inleiding en H1 methoden en technieken 2025_versie Toledo (1).pptx

# Inleiding tot de histologie en studiemethoden Dit onderwerp introduceert de grondbeginselen van de histologie, de methoden die gebruikt worden om cellen en weefsels te bestuderen, en de algemene structuur van het curriculum, aangevuld met studietips en verwachtingen ten aanzien van studenten. ## 1. Inleiding tot de histologie en studiemethoden Histologie is de wetenschap die zich bezighoudt met de structuur van weefsels en de onderlinge communicatie tussen cellen, waarbij de relatie tussen vorm (morfologie) en functie centraal staat. Een diepgaande kennis van normale histologie is essentieel voor het begrijpen van afwijkende cel- en orgaanfuncties en ziekteprocessen. ### 1.1 De opleiding en het leerproces De cursus histologie is onderdeel van het opleidingsonderdeel Anatomie I en Histologie. Het didactisch team bestaat uit docenten voor zowel anatomie als histologie. De OLA Histologie omvat hoorcolleges (totaal 12 uur) en oefenzittingen (totaal 4 uur). #### 1.1.1 Leermateriaal Het leermateriaal voor de OLA Histologie bestaat uit: * Powerpoint slides van de hoorcolleges (beschikbaar op Toledo). * De ACCO-cursus. * Digitale preparaten via het Smartzoom platform voor de oefenzittingen, inclusief opdrachten en annotaties. * Optioneel/verdiepend: handboeken zoals "Basic Histology" van Junqueira & Mescher of "Lange Human Histology" van Stevens & Lowe. * Lesopnames van de hoorcolleges zijn beschikbaar, maar die van de interactieve werkzittingen niet. #### 1.1.2 Inhoud en planning De hoorcolleges (12 uur) behandelen de volgende onderwerpen: 1. Studiemethoden voor onderzoek van cellen en weefsels (2-3 uur) 2. Integratie van cellen in weefsels: cel-cel en cel-matrix verbindingen, celadhesie, en histologie van epitheel- en klierweefsels (2 uur) 3. Histologie van bindweefsel (gewoon, vet, kraakbeen, bot) (4 uur) 4. Histologie van contractiel weefsel (2 uur) 5. Histologie van zenuwweefsel (2 uur) Aanvullend zijn er werkzittingen (4 uur) die bestaan uit: * Interactieve oefensessies met gedigitaliseerde histologische beelden op het Smartzoom platform. * Een proefexamen ter voorbereiding op het examen. * Een vragen- en herhalingsles, mede gebaseerd op het discussieforum op Toledo. #### 1.1.3 Examen vorm Het examen voor Anatomie I en Histologie is een combinatie van meerkeuzevragen met giscorrectie en open vragen. Het histologiegedeelte (1/3 van het examen) bestaat uit 20 meerkeuzevragen, waarvan 10 met een foto/figuur. #### 1.1.4 Verwachtingen van de student Van studenten wordt verwacht dat ze op tijd aanwezig zijn, respect tonen voor medestudenten en docenten, en discreet omspringen met patiëntengegevens. Actieve medewerking tijdens werkzittingen en het gebruik van het discussieforum op Toledo worden aangemoedigd. > **Tip:** Volg de lessen aandachtig en maak notities met pen en papier. Breng "reliëf" aan in de leerstof door te focussen op wat de docent benadrukt. Oefen veel met de preparaten, aangezien een aanzienlijk deel van de examenvragen gebaseerd is op histologische foto's. ### 1.2 Studiemethoden voor onderzoek van cellen en weefsels Dit onderdeel introduceert de fundamentele technieken die worden toegepast om cellen en weefsels microscopisch te bestuderen. #### 1.2.1 Definitie en doel van histologie Histologie richt zich op het bestuderen van de microscopische structuur van weefsels. Het doel is om inzicht te krijgen in de opbouw van weefsels, de communicatie tussen cellen, en de relatie tussen vorm en functie. Dit vormt de basis voor het begrijpen van pathologische processen. #### 1.2.2 Microscopen: principes en types Microscopie stelt ons in staat om structuren te bestuderen die met het blote oog niet zichtbaar zijn. ##### 1.2.2.1 Resolutie (oplossend vermogen) Resolutie is de minimale afstand tussen twee punten waarop deze nog