Ppt3_qPCR.pdf

# Het principe en verloop van kwantitatieve PCR (qPCR) Kwantitatieve PCR (qPCR) maakt continue detectie van DNA-amplificatie over tijd mogelijk, wat essentieel is voor kwantificering, in tegenstelling tot klassieke PCR [9](#page=9). ### 1.1 Principe van qPCR Klassieke PCR is niet geschikt voor het kwantificeren van doelwit-DNA in een monster, omdat de amplificatie pas achteraf wordt gevisualiseerd, bijvoorbeeld door gelelektroforese. qPCR, ook wel real-time PCR genoemd, stelt echter in staat de PCR-reactie continu te volgen en de DNA-toename cyclus per cyclus waar te nemen. Dit wordt bereikt door het gebruik van een fluorescente detectormolecule die bindt aan het PCR-product, waardoor de fluorescentie tijdens de reactie gemeten kan worden [7](#page=7) [9](#page=9). #### 1.1.1 Verschil met klassieke PCR Het kernverschil ligt in de detectiemethode: klassieke PCR is een "end-point" analyse, terwijl qPCR een "real-time" analyse is. Kleine variaties in PCR-efficiëntie kunnen bij klassieke PCR leiden tot grote verschillen in het eindproduct, wat kwantificering onbetrouwbaar maakt. qPCR daarentegen meet de fluorescentie tijdens de amplificatie, wat veel gevoeliger is voor variaties [14](#page=14) [15](#page=15) [9](#page=9). #### 1.1.2 Vereisten voor het amplicon De algemene regels voor PCR-producten (amplicons) blijven gelden voor qPCR [10](#page=10): * Het amplicon dient maximaal 100 bp te zijn [10](#page=10). * Secundaire structuren in het amplicon moeten laag gehouden worden [10](#page=10). * Vermijd 3'-self-complementariteit [10](#page=10). * Het aantal cycli moet zorgvuldig gekozen worden om competitie tussen primers en amplicon voor binding aan de template te minimaliseren en 5'-3' exonuclease afbraak van het amplicon te voorkomen [10](#page=10). ### 1.2 Verloop van qPCR Een typisch qPCR-experiment wordt in de praktijk minimaal in duplo, maar meestal in triplo uitgevoerd, met de mogelijkheid tot schaalvergroting van het experiment [11](#page=11). #### 1.2.1 Thermische cycli en detectie De thermische cycli omvatten doorgaans de volgende stappen: * **Initiële denaturatie:** Vaak 95°C gedurende 2 tot 5 minuten [12](#page=12) [13](#page=13). * **Denaturatie:** 95°C gedurende 15 tot 30 seconden [12](#page=12) [13](#page=13). * **Annealing:** 60°C gedurende 30 seconden of 45 seconden [12](#page=12) [13](#page=13). * **Elongatie:** 72°C gedurende 30 seconden, waarbij detectie plaatsvindt. De eindelongatie is niet van tel voor de kwantificering in qPCR [12](#page=12) [13](#page=13). Na de amplificatiecycli volgt een smeltpuntbepaling, waarbij de detectie plaatsvindt bij stijgingen van 0.5°C of minder. Het aantal cycli is doorgaans rond de 40 [11](#page=11) [12](#page=12) [13](#page=13). ### 1.3 Visualisatie en analyse van qPCR data De resultaten van qPCR worden weergegeven in een amplificatieplot, die de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit uitzet tegen het cyclusnummer [16](#page=16) [8](#page=8). #### 1.3.1 Normalisering van het fluorescent signaal Het fluorescente signaal (Rn) wordt genormaliseerd ten opzichte van een passieve interne referentie, zoals ROX (ROX = een fluorochroom dat niet deelneemt aan de amplificatie). Deze normalisatie corrigeert voor variatie tussen de verschillende wells van het experiment, zoals pipetteerfouten en variaties in fluorescentiedetectie van het apparaat. ROX is vaak aanwezig in qPCR ready mixes of buffers [18](#page=18). #### 1.3.2 Fasen van de amplificatieplot Een amplificatieplot kan worden onderverdeeld in vier fasen [19](#page=19) [20](#page=20) [21](#page=21) [22](#page=22): 1. **Basislijn of ruis:** De fase waarin het fluorescent signaal significant lager is dan de detectielimiet [22](#page=22). 2. **Vroege exponentiële fase:** Hier begint de verdaderoedubbeling van het PCR-product per cyclus (in theorie). Dit is de meest betrouwbare fase voor kwantificering en waar de drempel (threshold) wordt ingesteld [22](#page=22) [23](#page=23). 3. **Late exponentiële fase (Log-lineair):** De amplificatie vertraagt doordat de bouwstenen schaarser worden [22](#page=22). 