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# Métodos espectroscópicos e espectrofotométricos Os métodos espectroscópicos e espectrofotométricos são técnicas analíticas cruciais que exploram a interação da radiação eletromagnética com a matéria para identificar e quantificar substâncias [2](#page=2). ### 1.1 Princípios fundamentais da interação radiação-matéria A espectroscopia estuda como diferentes formas de energia, especialmente a radiação eletromagnética, interagem com a matéria. Essa interação pode levar à absorção ou emissão de energia por átomos, íons ou moléculas [2](#page=2). #### 1.1.1 Absorção de radiação A absorção de radiação ocorre quando um quantum de energia radiante coincide com a energia necessária para promover um elétron de um átomo, íon ou molécula para um estado de energia superior [3](#page=3). * **Átomos:** A absorção de radiação em átomos causa transições de elétrons entre orbitais atômicas [3](#page=3). * **Moléculas:** Em moléculas, a absorção de radiação induz transições eletrônicas. Essas transições são associadas às "nuvens" de elétrons nas orbitais moleculares e envolvem a energia total da molécula, que é a soma das energias eletrônica, vibracional e rotacional. A equação geral para a energia molecular é [3](#page=3): $E_{molécula} = E_{eletrônico} + E_{vibracional} + E_{rotacional}$ [3](#page=3). #### 1.1.2 Processos moleculares resultantes da absorção de radiação A absorção de radiação por moléculas pode levar a diversos processos, sendo os mais representativos a excitação eletrônica [4](#page=4). Um esquema geral descreve a absorção molecular onde uma molécula no estado fundamental (M) absorve um fóton ($h\nu$) para atingir um estado excitado (M*). A molécula excitada pode então retornar ao estado fundamental através da emissão de calor ou radiação [5](#page=5). $$M + h\nu \rightarrow M^*$$ [5](#page=5). $$M^* \rightarrow M + calor$$ [5](#page=5). As transições eletrônicas mais comuns em compostos orgânicos, que requerem grupos funcionais insaturados com ligações $\pi$, são as $n \rightarrow \pi^*$ e $\pi \rightarrow \pi^*$. Esses centros de absorção são conhecidos como cromóforos [5](#page=5). ### 1.2 Espectrofotometria: Medição de Transmitância e Absorvância A espectrofotometria foca na medição da transmitância (T) ou absorvância (A) de uma solução-amostra contida em uma cuvete transparente [7](#page=7). A radiação incidente em uma cuvete pode ser transmitida, absorvida, refletida ou dispersa [7](#page=7). #### 1.2.1 Definição de Transmitância (T) e Absorvância (A) * **Transmitância (T):** É a razão entre a potência radiante do feixe emergente ($P$) e a potência radiante do feixe incidente ($P_0$) [8](#page=8). $$T = \frac{P}{P_0}$$ [8](#page=8). * **Absorvância (A):** É o logaritmo decimal do inverso da transmitância [8](#page=8). $$A = \log \left(\frac{1}{T}\right)$$ [8](#page=8). Alternativamente, usando as potências radiantes: $$A = \log \left(\frac{P_0}{P}\right)$$ [8](#page=8). A transmitância pode ser calculada como: $$T = \frac{P_{amostra}}{P_{solvente}}$$ [8](#page=8). No contexto teórico, perdas de energia por reflexão, absorção pelo solvente ou dispersão são consideradas nulas. Na prática, estas perdas são corrigidas comparando a transmitância da solução amostra com a do solvente ou branco [8](#page=8). A absorvância também é conhecida como "densidade óptica" e é preferível para medições quantitativas por ser diretamente proporcional à concentração da espécie absorvente [9](#page=9). #### 1.2.2 Lei de Beer A Lei de Beer estabelece uma relação linear entre a absorvância e a concentração de uma espécie química absorvente, desde que a largura da célula (caminho óptico) seja constante [9](#page=9). * Para concentração em g/L: $$A = a \cdot b \cdot C$$ [9](#page=9). Onde: * $a$ é a absortividade da espécie química absorvente (unidades: g$^{-1}$ L cm$^{-1}$). * $b$ é a largura da célula (caminho óptico) em cm. * $C$ é a concentração em g/L. * Para concentração em moles/L (M), a absortividade é chamada de absortividade molar ($\epsilon$) e suas unidades são M$^{-1}$cm$^{-1}$: $$A = \epsilon \cdot b \cdot C$$ [9](#page=9). A lei de Beer-Lambert, em sua forma mais completa, é frequentemente escrita como: $$A_{\lambda} = \epsilon_{\lambda} b C$$ [9](#page=9). Onde $\lambda$ indica que a absortividade molar é dependente do comprimento de onda. A relação entre transmitância e concentração pode ser expressa como: $$T = 10^{-\epsilon b C}$$ [9](#page=9). > **Tip:** A absorvância é diretamente proporcional à concentração, o que a torna uma grandeza prática para análises quantitativas. Medições de absorvância mantêm uma relação linear com a concentração, enquanto a transmitância exibe uma relação exponencial decrescente [9](#page=9). #### 1.2.3 Desvios da Lei de Beer Desvios da Lei de Beer podem ocorrer devido a fatores