PBTech_4_notes.pdf

# Ontwikkeling van biotherapeutica en eiwitmodificatie Dit onderwerp behandelt de engineering van eiwitten voor de ontwikkeling van biotherapeutica, inclusief het ontwerpen van constructies, het gebruik van linkers en de modificatie van eiwitten middels mutaties, inserties en deleties, waarbij de focus ligt op hoe deze veranderingen de functie en eigenschappen van eiwitten beïnvloeden. ## 1.1 Inleiding tot biotherapeutische engineering Biotherapeutische engineering omvat verschillende strategieën om eiwitten te modificeren voor therapeutische doeleinden. Deze modificaties kunnen variëren van puntmutaties, inserties en deleties tot de chemische modificatie van eiwitten, het gebruik van onnatuurlijke aminozuren, het aanbrengen van tags voor zuivering of detectie, domeinwissels, en de fusie van functionele domeinen, wat leidt tot de creatie van nieuwe eiwitten [16](#page=16). ## 1.2 Belang van eiwitstructuur en modificaties De uiteindelijke toepassing van een eiwit stuurt de ontwerpstappen voor de ontwikkeling ervan. Eiwitstructuur is cruciaal voor functie en veiligheid van medicijnen, aangezien de meeste eiwitten een beperkt stabielheidsbereik hebben en misgevouwen eiwitten over het algemeen niet correct terugvouwen. Veranderingen in eiwitten, zoals post-translationele modificaties (PTM's) zoals glycosylering, acetylering, fosforylering en prenylering, kunnen de eigenschappen en functie van een eiwit significant beïnvloeden. De verwerking en zuivering van eiwitten, evenals de uiteindelijke formulering, bepalen mede de levensvatbaarheid van het product [17](#page=17) [18](#page=18) [4](#page=4). ## 1.3 Ontwerp van eiwitconstructies Het ontwerpproces van een eiwitconstructie begint met het identificeren van het gen van interesse (GoI) en de beoogde toepassing (Application), leidend tot het uiteindelijke eiwit van interesse (PoI). Dit proces omvat DNA-assemblage, eiwitexpressie en eiwitzuivering [4](#page=4). ### 1.3.1 DNA-assemblage en expressiekeuzes Bij de DNA-assemblage worden keuzes gemaakt met betrekking tot de bron van DNA en de methodologie voor DNA-assemblage. Voor expressie wordt het expressiesysteem, de subcloneringsstrategie, de keuze van zuiveringstags en de keuze van linkers bepaald [5](#page=5). ### 1.3.2 Voorbeeld: scFv constructie Een voorbeeld van een constructie is een single-chain variable fragment (scFv), dat bestaat uit de VH (variabele zware keten) en VL (variabele lichte keten) regio's van een antilichaam die de bindingsplaats vormen. Deze constructie is typisch klein, heeft weinig glycosylering en is niet-toxisch, waardoor expressie in *E. coli* mogelijk is met een IPTG-induceerbaar systeem, mits er een hoge zuiverheid vereist is [6](#page=6) [7](#page=7). #### 1.3.2.1 Rol van expressievectoren en linkers Expressievectoren, zoals pET28, bevatten regulatie van transcriptie en kunnen vaak standaard zuiveringstags bevatten, zoals een His-tag, die snelle, maar niet altijd zeer selectieve zuivering mogelijk maakt. Om individuele componenten van het eiwit van interesse (PoI) en tussen het PoI en de zuiveringstag te scheiden, zijn eiwitlinkers nodig. Linkers kunnen de oplosbaarheid, vouwing, expressieniveaus, bioactiviteit, labellering, farmacokinetiek en -dynamiek van eiwitten beïnvloeden. Ze kunnen variëren van enkele aminozuren tot hele fusiedomeinen [7](#page=7) [8](#page=8) [9](#page=9). #### 1.3.2.2 Revisie van componenten en DNA-assemblagemethoden Het ontwerpproces kan iteratief zijn, waarbij componenten herzien moeten worden. DNA-assemblagemethoden, zoals Type IIS restrictie-enzymen, maken "scarless" klonering mogelijk, waarbij overbodige sequenties aan het einde van het eiwit worden vermeden. PCR kan worden gebruikt om DNA te amplificeren met specifieke overhangen die nodig zijn voor klonering of om gewenste sequenties, zoals linkers, te introduceren [10](#page=10) [11](#page=11) [12](#page=12) [13](#page=13). ### 1.3.3 Eindsituatie van een constructie Een succesvol ontworpen constructie, zoals een scFv, kan een VH-domein bevatten, een flexibele linker, een VL-domein en een minimale linker gevolgd door een inteïn-tag, die uiteindelijk resulteert in een zuiver eiwit [13](#page=13) [14](#page=14). ## 1.4 Protein tags voor zuivering en functionaliteit Protein tags zijn genetisch gecodeerde sequenties die aan het eiwit van interesse worden gefuseerd en verschillende functies kunnen dienen. Hoewel ze vaak voor zuivering worden gebruikt door hun specifieke biofysische eigenschappen te benutten, kunnen ze ook andere rollen vervullen, zoals het beïnvloeden van farmacokinetiek of het faciliteren van detectie [18](#page=18) [19](#page=19). ### 1.4.1 His-tag De His-tag, traditioneel bestaande uit zes histidines, maakt zuivering mogelijk via de chelatie van metaalionen (zoals Cu²⁺, Ni²⁺, Co²⁺). Elutie gebeurt door competitie met imidazole, dat bindt aan het metaalion. De selectiviteit kan worden beïnvloed door het type metaalion; kobalt kan leiden tot hogere zuiverheid door minder binding van contaminanten, terwijl koper meer eiwitherstel kan bieden. De His-tag is niet erg selectief vanwege de lage affiniteit voor het Ni-NTA-medium, die niet significant verschilt van die van natuurlijke eiwitten zonder His-tag [20](#page=20) [21](#page=21). ### 1.4.2 Inteïne + Chitin Binding Protein (NEB IMPACT systeem) Het NEB IMPACT systeem maakt gebruik van een fusie van een inteïne met een chitin-bindend domein (CBD). Het CBD zorgt voor efficiënte opvang van het getagde eiwit op een chitin-kolom. Na activatie van de inteïne kan het gezuiverde eiwit selectief worden geëlueerd. Het voordeel hiervan is een lage achtergrondbinding aan de chitin, wat minder zuiveringsstappen vereist voor toepassingen zoals kristalografie of therapeutica. In tegenstelling tot een His-tag, blijft het eiwit na zuivering met het inteïn-CBD-systeem meestal tag-vrij [22](#page=22) [23](#page=23) [9](#page=9). ### 1.4.3 Myc tag De Myc tag is gebaseerd op het EQKLISEEDL epitope, waarvoor c-myc antilichamen beschikbaar zijn. Elutie kan plaatsvinden door competitie met een peptide, veranderingen in pH, of denaturatie met middelen zoals ureum of guanidine. Denaturerende elutie kan de opbrengst van het eiwit verminderen door de noodzaak van refolding, maar kan nuttig zijn voor kwantificering van expressie op kleine schaal [25](#page=25). ### 1.4.4 Tag verwijdering met endopeptidasen Voor het verwijderen van tags worden vaak endopeptidasen gebruikt. Veelgebruikte proteasen zijn Factor Xa, TEV protease en SUMO [26](#page=26) [27](#page=27) [29](#page=29). * **Factor Xa:** Is een serine protease betrokken bij bloedstolling. Het herkent de sequentie LVPR↓GS, maar