, jouant divers rôles dans l'expression génique. #### 4.3.1 Types d'ARN Il existe plusieurs types d'ARN, chacun avec une fonction spécifique : * **ARNm (ARN messager):** Transcrit à partir de l'ADN, il transporte l'information génétique du noyau vers le cytoplasme pour la traduction en protéines. Ce sont des molécules généralement peu structurées et donc sensibles aux ribonucléases, reflétant leur rôle transitoire . * **ARNr (ARN ribosomal):** Constitue la majorité de l'ARN cellulaire (80-85%). Associé à des protéines, il forme les ribosomes, structures responsables de la synthèse des protéines . * **ARNt (ARN de transfert):** Molécules courtes qui adaptent les acides aminés à l'ARNm lors de la traduction, reconnaissant les codons grâce à leur anticodon. Ils sont très structurés et donc peu sensibles aux ribonucléases . * **ARN prémessager (pré-ARN messager):** ARN précurseur des ARNm, sujet à l'épissage chez les eucaryotes . * **ARN antisens:** ARN complémentaire à une séquence d'un autre ARN, inhibant sa fonction . * **ARN monocistronique/polycistronique:** L'ARNm monocistronique code pour un seul polypeptide, tandis que l'ARNm polycistronique en code pour plusieurs . * **MicroARN (miARN):** Petits ARN non codants qui régulent l'expression génique en interférant avec la traduction des ARNm cibles . * **ARN interférent (ARNi):** Mécanisme de régulation génique impliquant des ARN double-brin qui induisent la dégradation de l'ARNm correspondant ou l'inhibition de la traduction . #### 4.3.2 Composition et différences avec l'ADN Les briques élémentaires de l'ARN sont très similaires à celles de l'ADN, mais avec deux différences cruciales : 1. **Sucre:** La présence d'une fonction -OH en position 2' du ribose (plutôt qu'un H dans le désoxyribose de l'ADN) . 2. **Base azotée:** Le remplacement de la thymine (T) par l'uracile (U). Les nucléotides de l'ARN sont donc notés AMP, CMP, GMP, et UMP . Ces différences confèrent à l'ARN des structures, des fonctions et des durées de vie distinctes de celles de l'ADN. Comme les protéines, les ARN peuvent adopter des structures complexes et posséder des activités catalytiques (ribozymes) ou régulatrices . #### 4.3.3 Structures des ARN Les ARN peuvent former des structures secondaires et tertiaires complexes. * **Structure secondaire:** Implique des appariements de bases intramoléculaires, formant des régions double brin et des boucles. Les motifs courants incluent les boucles internes, les épingles à cheveux, les tiges avec trois ou quatre branches, et les bombements. Les appariements non classiques comme G=U (wobble pairs) sont fréquents et augmentent la diversité des structures possibles. Des appariements de type Hoogsteen existent également . * **Structure tertiaire:** Résulte de l'interaction entre des régions éloignées de la chaîne ARN, stabilisée par des liaisons hydrogène (y compris non standards), des interactions électrostatiques et des forces de van der Waals . * **ARNt:** Présentent des structures tridimensionnelles bien caractérisées, souvent représentées en forme de "L". Les boucles de l'ARNt (boucle de l'anticodon, boucle D, boucle T, boucle variable) sont des éléments clés de leur structure . * **Bases modifiées:** Les ARN, en particulier les ARNt, contiennent souvent des bases modifiées (ex: pseudouridine, ribothymidine, méthyladénosine) qui jouent un rôle dans la structure et la fonction . * **ARNr:** Possèdent également des structures secondaires et tertiaires complexes qui sont essentielles à leur fonction ribosomique. Les boucles quadruples (tetraloops) sont des motifs structuralement importants . #### 4.3.4 Taille et sédimentation des ARN La taille des différents types d'ARN varie considérablement, reflétée par leurs coefficients de sédimentation (S) . * **ARNm:** Hétérogènes en taille, masse moléculaire et coefficient de sédimentation . * **ARNt:** Petits, avec une masse moléculaire d'environ 25 kDa et un coefficient de sédimentation de 4S . * **ARNr:** Les ARNr 5S, 16S, et 23S sont plus grands et sédimentent à des vitesses plus élevées (5S, 16S, 23S). L'ARNr 16S est une composante majeure de la petite sous-unité ribosomique bactérienne . Les ARNm représentent une petite fraction des ARN totaux d'une cellule (3-5%), le reste étant constitué principalement d'ARNr (80-85%) et d'ARNt (10-15%) . --- ## Erreurs courantes à éviter - Révisez tous les sujets en profondeur avant les examens - Portez attention aux formules et définitions clés - Pratiquez avec les exemples fournis dans chaque section - Ne mémorisez pas sans comprendre les concepts sous-jacents