instrumentais ou químicos [10](#page=10). * **Desvios Aparente Instrumentais:** * **Radiação Policromática:** O uso de radiação não monocromática pode levar a desvios, pois diferentes comprimentos de onda podem ter diferentes absortividades [10](#page=10). * **Radiação Parasita:** Luz que entra no detector sem ter passado pela amostra [10](#page=10). * **Limitações Reais:** * **Concentração Elevada:** A lei de Beer é geralmente válida para concentrações abaixo de 0.01 M. Em concentrações mais altas, a relação entre absorvância e concentração pode se tornar não linear [10](#page=10). * **Soluções Heterogêneas:** A lei assume soluções homogêneas [10](#page=10). * **Desvios Químicos Aparente:** Ocorrem quando o analito se dissocia, associa ou reage com o solvente, formando produtos com propriedades de absorção diferentes [10](#page=10). ### 1.3 Características e Aspectos Metodológicos dos Métodos Espectrofotométricos Os métodos espectrofotométricos baseiam-se na comparação da absorção de radiação de uma solução-amostra com a de soluções-padrão preparadas em concentrações conhecidas [11](#page=11). #### 1.3.1 Características Gerais * **Aplicabilidade:** Podem ser aplicados a substâncias orgânicas e inorgânicas, frequentemente exigindo derivatização com reagentes complexantes ou de coloração [11](#page=11). * **Sensibilidade:** Boa sensibilidade na faixa de concentração de $10^{-2}$ a $10^{-5}$ M, podendo ser estendida até $10^{-7}$ M [11](#page=11). * **Seletividade:** Geralmente média a alta [11](#page=11). * **Precisão e Exatidão:** Apresentam boa precisão (2-3%) e exatidão [11](#page=11). #### 1.3.2 Aspectos Metodológicos Várias variáveis podem influenciar a absorvância de uma solução e devem ser cuidadosamente controladas [11](#page=11): * **Qualidade das Cuvetes:** O material, dimensões e tolerâncias das cuvetes são cruciais. Existem diferentes classes de qualidade (A, B, C) com tolerâncias específicas. As cuvetes retangulares, de fluxo e cilíndricas são tipos comuns [12](#page=12). * **Seleção do Comprimento de Onda Analítico ($\lambda_{máx}$):** Em análise quantitativa, é preferível utilizar o comprimento de onda de máximo de absorção ($\lambda_{máx}$) para obter maior sensibilidade de calibração [13](#page=13). * **Solvente:** A natureza do solvente pode afetar o espectro de absorção [11](#page=11). * **pH da Solução:** O pH pode influenciar a espécie química em solução e, consequentemente, sua absorvância [11](#page=11). * **Temperatura:** Alterações de temperatura podem afetar as interações moleculares e os equilíbrios químicos [11](#page=11). * **Concentrações de Eletrólitos:** A presença de eletrólitos pode alterar as propriedades de absorção [11](#page=11). * **Presença de Espécies Químicas Interferentes:** Outras substâncias na amostra que absorvem no mesmo comprimento de onda podem causar interferência [11](#page=11). #### 1.3.3 Curvas de Calibração A curva de calibração é obtida plotando a absorvância versus a concentração de soluções padrão. Idealmente, se a Lei de Beer for obedecida, a curva será uma reta que passa pela origem ou próxima dela. Desvios da linearidade indicam que a Lei de Beer não está sendo cumprida sob as condições utilizadas [13](#page=13). #### 1.3.4 Erros na Medição de Concentração A medição da transmitância é afetada por erros fotométricos que podem resultar em erros relativos na concentração calculada. Esses erros podem ser causados por [14](#page=14): * Ruído elétrico instrumental [14](#page=14). * Flutuações na fonte de radiação [14](#page=14). * Incerteza na leitura da escala [14](#page=14). * Posicionamento inadequado das cuvetes [14](#page=14). A relação entre o erro relativo na concentração ($\Delta C/C$) e a absorvância é dada por: $$\frac{\Delta C}{C} = \frac{0.434 \Delta T}{T \log T}$$ [14](#page=14). ### 1.4 Instrumentação para Medição de Absorção Instrumentos para medir a absorção de radiação nas regiões do ultravioleta (UV) e visível (Vis) geralmente consistem nos seguintes componentes básicos [15](#page=15): * **Fonte de Energia Radiante:** Deve ser estável. * **Dispositivo Seletor de Comprimento de Onda:** Permite isolar uma banda estreita de comprimentos de onda (monocromador). * **Recipientes Transparentes (Cuvetes):** Contêm as soluções-amostra. * **Detector ou Transdutor:** Converte a energia radiante em sinal elétrico. * **Sistema de Leitura:** Apresenta o sinal medido. > **Tip:** Fotômetros e espectrofotômetros são os instrumentos utilizados para essas medições. A diferença principal reside na capacidade de isolar comprimentos de onda específicos. Fotômetros usam filtros, enquanto espectrofotômetros usam prismas ou grades de difração para dispersar a luz [15](#page=15). #### 1.4.1 Tipos de Espectrofotômetros * **Espectrofotômetros de Feixe Simples:** O feixe de radiação passa sequencialmente pela amostra e