is enigszins promiscu [26](#page=26). * **TEV protease:** Is een specifieke cysteïne protease die de sequentie ENLYFQ↓G herkent. Vaak wordt de tag aan de N-terminus geplaatst en het eiwit van interesse aan de C-terminus, waardoor na behandeling met TEV een enkele glycine aan de N-terminus van het eiwit achterblijft [27](#page=27) [28](#page=28). * **SUMO:** (Small ubiquitin-like modifier) is een fusiedomein dat de oplosbaarheid kan verbeteren en efficiënte expressie van peptiden en eiwitten kan ondersteunen. SUMO-protease is zeer specifiek en cleavet zonder linker, wat resulteert in het behoud van de oorspronkelijke eiwitsequentie. SUMO is efficiënter dan TEV, werkt bij lagere concentraties en lagere temperaturen, en kan de expressie van heterologe eiwitten verbeteren [29](#page=29) [31](#page=31). Bij het ontwerpen van constructies met proteolytische klieving is het belangrijk om te overwegen of er een linker nodig is en hoe deze de finale eiwitsequentie beïnvloedt [30](#page=30) [31](#page=31). ### 1.4.5 Tags voor functionaliteit buiten zuivering Sommige tags zijn ontworpen voor functies die verder gaan dan alleen zuivering [19](#page=19). * **Sortase-gemedieerde ligatie:** Sortase A is een transpeptidase die peptidebindingen kan vormen. Het vereist een LPXTG-motief op het "doelwit" en minimaal twee glycines op de "payload". Dit maakt het mogelijk om specifieke fusies te creëren, inclusief de aanhechting van niet-peptidische moleculen of de cyclisering van eiwitten. Het kan ook worden gebruikt voor site-specifieke labellering [33](#page=33) [34](#page=34) [37](#page=37). * **In vivo biotinylering (AviTag):** Het *E. coli* biotin ligase (BirA) kan selectief een korte peptide-sequentie (AviTag) labelen met biotine. Dit proces is site-specifiek en werkt in eukaryoten, prokaryoten en in vivo. Biotinylering is nuttig voor diagnostiek en screeningplatforms, omdat het de variabiliteit van chemische synthese minimaliseert [37](#page=37) [38](#page=38). * **AlbudAbs:** Dit zijn kleine antilichaamfragmenten (ongeveer 12 kDa) die een hoge affiniteit hebben voor humaan serum albumine (HSA). Ze binden aan een regio van HSA die niet gemoduleerd wordt door endogene liganden, waardoor ze de farmacokinetiek van biotherapeutica verlengen zonder de natuurlijke functie van HSA te belemmeren. Dit resulteert in een significant hogere serum halfwaardetijd vergeleken met ongemodificeerde eiwitten [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41). * **XTEN:** Dit is een ~864 aminozuur lang, ongestructureerd, semi-rationeel eiwit dat wordt gebruikt om de halfwaardetijd van biotherapeutica te verlengen. XTEN werkt door het eiwit een grotere structuur te geven, wat leidt tot een langzamere renale klaring. De lengte van de XTEN-tag kan worden aangepast om de gewenste halfwaardetijd te bereiken. Het toevoegen van een XTEN-tag kan echter de fysisch-chemische eigenschappen van het eiwit beïnvloeden, zoals de iso-elektrische punt (pI) en de grootte, wat gevolgen kan hebben voor de zuiveringsprocessen [42](#page=42) [43](#page=43). --- # Antilichamen: generatie en derivaten Dit gedeelte behandelt de methoden voor het genereren van antilichamen, inclusief immunisatie en het stabiliseren van de productie middels hybridoma's, alsook de verschillende antilichaamderivaten en hun productiemethoden [2](#page=2). ### 2.1 Generatie van antilichamen Antilichamen worden gegenereerd door B-cellen, waarbij elke antilichaam-producerende B-cel een uniek antilichaam produceert als resultaat van V(D)J recombinatie. De variabiliteit wordt bereikt door de combinatie van verschillende V (variabele), D (diversity) en J (joining) gen-segmenten, wat kan leiden tot meer dan $10^{10}$ mogelijke antilichaamvarianten [46](#page=46). #### 2.1.1 Immunisatie Immunisatie is het proces waarbij een dier wordt blootgesteld aan een antigeen met als doel een sterke immuunrespons op te wekken [47](#page=47). * **Dieren:** Veelgebruikte dieren voor immunisatie zijn konijnen, muizen, geiten en paarden [47](#page=47). * **Antigeen:** Dit kan variëren van cellulaire componenten, eiwitten tot nucleïna. * **Adjuvans:** Een stof die de immunogeniciteit van het antigeen niet-specifiek versterkt. Adjuvantia, zoals Complete Freund's Adjuvant (met mineralenolie voor langzame afgifte van antigeen en geïnactiveerde *M. tuberculosis* deeltjes om ontsteking te induceren), helpen het immuunsysteem te activeren en de afgifte van antigeen te verlengen, waardoor minder antigeen nodig is en kosten worden verlaagd [47](#page=47). * **Kwaliteit van antigeen:** De kwaliteit, zuiverheid en biologische activiteit van het antigeen zijn cruciaal. Een ‘vuil’ antigeen kan leiden tot een respons tegen contaminanten in plaats van tegen het gewenste antigeen [47](#page=47). * **Epitopie beschikbaarheid:** Bij immunisatie met een volledig gevouwen eiwit zijn niet alle aminozuren even toegankelijk. De eiwitkern is doorgaans niet toegankelijk, wat de kans op antilichamen tegen deze sequenties verkleint. Bij immunisatie met een gedenatureerd eiwit zijn alle sequenties toegankelijk, wat kan leiden tot een antilichaam dat alleen werkt tegen het gedenatureerde eiwit, wat minder nuttig is voor therapeutische toepassingen [47](#page=47). Een typisch protocol voor antilichaamgeneratie in muizen omvat de volgende stappen [48](#page=48): * Dag 1: Antigeen + adjuvans * Dag 10-15: Antigeen + adjuvans * Dag 20-30: Alleen antigeen * Dag 30-40: Testen van serum op activiteit * Dag 50-60: Finale ‘boost’ met alleen antigeen * Dag 55-65: Isoleren van de milt > **Tip:** Het genereren van antilichamen door immunisatie is een stochastisch proces; er is geen garantie dat twee dieren hetzelfde antilichaam zullen produceren. Bovendien genereren de meeste modelorganismen slechts kleine hoeveelheden antilichamen die niet volstaan voor therapie [49](#page=49). #### 2.1.2 Stabilisatie van antilichaamproductie: Hybridoma's Primaire cellen (zoals B-cellen) hebben een beperkte levensduur in cultuur en senescen (stoppen met delen) na 20-40 replicaties. Om een continue productie van specifieke antilichamen te garanderen, worden B-cellen gefuseerd met myeloomcellen om **hybridoma's** te vormen [51](#page=51). * **Cel fusie:** Polyethyleenglycol (PEG) faciliteert de cel fusie tussen B-cellen en myeloomcellen (bijvoorbeeld Sp2/0-Ag14) [51](#page=51). * **Selectie:** De gevormde hybridoma's worden geselecteerd met behulp van specifieke media. * **HAT-medium (Hypoxanthine + Aminopterine + Thymidine):** Aminopterine remt de *de novo* synthese van purine en pyrimidine nucleotiden en doodt hierdoor de myeloomcellen die geen salvage pathway hebben voor DNA-synthese (#page=51, 52) [51](#page=51) [52](#page=52). * **Hypoxanthine en Thymidine:** Deze fungeren als substraten voor de salvage pathway, die door zowel B-cellen als hybridoma's wordt gebruikt (#page=51, 52) [51](#page=51) [52](#page=52). * **Resultaat:** Alleen de immortale hybridoma's, die de genetische informatie van zowel de B-cel als de myeloomcel hebben geërfd en de salvage pathway kunnen gebruiken, overleven. De niet-immortaliseerbare B-cellen sterven vanzelf af in cultuur (#page=51, 52) [51](#page=51) [52](#page=52). De resulterende hybridoma's zijn stabiel en secreteren IgG-antilichamen. De antilichamen worden geoogst uit het kweek supernatant en geëvalueerd middels diverse biFysische methoden zoals flowcytometrie, immunohistologie, cytotoxiciteitstesten, ELISA en Surface Plasmon Resonance (SPR) [51](#page=51) [52](#page=52). #### 2.1.3 Productie en opslag van hybridoma's * **Productie:** De productie van antilichamen uit hybridoma's kan opgeschaald worden door serieuze cultuuramplificatie. Dit proces is echter complexer dan bij bacteriële culturen vanwege de fragiliteit van zoogdiercellen. Kweekcondities, zoals de behoefte aan complexe media, stabiele temperatuur, zuurstofvoorziening en soms een hechtingsondersteuning, maken het ontwerp van bioreactoren uitdagend. Mammaliaanse cellen groeien langzaam en zijn vatbaar voor contaminatie [54](#page=54). * **Opslag:** Hybridoma-cellen worden opgeslagen door ze te resuspenderen in vers medium met Fetal Calf Serum (FCS) voor optimale groeiomstandigheden, een cryoprotectant (zoals DMSO of glycerol) toe te voegen, en de cultuur vervolgens langzaam af te koelen naar -80°C voordat ze voor langdurige opslag in vloeibare stikstof worden geplaatst [53](#page=53). > **Tip:** Hoewel hybridoma's op schaal werken, hebben ze beperkingen: ze zijn langzamer en duurder in onderhoud, en er is variabiliteit in de opbrengst tussen verschillende antilichamen/hybridoma-cellen [55](#page=55). ### 2.2 Antilichaamderivaten Antilichaamderivaten zijn gemodificeerde vormen van antilichamen die zijn ontworpen om specifieke eigenschappen te verbeteren, zoals halfwaardetijd, stabiliteit of functionaliteit. #### 2.2.1 Derivaten ter verlenging van de halfwaardetijd Verschillende tags en structuren kunnen worden toegevoegd om de halfwaardetijd van een antilichaam in serum te verlengen, wat resulteert in een langere werkzaamheid en potentieel lagere doseringsfrequentie. * **AlbudAbs:** Dit zijn antilichamen tegen menselijk serumalbumine (HSA) die een ongeveer 12 kDa domein vormen. Ze binden aan een deel van HSA dat niet gemoduleerd wordt door endogene liganden, waardoor ze de halfwaardetijd van een biotherapeuticum in serum verhogen (#page=39, 40). Het voordeel van AlbudAbs is dat ze de natuurlijke functie van HSA behouden en dat de natuurlijke liganden niet concurreren voor binding. HSA-fusies kunnen minder stabiel zijn, mogelijk door interferentie met de HSA-functie [39](#page=39) [40](#page=40). * **XTEN:** Dit is een ~864 aminozuur lang ‘semi-rationeel’ ongestructureerd eiwit, bestaande uit repetitieve 36-meren met een specifieke samenstelling (8% A, 12% E, 18% G, 17% P, 28% S en 17% T). XTEN verlengt de plasma halfwaardetijd significant (bijvoorbeeld 12-voudig voor GFP, >53-voudig voor glucagon) op een manier die lengte-afhankelijk is en overdraagbaar is naar verschillende soorten. XTEN omzeilt interactie met albumine en verhoogt de halfwaardetijd door de grootte van de tag zelf, wat ook de renale klaring vertraagt (#page=42, 43). Het toevoegen van XTEN kan echter impact hebben op de upstream en downstream processen, zoals de pI en grootte van het eiwit, wat de zuivering kan beïnvloeden [42](#page=42) [43](#page=43). > **Tip:** Zowel AlbudAbs als XTEN zijn effectief voor het verlengen van de halfwaardetijd. AlbudAbs doen dit door binding aan albumine, terwijl XTEN dit doet door een grotere structuur aan het eiwit te geven [42](#page=42). #### 2.2.2 Derivaten voor specifieke modificatie en detectie * **Sortase-gemedieerde ligatie:** Dit is een enzymatische methode die het mogelijk maakt om een label op een eiwit aan te brengen op een sequentie-specifieke manier. De applicatie is vergelijkbaar met die van AviTag [37](#page=37). * **In vivo biotinylering (AviTag):** De AviTag is een korte, specifieke peptide-sequentie die herkend wordt door *E. coli* biotin ligase (BirA). BirA brengt selectief een biotine aan op een lysine-residu van het eiwit met bijna 100% efficiëntie. In tegenstelling tot chemische biotinylering, die minder selectief is en diverse reactieplaatsen kan targeten, biedt AviTag site-specifieke labelling en minimaliseert variabiliteit (#page=37, 38). Dit is voordelig voor diagnostica en screeningsplatforms. De zuivering en detectie maken gebruik van de sterke interactie tussen biotine en avidine-achtige eiwitten [37](#page=37) [38](#page=38). #### 2.2.3 Chimerische en gehumaniseerde antilichamen Deze derivaten worden gecreëerd door genetische engineering om de immunogeniciteit in mensen te verminderen. * **Chimerische antilichamen:** Hierbij worden de variabele domeinen van een antilichaam van een niet-menselijk dier (bv. muis) gecombineerd met de constante domeinen van een humaan antilichaam (#page=50, 58) [50](#page=50) [58](#page=58). * **Gehumaniseerde antilichamen:** Bij deze techniek worden alleen de complementaire Determinerende Regio's (CDR's), die de antigenbindende loops vormen, van een muizenantilichaam in het menselijke antilichaamframework geplaatst (#page=50, 59). De resterende delen van het antilichaam komen uit menselijke genen (#page=50, 59). Dit wordt bereikt door de DNA-sequenties van de CDR-loops van het muizenantilichaam te klonen in een humaan IgG-gen [50](#page=50) [59](#page=59). > **Tip:** De nomenclatuur voor chimerische en gehumaniseerde antilichamen is gebaseerd op de mate waarin het antilichaam is ‘gehumaniseerd’ [50](#page=50). #### 2.2.4 Andere antilichaamderivaten * **Nanobodies:** Dit zijn VhH domeinen uit kameelachtigen of VNAR domeinen uit haaien. Ze kunnen in bacteriële systemen geproduceerd worden (#page=51, 61, 62). Glycosylering is afhankelijk van het productiemodel en de sequenties [51](#page=51) [61](#page=61) [62](#page=62). * **Bicyclische peptiden:** Dit zijn peptiden die aan een chemische kern zijn gebonden, waardoor ze lussen vormen die geschikt zijn voor antigenbinding. De cysteïnes in de peptideketen fungeren als ankerpunten rond een hydrofobe kern (#page=51, 60, 61). De chemische kern kan worden gedeviatiseerd met toxines of andere functionaliteiten, waarbij de peptide zorgt voor de targeting [51](#page=51) [60](#page=60) [61](#page=61). * **Diabodies:** Dit zijn