01 inleiding & techniek 25-26 & notes.pdf

# Methoden en materialen voor celcultuur in wetenschappelijk onderzoek Het succesvol uitvoeren van celcultuuronderzoek vereist een nauwgezette selectie en correct gebruik van diverse methoden en materialen om een in vitro omgeving te creëren die vergelijkbaar is met de in vivo situatie [11](#page=11). ### 1.1 Fasen van celcultivering Het proces van het creëren van een cellijn uit weefsel, zoals een orgaan of tumor, is essentieel om onderzoek te vereenvoudigen. De stappen omvatten [9](#page=9): * Enzymatische behandeling van het weefsel [9](#page=9). * Centrifugeren van de cellen om ze te laten bezinken [9](#page=9). * Uitplaatsten van de cellen in een geschikt groeirecipiënt, zoals een petrischaal [9](#page=9). * Hoop dat de cellen deze behandeling overleven en in staat zijn uit te groeien [9](#page=9). * Indien een confluente laag cellen is bereikt, worden de cellen losgemaakt en gesplitst [9](#page=9). ### 1.2 Typische celculturen Celculturen kunnen worden geobserveerd als monolaagculturen van epitheelcellen, waarbij kolonies ontstaan uit individuele cellen. Een voorbeeld hiervan is een opname met hoge vergroting waarbij elke witte lijn de celrand toont, en een opname met lage vergroting die laat zien hoe een kolonie uit één cel ontstaat en uit meerdere cellen bestaat [10](#page=10). ### 1.3 Cultuurcondities Om ervoor te zorgen dat cellen die in vitro groeien vergelijkbaar zijn met cellen in het lichaam (in vivo), moeten de cultuurcondities juist zijn [11](#page=11). #### 1.3.1 Groeimedia * **MEM (Minimum Essential Medium)** bevat: * Isotonische zouten, zoals het NaHCO3/H2CO3-buffersysteem dat ook in bloed voorkomt [11](#page=11). * Een energiebron, namelijk glucose [11](#page=11). * Essentiële aminozuren en vitamines, die het lichaam niet zelf kan synthetiseren [11](#page=11). * Serum, wat nagenoeg essentieel is, maar een duur natuurproduct is met kwaliteitsvariatie [11](#page=11). * Andere klassieke celmedia zijn onder andere DMEM, M199, McCoy’s, en RPMI1640 [11](#page=11). #### 1.3.2 CO2-atmosfeer De culturen moeten worden gegroeid onder een atmosfeer van 5% CO2 in lucht. Dit percentage CO2 is vergelijkbaar met het CO2-gehalte in bloed en weefselvochten, terwijl de normale atmosfeer slechts 0,03% CO2 bevat. Dit is cruciaal voor het bereiken van een optimale pH van 7,4 [11](#page=11). ### 1.4 Cultuurrecipiënten Verschillende soorten recipiënten worden gebruikt voor celkweek, afhankelijk van de toepassing en incubatiecondities [12](#page=12). * **Gesloten flessen (bv. Falcons)**: Deze worden gebruikt in warme kamers. Voor het creëren van de juiste CO2-concentratie wordt CO2 toegevoegd voordat de fles wordt afgesloten [12](#page=12). * **Open platen**: Deze worden gebruikt in CO2-ovens [12](#page=12). * **Rollerflessen**: Deze bieden een groot oppervlak voor celgroei met een relatief kleine hoeveelheid medium en worden gebruikt in de warme kamer [12](#page=12). * **CO2-ovens**: Deze faciliteiten huisvesten de cultuurplaten onder gecontroleerde omstandigheden [12](#page=12). ### 1.5 Groeisubstraten en -procedures Groeisubstraten zijn fysische dragers die cellen beschermen tegen anoïkis, een vorm van geprogrammeerde celdood (apoptose). Ze zijn essentieel voor adherente celculturen, wat van toepassing is op de meeste celtypes, maar niet op circulerende bloedcellen of bepaalde tumorcellen [15](#page=15). #### 1.5.1 Materie van groeisubstraten Diverse materialen kunnen als groeisubstraat dienen: * **Glas**: Van nature negatief geladen [15](#page=15). * **Voorbehandeld polystyreen**: Gebruikt in microplaten, flessen, multiplaten, rollers en beads [15](#page=15). * **Coatings**: Zoals poly-D-lysine (sterk positief geladen) en collageen (een eiwit van de extracellulaire matrix, ECM) [15](#page=15). * **Geconditioneerd milieu**: Kan continu gevormd worden door feedercelculturen. Deze feedercellen zijn vaak geïnhibeerd voor celdeling (bv. door beperkte irradiatie met gamma-stralen), maar behouden hun celmetabolisme [15](#page=15). #### 1.5.2 Belang van substraten en procedures Pogingen worden ondernomen om in vitrocondities zo veel mogelijk te laten lijken op de in vivo situatie. Soms worden cellen gekweekt op een eiwit van de ECM. Cellen kunnen ook signalen of stoffen van omringende cellen nodig hebben. Dit kan nagebootst worden door [15](#page=15): 1. Het gebruiken van medium van bijvoorbeeld een moedercultuur [15](#page=15). 2. Het kweken van cellen op een feedercellaag [15](#page=15). ### 1.6 Oorsprong van cellen en cellijnen Cellen en cellijnen die in onderzoek worden gebruikt, kunnen afkomstig zijn uit verschillende bronnen: * **Andere laboratoria**: Uitgewisselde culturen [14](#page=14). * **Eigen isolatie**: Primaire culturen die vers worden geïsoleerd uit weefsels [14](#page=14). * **Celbanken**: Gecertificeerde collecties van cellijnen, zoals ATCC (The American Type Culture Collection) en ECACC (The European Collection of Cell Cultures) [14](#page=14). ### 1.7 Voorbeelden van celcultuurprotocollen De literatuur beschrijft diverse specifieke protocollen voor celcultuur en de bijbehorende methoden en apparatuur [13](#page=13). * **Celcultuur en fluorescente kleurstoffen**: Gebruik van confocale microscopie systemen (bv. Olympus FV300 FluoView) met specifieke lenzen (bv. 60×, 1.4 NA PlanApo), lasers (bv. argon/krypton Omnichrome 488/568/647), en instellingen voor laserintensiteit, confocale apertuur en pixel dwell times. Cellen werden geïncubeerd in DME met hoge glucose, L-glutamine en pyridoxine HCl, zonder natrium pyruvaat, aangevuld met fetale kalfsserum, nerve growth factor en natrium pyruvaat. Temperatuur werd gehandhaafd op 37°C met een geforceerde luchtverwarmer. Embryonale dag 14 kippen DRG neuronen werden gekweekt op poly-L-ornithine/laminine gecoate glazen dekglaasjes [13](#page=13). * **Celcultuur en immunofluorescentiemicroscopie**: Menselijke osteosarcoma (U2OS) cellen werden onderhouden in Dulbecco's modified Eagle’s medium aangevuld met fetale runderserum, L-glutamine, penicilline en streptomycine. Voor immunofluorescentie werden de U2OS cellen op dekglaasjes geplaatst die vooraf waren gecoat met fibronectine [13](#page=13). * **Primaire celkweek**: Primaire RASMCs (rat aorta smooth muscle cells) werden gekweekt in DME met fetale bovine serum (FBS), penicilline, streptomycine en Hepes (pH 7,4). Deze cellen werden gepasseerd om de 3 tot 5 dagen en gebruikt tussen 4 en 8 passages. Primaire MASMCs (muis aorta smooth muscle cells) werden geoogst uit aortas, geëvalueerd met een α-smooth muscle actin antilichaam, en gekweekt in DME met FBS, penicilline en streptomycine. Deze werden gepasseerd om de 2 tot 4 dagen en gebruikt tussen 4 en 8 passages. Cellijnen zoals A7r5, 3T3, en 293T werden gekweekt in DME met FBS. ATII, bFGF, en PDGF-BB werden verkregen uit commerciële bronnen. Voor stimulatie-experimenten werden cellen quiescent gemaakt door incubatie in medium met paarden serum gedurende 72 uur, alvorens FBS of groeifactor toe te voegen. Controlecultures ontvingen een equivalent volume vehicle. Whole cellular protein werd geëxtraheerd op de ingestelde tijdstippen [13](#page=13). > **Tip:** Het correct noteren van de oorsprong van cellijnen is van cruciaal belang voor reproduceerbaarheid in wetenschappelijk onderzoek. Gebruik altijd de officiële namen van celbanken zoals ATCC of ECACC [14](#page=14). * * * # Celgroei en deling in cultuur Cellen in cultuur vertonen specifieke groeipatroon en delingsmechanismen die sterk beïnvloed worden door de kweekcondities en hun intrinsieke eigenschappen. ### 2.1 Principes van celgroei in cultuur #### 2.1.1 Celdichtheid-afhankelijke inhibitie (Contactinhibitie) Cellen in cultuur delen normaal gesproken totdat ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Op dit punt treedt contactinhibitie van celproliferatie op, mede door concurrentie voor groeifactoren (mitogenen). Dit proces zorgt ervoor dat de celdeling stopt zodra de cellen elkaar raken en de beschikbare ruimte volledig is benut [17](#page=17). * **Tip:** Het toevoegen van vers kweekmedium kan de delingen opnieuw opstarten, omdat dit de concentratie aan groeifactoren verhoogt [17](#page=17). #### 2.1.2 Groei in 3D-structuren Tumorcellen kunnen afwijken van dit patroon en de neiging hebben om ook in drie dimensies (3D) te groeien, bijvoorbeeld in dense foci. Dit fenomeen duidt vaak op een verlies van contactinhibitie, waardoor tumorcellen zich ongecontroleerd ophopen en "klontjes" of "hoopjes" vormen [18](#page=18). * **Voorbeeld:** MDCK cellen, epitheelcellen van het nierkanaal van honden, kunnen zowel in een 2D-cultuur op een filter groeien als in een omgeving met specifieke extracellulaire componenten die de vorming van cysten (3D-structuren) bevorderen. Dit illustreert hoe kweekomstandigheden de groeipatroon kunnen sturen en hoe eiwitten zich apicaal of basolateraal kunnen positioneren in deze 3D-structuren [19](#page=19). ### 2.2 Celtransfer en splitsen van culturen Om een celcultuur te onderhouden en te laten voortduren, is het noodzakelijk om de cellen te splitsen, vooral wanneer ze een confluente laag hebben bereikt. Dit proces, ook wel celtransfer genoemd, is essentieel voor zowel suspensie- als adherente celculturen [17](#page=17) [20](#page=20). #### 2.2.1 Celtransfer bij suspensieculturen Bij suspensieculturen, waar cellen vrij in het medium zweven, gebeurt de verdunning door eenvoudige verdunning van de cel-suspensie in vers medium. Dit kan eventueel na zacht afcentrifugeren en heropname in nieuw medium plaatsvinden [20](#page=20). #### 2.2.2 Celtransfer bij adherente cellen Voor adherente cellen vindt celtransfer plaats zodra confluentie van de celmonolaag optreedt, gemiddeld om de 3 tot 7 dagen [20](#page=20). * **Procedure:** 1. De celcultuur wordt behandeld met een oplossing van trypsine/EDTA (TE) [20](#page=20). 2. **Trypsine:** Dit is een maagprotease dat bij korte blootstelling de oppervlakte-eiwitten van de cellen degradeert [20](#page=20). 3. **EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat):** Dit cheleert calcium- en magnesiumionen, wat essentieel is voor zowel intercellulaire adhesie als de binding van cellen aan het substraat [20](#page=20). 4. Door deze behandeling komen de cellen los van het substraat en van elkaar, waardoor ze een suspensie van levende, opgebolde cellen vormen [20](#page=20). 5. De suspensie wordt geoptimaliseerd om monocellulair te zijn, zonder meercellige aggregaten [20](#page=20). 6. Deze suspensie wordt vervolgens verdund (uitgesplitst) en uitgezaaid in nieuwe recipiënten. De verdunningsfactor varieert typisch van 1 over 3 voor normale cellen tot 1 over 30 voor tumorale cellen [20](#page=20). 7. Resterend trypsine wordt geïnhibeerd door protease-inhibitoren, die van nature aanwezig zijn in het serum van het kweekmedium [20](#page=20). * **Tip:** De combinatie van trypsine en EDTA is cruciaal omdat trypsine de cel-cel verbindingen verbreekt door proteïnen te denatureren, terwijl EDTA de cel-substraat verbindingen verstoort door de noodzakelijke divalentie ionen (Ca$^{2+}$, Mg$^{2+}$) weg te vangen. * * * # Apparatuur en faciliteiten voor celkweek Dit onderdeel behandelt de essentiële apparatuur en faciliteiten die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van celkweek experimenten, met de nadruk op de principes van celadhesie en -spreiding. ### 3.1 Celadhesie en -spreiding Celadhesie en -spreiding zijn cruciale processen die plaatsvinden nadat cellen zijn losgemaakt en uitgeplaatst op een substraat. Dit proces omvat verschillende stappen [22](#page=22): * **Gravitationele uitzakking:** Cellen zakken aanvankelijk uit onder invloed van de zwaartekracht [22](#page=22). * **Initieel contact met het substraat:** Cellen maken een eerste contact met het substraat, waarbij het adhesieoppervlak nog minimaal is omdat de cellen opgebold zijn [22](#page=22). * **Progressieve spreiding:** In de uren die volgen, ondergaan de cellen een proces van geleidelijke spreiding over het substraat. Dit vereist energie en veranderingen in het cytoskelet, wat leidt tot een vergroting van het celcontact-oppervlak en een versterking van de cel-substraatsadhesie [22](#page=22). * **Sterke binding met het substraat:** Uiteindelijk vormen cellen een sterke binding met het substraat door dit te modificeren met zelf aangemaakte extracellulaire matrix (ECM) moleculen [22](#page=22). Ondanks de sterke cel-substraatsadhesie, kunnen cellen doorgaans (langzaam maar zeker) migreren over het celoppervlakte. Dit gebeurt door tijdelijke inhibitie van de celadhesie op een bepaalde locatie (waar de cel loskomt) en gelijktijdige opbouw van adhesie elders, in de richting van de migratie [22](#page=22). > **Tip:** Het begrijpen van deze stappen is essentieel voor het optimaliseren van celgroei en -gedrag in cultuur, vooral bij het beoordelen van de vitaliteit en morfologie van cellen onder een microscoop, zoals geïllustreerd met muisfibroblasten op verschillende tijdstippen na uitplating [22](#page=22). ### 3.2 Laminaire flowbench De laminaire flowbench is een fundamenteel stuk apparatuur in celkweeklaboratoria. Het biedt een steriele werkomgeving door middel van een ingebouwd steriliserend HEPA-filter (High Efficiency Particulate Air). Dit filter verwijdert deeltjes uit de lucht, waardoor het risico op contaminatie van celculturen wordt geminimaliseerd [23](#page=23). > **Tip:** Werk altijd binnen de laminaire flowbench voor alle handelingen waarbij de celcultuur aan de omgeving wordt blootgesteld, zoals het overbrengen van media, het uitzademen van cellen, of het toevoegen van reagentia. ### 3.3 CO2-oven De CO2-oven, ook wel een incubator genoemd, is een ander essentieel facilitair apparaat voor celkweek. Deze incubatoren zijn uitgerust met een steriliserend HEPA-filter om de interne omgeving te zuiveren. Ze reguleren nauwkeurig de temperatuur (meestal $37^{\\circ}$C) en de CO2-concentratie (meestal 5%) die nodig zijn voor optimale celgroei en -metabolisme. De CO2-regeling is cruciaal voor het handhaven van de pH van het celkweekmedium, dat vaak buffert met een bicarbonaat-CO2-systeem [23](#page=23). ### 3.4 Opslag van ingevroren cellen Voor langdurige opslag van celculturen wordt gebruik gemaakt van cryogene opslagfaciliteiten. Cellen worden ingevroren in speciale cryoprotectieve media en bewaard in vloeibare stikstof bij een temperatuur van $-196^{\\circ}$C. Dit proces behoudt de levensvatbaarheid van de cellen voor onbepaalde tijd [23](#page=23). ### 3.5 CTC core De CTC core in The Core (UZ campus) vertegenwoordigt een geavanceerde faciliteit die beschikt over meerdere laminaire flowbenches. Met 17 flowbenches is deze locatie uitgerust om complexe celkweekexperimenten op grote schaal uit te voeren en de benodigde steriele werkomgevingen te garanderen [24](#page=24). * * * # Stamceltypen en hun eigenschappen Stamcellen zijn veelzijdige cellen die de kern vormen van ontwikkeling en weefselherstel, gekenmerkt door hun vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie in gespecialiseerde celtypen. ### 4.1 Definitie en kern eigenschappen van stamcellen Een stamcel is gedefinieerd als een cel met het vermogen om zich continu te delen en te differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen en weefsels [27](#page=27). Stamcellen bezitten twee fundamentele eigenschappen: 1. **Zelfvernieuwing:** Het vermogen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te maken [28](#page=28). 