als afzonderlijke punten waargenomen kunnen worden. * **Menselijk oog:** Ongeveer 70 µm (0,07 mm) op een afstand van 25 cm. In de praktijk eerder 0,1 tot 0,2 mm. * **Lichtmicroscoop:** Bereikt een resolutie van ongeveer $0,2$ µm ($200$ nm), wat ongeveer 500 keer nauwkeuriger is dan het blote oog. * **Elektronenmicroscoop:** Kan een resolutie bereiken van ongeveer $0,2$ nm, wat 1000 keer beter is dan een lichtmicroscoop. ##### 1.2.2.2 De lichtmicroscoop Een lichtmicroscoop bestaat uit drie belangrijke lenssystemen: * **Condensor:** Bundelt het licht. * **Objectief:** Vormt een vergroot beeld van het object. * **Oculair:** Vergroot het beeld verder tot een virtueel beeld dat met het oog waargenomen kan worden. De **eindvergroting** wordt berekend als: $$ \text{Eindvergroting} = \text{Vergroting objectief} \times \text{Vergroting oculair} $$ Belangrijke onderdelen van een lichtmicroscoop zijn: de lichtbron, het lenzenstelsel voor lichtbundeling (condensor), de tafel voor het preparaat, het lenzenstelsel voor vergroting (objectief en oculair), en het mechaniek voor het afstellen van de lenzenafstand. ##### 1.2.2.3 Soorten microscopen * **Contrastmicroscopie:** Wordt gebruikt om het contrast in ongekleurde preparaten te verhogen. Voorbeelden zijn helderveld-, fasecontrast- en interferentiecontrastmicroscopie. Om levende cellen te bestuderen, wordt een omkeer (inverted) microscoop gebruikt. * **Fluorescentiemicroscopie:** Maakt de lokalisatie en kwantificering van fluorescerende moleculen in cellen mogelijk. Dit gebeurt door detectie van licht dat wordt uitgezonden door een fluorescerende molecule na absorptie van excitatielicht met een kortere golflengte. Het emissielicht heeft een langere golflengte. ##### 1.2.2.4 Elektronenmicroscopie Principes van elektronenmicroscopie zijn Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM) en Scanning Elektronenmicroscopie (SEM). Bij TEM worden ultradunne coupes (40-80 nm) van weefsel, ingebed in kunsthars en gekleurd met zware metalen, bestudeerd met een elektronenstraal. #### 1.2.3 Technieken voor lichtmicroscopie Het proces van het prepareren van weefsels voor lichtmicroscopie omvat verschillende stappen: ##### 1.2.3.1 Voorbereiden van het weefsel Dit begint met het verkrijgen van het weefsel (biopsie, chirurgische resectie) en de **fixatie**. Fixatie is essentieel om de architectuur van het weefsel te bewaren en afbraakprocessen te voorkomen. * **Vastzetten van biomoleculen:** De structuur van biomoleculen wordt gewijzigd en de functie van eiwitten wordt gestopt. Componenten worden op hun plaats gehouden. * **Fixatievloeistoffen:** Meestal formaldehyde-gebaseerd (bv. Formol 6%) of alcohol-gebaseerd. Formol penetreert weefsels met een snelheid van ongeveer 1 mm per uur. * **Praktische aspecten:** Voldoende grote pot, voldoende fixatievloeistof (minimaal 1:2 verhouding), datum en uur van fixatie, en een goed sluitende pot zijn cruciaal. Fixatie kan door immersie of perfusie (circuleren van fixatief door het weefsel). ##### 1.2.3.2 Maken van paraffinecoupes (FFPE: formalin fixed paraffin embedded) Dit proces omvat: 1. **Macroscopie en versnijden:** Meten, wegen, beschrijven en inkten van snedevlakken. 2. **Inbedden:** Stapsgewijze dehydratatie (verwijderen van water), klaring (verwijderen van alcohol met bv. tolueen of xyleen), en infiltratie met gesmolten paraffine. 3. **Coupes snijden met microtoom:** Het paraffineblok wordt met een microtoom in dunne coupes gesneden (5-7 µm dik). 4. **Monteren:** De coupes worden op een draagglaasje bevestigd. 