12_Detectie_kweek_en_identificatie (4).pdf

# Algemene principes van diagnostiek in de medische microbiologie Het medisch microbiologisch laboratorium speelt een cruciale rol in de diagnose van infectieziekten door pathogenen aan te tonen en de immuunrespons van de patiënt te beoordelen [1](#page=1). ### 1.1 Inleiding tot diagnostiek #### 1.1.1 De taken van het medisch microbiologisch laboratorium Het medisch microbiologisch laboratorium voert onderzoek uit op aanvraag van de arts met als doel te bepalen of een patiënt een infectie heeft, wat de verwekker is en welke antimicrobiële middelen effectief zijn. Daarnaast worden adviezen gevraagd over de juiste afname en bewaring van monsters. De gangbare technieken omvatten microscopie, kweek met identificatie, antigendetectie, moleculaire detectietechnieken en serologie (het aantonen van antilichamen als bewijs van infectie). Het antibiogram, hoewel besproken bij antibiotica, is ook een belangrijk onderdeel van het diagnostisch proces. Resultaten van het antibiogram zijn niet alleen van belang voor de individuele patiënt, maar dragen ook bij aan epidemiologische gegevens over resistentiepatronen ten gunste van de gemeenschap. Niet-routinematige onderzoeken zijn onder andere 'fingerprinting' en viruskweek [4](#page=4). #### 1.1.2 Microbiologische etiologie aantonen: met welke technieken? In de medische microbiologie is het aantonen van de microbiologische verwekker essentieel, met name wanneer klinische beelden niet eenduidig zijn. Hoewel sommige ziektebeelden, zoals typische mazelen, suggestief zijn voor een specifieke diagnose, is dit zelden het geval. Minder typische presentaties van infecties, zoals TBC, of aandoeningen zoals pyelonefritis, vereisen diagnostische inspanningen om de causale agens te identificeren. De technieken die worden gebruikt om microbiologische etiologie aan te tonen, omvatten [7](#page=7): * **Microscopie:** voor het detecteren van specifieke morfologische kenmerken [7](#page=7). * **Kweek:** gebruikmakend van eenvoudige media voor bacteriën [7](#page=7). * **Celkweek:** noodzakelijk voor het kweken van virussen en chlamydiae [7](#page=7). * **Non-culture detection:** methoden die geen kweek vereisen, zoals antigendetectie en detectie van genoommateriaal [7](#page=7). * **Immuunrespons:** door middel van serologie (aantonen van antilichamen) of huidtesten [7](#page=7). ### 1.2 Directe detectie #### 1.2.1 Microscopie Microscopie is een fundamentele directe detectiemethode in de medische microbiologie. Het stelt laboranten in staat om morfologische kenmerken van micro-organismen direct in het specimen te observeren. Dit kan variëren van het identificeren van bacteriën, schimmels tot parasieten, afhankelijk van het type specimen en de gebruikte kleuringsmethoden, zoals de Gramkleuring [1](#page=1) [4](#page=4) [7](#page=7). #### 1.2.2 Niet-microscopische methoden Naast microscopie zijn er andere directe detectiemethoden die geen levende celcultuur vereisen. Deze omvatten antigendetectie en moleculaire detectietechnieken. Deze methoden kunnen sneller resultaten opleveren dan kweekmethoden [4](#page=4) [7](#page=7). ### 1.3 Detectie na amplificatie #### 1.3.1 Basistechniek voor kweek van micro-organismen Kweek is een essentiële techniek om micro-organismen te isoleren en te identificeren. Het proces omvat het inoculeren van een geschikt medium, gevolgd door incubatie onder specifieke omstandigheden om groei te bevorderen [1](#page=1) [2](#page=2) [4](#page=4). #### 1.3.2 Identificatie van de opgegroeide bacteriën Na succesvolle kweek is identificatie cruciaal om de specifieke bacteriesoort te bepalen. ##### 1.3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie Traditionele methoden voor bacteriële identificatie maken gebruik van biochemische tests die enzymatische activiteiten meten, of serologische reacties waarbij specifieke antilichamen worden gebruikt om bacteriële antigenen te detecteren [2](#page=2). ##### 1.3.2.2 Identificatie met MaldiTOF massaspectrografie MaldiTOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) massaspectrometrie is een geavanceerde techniek die de identificatie van bacteriën versnelt door de analyse van hun eiwitprofielen [2](#page=2). #### 1.3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen vereisen speciale media of incubatiecondities om te kunnen groeien. Dit kan anaerobe omstandigheden, specifieke voedingsstoffen of langere incubatietijden omvatten [2](#page=2). #### 1.3.