1-methoden en technieken (1).pptx

# Basisprincipes van microscopie en resolutie Hier is een samenvatting van de basisprincipes van microscopie en resolutie, bedoeld als studiemateriaal voor examens. ## 1. Basisprincipes van microscopie en resolutie Dit onderwerp duikt in de fundamentele principes van licht- en elektronenmicroscopie, met speciale aandacht voor de werking van lenzen, de definitie van resolutie en de factoren die deze beïnvloeden, zoals numerieke apertuur en golflengte, evenals het concept van lege vergroting. ### 1.1 Algemene principes van microscopie Microscopen maken gebruik van lenzensystemen om objecten te vergroten, waardoor details zichtbaar worden die met het blote oog niet waarneembaar zijn. De eindvergroting van een lichtmicroscoop wordt bepaald door de vermenigvuldiging van de vergroting van het objectief en de vergroting van het oculair. Het objectief speelt een cruciale rol in het bepalen van de resolutie. ### 1.2 Resolutie De resolutie wordt gedefinieerd als de kleinst mogelijke afstand tussen twee punten waarbij deze twee punten nog steeds als afzonderlijk van elkaar waargenomen kunnen worden. * **Blote oog:** De resolutie van het blote oog is ongeveer $0.1$ millimeter. * **Lichtmicroscoop:** Een lichtmicroscoop kan een resolutie bereiken van ongeveer $0.2$ micrometer. * **Elektronenmicroscoop:** Een elektronenmicroscoop kan een aanzienlijk hogere resolutie bereiken, tot ongeveer $0.1$ nanometer. De maximale resolutie die theoretisch haalbaar is, is ongeveer de helft van de golflengte van de gebruikte straling. * **Zichtbaar licht:** De golflengte van zichtbaar licht ligt tussen $390$ en $700$ nanometer. * **Versnelde elektronen:** Versnelde elektronen in een elektronenmicroscoop hebben een effectieve golflengte van ongeveer $0.2$ nanometer. ### 1.3 Factoren die resolutie beïnvloeden De resolutie van een microscoop wordt voornamelijk bepaald door de optische eigenschappen van het objectief. Twee belangrijke factoren zijn de numerieke apertuur (NA) en de golflengte van het gebruikte licht of deeltjes. #### 1.3.1 Numerieke apertuur (NA) De numerieke apertuur is een maat voor het vermogen van een lens om licht op te vangen. Het wordt gedefinieerd als het product van de brekingsindex van het medium tussen het object en de lens ($N$) en de sinus van de halve openingshoek van de lens ($\alpha$). $$ NA = N \cdot \sin \alpha $$ Een hogere NA betekent dat de lens meer licht kan opvangen, wat resulteert in een betere resolutie. #### 1.3.2 Golflengte ($\lambda$) De resolutie ($R$) van een microscoop is omgekeerd evenredig met de numerieke apertuur en recht evenredig met de golflengte van de gebruikte straling. De relatie wordt vaak beschreven door de volgende formule, waarbij $K$ een constante is die afhangt van de gebruikte microscopietechniek: $$ R = K \cdot \frac{\lambda}{NA} $$ Dit betekent dat kortere golflengtes, zoals die van elektronen in een elektronenmicroscoop, leiden tot een hogere resolutie vergeleken met zichtbaar licht. ### 1.4 Lege vergroting Lege vergroting treedt op wanneer een beeld optisch wordt vergroot zonder dat dit leidt tot een toename van de resolutie. Met andere woorden, het vergrote beeld toont geen nieuwe details, maar maakt bestaande details simpelweg groter. De zinvolle vergroting van een microscoop wordt bepaald door de resolutie van de microscoop in combinatie met de resolutie van het menselijk oog. De relatie die de zinvolle vergroting aangeeft is: $$ \text{Resolutie oog} = \text{Resolutie microscoop} \times \text{Vergroting} $$ Een typisch voorbeeld is: * **Lichtmicroscoop:** $0.2$ micrometer resolutie microscoop $\times 500$ vergroting $\approx 0.1$ millimeter resolutie oog. * **Elektronenmicroscoop:** $0.1$ nanometer resolutie microscoop $\times 1000000$ vergroting $\approx 0.1$ millimeter resolutie oog. Als de vergroting hoger is dan wat nodig is om de limieten van de resolutie van de microscoop te tonen, spreken we van lege vergroting. ### 1.5 Contrastmicroscopie Contrastmicroscopie is essentieel voor het visualiseren van structuren in ongekleurde preparaten, die vaak weinig inherent contrast hebben. Verschillende technieken verhogen het contrast: * **Helderveld microscopie:** Dit is de standaardmethode waarbij licht door het preparaat schijnt en de absorptie door het preparaat voor contrast zorgt. * **Fasecontrast microscopie:** Deze techniek maakt gebruik van faseverschuivingen van licht dat door verschillende delen van het preparaat gaat. Het resulteert vaak in een karakteristiek halo-effect rond de structuren. * **Interferentiecontrast microscopie (Nomarski):** Deze methode maakt gebruik van interferentie van lichtgolven om topografische details te visualiseren, wat leidt tot een pseudo-reliëf-effect. Voor het observeren van levende cellen wordt vaak een **omgekeerde microscoop (inverted microscope)** gebruikt, waarbij de lenzen zich onder het monster bevinden. ### 1.6 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorochromen die licht van een specifieke golflengte absorberen en vervolgens licht van een langere golflengte uitzenden. * **Epifluorescentie:** Dit is de meest basale vorm waarbij excitatie- en emissielicht door dezelfde lens gaan. * **Photobleaching:** Een nadeel kan zijn dat fluorochromen na verloop van tijd vervagen onder de excitatie. * **Overlay van opnames:** Door opnames met verschillende fluorochromen te combineren, kunnen meerdere