4. **Plateaufase:** De reactie stopt en er wordt geen nieuw PCR-product meer gevormd [22](#page=22). #### 1.3.3 Bepaling van de Cq-waarde De **Ct-waarde** of **Cq-waarde** (threshold cycle) is het cyclusnummer waarbij de fluorescentie de ingestelde drempel overschrijdt. De drempellijn wordt geplaatst in een stabiele zone van de vroege exponentiële fase. De Cq-waarde wordt automatisch berekend, maar kan ook handmatig bepaald worden door een rechte lijn parallel aan de X-as te tekenen op de best passende plaats [23](#page=23). > **Tip:** Het correct plaatsen van de drempellijn is cruciaal voor accurate kwantificering. Zorg dat deze in de exponentiële fase ligt [23](#page=23). ### 1.4 Relatie tussen templatehoeveelheid en Cq-waarde Er bestaat een omgekeerd evenredig verband tussen de Cq-waarde en de logaritme van het aantal doelwit-DNA (of RNA) moleculen aan het begin van de reactie [27](#page=27). * Een hogere hoeveelheid template aan het begin van de reactie leidt tot een snellere overschrijding van de detectiedrempel [25](#page=25). * Dit resulteert in een vroegere start van de exponentiële fase en dus een lagere Cq-waarde [25](#page=25). * Een hogere hoeveelheid template leidt ook tot het sneller bereiken van de plateaufase [25](#page=25). > **Tip:** Cq-waarden boven 35-38 worden als onbetrouwbaar beschouwd. Een minimaal verschil in Cq-waarden kan duiden op een significant verschil in templatehoeveelheid [25](#page=25). #### 1.4.1 Interpretatie van Cq-waarden * Als de exponentiële fase in slechts één staal niet wordt bereikt, kan dit duiden op een probleem met dat specifieke staal [28](#page=28). * Als de exponentiële fase in alle stalen niet wordt bereikt, kan dit wijzen op een probleem met de PCR-reactie zelf, zoals de primers, de mastermix, of de thermocycler [28](#page=28). > **Example:** Een staal met een Cq-waarde van 22 bevat bij de start van de qPCR meer DNA-moleculen dan een staal met een Cq-waarde van 26. De amplificatiecurve voor staal A zal steiler en vroeger de drempel overschrijden dan die van staal B [26](#page=26) [29](#page=29). --- # Berekeningsmethoden voor qPCR resultaten Dit deel behandelt de verschillende methoden voor de kwantificering van qPCR-resultaten, inclusief de Delta-delta-Cq methode en de standaardcurve methode, evenals de berekening van PCR-efficiëntie. ### 2.1 Principes van qPCR resultaatberekening De berekening van qPCR-resultaten is afhankelijk van de toepassing. Resultaten kunnen op verschillende manieren worden weergegeven [30](#page=30): * **Cq waarde:** Een eenvoudig 'ja/nee' indicatie van de aanwezigheid van de target [30](#page=30). * **Cq waarde voor 'fold change'**: Dit wordt gebruikt voor relatieve kwantificering, waarbij de verandering ten opzichte van een referentie wordt uitgedrukt [30](#page=30). * **Cq waarde voor absolute waarde**: Dit wordt gebruikt voor absolute kwantificering, waarbij een specifieke hoeveelheid template DNA (bijvoorbeeld 5 picogram) aan het begin van het experiment wordt bepaald [30](#page=30). De methoden voor berekening omvatten de Delta-delta-Cq methode voor relatieve kwantificering en de standaardcurve methode die zowel voor absolute als relatieve kwantificering kan worden ingezet. Gespecialiseerde software wordt vaak gebruikt voor deze analyses [31](#page=31). ### 2.2 De delta-delta-Cq methode De Delta-delta-Cq methode, ook wel de vergelijkende Ct methode genoemd, is een methode voor relatieve kwantificering. Deze methode wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheid DNA template aan het begin van een experiment te bepalen, in vergelijking met een controlestaal, om zo de 'fold change' te berekenen [33](#page=33). De berekening verloopt in twee stappen: 1. **Berekening van de Delta Cq (ΔCq)**: De ΔCq waarde voor een staal wordt berekend door de Cq waarde van de referentie af te trekken van de Cq waarde van het staal van interesse. $$ \Delta Cq_{\text{staal}} = Cq_{\text{staal}} - Cq_{\text{referentie}} $$ [34](#page=34). 2. **Berekening van de Delta Delta Cq (ΔΔCq)**: De ΔΔCq waarde wordt berekend door de ΔCq waarde van de referentie af te trekken van de ΔCq waarde van het staal. $$ \Delta\Delta Cq = \Delta Cq_{\text{staal}} - \Delta Cq_{\text{referentie}} $$ [34](#page=34) [38](#page=38). 