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek ##### 1.3.4.1 Staaltypes De interpretatie van bacteriologische onderzoeksresultaten hangt sterk af van het type monster dat is afgenomen. Monsternames van steriele locaties (bv. bloed, liquor) hebben een hogere diagnostische waarde dan monsters van gekoloniseerde gebieden (bv. keeluitstrijkjes) ] [2](#page=2). ##### 1.3.4.2 Belang van aspect tijd (bij diagnose door kweek) Het aspect tijd is cruciaal bij diagnose via kweek. De tijd die nodig is voor groei en identificatie bepaalt hoe snel een definitieve diagnose kan worden gesteld, wat direct invloed heeft op de behandeling van de patiënt [2](#page=2). #### 1.3.5 Detectie na moleculaire amplificatie Moleculaire amplificatietechnieken, zoals Polymerase Chain Reaction (PCR), maken het mogelijk om specifieke nucleïnezuren van pathogenen te detecteren. Deze methoden zijn zeer gevoelig en specifiek en kunnen pathogenen identificeren, zelfs bij lage concentraties [1](#page=1). ### 1.4 Serologie Serologie omvat de detectie van antilichamen die door het immuunsysteem van de gastheer worden geproduceerd als reactie op een infectie. Door het meten van de antilichaamtiters, of het aantonen van specifieke antilichamen (IgM, IgG), kan men informatie verkrijgen over een actieve of doorgemaakte infectie. Technieken zoals ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) worden veelvuldig gebruikt in de serologische diagnostiek. De interpretatie van serologische resultaten vereist kennis van de kinetiek van de immuunreactie [1](#page=1) [4](#page=4). > **Tip:** De interpretatie van diagnostische resultaten vereist een grondige kennis van de natuurlijke flora en de kinetiek van de immuunreactie. Zonder deze context kunnen resultaten verkeerd worden geïnterpreteerd [1](#page=1). > > **Tip:** Onzekerheid, verwachtingen en tijdsdruk kenmerken de klinische praktijk. Diagnostiek biedt houvast, zeker bij gebrek aan uitgebreide klinische ervaring [3](#page=3). > > **Tip:** Vraag altijd naar de juiste staalafname en bewaringsmethoden. Een incorrect afgenomen of bewaard monster kan leiden tot fout-negatieve resultaten [1](#page=1) [4](#page=4). --- # Directe detectiemethoden voor pathogenen Directe detectiemethoden maken het mogelijk om pathogenen te identificeren zonder dat er eerst een kweek in vitro nodig is, wat essentieel is wanneer de kiem te klein, verborgen of onbekend is qua morfologie. Deze methoden omvatten zowel microscopische als niet-microscopische technieken, waarbij vaak antilichamen of nucleïnezuren worden gebruikt [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19). ### 2.1 Microscopische methoden Microscopie maakt directe visualisatie van pathogenen mogelijk, variërend in resolutie en toepassingsgebied afhankelijk van het type microscoop [8](#page=8). #### 2.1.1 Gewone lichtmicroscopie Gewone lichtmicroscopie biedt een maximale vergroting van ongeveer 1000x, waardoor objecten kleiner dan 0,2 micrometer zichtbaar kunnen worden gemaakt [8](#page=8). * **Zonder fixatie en kleuring:** Deze methode kan worden gebruikt voor het aantonen van schimmels, parasieten, en bij urineweginfecties. Het wordt ook toegepast als 'wet stain' voor bijvoorbeeld vaginale uitstrijkjes [8](#page=8). * **Met fixatie en kleuring:** Voor een duidelijk beeld van bacteriën is een vergroting van 1000x en een gefixeerd en gekleurd preparaat vereist [8](#page=8). * **Gramkleuring:** De meest gebruikte kleuring in de bacteriologie. Het principe berust op de celwandsamenstelling, met name de hoeveelheid peptidoglycaan. Grampositieve bacteriën behouden na de kleuring een blauwe kleur, terwijl gramnegatieve bacteriën en cellen rood worden gekleurd als tegenkleuring [11](#page=11) [8](#page=8). * **Toepassing bij meningitis:** Een krachtig voorbeeld is de gramkleuring van lumbaalvocht bij verdenking op meningitis. Grampositieve diplokokken duiden op pneumokokken, wat implicaties heeft voor de behandeling (ceftriaxone) en de verwachting van secundaire gevallen. Gramnegatieve diplokokken wijzen op meningokokken, wat de keuze van behandeling (smal spectrum penicilline of amoxicilline) en preventieve maatregelen voor contactpersonen beïnvloedt. In de praktijk wordt vaak gestart met ceftriaxone, waarna de behandeling kan worden aangepast op basis van kweek en antibiogram [12](#page=12). * **Gramnegatieve staven:** Bij het zien van gramnegatieve staven in een reincultuur is de identificatie minder specifiek, aangezien dit kan duiden op diverse genera zoals *E. coli*, *Salmonella*, *Shigella*, of *P. aeruginosa*. Het onderscheid met grampositieve stafylokokken is echter al informatief [13](#page=13). * **Beperkingen bij commensale flora:** Bij monsters waar een commensale flora aanwezig is, zoals stoelgang, is gramkleuring meestal niet zinvol omdat pathogenen moeilijk te onderscheiden zijn [13](#page=13). * **Zuurvaste kleuring:** Gebruikt voor het aantonen van zuurvaste bacteriën, voornamelijk mycobacteriën zoals *M. tuberculosis*. Het principe is gebaseerd op de mycolzuurmantel van de celwand, waardoor intracellulaire kleurstoffen niet verwijderd kunnen worden met een zuur-alcohol mengsel [14](#page=14). * **Varianten:** De Ziehl-Neelsen kleuring en de auramine kleuring (een fluorescerende molecule die afgelezen wordt op een fluorescentiemicroscoop) zijn twee varianten. Auramine kleuring is sneller en gevoeliger [14](#page=14). * **Niet zichtbaar met lichtmicroscopie:** Virussen, mycoplasmata en chlamydiae zijn niet zichtbaar met deze technieken. Virussen kunnen indirect zichtbaar worden gemaakt door hun cytopathogeen effect op celculturen [8](#page=8). #### 2.1.2 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt het mogelijk om micro-organismen (en weefsels) op te sporen die zijn aangekleurd met een antiserum of probe gelabeld