2. **Differentiatie:** Het vermogen om te ontwikkelen tot de volwassen celtypen die onze organen en weefsels vormen [28](#page=28). ### 4.2 Totipotente stamcellen Totipotente stamcellen worden waargenomen in de vroege uren na de bevruchting, wanneer de bevruchte eicel zich deelt in twee cellen. Een stamcel wordt als "totipotent" beschouwd als deze het potentieel heeft om zich te ontwikkelen tot een volledige foetus [28](#page=28). > **Voorbeeld:** De bevruchte eicel deelt zich initieel, en elke resulterende cel kan nog steeds tot een volledige foetus uitgroeien [28](#page=28). ### 4.3 Pluripotente stamcellen Na ongeveer vier dagen van celdeling doorloopt de bevruchte eicel meerdere delingscycli, wat resulteert in ongeveer 140 totipotente stamcellen. Deze vormen een holle bol die bekend staat als een blastocyst. De cellen aan de binnenkant van deze holle bol vormen de binnenste celmassa (ICM). Wanneer de blastocyst zich in de baarmoeder nestelt, differentiëren de buitenste cellen van de blastocyst in de cellen die verantwoordelijk zijn voor de vorming van de placenta. De binnenste celmassa wordt vervolgens een foetus. Omdat de binnenste celmassa zich niet tot een foetus kan ontwikkelen zonder de placenta, zijn deze cellen niet totipotent, maar pluripotent. Dit betekent dat ze de potentie hebben om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen [29](#page=29). > **Voorbeeld:** De binnenste celmassa (ICM) van de blastocyst is pluripotent [29](#page=29). ### 4.4 Multipotente stamcellen De individuele cellen binnen de binnenste celmassa worden geleidelijk aan meer gespecialiseerd. Hemopoëtische stamcellen zijn een voorbeeld van multipotente stamcellen. Deze cellen hebben het potentieel om zich te ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen. Echter, hun differentiatie is beperkt tot de ontwikkeling van bloedcellen [30](#page=30). > **Voorbeeld:** Hemopoëtische stamcellen kunnen differentiëren tot rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen [30](#page=30). * * * # Voorbereiding en observatie van cellen en weefsels voor microscopie Het doel van de voorbereiding en observatie van cellen en weefsels voor microscopie is om deze observeerbaar te maken voor lichtmicroscopie (LM) of elektronenmicroscopie (EM) door problemen met lichtdoorlatendheid en contrast op te lossen [42](#page=42). ### 5.1 Noodzaak van histologische technieken Biologisch materiaal is vaak te dik om licht of elektronen door te laten. Bovendien bevat het te weinig contrastverhogende componenten om structuurdetails waar te nemen. Histologische technieken maken het mogelijk om weefsels voldoende dun te snijden en contrast aan te brengen, zodat structuurdetails zichtbaar worden. Het gebruik van coupes is essentieel om subcellulaire details waar te nemen [42](#page=42) [43](#page=43) [44](#page=44). ### 5.2 Procedure voor paraffine coupes De procedure voor het maken van paraffine coupes omvat de volgende stappen [43](#page=43): * **Fixatie:** Een klein stukje weefsel wordt gefixeerd, meestal via immersiefixatie [43](#page=43). * **Dehydratatie:** Het weefsel wordt ontwaterd [43](#page=43). * **Inbedding:** Het weefsel wordt in vloeibare paraffine geplaatst [43](#page=43). * **Snijden:** Met een microtoom worden secties gesneden met een dikte variërend van 0,5 tot 50 micrometer (μm) [43](#page=43). * **Kleuren:** De secties worden op een microscoopglaasje gekleurd [43](#page=43). > **Voorbeeld:** H/E (Hematoxyline & Eosine) kleuring is een veelgebruikte methode die details van celkernen en cytoplasma zichtbaar maakt [44](#page=44). ### 5.3 Kwaliteitscontrole van celcultures: contaminatie en stabiliteit Naast de voorbereiding van weefsels voor microscopische analyse, is kwaliteitscontrole van celcultures cruciaal. #### 5.3.1 Contaminatie met micro-organismen Contaminatie met micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en vooral antibiotica-resistente mycoplasma’s (pleuropneumonia-like organisms, PPLO) is een significant probleem. Mycoplasma’s zijn parasitair, deels intracellulair, verstoren het cellulaire metabolisme (vaak door verzuring van het milieu), zijn moeilijk detecteerbaar (via cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA, PCR-detectie) en vaak moeilijk elimineerbaar [37](#page=37). > **Effecten van mycoplasma contaminatie:** Mycoplasma’s kunnen diverse effecten hebben op eukaryote cellen, waaronder veranderingen in eiwit-, RNA- en DNA-synthese, metabolisme, chromosomale afwijkingen, celmembraancompositiesamenstelling, morfologie, lymfocytenactivatie, cytokine-expressie, viruspropagatie, signaaltransductie, cellulaire transformatie en proliferatiekenmerken, wat kan leiden tot totale degeneratie van de kweek. Bij hybrideoma's kunnen ze cel fusie, selectie van fusieproducten, screening van monoklonale antistofreactiviteit beïnvloeden, resulteren in antistoffen tegen mycoplasma in plaats van het doelantigeen, en de opbrengst van monoklonale antistoffen verminderen [38](#page=38). #### 5.3.2 Contaminatie met vreemde cellen Vreemde cellen, zoals cellijnen afkomstig van andere soorten, zijn ook een veelvoorkomend en onderschat probleem. Veel "oude" cellijnen zijn varianten van HeLa, afgeleid van een humane cervix-tumor. Het is ook voorgekomen dat "menselijke" cellijnen eigenlijk van muis of rat afkomstig bleken te zijn. Detectie hiervan kan gebeuren door genetische fingerprinting en karyotypering [37](#page=37). #### 5.3.3 Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit De (genetische) zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kunnen worden gemeten door karyotypering, waarbij het aantal en de vorm van chromosomen in individuele cellen worden bepaald [39](#page=39). #### 5.3.4 Inherente genetische instabiliteit Het genotype (weerspiegeld in chromosoomvorm en -aantal) van gekweekte cellen is vaak evoluerend van slecht naar slechter. Dit is niet te vermijden maar wel beperkbaar door regelmatig terug te keren naar stock-cultures, die ingevroren zijn met anti-kristallijn cryoprotectief middel zoals glycerol of DMSO in vloeibare stikstof bij -196°C [40](#page=40). * * * # Specifieke kleurtechnieken in histologisch onderzoek Dit hoofdstuk beschrijft verschillende specifieke kleurtechnieken die gebruikt worden in histologisch onderzoek om bepaalde structuren of moleculen binnen weefsels zichtbaar te maken, waaronder indifferente kleurstoffen, immunohistochemische kleuringen en enzymkleuringen. ### 6.1 Indifferente kleurstoffen Indifferente kleurstoffen zijn substanties die vetten aankleuren. Een voorbeeld hiervan is Oil Red O, een kleurstof die gebruikt wordt om vetcellen zichtbaar te maken [68](#page=68) [69](#page=69). ### 6.2 Immunohistochemische kleuring Immunohistochemische kleuringen maken gebruik van de specifieke binding tussen een antigeen en een antilichaam om bepaalde bestanddelen in een weefsel aan te kleuren. Het antilichaam wordt hierbij gekoppeld aan een kleurstof, een fluorescente label of colloïdaal goud [68](#page=68). #### 6.2.1 Voorbeelden van immunohistochemische kleuringen * **Specifiek microtubuli** [70](#page=70). * **Specifiek connexine 43** op een coupe van muishart [70](#page=70). Een veelgebruikte methode binnen de immunocytochemie is de **DAB-kleuring** (3,3'-diaminobenzidine) [70](#page=70). ### 6.3 Enzymkleuringen Enzymkleuringen tonen de activiteit van specifieke enzymen aan door gebruik te maken van een voor het enzym specifiek substraat. De reactie van het substraat met het enzym resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag, die zichtbaar gemaakt kan worden [68](#page=68). #### 6.3.1 Voorbeeld van een enzymkleuring * **Glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) kleuring**: Deze kleuring kan de activiteit van G6PD aantonen in erytrocyten. Erytrocyten met G6PD-activiteit worden aangekleurd, terwijl G6PD-deficiënte erytrocyten ongekleurd blijven. Deze methode kan gebruikt worden om G6PD-deficiëntie te diagnosticeren. De tetrazoniumzoutmethode kan worden toegepast voor G6PD kleuring [71](#page=71). > **Tip:** Bij enzymkleuringen is het cruciaal dat het gebruikte substraat specifiek is voor het te detecteren enzym om fout-positieve resultaten te voorkomen. > **Tip:** Immunohistochemische technieken vereisen vaak fixatie van het weefsel om de integriteit van antigenen te behouden, maar dit kan soms leiden tot maskering van epitopen, wat de antilichaambinding kan beïnvloeden. Antigeen-retrieval methoden worden dan toegepast. * * * # fluorescentiemicroscopie technieken en toepassingen Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van het principe van fluorescentie om specifieke structuren in biologische monsters te visualiseren en te analyseren. ### 7.1 Conventionele fluorescentiemicroscopie Conventionele epifluorescentiemicroscopen maken gebruik van een klassieke opstelling met digitale registratie en kunnen worden gebruikt zonder oculaire directe registratie. Een voorbeeld van gecombineerde technieken is een driedubbele overlay, waarbij morfologie met DIC-Nomarski wordt gecombineerd met de visualisatie van kernen (DNA) met een blauw fluorochroom en mitochondria met een rood fluochroom. Een illustratief voorbeeld hiervan is de aankleuring van endotheliale cellen van longarteriën van runderen, waarbij het cytoskelet (actine in groen), mitochondria (rood) en DNA (blauw) worden gekleurd met specifieke fluorescerende reagentia [81](#page=81) [82](#page=82) [83](#page=83). > **Tip:** Driedubbele overlays, zoals getoond met de combinatie van DIC, blauwe en rode fluorescentie, bieden een rijke, multidimensionale weergave van celstructuren en -processen [82](#page=82). ### 7.2 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) Het principe van de confocale laser scanning microscoop (CLSM) berust op het gebruik van een puntvormige lichtbron (laser) en pinholes om de beeldkwaliteit te verbeteren. Een laserstraal scant het monster punt voor punt, en enkel emissielicht afkomstig van het gewenste focale vlak bereikt de detector via een pinhole. De tweede pinhole, die zich op dezelfde optische as bevindt als de emissiepinhole, belet dat strooilicht van boven of onder het focusvlak de detector bereikt, wat resulteert in een scherper beeld met een hogere optische sectiekwaliteit. Deze techniek maakt het mogelijk om emissie vanuit gescande punten in drie dimensies (XYZ) te registreren [84](#page=84). #### 7.2.1 Opstelling van de CLSM Een typische confocale laser scanning microscoop bestaat uit laserlichtbronnen, een elektronisch filters- en spiegelhuis, en een objectief [84](#page=84) [85](#page=85). #### 7.2.2 Voordelen van confocale microscopie Conventionele microscopie kan soms worden verbeterd met softwarematige deconvolutie-algoritmes om hogere resoluties te verkrijgen. Echter, confocale microscopie is beter geschikt voor time-lapse studies en de analyse van dynamische processen, evenals voor andere moderne microscopische toepassingen [86](#page=86) [87](#page=87). > **Voorbeeld:** CLSM is ideaal voor het bestuderen van de beweging van organellen binnen levende cellen over tijd, dankzij de mogelijkheid om optische coupes te maken en de tijdsafhankelijke fluorescentiesignalen te registreren [87](#page=87). * * * # deconvolutie-fluorescentiemicroscopie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie is een softwarematige beeldverbeteringstechniek die de resolutie van conventionele digitale beelden kan verbeteren door ruis en onscherpte te verminderen [86](#page=86). ### 8.1 Algemene principes van deconvolutie Conventionele digitale beelden verkregen met fluorescentiemicroscopen bevatten vaak artefacten die de resolutie en interpretatie van de beelden beïnvloeden. Deconvolutie-algoritmes trachten deze artefacten te corrigeren door het oorspronkelijke beeld te herstellen op basis van een model van het beeldvormingsproces. Dit proces is gebaseerd op het principe dat het waargenomen beeld het resultaat is van de convolutie van het ware object en de puntspreidingsfunctie (Point Spread Function, PSF) van het optische systeem [86](#page=86). #### 8.1.1 De puntspreidingsfunctie (PSF) De PSF beschrijft hoe een puntvormig object wordt afgebeeld door het microscoop. Het is in wezen een maat voor de onscherpte die door het systeem wordt geïntroduceerd. Een ideale microscoop zou een puntvormige PSF hebben, maar in de praktijk is de PSF altijd uitgesmeerd, wat leidt tot verlies van details en verminderde resolutie [86](#page=86). #### 8.1.2 Het deconvolutieproces Het deconvolutieproces probeert het oorspronkelijke, scherpe beeld te reconstrueren door de effecten van de PSF "ongedaan te maken". Dit wordt gedaan door een wiskundige bewerking uit te voeren op het waargenomen beeld. Er zijn verschillende algoritmes voor deconvolutie, zoals [86](#page=86): * **Lineaire deconvolutie:** Dit type algoritme gebruikt lineaire wiskundige bewerkingen. * **Niet-lineaire deconvolutie:** Deze algoritmes zijn complexer en kunnen beter omgaan met ruis en andere beeldartefacten [86](#page=86). #### 8.1.3 Visuele verbetering Door deconvolutie toe te passen, kan de onscherpte in een fluorescentiebeeld aanzienlijk worden verminderd. Dit resulteert in scherpere structuren, een betere scheiding van nabijgelegen objecten en een verbeterd contrast [88](#page=88). > **Tip:** De effectiviteit van deconvolutie hangt sterk af van de nauwkeurigheid van de gebruikte PSF en de kwaliteit van het oorspronkelijke beeld. Een goed gedefinieerde PSF, die vaak wordt bepaald door het microscoop en de gebruikte objectieven, is cruciaal voor succesvolle deconvolutie [86](#page=86). ### 8.2 Toepassingen en vergelijking met confocale microscopie Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie biedt een alternatief voor confocale microscopie voor het verkrijgen van beelden met hoge resolutie. Hoewel confocale microscopie intrinsiek beelden met een hogere signaal-ruisverhouding en optische secties kan produceren, kan softwarematige deconvolutie op conventionele beelden vaak vergelijkbare verbeteringen in resolutie en detail bieden. Dit maakt deconvolutie een waardevolle techniek, vooral wanneer confocale microscopie niet beschikbaar is of wanneer beelden van dynamische processen gedurende langere tijd moeten worden opgenomen [86](#page=86) [87](#page=87). > **Voorbeeld:** Afbeeldingen voor en na deconvolutie tonen duidelijk de verbetering in scherpte en detail, waarbij fijne structuren die voorheen vervaagd waren, nu goed zichtbaar zijn [88](#page=88). ### 8.3 4D Live Cell Imaging Deconvolutie kan ook een rol spelen in complexere beeldvormingsstrategieën zoals 4D Live Cell Imaging. Deze techniek combineert ruimtelijke (XYZ) en temporele (tijd) dimensies met multi-kleur imaging om dynamische biologische processen in levende cellen te