3. **Berekening van de Fold Change**: De fold change, die aangeeft hoeveel maal de hoeveelheid target is veranderd, wordt berekend met de volgende formule: $$ \text{Fold change} = 2^{-\Delta\Delta Cq} $$ [34](#page=34) [38](#page=38). > **Tip:** De delta-delta-Cq methode gaat uit van een PCR-efficiëntie van 100% [42](#page=42). #### 2.2.1 Toepassing van de delta-delta-Cq methode **Voorbeeld 1: Oppvolging besmetting met Groep A-streptokokken** [35](#page=35). * Staal A (controle/referentie): Cq = 32 * Staal B (onbehandeld): Cq = 25 * ΔCq (staal B) = $Cq_{\text{staal B}} - Cq_{\text{staal A}} = 25 - 32 = -7$ [35](#page=35). * Fold change = $2^{-\Delta Cq_{\text{staal B}}} = 2^{-(-7)} = 2^7 = 128$ [35](#page=35). * **Conclusie:** Er is 128 keer meer Streptokokken aanwezig in staal B ten opzichte van staal A [35](#page=35). **Voorbeeld 2: Start behandeling met medicijn (testfase) voor Groep A-streptokokken** [36](#page=36). * Staal C (controle/referentie): Cq = 25 * Staal D (behandeld na 2 weken): Cq = 34,5 * ΔCq (staal D) = $Cq_{\text{staal D}} - Cq_{\text{staal C}} = 34,5 - 25 = 9,5$ [36](#page=36). * Fold change = $2^{-\Delta Cq_{\text{staal D}}} = 2^{-9,5} \approx 0,00138$ [36](#page=36). * **Conclusie:** Er is 0,00138 keer meer Streptokokken aanwezig in staal D ten opzichte van staal C, wat betekent dat er 724 keer minder Streptokokken aanwezig zijn in staal D vergeleken met staal C ($1 / 0,00138 \approx 724$) [36](#page=36). #### 2.2.2 Delta-delta-Cq methode bij RT-qPCR of met interne controle Bij RT-qPCR of bij het gebruik van een interne controle, wordt de expressie van een gen van interesse vergeleken met de expressie van een huishoudgen (een stabiel en constitutief tot expressie komend gen). De interne controle kan endogeen zijn of 'gespike' worden [37](#page=37) [38](#page=38). De formule voor de fold change blijft hetzelfde: $$ \text{Fold change} = 2^{-\Delta\Delta Cq} $$ [38](#page=38). Waar: $$ \Delta Cq_{\text{staal}} = Cq_{\text{gen van interesse}} - Cq_{\text{huishoudgen}} $$ [40](#page=40). $$ \Delta\Delta Cq = \Delta Cq_{\text{staal}} - \Delta Cq_{\text{referentie}} $$ [40](#page=40). **Voorbeeld: Analyse van IL-6 genexpressie na behandeling (farmaceutische studie)** [39](#page=39) [40](#page=40). * **Condities:** * Solvent (referentie): Cq (IL-6) = 25, Cq (beta-actine) = 18 * Pomalidomide: Cq (IL-6) = 29, Cq (beta-actine) = 17 * Lenalidomide: Cq (IL-6) = 28, Cq (beta-actine) = 17,5 * **Berekening voor Pomalidomide:** * ΔCq (IL-6, Pomalidomide) = $29 - 17 = 12$ * ΔCq (IL-6, Solvent) = $25 - 18 = 7$ * ΔΔCq (Pomalidomide) = $12 - 7 = 5$ [40](#page=40). * Fold change (Pomalidomide) = $2^{-5} = 0,031$ [40](#page=40). * **Berekening voor Lenalidomide:** * ΔCq (IL-6, Lenalidomide) = $28 - 17,5 = 10,5$ * ΔCq (IL-6, Solvent) = $25 - 18 = 7$ * ΔΔCq (Lenalidomide) = $10,5 - 7 = 3,5$ [40](#page=40). * Fold change (Lenalidomide) = $2^{-3,5} \approx 0,088$ [40](#page=40). * **Conclusie:** Behandeling met Pomalidomide leidt tot een daling van de IL-6 genexpressie met een factor 1/0,031 ≈ 32 ten opzichte van het referentiegen beta-actine. Behandeling met Lenalidomide leidt tot een daling met een factor 1/0,088 ≈ 11,4. Dit suggereert dat Pomalidomide effectiever is in het onderdrukken van IL-6 expressie [40](#page=40). #### 2.2.3 Beperkingen van de delta-delta-Cq methode * De methode is complexer bij het gebruik van meerdere referentiegenen. Tegenwoordig worden er normaal gesproken 3 referentiegenen gebruikt bij RT-qPCR [42](#page=42). * De methode gaat uit van 100% PCR-efficiëntie, wat in de praktijk niet altijd het geval is. Variaties in PCR-efficiëntie kunnen leiden tot onnauwkeurigheden [42](#page=42) [45](#page=45). * Grote artefacten in de huishoudgenen kunnen grote gevolgen hebben voor de resultaten [42](#page=42). > **Tip:** Het perfecte huishoudgen bestaat niet. Een oplossing hiervoor is het middelen over meerdere huishoudgenen, wat een andere berekeningsmethode vereist [43](#page=43). ### 2.3 De standaardcurve methode De standaardcurve methode maakt absolute kwantificering mogelijk, wat betekent dat de exacte hoeveelheid DNA template aan het begin van het experiment kan worden bepaald. Dit is mogelijk mits de hoeveelheid van het target DNA in de standaard bekend is. De methode kan ook gebruikt worden voor relatieve kwantificering [47](#page=47). #### 2.3.1 Benodigdheden voor de standaardcurve methode * **Template met gekende concentratie:** Dit vormt de basis voor de standaardcurve [48](#page=48). * **Verdunningsreeks:** Een serie van bekende concentraties, bijvoorbeeld seriële verdunningen van 1/5 of 1/10, wordt aangemaakt [48](#page=48). * **Standaardcurve:** * De Y-as van de curve vertegenwoordigt de Cq-waarden [48](#page=48) [51](#page=51). * De X-as van de curve vertegenwoordigt de logaritme van de concentratie van de template. Dit kan een absolute eenheid zijn (zoals kopie-aantal, nanogram) of een relatief getal (bijvoorbeeld de plaats in de verdunningsreeks) [48](#page=48) [51](#page=51). * De standaardcurve wordt vaak beschreven door een lineaire vergelijking: $$ Y = ax + b $$ [50](#page=50). Hierbij is $Y$ de Cq