met een fluorescerende marker, zoals bij Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH). Antigenen van bacteriën en virussen kunnen worden opgespoord door binding met gemerkte antisera (of probes) via directe of indirecte immunofluorescentie. Voorbeelden zijn het aantonen van *Chlamydia trachomatis* in een endocervicaal uitstrijkje [8](#page=8) [9](#page=9). #### 2.1.3 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopie is noodzakelijk voor het visualiseren van virussen. EM wordt echter zeer zelden gebruikt in de routine-diagnostiek [8](#page=8). > **Tip:** Microscopische methoden bieden snelle resultaten en zijn vaak goedkoop. Ze zijn bijzonder nuttig bij het stellen van een diagnose voor specifieke aandoeningen zoals meningitis of vaginitis. Echter, de specificiteit kan beperkt zijn door bijmenging van normale flora of door morfotypes die niet uniek zijn voor een pathogeen. De kwaliteit van het afgenomen monster is ook van belang; bijvoorbeeld, veel plaveiselcellen in een sputumstaal duiden op een slechte staalkwaliteit [15](#page=15). ### 2.2 Niet-microscopische methoden Niet-microscopische methoden worden ingezet wanneer pathogenen niet zichtbaar zijn met lichtmicroscopie vanwege hun grootte, verborgen locatie, of afwezigheid van een typisch voorkomen. Deze methoden zijn meestal gebaseerd op antilichaam-detectie of nucleïnezuur hybridisatie [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19). #### 2.2.1 Antigeendetectie Antigeendetectie methoden maken gebruik van antilichamen om specifieke antigenen van pathogenen te detecteren [18](#page=18). * **Bacteriën:** Voorbeelden zijn de detectie van pneumokokken- of legionella-antigeen in urine bij verdenking op pneumonie en de detectie van *C. difficile* toxine in feces bij typische diarree [16](#page=16). * **Virussen:** Detectie van rotavirusantigeen in feces bij kinderen met diarree respiratoir syncytieel virus (RSV) in respiratoire aspiraten bij kinderen met bronchiolitis en influenza (seizoensgriep). Ook kan HBsAg en HIV p24 antigeen in bloed worden gedetecteerd om de vensterperiode te verkorten [17](#page=17). * **Schimmels:** Opsporing van galactomannan polysaccharide, een component van de celwand van *Aspergillus spp.*, in serum [18](#page=18). * **Protozoa:** Sneltesten voor *Plasmodium spp.* antigeen detectie bij verdenking op malaria in bloed [19](#page=19). > **Voorbeeld (Sandwich ELISA):** Een antigeendetectietest via sandwich ELISA werkt doordat het antigeen in het staal wordt gebonden door een 'capture' antilichaam. Een tweede antilichaam, covalent gebonden aan een enzym, bindt vervolgens aan het antigeen. De detectie vindt plaats via een enzymatische reactie die leidt tot de vorming van een gekleurd substraat dat optisch gemeten kan worden [18](#page=18). > **Voorbeeld (Immunochromatografie):** Een antigeendetectietest via immunochromatografie, vergelijkbaar met een zwangerschapstest, begint met het aanbrengen van patiëntenbloed op een nitrocellulose strip. Met een buffer die een gelabeld detectieantilichaam bevat, wordt het monster naar detectielijntjes geleid. Als het antigeen aanwezig is, wordt het samen met het gelabelde antilichaam gevangen door een capture antilichaam op de eerste lijn. Een tweede lijn bevat een antilichaam dat controleert op de aanwezigheid van het gelabelde antilichaam, wat zorgt voor een positieve controle van de reagentia. De zichtbaarheid van gouddeeltjes op een lijn duidt op de aanwezigheid van het antigeen [19](#page=19). #### 2.2.2 Genoomdetectie (Nucleïnezuur hybridisatie) Nucleïnezuur hybridisatietechnieken, zoals Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH), kunnen ook worden gebruikt voor directe detectie [17](#page=17). * **Voorbeelden:** High-risk humaan papillomavirus (HPV) DNA in situ hybridisatie op een cervicaal specimen bij CIN3 [17](#page=17). > **Conclusie over niet-microscopische methoden:** Deze methoden zijn doorgaans snel, mogelijk binnen dezelfde dag of zelfs minuten indien dringend. Ze zijn eenvoudig in gebruik en vereisen weinig training. Hoewel de kosten per individueel staal voor een specifieke diagnose relatief hoog kunnen zijn en veel afval genereren, bieden ze een hoge specificiteit doordat er zeer gericht wordt gezocht. Het nadeel is dat de gevoeligheid bij sommige tests beperkt kan zijn, waardoor andere mogelijke oorzaken gemist kunnen worden [20](#page=20). --- # Detectie na amplificatie en kweektechnieken Dit onderwerp behandelt de methoden voor het kweken en identificeren van micro-organismen, inclusief de uitdagingen bij moeilijk kweekbare soorten en detectiemethoden na moleculaire amplificatie. ### 3.1 Kweektechnieken voor micro-organismen #### 3.1.1 Basistechniek voor kweek Het kweken van micro-organismen vereist optimale omstandigheden wat betreft voedingsbronnen, temperatuur en atmosferische condities. Na een aanpassingsperiode volgt een logaritmische toename van bacteriën, waardoor ze microscopisch zichtbaar worden [21](#page=21). #### 3.1.2 Kweekbodems * **Vloeibare kweekbodems:** Gebruikt voor verder onderzoek naar bacteriële kenmerken; resultaten zijn vaak simpelweg "troebel" of "niet troebel" [22](#page=22). * **Agarbodems:** Hierop ontstaan kolonies, waarbij één bacterie één kolonie vormt. Dit maakt het mogelijk het aantal soorten te zien en geeft een indicatie van de soort of groep op basis van het uitzicht van de kolonie. Het uitstrijken van het staal over segmenten bevordert de isolatie van afzonderlijke kolonies, essentieel voor identificatie. Resultaten kunnen semikwantitatief worden gerapporteerd (bijvoorbeeld op basis van groei in zones) of kwantitatief als aantal Kolonievormende Eenheden (KVE) of Colony-Forming Units (CFU) per volume [22](#page=22). #### 3.1.3 Selectieve en differentiële media In kweekbodems kunnen stoffen worden toegevoegd om: * De bodem rijker te maken voor de groei van moeilijke soorten [23](#page=23). * Bloed toe te voegen voor betere groei van specifieke soorten en om hemolyse te observeren [23](#page=23). * De bodem selectiever te maken door de groei van bepaalde soorten te onderdrukken, waardoor klinisch relevante soorten zichtbaar worden [23](#page=23). * De bodem differentiëel te maken met behulp van pH-indicatoren of chromogene stoffen, wat leidt tot kolonies met verschillende kleuren en uitzichten [23](#page=23). * Antibiotica toe te voegen om specifiek resistente soorten op te sporen, bijvoorbeeld voor MRSA-screening [23](#page=23). Selectieve bodems zijn cruciaal of essentieel voor het vinden van specifieke soorten binnen een mengflora [23](#page=23). #### 3.1.4 Hemolyse van rode bloedcellen Hemolyse is een kenmerk dat bij diverse soorten wordt waargenomen, met name bij streptokokken, en is nuttig voor eerste identificatie op groeps- of soortniveau. Hemolytische streptokokken is een gangbare term in de bacteriologische diagnostiek en naamgeving. Er worden onderscheiden gemaakt tussen β-hemolytisch (volledige lysis), α-hemolytisch of vergroenend (partiële lysis), en niet-hemolytisch (γ-hemolytisch) [24](#page=24). ### 3.2 Identificatie van opgegroeide bacteriën Het uitzicht van kolonies kan suggestief zijn voor een bepaalde groep, genus of species, maar zelden volstaat dit voor een volledige identificatie. Identificatie vindt plaats op basis van diverse eigenschappen [25](#page=25): * **Gramkleur en celvorm** [25](#page=25). * **Uitzicht van kolonies:** grootte, randen, kleur (pigment, indicator), geur [25](#page=25). * **Fysiologische en biologische kenmerken:** * Afbraak en/of assimilatie van suikers, aminozuren, etc. [25](#page=25). * Groei onder specifieke omstandigheden (temperatuur, pH, zoutconcentratie) [25](#page=25). * Profiel van kenmerkende metabolieten [25](#page=25). * Celwandsamenstelling [25](#page=25). * **Genetisch profiel:** Totaal DNA, ribosomaal RNA (rRNA) [25](#page=25). * **Specifieke antilichamen:** Tegen typische antigenen [25](#page=25). #### 3.2.1 Enzymatische en serologische identificatie Bacteriën kunnen snel geïdentificeerd of getypeerd worden door agglutinatie met specifieke antilichamen, vaak gebonden aan latexdeeltjes, wat resulteert in klontering. Een voorbeeld is de ureasetest, die bepaalt of een bacterie ureum kan splitsen. Positieve resultaten leiden tot alkalinisatie door ammoniakvorming, wat zichtbaar wordt door een rode kleur dankzij een pH-indicator in de kweekbodem. Deze tests zijn vaak geminiaturiseerd of geautomatiseerd in "batterijen" van enzymatische tests [26](#page=26). #### 3.2.2 Identificatie met MALDI-TOF massaspectrometrie Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie is een moderne techniek die sinds ongeveer tien jaar breed wordt ingezet in diagnostische laboratoria [27](#page=27). * **Universeel:** Maakt identificatie mogelijk zonder voorkennis van de specifieke bacteriegroep [27](#page=27). * **Tijdwinst:** Resultaten zijn doorgaans binnen 24 uur beschikbaar, wat een tijdwinst van minstens één dag oplevert ten opzichte van klassieke methoden. Dit voordeel is nog groter voor moeilijk identificeerbare soorten [27](#page=27). **Principe van MALDI-TOF:** Een kleine hoeveelheid gekweekte bacterie wordt gefixeerd op een drager (matrix) en in het toestel gebracht. In vacuüm wordt de bacterie met een laser gefragmenteerd, waarbij eiwitten worden gebroken. De fragmenten worden gescheiden op basis van hun massa-ladingverhouding via een Time-Of-Flight (TOF) buis, waarbij grotere fragmenten langzamer en kleinere fragmenten sneller bewegen. De geregistreerde fragmenten vormen een "piekenpatroon" dat wordt geanalyseerd door software. Dit profiel wordt vergeleken met een database van referentiemassaspectra om de bacterie te identificeren [28](#page=28) [29](#page=29). > **Tip:** De tijdwinst van MALDI-TOF is significant, omdat klassieke identificatietechnieken vaak een overnachtingskweek vereisen [27](#page=27). ### 3.3 Kweek van moeilijker kweekbare micro-organismen Sommige micro-organismen vereisen speciale kweekomstandigheden of kunnen helemaal niet *in vitro* gekweekt worden. * **Anaeroben:** Vereisen kweekomstandigheden zonder zuurstof, ook tijdens transport moet zuurstof worden geweerd [31](#page=31) [32](#page=32). * **Trage groeiers of niet op klassieke bodems:** * *Mycobacteriën:* Groei kan weken duren [31](#page=31). * *Mycoplasmata:* Vormen microscopische kolonies op speciale media [31](#page=31). * *Chlamydia:* Kunnen alleen op cellijnen worden gekweekt. De bacteriën groeien in glycogeenbevattende inclusies, die aangetoond kunnen worden met lugolkleuring [31](#page=31) [33](#page=33). * **(Bijna) onkweekbare bacteriën:** Sommige, zoals *Mycobacterium leprae* en *Treponema pallidum*, kunnen alleen in levende dieren (bijvoorbeeld gordeldier of konijnentestikels) gekweekt worden, maar niet *in vitro*. Andere zijn helemaal niet kweekbaar [31](#page=31). * **Schimmels en gisten:** Kunnen soms op bacteriële media groeien, maar vaak zijn selectieve media nodig voor een hogere gevoeligheid. Hun groei kan ook trager zijn dan die van bacteriën [31](#page=31). * **Virussen:** Zijn obligate intracellulaire parasieten en worden gekweekt op specifieke cellijnen. Aanwezigheid wordt aangetoond via cytopathogeen effect of immuundetectie/hybridisatie. Kweek van virussen vraagt veel expertise, verse stalen, is bewerkelijk en duur, en wordt daarom steeds meer vervangen door moleculaire detectiemethoden [31](#page=31) [33](#page=33). * **Protozoa:** Worden doorgaans niet gekweekt voor routine diagnostiek [31](#page=31). ### 3.4 Interpretatie in het bacteriologisch onderzoek Bij bacteriologisch onderzoek is het cruciaal om de kweek- en identificatietechnieken af te stemmen op de klinische vraagstelling. Het identificeren van alle bacteriën in een monster is niet de strategie, aangezien veel commensale bacteriën aanwezig zijn [34](#page=34). #### 3.4.1 Staaltypes en interpretatie * **Type 1: Plaats zonder normale flora** * Voorbeelden: bloed, gewrichtsvocht, pleuravocht [36](#page=36). * Als een bacterie wordt gevonden, is dit vrijwel altijd een pathogeen [36](#page=36). * Voorzorgsmaatregelen: aseptisch afnemen en desinfectie van het oppervlak [36](#page=36). * Contaminanten (vaak huidbewoners) worden meestal in kleinere aantallen aangetroffen dan pathogenen, wat helpt bij de interpretatie. Het onderscheid tussen contaminatie en infectie met laag-virulente soorten kan echter moeilijk zijn, zeker bij patiënten met prothesen of verzwakt immuunsysteem [36](#page=36). * **Hemocultuur (bloedkweek):** Een bijzonder type 1 staal. Er wordt een groot volume kweekbodem en bloed gebruikt om remmende stoffen te neutraliseren en kleine aantallen bacteriën te detecteren. De bodems worden geschud, zijn rijk en langdurig geïncubeerd, wat zowel gunstig is voor de verwekker als voor contaminanten. Een contaminant kan een echte pathogeen maskeren of leiden tot een verkeerde diagnose. Een hemocultuur vereist zeer zorgvuldige afname [36](#page=36). * **Type 2: Plaats zonder normale flora die een zone met normale flora passeert** * Voorbeelden: longen, bronchiën, blaas die passeren via keel (speeksel), urethra, vulva [37](#page=37). * Oplossing: maximaliseren van de detectie van "witte bollen" (pathogenen) en minimaliseren van "zwarte bollen" (commensalen) door maatregelen bij afname, transport en verwerking [37](#page=37). * **Afname:** Sputum: diep monster, patiënt moet fluim hoesten, niet speeksel. Urine: midstream, eventueel via punctie of katheterisatie [37](#page=37). * **Transport:** Snel transport is essentieel om bacteriegroei te beperken, het aantal kritische soorten te behouden en menging van ettervlokjes en speeksel te voorkomen. Koel bewaren van urinemonsters is noodzakelijk om de telling betrouwbaar te houden [37](#page=37). * **In het labo:** Kwantitatieve kweken, detectie van bekende verwekkers, en eventueel "wassen" van sputum om speeksel te verwijderen. Een hoog aantal plaveiselcellen in sputum duidt op speekselcontaminatie, terwijl neutrofielen op een infectie wijzen [37](#page=37). * **Type 3: Monsters met pathogenen tussen bestaande commensale flora** * Voorbeelden: stoelgang, keeluitstrijkje, fistel, chronische wonde, vagina [38](#page=38). * Essentieel: kennis van potentiële verwekkers voor de specifieke locatie. Selectieve bodems worden gebruikt om potentiële pathogenen op te sporen [38](#page=38). * **Kwantitatieve analyse:** Kan belangrijk zijn als pathologie te wijten is aan overgroei (bv. *Candida* infectie) [38](#page=38). * **Screening:** Voor MRSA of andere multiresistente stammen, ter voorbereiding op een infectie of isolatiemaatregelen [38](#page=38). * **Communicatie:** Essentieel om de microbioloog te informeren over afwijkende verwachtingen op basis van reisgeschiedenis, exposities, immuunsuppressie, etc. [38](#page=38). * **Pre-analytische kwaliteit:** Slechte monsterkwaliteit leidt tot onbetrouwbare resultaten [38](#page=38). ### 3.5 Belang van tijd bij diagnose door kweek De analysetijd voor microbiologische onderzoeken, met name die gebaseerd op kweek, is relatief lang vergeleken met chemische bepalingen [39](#page=39). * **Microscopie:** Enkele minuten tot dezelfde dag [39](#page=39). * **Kweek + identificatie:** Doorgaans 24-48 uur, inclusief overnachting in de broedstoof en identificatietesten. Met technieken als MALDI-TOF kan dit op dezelfde dag [39](#page=39). * **Antibiogram:** Vereist eerst groei, dus duurt minimaal 48 uur na de initiële kweek [39](#page=39). * **Globaal:** Resultaten duren vaak 2 tot 3 dagen. Voor sommige stalen en bacteriën kan dit oplopen tot 3-5 dagen [39](#page=39). * **Vertragingen:** Transportduur en sluitingstijden van laboratoria (avonden, weekenden) kunnen de resultaten verder vertragen [39](#page=39). * **Specifieke micro-organismen:** Virussen, mycobacteriën, mycoplasmata en anaeroben vereisen langere kweek- of analyseperioden, waarbij snellere (niet-kweekgebaseerde) technieken de voorkeur krijgen [39](#page=39). ### 3.6 Detectie na moleculaire amplificatie Moleculaire amplificatietechnieken, met name (reverse transcriptie-)PCR, zijn een belangrijke aanvulling op of vervanging van kweekmethoden [40](#page=40). * **Kenmerken:** Vaak kwantitatief, vereisen staalvoorbereiding en strikte voorzorgsmaatregelen om moleculaire contaminatie te voorkomen [40](#page=40). * **Automatisering:** Evolueert naar automatisering, wat individuele monsteranalyse en urgente analyses mogelijk maakt [40](#page=40). * **Toepassingsgebied:** Breed, voor vrijwel alle pathogenen [40](#page=40). * **Specificiteit en gevoeligheid:** Zeer hoog, wat zowel een voor- als een nadeel kan zijn [40](#page=40). * **Combinatie met sequencing:** Kan worden gecombineerd met Sanger- of deep sequencing voor verder onderzoek [40](#page=40). #### 3.6.1 Toepassingen van moleculaire amplificatie * **Bacteriën:** * Direct op staal of in combinatie met kweek [41](#page=41). * Aantonen van aanwezigheid (bv. 16S rRNA gen PCR) [41](#page=41). * Detectie van moeilijk kweekbare organismen (bv. *Mycobacteriën*) [41](#page=41). * Detectie van resistentiegenen (vaak na kweek) [41](#page=41). * Typering voor stamvergelijking (bv. in ziekenhuishygiëne) [41](#page=41). * Onderzoek naar diversiteit van flora (bv. darmmicrobioom) [41](#page=41). * **Virussen:** * Direct op staal [41](#page=41). * Aantonen en kwantificeren (bv. HIV, CMV, HSV, HBV) [41](#page=41). * Typeren van virale varianten (genotypes) en bepaling van antivirale resistentie op genetisch niveau [41](#page=41). * **Schimmels:** * Direct op staal (bv. respiratoir) [41](#page=41). * Aantonen van aanwezigheid (bv. *Aspergillus fumigatus*) [41](#page=41). * **Protozoa:** * Direct op staal (biopten, stoelgang, bloed) [41](#page=41). * Aantonen van aanwezigheid (bv. toxoplasmose, amoebiase, *Plasmodium falciparum*) [41](#page=41). * **Wormen:** * Direct op staal (stoelgang, serum) [41](#page=41). * Aantonen van aanwezigheid (bv. nematoden, filariasen, schistosomiase) [41](#page=41). --- # Serologie als diagnostische methode Serologie is een diagnostische methode die zich richt op het opsporen van antilichamen in lichaamsvloeistoffen, voornamelijk serum. Deze techniek maakt het indirect mogelijk om een vroeg contact met een pathogeen aan te tonen, zonder direct te informeren over de actuele aanwezigheid van het pathogeen. Antilichamen zijn relatief stabiel in vitro en serummonsters kunnen na koeling wekenlang of na invriezing jarenlang bewaard worden voor serologische testen [42](#page=42). ### 4.1 Principes van serologische testen Het principe achter serologische onderzoeken is de detectie van specifieke antistoffen. Een veelgebruikte methode is de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) [42](#page=42) [43](#page=43). #### 4.1.1 ELISA-principe Bij een ELISA-test wordt een antigeen (het molecuul dat een immuunrespons opwekt) op de bodem van een plastic drager (well) gecoat. Vervolgens wordt patiëntenserum toegevoegd, waarin eventueel antilichamen aanwezig zijn. De detectie vindt plaats met behulp van een enzym-gebonden anti-immuunglobuline (bv. anti-IgM of anti-IgG). Na toevoeging van een substraat wordt een kleurreactie waargenomen, die optisch gedetecteerd kan worden [42](#page=42). > **Tip:** ELISA is een snelle test die binnen enkele uren resultaten kan opleveren [42](#page=42). ### 4.2 Antilichaamklassen en infectietijdlijnen De aanwezigheid en de soort antilichamen (IgM en IgG) geven belangrijke informatie over de timing en fase van een infectie. #### 4.2.1 IgM antistoffen IgM antistoffen wijzen doorgaans op een recente infectie. Ze worden meestal binnen één week na infectie detecteerbaar, bereiken een piek binnen twee weken, en worden na enkele maanden vaak weer negatief. Het is belangrijk te beseffen dat een patiënt al infectieus kan zijn voor anderen voordat IgM antistoffen aantoonbaar zijn. Deze periode wordt de vensterperiode of window phase genoemd. Om de vensterperiode te verkorten, kunnen gevoeliger tests, zoals PCR, naast serologie worden ingezet. Bij HIV-infectie is bijvoorbeeld de PCR binnen ongeveer tien dagen positief, terwijl serologie gemiddeld pas na drie weken positief wordt [43](#page=43). #### 4.2.2 IgG antistoffen Specifieke IgG antistoffen worden meestal pas na meer dan één week detecteerbaar. Vaak zijn ze levenslang detecteerbaar, hoewel dit kan variëren afhankelijk van de specifieke infectie [43](#page=43). #### 4.2.3 Titerbepalingen Serologisch onderzoek kan kwalitatief (positief of negatief) of kwantitatief (titerbepaling) gebeuren. Titerbepalingen, met name voor IgG, kunnen nuttig zijn. Een viervoudige toename in