pelo detector [16](#page=16). * **Espectrofotômetros de Feixe Duplo:** Um divisor de feixe permite que a radiação passe simultaneamente (ou em alternância muito rápida) por uma referência (branco) e pela amostra, o que melhora a estabilidade e a compensação de flutuações da fonte [17](#page=17). * **Espectrofotômetros Leitores de Microplacas (Microplate Readers):** Projetados para analisar múltiplas amostras em microplacas, permitindo leituras rápidas e automatizadas em diversos comprimentos de onda. Estes podem ter caminhos ópticos fixos ou variáveis dependendo do volume da amostra e das dimensões do poço da microplaca [18](#page=18). ### 1.5 Reflectância A reflectância mede a proporção da radiação eletromagnética incidente em uma superfície que é refletida. É expressa como uma fração ou porcentagem [19](#page=19). * $$R = \frac{\text{Fluxo de radiação refletido}}{\text{Fluxo de radiação incidente}}$$ [19](#page=19). * Se $R=0$, não há reflexão. Se $R=1$, toda a radiação é refletida. * A reflectância é uma grandeza adimensional [19](#page=19). Medições espectrofotométricas podem ser obtidas por absorção ou por reflexão, especialmente em analisadores baseados em química seca. A relação entre absorvância e reflectância é frequentemente expressa como: $$A = a \cdot b \cdot c = \log \left(\frac{1}{R}\right)$$ [19](#page=19). --- # Métodos eletroanalíticos na bioquímica clínica Este tópico aborda a aplicação de métodos eletroanalíticos para a determinação de analitos cruciais em bioquímica clínica, focando-se em iões e gases com relevância diagnóstica e terapêutica [21](#page=21) [22](#page=22). ### 2.1 Princípios gerais dos métodos eletroanalíticos Os métodos eletroanalíticos baseiam-se na medição de propriedades elétricas de espécies químicas em solução, como parte de uma célula eletroquímica. Os sistemas experimentais geralmente incluem a solução do analito (ou eletrólito), elétrodos e um instrumento de medição. Estes métodos são versáteis, podendo ser aplicados diretamente em amostras complexas, sem necessidade de tratamentos extensivos, sendo rápidos, económicos e apresentando boa sensibilidade, seletividade e um amplo intervalo dinâmico [29](#page=29) [30](#page=30). Os métodos eletroquímicos podem ser categorizados em: * **Métodos baseados em processos de elétrodo:** Envolvem a aplicação de voltagem ou corrente a um elétrodo e a medição da corrente resultante ou da variação de voltagem. Exemplos incluem voltametria e coulometria [29](#page=29). * **Métodos potenciométricos:** Medem o potencial termodinâmico de equilíbrio de um sistema químico sem causar eletrólise ou passagem de corrente. A medição da diferença de potencial é fundamental, dada pela equação [29](#page=29): $$E = E_{\text{indicador}} - E_{\text{referência}} + E_{\text{junção}}$$ * **Métodos condutimétricos:** Medem a condutibilidade elétrica de um eletrólito, assumindo que a resistência dos elétrodos é desprezável [29](#page=29). #### 2.1.1 Potenciometria A potenciometria é uma técnica que permite a medição direta de analitos ou a realização de titulações (métodos indiretos). Para medições potenciométricas, são necessários elétrodos de referência e elétrodos indicadores [30](#page=30). ##### 2.1.1.1 Elétrodos de referência Elétrodos de referência comuns incluem o elétrodo de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl) e o elétrodo de calomelanos saturado (SCE) [31](#page=31). * **Elétrodo de prata/cloreto de prata:** $$ \text{AgCl(s)} + e^- \rightleftharpoons \text{Ag(s)} + \text{Cl}^-(\text{aq}) $$ Potencial padrão ($E^0$) = 0,268 V; Potencial a KCl saturado ($E$) = 0,197 V [31](#page=31). * **Elétrodo de calomelanos saturado (SCE):** $$ \text{Hg}_2\text{Cl}_2\text{(s)} + 2e^- \rightleftharpoons 2\text{Hg(l)} + 2\text{Cl}^-(\text{aq}) $$ Potencial padrão ($E^0$) = 0,222 V; Potencial a KCl saturado ($E$) = 0,241 V [31](#page=31). ##### 2.1.1.2 Elétrodos indicadores Os elétrodos indicadores são projetados para serem seletivos a um determinado analito. Podem ser divididos em: * **Elétrodos seletivos de iões (ISEs):** * **Membrana cristalina:** Utilizam monocristais (ex: LaF₃ para F⁻) ou policristais (ex: Ag₂S para S²⁻ e Ag⁺) [32](#page=32). * **Membrana não cristalina:** Incluem membranas de vidro (ex: para H⁺, Na⁺) e membranas líquidas (ex: com trocadores iónicos em matriz de PVC, para NO₃⁻) [32](#page=32). * **Elétrodos seletivos de moléculas:** * **Elétrodos sensíveis a gases:** Utilizam membranas hidrofóbicas (ex: para CO₂) [32](#page=32). * **Elétrodos para substratos de enzimas:** Detectam substratos de enzimas (ex: urease) [32](#page=32). As membranas desses elétrodos devem apresentar reduzida solubilidade em meio aquoso, condutividade elétrica e seletividade para o analito de interesse [32](#page=32). #### 2.1.2 Elétrodos de membrana de vidro para pH O elétrodo de pH de membrana