structuren in één beeld worden weergegeven. Vaak wordt het celkern aangetoond met blauwe kleuringen zoals DAPI of Hoechst. ### 1.7 Confocale microscopie Confocale microscopie maakt optische coupes van een preparaat mogelijk. Het principe berust op het gebruik van een **pinhole** die licht dat niet uit het focusvlak komt, blokkeert. Dit resulteert in scherpere beelden en de mogelijkheid om een stapel van verschillende optische coupes (een **stack**) te combineren tot een 3D-reconstructie. > **Tip:** Confocale microscopie is zeer nuttig voor het bestuderen van de driedimensionale structuur van cellen en weefsels. --- # Technieken voor contrastverhoging en fluorescentie Dit deel van de studiehandleiding behandelt methoden om het contrast in microscopische preparaten te verhogen, met een focus op helderveld-, fasecontrast- en interferentiecontrastmicroscopie, evenals de principes en toepassingen van fluorescentiemicroscopie. ### 2.1 Contrastverhogende technieken Om de zichtbaarheid van structuren in ongekleurde preparaten te verbeteren, worden verschillende contrastverhogende technieken toegepast: * **Helderveldmicroscopie:** Dit is de meest basale vorm van lichtmicroscopie, waarbij het preparaat wordt verlicht vanuit de onderzijde. Het contrast ontstaat door absorptie van licht door de specimen. Levende cellen kunnen hierdoor echter moeilijk zichtbaar zijn vanwege hun lage inherent contrast. * **Fasecontrastmicroscopie:** Deze techniek is met name geschikt voor het visualiseren van levende, ongekleurde cellen en weefsels. Het maakt gebruik van faseverschuivingen die optreden wanneer licht door structuren met verschillende brekingsindices gaat. Deze faseverschuivingen worden omgezet in zichtbare helderheidsverschillen. Een kenmerkend artefact van fasecontrastmicroscopie is het "halo-effect" rondom de gedetailleerde structuren. > **Tip:** Fasecontrastmicroscopie is cruciaal voor het bestuderen van dynamische cellulaire processen zonder de cellen te beschadigen met kleurstoffen. * **Interferentiecontrastmicroscopie (DIC - Differential Interference Contrast):** Deze methode produceert een pseudo-3D-beeld door interferentie van lichtstralen die langs verschillende paden door het preparaat lopen. Het biedt een hoge resolutie en een uitstekende beeldkwaliteit, waarbij details van het oppervlak van de specimen goed zichtbaar worden gemaakt. Een typisch kenmerk is het pseudo-relief effect, dat diepte suggereert. ### 2.2 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorochromen (fluorescerende moleculen) die licht absorberen bij een specifieke golflengte en dit weer uitzenden op een langere golflengte. Dit maakt de visualisatie van specifieke moleculen of structuren mogelijk. * **Epifluorescentie:** Bij epifluorescentiemicroscopie wordt de excitatie- en emissiebundel door dezelfde optische weg geleid. Het licht wordt via de objectieflens op het preparaat gericht. > **Tip:** Het gebruik van meerdere fluorochromen in één preparaat, met elk een eigen excitatie- en emissiespectrum, maakt het mogelijk om verschillende cellulaire componenten gelijktijdig te visualiseren. Dit kan leiden tot een "overlay" van de verschillende beelden. * **Voorbeelden van fluorochromen en hun toepassingen:** * **DAPI/Hoechst:** Deze kleurstoffen binden aan DNA en worden gebruikt voor nucleaire kleuring, meestal resulterend in een blauwe fluorescentie. * **MitoTracker Red CMXRos:** Kleurt de mitochondriën in cellen rood. * **Alexa Fluor 488:** Wordt vaak geconjugeerd aan fylloïde om cytoskeletale actinefilamenten groen te kleuren. * **Photobleaching:** Dit is het proces waarbij fluorochromen permanent worden beschadigd door langdurige blootstelling aan excitatie-licht. Dit kan de signaalsterkte verminderen en beperkt de duur van de observatie. * **Confocale microscopie:** Dit is een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die optische coupes van het preparaat maakt. Het principe is gebaseerd op het gebruik van een "pinhole" (kleine opening) in de detectiebaan, die ervoor zorgt dat alleen licht afkomstig uit het brandpunt van de objectief wordt geregistreerd. Licht van buiten het brandpunt wordt onderdrukt, wat resulteert in een hogere resolutie en de mogelijkheid om scherpere beelden te verkrijgen, zelfs in dikkere monsters. * **Stack (gecombineerde optische coupes):** Door meerdere optische coupes (z-stack) van een monster te maken op verschillende dieptes en deze te combineren, kan een gedetailleerd 3D-model van het preparaat worden opgebouwd. > **Voorbeeld:** Een z-stack verkregen met confocale microscopie kan worden gebruikt om de driedimensionale distributie van eiwitten, zoals Tubulin-GFP, GPI-YFP en H2B-mCherry, in HeLa Kyoto cellen te bestuderen. Deze technieken voor contrastverhoging en fluorescentiemicroscopie zijn essentieel voor de gedetailleerde studie van cellulaire structuren, moleculaire lokalisatie en dynamische processen in biologische preparaten. --- # Methoden voor weefsel- en celbereiding Dit onderwerp behandelt de fundamentele technieken voor het verkrijgen en prepareren van weefsels en cellen voor microscopisch onderzoek. ### 3.1 Het verkrijgen van weefsels en cellen Er zijn diverse methoden om weefselmateriaal te verkrijgen voor analyse: * **Operatieve wegname:** Dit omvat het chirurgisch verwijderen van organen of grotere weefselstukken. * **Biopsie:** Een minder ingrijpende methode waarbij een klein deel van het weefsel