| Term | Definition | |------|------------| | Acide désoxyribonucléique (ADN) | Molécule contenant l'information génétique, composée de quatre bases élémentaires : A, T, C, G. Chaque cellule d'un individu possède le même génome. | | Acide ribonucléique (ARN) | Molécule similaire à l'ADN, mais avec une différence cruciale : la présence d'une fonction -OH en 2' du sucre et le remplacement de la thymine par l'uracile. Il existe plusieurs types d'ARN (ARNm, ARNr, ARNt) aux fonctions distinctes. | | Nucléotide | Les briques élémentaires constituants les acides nucléiques (ADN et ARN). Un nucléotide est composé d'une base azotée, d'un sucre et d'un groupement phosphate. | | Base azotée | Composant des nucléotides, il en existe deux familles principales : les purines (Adénine, Guanine) et les pyrimidines (Cytosine, Thymine pour l'ADN, Uracile pour l'ARN). | | Purine | Type de base azotée comportant un double cycle. Les purines présentes dans les acides nucléiques sont l'Adénine (A) et la Guanine (G). | | Pyrimidine | Type de base azotée comportant un cycle simple. Les pyrimidines présentes dans l'ADN sont la Cytosine (C) et la Thymine (T), tandis que l'ARN contient l'Uracile (U) à la place de la Thymine. | | Adénine | Base azotée purique présente dans l'ADN et l'ARN. Elle s'apparie classiquement avec la Thymine (dans l'ADN) ou l'Uracile (dans l'ARN) par deux liaisons hydrogène. | | Guanine | Base azotée purique présente dans l'ADN et l'ARN. Elle s'apparie classiquement avec la Cytosine par trois liaisons hydrogène. | | Cytosine | Base azotée pyrimidique présente dans l'ADN et l'ARN. Elle s'apparie classiquement avec la Guanine par trois liaisons hydrogène. | | Thymine | Base azotée pyrimidique présente uniquement dans l'ADN. Elle s'apparie classiquement avec l'Adénine par deux liaisons hydrogène. | | Uracile | Base azotée pyrimidique présente uniquement dans l'ARN. Elle s'apparie classiquement avec l'Adénine par deux liaisons hydrogène. | | Ribose | Sucre à cinq carbones (pentose) qui compose les nucléotides de l'ARN. Il possède une fonction hydroxyle (-OH) sur le carbone 2'. | | Désoxyribose | Sucre à cinq carbones (pentose) qui compose les nucléotides de l'ADN. Il se distingue du ribose par l'absence de fonction hydroxyle (-OH) sur le carbone 2'. | | Nucléoside | Molécule composée d'une base azotée liée à un sucre (ribose ou désoxyribose). La liaison se fait entre le carbone 1' du sucre et le groupement azote de la base. | | Nucléotide triphosphate | Forme activée des nucléotides, possédant trois groupements phosphate. Ces molécules servent de précurseurs à la synthèse de l'ADN et de l'ARN, et jouent également un rôle énergétique (ATP, GTP). | | Dogme central de la biologie moléculaire | Principe fondamental décrivant le flux de l'information génétique : ADN (réplication) -> ARN (transcription) -> Protéines (traduction). | | Réplication | Processus de duplication de l'ADN, assurant la transmission de l'information génétique lors de la division cellulaire. Elle est semi-conservative. | | Transcription | Processus de synthèse d'une molécule d'ARN à partir d'une matrice d'ADN. C'est la première étape de l'expression des gènes. | | Traduction | Processus de synthèse d'une protéine à partir de la séquence d'ARN messager (ARNm). Elle a lieu sur les ribosomes. | | Règle de Chargaff | Ensemble de règles observées concernant la composition en bases de l'ADN : la quantité d'Adénine est égale à celle de Thymine (A=T), et la quantité de Guanine est égale à celle de Cytosine (G=C). | | Double hélice | Structure tridimensionnelle caractéristique de l'ADN, formée de deux brins polynucléotidiques enroulés l'un autour de l'autre. | | Appariement Watson-Crick | Appariement spécifique des bases azotées au sein de la double hélice d'ADN : l'Adénine s'apparie avec la Thymine (A-T) et la Guanine s'apparie avec la Cytosine (G-C) par liaisons hydrogène. | | Liaison hydrogène | Liaison faible mais importante qui maintient ensemble les deux brins de la double hélice d'ADN par l'appariement des bases. | | Brin sens / Brin antisens | Dans une molécule d'ADN double brin, le brin sens (ou codant) est la séquence qui est transcrite, tandis que le brin antisens (ou matrice) sert de modèle pour la synthèse de l'ARN. | | ADN-B | Structure la plus courante de l'ADN double