waarde, $x$ de logaritme van de concentratie, $a$ de helling (slope) en $b$ het y-intercept [50](#page=50). #### 2.3.2 Bepalen van de PCR efficiëntie met de standaardcurve De PCR-efficiëntie ($E$) is cruciaal voor nauwkeurige kwantificering. Idealiter is deze 100%, maar acceptabele waarden liggen tussen 90% en 110% [52](#page=52). De PCR-efficiëntie kan worden berekend uit de helling ($m$) van de standaardcurve [53](#page=53): $$ E = (10^{-1/m} - 1) \times 100\% $$ [55](#page=55). * Bij een efficiëntie van 100% is de helling $m = -1 / \log_2 \approx -3,32$ [53](#page=53). * Grotere negatieve waarden voor de helling duiden op een minder efficiënte reactie [53](#page=53). > **Tip:** De PCR-efficiëntie moet altijd gecontroleerd worden om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen [57](#page=57). #### 2.3.3 Proces van qPCR berekening obv standaardcurve 1. **Standaardcurve maken:** Teken een grafiek met de Cq-waarden (Y-as) tegen de logaritme van de concentraties (X-as) van de verdunningsreeks [48](#page=48) [56](#page=56). 2. **PCR efficiëntie berekenen:** Bepaal de helling van de standaardcurve en bereken de PCR-efficiëntie met de formule. Beoordeel of deze binnen de acceptabele marge van 90-110% valt [52](#page=52) [53](#page=53) [55](#page=55) [56](#page=56). 3. **Staalanalyse:** Gebruik de standaardvergelijking ($Y = ax + b$) om de Cq-waarden van de onbekende stalen om te zetten in een relatief getal of absolute hoeveelheid [56](#page=56). 4. **Relatieve kwantificering (met standaardcurve):** * Bereken de gemiddelde Cq-waarden voor het gen van interesse en voor het referentiegen per staal [58](#page=58). * Deel het gemiddelde van het gen van interesse door het gemiddelde van het referentiegen [58](#page=58). * Vergelijk de waarden van de behandelde stalen met de solventcontrole [58](#page=58). 5. **Besluitvorming:** Interpreteer de resultaten en vorm een conclusie [57](#page=57) [58](#page=58). #### 2.3.4 Omgaan met meerdere referentiegenen bij standaardcurve methode Wanneer meerdere referentiegenen worden gebruikt, wordt de gemiddelde waarde van deze referentiegenen gebruikt om mee te delen. Het is echter essentieel dat de referentiegenen een verband hebben met elkaar en vergelijkbaar gedrag vertonen [59](#page=59). > **Tip:** Analyseer de amplificatiecurve, smeltcurve (indien mogelijk) en de PCR-efficiëntie kritisch voordat u de staalanalyse uitvoert. Grote artefacten in huishoudgenen kunnen grote gevolgen hebben [42](#page=42) [57](#page=57). ### 2.4 Overige overwegingen * **PCR inhibitoren:** PCR-inhibitoren kunnen de PCR-efficiëntie negatief beïnvloeden. Het analyseren van de amplificatiecurve kan hier inzicht in geven [45](#page=45) [57](#page=57). * **NTC (No Template Control):** Controleer op contaminatie door het analyseren van NTCs in de amplificatiecurve [57](#page=57). * **Software:** Gespecialiseerde software zoals qBASE, LightCycler 480, of andere platforms (bv. FBT-Qiaquant, MLT-Cobas, Lightcycler) kan gebruikt worden voor de analyse [31](#page=31) [56](#page=56). --- # DNA-detectiemoleculen en melt curve analyse Dit onderwerp behandelt de verschillende soorten DNA-detectiemoleculen die gebruikt worden in qPCR, waaronder SYBR Green en probes, en de techniek van smeltcurve analyse. Real-time PCR is enkel mogelijk door het gebruik van een detectiemolecule die fluoresceert nadat deze aan het amplicon gebonden heeft. De hoeveelheid fluorescentie die in elke cyclus gemeten wordt, is proportioneel aan de hoeveelheid PCR-product die gevormd werd [60](#page=60) [61](#page=61). ### 3.1 Soorten DNA-detectiemoleculen Er zijn grofweg twee hoofdtypes DNA-detectiemoleculen: fluorescente kleurstoffen voor DNA en probes [61](#page=61). #### 3.1.1 SYBR Green en andere fluorescente kleurstoffen voor DNA SYBR Green intercaleert tussen de basenparen van dubbelstrengs DNA (dsDNA) en fluoresceert groen (emissiemax 520 nm) bij bestraling met blauw licht (excitatiemax 497 nm). Hoe meer PCR-product er is, hoe meer SYBR Green kan binden, en hoe sterker de fluorescentie [62](#page=62). **Voordelen:** * Eenvoudig in gebruik [63](#page=63). **Nadelen:** * Kan aan al het DNA binden, wat het minder ideaal maakt voor toepassingen die primair gericht zijn op kwantificering [63](#page=63). Een voorbeeld van een kit gebaseerd op SYBR Green is de PRIMEPCR SYBR® GREEN ASSAY: APOBEC3D, HUMAN kit van Bio-rad [63](#page=63). SYBR Green is heel geschikt voor melt(ing) curve analyse. Wanneer een PCR goed ontworpen is, kan een