wordt weggenomen. Dit kan op verschillende manieren gebeuren: * **Endoscopische biopsie:** Weefsel wordt tijdens een endoscopie verwijderd. * **Naaldbiopsie (punchbiopsie):** Met een holle naald of een ponsinstrument wordt een cilindervormig stukje weefsel verkregen. * **Incisie/excisie biopsie:** Een klein incisie- of excisiebiopt wordt genomen. * **Verzamelen van individuele cellen:** Cellen kunnen ook direct verkregen worden uit: * **Lichaamsvloeistoffen:** Zoals bloed, urine of sereuze vloeistoffen. * **Directe afname van oppervlakken:** Via methoden zoals een cervixbrush of mondschraper. ### 3.2 Paraffine techniek De paraffine techniek is een veelgebruikte methode voor het prepareren van weefselcoupes, waarbij de structuur van het weefsel zo goed mogelijk wordt behouden. Het proces bestaat uit de volgende stappen: 1. **Fixatie:** * **Doel:** Het stoppen van de cellulaire activiteit en het behouden van de weefselstructuur. Fixatie helpt de eiwitfunctie te beëindigen en de moleculen op hun plaats te houden. * **Veelgebruikt fixatiemiddel:** Formaldehyde is een veelgebruikte fixatief. * **Soorten fixatoren:** Er bestaan zowel enkelvoudige als samengestelde fixatoren, die elk specifieke neveneffecten kunnen hebben. 2. **Dehydratatie:** * Het weefsel wordt stapsgewijs ontwaterd door het te onderdompelen in alcoholen van oplopende concentratie (bijvoorbeeld van 70% naar 100%). 3. **Transparantisering/Ontvetting:** * Na dehydratatie wordt het weefsel transparant gemaakt, vaak met oplosmiddelen zoals tolueen of xyleen, om de alcohol te vervangen en het weefsel voor te bereiden op de inbedding. 4. **Inbedden:** * Het gedehydrateerde en getransparant gemaakte weefsel wordt ingebed in gesmolten paraffine. Na afkoeling vormt de paraffine een vaste blok waarin het weefsel zich bevindt. 5. **Snijden (sectie maken):** * De paraffineblokken worden met een microtoom gesneden tot zeer dunne coupes (doorgaans enkele micrometers dik). 6. **Deparaffinering:** * De dunne coupes moeten worden ontdaan van de paraffine om kleuringen mogelijk te maken. Dit gebeurt door de coupes opnieuw te behandelen met oplosmiddelen zoals xyleen/tolueen, gevolgd door het terugbrengen van de alcoholconcentratie in water (dalende % alcohol in water). 7. **Kleuren:** * De ontparaffineerde coupes worden gekleurd met specifieke kleurstoffen om structuren zichtbaar te maken. 8. **Monteren:** * De gekleurde coupes worden op een objectglaasje gemonteerd, bedekt met een dekglaasje en soms afgedicht met een mountant. **Tip:** De paraffine techniek is uitstekend voor het verkrijgen van gedetailleerde structurele informatie, maar kan componenten die gevoelig zijn voor oplosmiddelen of hitte (zoals bepaalde eiwitten of vetten) degraderen of oplossen. ### 3.3 Cryosectie techniek De cryosectie techniek is een snellere methode waarbij weefsel direct wordt ingevroren om coupes te maken. * **Invriezen:** Het weefsel wordt zeer snel ingevroren met behulp van vaste kooldioxide (droogijs, bij ongeveer -70°C) of vloeibare stikstof (bij ongeveer -180°C). * **Inbedden (optioneel):** Vaak wordt het ingevroren weefsel ingebed in een cryoprotectieve medium, zoals OCT (Optimal Cutting Temperature) compound. * **Bewaren en snijden:** Het bevroren weefsel of het met OCT ingebedde weefsel wordt bewaard en gesneden op een temperatuur van ongeveer -20°C met behulp van een cryostaat. * **Kwaliteit van coupes:** De coupes die met cryosectie worden verkregen, zijn doorgaans van lagere kwaliteit wat betreft fijne structurele details in vergelijking met de paraffine techniek. * **Voordelen:** * **Snelheid:** De techniek is aanzienlijk sneller dan de paraffine techniek. * **Behoud van oplosbare/labiele componenten:** Ideaal voor de detectie van componenten die door de paraffine techniek worden opgelost (bijvoorbeeld vetten) of gedenatureerd (zoals groen fluorescent proteïne - GFP). * **Detectie van enzymactiviteit:** De cryotechniek is beter geschikt voor het behouden van enzymatische activiteit. * **Mogelijkheid tot verdere analyse:** Eiwitten, RNA en DNA kunnen na cryosectie nog steeds worden geanalyseerd. **Voorbeeld:** Als men de distributie van vetten in een weefsel wil bestuderen, is cryosectie de aangewezen methode, omdat paraffine inbedding de vetten zou oplossen. ### 3.4 Kleuringen (contrasteren) Na het maken van coupes is kleuring essentieel om structuren zichtbaar te maken, aangezien de meeste biologische weefsels transparant zijn. * **Hematoxyline & Eosine (H&E):** * Dit is een van de meest gebruikte kleuringen in de histologie. * **Hematoxyline:** Kleurt zure componenten, voornamelijk de celkernen, in paars-blauw. * **Eosine:** Kleurt basische componenten, zoals het cytoplasma en intercellulaire materie, in roze. * **PAS kleuring (Periodic Acid-Schiff):** * Deze kleuring is specifiek voor koolhydraten (suikers) en slijm. * **Werkingsmechanisme:** Perjoodzuur oxideert diolen tot aldehyde groepen, die vervolgens reageren met Schiff's reagent om een roze-rode kleur te produceren. * **Toepassing:** Vaak gebruikt om slijmbekercellen in het darmkanaal te visualiseren, of om de basaalmembraan aan te tonen. **Voorbeeld:** Een darmvillus gekleurd met PAS zal de slijmbekercellen in de epitheellaag duidelijk laten zien door de gekleurde suikers in het geproduceerde slijm. De pijl op de afbeelding zou kunnen wijzen naar de basaalmembraan. ### 3.5 Gespecialiseerde technieken voor cel- en