dubbele scFv (single-chain variable fragment) met linkers die de voorkeur geven aan een dimeer conformati [61](#page=61). #### 2.2.5 Antilichamen als farmaceutica Antilichamen (IgG's) zijn grote, complexe en heterogene moleculen bestaande uit vier peptiden die verbonden zijn door cysteïnebruggen (#page=57, 58). Ze hebben diverse glycosyleringstoestanden en functionele domeinen. Antilichamen zijn instabiel en gevoelig voor aggregatie, misvorming, degradatie en immunogeniciteit, wat ze extreem gevoelig maakt voor procesveranderingen [57](#page=57) [58](#page=58). **Zuivering:** Eiwitten zoals Proteïne A (uit *Staphylococcus*) en Proteïne G (uit *Streptococcus*) binden specifiek aan de Fc-regio van IgG, wat gebruikt kan worden voor zuivering. Elutie gebeurt door verandering van zoutconcentratie en pH [56](#page=56). **Productie van antilichamen:** * **Bicylces:** Chemische productie [62](#page=62). * **Nanobodies:** Bacteriële productie [62](#page=62). * **IgG:** Hybridoma's of CHO-cellen [62](#page=62). --- # Affiniteitsbepaling en massawerking modellen Dit thema behandelt de principes van affiniteitsbepaling met technieken zoals ELISA, BioLayer Interferometry (BLI) en Surface Plasmon Resonance (SPR), alsook het wiskundig beschrijven van moleculaire interacties via massawerking modellen. ### 3.1 Methoden voor affiniteitsbepaling Affiniteitsbepaling is cruciaal voor het begrijpen van moleculaire interacties, met name tussen antilichamen en hun doelwitten. Diverse technieken worden ingezet om deze interacties te kwantificeren en te karakteriseren [63](#page=63). #### 3.1.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA is een veelgebruikte assay in de biotechnologie die berust op het creëren van een koppeling tussen een oppervlak en een detectiemiddel via specifieke bindingsinteracties. Enzymen die aan het detectiemiddel zijn gekoppeld, versterken het signaal door middel van meerdere omzettingen (turnover). Gangbare enzymen in ELISA zijn Horseradish peroxidase (HRP), Alkaline phosphatase (AP) en luciferase [71](#page=71). De kernprincipes van ELISA omvatten: * **Discrimineren van specifiek en niet-specifiek binden:** Dit is essentieel voor betrouwbare resultaten [72](#page=72). * **Gebruik van blokkerende agentia:** Specifieke, maar niet-relevante targets, zoals caseïne of detergentia, worden gebruikt om niet-specifieke bindingsplaatsen op het oppervlak (bv. de plaat) te maskeren en om te concurreren in niet-specifieke interacties [72](#page=72). * **Afhankelijkheid van affiniteit en concentratie:** De assay werkt optimaal wanneer antilichamen specifiek en met hoge affiniteit binden. Zowel de concentratie van het antilichaam als de tijdsduur van de incubatie zijn significante factoren [73](#page=73). * **Achtergrondsignaal:** Een achtergrondsignaal, afkomstig van niet-specifieke binding, is een veelvoorkomende technische uitdaging [73](#page=73). * **Doel:** Het creëren van een experimentele topologie die het oppervlak verbindt met het signaalgenererende enzym [73](#page=73). Het principe van "multiple turnover" bij enzymen in ELISA betekent dat één enzymmolecuul duizenden keren een reactie kan katalyseren, wat resulteert in een sterk versterkt detectiesignaal en een zeer gevoelige assay [71](#page=71). > **Tip:** De optimale eiwitconcentratie voor binding is cruciaal. Te lage concentraties leiden tot onvoldoende binding, terwijl te hoge concentraties de specificiteit kunnen verminderen en de discriminatie bemoeilijken [70](#page=70) [73](#page=73). #### 3.1.2 BioLayer Interferometry (BLI) BioLayer Interferometry (BLI) is een biofysische methode die veranderingen in de optische dikte van een biolayer meet als gevolg van moleculaire interacties [74](#page=74) [78](#page=78). * **Werkingsprincipe:** Een vezeltip wordt voorzien van een speciale optische laag, waarop een capture molecuul (ligand) wordt bevestigd. Wanneer deze tip in een monster wordt gedipt dat het doelmolecuul (analyte) bevat, bindt de analyte aan de ligand. Deze binding verandert de dikte van de biolayer. Witte licht wordt door de vezel gestuurd; twee stralen worden gereflecteerd: één van de tip (referentie) en één van de moleculaire laag. Het interferentiepatroon van deze twee stralen wordt gemeten [74](#page=74) [75](#page=75) [78](#page=78). * **Meetbare grootheden:** De fase van de interferentie is een functie van de moleculaire laagdikten, wat direct verband houdt met het aantal gebonden moleculen op de tip. Veranderingen in de afstand tussen de reflecterende oppervlakken (die gerelateerd is aan de dikte van de moleculaire laag) veranderen het interferentiepatroon. Deze veranderingen kunnen worden gemonitord in de tijd om kinetische data te verkrijgen over moleculaire interacties [74](#page=74) [75](#page=75) [79](#page=79). * **Kinetische en affiniteitsbepaling:** BLI kan associatie- en dissociatiesnelheden meten, waaruit de affiniteit kan worden afgeleid. In een simpel 1:1 bindingsmodel worden de associatie- en dissociatiefasen beschreven door exponentiële functies [76](#page=76) [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82). * **Associatie (Association):** In het begin domineert de associatie de sensorgram. De associatiesnelheidsconstante ($k_a$) beschrijft de snelheid van complexvorming en heeft typische waarden van $10^3$ tot $10^7$ M$^{-1}$s$^{-1}$ [81](#page=81) [83](#page=83). * **Evenwicht (Equilibrium):** Uiteindelijk wordt een evenwicht bereikt waarbij de associatie- en dissociatiesnelheden gelijk zijn [82](#page=82) [83](#page=83). * **Dissociatie (Dissociation):** Wanneer de analyte niet langer aanwezig is, treedt dissociatie op als een exponentiële afbraak over tijd. De dissociatiesnelheidsconstante ($k_d$) beschrijft de fractie van complexen die per seconde vervalt en heeft typische waarden van $10^{-2}$ tot $10^{-5}$ s$^{-1}$ [83](#page=83). * **Affiniteit (KD):** De affiniteit, uitgedrukt als de dissociatieconstante ($K_D$), is de verhouding van $k_d$ tot $k_a$ ($K_D = k_d/k_a$). Een lagere $K_D$ duidt op een hogere affiniteit [83](#page=83). * **Voordelen:** BLI kan interacties in complexe mengsels meten, wat een voordeel is ten opzichte van SPR. Het meet verschuivingen in lengte, wat het geschikt maakt voor analytes met een laag moleculair gewicht [85](#page=85). > **Tip:** De x-as van een sensogram in BLI vertegenwoordigt tijd. De respons op de y-as geeft de verandering in de dikte van de biolayer weer als gevolg van binding [64](#page=64) [80](#page=80). #### 3.1.3 Surface Plasmon Resonance (SPR) Surface Plasmon Resonance (SPR) is een andere biofysische techniek die wordt beschouwd als de industriële gouden standaard voor het meten