single nucleotide polymorphism (SNP) al leiden tot een afwijkende smelttemperatuur ($T_m$) waarde van het PCR-product. Door na qPCR de smeltcurve van de bekomen reactieproducten te bepalen en via de software de $T_m$ hieruit af te leiden, kan men onderscheid maken tussen allelen die in sequentie verschillen [65](#page=65). > **Tip:** Hoewel SYBR Green bindt aan al het dsDNA, kan dit in bepaalde gevallen juist nuttig zijn voor de analyse, met name voor het monitoren van de amplificatie en het uitvoeren van smeltcurve analyses [65](#page=65). In geval van twijfel kan een met SYBR Green gedetecteerde qPCR nog op een agarosegel gezet worden voor verdere verificatie van de PCR-producten [70](#page=70). #### 3.1.2 Probes Om specifieke detectie mogelijk te maken, zijn er detectorprobes ontwikkeld die enkel aan het beoogde PCR-product binden. Verschillende soorten probes bestaan, waaronder Taqman probes, molecular beacons, dual hybridisation probes en scorpion probes [75](#page=75) [76](#page=76). ##### 3.1.2.1 Taqman probe Een Taqman probe is een korte DNA-sequentie die specifiek bindt aan het PCR-product. Tijdens de extensie fase van de PCR, knipt een polymerase met 5' naar 3' exonuclease activiteit de probe, wat leidt tot de vrijgave van een fluorofoor en een quencher. Hoe meer probe er geknipt wordt, hoe meer amplicons er zijn, en dus hoe meer template er oorspronkelijk in de qPCR-reactie aanwezig was [77](#page=77) [78](#page=78). **Voordelen:** * Hoge specificiteit [79](#page=79). * Mogelijkheid tot multiplex PCR mits gebruik van een verschillende fluorescente groep voor elke probe [79](#page=79). **Nadelen:** * Hogere kosten van de probe [79](#page=79). * Complexiteit van het assay design [79](#page=79). * Vereist DNA-polymerasen met 5' naar 3' exonuclease activiteit [79](#page=79). * Kan niet gebruikt worden voor een smeltcurve analyse [79](#page=79). ##### 3.1.2.2 Molecular beacon Een molecular beacon is een hairpin-structuur probe met aan de uiteinden een fluorofoor en een quencher. In de open, lineaire vorm (wanneer gebonden aan het doel-DNA) zijn de fluorofoor en de quencher van elkaar gescheiden, waardoor fluorescentie wordt waargenomen. De probe mag bij een lagere temperatuur binden dan de extensietemperatuur, waardoor de probe hybridisatiestap en afleesstap losgekoppeld kunnen worden van de synthesestap. Beacon DesignerTM is een softwarepakket speciaal ontworpen voor het design van molecular beacons [80](#page=80) [81](#page=81) [82](#page=82). ##### 3.1.2.3 Dual hybridisation probe Dual hybridisation probes maken gebruik van fluorescentie resonance energy transfer (FRET). Dit principe houdt in dat de emissiegolflengte van de ene fluorescente groep (de donor, D) overeenkomt met de excitatiegolflengte van de andere fluorescente groep (de reporter, R). FRET treedt enkel op wanneer de afstand tussen de donor en de reporter niet te groot is, bijvoorbeeld tussen een fluoresceïne-rhodaminekoppel wanneer de tussenliggende afstand 4 tot 5 nucleotiden bedraagt. Deze probes binden aan het DNA tijdens de annealing stap, en de detectie gebeurt VOOR de elongatie [84](#page=84) [86](#page=86) [87](#page=87). ##### 3.1.2.4 Scorpion probe Scorpion probes combineren de primer en de probe in één molecuul. Na amplificatie vouwt de probe zich om te hybridiseren met het amplicon, wat leidt tot een fluorescente signaal [88](#page=88). ### 3.2 Melting curve analyse Melting curve analyse is een techniek die wordt uitgevoerd na de qPCR-cyclus. Hierbij wordt de fluorescentie gemeten terwijl de temperatuur geleidelijk wordt verhoogd. De analyse focust op de afgeleide van de fluorescentie ten opzichte van de temperatuur ($-dF/dT$) versus de temperatuur ($T$) [66](#page=66). * **Eén product:** Resulteert in één piek in de smeltcurve [67](#page=67). * **Meerdere producten:** Meerdere pieken worden gedetecteerd [73](#page=73). * **Primer dimeer analyse:** Smeltcurve analyse kan gebruikt worden om de aanwezigheid van primer dimeren te detecteren, die doorgaans een lagere smelttemperatuur hebben dan het beoogde amplicon [68](#page=68) [69](#page=69). > **Tip:** De smelttemperatuur ($T_m$) van een amplicon kan worden afgeleid uit de smeltcurve door het punt te bepalen waar de fluorescentie het snelst afneemt (het midden van de piek) [73](#page=73). qPCR, naast kwantificering, biedt ook veel mogelijkheden voor het opsporen en identificeren van allelen en voor het automatiseren van detectieprocessen. Smeltcurve analyse, bijvoorbeeld, kan