de vidro é um tipo específico de ISE amplamente utilizado. A sua estrutura é baseada em sílica com incorporação de óxidos metálicos, como Al₂O₃ ou B₂O₃, resultando numa membrana com propriedades de troca iónica. Quando em contato com uma solução aquosa, a superfície da membrana hidrata, permitindo a troca de íons sódio por prótons. A diferença de potencial gerada é proporcional ao pH da solução [32](#page=32) [33](#page=33) [34](#page=34). A relação entre potencial e pH é descrita por: $$ E = \text{constante} - 0,0591 \cdot \text{pH} $$ A definição operacional de pH pela IUPAC baseia-se na medição da diferença de potencial entre um elétrodo de membrana de vidro e um elétrodo de referência. A equação que relaciona a diferença de potencial com o pH é: $$ \frac{(E_a - E_s)}{0,0591} = \text{pH}_s - \text{pH}_a $$ ou, considerando a temperatura de 25ºC: $$ E_a - E_s = \frac{RT}{F} \ln \left(\frac{a_{H^+}^a}{a_{H^+}^s}\right) \approx 0,0591 (\text{pH}_s - \text{pH}_a) $$ onde $R$ é a constante dos gases, $T$ é a temperatura em Kelvin, $F$ é a constante de Faraday, $a_{H^+}$ é a atividade de íons hidrogénio, e os índices $a$ e $s$ referem-se à amostra e ao tampão, respetivamente. O "slope" ou inclinação é de 0,0591 V/pH a 25ºC [35](#page=35). #### 2.1.3 Elétrodos de membrana líquida com ionóforos Estes elétrodos utilizam compostos macrocíclicos, conhecidos como ionóforos, incorporados numa matriz de PVC. São particularmente úteis para a determinação de vários íons em fluidos fisiológicos [36](#page=36). * **Elétrodo de potássio (K⁺):** O ionóforo valinomicina, um antibiótico com estrutura tridimensional rígida, possui poros com dimensões compatíveis com o raio do íon potássio não hidratado, atuando como um transportador neutro para K⁺. Estes elétrodos, desenvolvidos a partir de 1969, oferecem boa seletividade em fluidos fisiológicos [37](#page=37). * **Elétrodos para outros íons:** Outros ionóforos e trocadores iónicos são utilizados para a determinação de Ca²⁺, Mg²⁺, Na⁺, Li⁺ e Cl⁻ em sangue. Exemplos de ionóforos incluem o ETH 1001 para Ca²⁺ e o ETH 227 para Mg²⁺ e Na⁺. Para Cl⁻, utiliza-se um trocador iónico como o tridodecilmetilamónio cloreto [38](#page=38). ### 2.2 Analitos de interesse clínico e seus métodos de determinação A determinação de diversos analitos em bioquímica clínica é crucial para a avaliação do estado fisiológico e metabólico dos pacientes [22](#page=22). #### 2.2.1 pH (H⁺) * **Interesse clínico:** O pH sanguíneo (normalmente 7,35-7,45) reflete o equilíbrio ácido-base do organismo, sendo vital para diagnosticar condições como acidose (pH baixo) ou alcalose (pH alto) [22](#page=22). * **Método de determinação:** Elétrodo de membrana de vidro sensível à concentração de íons hidrogénio (H⁺) [22](#page=22). #### 2.2.2 Sódio (Na⁺) * **Interesse clínico:** O sódio é o principal cátion extracelular, essencial para a regulação do volume sanguíneo, pressão arterial e equilíbrio osmótico. Níveis anormais (hiponatremia ou hipernatremia) podem indicar distúrbios neurológicos e cardiovasculares. Intervalo de referência: 135-145 mM [23](#page=23). * **Método de determinação:** Elétrodos seletivos de iões com membrana de vidro ou líquida contendo ionóforos específicos para o sódio [23](#page=23). #### 2.2.3 Potássio (K⁺) * **Interesse clínico:** Crucial para o funcionamento cardíaco e muscular. Alterações (hipocaliemia e hipercaliemia) podem afetar o ritmo cardíaco e a função muscular, sendo importantes no diagnóstico de doenças renais e endócrinas. Intervalo de referência: 3.5-5.0 mM [23](#page=23). * **Método de determinação:** Elétrodos seletivos de membrana líquida com ionóforos específicos para o potássio, como a valinomicina [23](#page=23) [37](#page=37). #### 2.2.4 Cálcio (Ca²⁺) * **Interesse clínico:** Importante na coagulação sanguínea, contração muscular e função nervosa. Anomalias (hipocalcemia e hipercalcemia) podem indicar desordens hormonais, doenças ósseas ou problemas renais. Intervalos de referência: Ca²⁺ total 2.15-2.55 mM; Ca²⁺ ionizado 1.10-1.35 mM [24](#page=24). * **Método de determinação:** Elétrodo seletivo de membrana líquida com ionóforos específicos para o cálcio [24](#page=24). #### 2.2.5 Cloreto (Cl⁻) * **Interesse clínico:** Auxilia na manutenção do equilíbrio osmótico e ácido-base. Desvios podem indicar desidratação, doenças renais ou metabólicas, e são comuns em distúrbios ácido-básicos. Intervalo de referência: 90-106 mM [24](#page=24). * **Método de determinação:** Elétrodos seletivos de membrana líquida com trocadores iónicos para cloreto [24](#page=24). #### 2.2.6 Oxigénio (O₂) * **Interesse clínico:** A pressão parcial de oxigénio no sangue (pO₂) é um indicador da capacidade respiratória e da oxigenação, essencial em pacientes com doenças respiratórias e emergências [25](#page=25). * **Método de determinação:** Sensor