5. **Deparaffineren:** De coupes worden opnieuw behandeld met xyleen/tolueen en vervolgens in dalende percentages alcohol om de paraffine te verwijderen, alvorens ze in een waterige oplossing te brengen. **Voordelen FFPE:** Volume van het biopt minder belangrijk, technisch eenvoudig, eenvoudig te stockeren, optimale morfologische kwaliteit, geschikt voor immunohistochemie (IHC). **Nadelen FFPE:** Tijdrovend, arbeidsintensief, eiwitactiviteit wordt uitgeschakeld, DNA/RNA fragmentatie kan moleculair onderzoek beperken. ##### 1.2.3.3 Maken van vriescoupes Dit proces is sneller en wordt vaak gebruikt voor peroperatieve diagnostiek: 1. **Versnijden:** Het weefsel wordt snel ingevroren (bv. in vloeibare N$_2$ of isopentaan). 2. **Invriezen:** Snel invriezen bij zeer lage temperaturen (bv. -196 °C). 3. **Snijden met cryostaats:** Het bevroren weefsel wordt met een cryostaatsneden. 4. **Kleuren en plakken:** De coupes worden gekleurd en gemonteerd. **Voordelen vriescoupes:** Zeer snel, geschikt voor detectie van componenten die oplossen bij paraffine-inbedding (bv. vet), enzymactiviteit blijft bewaard, uitgebreid moleculair onderzoek mogelijk door betere preservatie van RNA/DNA. **Nadelen vriescoupes:** Kan enkel voor kleine fragmenten, technisch niet eenvoudig, opslag vereist dure diepvrieskasten, morfologische kwaliteit is suboptimaal (vriesartefacten). ##### 1.2.3.4 Kleuren van de coupes Cellen en weefsels zijn van nature kleurloos en transparant. Kleuringen maken celcomponenten zichtbaar en verhogen het contrast. * **Niet-specifieke kleuringen:** Kleuren alle cellen op een vergelijkbare manier. * **Specifieke kleuringen:** Selecteren bepaalde celcomponenten op basis van hun chemische eigenschappen. **Soorten kleurstoffen:** * **Zure kleurstoffen (acidofiel/eosinofiel):** Reageren met basische componenten in cellen (bv. cytoplasmatische eiwitten). Deze worden roze gekleurd door eosin. * **Basische kleurstoffen (basofiel):** Reageren met zure componenten in cellen (bv. DNA in de nucleus, RNA in het RER). Deze worden donkerblauw/paars gekleurd door hematoxyline. **Veelgebruikte combinaties:** * **Hematoxyline en Eosine (H&E):** Hematoxyline kleurt basofiele structuren blauw/paars (nuclei, RER), en Eosine kleurt acidofiele structuren roze (cytoplasma, collageen). * **Periodic acid-Schiff (PAS):** Kleurt koolhydraten en koolhydraatrijke macromolecules magenta. Dit omvat glycogeen, mucus, basale membranen en reticuline vezels. * **Enzymhistochemische kleuringen:** Gebruiken enzymatische reacties in vriescoupes (bv. ATPase voor spierziekten). * **Trichroom Masson kleuring:** Gebruikt drie kleurstoffen om bindweefselcomponenten, zoals collageen (blauw/groen), te visualiseren naast kernen (blauw/paars) en cytoplasma/fibrine (roze/rood). Andere kleuringen omvatten Nissl en methyleenblauw (neuronen), reticuline kleuring (beenmerg), en Von Gieson (vasculatuur, huid). ##### 1.2.3.5 Immunohistochemie (IHC) Immunohistochemie wordt gebruikt om specifieke antigenen (eiwitten) in weefselcoupes aan te tonen en te lokaliseren met behulp van specifieke antistoffen. * **Principe:** Gebruikt immunologische reacties (antigeen-antistof) gecombineerd met chemische detectie om de interactie zichtbaar te maken. * **Technieken:** Directe techniek (gelabelde primaire antistof) en indirecte techniek (gelabelde secundaire antistof, die gevoeliger is). * **Labels:** Kunnen enzymen (bv. HRP met DAB als chromogeen) of fluorochroomen zijn. * **Toepassingen:** Aantonen van eiwitten zoals proliferatiemarkers (Ki67), celadhesiemoleculen (CD138) of cytoskeletcomponenten (Vimentine). ##### 1.2.3.6 In situ hybridisatie (ISH) ISH wordt gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties aan te tonen door gebruik te maken van gelabelde probes (complementaire DNA- of RNA-strengen). * **Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH):** Gebruikt fluorescerende labels. * **Chromogene In Situ Hybridisatie (CISH):** Combineert kenmerken van IHC en ISH voor beoordeelbare morfologie. ##### 1.2.3.7 Monteren en interpreteren Gemonteerde preparaten worden beschermd en bewaard. Bij de interpretatie van microscopische coupes is het belangrijk