weefselanalyse Naast de basiskleuringen zijn er diverse geavanceerde technieken voor specifieke analyses: * **Autoradiografie:** * **Principe:** Radioactief gelabelde moleculen (bv. $^3\text{H}$-thymidine, dat wordt opgenomen door delende cellen) worden toegediend aan het biologische systeem. * **Detectie:** Een coupe wordt blootgesteld aan een fotografische emulsie. Zwarte zilverkorrels in de emulsie geven de locaties aan waar radioactiviteit is gedetecteerd. * **Toepassing:** Wordt gebruikt om celproliferatie of de opname van specifieke moleculen te bestuderen. **Voorbeeld:** In een lymfeknooppreparaat kunnen pijlen wijzen naar delende cellen die zichtbaar zijn gemaakt met autoradiografie na toediening van $^3\text{H}$-thymidine. * **Enzymhistochemie:** * **Principe:** Detecteert de aanwezigheid en lokalisatie van specifieke enzymen in weefselcoupes door een biochemische reactie die een zichtbaar product oplevert. * **Voorbeeld:** De detectie van peroxidase activiteit. Waterstofperoxide ($H_2O_2$) reageert in aanwezigheid van peroxidase en DAB (3,3'-diaminobenzidine) om een bruin precipitaat te vormen. Peroxidase wordt ook vaak gebruikt als label in immunocytochemie. **Voorbeeld:** Een coupe van coloncarcinoom die gekleurd is voor FANCD2, een merker die geassocieerd wordt met lymfeklier metastase, kan enzymhistochemie gebruiken. * **Immunocytochemie/Immunohistochemie:** * **Principe:** Maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan bepaalde antigenen (eiwitten) in cellen of weefsels. * **Labels:** De antilichamen zijn gekoppeld aan detecteerbare labels, zoals: * **Fluorochroom:** Bijvoorbeeld FITC, TRITC, Alexa dyes. * **Enzymen:** Zoals peroxidase. * **Colloïdaal goud:** Vaak gekoppeld aan Proteïne A van *Staphylococcus aureus*. * **Soorten antilichamen:** Er wordt gebruik gemaakt van zowel polyclonale als monoclonaal antilichamen. * **Types:** * **Directe immunocytochemie:** Het primaire antilichaam is direct gelabeld. * **Indirecte immunocytochemie:** Een gelabeld secundair antilichaam bindt aan het primaire antilichaam, wat resulteert in een sterkere signaalversterking. * **In situ hybridisatie (ISH):** * **Principe:** Detecteert specifieke nucleïnezuursequenties (DNA of RNA) binnen cellen of weefsels met behulp van complementaire, gelabelde probe-moleculen. * **Voorbeeld:** Een weefselcoupe van een goedaardige tumor kan worden onderzocht met ISH om de aanwezigheid van humaan papillomavirus (HPV) DNA te detecteren. Een bruine kleur duidt op de aanwezigheid van het virus-DNA. Vaak wordt een tegenkleuring met hematoxyline gebruikt om de celkernen te visualiseren. * **FISH (Fluorescentie In Situ Hybridisatie):** Een variant waarbij fluorescente labels worden gebruikt om nucleïnezuren te detecteren. Dit is met name nuttig voor de detectie van chromosoomaberraties. **Voorbeeld:** FISH kan gebruikt worden om trisomie 21 te detecteren, waarbij chromosoom 21 (rood) en chromosoom 13 (groen) worden gevisualiseerd. Een normaal individu zou een normale hoeveelheid van elk chromosoom laten zien. * **Elektronenmicroscopie (TEM & SEM):** * **Preparatie:** Vereist specifieke fixatie (bijvoorbeeld met glutaaraldehyde en $OsO_4$), inbedding in kunstharsen, snijden van zeer dunne coupes (ongeveer 50 nm voor TEM) op metalen gridjes, en contrasteren met zware metalen (zoals uranium en lood) om contrast te verhogen. * **TEM (Transmission Electron Microscopy):** Levert beelden van de ultrastructuur van de cel. * **SEM (Scanning Electron Microscopy):** Levert beelden van het oppervlak van het preparaat, met een hoge diepteperceptie. ### 3.6 Geavanceerde microscopietechnieken Naast de standaard licht- en elektronenmicroscopie zijn er diverse geavanceerde technieken die hogere resolutie, betere optische coupes of specifieke analyses mogelijk maken: * **Atomic Force Microscopy (AFM):** Meet de topografie van een oppervlak door een zeer fijne naald ('veer') langs het oppervlak te scannen. * **2-Foton microscopie:** Vergelijkbaar met confocale microscopie, maar met minder photobleaching door het gebruik van langere golflengtes en een specifieke excitatieprocedure. * **Lightsheet microscopie:** Geschikt voor het beeldvormen van grotere 3D-specimens met minimale fototoxiciteit. * **Superresolutie microscopie technieken:** Deze technieken doorbreken de diffractielimiet van de lichtmicroscopie, waardoor visualisatie op moleculair niveau mogelijk wordt. Voorbeelden zijn: * SIM (Structured Illumination Microscopy) * SMI (Spatially Modulated Illumination Microscopy) * PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) * STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) * NSOM (Near-Field Scanning Optical Microscopy) * STED (Stimulated Emission Depletion) microscopie --- # Kleuringstechnieken en immunomarkering Deze sectie bespreekt diverse technieken voor het visualiseren van microscopische structuren en moleculen in cellen en weefsels, met een focus op kleuringsmethoden, enzymhistochemie en immunomarkering. ### 4.1 Kleuringstechnieken Kleuringen worden gebruikt om contrast te creëren in ongekleurde preparaten, waardoor structuren beter zichtbaar worden onder de microscoop. #### 4.1.1 Hematoxyline en Eosine (H&E) H&E is een veelgebruikte kleuringstechniek in de histologie. * **Hematoxyline:** Kleurt zure componenten, zoals celkernen, paars-blauw. * **Eosine:** Kleurt basische componenten, zoals cytoplasma en extracellulaire matrix, roze. #### 4.1.2 PAS kleuring De Periodic Acid-Schiff (PAS) kleuring is specifiek voor het detecteren van koolhydraten (suikers). Het mechanisme berust op de reactie van perjoodzuur met aldehyde-groepen, die vervolgens reageren met Schiff's reagent om een gekleurd product te vormen. > **Tip:** Deze kleuring is uitermate geschikt voor het visualiseren van slijmbekercellen in het darmepitheel, waar suikers in het slijm geproduceerd worden. Het kan ook gebruikt worden om de basale membraan aan te tonen. #### 4.1.3 Autoradiografie Autoradiografie maakt het mogelijk om de locatie van radioactief gelabelde moleculen in een preparaat te visualiseren. 