amperométrico, onde a corrente redox é proporcional à concentração de oxigénio [25](#page=25). #### 2.2.7 Dióxido de Carbono (CO₂) * **Interesse clínico:** A pressão parcial de dióxido de carbono (pCO₂) reflete o estado respiratório e o equilíbrio ácido-base. Níveis elevados podem indicar acidose respiratória, enquanto níveis baixos estão associados a alcalose respiratória [25](#page=25). * **Método de determinação:** Sensor potenciométrico, onde a variação de potencial mede a concentração de CO₂. Este método é frequentemente realizado em conjunto com um elétrodo de pH numa célula de fluxo de sangue, utilizando uma membrana permeável a gases. A relação entre pCO₂ e pH é dada por [25](#page=25) [41](#page=41) [42](#page=42): $$ E = \text{Constante} + S \cdot \log K_{\text{eq}} \frac{p\text{CO}_2}{[\text{HCO}_3^-]} $$ ou mais simplificadamente: $$ E = \text{Constante}' + S \cdot \log p\text{CO}_2 $$ onde $S$ é a inclinação de aproximadamente 0,0591 a 25ºC [41](#page=41). > **Tip:** Em análises de gases sanguíneos, é comum a utilização de medidores de gases sanguíneos ("blood gas analyzers") que combinam a medição de pH, pO₂ e pCO₂, além de outros eletrólitos e metabólitos em amostras de sangue total [43](#page=43). ### 2.3 Relação entre atividade e concentração A atividade iónica ($a_A$) de uma espécie química em solução está relacionada à sua concentração ($c_A$) pelo coeficiente de atividade ($g_A$): $$ a_A = g_A \cdot c_A $$ A força iónica ($I$) de uma solução é definida como: $$ I = \frac{1}{2} \sum_{i} c_i z_i^2 $$ onde $c_i$ é a concentração do ião $i$ e $z_i$ é a sua carga [44](#page=44). A Equação de Debye-Hückel descreve a relação entre o coeficiente de atividade e a força iónica : $$ \log g_A = \frac{-0.509 \cdot z_A^2 \cdot \sqrt{I}}{1 + 0.328 \cdot \alpha_A \cdot \sqrt{I}} $$ onde $z_A$ é a carga do ião, $I$ é a força iónica, e $\alpha_A$ é o diâmetro do ião hidratado. Uma forma simplificada é [44](#page=44): $$ \log g_A = \frac{-0.509 \cdot z_A^2 \cdot \sqrt{I}}{1 + \sqrt{I}} $$ #### 2.3.1 Efeito da força iónica e do teor de água O coeficiente de atividade de um ião pode variar significativamente com a força iónica da solução. Por exemplo, no plasma sanguíneo humano normal, os coeficientes de atividade estimados são: $g_{\text{Na}^+} = 0.75$, $g_{\text{K}^+} = 0.74$, e $g_{\text{Ca}^{2+}} = 0.31$ [45](#page=45). A concentração em molaridade ($M$) é definida como moles de soluto por litro de solução, enquanto a molalidade ($m$) é definida como moles de soluto por quilograma de solvente. A relação é $M = m \cdot \rho_{\text{H}_2\text{O}}$, onde $\rho_{\text{H}_2\text{O}}$ é a concentração mássica da água. Em casos de hiperlipidemia ou hiperproteinemia severa, a concentração de água no plasma pode diminuir (para 0.8 Kg/L), fazendo com que a concentração em molaridade seja cerca de 20% menor que a molalidade [45](#page=45). O "Efeito de Exclusão de Eletrólitos" ("Electrolyte Exclusion Effect") ocorre quando eletrólitos são excluídos de frações do volume total do plasma ocupadas por sólidos (lipídios, proteínas), afetando as medições por elétrodos seletivos de iões (ISEs) diretos em comparação com fotometria de emissão de chama ou ISEs indiretos [46](#page=46). > **Tip:** É crucial considerar os efeitos da matriz da amostra (força iónica, teor de água, presença de proteínas e lipídios) nas medições eletroanalíticas em fluidos biológicos, pois podem levar a desvios significativos nos valores obtidos [45](#page=45) [46](#page=46). --- # Princípios de medição eletroquímica Esta seção explora os princípios subjacentes a vários métodos eletroanalíticos, incluindo voltametria, amperometria, potenciometria e condutimetria, detalhando os seus componentes, aplicações e influências. Os métodos eletroanalíticos baseiam-se na medição de propriedades elétricas de uma espécie química em solução, como parte integrante de uma célula eletroquímica. Um sistema experimental típico inclui a solução do analito/eletrólito e elétrodos, conectados a um instrumento analítico de medição [29](#page=29). ### 3.1 Potenciometria A potenciometria mede o potencial termodinâmico de equilíbrio de um sistema químico sem causar eletrólise ou passagem de corrente, a fim de não afetar o equilíbrio. As medições da diferença de potencial em potenciometria são dadas pela equação $E = E_{indicador} – E_{referência} + E_{junção}$. Esta técnica pode ser utilizada em medições diretas ou em titulações (métodos indiretos). As principais características analíticas incluem a utilização direta em amostras complexas e solventes não aquosos, não ser destrutiva para a amostra, exigir poucos tratamentos prévios, ser rápida e económica, e oferecer boa sensibilidade, seletividade e um amplo intervalo dinâmico [29](#page=29) [30](#page=30). #### 3.1.1 Elétrodos de Referência Os elétrodos de referência são cruciais em