toegepast worden voor de amplificatie van genomisch DNA van verwante bacteriën om onderscheid te maken op basis van genetische verschillen [71](#page=71) [72](#page=72). --- # Droplet Digital PCR (ddPCR) Droplet Digital PCR (ddPCR) is een geavanceerde kwantificatiemethode die absolute concentraties van nucleïnezuren met hoge precisie kan bepalen [94](#page=94). ### 4.1 Concept en workflow van ddPCR ddPCR is gebaseerd op het principe van het verdelen van een PCR-reactiemix in tienduizenden tot honderdduizenden minuscule druppels, ook wel 'droplets' genoemd. Elke druppel fungeert als een individuele reactie-eenheid waarin een PCR-reactie plaatsvindt. Na afloop van de PCR wordt de fluorescentie van elke druppel gemeten. De gegevens van alle druppels worden vervolgens geanalyseerd met behulp van Poisson-statistieken om de absolute concentratie van het doelmolecuul in het oorspronkelijke monster te bepalen [96](#page=96) [97](#page=97) [98](#page=98). #### 4.1.1 De droplet generator De workflow van ddPCR begint met het genereren van een water-in-olie-emulsie van minuscule druppels. Een enkel monster van bijvoorbeeld 20 microliter wordt verdeeld over tienduizenden droplets [96](#page=96) [98](#page=98). #### 4.1.2 De PCR-reactie in droplets Elke druppel bevat een enkele qPCR-reactie die een Taqman probe gebruikt. De Taqman probe fungeert als een limiterend agens in de reactie. Na de PCR-cyclus wordt de fluorescentie van elke druppel gemeten met behulp van een flowcytometer [97](#page=97). #### 4.1.3 Reactiemix De ddPCR reactiemix bevat de volgende componenten: * Primers [100](#page=100). * Probes, waaronder Taqman Probe 1 (met FAM voor kleur 1) en Taqman Probe 2 (met HEX of VIC voor kleur 2) [100](#page=100). * ddPCR Supermix (met dNTP's, polymerase, buffer en MgCl2) [100](#page=100). * DNA template [100](#page=100). #### 4.1.4 Resultaatverwerking Een positieve druppel wordt gedefinieerd als een druppel met een fluorescentie-intensiteit boven een bepaalde detectielimiet, wat overeenkomt met de aanwezigheid van het doelmolecuul. Een negatieve druppel heeft een fluorescentie-intensiteit onder de detectielimiet. Op basis van het aantal positieve en negatieve druppels kan de oorspronkelijke DNA-concentratie in het hele monster worden afgeleid . > **Tip:** ddPCR maakt multiplexing mogelijk, waarbij meestal twee detectiekanalen worden gebruikt om verschillende doelmoleculen tegelijk te detecteren. Elke stip op een grafiek vertegenwoordigt één gemeten druppel voor een specifieke kleur . ### 4.2 Detectiemethoden De detectie in ddPCR vindt plaats na de PCR-reactie en maakt gebruik van een flowcytometer. Hierbij wordt de fluorescentie-intensiteit van elke individuele druppel gemeten. Het principe van multiplexing maakt de detectie van meerdere targets in hetzelfde monster mogelijk, meestal via twee verschillende fluorescentiekanalen [97](#page=97). ### 4.3 Voordelen en nadelen van ddPCR #### 4.3.1 Voordelen ddPCR biedt verschillende belangrijke voordelen: * **High throughput:** Maakt de analyse van een groot aantal monsters mogelijk . * **Absolute kwantificering zonder standaard:** Bepaalt de absolute hoeveelheid doel-DNA zonder dat er referentiestandaarden nodig zijn . * **Vereist zeer kleine hoeveelheden monster:** Ideaal voor zeldzame monsters zoals biopsieën of forensisch materiaal . * **Laag reactievolume:** Minimaliseert het gebruik van kostbare reagentia (consumables) . * **Hoge accuraatheid:** Bereikt hoge precisie door het grote aantal replicaten per monster . * **Hoge resolutie:** Maakt de detectie van kleine verschillen mogelijk, zoals veranderingen in kopieaantallen van genen . > **Tip:** De hoge resolutie van ddPCR is bijzonder nuttig voor het detecteren van subtiele genetische variaties, zoals copy-number variaties (CNV's). #### 4.3.2 Nadelen De belangrijkste nadelen van ddPCR zijn gerelateerd aan de benodigde apparatuur: * **Dure apparatuur:** Vereist de aanschaf van drie verschillende apparaten: een Droplet Generator, een klassiek PCR-apparaat en een Droplet Reader (die fungeert als een flowcytometer) . ### 4.4 Toepassingen van ddPCR ddPCR heeft een breed scala aan toepassingen in moleculaire diagnostiek en onderzoek: * **Analyse van copy number variation (CNV):** Kwantificeert variaties in het aantal kopieën van genen, zoals duplicaties van genen die betrokken zijn bij het tegengaan van celdood, wat relevant is voor kankeronderzoek . * **Detectie van zeldzame sequenties:** Efficiënt in het detecteren van minimale