bestuderen [89](#page=89). #### 8.3.1 Componenten van 4D Live Cell Imaging Een typische opstelling voor 4D Live Cell Imaging omvat: * Een incubatiekamer die temperatuur en gasomstandigheden reguleert [90](#page=90). * Een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met gemotoriseerde tafel en objectieflens [90](#page=90). * Een digitale camera voor beeldacquisitie [90](#page=90). * Een trillingsvrije tafel om bewegingsartefacten te minimaliseren [90](#page=90). * Computergestuurde controle voor focus en positionering [90](#page=90). #### 8.3.2 Time-lapse opnames Bij time-lapse opnames worden beelden met regelmatige tussenpozen gedurende een bepaalde periode verzameld. Bijvoorbeeld, beelden die elke 30 seconden worden genomen over een periode van 8 uur, kunnen met een afspeelsnelheid van 10 frames per seconde worden bekeken om de dynamiek van bijvoorbeeld muisfibroblasten te bestuderen. Deconvolutie kan worden toegepast op de individuele beelden van deze tijdreeksen om de resolutie en het detail te verbeteren [86](#page=86) [89](#page=89) [91](#page=91). * * * # stappen in de staalbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) Het succesvol uitvoeren van Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) vereist een nauwkeurige en stapsgewijze voorbereiding van biologisch materiaal om fijne structuren zichtbaar te maken . ### 9.1 Algemene principes van staalbereiding #### 9.1.1 Waarom voorbewerking nodig is Biologisch materiaal vertoont van nature weinig densiteitsverschillen, wat resulteert in een laag contrast wanneer het wordt doorstraald met elektronen. Om dit contrast te verhogen en de fijne structuren zichtbaar te maken, zijn diverse bewerkingsstappen noodzakelijk . #### 9.1.2 Principe van elektronenmicroscopie en beeldvorming Bij TEM worden elektronen versneld met een bepaalde golflengte. Deze golflengte ligt buiten het bereik van de gevoeligheid van het menselijk oog, waardoor het beeld wordt waargenomen op een fluorescentiescherm of fotografische plaat. Beeldvorming ontstaat door de strooiing van elektronen op de atomen van het doorstraalde weefsel; dichtere structuren absorberen elektronen meer dan minder dichte structuren . ### 9.2 De stappen van staalbereiding De voorbereiding van biologisch materiaal voor TEM omvat typisch de volgende stappen: #### 9.2.1 Fixatie * **Doel:** Het zo intact mogelijk vastleggen van fijne structuren in cellen en het doorlaatbaar maken van de cellen voor componenten in de vervolgstappen . * **Methode:** Brokjes ruw materiaal, zoals weefselstukjes van enkele millimeters of losse cellen, worden gefixeerd met chemische stoffen, bijvoorbeeld glutaaraldehyde . #### 9.2.2 Spoeling en 'kleuring' (contrasteren) * **Doel:** Het creëren van contrastverschillen door de aanhechting van verbindingen van zware metalen aan specifieke celregio's . * **Principe:** Zware metalen binden zich aan celregio's zoals vetrijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern en eiwitrijke structuren zoals cytoskelet-elementen. Deze metaalverbindingen weerkaatsen elektronen, waardoor de gemerkte structuren als donkere plekken in de elektronenmicroscoop verschijnen. Dit proces wordt 'kleuren' genoemd, hoewel er geen sprake is van ware kleuren . * **Gebruikte stoffen:** * Osmiumtetroxide ($OsO\_4$). Dit kan reeds bij de fixatie worden toegevoegd en dient ook als tweede fixatief voor membranen . * Uranylacetaat . * Kaliumpermanganaat . * Loodcitraat, vaak in combinatie met uranylacetaat als contrasteringsvloeistof . #### 9.2.3 Dehydratatie * **Doel:** Het verwijderen van alle water uit het monster, noodzakelijk voor de inbedding in hydrofobe kunstharsen . * **Methode:** Het biologisch materiaal wordt behandeld met wasstappen van toenemende concentraties ethanol of aceton . #### 9.2.4 Inbedding in hars * **Doel:** Het verkrijgen van een stabiel en snijdbaar blokje materiaal voor het maken van ultradunne coupes . * **Proces:** 1. Het materiaal wordt geleidelijk geïnfiltreerd met de nog ongepolymeriseerde hars . 2. Het hars-doordrongen materiaal wordt in een houder geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule . 3. Polymerisatie vindt plaats door middel van warmte (oven), magnetron of katalysatie met ultraviolet licht. Hierdoor worden harde, goed snijbare blokjes verkregen . #### 9.2.5 Trimming van het blokje hars en ultradun snijden * **Doel:** Het creëren van coupes met een dikte van ongeveer 60 tot 90 nanometer . * **Apparatuur:** Dit gebeurt met een ultramicrotoom . * **Snijvlak:** Gebruik wordt gemaakt van speciale messen van gekliefd puur glas of diamanten messen . #### 9.2.6 Opvangen van coupes op gridje * **Methode:** Water in een klein vaatje achter het mes zorgt voor smering van het snijvlak en opvang van de coupes. De uiterst fragiele coupes worden van het wateroppervlakte opgelepeld op een gridje . * **Gridje:** Dit is een klein metaalschijfje van minder dan 5 millimeter met een roosterpatroon . > **Tip:** Het is cruciaal dat de coupes ultradun zijn (60-90 nm) zodat elektronen erdoorheen kunnen passeren. Dit maakt visuele analyse met de TEM mogelijk . > > **Voorbeeld:** Een typische coupe na de voorbereiding wordt op een gridje geplaatst dat vervolgens in de elektronenmicroscoop wordt ingebracht . * * * # Speciale elektronenmicroscopietechnieken voor celstructuuranalyse Speciale elektronenmicroscopietechnieken zoals vries-breek, vries-ets, cryo-elektronen-tomografie en SBF/FIB-SEM bieden gedetailleerde inzichten in celstructuren die met standaardtechnieken niet zichtbaar zijn . ### 10.1 Vries-breek en vries-ets technieken Deze technieken zijn met name nuttig voor het analyseren van membraanstructuren . #### 10.1.1 Vries-breek (Freeze-fracture) * **Principe:** Door toepassing van een diepgekoeld mes breken cellulaire membranen doorgaans tussen hun binnen- (cytoplasmatische) en buitenblad (extracellulaire). Dit scheidt de twee leaflets van de lipidendubbellaag . * **Inzicht:** Levert informatie over de organisatie van membraaneiwitten en eiwitaggregaten binnen de membraanhelften . * **Visualisatie:** Het gebroken oppervlak wordt vervolgens bestoven met zware atomen voor visualisatie in een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) of scanning-elektronenmicroscoop (SEM). Een replica kan ook gemaakt worden om de elektronenpassage in de TEM te verbeteren . * **Voorbeeld:** TEM-opname van een replica van een vriesbreekpreparaat van een wortelcel van de ui toont de nucleaire membraan (NE) met nucleaire poriën (NP), de celwand (CW), het Golgi apparaat (G) en de vacuole (V). Een ander voorbeeld toont microvilli (MV), celmembraan (CM), mitochondriën (M), het Golgi apparaat (G), de celkern (N) en kernporiën op het oppervlak van een darmepitheelcel van de muis . #### 10.1.2 Vries-ets (Freeze-etching) * **Principe:** Deze techniek genereert meer 3D-structuur door een dunne laag ijs te verwijderen via sublimatie (overgang van vaste naar gasvorm) onder vacuüm . * **Voordeel:** Geeft een gedetailleerder 3D-beeld van de membraanstructuur dan vries-breek alleen . ### 10.2 Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-electron tomography) Cryo-elektronen-tomografie is een geavanceerde techniek voor 3D-reconstructie van objecten op basis van een serie 2D-projecties . * **Principe:** Een serie 2D-projecties van een object wordt verkregen terwijl het object of de belichtingsdetector rond één as gekanteld wordt . * **Reconstructie:** De 3D-reconstructie gebeurt door middel van progressieve berekening (Fourier-analyse) van terugprojecties naar een virtueel 3D-beeld van het originele object . * **Nauwkeurigheid:** De nauwkeurigheid van het gereconstrueerde beeld neemt toe naarmate meer projecties met kleinere hoekverschuivingen gecombineerd kunnen worden, wat leidt tot minder artefacten door ontbrekende data ('missing-wedge'). Dit principe kan geïllustreerd worden voor 2D-reconstructies op basis van 1D-projecties . * **Toepassing:** Deze techniek maakt gedetailleerde 3D-analyse mogelijk van complexe cellulaire structuren, zoals nucleaire pore complexen (NPC's). Door meerdere NPC's te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar gemaakt worden. Het principe wordt geïllustreerd met projecties van een kern van de slijmzwam \_Dictyostelium discoideum, waarbij NPC's en het ruw endoplasmatisch reticulum (RER) zichtbaar zijn . ### 10.3 Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) Deze technieken maken het mogelijk om secties van het monster weg te nemen in de microscoop, wat leidt tot een serie opeenvolgende beelden die gebruikt kunnen worden voor 3D-reconstructies . * **SBF-SEM:** Een ultramicrotoom verwijdert continu dunne lagen van het monster aan de binnenkant van de blok die wordt gescand . * **FIB-SEM:** Een ionenlaser wordt gebruikt om materiaal weg te etsen, waardoor opeenvolgende lagen van het monster worden blootgelegd voor beeldvorming . * **Toepassing:** Beide technieken maken gedetailleerde reconstructies van driedimensionale cellulaire architectuur mogelijk . ### 10.4 Analyse van trachea-epitheel met TEM en SEM Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM) worden gebruikt om de celtypen in het trachea-epitheel te bestuderen . #### 10.4.1 TEM-analyse * **Celtypes:** Het epitheel van de trachea bestaat uit twee celtypes: gecilieerde cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen . * **Ondersteunende structuur:** Het epitheel rust op een basaal membraan (BM) en fibreus bindweefsel, met fibrocyten (F), collageenvezels (Co) en elastinevezels (El) . * **Gecilieerde cellen:** Deze bevatten veel mitochondriën en enig glad endoplasmatisch reticulum (SER) . * **Mucus-producerende cellen:** Deze zijn rijk aan ruw endoplasmatisch reticulum (ER), hebben een uitgebreid Golgi-apparaat (G) en bevatten mucusgevulde secretiedruppels (MD) . * **Cilia en microvilli:** De cilia (C) worden doorsneden in verschillende richtingen (longitudinaal, schuin, dwars) en zijn, net als microvilli (MV), begrensd door een dubbelbladige biologische membraan (UM, unit membrane) . #### 10.4.2 SEM-analyse * **Celtypes:** SEM toont ook de twee celtypes: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak . * **Monsterpreparatie:** Monsters voor SEM worden geleidend gemaakt voor elektriciteit door ze met een sputter coater te voorzien van een dun laagje goud of goud/palladium. Dit is essentieel omdat biologische monsters doorgaans niet geleidend zijn . * * * # Toepassingen van fluorescentiemicroscopie in celbiologie Fluorescentiemicroscopie maakt het mogelijk om specifieke moleculen binnen (levende) cellen zichtbaar te maken en te kwantificeren, wat essentieel is voor het bestuderen van cellulaire processen [75](#page=75). ### 11.1 Detectie van ionenconcentraties Een belangrijke toepassing is het gebruik van ion-gevoelige kleurstoffen, waarvan de fluorescentie afhankelijk is van de concentratie specifieke ionen. Een voorbeeld hiervan is Fura-2, een kleurstof die de intracellulaire calciumconcentratie meet. Veranderingen in calciumconcentraties kunnen leiden tot cellulaire responsen, zoals het sturen van celbeweging door de vorming van nieuwe gradiënten [75](#page=75). > **Voorbeeld:** In de afbeeldingen op pagina 75 is te zien hoe Fura-2 kleuring in levende cellen veranderingen in calciumconcentratie visualiseert, waarbij groen de hoogste concentratie aangeeft en een richtingverandering na stimulatie wordt getoond [75](#page=75). ### 11.2 Immunofluorescentiemicroscopie Immunofluorescentiemicroscopie maakt gebruik van antilichamen waaraan een fluorochroom is geconjugeerd om specifieke eiwitten in cellen of weefsels te detecteren. Dit is met name effectief voor het visualiseren van specifieke eiwitten in gefixeerde cellen of weefsels [75](#page=75) [77](#page=77). > **Voorbeeld:** Op pagina 77 wordt een voorbeeld getoond van een specifiek eiwit dat in een gefixeerde cel wordt gevisualiseerd door middel van immunofluorescentiemicroscopie [77](#page=77). ### 11.3 Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten Een andere methode is het "taggen" van eiwitten met fluorescente eiwitten, zoals Green Fluorescent Protein (GFP) of andere varianten, waardoor specifieke eiwitten in levende cellen kunnen worden gevolgd. Dit maakt het mogelijk om eiwitlokalisatie en -dynamiek in real-time te bestuderen [75](#page=75). #### 11.3.1 Genetische modificatie voor eiwitexpressie Genen voor fluorescente eiwitten, zoals Blue Fluorescent Protein (BFP) en Yellow Fluorescent Protein (YFP), kunnen worden ingebouwd in embryonale stamcellen om deze cellen of embryo's in verschillende stadia blauw en groen te laten fluoresceren [79](#page=79). > **Voorbeeld:** De afbeeldingen op pagina 79 tonen blauw en groen fluorescerende embryo's in zowel vroege als late ontwikkelingsstadia na de inbouw van genen voor BFP en YFP [79](#page=79). ### 11.4 Visualisatie van organellen Fluorescentiemicroscopie wordt ook gebruikt voor de visualisatie van organellen, zoals lysosomen en mitochondria, in gecultiveerde cellen [76](#page=76). ### 11.5 Dubbele fluorescentie en colocalisatie Door het gebruik van fluorochromen met verschillende emissie- en excitatiegolflengtes, kunnen meerdere eiwitten of structuren tegelijkertijd worden aangekleurd en gevisualiseerd. Dit maakt het bestuderen van de interactie en lokalisatie van verschillende componenten mogelijk, een techniek die bekend staat als colocalisatie [77](#page=77) [79](#page=79). > **Voorbeeld:** Op pagina 79 wordt een voorbeeld gegeven van dubbele fluorescentie waarbij zowel cytoskelet-kabels (actine in groen) als "voetjes" (vinculine in rood) worden aangekleurd. De overlappende signalen tonen de colocalisatie van vinculine met de actinekabels aan [79](#page=79). ### 11.6 Verschillende soorten fluorescente eiwitten Er bestaan diverse soorten fluorescente eiwitten die in de biotechnologie worden gebruikt, zowel in gezuiverde vorm in buisjes als tot expressie gebracht in organismen zoals bacteriën. Deze eiwitten variëren in hun spectrale eigenschappen, wat hun toepasbaarheid in diverse microscopische technieken bepaalt [80](#page=80). > **Tip:** Het kiezen van de juiste fluorochroom is cruciaal en hangt af van het specimen, de cellulaire omgeving en de specifieke vraagstelling. Verschillende fluorochromen hebben unieke excitatie- en emissiespectra die optimaal benut moeten worden [75](#page=75) [80](#page=80). * * * # Snijden van weefselcoupes voor licht- en elektronenmicroscopie 12. Snijden van weefselcoupes voor licht- en elektronenmicroscopie Het snijden van weefselcoupes is een essentiële stap voor microscopische analyse, waarbij de dikte van de coupes wordt bepaald door het inbedmateriaal en de microscopische techniek (licht- of elektronenmicroscopie) [48](#page=48). ### 12.1 Principe van het snijden Het principe achter het snijden van weefselcoupes is het verkrijgen van dunne doorsneden van het ingebedde weefsel, zodat licht of elektronen erdoorheen kunnen dringen voor observatie. De benodigde dikte varieert aanzienlijk tussen lichtmicroscopie (LM) en elektronenmicroscopie (EM) [48](#page=48). #### 12.1.1 Inbedmaterialen en coupe diktes * **Paraffine:** Dit is een klassiek inbedmiddel voor LM. Het is relatief zacht en maakt coupes met een minimale dikte van ongeveer 5-10 µm mogelijk. Paraffine wordt verwarmd tot 55°C om te smelten en in het weefsel te dringen, waarbij de meeste epitopen behouden blijven [48](#page=48). * **Harsen en plastics:** Deze zijn harder dan paraffine en maken dunnere coupes mogelijk, tot wel 60-70 nm, wat geschikt is voor EM. Polymerisatie van deze harsen vindt plaats bij 60-65°C. Harsen zijn, in tegenstelling tot paraffine, moeilijk uit het weefsel te verwijderen, wat ze minder geschikt maakt voor immuunkleuringen [48](#page=48). #### 12.1.2 Microtomie Het snijden van ingebed materiaal gebeurt met een microtoom [48](#page=48). * **Microtomen voor LM:** Deze zijn uitgerust met stalen messen [48](#page=48). * **Microtomen voor EM:** Deze gebruiken glazen of diamanten messen [48](#page=48). #### 12.1.3 Opvang van coupes * **Voor LM:** Coupes worden aangebracht op glazen draagglasjes [48](#page=48). * **Voor EM:** Coupes worden op metalen (koper of nikkel) roostertjes, aangeduid als grids, geplaatst [48](#page=48). ### 12.2 Lichtmicroscopie (LM) De ontwikkeling van de lichtmicroscoop heeft een snelle evolutie doorgemaakt, met verbeteringen in de 19e en 20e eeuw, en de introductie van fluorescentie, digitale opnames en confocale technieken in de tweede helft van de 20e eeuw [51](#page=51). #### 12.2.1 Resolutie en preparaatkenmerken De resolutie van een lichtmicroscoop is beperkt tot ongeveer 200 nm. Dit wordt bepaald door het objectief en de golflengte van het zichtbaar licht. De effectieve resolutie wordt mede beïnvloed door de aard van het preparaat [52](#page=52): * **Gefixeerd en gekleurd:** Preparaten worden gekleurd (bv. met Hematoxyline/Eosine) voor detectie op basis van lichtabsorptie (klaarveldmicroscopie) [52](#page=52). * **Levend materiaal:** Levende cellen vertonen doorgaans weinig contrast en vereisen speciale microscopische technieken [52](#page=52). #### 12.2.2 Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop Het klassieke lichtmicroscoop, ook wel klaarveldmicroscoop (bright field) genoemd, maakt gebruik van doorvallend wit licht. Het bestaat uit drie hoofdcomponenten [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55): 1. **Condensor:** Bundelt het doorvallende licht op het preparaat. De belichting door de condensor, samen met het objectief, bepaalt de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). 2. **Objectief:** Vormt een vergroot beeld van het preparaat. Het objectief heeft een korte werkafstand [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). 3. **Oculair:** Vergroot het beeld dat door het objectief is gevormd [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). Een lichtbron produceert wit licht dat via een spiegel en de condensor op het preparaat wordt gericht. Een prisma kan worden gebruikt om de lichtweg te buigen voor een comfortabele observatiepositie [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55). #### 12.2.3 Typen lichtmicroscopen Er zijn verschillende typen lichtmicroscopen beschikbaar, waaronder: * Histologie-microscoop * Discussie-microscoop met digitale camera * Geïnverteerde lichtmicroscoop (ideaal voor observatie van levende celcultures) [56](#page=56). #### 12.2.4 Voorbeelden van lichtmicroscopische analyse * **Kleuring van darmvillus met PAS en Hematoxyline:** PAS kleurt vrije suikers aan (bv. intervilleus slijm en microvilli), terwijl hematoxyline zure componenten zoals celkernen aankleurt. Eosine kleurt eiwitten roze aan, wat leidt tot de veelgebruikte HE-kleuring. De basaalmembraan kan ook zichtbaar worden gemaakt [57](#page=57). * **HE-kleuring van dunne darm (muis):** Deze kleuring maakt structuren zoals villi, lamina propria, submucosa, crypten en slijmbekercellen zichtbaar [58](#page=58). ### 12.3 Elektronenmicroscopie (EM) Voor EM worden harsen en plastics gebruikt als inbedmateriaal, waardoor coupes met een dikte van 60-70 nm verkregen kunnen worden. Deze coupes worden op metalen grids geplaatst voor analyse. De specifieke principes en technieken voor EM-snijden worden niet gedetailleerd uitgewerkt op de hier verstrekte pagina's, maar de dunnere coupe dikte en specifieke inbedmiddelen zijn cruciaal voor het verkrijgen van de hogere resolutie die EM biedt [48](#page=48). * * * # elektronenmicroscopie technieken en toepassingen Elektronenmicroscopie (EM) omvat technieken die elektronen gebruiken om beelden te genereren met een significant hogere resolutie dan lichtmicroscopen, waardoor structuren op moleculair en atomair niveau zichtbaar worden gemaakt [98](#page=98). ### 13.1 Algemene principes van elektronenmicroscopie In tegenstelling tot lichtmicroscopen, die fotonen gebruiken, maakt elektronenmicroscopie gebruik van elektronen voor beeldvorming. Dit is mogelijk doordat de golflengte van elektronen veel kleiner is dan die van zichtbaar licht, wat resulteert in een hogere resolutie. Elektronen worden opgewekt door het verhitten van een filament (kathode) en aangetrokken tot een anode. Elektromagnetische magneten fungeren als lenzen om de elektronenbundel te sturen en te focussen. Het gehele proces vindt plaats in een hoog vacuüm om interactie met gasmoleculen te voorkomen [98](#page=98). #### 13.1.1 Vergroting en resolutie Elektronenmicroscopen kunnen vergrotingen bereiken tot wel 600.000 keer en meer. Het scheidend vermogen kan theoretisch kleiner zijn dan 3 nanometer (nm), met typische waarden rond de 1 nm voor TEM. Dit stelt onderzoekers in staat om individuele atomen waar te nemen [98](#page=98) [99](#page=99). #### 13.1.2 Componenten van een elektronenmicroscoop Een elektronenmicroscoop heeft een elektronenkanon als bron en elektromagnetische lenzen die de elektronenbundel afbuigen. Er is een condensorlens om de bundel te concentreren, een objectief om scherp te stellen, en bij scanning elektronenmicroscopie (SEM) zijn er componenten voor het aftasten van het preparaat [98](#page=98). ### 13.2 Types van elektronenmicroscopie Er zijn twee hoofdtypen elektronenmicroscopie: transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM) [99](#page=99). #### 13.2.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) TEM wordt gebruikt om de interne structuren van objecten zoals weefsels, cellen en virussen te bestuderen. Bij TEM wordt een elektronenbundel door ultradunne preparaten gestuurd (50-100 nm dik). De elektronen worden verstrooid door zware atoomkernen in het preparaat, en dit verstrooide beeld wordt op een fluorescent scherm waargenomen [98](#page=98) [99](#page=99). * **Resolutie:** Ongeveer 1 nm [99](#page=99). * **Principe:** Elektronenverstrooiing op zware atoomkernen in ultradunne preparaten [99](#page=99). * **Beeldvorming:** Op een fluorescerend scherm [99](#page=99). ##### 13.2.1.1 Fixatie- en kleuringstechnieken voor TEM Onbehandeld biologisch materiaal vertoont nauwelijks contrast in een TEM, daarom zijn aangepaste fixatie- en kleuringstechnieken essentieel . * **Fixatie:** Biologisch materiaal wordt gefixeerd met glutaaraldehyde (bivalente crosslinker van NH2-groepen) en osmiumtetroxide (sterk oxidans dat lipiden en eiwitten stabiliseert) . * **Kleuring:** Kleuring met zware metalen zoals uranylacetaat en lood zorgt voor contrast. Deze metalen weerkaatsen elektronen en binden zich aan specifieke structuren, waardoor deze donker verschijnen in het beeld. Structuren met minder affiniteit voor deze kleurstoffen laten meer elektronen door en verschijnen lichter. Een te dik preparaat zou alle elektronen tegenhouden, wat resulteert in een zwart beeld . ##### 13.2.1.2 Speciale preparatietechnieken voor TEM Naast ultradunne secties worden ook andere technieken gebruikt: * **Negatieve kleuring:** Hierbij worden deeltjes (bv. virusdeeltjes) omgeven door een zwaar metaal (bv. uranylacetaat, fosfowolfraamzuur). Het metaal omringt de deeltjes, waardoor deze zichtbaar worden als witte structuren tegen een zwarte achtergrond . * **Shadowing (schaduwtechniek):** Het preparaat wordt schuin bestoven met een zwaar metaal zoals platina, goud of chroom. Dit creëert een driedimensionaal effect door schaduwen te werpen op het oppervlak van de structuur. Rotary shadowing wordt gebruikt voor het visualiseren van nucleïnezuren op roterende specimens . #### 13.2.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) SEM wordt gebruikt om het oppervlak van objecten zoals weefsels, macromoleculaire aggregaten en materialen in beeld te brengen. Het preparaat kan groter en dikker zijn dan bij TEM, maar moet wel gecoat worden met een zwaar metaal [99](#page=99). * **Principe:** Het preparaat wordt in hoog vacuüm afgescand met een elektronenbundel. Hierbij treedt terugkaatsing van elektronen op en worden secundaire elektronen gegenereerd uit het preparatoppervlak [99](#page=99). * **Detectie:** De gegenereerde secundaire elektronen worden gedetecteerd, versterkt en computergestuurd verwerkt tot een driedimensionaal beeld [100](#page=100) [99](#page=99). ### 13.3 Toepassingen Elektronenmicroscopie wordt toegepast in diverse onderzoeksgebieden, waaronder de pathologie. #### 13.3.1 Diagnose van mucoviscidose (cystic fibrosis) Hoewel de primaire focus van de documentatie ligt op de technieken, wordt als illustratie de detectie van het CFTR-eiwit via immunohistochemie genoemd in de context van mucoviscidose. Mutaties in het CFTR-gen leiden tot een verstoorde productie of functie van het CFTR-eiwit, dat betrokken is bij het transport van chloride-ionen. In het geval van de meest voorkomende mutatie (deletie van een aminozuur op positie 508), wordt het eiwit retentie in het endoplasmatisch reticulum ondergaan en afgebroken, wat leidt tot subcellulaire mislocatie. Immunohistochemie kan hierbij gebruikt worden om wild-type en gemuteerde CFTR-eiwitten op weefselcoupes te detecteren [92](#page=92). > **Tip:** Hoewel de documentatie niet diep ingaat op de EM-toepassingen voor CFTR-detectie, is het belangrijk te onthouden dat de hoge resolutie van EM, met name TEM, cruciaal is voor het bestuderen van subcellulaire structuren en eiwitlokalisatie op een gedetailleerd niveau [98](#page=98) [99](#page=99). > **Voorbeeld:** In de context van mucoviscidose zou TEM gebruikt kunnen worden om veranderingen in de ultrastructuur van cellen in de luchtwegen of zweetklieren te bestuderen, waar de abnormale slijmproductie plaatsvindt. De negatieve kleuring of shadow casting technieken zouden kunnen worden toegepast om de morfologie van virussen of andere deeltjes te visualiseren die mogelijk een rol spelen in de pathologie [92](#page=92). * * * # Lichtmicroscopietechnieken en kleuringen voor weefselanalyse Lichtmicroscopietechnieken en weefselkleuringen zijn essentieel voor het visualiseren en analyseren van celstructuren en weefselarchitectuur die anders transparant zouden zijn [60](#page=60) [64](#page=64). ### 14.1 Algemene principes van lichtmicroscopie en contrastverhoging Lichtmicroscopie maakt gebruik van licht om beelden te vergroten en te bestuderen. Om structuren zichtbaar te maken, is contrast essentieel, aangezien veel biologische preparaten van nature transparant zijn. Er zijn twee hoofdbenaderingen om contrast te verhogen [60](#page=60): * **Histologische kleuringen:** Deze technieken maken gebruik van kleurstoffen die selectief binden aan specifieke celcomponenten, waardoor deze zichtbaar worden door absorptie van bepaalde golflengtes van wit licht [60](#page=60) [63](#page=63). * **Speciale microscopietechnieken:** Deze methoden manipuleren het licht zelf om contrast te genereren uit ongekleurde preparaten, met name levende cellen [59](#page=59) [60](#page=60). #### 14.1.1 Klaarveldmicroscopie De standaard lichtmicroscoop, ook wel klaarveldmicroscoop genoemd, maakt gebruik van doorvallend wit licht. Bij ongekleurde preparaten is het contrast vaak laag, waardoor het moeilijk is om details te onderscheiden [61](#page=61) [63](#page=63). #### 14.1.2 Fasecontrastmicroscopie * **Principe:** Ontwikkeld door Zernike (Nobelprijs 1953), maakt fasecontrastmicroscopie gebruik van kleine faseverschuivingen die ontstaan door verschillen in brekingsindex binnen het preparaat. Deze faseverschuivingen worden omgezet in amplitudeveranderingen (licht/donker), wat resulteert in een zwart-wit beeld [59](#page=59) [60](#page=60). * **Toepassing:** Ideaal voor het bestuderen van ongekleurde preparaten, zoals levende cellen in cultuur of vriescoupes van ongefixeerd weefsel [59](#page=59). #### 14.1.3 Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) Microscopie * **Principe:** Ook bekend als Nomarski-microscopie maakt DIC gebruik van interferentie van doorvallend gepolariseerd licht om verschillen in optische dichtheid zichtbaar te maken. Dit vereist een gespecialiseerde microscoop met prisma's en interferentiefilters [59](#page=59) [60](#page=60). * **Toepassing:** Vergelijkbaar met fasecontrast, wordt gebruikt voor het visualiseren van levende, ongekleurde preparaten [62](#page=62). #### 14.1.4 Digitale en Fluorescentiemicroscopie * **Digitale microscopie:** Gebruikt ultragevoelige videocamera's en computerverwerking om beelden te genereren. Dit maakt dynamische observaties mogelijk, inclusief real-time en time-lapse opnames [59](#page=59). * **Fluorescentiemicroscopie:** Wordt gebruikt voor 'live cell imaging' en maakt het mogelijk om met behulp van fluorescerende moleculen specifieke structuren aan te kleuren en te volgen [59](#page=59). ### 14.2 Weefselkleuringstechnieken Kleuringen zijn cruciaal voor het zichtbaar maken van anatomische structuren in weefselcoupes. De meeste kleurstoffen zijn waterige oplossingen en de coupes moeten eerst worden gedeparaffineerd. Ionische binding, gebaseerd op elektrostatische aantrekking tussen tegengesteld geladen moleculen, is het dominante bindingsmechanisme in histologische kleuringen [63](#page=63) [64](#page=64). #### 14.2.1 Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring De H&E-kleuring is de meest gebruikte routinekleuring in de histologie en pathologie vanwege de effectiviteit en het vermogen om verschillende cel- en weefselcomponenten te differentiëren [64](#page=64) [65](#page=65). * **Hematoxyline:** * Werkt als een basische kleurstof, meestal in complex met metaalzouten zoals aluminium, die als beitsmiddel dienen [64](#page=64). * Is kationisch (positief geladen) en bindt aan negatief geladen, basofiele celbestanddelen [64](#page=64). * Kleurt voornamelijk celkernen (nucleïnezuren) diep blauw tot donkerpaars [64](#page=64) [65](#page=65). * Goed gefixeerde kernen vertonen gedetailleerde intranucleaire structuren, zoals heterochromatine, wat diagnostisch belangrijk is bij kanker [65](#page=65). * Nucleoli kleuren met eosine, maar de patronen van chromatinecondensatie in de kernen zijn diagnostisch significant [65](#page=65). * Kan soms ook worden gebruikt als tegenkleuring in immunohistochemische procedures [66](#page=66). * **Eosine:** * Werkt als een zure kleurstof en is anionisch (negatief geladen) [64](#page=64). * Bindt aan positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma [64](#page=64). * Kleurt