medições potenciométricas para fornecer um potencial estável e bem definido. Exemplos comuns incluem o Elétrodo de Prata/Cloreto de Prata (Ag/AgCl) e o Elétrodo de Calomelanos Saturado (SCE) [31](#page=31). * **Elétrodo de Prata/Cloreto de Prata:** * Reação: $\text{AgCl (s) + e}^- \rightarrow \text{Ag (s) + Cl}^-\text{(aq)}$ * Potencial a saturação de KCl: $E(\text{KCl sat}) = 0,197$ V [31](#page=31). * Potencial padrão ($E^0$): $0,268$ V [31](#page=31). * **Elétrodo de Calomelanos Saturado (SCE):** * Reação: $\text{Hg}_2\text{Cl}_2\text{(s) + 2e}^- \rightarrow \text{2Hg (l) + 2Cl}^-\text{(aq)}$ * Potencial a saturação de KCl: $E(\text{KCl sat}) = 0,241$ V [31](#page=31). * Potencial padrão ($E^0$): $0,222$ V [31](#page=31). #### 3.1.2 Elétrodos Indicadores Os elétrodos indicadores são projetados para responder à atividade de um íon específico na solução. Eles podem ser classificados em: * **I – Elétrodos Seletivos de Íons (ISEs):** * **a) Membrana Cristalina:** * Monocristalina: Exemplo, $\text{LaF}_3$ para $\text{F}^-$ [32](#page=32). * Policristalina: Exemplo, $\text{Ag}_2\text{S}$ para $\text{S}^{2-}$ e $\text{Ag}^+$ [32](#page=32). * **b) Membrana não Cristalina:** * Vidro: Utilizado para $\text{H}^+$, $\text{Na}^+$ [32](#page=32). * Líquidas: Utilizam trocadores iônicos líquidos em matriz de PVC, como para $\text{NO}_3^-$ [32](#page=32). * **II – Elétrodos Seletivos de Moléculas:** * **a) Elétrodos sensíveis a gases:** Exemplo, membranas hidrofóbicas para $\text{CO}_2$ [32](#page=32). * **b) Elétrodos para substratos de enzimas:** Exemplo, urease [32](#page=32). As propriedades essenciais de uma membrana para um ISE incluem solubilidade reduzida em meio aquoso, condutividade elétrica e seletividade para o íon principal (através de troca iônica, cristalização ou complexação) [32](#page=32). ##### 3.1.2.1 Elétrodo de pH de Membrana de Vidro Este elétrodo é um exemplo clássico de ISE, descoberto no início do século XX e amplamente utilizado para medir o balanço ácido-base no sangue. A membrana de vidro, desenvolvida por Eisenman, geralmente contém $\text{SiO}_2$, $\text{Na}_2\text{O}$ e $\text{Al}_2\text{O}_3$ ou $\text{B}_2\text{O}_3$. Quando imerso em solução aquosa, a superfície do vidro hidrata e os íons sódio trocam com os prótons [33](#page=33) [34](#page=34). * **Funcionamento:** A troca iônica na superfície da membrana de vidro gera um potencial dependente da atividade de $\text{H}^+$ [33](#page=33). * **Relação com pH:** A relação potencial-pH é dada por $E = \text{const.} - 0,0591 \cdot \text{pH}$ [33](#page=33). * **Definição Formal de pH:** $\text{pH} = -\log [\text{H}^+]$ [33](#page=33). * **Relação com Atividade de H+:** $E = \text{Const.} + 0,0591 \log a_{\text{H}^+}$ [33](#page=33). A definição operacional de pH pela IUPAC baseia-se na medição da diferença de potencial entre um elétrodo de membrana de vidro e um elétrodo de referência. A equação que relaciona as leituras de potencial ($E_a$, $E_s$) e os valores de pH ($pH_a$, $pH_s$) é [35](#page=35): $$E_a - E_s = 0,0591 \log (a_{\text{H}^+})_a - 0,0591 \log (a_{\text{H}^+})_s$$ [35](#page=35). Rearranjando, obtém-se: $$\frac{E_a - E_s}{0,0591} = \log (a_{\text{H}^+})_a - \log (a_{\text{H}^+})_s$$ [35](#page=35). Ou, para uma temperatura de $25^o\text{C}$: $$\frac{E_a - E_s}{2,303 \frac{RT}{F}} = pH_s - pH_a$$ [35](#page=35). O "slope" (inclinação) da curva de calibração é tipicamente $0,0591$ V/pH [35](#page=35). ##### 3.1.2.2 Elétrodos de Membrana Líquida Estes elétrodos utilizam trocadores iônicos ou ionóforos (compostos macrocíclicos) em uma matriz de PVC. Podem ser construídos para diversos íons, mas a seletividade e o tempo de vida são geralmente inferiores aos de membrana cristalina. Elétrodos com bom desempenho incluem os para $\text{Ca}^{2+}$, $\text{K}^+$, e $\text{NO}_3^-$ [36](#page=36). Um exemplo notável é o elétrodo de $\text{K}^+$ baseado na valinomicina, um antibiótico que atua como um transportador neutro para o íon potássio, com dimensões de poro adequadas ao raio do $\text{K}^+$ não hidratado. Estes elétrodos, desenvolvidos a partir dos anos 70, são utilizados para avaliar o balanço eletrolítico [37](#page=37). Elétrodos de membrana líquida para a determinação de $\text{Ca}^{2+}$, $\text{Mg}^{2+}$, $\text{Na}^+$, $\text{Li}^+$ e $\text{Cl}^-$ no sangue utilizam ionóforos específicos [38](#page=38). #### 3.1.3 Elétrodos Sensíveis a Gases Elétrodos seletivos a gases, como o elétrodo de $\text{CO}_2$, medem a pressão parcial de um gás dissolvido na amostra. O elétrodo de $\text{CO}_2$ tipicamente consiste em uma membrana de silicone permeável ao gás, que envolve um elétrodo de pH [41](#page=41) [42](#page=42). * **Princípio:** O $\text{CO}_2$ difunde através da membrana e reage com a água na solução interna, formando $\text{HCO}_3^-$ e $\text{H}^+$. A concentração de $\text{H}^+$ gerada é medida por um elétrodo de pH interno [41](#page=41) [42](#page=42). * **Equação:** $\text{CO}_2\text{(aq)} + \text{H}_2\text{O} \rightleftharpoons \text{HCO}_3^- + \text{H}^+$ [41](#page=41). * **Relação com $\text{pCO}_2$:** $E = \text{Const.