1. Radioactief gelabelde moleculen (bijvoorbeeld $^3$H-thymidine) worden toegediend aan het levende organisme of de celcultuur. 2. Een weefselcoupe wordt vervolgens blootgesteld aan een fotografische emulsie. 3. De radioactiviteit veroorzaakt een reactie in de emulsie, resulterend in de vorming van zwarte zilverkorrels op plaatsen waar het label aanwezig is. > **Voorbeeld:** Autoradiografie kan gebruikt worden om delende cellen in een lymfeknoop te identificeren door het toedienen van $^3$H-thymidine, dat wordt opgenomen door cellen in S-fase van de celcyclus. ### 4.2 Enzymhistochemie Enzymhistochemie maakt gebruik van enzymatische reacties binnen weefselcoupes om specifieke enzymen te lokaliseren. > **Voorbeeld:** Peroxidase-activiteit kan worden gedetecteerd door de reactie met waterstofperoxide ($H_2O_2$) en 3,3'-diaminobenzidine (DAB). Hierbij wordt water gevormd en een bruin neerslag van DAB, dat vervolgens onder de microscoop zichtbaar is. Peroxidase wordt vaak gebruikt als label in andere technieken. ### 4.3 Immunocytochemie en Immunohistochemie Immunocytochemie en immunohistochemie maken gebruik van antilichamen om specifieke antigenen (moleculen van interesse) in cellen en weefsels te detecteren. #### 4.3.1 Principes * **Antilichamen:** Dit zijn eiwitten die specifiek binden aan antigenen. Men onderscheidt: * **Polyclonale antilichamen:** Geproduceerd door verschillende B-celklonen, herkennen meerdere epitopen op hetzelfde antigeen. * **Monoclonale antilichamen:** Geproduceerd door een enkele B-celkloon, herkennen een specifiek epitoop. * **Labels:** Om de antilichaam-antigeenbinding zichtbaar te maken, worden verschillende labels gebruikt: * **Fluorochromen:** Moleculen die licht emitteren na excitatie met een specifieke golflengte (bv. FITC, TRITC, Alexa dyes). * **Enzymen:** Zoals peroxidase (bv. HRP) of alkalinische fosfatase (AP), die een substraat omzetten in een gekleurd product. * **Colloïdaal goud:** Vaak gekoppeld aan Proteïne A (van *Staphylococcus aureus*), dat kan worden gedetecteerd met specifieke methoden. #### 4.3.2 Directe immunocytochemie Bij de directe methode wordt een antilichaam direct gekoppeld aan een label. Dit antilichaam bindt aan het antigeen in het preparaat. De detectie van het label geeft de locatie van het antigeen aan. #### 4.3.3 Indirecte immunocytochemie De indirecte methode maakt gebruik van een primair antilichaam dat aan het antigeen bindt, en een secundair antilichaam dat gelabeld is en bindt aan het primaire antilichaam. Dit leidt tot signaalamplificatie omdat meerdere secundaire antilichamen aan één primair antilichaam kunnen binden. > **Tip:** Indirecte methoden bieden vaak een hogere gevoeligheid dan directe methoden vanwege de signaalamplificatie. #### 4.3.4 Immunohistochemie Immunohistochemie is specifiek de toepassing van immunocytochemische technieken op weefselcoupes. ### 4.4 In situ hybridisatie (ISH en FISH) In situ hybridisatie is een techniek om de locatie van specifieke nucleïzuursequenties (DNA of RNA) in cellen of weefsels te visualiseren. * **Nucleïnezuur sondes:** Korte, enkelstrengs stukjes DNA of RNA die complementair zijn aan de doelsequenties. * **Labels:** Deze sondes kunnen worden gelabeld met bijvoorbeeld fluorochromen of enzymen. #### 4.4.1 In situ hybridisatie (ISH) Bij de standaard ISH worden de gelabelde sondes gebruikt om de aanwezigheid van DNA of RNA te detecteren. De detectie van het label geeft de locatie van de doelsequenties aan. > **Voorbeeld:** ISH kan gebruikt worden om het DNA van virussen in geïnfecteerde cellen aan te tonen. Een tegenkleuring (bv. met hematoxyline) kan gebruikt worden om de celstructuur beter zichtbaar te maken. #### 4.4.2 Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) FISH maakt gebruik van fluorescente labels op de sondes. Dit maakt het mogelijk om verschillende sequenties tegelijkertijd te detecteren met behulp van verschillende kleuren fluorescente labels. > **Voorbeeld:** FISH kan worden toegepast voor de detectie van chromosoomaberraties. Groene en rode fluorescentie kunnen bijvoorbeeld gebruikt worden om de aanwezigheid van chromosoom 13 en chromosoom 21 aan te geven, wat nuttig is voor de diagnose van trisomie 21. --- # Geavanceerde microscopietechnieken en superresolutie Dit gedeelte behandelt geavanceerde microscopietechnieken die een hogere resolutie en meer gedetailleerde visualisatie van biologische structuren mogelijk maken, evenals methoden om de beperkingen van de klassieke lichtmicroscopie te overwinnen. ### 5.1 Geavanceerde microscopietechnieken Deze technieken bouwen voort op de principes van lichtmicroscopie, maar introduceren specifieke methoden om dieper in weefsels te kijken, het contrast te verbeteren, of specifieke structuren te isoleren. #### 