van intermoleculaire interacties [84](#page=84) [85](#page=85). * **Werkingsprincipe:** SPR maakt gebruik van het principe van oppervlakteplasmonresonantie, een fenomeen dat optreedt bij de interactie van goud met licht. Bij een dunne goudfilm wordt een elektronresonantie-effect geïnduceerd afhankelijk van de invalshoek van het licht. De aanwezigheid van moleculen (liganden) aan de andere kant van de film verandert de hoek waarbij resonantie optreedt, wat gedetecteerd wordt [84](#page=84). * **Beperkingen:** In tegenstelling tot BLI, dat lengteveranderingen meet, is SPR beperkt door de massa van de analyte. Dit betekent dat SPR beter werkt voor grotere analytes, omdat deze grotere massaverschillen veroorzaken nabij de goudfilm, wat resulteert in hogere detectiesignalen. SPR vereist stabiele buffers en gezuiverd materiaal, terwijl BLI enigszins complexere oplossingen aankan [84](#page=84) [85](#page=85). > **Tip:** Hoewel SPR de gouden standaard is, heeft BLI voordelen op het gebied van kosten, complexiteit en snelheid [84](#page=84). ### 3.2 Massawerking modellen Massawerking modellen bieden een wiskundige beschrijving van moleculaire interacties en zijn fundamenteel in diverse wetenschappelijke velden [64](#page=64). #### 3.2.1 Principe van Massawerking Het massawerkingmodel stelt dat de snelheid van een chemische reactie evenredig is met de concentraties van de reagerende stoffen [64](#page=64) [66](#page=66). Voor een reversibele reactie waarbij stof A en stof B complex AB vormen met snelheidsconstanten $k_1$ (associatie) en $k_{-1}$ (dissociatie), geldt de volgende differentiaalvergelijking voor de verandering in de concentratie van het complex AB over tijd ($t$): $$ \frac{d[AB]}{dt} = k_1 [A][B - k_{-1} [AB $$ [64](#page=64) [80](#page=80). #### 3.2.2 Michaelis-Menten Systeem Een variant van het massawerkingmodel is het Michaelis-Menten systeem, dat vaak wordt toegepast in de enzymologie. Hierbij reageert een enzym (E) met een substraat (S) om een enzym-substraatcomplex (ES) te vormen, dat vervolgens kan terugvallen naar E en S, of kan reageren om een product (P) en het vrije enzym te vormen. $$ E + S \xrightleftharpoons[k_{-1}]{k_1} ES \xrightarrow{k_2} E + P $$ [64](#page=64). De verandering in de concentratie van het ES-complex wordt beschreven door: $$ \frac{d[ES]}{dt} = k_1 [E][S - k_{-1} [ES - k_2 [ES $$ [64](#page=64). Hierbij is $[E]_0$ de totale initiële enzymconcentratie, dus $[E]_0 = [E + [ES]$ [64](#page=64). Door de steady-state aanname te hanteren, waarbij $d[ES]/dt = 0$, kan de concentratie van het ES-complex worden uitgedrukt in termen van de initiële concentraties en de snelheidsconstanten. Dit leidt tot de bekende Michaelis-Menten vergelijking voor de productvormingssnelheid [64](#page=64): $$ \frac{d[P]}{dt} = \frac{v_{max}[S]}{S + K_M} $$ waarbij $v_{max} = k_2 [E]_0$ en $K_M = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}$. $K_M$ vertegenwoordigt de Michaelis-constante [64](#page=64). #### 3.2.3 Massawerking voor Binding Voor een simpele 1:1 bindingsinteractie tussen een proteïne (P) en een target (T) om een complex (PT) te vormen: $$ P + T \xrightleftharpoons[k_{-1}]{k_1} PT $$ [66](#page=66) [67](#page=67) [69](#page=69). De verandering in de concentratie van het PT-complex over tijd is: $$ \frac{d[PT]}{dt} = k_1 [P][T - k_{-1} [PT $$ [66](#page=66) [67](#page=67) [69](#page=69). Bij evenwicht, wanneer $d[PT]/dt = 0$, geldt: $$ \frac{k_{-1}}{k_1} = \frac{[P][T]}{[PT]} = K_D $$ [67](#page=67) [69](#page=69). Hier is $K_D$ de dissociatieconstante, die de affiniteit van de interactie weergeeft [83](#page=83). Fractionele binding ($\theta$) kan worden gedefinieerd als de fractie van het target die gebonden is aan het proteïne: $$ \theta = \frac{[PT]}{[T]_0} = \frac{[PT]}{[T + [PT]} $$ [67](#page=67). Door substitutie en herschikking kan dit worden uitgedrukt als: $$ \theta = \frac{[P]}{K_D + [P]} $$ [67](#page=67) [69](#page=69) [70](#page=70). #### 3.2.4 Kinetiek en Affiniteit uit Massawerking * **Tijdaspect van binding:** Binding is geen instant proces; het duurt tijd om evenwicht te bereiken. Dit tijdsverloop is zichtbaar in sensogrammen van technieken zoals BLI [69](#page=69). * **Verhouding tussen affiniteit en interactiesnelheden:** Twee liganden kunnen dezelfde affiniteit hebben, maar sterk verschillende associatie- en dissociatiesnelheden vertonen. Een lagere dissociatiesnelheid ($k_d$) leidt tot een hogere affiniteit *alleen* als de associatiesnelheid ($k_a$) gelijk is [68](#page=68) [69](#page=69). * **Verhoging van affiniteit:** Affiniteit kan worden verhoogd door hogere associatiesnelheden (sneller binden) en/of lagere dissociatiesnelheden (langzamer loskomen) [69](#page=69). * **Specificiteit:** Specificiteit ontstaat binnen een bepaald concentratiebereik waarbij de fractionele binding voor het doelwit significant verschilt van die voor off-targets. Bij zeer hoge concentraties kan een proteïne echter aan meer moleculen binden dan alleen zijn specifieke doelwit, zelfs als de inherente specificiteit en affiniteit behouden blijven [69](#page=69) [70](#page=70). #### 3.2.5 Beperkingen van Massawerking Modellen Massawerking modellen hebben inherente beperkingen: * **Homogeniteitsaannames:** Ze gaan ervan uit dat er geen tijd verstrijkt voor binding of diffusie, en dat er geen barrières zijn voor interactie [66](#page=66). * **Continue aard:** De modellen zijn continu, wat wiskundig betekent dat theoretisch zeer lage concentraties (bv. attomolair) kunnen worden bereikt. Biologische systemen zijn echter discreet en gebaseerd op populatiegedrag dat voortkomt uit stochasticiteit [66](#page=66). Deze beperkingen impliceren dat hoewel massawerking modellen een krachtig raamwerk bieden voor het begrijpen van moleculaire interacties, hun toepassing in de praktijk rekening moet houden met de discretie en complexiteit van biologische systemen [66](#page=66). --- # Flowcytometrie en enzymatische reacties Dit onderdeel bespreekt de principes van flowcytometrie voor data-analyse en de detectie van biologische deeltjes, evenals het gebruik van enzymen in assays en de expressie van actieve enzymen op celoppervlakken. ### 4.1 Flowcytometrie Flowcytometrie is een techniek die wordt gebruikt voor het detecteren en analyseren van biologische deeltjes, zoals cellen, terwijl ze door een lichtbron stromen. De kracht van deze methodologie ligt in de combinatie van verschillende aspecten [87](#page=87) [88](#page=88). #### 4.1.1 Basisprincipe #### 4.1.1.1 Principe van werking Het monster stroomt door een lichtbron, wat afhangt van het machinespecifieke vloeistofsysteem. Bij flowcytometrie is dit doorgaans een laminair