} + S \log [\text{H}^+]$ e $E = \text{Const.} + S (\log K_{eq} \frac{pCO_2}{[\text{HCO}_3^-]})$ levam a $E = \text{Const}' + S \log pCO_2$ [41](#page=41). * **Sensor Clark:** O elétrodo de Clark, usado para medição de oxigênio ($\text{PO}_2$), também emprega uma membrana gasosa e um elétrodo, operando tipicamente a um potencial de $-0,85$ V para o cátodo. A solução para o cálculo da concentração de $\text{O}_2$ dissolvido baseia-se na Lei de Henry [51](#page=51) [52](#page=52). Analisadores de gases sanguíneos são dispositivos que medem o pH, $\text{pO}_2$ e $\text{pCO}_2$ no sangue, além de outros metabólitos e eletrólitos [43](#page=43). #### 3.1.4 Efeito da Força Iônica e Coeficiente de Atividade A relação entre a atividade iônica ($a_A$) de uma espécie química e sua concentração ($c_A$) é dada por $a_A = g_A \cdot c_A$, onde $g_A$ é o coeficiente de atividade. A força iônica ($I$) de uma solução é definida como $I = \frac{1}{2} \sum_{i} c_i z_i^2$. A Equação de Debye-Hückel e sua forma simplificada descrevem a relação entre o coeficiente de atividade, a carga iônica e a força iônica [44](#page=44). A força iônica tem um impacto significativo nos coeficientes de atividade. Por exemplo, em plasma sanguíneo humano normal, os coeficientes de atividade para $\text{Na}^+$, $\text{K}^+$ e $\text{Ca}^{2+}$ são $0,75$, $0,74$ e $0,31$, respectivamente. É importante distinguir entre molaridade (mol soluto/L solução) e molalidade (mol soluto/Kg solvente), onde a molalidade é independente da temperatura [45](#page=45). O "Efeito de Exclusão de Eletrólitos" ocorre em amostras complexas como o plasma, onde a presença de sólidos (como eritrócitos) ou volumes não aquosos (lipídios, proteínas) pode reduzir a fração de volume disponível para os eletrólitos, afetando as medições por eletrodos seletivos de íons ou fotometria de emissão de chama [46](#page=46). ### 3.2 Voltametria e Amperometria A voltamétria compreende métodos eletroanalíticos onde a corrente resultante de uma reação redox à superfície de um elétrodo é medida em função do potencial aplicado. É útil para o estudo de espécies eletroativas. Um voltanograma registra a corrente redox (Faradaica) em função do potencial aplicado, apresentando uma corrente limite ($I_d$) e um potencial de meia-onda ($E_{1/2}$) [48](#page=48). * **Voltamograma:** Gráfico de corrente vs. potencial [48](#page=48). * **Corrente Catódica:** Geralmente representada na direção negativa [48](#page=48). * **Corrente Anódica:** Geralmente representada na direção positiva [48](#page=48). Na voltamétria, utiliza-se um sistema de três elétrodos com controlo potenciostático: Elétrodo de Trabalho (WE), Elétrodo Auxiliar (AE) e Elétrodo de Referência (RE). A diferença de potencial total é dada por $E = E(\text{cátodo}) – E(\text{ânodo}) - I \cdot R$, onde $I \cdot R$ é a queda ôhmica [50](#page=50). A amperometria é um método relacionado onde o potencial é mantido constante e a corrente é monitorada ao longo do tempo [49](#page=49). ### 3.3 Condutimetria A condutimetria mede a condutibilidade elétrica de soluções eletrolíticas. É uma medida da capacidade dos íons na solução de transportar corrente elétrica sob a influência de um potencial (geralmente AC). A condutividade depende do número de íons (concentração), mobilidade iônica e carga. É um método sensível, mas não seletivo [53](#page=53). * **Condutância (G):** É o inverso da resistência elétrica (R) e tem unidades de $\text{ohm}^{-1}$ ou Siemens (S) [53](#page=53). * **Condutividade Específica (k):** É a condutância de um cubo de $1$ cm de lado e expressa em $\text{S} \cdot \text{cm}^{-1}$ [53](#page=53) [54](#page=54). * **Constante da Célula:** A razão entre a área da superfície do elétrodo (A) e a distância entre os elétrodos (d) é conhecida como constante da célula. A relação entre condutância e condutividade é dada por $G = \kappa \frac{A}{d}$ [53](#page=53) [54](#page=54). Fatores que afetam a condutividade incluem a concentração iônica, o tipo de íons (mobilidade e raio iônico) e a temperatura (aproximadamente $2\% / ^o\text{C}$ para soluções aquosas) [54](#page=54). A condutividade do sangue total é influenciada pelo volume fracionário e forma dos eritrócitos, bem como pela condutividade do plasma. A relação dada é [55](#page=55): $$G_{bis} = a \cdot (1 - H) + c \cdot H$$ Onde $G_{bis}$ é a condutividade do sangue total, $a$ é a condutividade do plasma, $H$ é a porcentagem de hematócrito, e $c$ é um fator para a orientação das eritrócitos. A condutimetria é utilizada em medições de hematócrito (POCT) e na contagem eletrônica de suspensões