cytoplasma en extracellulaire matrix roze [64](#page=64) [65](#page=65). * Eosinofiele stoffen worden ook wel acidofiele stoffen genoemd [57](#page=57). * Nucleoli kunnen roze kleuren met eosine [65](#page=65). * Een duidelijke blauwe gloed in het cytoplasma kan wijzen op overvloedige polyribosomen [65](#page=65). * **Voordelen van H&E:** * Geschikt voor een breed scala aan fixatieven [65](#page=65). * Laat een breed scala aan cytoplasmatische, nucleaire en extracellulaire matrixkenmerken zien [65](#page=65). * Essentieel voor het herkennen van weefseltypes en morfologische veranderingen, met name in kankerdiagnose [65](#page=65). * **Beperkingen van H&E:** * Onverenigbaar met immunofluorescentie op dezelfde coupe [65](#page=65). #### 14.2.2 Periodic Acid Schiff (PAS) kleuring * **Principe:** De PAS-kleuring kleurt vrije suikers en koolhydraten aan [57](#page=57). * **Toepassing:** Wordt gebruikt om structuren zoals het intervilleuze slijm in de darm en de microvilli (borstelzoom) aan te kleuren [57](#page=57). #### 14.2.3 Voorbeelden van anatomische structuren gekleurd met H&E en PAS * **Darmvillus (met PAS en Hematoxyline):** * PAS kleurt het intervilleus slijm en de microvilli [57](#page=57). * Hematoxyline kleurt de celkernen van enterocyten, lymfocyten en fibroblasten [57](#page=57). * De basaalmembraan wordt aangegeven met pijlen [57](#page=57). * **Dunne darm muis (met H&E):** * Identificeerbare structuren zijn de villus (darmvlok), lamina propria, muscularis mucosa, submucosa en crypten [58](#page=58). * Slijmbekercellen zijn ook zichtbaar [58](#page=58). > **Tip:** Bij H&E-kleuring worden structuren die anders transparant zouden zijn, zichtbaar gemaakt door de verschillen in de chemie van het weefsel waarop de kleurstoffen reageren [64](#page=64). > **Tip:** De Golgi-zone kan voorzichtig worden geïdentificeerd door de afwezigheid van kleuring naast de kern [65](#page=65). * * * # Principes van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen, fluorochromen genaamd, om moleculen en structuren in (levende) cellen te visualiseren en te kwantificeren door geabsorbeerd licht uit te zenden als fluorescentiestraling [73](#page=73). ### 15.1 Algemene principes Bij fluorescentiemicroscopie wordt een fluorofoor geëxciteerd door licht van een specifieke golflengte, waarna het een foton uitzendt met een golflengte die groter of gelijk is aan de geabsorbeerde golflengte. Het principe berust op het gebruik van excitatielicht van een kortere golflengte (bijvoorbeeld ultraviolet, blauw, groen) dat door het preparaat wordt gestuurd, waarna de fluorochrome stof emissielicht van een langere golflengte (groen, rood-infrarood) uitzendt [72](#page=72) [73](#page=73). #### 15.1.1 De rol van filters Essentieel in fluorescentiemicroscopie is het scheiden van het excitatielicht van het emissielicht. Dit wordt bereikt met behulp van specifieke filters: * **Excitatiefilter:** Dit filter laat alleen de golflengte(s) door die nodig zijn om het fluorofoor te exciteren [74](#page=74). * **Barrièrefilter (emissiefilter of stopfilter):** Dit filter blokkeert het resterende excitatielicht en laat alleen het zwakkere emissielicht van het fluorofoor door naar de detector. Er mag nagenoeg geen overlap zijn tussen de transmissiebanden van het excitatiefilter en het barrièrefilter [73](#page=73). * **Dichroïsche spiegel (beamsplitter):** Deze spiegel reflecteert het excitatielicht naar het preparaat en laat het emissielicht door naar de detector [74](#page=74). #### 15.1.2 Componenten van een epifluorescentiemicroscoop Een typische epifluorescentiemicroscoop bestaat uit de volgende componenten [74](#page=74): 1. **Excitatiebron:** Dit kan een kwikdamplamp (Hg) of xenonlamp (Xe) zijn voor conventionele microscopie, of een laser (bv. Argon-laser van 488 nm) voor confocale laser scanning microscopie (CLSM) (#page=72, 74) [72](#page=72) [74](#page=74). 2. **Golflengtefilters in een filterkubus:** Hierin bevinden zich het excitatiefilter, de dichroïsche spiegel en het emissiefilter. 3. **Detector:** Dit zijn de ogen of een camera (digitaal/analoog) die het fluorescente signaal opvangen [74](#page=74). #### 15.1.3 Spectrum van een fluorofoor Elk fluorofoor heeft een specifiek excitatie- en emissiespectrum. Het excitatiespectrum geeft aan bij welke golflengten het fluorofoor licht absorbeert, en het emissiespectrum geeft aan bij welke golflengten het licht uitzendt. Bijvoorbeeld, Alexa 488 heeft een excitatiepiek rond 488 nm en een emissiepiek rond 519 nm [73](#page=73) [74](#page=74). > **Tip:** Het verschil in golflengte tussen absorptie en emissie wordt Stokes-verschuiving genoemd. ### 15.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie is een veelzijdige techniek die kan worden gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder: #### 15.2.1 Kwantificeren van moleculen De fluorescentie-intensiteit van een kleurstof kan afhankelijk zijn van de concentratie van specifieke ionen of moleculen, waardoor kwantificatie mogelijk is [75](#page=75). * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Deze kleurstoffen veranderen hun fluorescentie in respons op de concentratie van specifieke ionen, zoals intracellulair calcium (Ca2+). Fura-2 is een voorbeeld van een Ca2+-gevoelige kleurstof die veranderingen in Ca2+-concentratie in levende cellen zichtbaar kan maken [75](#page=75). * **Immunofluorescentiemicroscopie:** Hierbij worden specifieke eiwitten gedetecteerd met behulp van antilichamen waaraan een fluorogroom is gekoppeld. Dit maakt het mogelijk om de lokalisatie en distributie van specifieke eiwitten in cellen en weefsels te bestuderen, zowel in gefixeerde als levende preparaten [75](#page=75) [77](#page=77). #### 15.2.2 Labeling van biomoleculen * **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Door genen voor fluorescente eiwitten (zoals Blue Fluorescent Protein (BFP) of Yellow Fluorescent Protein (YFP)) in te bouwen, kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden getraceerd en gevisualiseerd. Dit leidt tot embryo's die blauw of groen fluoresceren. Voorbeelden van dergelijke eiwitten zijn in buisjes of tot expressie gebracht in bacteriën [79](#page=79) [80](#page=80). * **Visualisatie van organellen:** Lysosomen en mitochondriën in gecultiveerde cellen kunnen worden gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie [76](#page=76). #### 15.2.3 Analyse van cellulaire structuren en interacties * **Visualisatie van specifieke eiwitten:** Een specifiek eiwit kan in gefixeerde cellen of weefsels worden gevisualiseerd [77](#page=77). * **Aankleuring van meerdere eiwitten:** Het is mogelijk om twee of meer eiwitten in een cel tegelijkertijd aan te kleuren om hun relatieve lokalisaties te bestuderen (#page=78, 79) [78](#page=78) [79](#page=79). * **Colocalisatieanalyse:** Door verschillende structuren met verschillende fluorochromen aan te kleuren, kan colocalisatie – de aanwezigheid van twee moleculen op dezelfde locatie – worden aangetoond. Bijvoorbeeld, de aankleuring van cytoskeletkabels (actine in groen) en 'voetjes' (vinculine in rood) kan de colocalisatie van deze componenten aantonen [79](#page=79). #### 15.2.4 Combinatie van technieken Fluorescentiemicroscopie kan worden gecombineerd met andere beeldvormingstechnieken, zoals Differential Interference Contrast (DIC) – ook bekend als Nomarski-microscopie – om zowel morfologie als specifieke moleculen tegelijkertijd te bestuderen. Een driedubbele overlay kan bijvoorbeeld de morfologie (DIC), de kernen (met blauw fluorogroom) en de mitochondriën (met rood fluochroom) tegelijkertijd weergeven [82](#page=82). > **Tip:** Bij het combineren van beelden uit verschillende kanalen (bijvoorbeeld blauw en rood) wordt vaak een overlay-beeld gecreëerd om de ruimtelijke relatie tussen de verschillende structuren te visualiseren [82](#page=82). #### 15.2.5 Conventionele versus confocale microscopie * **Epifluorescentie:** Dit is de conventionele methode waarbij het gehele preparaat tegelijkertijd wordt geëxciteerd [72](#page=72). * **Confocale laser scanning microscopie (CLSM):** Deze techniek gebruikt een laser als excitatielichtbron en een pinhole om alleen het licht van het brandpunt door te laten, wat resulteert in een optische doorsnede met verbeterde resolutie en contrast, vooral in dikkere monsters [72](#page=72). #### 15.2.6 Microscoopopstellingen Moderne fluorescentiemicroscopen kunnen klassieke opstellingen met een digitale camera voor registratie gebruiken, of zelfs zonder oculair directe registratie toepassen [81](#page=81). > **Voorbeeld:** Een cel kan worden aangekleurd met een fluorescente kleurstof die bindt aan DNA (bijvoorbeeld DAPI, dat blauw fluoresceert) en tegelijkertijd met een kleurstof die bindt aan mitochondriën (bijvoorbeeld MitoTracker Red, dat rood fluoresceert). Door de beelden uit beide kanalen te combineren, kan men zien of de mitochondriën zich in de buurt van de celkernen bevinden. * * * # Verschillende methoden voor het verkrijgen van stamcellen Stamcellen zijn cruciaal voor celvernieuwing en weefselontwikkeling, en hun verkrijging kan via verschillende methoden, elk met specifieke eigenschappen en ethische overwegingen [27](#page=27). ### 16.1 Definitie en eigenschappen van stamcellen Een stamcel wordt gedefinieerd als een cel die het vermogen heeft om zich continu te delen en te differentiëren tot verschillende andere celtypen en weefsels. Stamcellen bezitten twee essentiële eigenschappen: zelfvernieuwing (het vermogen om identieke kopieën van zichzelf te produceren) en differentiatie (het vermogen om te ontwikkelen tot gespecialiseerde volwassen celtypen die organen en weefsels vormen) [27](#page=27) [28](#page=28). ### 16.2 Typen stamcellen Stamcellen worden geclassificeerd op basis van hun differentiatiepotentieel: * **Totipotente stamcellen:** Deze hebben de potentie om zich te ontwikkelen tot een volledige foetus, inclusief de placenta en de omringende weefsels. De bevruchte eicel in de eerste uren na de conceptie is een voorbeeld van een totipotente stamcel [28](#page=28). * **Pluripotente stamcellen:** Cellen die zich kunnen ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen. De binnenste celmassa van een blastocyst, die zich na implantatie in de baarmoeder ontwikkelt tot de foetus, is pluripotent, aangezien deze de placenta niet kan vormen. Embryonale stamcellen (ES-cellen) zijn ook pluripotent [29](#page=29) [35](#page=35). * **Multipotente stamcellen:** Deze hebben het potentieel om zich te ontwikkelen tot een beperkt aantal gespecialiseerde celtypen binnen een specifieke weefsellijn of orgaan. Hemopoëtische stamcellen, die zich kunnen differentiëren tot diverse bloedceltypen (rode bloedcellen, bloedplaatjes, witte bloedcellen), zijn een voorbeeld van multipotente stamcellen [30](#page=30). ### 16.3 Methoden voor het verkrijgen van stamcellen #### 16.3.1 Embryonale stamcellen * **Muizen embryonale stamcellen:** Verkregen uit de binnenste celmassa van een muizenblastocyst. Deze cellen worden gekweekt op een feederlaag met groeifactoren, zoals Leukemia Inhibitory Factor (LIF). Na scheiding van de cellen via trypsinetreatment, kunnen ze opnieuw worden uitgeplaat om stabiele cellijnen te vormen die bewaard kunnen worden door invriezen [31](#page=31). * **Humane embryonale stamcellen:** Verkregen uit embryo's uit in-vitrofertilisatie (IVF)-trajecten. De aanmaak en het gebruik ervan is ethisch gevoelig en aan strikte wetgeving gebonden, waarbij het moment van embryo-gebruik (maximaal 12 dagen oud in België) en het doel van het onderzoek van belang zijn [33](#page=33). #### 16.3.2 Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) worden \_in vitro gecreëerd door volwassen somatische cellen (bijvoorbeeld huidcellen) te herprogrammeren tot een pluripotente staat, vergelijkbaar met embryonale stamcellen. Deze methode is ethisch minder beladen dan het gebruik van embryonale stamcellen [34](#page=34). #### 16.3.3 Orgaan- en weefselkweken * **Celcultuur:** Historisch gezien begon celcultuur met tissue culture (TC) in 1907, waarbij zenuwen uit kikkerembryo's werden gekweekt. Latere ontwikkelingen leidden tot 2D-monolaagcultures, die de 3D-organen nabootsen. Cellen kunnen afkomstig zijn van primaire culturen (direct uit organen of tumoren) of van stabiele cellijnen. Het proces omvat enzymatische behandeling van weefsel, centrifugeren van cellen, uitzetten in een groeirecipiënt en, indien nodig, splitsen van de confluente laag [14](#page=14) [8](#page=8) [9](#page=9). * **Groeicondities:** Cellen worden gekweekt in specifieke media, zoals Minimum Essential Medium (MEM), dat isotonische zouten, glucose, essentiële aminozuren, vitamines en serum bevat. De culturen worden meestal onder een atmosfeer van 5% CO2 in lucht gehouden om een pH van 7,4 te handhaven [11](#page=11). * **Groeisubstraten:** Voor adherente celculturen is een substraat noodzakelijk dat beschermt tegen anoïkis (een vorm van apoptose). Dit kan glas, voorbehandeld polystyreen, of coatings zoals poly-D-lysine, collageen, of geconditioneerd medium van feedercellen zijn. Cellen interageren met hun micro-omgeving via aspecifieke fysieke interacties of specifieke functionele interacties met onderliggende cellen en de extracellulaire matrix (ECM), wat differentiatie kan induceren [15](#page=15) [16](#page=16). * **Celtransfer:** Cellen in cultuur delen tot contactinhibitie optreedt, waarna ze gesplitst kunnen worden. Bij adherente cellen gebeurt dit doorgaans met trypsine/EDTA, dat de celadhesie aan het substraat en tussen cellen degradeert [17](#page=17) [20](#page=20). * **3D-organoïden:** Stamcellen kunnen \_in vitro worden gebruikt om organoïden te creëren, die als "organen in een schaaltje" fungeren en de structuur en functie van echte organen nabootsen [36](#page=36). #### 16.3.4 Methode voor weefselpreparatie voor microscopie (secundair relevant voor stamcelisolatie-analyse) Hoewel niet direct een methode voor stamcelverkrijging, zijn de technieken voor het prepareren en observeren van cellen en weefsels essentieel voor de analyse van stamcellen: * **Fixeren:** Het bewaren van de oorspronkelijke structuur door eiwitten te denatureren met chemische fixatieven (bv. formol, glutaraldehyde) of door invriezen. Dit voorkomt de activiteit van afbraakenzymen [45](#page=45). * **Inbedden:** Het doordringen en omwikkelen van gefixeerd materiaal met een substantie die het snijdbaar maakt, zoals paraffine of hars, na dehydratatie en "clearing" [46](#page=46) [47](#page=47). * **Snijden:** Het verkrijgen van dunne plakken (coupes) met een microtoom voor lichtmicroscopie (LM, 5-10 µm) of elektronenmicroscopie (EM, 70 nm) [48](#page=48). * **Kleuren/contrasteren:** Toepassen van kleurstoffen (bv. Hematoxyline/Eosine, PAS) of speciale microscopische technieken (fasecontrast, DIC) om structurele details zichtbaar te maken [52](#page=52) [57](#page=57) [59](#page=59). ### 16.4 Kwaliteitscontrole van celculturen Bij celcultuur is kwaliteitscontrole essentieel om contaminatie te voorkomen en de zuiverheid en stabiliteit te waarborgen [37](#page=37). * **Contaminatie:** Kan optreden