hélice, tournant vers la droite, avec des paires de bases perpendiculaires à l'axe de l'hélice. | | ADN-A | Forme d'hélice droite de l'ADN, plus courte et plus large que l'ADN-B, souvent trouvée dans les milieux déshydratés. | | ADN-Z | Forme d'hélice gauche de l'ADN, présentant une structure en zigzag, avec des paires de bases perpendiculaires à l'axe de l'hélice. Rare et sans grands ni petits sillons. | | Sillon majeur / Sillon mineur | Les deux types de sillons formés par l'enroulement des deux brins dans la structure de l'ADN double hélice. Ils jouent un rôle dans l'interaction avec les protéines. | | Topologie de l'ADN | Étude des propriétés géométriques des molécules d'ADN, notamment leur enroulement et leur superenroulement. | | Superenroulement | Torsion supplémentaire de la double hélice d'ADN sur elle-même, qui peut être positive ou négative. Il est essentiel pour la compaction de l'ADN dans la cellule. | | Topoisomère | Molécules d'ADN ayant la même séquence de bases mais différant par leur nombre de tours. | | Topoisomérase | Enzyme capable de modifier le nombre d'enlacements des brins d'ADN, soit en coupant et resoudant un brin (Topoisomérase I), soit les deux brins (Topoisomérase II). Elles régulent le superenroulement de l'ADN. | | Chromosome bactérien | Molécule d'ADN généralement circulaire chez les procaryotes, compactée dans le nucléotide. | | Nucléoïde | Région du cytoplasme bactérien où se trouve le chromosome ADN, non délimitée par une membrane. | | Plasmide | Petite molécule d'ADN circulaire extrachromosomique, capable de réplication autonome, présente chez de nombreuses bactéries. | | Chromosome eucaryote | Molécule d'ADN linéaire, beaucoup plus grande que le chromosome bactérien, associée à des protéines (histones) pour former la chromatine. | | Histone | Protéines basiques qui s'associent à l'ADN pour former les nucléosomes, l'unité de base de la compaction de la chromatine chez les eucaryotes. | | Nucléosome | Unité structurelle de base de la chromatine, composée d'un octamère d'histones autour duquel s'enroule environ 147 paires de bases d'ADN. | | Octamère d'histones | Complexe formé par deux copies de chaque histone : H2A, H2B, H3 et H4. | | Fibre de 30 nm | Structure secondaire de la chromatine formée par l'assemblage de plusieurs nucléosomes en une fibre plus compacte, stabilisée par l'histone H1. | | Matrice nucléaire | Réseau protéique fibreux présent dans le noyau des cellules eucaryotes, auquel sont fixées les boucles de chromatine. | | Hétérochromatine | Forme très condensée de la chromatine, généralement inactive génétiquement. | | Euchromatine | Forme moins condensée de la chromatine, active génétiquement et où se déroulent la transcription et la réplication. | | ARN messager (ARNm) | Molécule d'ARN qui transporte l'information génétique du noyau au cytoplasme, où elle sert de matrice pour la synthèse des protéines par les ribosomes. | | ARN ribosomique (ARNr) | ARN qui, associé à des protéines, forme les ribosomes, les organites cellulaires responsables de la synthèse protéique. | | ARN de transfert (ARNt) | Molécule d'ARN qui transporte les acides aminés spécifiques vers le ribosome, où ils sont assemblés selon la séquence de l'ARNm. Chaque ARNt possède un anticodon complémentaire à un codon de l'ARNm. | | Codon | Séquence de trois nucléotides sur l'ARNm qui spécifie un acide aminé particulier ou un signal de terminaison de la synthèse protéique. | | Anticodon | Séquence de trois nucléotides sur l'ARNt qui est complémentaire à un codon de l'ARNm, assurant la reconnaissance et le positionnement correct des acides aminés. | | Épissage | Processus de maturation des ARN pré-messagers chez les eucaryotes, où les introns sont retirés et les exons sont liés ensemble pour former l'ARNm mature. | | Ribozyme | Molécule d'ARN possédant une activité catalytique, similaire à celle d'une enzyme protéique. | | Riboswitch | Région d'ARN qui peut se lier à de petites molécules (métabolites) et modifier son repliement, régulant ainsi l'expression génique. | | Electrophorèse sur gel d'agarose | Technique permettant de séparer des fragments d'ADN ou d'ARN en fonction de leur taille, en appliquant un courant électrique à travers un gel. | | Bromure d'éthidium | Agent intercalant fluorescent utilisé pour visualiser l'ADN ou l'ARN sur un gel d'électrophorèse sous lumière UV. | | Marqueurs de taille (DNA ladders) | Mélange de fragments d'ADN de tailles