om 3D-structuren in 2D-doorsnedes correct te reconstrueren en mogelijke artefacten te herkennen. #### 1.2.4 Artefacten in histologische preparaten Artefacten zijn onbedoelde structuren of veranderingen die optreden tijdens het prepareren van weefselcoupes. Voorbeelden zijn: * Krimping * Cholesterolkristallen * Oplossen van vet * Scheurtjes en plooitjes > **Tip:** Leer de principes achter elke kleuring en begrijp de chemische reacties die leiden tot de kleurverandering. Dit helpt bij het interpreteren van beelden en het herkennen van fouten in de preparatie. > **Tip:** Wees kritisch bij het bekijken van microscopische beelden. Oefen met het identificeren van specifieke celcomponenten en structuren in verschillende weefsels. Begrijp de beperkingen van elke techniek. --- # Technieken voor lichtmicroscopie Hier is een gedetailleerde studiehandleiding over technieken voor lichtmicroscopie. ## 2. Technieken voor lichtmicroscopie Dit deel van de cursus behandelt de diverse technieken die essentieel zijn voor het voorbereiden en bestuderen van weefsels met behulp van een lichtmicroscoop, inclusief de fabricage van coupes, kleuringen en de fundamentele principes van de microscoop zelf. ### 2.1 Inleiding tot histologie en microscopie Histologie is de studie van weefsels en hun opbouw, met een focus op de relatie tussen vorm (morfologie) en functie. Kennis van normale histologie is cruciaal voor het begrijpen van afwijkende celfuncties, orgaanstoornissen en ziekteprocessen. Om weefsels microscopisch te kunnen onderzoeken, is een adequate voorbereiding van het materiaal noodzakelijk. Dit kan gebeuren door cellen uit te strijken voor cytologisch onderzoek of door dunne sneetjes van weefsel te maken voor histologisch onderzoek. ### 2.2 De lichtmicroscoop De lichtmicroscoop (Latijn: *micros* = klein, *skopein* = zien) vergroot het beeld van een object om structuren te kunnen waarnemen die met het blote oog niet zichtbaar zijn. * **Resolutie (oplossend vermogen):** Dit is de minimale afstand tussen twee punten waarbij deze nog als afzonderlijke punten kunnen worden waargenomen. * Menselijk oog: Ongeveer $0.1$ mm tot $0.2$ mm ($100$ tot $200$ micrometer) op een afstand van $25$ cm. * Lichtmicroscoop: Ongeveer $0.2$ micrometer ($200$ nanometer), wat ongeveer $500$ keer nauwkeuriger is dan het blote oog. Een lichtmicroscoop bestaat typisch uit de volgende onderdelen: 1. **Lichtbron:** (halogeen of LED) 2. **Condensor:** Een lenzensysteem dat het licht bundelt en op het preparaat projecteert. 3. **Objecttafel:** Waar het preparaat wordt gepositioneerd. 4. **Vergrotingselementen:** Objectief- en oculairlenzen. 5. **Mechaniek:** Om de lenzen op de juiste afstand tot het object te brengen. * **Objectief:** De lens die het object afbeeldt en een vergroot beeld vormt van het licht dat door het preparaat valt. Objectieven variëren in vergroting (bijv. $2.5 \times$ tot $100 \times$) en zijn gemonteerd op een draaibare revolver. * **Oculair:** De lens waarmee het door het objectief gevormde beeld verder wordt vergroot tot een virtueel beeld dat met het oog waargenomen kan worden. Meestal $10 \times$ vergroting. De eindvergroting van een lichtmicroscoop wordt berekend als: $$ \text{Eindvergroting} = \text{Vergroting objectief} \times \text{Vergroting oculair} $$ #### 2.2.1 Soorten lichtmicroscopen * **Contrastmicroscopie:** Verhoogt het contrast in ongekleurde preparaten. * **Helderveldmicroscopie:** Standaardmethode met donkere structuren tegen een lichte achtergrond. * **Fasecontrastmicroscopie:** Creëert een halo-effect rond structuren, nuttig voor het bekijken van levende cellen. * **Interferentiecontrastmicroscopie:** Produceert een pseudo-reliëf effect, ook voor levende cellen. * **Omkeermicroscoop (inverted microscope):** De objectieven bevinden zich onder de objecttafel, ideaal voor het observeren van levende cellen