door micro-organismen (bacteriën, gisten, schimmels, mycoplasma's) of door vreemde cellen. Mycoplasma-contaminatie kan leiden tot diverse negatieve effecten op celgroei en -metabolisme [37](#page=37) [38](#page=38). * **Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit:** Wordt gemeten door middel van karyotypering, waarbij het aantal en de vorm van de chromosomen worden bepaald [39](#page=39). * **Genetische instabiliteit:** Gecultiveerde cellen kunnen genetisch instabiel worden. Dit kan worden beperkt door regelmatig terug te keren naar stock-cultures die ingevroren zijn in vloeibare stikstof met cryoprotectiva zoals glycerol of DMSO [40](#page=40). * * * ## 16 Verschillende methoden voor het verkrijgen van stamcellen Dit onderwerp behandelt diverse microscopische technieken die worden gebruikt voor het bestuderen van cellen en weefsels. ### 16.1 Kleuringen voor lichtmicroscopie Kleuringen verhogen het contrast in weefselcoupes, waardoor structuren die anders transparant zouden zijn, zichtbaar worden. Kleurstoffen zijn doorgaans waterige oplossingen die via ionische binding aan specifieke celbestanddelen hechten, op basis van hun chemische eigenschappen [63](#page=63) [64](#page=64). #### 16.1.1 Hematoxyline en eosine (H/E) kleuring Dit is de meest gebruikte routinekleuring in het histologisch onderzoek [64](#page=64). * **Hematoxyline:** Werkt als een basische kleurstof na complexvorming met aluminiumzouten. Het is kationisch en bindt aan negatief geladen, basofiele componenten zoals nucleïnezuren in de celkern, wat resulteert in een blauw-paarse kleur. Goed gefixeerde kernen tonen intranucleaire details, en patronen van heterochromatinecondensatie zijn diagnostisch belangrijk [64](#page=64) [65](#page=65). * **Eosine:** Werkt als een zure kleurstof. Het is anionisch en bindt aan positief geladen, acidofiele componenten zoals eiwitten in het cytoplasma, wat resulteert in een roze kleur. Nucleoli worden met eosine gekleurd, en een blauwe gloed in het cytoplasma kan duiden op overvloedige polyribosomen [64](#page=64) [65](#page=65). H/E kleuring is essentieel voor het herkennen van weefseltypes en morfologische veranderingen, met name in de kankerdiagnose. Een beperking is de onverenigbaarheid met immunofluorescentie, hoewel het nuttig kan zijn voor seriële coupes. Hematoxyline alleen kan als tegenkleuring worden gebruikt in immunohistochemische of hybridisatieprocedures met colorimetrische substraten [65](#page=65) [66](#page=66). > **Tip:** Let op de verschillende patronen van heterochromatinecondensatie in de celkern, deze kunnen diagnostisch relevant zijn [65](#page=65). #### 16.1.2 Specifieke kleurtechnieken Naast H/E zijn er diverse specifieke kleurtechnieken: * **Indifferente kleurstoffen:** Kleuren vetten aan. Een voorbeeld is **Oil Red O** voor het aankleuren van vetcellen [68](#page=68) [69](#page=69). * **Immunohistochemische kleuring:** Detecteert specifieke bestanddelen op basis van antigen-antilichaam binding. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud. Een voorbeeld is de kleuring van microtubuli of connexine 43 [68](#page=68) [70](#page=70). * **Enzymkleuringen:** Tonen de activiteit van enzymen aan door middel van een enzym-specifiek substraat. De reactie resulteert in een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de kleuring van glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten [68](#page=68) [71](#page=71). ### 16.2 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen) die geëxciteerd licht uitzenden met een langere golflengte [72](#page=72) [73](#page=73). #### 16.2.1 Principe van fluorescentiemicroscopie * **Excitatielicht:** Licht van een specifieke golflengte wordt geabsorbeerd door het fluorofoor [73](#page=73). * **Emissielicht:** Het geabsorbeerde licht wordt uitgezonden als fluorescentiestraling met een langere golflengte [73](#page=73). * **Filters:** Excitatiefilters laten de excitatielichtgolflengte door, terwijl barrièrefilters (emissiefilters) het emissielicht doorlaten en het excitatielicht tegenhouden [73](#page=73) [74](#page=74). #### 16.2.2 Typen fluorescentiemicroscopie * **Epifluorescentie:** Gebruikt een lichtbron zoals een kwikdamplamp of LEDs [72](#page=72) [74](#page=74). * **Confocale laser scanning microscopie (CLSM):** Gebruikt een laser als exciterende lichtbron. Een pinhole zorgt ervoor dat alleen licht uit het gewenste focale vlak de detector bereikt, wat resulteert in optische secties. Dit verbetert de resolutie en reduceert achtergrondfluorescentie vergeleken met conventionele epifluorescentie [72](#page=72) [84](#page=84) [86](#page=86). #### 16.2.3 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie kan moleculen in levende of gefixeerde cellen aankleuren en kwantificeren [75](#page=75). * **Ion-gevoelige kleurstoffen:** De fluorescentie is afhankelijk van de ionenconcentratie, bijvoorbeeld voor het meten van intracellulair calcium [75](#page=75). * **Immunofluorescentiemicroscopie:** Detecteert specifieke eiwitten met behulp van antilichamen waaraan een fluorofoor is gekoppeld. Dit maakt visualisatie van specifieke eiwitten in gefixeerde cellen of weefsels mogelijk [75](#page=75) [77](#page=77). * **Tagging van eiwitten met fluorescerende eiwitten:** Maakt detectie van specifieke eiwitten in levende cellen mogelijk [75](#page=75). * **Visualisatie van organellen:** Bijvoorbeeld lysosomen en mitochondria in gecultiveerde cellen [76](#page=76). * **Dubbele fluorescentie:** Maakt het mogelijk om twee verschillende eiwitten tegelijkertijd aan te kleuren, bijvoorbeeld cytoskelet-kabels (actine) en cellulaire adhesiepunten (vinculine) [79](#page=79). > **Tip:** De golflengte van het emissielicht is altijd groter of gelijk aan de golflengte van het geabsorbeerde licht [73](#page=73). #### 16.2.4 4D Live Cell Imaging Deze techniek combineert 3D multi-kleuren imaging met time-lapse opnames om dynamische processen in levende cellen te bestuderen [89](#page=89). * **3D multi-kleuren imaging:** Registreert simultaan verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies [89](#page=89). * **Time lapse recording:** Registreert processen over een bepaalde periode met opnames op vaste tijdspunten [89](#page=89). De opstelling voor 4D Live Cell Imaging omvat een incubatiekamer, een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop, een digitale camera en een trillingsvrije tafel. Een voorbeeld is de opname van muisfibroblasten over 8 uur met opnames elke 30 seconden [90](#page=90) [91](#page=91). ### 16.3 Immunohistochemie voor specifieke eiwitten Immunohistochemie wordt gebruikt om de lokalisatie van specifieke eiwitten in weefselcoupes te bestuderen. Dit is relevant bij genetische ziekten, zoals mucoviscidose (cystic fibrosis), waarbij mutaties in het CFTR-gen leiden tot de productie van een verstoord CFTR-eiwit [93](#page=93). * **CFTR-eiwit:** Betrokken bij het transport van chloride-ionen door het celmembraan [93](#page=93). * **Wild-type CFTR:** Wordt naar de apicale membraan getransporteerd via het Golgi-netwerk [93](#page=93). * **CFTR-mutatie (bv. deletie op positie 508):** Leidt tot retentie van het eiwit in het ER en afbraak, wat resulteert in subcellulaire mislocatie [93](#page=93). Immunohistochemie kan de aanwezigheid van wild-type en mutante CFTR-eiwitten detecteren met behulp van specifieke antilichamen. Voorbeelden zijn de analyse van bronchiaal epitheel en huidzweetklieren [93](#page=93) [94](#page=94) [95](#page=95). ### 16.4 Virtuele microscopie Virtuele microscopie is een digitaal alternatief voor klassieke microscopie, waarbij cel- en weefselpreparaten in hun totaliteit met hoge resolutie worden ingescand en gedigitaliseerd voor weergave op een computerscherm. Dit maakt navigatie en zoomen in het beeld mogelijk [95](#page=95) [96](#page=96). ### 16.5 Flowcytometrie Flowcytometrie is een techniek voor het tellen en analyseren van microscopisch kleine deeltjes, zoals cellen, in een stromende vloeistof [96](#page=96). * **Principe:** Gebaseerd op lichtverstrooiing en fluorescentie. Individuele cellen, gelabeld met fluorescerende stoffen, passeren een laserstraal [97](#page=97). * **Analyse:** De fluorescentie en de verstrooiing van het licht door de cel worden gemeten om het aantal en de types cellen in het monster te bepalen [97](#page=97). ### 16.6 Elektronenmicroscopie (EM) Elektronenmicroscopen gebruiken elektronen in plaats van licht voor beeldvorming, wat een veel hogere resolutie mogelijk maakt [98](#page=98). #### 16.6.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) * **Principe:** Een elektronenbundel wordt door een ultradun preparaat gestuurd, waarbij de elektronen worden verstrooid door zware atoomkernen. Beeldvorming vindt plaats op een fluorescerend scherm [98](#page=98) [99](#page=99). * **Resolutie:** Tot 1 nanometer (nm) met vergrotingen tot wel 600.000x of meer [98](#page=98) [99](#page=99). * **Technische vereisten:** Vereist hoog vacuüm omdat elektronen gemakkelijk worden gestopt door gasmoleculen . * **Fixatie en kleuring:** Aangepaste technieken zijn nodig. Biologisch materiaal vertoont van zichzelf weinig contrast en wordt daarom behandeld met verbindingen van zware metalen (bijv. osmiumtetroxide, uranylacetaat, loodcitraat) die elektronen weerkaatsen. Negatieve kleuring (exclusie van zwaar metaal door het preparaat) en 'shadowing' (schuine bestuiving met metaal) zijn gebruikelijke technieken . * **Staalbereiding:** Vereist fixatie, spoeling, kleuring, dehydratatie en inbedding in hars. Vervolgens worden ultradunne coupes (50-100 nm) gesneden met een ultramicrotoom . * **Interpretatie:** Kan complex zijn door de 2D-weergave van 3D-structuren. Nauwkeurige 3D-reconstructies kunnen tijdrovend zijn . > **Tip:** De golflengte van elektronen is veel kleiner dan die van licht, wat de hogere resolutie in EM verklaart . #### 16.6.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) * **Principe:** Een elektronenbundel scant het oppervlak van het preparaat, waarbij teruggekaatste en secundaire elektronen worden gegenereerd. Deze worden gedetecteerd om een 3-dimensionaal beeld te reconstrueren [98](#page=98) [99](#page=99). * **Toepassing:** Vooral geschikt voor het bestuderen van oppervlaktestructuren van weefsels en materialen [99](#page=99). * **Voorbeeld:** SEM-analyse van het oppervlak van sarcomacellen in cultuur . #### 16.6.3 Speciale EM technieken * **Vries-breek (freeze-fracture) en Vries-ets (freeze-etching):** Technieken om celmembranen en hun structuren te bestuderen. Vries-etsen verwijdert een dunne laag ijs door sublimatie voor meer 3D-structuur. De vries-breek technologie levert informatie over membraanstructuren, zoals eiwitten in de dubbellaag . * **Cryo-elektronen-tomografie:** Maakt 3D-reconstructies mogelijk door een serie 2D-projecties te combineren die worden gemaakt terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld. Dit principe wordt toegepast om de structuur van bijvoorbeeld een nucleair pore-complex (NPC) te bestuderen . * **SBF-SEM & FIB-SEM (Serial Block Face-SEM & Focused Ion Beam-SEM):** Technieken waarbij materiaal sequentieel wordt verwijderd met een ultramicrotoom of ionenlaser om 3D-reconstructies te maken . * * * Dit onderwerp bespreekt diverse geavanceerde microscopische technieken die worden gebruikt om celstructuren en -componenten te bestuderen, met name gericht op de analysemethoden voor specifieke eiwitten en grotere celvolumes. ### 16.1 Microscopische analyse van celstructuren #### 16.1.1 Scanning Electron Microscopy (SEM) Scanning Electron Microscopy (SEM) wordt gebruikt om het oppervlak van cellen en weefsels te visualiseren met een hoge resolutie. Voor deze analyse worden monsters geleidend gemaakt voor elektriciteit door ze te bedekken met een uiterst dun laagje (1,5-3 nanometer) goud of goud/palladium met behulp van een sputter coater. Een voorbeeld hiervan is de SEM-analyse van epitheel van de trachea (luchtpijp), die twee celtypes toont: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak. De vergroting bij deze analyse is ongeveer 4.000 keer . #### 16.1.2 Transmission Electron Microscopy (TEM) voor eiwitdetectie Transmission Electron Microscopy (TEM) kan worden ingezet voor de detectie van specifieke eiwitten. Dit gebeurt door gebruik te maken van antilichamen die gericht zijn tegen specifieke eiwitten, zoals een antilichaam tegen een capsid-eiwit dat specifiek is voor een HIV-partikel. Deze methode laat zien hoe het virus uit de cel 'budt' . ### 16.2 Analyse van grotere celvolumes met geavanceerde SEM-technieken #### 16.2.1 Serial Block-Face SEM (SBF-SEM) Serial Block-Face SEM (SBF-SEM) is een techniek die de analyse van grotere celvolumes mogelijk maakt. Bij deze methode worden dunne lagen van het monster \_in situ verwijderd binnen de vacuümkamer van de SEM, met behulp van een diamantmes . #### 16.2.2 Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM) Focused Ion Beam SEM (FIB-SEM) is een vergelijkbare techniek voor de analyse van grotere volumes. Ook hier worden dunne lagen van het monster \_in situ verwijderd, maar in plaats van een diamantmes wordt hiervoor een focused ion beam gebruikt. Beide technieken, SBF-SEM en FIB-SEM, stellen onderzoekers in staat om driedimensionale structuren binnen cellen en weefsels met hoge resolutie te reconstrueren . > **Tip:** SBF-SEM en FIB-SEM zijn krachtige methoden voor het bestuderen van de driedimensionale architectuur van biologische monsters, wat essentieel is voor het begrijpen van celorganisatie en -functie. * * * ## Veelgemaakte fouten om te vermijden * Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens * Let op formules en belangrijke definities * Oefen met de voorbeelden in elke sectie * Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Term | Definitie | | Cellijn | Een populatie cellen die afkomstig is van een enkelvoudige cel of een klein aantal cellen en die in staat is om zich onbeperkt te delen in vitro, waardoor een homogene populatie ontstaat voor onderzoek. | | Enzymatische behandeling | Een proces waarbij enzymen worden gebruikt om weefsels af te breken en individuele cellen los te maken, wat een essentiële stap is bij het starten van celculturen uit orgaan- of tumormateriaal. | | Centrifugeren | Een techniek waarbij cellen met behulp van middelpuntvliedende kracht naar de bodem van een buis worden gescheiden, vaak gebruikt na enzymatische behandeling om de cellen te verzamelen. | | Groeirecipiënt | Een container, zoals een petrischaal of kweekfles, waarin cellen worden geplaatst en gekweekt onder specifieke omstandigheden om te overleven en te groeien. | | Confluente laag | Een situatie waarin cellen in een kweekgroeien totdat ze elkaar raken en een continue, uniforme laag vormen, wat vaak een signaal is om de cellen te splitsen. | | Monolaagcultuur | Een celkweek waarbij de cellen zich verspreiden en een enkele laag vormen op het oppervlak van het groeirecipiënt, kenmerkend voor veel epitheelcellen. | | Kolonies | Groepen cellen die ontstaan uit een enkele moedercel en zich delen, zichtbaar als discrete structuren binnen een celkweek. | | Minimum