celulares sanguíneas (Princípio de Coulter) [55](#page=55). #### 3.3.1 Princípio de Coulter O Princípio de Coulter afirma que partículas que passam por uma abertura, acompanhadas por uma corrente elétrica, produzem uma mudança na impedância proporcional ao volume da partícula. Este pulso na impedância é originado pelo deslocamento do eletrólito causado pela partícula. Este princípio é amplamente aplicado em hematologia para contar e dimensionar as células sanguíneas. Em um sistema, partículas (verdes) em eletrólito passam por uma abertura em uma zona de detecção elétrica, gerando um sinal. A contagem de células sanguíneas (glóbulos vermelhos, brancos, plaquetas) pode ser realizada por este método, sendo o método de referência ICSH o método de impedância de abertura de canal único [56](#page=56) [57](#page=57). --- ## Erros comuns a evitar - Revise todos os tópicos cuidadosamente antes dos exames - Preste atenção às fórmulas e definições chave - Pratique com os exemplos fornecidos em cada seção - Não memorize sem entender os conceitos subjacentes

| Termo | Definição | |------|------------| | Espetroscopia | Ramo da ciência que estuda as interações entre a radiação eletromagnética e a matéria, permitindo a identificação e quantificação de átomos e moléculas. | | Radiação Eletromagnética | Uma forma de energia que se propaga como ondas e inclui, entre outras, a luz visível, o infravermelho, os raios X, os raios ultravioleta, as microondas e as ondas de rádio. | | Absorção de Radiação | Processo pelo qual um átomo, ião ou molécula adquire energia de um quantum de radiação, resultando na transição para um estado energético superior. | | Transmitância (T) | Razão entre a potência radiante transmitida por uma solução-amostra e a potência radiante incidente sobre ela. É uma medida da quantidade de luz que atravessa uma amostra. | | Absorvância (A) | Logaritmo (de base 10) do inverso da transmitância. É diretamente proporcional à concentração da espécie química absorvente e à largura da célula. | | Lei de Beer | Lei que estabelece a proporcionalidade linear entre a absorvância de uma solução e a concentração da espécie química absorvente, quando a largura da célula é constante. Expressa-se como $A = abc$ ou $A = \epsilon bc$. | | Absortividade Molar ($\epsilon$) | Constante que representa a capacidade de uma substância em absorver luz num determinado comprimento de onda e concentração molar. As suas unidades são $M^{-1}cm^{-1}$. | | Cromóforo | Grupo funcional em uma molécula responsável pela absorção de luz num determinado comprimento de onda, geralmente associado a ligações pi e sistemas insaturados. | | Cuvete | Recipiente transparente, geralmente de quartzo ou vidro, usado para conter a solução-amostra em medições espectrofotométricas, permitindo a passagem da radiação. | | Comprimento de Onda Analítico ($\lambda_{máx}$) | O comprimento de onda no qual uma substância exibe a máxima absorção de radiação. É preferencialmente utilizado em análises quantitativas devido à maior sensibilidade. | | Métodos Eletroanalíticos | Métodos analíticos que se baseiam na medição de propriedades elétricas de uma espécie química em solução, quando esta faz parte de uma célula eletroquímica. | | Potenciometria | Método eletroquímico que mede o potencial termodinâmico de equilíbrio de um sistema químico sem causar eletrólise, permitindo determinar a concentração de iões. | | Elétrodos Seletivos de Iões (ISE) | Elétrodos projetados para responder seletivamente à atividade de um ião específico em solução, com uma membrana que interage preferencialmente com esse ião. | | pH | Medida da acidez ou basicidade de uma solução aquosa, definida como o logaritmo negativo da concentração de iões hidrogénio $[H^+]$. | | Equilíbrio Ácido-Base | O estado fisiológico no qual as concentrações de ácidos e bases no organismo são mantidas dentro de limites estreitos, regulado principalmente pelo sistema respiratório e renal. | | Voltametria | Método eletroanalítico onde se mede a intensidade de corrente que flui em função do potencial aplicado a um elétrodo, estudando espécies eletroativas. | | Amperometria | Técnica eletroquímica que mede a corrente gerada numa célula eletroquímica em função do potencial aplicado, sendo frequentemente usada para determinar a concentração de oxigénio. | | Condutimetria | Método eletroquímico que mede a condutividade elétrica de uma solução, a qual está relacionada com a concentração total de iões dissolvidos. | | Força Iónica ($I$) | Medida da intensidade do campo elétrico devido à distribuição de todos os iões numa solução. É calculada com base nas concentrações e cargas dos iões presentes. | | Coeficiente de Atividade ($g$) | Fator que corrige a diferença entre a atividade de uma espécie química em solução e a sua concentração molar, especialmente em soluções não ideais. |