in kweek. * **Fluorescentiemicroscopie:** Detecteert en kwantificeert fluorescerende moleculen in cellen. Vereist dat de moleculen licht uitzenden met een specifieke golflengte na absorptie van excitatielicht. Wordt vaak gebruikt voor dubbelkleuring om co-lokalisatie te bestuderen. * Excitatielicht (korte golflengte) wordt geabsorbeerd. * Emissielicht (langere golflengte) wordt uitgezonden door de fluorescerende molecule. ### 2.3 Technieken voor lichtmicroscopie Het succesvol bestuderen van weefsels met een lichtmicroscoop vereist zorgvuldige voorbereiding van het weefsel, het maken van dunne coupes en specifieke kleuringen. #### 2.3.1 Voorbereiding van het weefsel Dit omvat het verkrijgen van het weefsel en de fixatie ervan. 1. **Nemen van het weefsel/herkomst:** * **Biopsie:** Weefsel verkregen uit een levend persoon voor diagnostiek of behandeling (bijv. chirurgische resectie, endoscopisch biopt, core needle biopt, punchbiopt, excisiebiopt, incisiebiopt). * **Cytologisch materiaal:** Aparte cellen verkregen door aspiratie (FNAC), uit vocht, bloed/beenmerguitstrijkjes, of borstels (bijv. cervixbrush). * **Orgaan-inkten:** Bij chirurgische ingrepen worden soms orgaansnedevlakken geïnkt om de plaatsing van coupes te markeren. 2. **Fixatie van het weefsel:** * **Doel:** De architectuur van het weefsel bewaren, autolyse (zelfvertering) voorkomen, de structuur van biomoleculen wijzigen en componenten op hun plaats houden. * **Eisen:** Voldoende ruime pot, voldoende fixatievloeistof (mengverhouding van minstens $1:2$ weefsel:vloeistof), correcte datering en urenregistratie, en een goed sluitende pot. * **Fixatie door immersie:** Weefsel wordt ondergedompeld in de fixatievloeistof. Formaldehyde (6%) penetreert weefsels met een snelheid van ongeveer $1$ mm per uur. * **Fixatie door perfusie:** Fixatievloeistof wordt door het weefsel gecirculeerd, wat een snellere en uniformere fixatie bevordert (bijv. bij longen). * **Soorten fixatieven:** * **Formaldehyde-gebaseerd:** Reageert met aminozuren en denatureert proteïnen (bijv. Formol 6%, Bouin's fixatief). * **Alcohol-gebaseerd:** Denatureert proteïnen door uitdroging (bijv. Ethanol 70-100%, Aceton). * **Reversibele fixatie:** Wordt gebruikt voor vriescoupes, waarbij de structuur niet permanent wordt gewijzigd (bv. 'snap freezing'). #### 2.3.2 Maken van paraffinecoupes (FFPE: formalin-fixed paraffin-embedded) Dit is een veelgebruikte methode voor het maken van dunne coupes voor lichtmicroscopie. 1. **Macroscopie en versnijden (medisch luik):** * Meten, wegen en beschrijven van het weefsel. * Snedevlakken worden geïnkt voor identificatie. * Solide organen worden ingesneden om de penetratie van fixatief te verbeteren. 2. **Inbedden:** * **Dehydratatie:** Het weefsel wordt stapsgewijs ontwaterd met alcoholen van oplopende concentratie (tot 100%). * **Klaring:** Alcohol wordt verwijderd met een agens waarin zowel alcohol als paraffine oplosbaar zijn (tolueen of xyleen). * **Paraffinering:** Het weefsel wordt geïnfiltreerd met gesmolten paraffine. * Het weefsel wordt in een mal met gesmolten paraffine geplaatst en laat uitharden tot een paraffineblok. 3. **Coupes snijden met microtoom en monteren:** * Het paraffineblok wordt met een microtoom tot zeer dunne coupes gesneden (meestal $5-7$ micrometer dik) die licht doorlaten. * De coupes worden op een draagglaasje gemonteerd. 4. **Deparaffineren:** * De paraffine wordt verwijderd uit de coupes door ze eerst in xyleen/tolueen en daarna in dalende concentraties alcohol in water te leggen, eindigend in water. Dit maakt de weefselcomponenten toegankelijk voor kleuring. * **Voordelen FFPE:** * Volume van het biopt is minder kritisch. * Technisch relatief eenvoudig. * Eenvoudig op te slaan. * Optimale morfologische kwaliteit. * Geschikt voor immunohistochemie (IHC). * **Nadelen FFPE:** * Duurt lang en is arbeidsintensief. * Activiteit van eiwitten wordt uitgeschakeld. * DNA-fragmentatie en RNA-degradatie beperken moleculair onderzoek (hoewel niet onmogelijk). * Vereist opslagruimte. #### 2.3.3 Maken van vriescoupes (cryosections) Deze methode is sneller en behoudt meer biochemische activiteit. 