Essential Medium (MEM) | Een veelgebruikt celcultuurmedium dat essentiële componenten bevat zoals zouten, glucose, aminozuren, vitamines en vaak serum, om de groei van cellen in vitro te ondersteunen. | | Isotonische zouten | Zouten die een vergelijkbare osmotische druk hebben als de intracellulaire vloeistof, wat helpt bij het handhaven van de celintegriteit en pH-balans in celcultuurmedia. | | CO2-incubator | Een gespecialiseerde incubator die een gecontroleerde atmosfeer van 5% CO2 in lucht handhaaft, wat cruciaal is voor het stabiliseren van de pH van celcultuurmedia naar een fysiologische waarde van ongeveer 7,4. | | In vitro | Een proces of experiment dat plaatsvindt buiten een levend organisme, in een gecontroleerde laboratoriumomgeving, zoals celkweek. | | In vivo | Een proces of experiment dat plaatsvindt binnen een levend organisme. | | Contactinhibitie | Het fenomeen waarbij cellen in cultuur stoppen met delen zodra ze een confluente tweedimensionale monolaag vormen, vaak als gevolg van concurrentie voor groeifactoren (mitogenen). | | Monolaag (monolayer) | Een enkele laag cellen die zich op een substraat heeft verspreid en gehecht, kenmerkend voor 2D-celculturen. | | Mitogenen | Stoffen die celdeling stimuleren; concurrentie om deze stoffen kan bijdragen aan contactinhibitie. | | Dochterculturen | Nieuwe celculturen die worden gecreëerd door bestaande culturen te splitsen, waardoor de celpopulatie wordt uitgebreid en de groeiomstandigheden behouden blijven. | | Trypsine-EDTA procedure | Een methode die wordt gebruikt om adherente cellen los te maken van hun substraat en van elkaar, door trypsine (een protease) en EDTA (dat calcium en magnesium cheleert) te gebruiken. | | Adherente cellen | Cellen die zich hechten aan een oppervlak of substraat om te groeien en te delen, in tegenstelling tot suspensiecellen. | | Suspensiecultures | Cellen die in een vloeibaar medium zweven en zich niet aan een substraat hechten om te groeien. | | Confluentie | De toestand waarbij een celcultuur een volledige bedekking van het groeioppervlak bereikt, met cellen die elkaar raken. | | Protease-inhibitoren | Stoffen die de activiteit van proteasen, zoals trypsine, remmen. Deze zijn vaak aanwezig in serum en helpen bij het neutraliseren van trypsine na celafscheiding. | | Cel-substraat-binding | De interactie en hechting tussen cellen en het oppervlak waarop ze groeien. | | Intercellulaire adhesie | De interactie en hechting tussen individuele cellen onderling. | | Monocellulair | Verwijst naar een suspensie van cellen die voornamelijk uit individuele cellen bestaat, zonder significante aggregaten of meercellige structuren. | | Laminaire flowbench | Een werkstation dat een gecontroleerde, schone omgeving biedt voor celkweekwerkzaamheden door middel van een luchtstroom die deeltjes verwijdert en steriliteit handhaaft. | | HEPA filter | Een High Efficiency Particulate Air filter dat wordt gebruikt om de lucht te zuiveren van microscopische deeltjes, zoals bacteriën en virussen, wat essentieel is voor steriele celkweekomstandigheden. | | CO2-oven | Een incubator die een gecontroleerde omgeving met een specifieke temperatuur, vochtigheid en CO2-concentratie biedt, noodzakelijk voor de groei en het onderhoud van cellen in cultuur. | | Vloeibare stikstof | Een cryogeen vloeistof met een temperatuur van -196°C, gebruikt voor de langdurige opslag van cellen en biologisch materiaal om hun levensvatbaarheid te behouden. | | Celadhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat of aan elkaar, wat cruciaal is voor hun overleving, groei en functie in een celkweekomgeving. | | Celspreiding | Het proces waarbij cellen zich na uitplating progressief over een substraat verspreiden, wat gepaard gaat met veranderingen in de celvorm en de ontwikkeling van cel-substraatsverbindingen. | | Cytoskelet | Een netwerk van eiwitfilamenten in het cytoplasma van eukaryote cellen dat structuur, vorm en beweging van de cel ondersteunt en mogelijk maakt. | | Extracellulaire matrix (ECM) | Een complex netwerk van macromoleculen, zoals eiwitten en polysachariden, die door cellen worden uitgescheiden en de weefselstructuur ondersteunen en de celactiviteit reguleren. | | Stamcel | Een cel met het vermogen om zich voortdurend te delen en te differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere soorten cellen of weefsels. | | Zelfvernieuwing | Het vermogen van stamcellen om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te maken, waardoor de stamcelpopulatie behouden blijft. | | Differentiëren | Het proces waarbij een minder gespecialiseerde cel verandert in een meer gespecialiseerd celtype, zoals een spiercel, zenuwcel of bloedcel. | | Totipotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot een volledige foetus, inclusief de placenta. De bevruchte eicel in de eerste uren na de bevruchting is een voorbeeld. | | Pluripotente stamcel | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen. De binnenste celmassa van de blastocyst is een voorbeeld. | | Blastocyst | Een holle bal van ongeveer 140 totipotente stamcellen die zich vormt in de vroege stadia van de embryonale ontwikkeling, ongeveer 4 dagen na de bevruchting. | | Multipotente stamcel | Een stamcel die het potentieel heeft om zich te ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen binnen een specifieke weefsellijn, zoals hemopoëtische stamcellen die zich ontwikkelen tot verschillende bloedceltypen. | | Hemopoëtische stamcel | Een type multipotente stamcel dat zich kan ontwikkelen tot verschillende gespecialiseerde bloedcellen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen. | | Contaminatie met micro-organismen | Dit verwijst naar de aanwezigheid van ongewenste micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en mycoplasma's in celculturen, die de groei en het metabolisme van de cellen kunnen verstoren en moeilijk te detecteren of te elimineren zijn. | | Mycoplasma’s (PPLO) | Parasitaire micro-organismen die vaak intracellulair leven, het cellulair metabolisme verstoren door bijvoorbeeld verzuring van het milieu, en moeilijk te detecteren en te elimineren zijn uit celculturen. | | Genetische fingerprinting | Een techniek die wordt gebruikt om de genetische identiteit van cellen te bepalen en contaminaties met cellen van andere soorten, zoals muizen of ratten in menselijke cellijnen, te detecteren. | | Karyotypering | Een techniek waarbij het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen worden bepaald, gebruikt om de genetische zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen te meten. | | Inherente genetische instabiliteit | Het fenomeen waarbij het genotype van gecultiveerde cellen, gereflecteerd door chromosoomvorm en -aantal, in de loop van de tijd kan evolueren, wat beperkt kan worden door regelmatig terug te keren naar stock-cultures. | | Cryoprotectief middel | Een stof, zoals glycerol of DMSO, die wordt gebruikt om cellen te beschermen tegen schade tijdens het invriezen, door de vorming van ijskristallen te voorkomen. | | Fixeren | Een procedure waarbij cellen of weefsels worden behandeld om hun structuur te behouden en te voorkomen dat ze verder degraderen na het nemen van een monster, essentieel voor microscopische observatie. | | Inbedden en snijden | Technieken waarbij weefselmonsters worden ingebed in een ondersteunend materiaal (zoals paraffine) en vervolgens in dunne secties worden gesneden met een microtoom, om ze geschikt te maken voor microscopische analyse. | | Kleuren of contrasteren | Procedures die worden toegepast op weefselcoupes om specifieke structuren zichtbaar te maken onder een microscoop, door het aanbrengen van kleurstoffen die selectief binden aan verschillende componenten van de cel of het weefsel. | | Histologische technieken | Een verzameling procedures die worden gebruikt om cellen en weefsels voor te bereiden voor microscopische observatie, met als doel ze dun genoeg te maken voor licht- of elektronenpenetratie en om voldoende contrast te creëren voor het waarnemen van structuurdetails. | | Paraffine coupes | Dun gesneden secties van weefsel die zijn ingebed in paraffine, gebruikt voor microscopische analyse na kleuring, met diktes variërend van 0,5 tot 50 micrometer. | | Indifferente kleurstoffen | Kleurstoffen die vetten aankleuren, zonder specifieke affiniteit voor bepaalde moleculaire structuren. | | Immunohistochemische kleuring | Een techniek die specifieke bestanddelen in weefsels aankleurt door gebruik te maken van de binding tussen een antigeen en een antilichaam. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud om zichtbaarheid te creëren. | | Enzymkleuringen | Kleuringsmethoden die de activiteit van specifieke enzymen aantonen. Dit gebeurt door een voor het enzym geschikt substraat toe te voegen, wat resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag op de plaats van de enzymactiviteit. | | Oil Red O | Een specifieke kleurstof die gebruikt wordt om vetcellen aan te kleuren in histologisch onderzoek, waardoor vetweefsel zichtbaar wordt. | | Immunocytochemische kleuring (DAB) | Een vorm van immunochemische kleuring waarbij 3,3'-diaminobenzidine (DAB) wordt gebruikt als substraat om een bruine neerslag te vormen, die de locatie van het antigeen aangeeft. | | Tetrazoniumzoutmethode | Een methode die gebruikt wordt voor enzymkleuringen, specifiek voor het aantonen van de activiteit van enzymen zoals glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD). | | Epifluorescentiemicroscoop | Een type fluorescentiemicroscoop waarbij de excitatie- en emissielichtpaden gescheiden zijn, wat resulteert in een efficiënte verlichting van het monster en een hoge signaal-ruisverhouding. Dit type microscoop wordt vaak gebruikt voor standaard fluorescentie-imaging toepassingen. | | Confocaal laser scanning microscoop (CLSM) | Een geavanceerde fluorescentiemicroscoop die een laserstraal gebruikt om het monster punt voor punt optisch af te tasten. Een pinhole voor de detector verwijdert onscherp licht van buiten het focale vlak, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en een betere optische doorsnede van het monster. | | Pinhole | Een kleine opening in de optische pad van een confocale microscoop die fungeert als een ruimtelijk filter. Het laat alleen licht van het scherpe, gewenste focale vlak door naar de detector, terwijl licht van boven en onder dit vlak wordt geblokkeerd, wat bijdraagt aan de verbeterde resolutie. | | DIC (Differentieel Interferentie Contrast) | Een beeldvormingstechniek die wordt gebruikt om de morfologie van cellen en weefsels te visualiseren, vaak in combinatie met fluorescentie. DIC-microscopie maakt gebruik van interferentie van licht om subtiele verschillen in de brekingsindex van het monster zichtbaar te maken, wat resulteert in een pseudo-3D-weergave. | | Fluorochroom | Een fluorescerende kleurstof die specifiek bindt aan bepaalde moleculen of structuren binnen een cel of weefsel. Wanneer deze fluorochromen worden geëxciteerd door licht van een specifieke golflengte, zenden ze licht uit op een langere golflengte, wat detecteerbaar is met een fluorescentiemicroscoop. | | Deconvolutie-algoritmes | Softwarematige technieken die worden toegepast op conventionele digitale beelden om de onscherpte te verminderen die wordt veroorzaakt door de beperkte optische resolutie van de microscoop. Deze algoritmes reconstrueren een scherper beeld door de effecten van de puntspreidingsfunctie van het optische systeem te "ontwarren". | | Time lapse microscopie | Een techniek waarbij beelden van een levend monster met regelmatige tussenpozen worden opgenomen over een langere periode. Dit maakt het mogelijk om dynamische processen, zoals celbeweging, celdeling of moleculaire interacties, in de loop van de tijd te bestuderen. | | Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie | Een techniek waarbij softwarematige bewerkingen, genaamd deconvolutie-algoritmes, worden toegepast op conventionele digitale beelden om een hogere resolutie te verkrijgen. Dit proces verbetert de beeldkwaliteit door ruis en onscherpte te verminderen die inherent zijn aan de microscopie. | | Conventionele fluorescentiemicroscoop | Een standaard fluorescentiemicroscoop die beelden genereert die onderhevig kunnen zijn aan onscherpte en ruis, met name in de diepte (Z-richting). De deconvolutie-fluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om de beperkingen van deze microscopen te overwinnen. | | Confocale microscopie | Een geavanceerdere microscopietechniek die beter geschikt is voor het analyseren van dynamische processen en time-lapse opnames. Het biedt doorgaans een hogere resolutie en minder achtergrondruis dan conventionele methoden. | | 4D Live Cell Imaging | Een gecombineerde techniek die snelle 3D multi-kleuren beeldvorming en time-lapse opnames integreert. Het maakt de registratie van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies mogelijk, gecombineerd met opnames over een bepaalde tijdsperiode om dynamische processen te bestuderen. | | 3D multi-kleuren imaging | Het simultaan registreren van verschillende fluorochromen in de driedimensionale (XYZ) ruimte, vaak op meerdere posities. Dit stelt onderzoekers in staat om de ruimtelijke distributie van verschillende moleculen tegelijkertijd te bestuderen. | | Time lapse recording | De registratie van biologische processen gedurende een welbepaalde periode. Op vaste tijdspunten worden beelden genomen, die vervolgens worden geassembleerd tot een versnelde film om snelle veranderingen zichtbaar te maken. | | Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een microscopische techniek die elektronenbundels gebruikt om beelden van zeer dunne monsters te creëren. De elektronen gaan door het monster heen, waardoor gedetailleerde structuren zichtbaar worden op atomair niveau. | | Fixatie | Een voorbewerkingstap waarbij biologisch materiaal wordt behandeld met chemische stoffen, zoals glutaaraldehyde, om de fijne structuren zo intact mogelijk te bewaren en het monster doorlaatbaar te maken voor volgende stappen. | | Kleuring (in TEM) | Het behandelen van biologisch materiaal met verbindingen van zware metalen, zoals osmiumtetroxide of uranylacetaat. Deze verbindingen binden zich aan specifieke celregio's en weerkaatsen elektronen, waardoor deze structuren donker verschijnen in de microscoop. | | Dehydratatie | Het proces waarbij water uit het monster wordt verwijderd door middel van wasstappen met oplopende concentraties van ethanol of aceton. Dit is noodzakelijk omdat de kunstharsen die gebruikt worden voor het inbedden hydrofoob zijn. | | Inbedding in hars | Het infiltreren van het gedehydrateerde biologische materiaal met een vloeibare kunsthars, gevolgd door polymerisatie (uitharding) door middel van warmte, UV-licht of katalysatie. Dit resulteert in harde, snijdbare blokjes materiaal. | | Ultramicrotoom | Een gespecialiseerd instrument dat wordt gebruikt om extreem dunne coupes (plakjes) van het ingebedde materiaal te snijden, met een dikte van typisch 60 tot 90 nanometer. | | Gridje | Een klein metalen schijfje met een