5.1.1 Confocale microscopie Confocale microscopie maakt het mogelijk om optische coupes van een preparaat te verkrijgen, wat resulteert in scherpere beelden zonder de noodzaak van fysieke sneden. * **Principe:** Het kernprincipe is de introductie van een **pinhole** (klein gaatje) in de optische paden van zowel de excitatielichtbron als de detectie. * Het excitatielicht wordt gefocusseerd tot een klein puntje op het preparaat. * Fluorescentie die uit dit focuspunt komt, wordt verzameld. * Een tweede pinhole, die zich op dezelfde optische as bevindt als het focuspunt, laat alleen licht door dat afkomstig is van het punt van interesse. Licht dat uit andere, niet-gefocuste delen van het preparaat komt, wordt door deze pinhole geblokkeerd. * **Beeldvorming:** Door het preparaat punt voor punt of lijn voor lijn af te tasten en de fluorescentie-intensiteit op te nemen, kan een 2D optische coupe worden geconstrueerd. Een **stack** van deze optische coupes, verkregen door de focuspositie van de microscoop te variëren, maakt 3D-reconstructies mogelijk. * **Voordelen:** Significante verbetering van het contrast en de resolutie in de z-as (diepte) vergeleken met conventionele fluorescentiemicroscopie, waardoor de visualisatie van gedetailleerde structuren binnen cellen en weefsels mogelijk wordt. #### 5.1.2 Twee-foton microscopie (2-photon microscopy) Deze techniek is vergelijkbaar met confocale microscopie qua principe, maar maakt gebruik van twee fotonen met een lagere energie die tegelijkertijd door het preparaat dringen. * **Principe:** Twee fotonen met een golflengte die niet zelf fluorescente excitatie veroorzaakt, kunnen gezamenlijk de energie leveren om een fluorofoor te exciteren. Dit proces treedt alleen op in het zeer kleine gebied waar de twee lichtbundels elkaar kruisen en de fotondichtheid hoog genoeg is. * **Voordelen:** * **Minder fotobleaching:** Omdat excitatie alleen optreedt in het focusvlak, is er minder schade aan het omringende weefsel en minder fotobleaching van fluorochromen. * **Diepere penetratie:** De langere golflengten van het excitatielicht kunnen dieper in biologische weefsels doordringen dan kortere golflengten die in confocale microscopie worden gebruikt. Dit maakt de visualisatie van structuren in grotere, dikkere weefselmonsters mogelijk. #### 5.1.3 Lightsheet microscopie (Vlouwmicroscopie) Lightsheet microscopie, ook bekend als Vlouwmicroscopie, biedt een efficiënte manier om grote 3D biologische specimens te visualiseren met hoge resolutie en minimale fototoxiciteit. * **Principe:** Het monster wordt verlicht door een dunne "sheet" van licht, loodrecht op de kijkrichting van de detector. Alleen het deel van het monster dat door de lightsheet wordt geëxciteerd, zendt fluorescentie uit en wordt door de camera geregistreerd. * **Voordelen:** * **Hoge snelheid:** Door het monster parallel aan de lichtsheet te scannen, kunnen 3D-datasets snel worden verkregen. * **Minimale fototoxiciteit:** Slechts een dunne laag van het monster wordt tegelijkertijd geëxciteerd, wat de schade aan het monster aanzienlijk vermindert, vooral bij levende organismen of cellen die over langere perioden moeten worden gevolgd. * **Hoge resolutie:** De combinatie van efficiënte excitatie en detectie leidt tot beelden met een hoge signaal-ruisverhouding en goede resolutie. #### 5.1.4 Atomic Force Microscopie (AFM) AFM is een scanning probe microscoop die de fysieke topografie van een oppervlak op atomair niveau kan afbeelden. * **Principe:** Een scherpe punt, bevestigd aan een flexibele cantilever (een soort veertje), scant het oppervlak van het monster. De interacties tussen de punt en het oppervlak oefenen krachten uit op de cantilever, waardoor deze buigt. Een laserstraal die op de cantilever weerkaatst, detecteert deze buiging, die vervolgens wordt omgezet in een topografisch beeld. * **Voordelen:** * **Hoge resolutie:** Kan structuren met een resolutie in de nanometer- tot picometerbereik afbeelden. * **Geen labeling nodig:** Vereist geen fluorescentie- of andere markers. * **Kan meten in verschillende omgevingen:** Kan worden gebruikt in lucht, vloeistoffen of vacuüm. * **Kan mechanische eigenschappen meten:** Naast topografie kan AFM ook informatie geven over de mechanische eigenschappen van het oppervlak. ### 5.2 Superresolutie microscopie Superresolutie microscopie technieken overwinnen de diffractielimiet van licht, die de resolutie van conventionele lichtmicroscopen beperkt tot ongeveer 200-250 nanometer. Deze technieken maken het mogelijk om individuele moleculen te visualiseren en structuren op een resolutie die significant lager is dan de golflengte van het gebruikte licht. #### 5.2.1 Structured Illumination Microscopy (SIM) SIM verhoogt de effectieve resolutie door gebruik te maken van gestructureerde belichting patronen. * **Principe:** Het monster wordt belicht met patronen van licht (bijvoorbeeld lijnen of rasters) onder verschillende oriëntaties en posities. Deze gestructureerde patronen creëren moiré-patronen met de fijne structuren in het monster. Door de moiré-patronen op te nemen en deze met geavanceerde algoritmen te analyseren, kunnen hogere frequenties (die overeenkomen met fijnere details) worden gereconstrueerd die normaal gesproken buiten het diffractielimiet vallen. * **Resolutieverbetering:** SIM kan de resolutie tot ongeveer 100-140 nanometer verbeteren. * **Voordelen:** Relatief eenvoudig te