de antilichaamconcentratie in twee opeenvolgende serumstalen, afgenomen met minimaal twee weken ertussen, kan duiden op een recente infectie. Stijgende IgG- of IgM-titers kunnen ook voorkomen bij reactivatie van een latente infectie, zoals bij virale infecties [43](#page=43). > **Voorbeeld:** Bij vaccinatie of herinfectie na jaren kan een duidelijke 'boost' in de IgG-respons worden waargenomen, waarbij de affiniteit van de latere IgG-golven hoger is dan die van de eerste [43](#page=43). #### 4.2.4 Affiniteit en polyklonale activatie Soms wordt de affiniteit van de aanwezige IgG's bepaald, bijvoorbeeld bij CMV-seropositiviteit bij zwangere vrouwen. Bij infectie met het Epstein-Barr-virus (EBV) kunnen IgM-titers tegen diverse antigenen stijgen door polyklonale activatie van B-cellen, wat kan leiden tot positieve IgM-testen tegen virussen waarmee de patiënt in het verleden al in contact is geweest [44](#page=44). ### 4.3 Beperkingen en uitzonderingen Serologische testen zijn niet zonder beperkingen en kunnen in specifieke patiëntengroepen vals positieve of vals negatieve resultaten geven. #### 4.3.1 Vals negatieve resultaten Vals negatieve resultaten kunnen optreden bij patiëntengroepen die minder efficiënt antilichamen produceren, zoals neonaten, zeer ouderen en immuungecompromitteerde personen [44](#page=44). #### 4.3.2 Vals positieve resultaten Vals positieve resultaten kunnen voorkomen bij patiënten die antilichamen passief hebben verkregen. Dit geldt voor neonaten die antilichamen transplacentair of via moedermelk ontvangen (detecteerbaar tot 6 maanden na geboorte), en na transfusie met plasmabevattende producten of immunoglobulines [44](#page=44). > **Voorbeeld:** Bij een hepatitis B virusinfectie met spontane genezing zijn er duidelijke verschillen in antigen- en antilichaamtiters over de tijd. Opvallend is dat de infectieuze periode (aantoonbaar via HBsAg) voorafgaat aan de symptomen zoals geelzucht. Virus-DNA kan via PCR al 1-2 weken voor HBsAg in serum worden aangetoond [44](#page=44). ### 4.4 Toepassingsgebied van serologie Serologie kent een breed toepassingsgebied in de diagnostiek en preventie van infectieziekten. #### 4.4.1 Diagnostiek van infectieziekten Serologie is met name nuttig voor de detectie van virale infecties vanwege de vaak chronische aard van deze infecties en de directe link tussen de aanwezigheid van het agens en de ziekte. Hoewel het nut bij bacteriën beperkter is, wordt het ingezet bij de diagnostiek van syfilis en de ziekte van Lyme (Borrelia burgdorferi). Voor andere pathogenen zijn meer gespecialiseerde tests beschikbaar [45](#page=45). #### 4.4.2 Screening en monitoring Serologie wordt gebruikt voor het screenen van dragers van infectieziekten zoals HIV, HBV en HCV. Tevens dient het voor het opvolgen van de vaccinatiestatus, bijvoorbeeld voor hepatitis B [45](#page=45). #### 4.4.3 Individuele diagnostiek Voor de individuele diagnostiek van doorgemaakte infecties kan serologisch onderzoek, eventueel in combinatie met lumbaal vocht, inzicht geven. Hoge lokale antilichamentiters in lumbaal vocht kunnen duiden op lokale productie en dus een intracerebrale infectie [45](#page=45). #### 4.4.4 Preventie Op het gebied van preventie wordt serologie toegepast, zoals CMV- en Toxoplasma-serologie bij zwangere vrouwen om het risico op congenitale infecties in te schatten [45](#page=45). ### 4.5 Conclusie Serologische methoden bieden een snelle en kosteneffectieve manier om indirect contact met pathogenen aan te tonen. Voor de belangrijkste pathogenen zijn deze tests vaak specifiek en gevoelig, en de detecteerbaarheid van antilichamen in vitro is een belangrijk voordeel. De belangrijkste beperking blijft dat serologie informatie geeft over een *vroeger* contact en geen uitsluitsel geeft over de *huidige* aanwezigheid van een pathogeen, tenzij het pathogeen per definitie vrijwel nooit geëlimineerd wordt, zoals HIV. Vaak is een combinatie van serologische testen met andere diagnostische methoden, zoals detectie van het agens zelf, noodzakelijk voor een volledige diagnose [45](#page=45). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Diagnostiek | Het proces van het identificeren van een ziekte of aandoening door middel van symptomen, tekens en onderzoek, met als doel een passende behandeling te kunnen starten. | | Staalafname | Het zorgvuldig verzamelen van biologisch materiaal, zoals bloed, urine, sputum of weefsel, voor laboratoriumonderzoek om de aanwezigheid van ziekteverwekkers of afwijkende celtypen te detecteren. | | Staalbewaring | Het correct bewaren van verzameld biologisch materiaal onder specifieke omstandigheden (temperatuur, medium) om de integriteit van pathogenen of biomoleculen te behouden totdat het monster wordt geanalyseerd. | | Pathogeen | Een micro-organisme, zoals een bacterie, virus, schimmel of parasiet, dat in staat is om een ziekte te veroorzaken bij een gastheer. | | Immuniteit | Het vermogen van het lichaam om zich te verdedigen tegen ziekteverwekkers, vaak aangetoond door de aanwezigheid van specifieke antistoffen of een celgemedieerde immuunrespons. | | Microscopie | Een techniek die