roosterpatroon waarop de ultradunne coupes worden opgevangen. Dit gridje wordt vervolgens in de transmissie-elektronenmicroscoop geplaatst voor observatie. | | Elektronenstrooiing | Het proces waarbij elektronen uit de bundel van de microscoop interageren met de atomen van het monster. Dichte structuren absorberen meer elektronen, wat resulteert in minder doorgelaten elektronen en dus een donkerder beeld. | | Contrasteren | Het verhogen van de densiteitsverschillen binnen het monster door het gebruik van zware metalen. Dit verbetert de zichtbaarheid van specifieke structuren in de TEM door een toename van elektronenstrooiing en dus contrast. | | Vries-breek (Freeze-fracture) | Een techniek waarbij cellulaire membranen worden gebroken, doorgaans tussen het binnenste en buitenste blad, om informatie te verkrijgen over membraanstructuren en de verdeling van eiwitten binnen de dubbele lipidenlaag. | | Vries-ets (Freeze-etching) | Een uitbreiding van vries-breek waarbij een dunne laag ijs van het preparaat wordt verwijderd door sublimatie onder vacuüm, wat resulteert in een grotere diepte en meer 3D-structuur die zichtbaar wordt gemaakt na bestuiving met zware atomen. | | Cryo-elektronen-tomografie (Cryo-electron tomography) | Een methode voor 3D-reconstructie van een object, waarbij een serie 2D-projecties wordt gemaakt terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld. De reconstructie vindt plaats door middel van Fourier-analyse van terugprojecties. | | SBF-SEM (Serial Block Face-SEM) | Een techniek waarbij een ultramicrotoom of ionenlaser delen van het monster verwijdert binnen de microscoop, waardoor opeenvolgende "blokgezichten" kunnen worden gescand met Scanning Electron Microscopy (SEM) voor 3D-reconstructie. | | FIB-SEM (Focused Ion Beam-SEM) | Een methode die gebruikmaakt van een gefocusseerde ionenbundel om materiaal weg te etsen, vaak in combinatie met SEM, om 3D-structuren op nanoschaal te analyseren door opeenvolgende lagen te verwijderen en te beeldvormen. | | Sublimatie | Het proces waarbij een stof direct overgaat van de vaste fase naar de gasfase, zonder eerst vloeibaar te worden. In vries-ets technieken wordt ijs gesublimeerd om meer oppervlaktestructuur bloot te leggen. | | Replica | Een negatieve afdruk van een oppervlak, gemaakt door het oppervlak te bestuiven met een zwaar metaal en vervolgens een dunne laag koolstof aan te brengen. Deze replica wordt vervolgens in een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) bekeken. | | Nucleair pore complex (NPC) | Een complex van eiwitten dat de nucleaire envelop van eukaryote cellen doordringt en de passage van moleculen tussen de kern en het cytoplasma reguleert. Cryo-elektronen-tomografie kan de 3D-structuur van NPC's gedetailleerd in beeld brengen. | | Dubbelbladige biologische membraan (Unit membrane) | De fundamentele structuur van biologische membranen, bestaande uit een dubbele laag fosfolipiden met daarin ingebedde eiwitten. Deze structuur is ook de begrenzing van organellen zoals cilia en microvilli. | | Basale membraan (Basal lamina) | Een dunne laag extracellulaire matrix die de basale zijde van epitheelcellen ondersteunt en scheidt van het onderliggende bindweefsel. Het fungeert als een steiger en filter. | | Fluorescentiemicroscopie | Een techniek die moleculen in (levende) cellen aankleurt en kwantificeert door gebruik te maken van fluorescerende stoffen die licht uitzenden na excitatie met specifieke golflengtes. | | Ion-gevoelige kleurstoffen | Moleculen waarvan de fluorescentie-eigenschappen veranderen in reactie op de concentratie van specifieke ionen, zoals calcium ($Ca^{2+}$), binnen een cel. | | Fura-2 | Een voorbeeld van een calcium-gevoelige kleurstof die gebruikt wordt om de intracellulaire concentratie van calciumionen te meten en te visualiseren in levende cellen. | | Immunofluorescentie microscopie | Een methode die specifieke eiwitten in cellen of weefsels detecteert door gebruik te maken van antilichamen waaraan een fluorescerende kleurstof (fluorochroom) is gekoppeld. | | Fluorescente eiwitten | Eiwitten die, wanneer ze genetisch worden gemarkeerd of tot expressie worden gebracht in cellen, licht kunnen uitzenden na excitatie, waardoor ze gebruikt kunnen worden voor het volgen van eiwitlokalisatie en -dynamiek in levende cellen. | | Organellen | Gespecialiseerde structuren binnen een cel met specifieke functies, zoals lysosomen en mitochondriën, die met fluorescentiemicroscopie gevisualiseerd kunnen worden. | | Gefixeerde cellen of weefsel | Cellulaire preparaten die behandeld zijn om hun structuur te behouden, waardoor ze geschikt zijn voor gedetailleerde analyse met technieken zoals immunofluorescentie microscopie. | | Dubbele fluorescentie | Een techniek waarbij twee verschillende fluorescerende labels worden gebruikt om twee verschillende moleculen of structuren binnen dezelfde cel tegelijkertijd te visualiseren en hun ruimtelijke relatie te bestuderen. | | Colocalisatie | Het verschijnsel waarbij twee verschillende moleculen of structuren zich op dezelfde locatie binnen een cel bevinden, wat aangetoond kan worden met dubbele fluorescentie microscopie. | | Vinculine | Een eiwit dat betrokken is bij de vorming van "voetjes" of adhesiepunten aan de extracellulaire matrix, en dat met fluorescentiemicroscopie gelokaliseerd kan worden. | | Microtoom | Een instrument dat wordt gebruikt voor het snijden van zeer dunne plakjes (coupes) van ingebed weefselmateriaal, essentieel voor zowel licht- als elektronenmicroscopie. | | Paraffine | Een klassiek inbedmiddel dat wordt gebruikt voor lichtmicroscopie, waardoor coupes met een dikte van ongeveer 5-10 µm verkregen kunnen worden. Het wordt verwarmd tot 55°C om te smelten en in het weefsel te dringen. | | Harsen en plastics | Hardere inbedmiddelen die gebruikt worden voor elektronenmicroscopie, waardoor coupes tot 60-70 nm dik gesneden kunnen worden. Polymerisatie van deze materialen gebeurt bij 60-65 °C. | | Lichtmicroscopie (LM) | Een microscopische techniek die gebruikmaakt van zichtbaar licht om beelden te vergroten. De resolutie wordt beperkt door de golflengte van het licht en bedraagt doorgaans ongeveer 200 nm. | | Elektronenmicroscopie (EM) | Een microscopische techniek die elektronenbundels gebruikt om beelden te vergroten, waardoor een veel hogere resolutie (tot 70 nm of beter) wordt bereikt dan met lichtmicroscopie. | | Resolutie | De kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden van elkaar waargenomen kunnen worden. Dit is een cruciale factor voor de detailweergave in microscopie. | | Condensor | Een onderdeel van een lichtmicroscoop dat het doorvallende licht bundelt op het preparaat, wat de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit beïnvloedt. | | Objectief | Het lenssysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het preparaat bevindt en een eerste, vergroot beeld vormt. Het objectief bepaalt, samen met de golflengte van het licht, de effectieve resolutie van de microscoop. | | Oculair | Het lenssysteem van een microscoop dat het door het objectief gevormde beeld verder vergroot en projecteert op het netvlies van de waarnemer. | | Helder veld / Klaar veld microscopie | Een type lichtmicroscopie waarbij het preparaat wordt belicht met doorvallend wit licht, waardoor het contrast wordt verkregen door lichtabsorptie van gekleurde structuren in het preparaat. | | HE-kleuring (Hematoxyline-Eosine) | Een veelgebruikte kleuringstechniek in de histologie waarbij hematoxyline zure (basofiele) componenten zoals celkernen blauw kleurt, en eosine eosinofiele/acidofiele stoffen zoals eiwitten roze kleurt. | | PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff) | Een kleuringstechniek die vrije suikers en koolhydraten in weefselcoupes aankleurt, vaak gebruikt om slijm en glycogeen zichtbaar te maken. | | Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij een preparaat wordt afgetast met een elektronenbundel; de detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen maakt de reconstructie van een driedimensionaal beeld van het oppervlak van het monster mogelijk. | | Elektromagnetische lenzen | Componenten in een elektronenmicroscoop die, in tegenstelling tot glaslenzen in een lichtmicroscoop, magnetische of elektrische velden gebruiken om de elektronenbundel te focussen en af te buigen, wat essentieel is voor beeldvorming. | | Hoog vacuüm | Een omgevingsconditie die vereist is voor elektronenmicroscopie omdat elektronen gemakkelijk worden gestopt door gasmoleculen; dit creëert een omgeving waarin de elektronenbundel ongehinderd kan reizen van de bron naar het monster en de detector. | | Negatieve kleuring | Een preparatietechniek voor elektronenmicroscopie waarbij het monster wordt omgeven door een zwaar metaalzout dat de elektronenbundel sterk verstrooit; het monster zelf neemt de kleurstof niet op en verschijnt als een helder object tegen een donkere achtergrond. | | Shadow casting (schaduwwerping) | Een preparatietechniek waarbij een monster onder een schuine hoek wordt bestoven met verdampt metaal (zoals platina of goud); dit creëert een driedimensionaal effect door de vorm van het monster te accentueren met schaduwen, waardoor details op het oppervlak zichtbaar worden. | | Ultradunne secties | Zeer dunne plakjes van biologisch materiaal, typisch 50-100 nanometer dik, die nodig zijn voor transmissie-elektronenmicroscopie; deze dunheid zorgt ervoor dat elektronen erdoorheen kunnen gaan en het interne structuur van de cel of weefsel zichtbaar maken. | | PAS-kleuring | Een histologische kleuringstechniek die vrije suikers en koolhydraten aankleurt, vaak gebruikt om slijm en microvilli in weefselcoupes te visualiseren. | | Hematoxyline | Een basische kleurstof die, in combinatie met een beitsmiddel zoals aluminiumzouten, negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern aankleurt, resulterend in een blauw-paarse kleur. | | Eosine | Een zure kleurstof die positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals eiwitten in het cytoplasma, aankleurt, resulterend in een roze kleur. | | HE-kleuring (Hematoxyline en Eosine) | Een veelgebruikte routinekleuringstechniek in de histologie die hematoxyline en eosine combineert om verschillende weefselstructuren zichtbaar te maken, waarbij kernen blauw-paars en cytoplasma en extracellulaire matrix roze kleuren. | | Fasecontrastmicroscopie | Een lichtmicroscopietechniek die kleine faseverschuivingen in licht, veroorzaakt door brekingsverschillen in het preparaat, omzet in amplitudeveranderingen (licht/donker) om contrast te genereren in ongekleurde preparaten, zoals levende cellen. | | Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie | Een techniek die gebruikmaakt van de interferentie van doorvallend gepolariseerd licht om verschillen in optische dichtheid binnen een preparaat om te zetten in een beeld met hoog contrast, vaak gebruikt voor levende, ongekleurde cellen. | | Basofiel | Verwijst naar celbestanddelen die een basische kleurstof aankleuren, zoals nucleïnezuren die door hematoxyline blauw-paars worden gekleurd. | | Acidofiel (Eosinofiel) | Verwijst naar celbestanddelen die een zure kleurstof aankleuren, zoals eiwitten die door eosine roze worden gekleurd. | | Microvilli (borstelzoom/staafjeszoom) | Kleine, vingerachtige uitsteeksels van het celmembraan aan het apicale oppervlak van epitheelcellen, die de oppervlakte vergroten voor absorptie en die door PAS-kleuring kunnen worden aangekleurd. | | Lamina propria | Het bindweefsel dat zich onder het epitheel bevindt in de wand van holle organen, zoals de darm. | | Submucosa | De laag bindweefsel die zich onder de lamina propria bevindt in de wand van holle organen. | | Crypten (Lieberkühn crypten) | Kleine klierbuizen die zich in de wand van de dunne darm bevinden en verantwoordelijk zijn voor de productie van darmsap. | | Excitatie | Het proces waarbij een fluorochroom fotonen absorbeert, wat leidt tot de stimulatie van elektronen naar een hogere energietoestand, waardoor de stof gaat fluoresceren. | | Emissie | Het proces waarbij een geëxciteerd fluorochroom terugkeert naar zijn grondtoestand door het uitzenden van fotonen, wat resulteert in fluorescentielicht dat een langere golflengte heeft dan het geabsorbeerde licht. | | Epifluorescentiemicroscopie | Een type fluorescentiemicroscopie waarbij het excitatielicht via dezelfde optische weg als het emissielicht de detector bereikt, wat resulteert in de verlichting van het gehele preparaat tegelijkertijd. | | Confocale laser scanning microscopie (CLSM) | Een geavanceerde fluorescentiemicroscopietechniek die een laserbundel gebruikt om het preparaat punt voor punt te scannen en een optische doorsnede te creëren, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en minder achtergrondruis. | | Golflengte | De afstand tussen opeenvolgende toppen of dalen van een golf, die de kleur van zichtbaar licht en de energie van fotonen bepaalt. Kortere golflengten bevatten meer energie. | | Excitatiespectrum | Een grafische weergave die de mate van absorptie van licht door een fluorochroom laat zien als functie van de golflengte van het invallende licht. | | Emissiespectrum | Een grafische weergave die de intensiteit van het door een fluorochroom uitgezonden licht laat zien als functie van de golflengte van het emissielicht. | | Barrièrefilter (Stopfilter) | Een filter in een fluorescentiemicroscoop dat het emissielicht van het fluorochroom doorlaat, maar het sterkere excitatielicht blokkeert om de detector te bereiken. | | Dichroïsche spiegel (Beamsplitter) | Een speciale spiegel die wordt gebruikt om het excitatielicht naar het preparaat te reflecteren en tegelijkertijd het emissielicht door te laten naar de detector, waardoor een efficiënte scheiding van de twee lichtpaden ontstaat. | | Celcultuur | Het in vitro kweken van cellen, weefsels of organen onder gecontroleerde omstandigheden. Dit omvat technieken zoals 2D-monolaagculturen en 3D-structuren. | | Monolaagcultuur (2D) | Een cultuurmethode waarbij cellen zich verspreiden en een enkele laag vormen op een substraat. Dit wordt vaak gebruikt om weefsels of organen te simuleren. | | Spheroid-vorming | Een methode waarbij cellen zich in een driedimensionale bolvormige structuur organiseren, vaak in collageengels. Dit kan worden gebruikt om 3D-weefselstructuren te modelleren. | | Immortalisatie | Het proces waarbij cellen in cultuur een onbeperkte levensduur verkrijgen, waardoor ze oneindig kunnen delen. Dit kan spontaan gebeuren, bijvoorbeeld bij tumorcellen, of geïnduceerd worden. | | Senescence | Het proces van veroudering in cellen, waarbij de celdeling vertraagt of stopt. Na verloop van tijd sterven de meeste cellen af. | | Passage | Het proces van het splitsen en verdelen van cellen uit een bestaande celcultuur naar nieuwe kweekmedia en recipiënten. Dit is noodzakelijk om de cellen in leven te houden en te laten groeien. | | Groeimedium | Een voedingsoplossing die essentiële componenten bevat, zoals zouten, glucose, aminozuren, vitaminen en serum, om de groei en het onderhoud van cellen in vitro te ondersteunen. |