resterende ziekte na kankerbehandeling, bijvoorbeeld de detectie van kankercellen in het bloed . * **Niet-invasieve prenatale testen (NIPT):** Wordt gebruikt voor de detectie van aneuploïdieën (zoals trisomie 21, 18, 13) door het kwantificeren van foetaal DNA in het bloedplasma van de moeder. Bij zwangere vrouwen is 3 tot 13 procent van het celvrije DNA afkomstig van de foetus . * **Analyse van genexpressie:** Meet de aanwezigheid van zeldzame mRNA's en miRNA's die geassocieerd zijn met ziekten, vaak in combinatie met reverse transcriptase PCR (RT-PCR). Veranderingen in miRNA-niveaus kunnen wijzen op verschillende aandoeningen, waaronder kanker . * **Single cell PCR analyse:** Maakt de analyse van genetisch materiaal op het niveau van individuele cellen mogelijk . * **Detectie van pathogenen:** Bepaalt de virale load . * **Microbioomanalyse:** Onderzoekt veranderingen in de samenstelling van microbioom, bijvoorbeeld in de oksel of darm . > **Voorbeeld:** Een klassiek voorbeeld van een ddPCR-toepassing is het nauwkeurig bepalen van de virale load van HIV in patiënten. Door het aantal virale genoomkopieën per volume bloed te kwantificeren, kan de effectiviteit van antiretrovirale therapie worden gemonitord . ### 4.5 Probe dynamics en eindpuntsbepaling ddPCR is gebaseerd op een eindpuntsbepaling van de fluorescentie na de PCR-cyclus. Dit is mogelijk en geen probleem bij ddPCR omdat er vele metingen per staal worden gedaan. De probe fungeert als limiterend agens, en de PCR bevindt zich in de exponentiële fase, waarbij dNTP's en primers niet limiterend zijn. Dit in tegenstelling tot klassieke PCR, waar limiterende factoren zoals dNTP's of primers ervoor kunnen zorgen dat de PCR in de plateaufase terechtkomt, waardoor meestal slechts één meting per staal wordt gedaan . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Kwantitatieve PCR (qPCR) | Ook bekend als Real-time PCR, is een techniek die het mogelijk maakt om de hoeveelheid doelwit-DNA of RNA in een monster te kwantificeren door de PCR-amplificatie continu te volgen in de tijd met behulp van fluorescente detectiemoleculen. | | Amplificatiecurve | Een grafiek die de toename van het fluorescente signaal weergeeft in de loop van de PCR-cycli, wat aangeeft hoeveel PCR-product er per cyclus wordt gevormd. | | Smeltcurve | Een grafiek die de afbraak van dubbelstrengs DNA weergeeft als functie van de temperatuur, waarbij de smeltcurve analyse helpt bij het identificeren van het aantal PCR-producten en mogelijke afwijkingen zoals primerdimeren. | | Cq-waarde (Ct-waarde) | De cyclusnummer waarbij het fluorescente signaal van een PCR-reactie een vooraf gedefinieerde drempelwaarde overschrijdt, wat een indicatie geeft van de initiële hoeveelheid doelwit-DNA. Een lagere Cq-waarde duidt op een hogere initiële hoeveelheid DNA. | | Delta delta Cq methode | Een veelgebruikte methode voor relatieve kwantificering in qPCR die de relatieve verandering in genexpressie of DNA-hoeveelheid tussen twee condities (bijvoorbeeld behandeling versus controle) berekent aan de hand van Cq-waarden en een referentiegen. | | Standaardcurve methode | Een methode voor kwantificering in qPCR waarbij een curve wordt geconstrueerd uit bekende concentraties van een standaard, waardoor de absolute hoeveelheid doelwit-DNA in onbekende monsters kan worden bepaald aan de hand van hun Cq-waarden. | | PCR efficiëntie | De mate waarin het PCR-proces het doelwit-DNA verdubbelt per cyclus. Een ideale efficiëntie is 100%, wat betekent dat het aantal amplicons per cyclus verdubbelt. Acceptabele waarden liggen meestal tussen 90% en 110%. | | SYBR Green | Een fluorescente kleurstof die zich intercaleert in dubbelstrengs DNA en groen fluoresceert wanneer deze wordt geëxciteerd. Het wordt gebruikt als reporter in qPCR om de accumulatie van PCR-producten te detecteren. | | Probe (Taqman, Molecular Beacon, etc.) | Een kort, enkelstrengs DNA- of RNA-molecuul dat specifiek bindt aan het doelwit-DNA-sequentie en een fluorescente signaal afgeeft. Probes bieden hogere specificiteit dan SYBR Green. | | Multiplex PCR | Een PCR-techniek waarbij meerdere doelwitsequenties tegelijkertijd in één reactie worden geamplificeerd en gedetecteerd, meestal door het gebruik van verschillende primerparen en/of probes met unieke fluorescente labels. | | Droplet Digital PCR (ddPCR) | Een techniek die de PCR-reactie opsplitst in duizenden tot miljoenen kleine druppeltjes. Elk druppeltje fungeert als een individuele PCR-reactie, wat