implementeren op bestaande microscopen en geschikt voor het beeldvormen van levende cellen met beperkte fototoxiciteit. #### 5.2.2 Spatially Modulated Illumination Microscopy (SMI) SMI is een variant van SIM die ook gebruik maakt van gepatroonde belichting. Het kan een resolutieverbetering tot ongeveer 130 nanometer bereiken. #### 5.2.3 Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy STED microscopie bereikt superresolutie door gebruik te maken van een gefocuste laserbundel die, naast de excitatiebundel, een donutvormige "depletion" bundel genereert. * **Principe:** * Een conventionele excitatiebundel brengt fluorofoor moleculen in een aangeslagen toestand. * Een tweede, donutvormige **depletion** bundel (met een langere golflengte) wordt tegelijkertijd aangezet. Deze bundel dooft de fluorescentie van moleculen die zich buiten het centrum van de donut bevinden door gestimuleerde emissie. * Alleen de moleculen in het kleine, centrale gebied van de donut kunnen fluoresceren. * Door de excitatie- en depletionbundels systematisch over het monster te scannen, kan een beeld worden gevormd met een resolutie die afhankelijk is van de intensiteit van de depletion bundel, en die veel hoger is dan de diffractielimiet. * **Resolutieverbetering:** STED kan resoluties bereiken van ongeveer 20-50 nanometer. * **Voordelen:** Hoge resolutie en relatief snelle beeldvorming, wat het geschikt maakt voor het bestuderen van dynamische processen in levende cellen. #### 5.2.4 Photoactivated Localization Microscopy (PALM) en STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) PALM en STORM zijn technieken die berusten op het probabilistisch aan- en uitzetten van individuele fluorescente moleculen in het monster en het nauwkeurig lokaliseren van hun positie. * **Principe:** * Het monster wordt gelabeld met speciale fluorescente eiwitten of moleculen die onder specifieke omstandigheden kunnen worden geactiveerd om te fluoresceren, en vervolgens weer kunnen worden uitgezet. * In plaats van alle moleculen tegelijk te exciteren, wordt slechts een kleine, willekeurige subset van moleculen tegelijkertijd geactiveerd om te fluoresceren. * De exacte positie van elk emitterende molecuul wordt bepaald door de positie van zijn diffractiepiek te analyseren. De nauwkeurigheid van deze lokalisatie kan tot enkele nanometers bedragen. * Door duizenden van deze beelden te verzamelen van verschillende sets van geactiveerde moleculen, wordt een superresolutiebeeld opgebouwd door de gelokaliseerde posities van alle moleculen samen te voegen. * **Resolutieverbetering:** PALM en STORM kunnen resoluties bereiken van ongeveer 10-20 nanometer. * **Voordelen:** Bieden extreem hoge resolutie, waardoor individuele moleculen en hun onderlinge posities kunnen worden bestudeerd. * **Nadelen:** Vereisen langere opnametijden omdat veel afzonderlijke beelden moeten worden verzameld, wat de toepassing op levende cellen kan beperken. PALM maakt gebruik van foto-activeerbare eiwitten, terwijl STORM vaak foto-omschakelbare fluorochromen gebruikt. > **Tip:** Hoewel alle superresolutie technieken de diffractielimiet doorbreken, hebben ze verschillende sterke en zwakke punten. De keuze van de techniek hangt af van de specifieke onderzoeksvraag, de aard van het monster en de vereiste tijdsresolutie. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Condensor | Het lenzencollectief onder het objectglas dat het licht bundelt en de verlichting van het preparaat regelt. Het zorgt voor een geconcentreerd en uniform licht dat door het monster schijnt. | | Objectief | De lens die zich het dichtst bij het te observeren preparaat bevindt en het primaire vergrote beeld vormt. De kwaliteit van het objectief is cruciaal voor de resolutie van de microscoop. | | Oculair | Het lenzencollectief waardoor de observator kijkt; het vergroot het door het objectief gevormde tussenbeeld verder. De totale vergroting van de microscoop is het product van de vergroting van het objectief en het oculair. | | Resolutie | De kleinste afstand tussen twee afzonderlijke punten die nog als zodanig waargenomen kunnen worden. Een hogere resolutie betekent dat fijnere details zichtbaar zijn. | | Numerieke apertuur (NA) | Een maat voor het lichtverzamelend vermogen van een lens, met name het objectief. De NA is afhankelijk van de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het preparaat en de halfgrootte van de openingshoek van de lens. Een hogere NA leidt tot een betere resolutie. | | Lege vergroting | Vergroting waarbij het beeld groter wordt weergegeven, maar er geen nieuwe details meer zichtbaar worden. Dit gebeurt wanneer de vergroting verder gaat dan wat de resolutie van het optische systeem toelaat. | | Helderveldmicroscopie | Een standaard microscopietechniek waarbij het preparaat wordt verlicht vanuit een heldere achtergrond. Monsters die licht absorberen of verstrooien, verschijnen donker tegen een heldere achtergrond. | | Fasecontrastmicroscopie | Een techniek die verschillen in brekingsindex en optische dikte in doorschijnende monsters zichtbaar maakt, wat leidt tot een contrast dat niet zichtbaar zou zijn in helderveldmicroscopie. Het kan een halo-effect rond de structuren veroorzaken. | | Interferentiecontrastmicroscopie | Een geavanceerde techniek die het contrast in doorzichtige monsters verhoogt door gebruik te maken van interferentieprincipes. Dit kan leiden tot een pseudo-reliëfeffect op het beeld, waardoor oppervlaktestructuren beter zichtbaar worden. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopietechniek die gebruik maakt van de fluorescentie van stoffen in het preparaat. Deze stoffen, fluorochromen, absorberen licht van een bepaalde golflengte en zenden het weer uit op een langere golflengte, wat resulteert in een helder beeld tegen een donkere achtergrond. | | Epifluorescentie | Een methode binnen de fluorescentiemicroscopie waarbij de excitatie- en emissielichtpaden van het monster gescheiden zijn. Het licht wordt van bovenaf op het monster gericht en de fluorescentie wordt van dezelfde kant gedetecteerd. | | Photobleaching | Het proces waarbij fluorochromen beschadigd raken door langdurige blootstelling aan excitatie licht, waardoor hun fluorescentie permanent afneemt of verdwijnt. Dit kan de levensduur van fluorescentie-experimenten beperken. | | Confocale microscopie | Een optische beeldvormingstechniek die beelden genereert door een punt-voor-punt scan van het monster. Een pinhole filter verwijdert onscherp licht, waardoor een optische coupe met hoge resolutie en contrast wordt verkregen. | | Optische coupe | Een dunne, scherpe doorsnede van een specimen verkregen door confocale microscopie of vergelijkbare technieken, waarbij onscherpte van boven- en onderliggende lagen wordt geëlimineerd. | | Paraffine techniek | Een methode voor weefselbereiding waarbij weefsel wordt gefixeerd, gedehydrateerd, ingebed in gesmolten paraffine, ingevroren en vervolgens in dunne coupes gesneden. Dit maakt langdurige conservering en gedetailleerde kleuring mogelijk. | | Fixatie | Het proces waarbij biologisch materiaal wordt behandeld met chemicaliën om de cellulaire structuur te preserveren en de afbraak door enzymen te stoppen. Dit stabiliseert eiwitten en andere moleculen op hun plaats. | | Dehydratatie | Het verwijderen van water uit weefselmonsters, meestal door opeenvolgende stappen in oplopende concentraties alcohol, voordat het monster wordt ingebed in een medium zoals paraffine of hars. | | Deparaffinering | Het omgekeerde proces van dehydratatie, waarbij paraffine uit weefselcoupes wordt verwijderd met behulp van oplosmiddelen zoals xyleen, zodat de coupes kunnen worden gekleurd in een waterige oplossing. | | Cryosectie techniek | Een methode waarbij weefsel snel wordt ingevroren en vervolgens in dunne plakjes wordt gesneden zonder fixatie of inbedding in paraffine. Dit is sneller en beter voor het detecteren van componenten die gevoelig zijn voor oplosmiddelen of denaturatie. | | Hematoxyline en Eosine (H&E) | Een veelgebruikte dubbele kleuring in de histologie. Hematoxyline kleurt celkernen paars-blauw (basofiel), terwijl eosine de cytoplasma en extracellulaire componenten roze kleurt (eosinofiel). | | PAS kleuring (Periodiek-zuur-Schiff) | Een kleuringstechniek die specifieke koolhydraten, zoals glycogeen en mucines, in weefsels detecteert. Het reageert met aldehydegroepen die na oxidatie met periodiek zuur worden gevormd. | | Autoradiografie | Een techniek waarbij radioactief gelabelde moleculen aan een organisme worden toegediend en hun verdeling in weefsels wordt gevisualiseerd met behulp van fotografische emulsie die reageert op de radioactiviteit. | | Enzymhistochemie | Een techniek die de lokalisatie van enzymactiviteit in weefsels of cellen bestudeert door een specifieke biochemische reactie te laten plaatsvinden die leidt tot een detecteerbaar product, zoals een kleuring of een neerslag. | | Immunocytochemie | Een techniek die antilichamen gebruikt om specifieke antigenen (eiwitten of andere moleculen) binnen cellen te detecteren en te lokaliseren. Dit kan direct of indirect gebeuren met behulp van labels. | | Immunohistochemie | Vergelijkbaar met immunocytochemie, maar dan toegepast op weefselcoupes om de lokalisatie van antigenen in de weefselstructuur te bestuderen. | | In situ hybridisatie (ISH) | Een techniek die wordt gebruikt om de aanwezigheid van specifieke nucleïnezuursequenties (DNA of RNA) binnen cellen of weefsels te detecteren met behulp van complementaire, gelabelde sondes. | | FISH (Fluorescentie In Situ Hybridisatie) | Een variant van ISH die fluorescerende labels gebruikt om nucleïnezuren te detecteren. Het wordt vaak gebruikt om chromosoomafwijkingen, genamplificatie of de lokalisatie van specifieke genen te identificeren. | | TEM (Transmissie Elektronenmicroscopie) | Een microscopietechniek die elektronenbundels gebruikt om een beeld te vormen van een ultradun specimen. Elektronen die door het specimen heen gaan, worden gedetecteerd, waardoor hoge resolutie beelden van interne structuren mogelijk zijn. | | SEM (Scanning Elektronenmicroscopie) | Een microscopietechniek waarbij een gefocuste elektronenbundel het oppervlak van een specimen aftast. De gedetecteerde secundaire of teruggekaatste elektronen creëren een beeld van het oppervlak van het monster met een grote scherptediepte. | | AFM (Atomic Force Microscopie) | Een type scanning probe microscopie dat met een uiterst fijne punt (probe) het oppervlak van een monster aftast en topografische informatie genereert op atomair of moleculair niveau. | | Superresolutie microscopie | Een groep geavanceerde microscopietechnieken die de limieten van de klassieke optische resolutie overwinnen, waardoor structuren kleiner dan de diffractielimiet van licht zichtbaar worden gemaakt. Voorbeelden zijn STED, PALM en STORM. |