stromingspatroon, terwijl bij FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) deeltjes in druppels worden verwerkt. Veranderingen in de lichtintensiteit door interactie met de stromende deeltjes genereren data. Elk datapunt is een computationeel geïntegreerde detectiegebeurtenis [87](#page=87). #### 4.1.1.2 Detectieparameters De detectie in flowcytometrie omvat verschillende aspecten: * **Forward scattering (FSC):** Dit geeft inzicht in de grootte van de deeltjes. FSC meet de mate van lichtverstrooiing naar voren, die correleert met de grootte van het deeltje [88](#page=88) [91](#page=91). * **Side scattering (SSC):** Dit geeft inzicht in de complexiteit of interne structuur van de deeltjes. SSC meet de lichtverstrooiing loodrecht op de lichtstraal, wat gevoelig is voor de interne structuur van de cel [88](#page=88). * **Fluorescentiekanalen:** Dit maakt het mogelijk om specifieke moleculen te detecteren met behulp van fluorescerende labels. Flowcytometers zijn ontworpen om meerdere fluorescentiesignalen van een enkele laser te isoleren met behulp van filters en dichroïsche spiegels die golflengtebereiken naar specifieke detectoren richten [88](#page=88). > **Tip:** Fluorescentie maakt het mogelijk om metingen in flowcytometrie te parallelliseren door gebruik te maken van reagentia die fluorescentie in specifieke kanalen geven, zoals DAPI voor blauwe fluorescentie, of fluorescerende eiwitten [88](#page=88). #### 4.1.2 Analyse van flowcytometriegegevens De analyse van flowcytometriegegevens omvat het selecteren van relevante data via gating en de visualisatie van de resultaten [89](#page=89). #### 4.1.2.1 Gating Gating is het proces van het selecteren van de relevante data voor analyse. Dit is cruciaal omdat een flowcytometer alle deeltjes meet, inclusief celaggregaten, dode cellen en celdebris, evenals elektronische ruis. Het doel van gating is om filters op het signaal toe te passen om de relevante data te selecteren [89](#page=89). Er zijn verschillende benaderingen voor gating: * **"Live" gating:** Dit wordt uitgevoerd tijdens de acquisitie om de kwaliteit van de data te maximaliseren. Hierbij worden deeltjes geselecteerd die voldoen aan vooraf gedefinieerde criteria, zodat de machine stopt met verzamelen zodra een bepaald aantal relevante gebeurtenissen is bereikt. Een typisch voorbeeld is het isoleren van enkele deeltjes met behulp van FSC en SSC, of het isoleren van cel-grote deeltjes met behulp van fluorescentie en FSC [89](#page=89) [90](#page=90). * **"Ad hoc" gating:** Dit wordt uitgevoerd tijdens de analyse van de data. Hierbij kunnen de gates worden aangepast op basis van nieuwe inzichten of waargenomen populaties die niet eerder waren voorzien. Bij ad hoc gating wordt echter het aantal beschikbare data-events beperkt door het aantal oorspronkelijk verzamelde events [89](#page=89) [90](#page=90). * **Forward en backward gating:** Deze termen beschrijven de richting van de gate ten opzichte van de data [90](#page=90). * **Forward gating:** Een subset van de data wordt geïsoleerd voordat de analyse wordt uitgevoerd [90](#page=90). * **Backward gating:** Gates worden ingesteld na de dataverzameling, waarbij waargenomen data worden verwijderd om de datakwaliteit te verbeteren. Dit is nuttig wanneer tijdens de analyse verschillen worden opgemerkt die de initiële gates niet hadden voorzien [92](#page=92). > **Tip:** De beste praktijk is om de gatingstrategie a priori te definiëren [92](#page=92). #### 4.1.2.2 Visualisatie De resultaten van flowcytometrie worden meestal gevisualiseerd met behulp van histogrammen en dot plots [92](#page=92). * **Histogrammen:** Tonen de distributie van één enkele variabele [90](#page=90). * **Dot plots:** Tonen de relatie tussen twee variabelen, waarbij elke stip een meting vertegenwoordigt [90](#page=90). #### 4.1.2.3 Data-analyse De analyse van de data is meestal gebaseerd op Gaussiaanse verdelingen [92](#page=92). > **Voorbeeld:** FITC (fluorescein isothiocyanaat) is een veelgebruikte fluorofoor die door de blauwe laser (488 nm) wordt geëxciteerd en gedetecteerd wordt met een groen filter (512/20 nm) [90](#page=90). ### 4.2 Enzymatische reacties in assays Enzymen spelen een cruciale rol in verschillende biologische assays, met name in ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). De functionele principes van enzymen, zoals hun activiteit op celoppervlakken, kunnen worden onderzocht [72](#page=72) [93](#page=93). #### 4.2.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ELISA is een veelgebruikte techniek om specifieke moleculen, zoals eiwitten, te detecteren en te kwantificeren [72](#page=72). ##### 4.2.1.1 Basisprincipe Alle varianten van ELISA werken op het principe van het discrimineren van specifieke van niet-specifieke binding [72](#page=72). * **Specifieke binding:** Het assay is gebaseerd op het vermogen van antilichamen om specifiek en met hoge affiniteit te binden aan hun doelwit [73](#page=73). * **Niet-specifieke binding:** Specifieke, maar niet-relevante doelwitten worden vaak gebruikt als blokkerende agentia (bijvoorbeeld caseïne, detergentia) om niet-specifieke bindingsplaatsen te maskeren of om te concurreren in niet-specifieke interacties [72](#page=72). * **Oppervlakte:** Een oppervlak (vaak een plaat) wordt gebruikt om immobilisatie mogelijk te maken [72](#page=72). * **Detector molecuul:** Een enzym wordt gekoppeld aan een detectiemolecuul (meestal een antilichaam) dat, na binding aan het doelwit, een detecteerbaar signaal genereert [72](#page=72). ##### 4.2.1.2 Cruciale factoren * **Antilichaamconcentraties:** Deze zijn cruciaal voor het succes van de techniek [73](#page=73). * **Tijd:** De incubatietijd voor antilichaambinding en de spoeltijden zijn significant [73](#page=73). * **Achtergrond:** Een veelvoorkomende technische hindernis is de achtergrondsignaal die afkomstig is van niet-specifieke binding [73](#page=73). * **Experimentele topologie:** Het doel is om een experimentele opstelling te creëren die het oppervlak verbindt met het signaalgenererende enzym [73](#page=73). > **Tip:** Te lage of te hoge eiwitconcentraties kunnen leiden tot slechte discriminatie tussen specifieke en niet-specifieke signalen [73](#page=73). #### 4.2.2 Expressie van actieve enzymen op celoppervlakken Het is mogelijk om enzymen op celoppervlakken te expresseren en hun functionaliteit te testen [93](#page=93). * **Voorbeeld:** Bacteriële cellen die een DNA-bindend eiwit op hun oppervlak tot expressie brengen, kunnen de insertie van cholesterol-gelabelde DNA-oligo's in het celmembraan katalyseren. T4 DNA-ligase (T4DL) kan op het celoppervlak worden uitgedrukt. Een T4DL K159D-mutant