connues, utilisé comme référence pour déterminer la taille des fragments d'ADN analysés par électrophorèse. | | Enzymes de restriction | Enzymes qui coupent l'ADN à des sites de reconnaissance spécifiques. Elles sont utilisées pour la manipulation de l'ADN et le clonage. | | Bouts cohésifs / Bouts droits | Les "bouts cohésifs" (ou collants) sont des extrémités courtes et décalées créées par certaines enzymes de restriction, permettant une liaison spécifique. Les "bouts droits" sont des extrémités franches. | | Southern blot | Technique d'hybridation permettant de détecter des séquences d'ADN spécifiques dans un échantillon. | | Northern blot | Technique d'hybridation permettant de détecter des séquences d'ARN spécifiques dans un échantillon. | | Séquençage | Détermination de l'ordre exact des nucléotides dans une molécule d'ADN ou d'ARN. | | Technique de Sanger | Méthode de séquençage de l'ADN basée sur l'utilisation de didésoxyribonucléotides (ddNTP) qui provoquent l'arrêt aléatoire de la synthèse d'un brin complémentaire. | | Didésoxyribonucléotide (ddNTP) | Nucléotide modifié qui, une fois incorporé dans une chaîne d'ADN en cours de synthèse, empêche l'élongation de cette chaîne en raison de l'absence du groupement 3'-OH. | | Amorcer / Amorce | Oligonucléotide court qui s'hybride à une séquence matrice et sert de point de départ pour la synthèse d'ADN par une ADN polymérase. Utilisé notamment en PCR et en séquençage. | | ADN polymérase | Enzyme qui catalyse la synthèse d'un brin d'ADN en ajoutant des nucléotides à une extrémité 3' d'une amorce. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Technique permettant d'amplifier de manière exponentielle un fragment d'ADN spécifique, en utilisant des cycles répétés de dénaturation, hybridation d'amorces et élongation par une ADN polymérase thermorésistante. | | Taq polymérase | ADN polymérase thermorésistante isolée de la bactérie Thermus aquaticus, couramment utilisée dans la PCR. | | Tm (Température de fusion/hybridation) | Température à laquelle 50% d'une population de duplex d'ADN est dénaturée en brins simples. Pour les amorces en PCR, c'est la température maximale à laquelle l'hybridation sur la matrice est complète. | | Chromatogramme | Représentation graphique des résultats d'un séquençage automatique, montrant les différents pics de fluorescence correspondant aux nucléotides détectés. | | Gène | Segment d'ADN qui contient l'information nécessaire à la synthèse d'une protéine ou d'une molécule d'ARN fonctionnelle. | | Paire de bases | Association de deux nucléotides complémentaires (A-T ou G-C) qui forment l'unité de base de la structure de la double hélice d'ADN. | | Liaison phosphodiester | Liaison chimique qui relie les nucléotides entre eux pour former les brins d'ADN et d'ARN. Elle se forme entre le groupe phosphate d'un nucléotide et le groupe hydroxyle en 3' du nucléotide précédent. | | Molécule d'ARN simple brin | L'ARN est généralement une molécule simple brin, mais il peut s'auto-apparier pour former des structures secondaires complexes. | | Structure secondaire de l'ARN | Repliement local de la chaîne d'ARN, formant des régions double brin (hélices) et des boucles. Les motifs courants incluent les épingles à cheveux et les boucles internes. | | Structure tertiaire de l'ARN | Structure tridimensionnelle complexe de l'ARN, résultant de l'interaction entre différentes régions de la chaîne simple brin, stabilisée par des liaisons hydrogène et d'autres interactions non covalentes. | | Wobble pair | Appariement non classique entre bases azotées dans les acides nucléiques, notamment G avec U, qui permet une certaine flexibilité dans la reconnaissance des codons par les ARNt. | | Paire de Hoogsteen | Type d'appariement de bases non canonique qui peut se former dans des structures d'acides nucléiques, impliquant des liaisons hydrogène différentes de celles de Watson-Crick. | | Métabolisme | Ensemble des processus chimiques qui se déroulent dans un organisme vivant pour maintenir la vie. | | AMPc et GMPc | Adénosine monophosphate cyclique et Guanosine monophosphate cyclique, seconds messagers impliqués dans la signalisation cellulaire. | | Chromosome bactérien | Molécule d'ADN généralement circulaire chez les procaryotes, compactée dans le nucléotide. | | Les nucléosomes | Unité structurelle de base de la chromatine, composée d'un octamère d'histones autour duquel s'enroule environ 147 paires de bases d'ADN. |