1. **Versnijden:** Weefselfragmenten worden gekoeld. 2. **Invriezen:** Snel invriezen, vaak in vloeibare stikstof ($-196^\circ$C) of isopentaan. 3. **Snijden met cryostaat:** Coupes worden gemaakt in een cryostaat bij temperaturen rond $-20^\circ$C. 4. **Kleuren en plakken:** De vriescoupes worden direct gekleurd en gemonteerd. * **Voordelen vriescoupes:** * Zeer snel (geschikt voor peroperatieve diagnostiek). * Beter voor detectie van componenten die oplossen tijdens de paraffinetekniek (bv. vet). * Enzymactiviteit van eiwitten blijft behouden. * Uitgebreid moleculair onderzoek mogelijk (betere preservatie van RNA en DNA). * **Nadelen vriescoupes:** * Alleen geschikt voor kleine fragmenten. * Technisch niet eenvoudig. * Vereist dure diepvrieskasten met beveiliging. * Morfologische kwaliteit is suboptimal (vriesartefacten kunnen optreden). #### 2.3.4 Kleuren van de coupes Cellen en weefsels zijn van nature kleurloos en transparant. Kleuring maakt specifieke structuren zichtbaar. * **Niet-specifieke kleuringen:** Alle cellen worden op dezelfde manier gekleurd. * **Specifieke kleuringen:** Selectief, doordat bepaalde chemische groeperingen of moleculen in de cel reageren met de kleurstof. **Soorten kleurstoffen en reacties:** * **Zure kleurstoffen (acidofiel/eosinofiel):** Reageren met basische componenten in cellen. * Cytoplasmatische eiwitten zijn basisch en binden zure kleurstoffen, waardoor ze roze kleuren met eosine. * Extracellulaire vezels zoals collageen zijn ook zuur en kleuren roze. * **Basische kleurstoffen (basofiel):** Reageren met zure componenten in cellen. * DNA (heterochromatine, nucleolus) in de nucleus en RNA in ribosomen en ruw endoplasmatisch reticulum zijn zuur en binden basische kleurstoffen, waardoor ze donkerblauw/paars kleuren (bv. met hematoxyline). * Soms is ook extracellulair materiaal basofiel (bv. koolhydraten in kraakbeen). **Veelgebruikte kleurcombinaties:** 1. **Hematoxyline & Eosine (H&E) kleuring:** * **Eosine:** Zure kleurstof, kleurt basische/acidofiele structuren roze (bv. cytoplasma). * **Hematoxyline:** Basische kleurstof (afkomstig van de logwood boom), kleurt zure/basofiele structuren donkerblauw/paars (bv. nucleus, ruw ER). 2. **Periodic acid-Schiff reaction (PAS):** * **Principe:** Perjoodzuur oxideert glycolgroepen (in koolhydraten) tot aldehydgroepen. Het Schiff-reagens reageert met deze aldehyden en geeft een donkerrode/magenta kleur. * **Kleurt:** Koolhydraten en koolhydraatrijke macromoleculen, zoals glycogeen, mucus (mucine), basale membranen, brush borders, en reticuline vezels. 3. **Enzymhistochemische kleuringen:** * Berusten op lokale enzymatische reacties in een weefselcoupe (meestal vriescoupes). * **Voorbeeld:** ATPase kleuring (pH 9.4) om spiervezeltypen te onderscheiden. 4. **Trichroom Masson kleuring:** * Gebruikt drie kleurstoffen om bindweefselcomponenten te differentiëren: * **Hematoxyline:** Kleurt kernen blauw/donkerpaars. * **Fuchsine:** Kleurt cytoplasma, fibrine roze; keratine en spiervezels helderrood. * **Anilineblauw:** Kleurt collageen blauw/groen. **Andere kleuringen:** * **Nissl en methyleenblauw:** Kleuren neuronen (met name RER) blauw. * **Reticuline kleuring:** Kleurt reticuline vezels zwart (belangrijk in beenmerg). * **Von Gieson (+/- elastica):** Kleurt collageen rood, kernen blauw, cytoplasma/erytrocyten geel. Met elastica worden elastinevezels blauw/zwart gekleurd. #### 2.3.5 Immunohistochemie (IHC) * **Principe:** Aantonen en lokaliseren van specifieke antigenen (eiwitten) in weefselcoupes met behulp van specifieke antistoffen (As), die gelabeld zijn om zichtbaar te maken. Dit is onderzoek op eiwitniveau. * **Terminologie:** * **Immuno:** Verwijst naar de antigen-antistof reactie. * **Histo:** Verwijst naar het weefsel. * **Chemie:** Verwijst naar de chemische reactie om de binding zichtbaar te maken. * **Antistoffen:** Commercieel verkrijgbaar, opgezet bij dieren (muizen, konijnen). Kunnen monoklonaal (reactief op één epitoop) of polyklonaal (reactief op meerdere epitopen van hetzelfde ag) zijn. * **Technieken:** * **Directe techniek (één-staps):** Een gelabelde primaire antistof bindt direct aan het ag in het weefsel. Voordeel: Snel. Nadeel: Minder gevoelig. * **Indirecte techniek:** Een primaire antistof bindt aan het ag, en een gelabelde secundaire antistof (die de primaire antistof herkent) bindt aan de primaire antistof. Voordeel: Gevoeliger (signaalversterking), minder gelabelde secundaire antistoffen nodig. Meest gebruikt in klinische praktijk. * **Labels:** * **Enzymen:** Bijvoorbeeld HRP (horseradish peroxidase) dat reageert met een chromogeen (bv. DAB) om een precipitatie te vormen (zichtbaar als bruine kleur). * **Fluorochromen:** Fluorescerende moleculen (bv. FITC, Alexa Fluor) die oplichten onder specifieke golflengtes. * **Toepassingen:** * Detectie van specifieke eiwitten (bv. Ki67 als proliferatiemarker, CD138 voor celadhesie, vimentine voor cytoskelet). * Bepaling van de locatie van het eiwit (nucleair, cytoplasmatisch, membraan). #### 2.3.6 In situ hybridisatie (ISH) * **Principe:** Aantonen en lokaliseren van specifieke DNA- of RNA-sequenties in weefselcoupes. Dit gebeurt met behulp van gelabelde probes (korte stukjes DNA of RNA die complementair zijn aan de doelsequentie). * **Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH):** De probes zijn gelabeld met fluorescerende moleculen. * **Chromogene In Situ Hybridisatie (CISH):** Gebruikt een enzymatische reactie met een chromogeen om een zichtbaar signaal te creëren. * **Combinatie met IHC:** Kan gecombineerd worden met immunohistochemie om zowel eiwitten als nucleïnezuren te bestuderen en de morfologie te beoordelen. #### 2.3.7 Monteren en interpreteren van preparaten * **Doel:** Het preparaat beschermen tegen uitdroging en beschadiging, en de duurzaamheid waarborgen. * **Interpretatie:** Het correct lezen van 2D-coupes om de 3D-structuur van weefsels te begrijpen. Structuren die in 3D complex zijn (bv. sterk gekronkelde buizen) kunnen in 2D doorsnedes als ronde of ovale vormen verschijnen, afhankelijk van de snijhoek. #### 2.3.8 Artefacten Artefacten zijn structuren of veranderingen die niet aanwezig waren in het levende weefsel, maar zijn ontstaan tijdens de preparatie. Voorbeelden zijn: * Krimp van weefsel. * Cholesterolkristallen (kunnen ontstaan bij fixatie of uitdrogen). * Oplossen van vetten (vooral bij paraffinetekniek). * Scheurtjes, plooien of vervormingen in de coupe. ### 2.4 Elektronenmicroscopie (kort overzicht) Hoewel dit deel specifiek over lichtmicroscopie gaat, wordt elektronenmicroscopie kort ter vergelijking genoemd. * **Resolutie:** Elektronenmicroscopen hebben een aanzienlijk hogere resolutie (ongeveer $0.2$ nanometer) dan lichtmicroscopen, waardoor veel fijnere details van celstructuren zichtbaar zijn. * **Principes:** Gebruiken elektronenstralen in plaats van licht. Er zijn twee hoofdtypen: * **Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM):** Elektronen gaan door het monster. Vereist ultradunne coupes (40-80 nm) en speciale fixatie (bv. glutaldehyde, osmiumtetroxide) en inbedding in kunsthars. * **Scanning Elektronenmicroscopie (SEM):** Elektronen scannen het oppervlak van het monster, wat een 3D-beeld oplevert. De verwerking van weefsel voor elektronenmicroscopie is complexer en vereist specifieke fixatie- en inbeddingsmethoden om de ultrastructuur te behouden. --- # Geavanceerde microscopische technieken