kan DNA binden maar niet ligateren [93](#page=93). * Als een eiwit dat tot expressie wordt gebracht een enzym is, kan de functie ervan worden getest [93](#page=93). ### 4.3 Verwante technieken (ter context) Hoewel niet het primaire focuspunt, worden andere technieken ter vergelijking genoemd: #### 4.3.1 BioLayer Interferometry (BLI) BLI meet veranderingen in de dikte van een biolayer als gevolg van moleculaire interacties, gebaseerd op interferentie van lichtgolven [74](#page=74). * **Principe:** Een witte lichtstraal wordt door een vezeltip gestuurd die is gecoat met een optische laag en een capture-molecuul. Wanneer een doelmolecuul (analyte) bindt aan het capture-molecuul, verandert de dikte van de laag, wat resulteert in een verandering in het interferentiepatroon van het gereflecteerde licht [74](#page=74) [79](#page=79). * **Data:** De afstand tussen de twee reflecterende oppervlakken bepaalt het interferentiepatroon. Veranderingen in dit patroon over tijd geven kinetische data over moleculaire interacties [75](#page=75) [79](#page=79). * **Kinetiek en Affiniteit:** In een simpel 1:1 bindingsmodel worden de associatie- en dissociatie-fasen beschreven door exponentiële functies [80](#page=80). * De **associatiesnelheidsconstante** ($k_a$) beschrijft de snelheid van complexvorming en heeft eenheden van M$^{-1}$s$^{-1}$. Typische waarden liggen tussen $10^3$ en $10^7$ M$^{-1}$s$^{-1}$ [81](#page=81) [83](#page=83). * De **dissociatiesnelheidsconstante** ($k_d$) beschrijft de stabiliteit van het complex en heeft eenheden van s$^{-1}$. Typische waarden liggen tussen $10^{-2}$ en $10^{-5}$ s$^{-1}$ [83](#page=83). * De **affiniteitsconstante** ($K_D$) is de verhouding $k_d/k_a$ en is omgekeerd evenredig met de evenwichtsconstante, waarbij de snelheid van associatie gelijk is aan de snelheid van dissociatie [83](#page=83). * **Toepassing:** BLI kan worden gebruikt voor het bepalen van bindingskinetiek en affiniteit, en kan omgaan met complexere mengsels dan SPR [74](#page=74) [85](#page=85). #### 4.3.2 Surface Plasmon Resonance (SPR) SPR is een andere techniek die wordt gebruikt voor het bepalen van bindingsaffiniteit en wordt beschouwd als de huidige industriële gouden standaard [84](#page=84) [85](#page=85). * **Principe:** SPR maakt gebruik van het fysieke effect van hoe goud interageert met licht. Een dunne goudfilm wordt gebruikt om een elektronresonantie-effect te induceren afhankelijk van de invalshoek van het licht. De aanwezigheid van moleculen aan de ligandzijde van de goudfilm verandert de hoek die nodig is voor resonantie, wat wordt gedetecteerd [84](#page=84). * **Gevoeligheid:** SPR is gevoelig voor de massa van het analyte en vereist stabiele buffers en gezuiverd materiaal. Het werkt beter voor grotere analieten omdat deze grotere massa-veranderingen veroorzaken [84](#page=84) [85](#page=85). > **Tip:** Hoewel beide technieken kinetiek en affiniteit kunnen meten, heeft BLI voordelen op het gebied van kosten, complexiteit en snelheid, terwijl SPR gevoeliger is voor buffercompositie en massa-veranderingen [85](#page=85). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Proteïne tags | Genetisch gecodeerde fusie-domeinen die aan een eiwit van interesse (PoI) worden gekoppeld om specifieke eigenschappen te verlenen, zoals vereenvoudigde zuivering, lokalisatie, etikettering of verbeterde bioactiviteit. | | Linkers | Moleculaire sequenties, variërend van enkele aminozuren tot grotere domeinen, die worden gebruikt om componenten van een eiwitconstruct te scheiden. Ze beïnvloeden de oplosbaarheid, vouwing, expressie en bioactiviteit van het uiteindelijke eiwit. | | V(D)J recombinatie | Een genetisch proces dat plaatsvindt tijdens de ontwikkeling van B-cellen, waarbij gensegmenten worden geherarrangeerd om een grote diversiteit aan immuunglobuline (antilichaam) variabele domeinen te creëren. | | Immunisatie | Het proces waarbij een organisme wordt blootgesteld aan een antigeen met als doel een immuunrespons op te wekken, resulterend in de productie van antilichamen tegen dat antigeen. | | Adjuvans | Een substantie die wordt toegediend samen met een antigeen om de immuunrespons te versterken en te verlengen, waardoor een effectievere antilichaamproductie wordt gestimuleerd. | | Hybridoma | Een hybride cel, gevormd door de fusie van een tumorcel (myeloomcel) en een antilichaam-producerende B-cel. Hybridoma's zijn zowel immortaal als in staat om specifieke antilichamen te produceren. | | ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) | Een veelgebruikte biochemische test om de aanwezigheid van een specifiek antigeen of antilichaam in een monster te detecteren. Het maakt gebruik van enzymconjugaten om een detecteerbaar signaal te genereren, vaak via een kleurreductie- of emissiereactie. | | Massawerking model | Een wiskundige beschrijving van de snelheid van chemische reacties, gebaseerd op de concentraties van reactanten en de snelheidsconstanten. Het wordt gebruikt om de dynamiek van moleculaire interacties, zoals enzym-substraatbinding, te modelleren. | | BioLayer Interferometry (BLI) | Een optische detectietechniek die veranderingen in de dikte van een biolayer meet, veroorzaakt door moleculaire interacties. Het is een non-invasieve methode die kinetische data levert over associatie- en dissociatiesnelheden. | | Surface Plasmon Resonance (SPR) | Een optische techniek die de resonantie van plasmonen op een goudfilm detecteert, wat verandert wanneer moleculen aan het oppervlak binden. SPR is een gevoelige methode voor het bepalen van affiniteiten en interactiekinetiek, en wordt beschouwd als de gouden standaard in de industrie. | | Flowcytometrie | Een techniek die de fysische en chemische eigenschappen van individuele cellen of deeltjes in een vloeiende stroom analyseert. Door interactie met licht en detectie van verstrooiing en fluorescentie, kunnen cellen worden geïdentificeerd, gekwantificeerd en gesorteerd. | | Gating | Een proces binnen de flowcytometrie waarbij specifieke populaties van cellen of deeltjes worden geselecteerd voor verdere analyse op basis van hun fysische en fluorescente eigenschappen. Dit helpt bij het isoleren van de relevante data uit een complex monstersignaal. | | Post-translationele modificatie (PTM) | Chemische veranderingen aan een eiwit na de synthese op het ribosoom. Voorbeelden zijn glycosylering, fosforylering, acetylering en prenylering, die de functie, stabiliteit en lokalisatie van het eiwit kunnen beïnvloeden. | | Epitope | Het specifieke deel van een antigeen waaraan een antilichaam (of een ander specifiek bindend molecuul) bindt. De toegankelijkheid en structuur van het epitopen zijn cruciaal voor de antilichaamherkenning. | | Affinity tag | Een korte eiwitsequentie die aan een eiwit van interesse wordt gekoppeld om de zuivering te vergemakkelijken. Deze tags binden selectief aan specifieke moleculen (bv. metalen, kralen) waardoor het eiwit uit een complexe mix kan worden geïsoleerd. | | Inteïne | Een eiwitsegment dat zichzelf uit kan knippen uit een precursor-eiwit, wat resulteert in de vorming van een nieuw eiwit met de resterende domeinen verbonden. Het kan gebruikt worden voor een "scarless" eiwitzuivering. | | Chitin binding domain (CBD) | Een eiwitdomein dat specifieke affiniteit heeft voor chitine, een polymeer van N-acetylglucosamine. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met andere tags voor eiwitzuivering. | | His-tag (polyhistidine-tag) | Een reeks van histidine-residuen (meestal 6 of meer) die aan een eiwit worden toegevoegd om de zuivering te vereenvoudigen door chelatiatie met metaalionen (zoals nikkel of kobalt) op een harskolom. | | Myc tag | Een korte peptide-epitope (~10 aminozuren) afgeleid van het c-Myc eiwit, dat wordt herkend door specifieke antilichamen. Het wordt gebruikt voor zowel zuivering als detectie van eiwitten. | | Factor Xa | Een serineprotease die betrokken is bij bloedstolling. Het wordt in biotechnologie gebruikt om specifieke knipsequenties te herkennen en te splitsen, vaak om eiwittags te verwijderen. | | TEV protease | Een specifiek cysteïneprotease, afkomstig van het Tobacco Etch Virus (TEV). Het wordt gebruikt voor selectieve knipplaatsen in eiwitconstructies, vooral om tags te verwijderen na zuivering. | | SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) | Een kleine fusiedomein die de oplosbaarheid van eiwitten kan verbeteren en als tag kan dienen. SUMO-protease kan de SUMO-tag specifiek verwijderen. | | Sortase | Een enzym uit Staphylococcus aureus dat eiwitten verankert aan de celwand. Het kan worden gebruikt voor het creëren van peptidefusies, waarbij een targetpeptide wordt gekoppeld aan een payload, vaak met behulp van specifieke herkenningsmotieven. | | AviTag | Een korte, geselecteerde peptide-sequentie die door het E. coli biotine ligase (BirA) selectief wordt gemerkt met biotine. Dit maakt site-specifieke biotineylering mogelijk voor detectie of zuivering. | | AlbudAbs | Kleine, antilichaam-achtige moleculen (~12 kDa) die een hoge affiniteit hebben voor humaan serum albumine (HSA). Ze worden gebruikt om de halfwaardetijd van biotherapeutica in het serum te verlengen door binding aan HSA. | | XTEN | Een groot (~864 aminozuren), semi-rationeel ontworpen ongestructureerd eiwit dat kan worden gefuseerd met biotherapeutica om hun halfwaardetijd in het serum te vergroten, voornamelijk door een grotere structuur te bieden die de renale klaring vertraagt. | | Fab (Fragment antigen-binding) | Een deel van een antilichaam dat de antigeenbindende capaciteit bevat. Het bestaat uit een lichte keten en een deel van de zware keten (CH1 en VL). | | Fc (Fragment crystallizable) | Het constante deel van een antilichaam, dat belangrijke functies heeft zoals binding aan immuuncellen en complementactivatie. | | Fv (Fragment variable) | Het variabele deel van een antilichaam, dat bestaat uit de VH en VL domeinen en verantwoordelijk is voor de specificiteit van de antigeenbinding. | | Chimeer antilichaam | Een antilichaam dat is samengesteld uit genetisch gemanipuleerde delen van verschillende soorten, meestal met variabele domeinen van een dierlijk antilichaam en constante domeinen van een humaan antilichaam. | | Gehumaniseerd antilichaam | Een antilichaam waarbij de variabele domeinen grotendeels humaan zijn, met alleen de CDR-loops (Complementarity Determining Regions) die van een dierlijk antilichaam afkomstig zijn om de antigeenbinding te behouden. | | Bicyclisch peptide | Een klein peptide dat is verankerd aan een chemische kern, waardoor peptide-loops worden gevormd die kunnen worden gemanipuleerd voor antigeenbinding. Het kan gemodificeerd worden met toxines of andere functionaliteiten. | | Nanobody | Een klein antilichaamfragment, afgeleid van de zware keten van antilichamen bij kameelachtigen (VHH) of haaien (VNAR). Ze zijn vaak stabieler en beter oplosbaar dan traditionele antilichamen. | | Receptor | Een molecuul (meestal een eiwit) aan het oppervlak van een cel of in het cytoplasma dat een specifieke chemische signaalstof bindt en daardoor een cellulaire respons initieert. | | Kinetische data | Informatie over de snelheid van moleculaire interacties, waaronder associatie- en dissociatiesnelheden. Deze data helpen bij het begrijpen van de dynamiek van binding tussen moleculen. | | Dissociatieconstante ($K_d$) | Een maat voor de affiniteit van een complex, gedefinieerd als de concentratie waarbij de helft van de bindingsplaatsen bezet is. Een lagere $K_d$ duidt op een hogere affiniteit. | | Associatiesnelheidsconstante ($k_a$) | De snelheid waarmee moleculen binden om een complex te vormen. Uitgedrukt in eenheden van M$^{-1}$s$^{-1}$. | | Dissociatiesnelheidsconstante ($k_d$) | De snelheid waarmee een complex dissocieert in zijn componenten. Uitgedrukt in eenheden van s$^{-1}$. | | Werkelijkheidsgetrouwheid (Specificity) | Het vermogen van een molecuul om specifiek te binden aan zijn beoogde doelwit en niet aan andere moleculen. | | Driehoekig (Triangulation) | Een concept dat wordt toegepast bij de analyse van gegevens, waarbij meerdere datasets of metingen worden gecombineerd om een meer omvattend beeld te krijgen. | | Heterogeen | Bestaande uit verschillende delen of bestanddelen, wat van toepassing kan zijn op complexe moleculen zoals eiwitten of antilichamen. | | Homogeen | Bestaande uit een uniforme samenstelling of structuur. In de context van massawerkingmodellen, wordt vaak uitgegaan van homogeniteit van de reactanten. | | Fluorescentie kanalen | Specifieke detectoren in een flowcytometer die golflengtebereiken detecteren die overeenkomen met de emissie van specifieke fluorescente markers. | | Fout door interferentie | Een verstoring van het signaal die wordt veroorzaakt door de interactie van verschillende golven, zoals bij biolayer interferometrie, waar reflecterende oppervlakken interferentiepatronen kunnen creëren. | | Fout door onvoorziene interferentie | De term "ad hoc gating" verwijst naar het aanpassen van gatingstrategieën na de initiële data-acquisitie, vaak om onverwachte resultaten of populaties in de data te isoleren of te verwijderen. | | Ritssluiting (Zipper) | Een metafoor voor het proces waarbij moleculen zich aan elkaar binden, wat een sequentieel proces kan impliceren dat vergelijkbaar is met het sluiten van een ritssluiting. |