zeer nauwkeurige absolute kwantificering mogelijk maakt zonder de noodzaak van een standaardcurve. | | Water-olie-emulsie | Een dispersie van waterdruppels in een continu medium van olie. In ddPCR wordt dit gebruikt om de PCR-reactiemengsels te verdelen in afzonderlijke, geïsoleerde micro-reactoren. | | Poisson statistiek | Een wiskundige verdeling die de waarschijnlijkheid van het optreden van een bepaald aantal gebeurtenissen beschrijft in een vaste interval van tijd of ruimte, en die in ddPCR wordt gebruikt om de initiële hoeveelheid doelwit-DNA te berekenen op basis van het aantal positieve druppeltjes. | | Genexpressie | Het proces waarbij de informatie in een gen wordt gebruikt om een functioneel product te maken, meestal een eiwit. Kwantificering van genexpressie wordt vaak gedaan met behulp van RT-qPCR. | | Huishoudgen | Een gen dat constitutief (constant) wordt uitgedrukt in de meeste cellen, ongeacht hun toestand of stimulus. Huishoudgenen worden vaak gebruikt als interne controlegen in qPCR om de variabiliteit in RNA-isolatie of reverse transcriptie te normaliseren. | | Referentiegen | Een gen waarvan de expressie stabiel wordt verondersteld te zijn onder de experimentele condities. Het wordt gebruikt als interne standaard voor relatieve kwantificering in qPCR. | | Smeltpuntbepaling (Tm) | De temperatuur waarbij de helft van het dubbelstrengs DNA is gedissocieerd tot enkelstrengs DNA. De Tm is afhankelijk van de DNA-sequentie en wordt gebruikt in smeltcurve analyse om de specificiteit van PCR-producten te beoordelen. | | Primer dimeer | Ongewenste PCR-producten die ontstaan wanneer primers met elkaar hybridiseren in plaats van met de template DNA. Ze kunnen de resultaten van qPCR beïnvloeden en worden vaak gedetecteerd tijdens smeltcurve analyse. | | Exponentiële fase | De fase in een PCR-reactie waarin het aantal kopieën van het doelwit-DNA theoretisch verdubbelt per cyclus, wat resulteert in een steile stijging van het fluorescente signaal in de amplificatiecurve. | | Plateaufase | De fase in een PCR-reactie waarin de amplificatie vertraagt of stopt. Dit kan gebeuren door uitputting van reactanten, ophoping van PCR-producten, of enzyminactivatie. | | Basislijn | Het initiële, lage fluorescente signaal in een qPCR-amplificatiecurve dat wordt gemeten voordat significante amplificatie plaatsvindt. | | Drempelwaarde (Threshold) | Een vooraf ingestelde fluorescentie-intensiteit die wordt gebruikt om de Cq-waarde te bepalen. Het wordt doorgaans ingesteld in de exponentiële fase van de amplificatiecurve. | | Absoluut kwantitatief | Het bepalen van de exacte hoeveelheid van een specifieke DNA- of RNA-sequentie in een monster, vaak uitgedrukt in kopieën per microliter, nanogram, etc. | | Relatief kwantitatief | Het vergelijken van de hoeveelheid van een specifieke DNA- of RNA-sequentie tussen verschillende monsters, vaak uitgedrukt als een 'fold change' (veranderingsfactor). | | FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) | Een mechanisme waarbij energie wordt overgedragen van een donor-fluorescente molecule naar een acceptor-fluorescente molecule wanneer ze zich dicht bij elkaar bevinden. Gebruikt in sommige probe-designs. | | Single cell PCR | PCR toegepast op individuele cellen om genetische analyse uit te voeren, zoals genexpressie of genotypering. | | Genoom | De volledige set van genetisch materiaal van een organisme. | | RNA-isolatie | Het proces van het extraheren van RNA uit biologische monsters. Cruciaal voor downstream toepassingen zoals RT-qPCR. | | Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) | Een techniek die RNA omzet in complementair DNA (cDNA) met behulp van reverse transcriptase, gevolgd door PCR om het cDNA te amplificeren. Wordt gebruikt om RNA-moleculen te detecteren en te kwantificeren. | | Copy Number Variation (CNV) | Variaties in het aantal kopieën van specifieke DNA-segmenten binnen het genoom. Kan worden geanalyseerd met behulp van technieken zoals ddPCR. | | Niet-invasieve prenatale testen (NIPT) | Tests die foetaal DNA uit het bloed van de moeder analyseren om chromosomale aneuploïdieën op te sporen zonder de noodzaak van invasieve procedures. | | Microbioomanalyse | De studie van de microbiële gemeenschappen die in een bepaald milieu leven, zoals de darm of de huid. Kan worden gedaan met behulp van PCR-gebaseerde methoden. | | Viral load | De hoeveelheid virusdeeltjes in een biologisch monster, zoals bloed of plasma. Wordt vaak gemeten met behulp van qPCR. |