gebruik maakt van een microscoop om objecten te vergroten die te klein zijn om met het blote oog te zien, gebruikt om structuren van micro-organismen en weefsels te bestuderen. | | Gramkleuring | Een differentiële kleuringstechniek die bacteriën groepeert in Gram-positief (kleuren blauw/paars) en Gram-negatief (kleuren rood/roze) op basis van de samenstelling van hun celwand. | | Kweek | Een laboratoriummethode waarbij micro-organismen worden vermeerderd in een gecontroleerde omgeving op voedingsbodems om hun groei en identiteit vast te stellen. | | PCR | Polymerase Chain Reaction (PCR) is een moleculaire techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-segmenten te vermenigvuldigen, waardoor grote hoeveelheden van een doel-DNA-sequentie kunnen worden gecreëerd voor detectie en analyse. | | ELISA | Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) is een veelgebruikte laboratoriumtest om de aanwezigheid van specifieke antigenen of antilichamen in een monster te detecteren door middel van enzymatische reacties die een kleursignaal produceren. | | Flora | De gemeenschap van micro-organismen, inclusief bacteriën, schimmels en virussen, die van nature leven op of in een gastheer, zoals op de huid of in de darmen, zonder noodzakelijk ziekte te veroorzaken. | | Immuunreactie | De reeks biologische processen waarbij het immuunsysteem reageert op de aanwezigheid van een vreemde stof, zoals een antigeen, met als doel deze te elimineren of te neutraliseren. | | Kinetiek van de immuunreactie | De tijdlijn en de snelheid waarmee de verschillende componenten van de immuunreactie optreden en veranderen na blootstelling aan een antigeen. | | Cytopathogeen effect | Veranderingen in cellen die worden veroorzaakt door de infectie met een virus, wat zichtbaar kan zijn onder de microscoop en wordt gebruikt voor virusidentificatie. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopietechniek die gebruik maakt van fluorescentie om specifieke structuren of moleculen in een monster te detecteren en te visualiseren nadat ze zijn aangekleurd met fluorescerende labels. | | FISH | Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) is een moleculaire cytogenetische techniek die fluorescerende probes gebruikt om de aanwezigheid van specifieke DNA- of RNA-sequenties direct in cellen of weefsels aan te tonen. | | Antigeendetectie | Een methode om specifieke moleculen (antigenen) van een micro-organisme of cel te identificeren, vaak met behulp van antilichamen die specifiek aan deze antigenen binden. | | Genoom | Het volledige genetische materiaal van een organisme, inclusief alle genen en niet-coderende DNA-sequenties, dat wordt onderzocht met moleculaire technieken. | | Moleculaire amplificatie | Technieken zoals PCR die worden gebruikt om specifieke nucleïnezuursequenties (DNA of RNA) exponentieel te vermenigvuldigen, waardoor zelfs kleine hoeveelheden detecteerbaar worden. | | Serologie | Het onderzoek van serum (het vloeibare deel van bloed na stolling) om de aanwezigheid en concentratie van antistoffen te bepalen, wat indicatief kan zijn voor een infectie of immuunrespons. | | Vensterperiode | De periode na blootstelling aan een infectieus agens waarin het organisme nog niet detecteerbaar is met standaardtests (zoals serologie) omdat de immuunrespons nog niet volledig is ontwikkeld, maar de infectie wel al aanwezig is en overdraagbaar kan zijn. | | Titer | De hoogste verdunning van een serum waarbij nog een reactie wordt waargenomen, bijvoorbeeld met een antigeen of antilichaam, wat een maat is voor de concentratie van de specifieke stof in het monster. | | Commensale flora | Micro-organismen die normaal gesproken op of in een gastheer leven zonder ziekte te veroorzaken en vaak een symbiotische relatie hebben, waarbij ze profiteren van de gastheer en de gastheer mogelijk voordeel ondervindt. | | MaldiTOF MS | Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry is een techniek die wordt gebruikt voor de snelle identificatie van micro-organismen door de analyse van hun eiwitprofielen, verkregen na laserdesorptie en ionisatie. | | MRSA | Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus is een bacteriesoort die resistent is tegen methicilline en andere antibiotica, wat de behandeling van infecties die door deze bacterie worden veroorzaakt bemoeilijkt. | | Hemolyse | Het afbreken van rode bloedcellen, wat kan worden veroorzaakt door bepaalde bacteriën en vaak wordt waargenomen op bloedagarplaten als een verkleuring rond de kolonies. | | Virulentie | De mate waarin een pathogeen in staat is om ziekte te veroorzaken en schade aan te richten in een gastheer. | | Stoelgang | Ontlasting of uitwerpselen, verzameld voor diagnostisch onderzoek om de aanwezigheid van intestinale pathogenen of andere afwijkingen op te sporen. | | Sputum | Slijm opgehoest uit de luchtwegen, verzameld voor onderzoek naar longinfecties en de aanwezigheid van micro-organismen. | | Lumbaalvocht | Vocht verkregen uit de lumbale ruimte van de wervelkolom door middel van een lumbaalpunctie, gebruikt voor diagnostiek van aandoeningen van het centrale zenuwstelsel, zoals meningitis. |