en artefacten Dit onderwerp belicht gespecialiseerde microscopische methoden zoals immunohistochemie en *in situ* hybridisatie voor de detectie van specifieke moleculen, de veelvoorkomende artefacten die bij microscopisch onderzoek kunnen optreden, en de fundamentele principes van elektronenmicroscopie. ### 3.1 Principes van microscopie en weefselvoorbereiding Microscopie stelt ons in staat structuren te bestuderen die met het blote oog niet zichtbaar zijn. Het oplossend vermogen, gedefinieerd als de minimale afstand tussen twee punten om ze als afzonderlijk te kunnen herkennen, is cruciaal. Voor het menselijk oog ligt dit rond de 70 micrometer ($\mu m$) op een afstand van 25 cm, wat in de praktijk neerkomt op ongeveer 0,1 tot 0,2 millimeter (mm). Een standaard transmissie lichtmicroscoop kan een resolutie van ongeveer 0,2 $\mu m$ (200 nanometer, nm) bereiken, wat een factor 500 nauwkeuriger is dan het blote oog. #### 3.1.1 De lichtmicroscoop De lichtmicroscoop bestaat uit drie belangrijke lenssystemen: * **Condensor:** Bundelt het licht dat door het preparaat schijnt. * **Objectief:** Vormt een vergroot beeld van het object. * **Oculair:** Vergroot het beeld van het objectief verder, zodat het met het oog waargenomen kan worden. De eindvergroting van een lichtmicroscoop wordt berekend door de vergroting van het objectief te vermenigvuldigen met de vergroting van het oculair ($ \text{Eindvergroting} = \text{Vergroting objectief} \times \text{Vergroting oculair} $). Verschillende typen lichtmicroscopen zijn beschikbaar, elk met specifieke toepassingen: * **Contrastmicroscopie:** Verhoogt het contrast in ongekleurde preparaten. Dit omvat helderveld-, fasecontrast- en interferentiecontrastmicroscopie. * **Omkeermicroscoop (inverted microscope):** Geschikt voor het bestuderen van levende cellen. * **Fluorescentiemicroscopie:** Maakt het mogelijk de lokalisatie en kwantificering van fluorescerende moleculen in cellen te bestuderen. Dit gebeurt door detectie op basis van het uitzenden van licht aan een specifieke golflengte door een fluorescerende molecule na absorptie van excitatielicht met een kortere golflengte. Emissielicht heeft een langere golflengte. #### 3.1.2 Weefselvoorbereiding voor lichtmicroscopie De voorbereiding van weefsels voor microscopisch onderzoek is een essentieel proces dat bestaat uit verschillende stappen: **A. Nemen en fixeren van het weefsel:** Het weefsel kan worden verkregen via biopsie (endoscopisch, core needle, punch) of excisie. Voor cytologisch onderzoek kunnen individuele cellen worden verkregen, bijvoorbeeld via fijne naald aspiratie (FNAC) of vloeistoffen zoals cervixuitstrijkjes. * **Fixatie:** Het doel is de weefselarchitectuur te bewaren en verteringsprocessen (autolyse) te voorkomen. Fixatie stopt de eiwitfunctie en houdt componenten op hun plaats. * **Chemische fixatie:** * **Formaldehyde-gebaseerd:** Zorgt voor cross-linking van eiwitten en denaturatie. Penetreert weefsels met ongeveer 1 mm per uur bij immersie. * **Alcohol-gebaseerd:** Wordt gebruikt voor bepaalde fixatiemethoden. * **Snap freezing:** Snelle invriezing bij -196°C voor vriescoupes. **B. Maken van paraffinecoupes (FFPE - formalin fixed paraffin embedded):** Dit proces omvat de volgende stappen: 1. **Macroscopie en versnijden:** Het weefsel wordt gemeten, gewogen en beschreven. Snedevlakken worden geïnkt. 2. **Inbedden:** Het weefsel wordt stapsgewijs gedehydrateerd (water verwijderen), geklaard (alcohol verwijderen met tolueen of xyleen) en geïnfiltreerd met paraffine. Dit resulteert in een paraffineblok. 3. **Coupes snijden met microtoom:** Het paraffineblok wordt in ultradunne coupes (5-7 $\mu m$) gesneden die licht doorlaten. 4. **Monteren:** De coupes worden op een draagglaasje geplaatst. 5. **Deparaffineren:** De coupes worden behandeld met xyleen/tolueen en vervolgens met dalende concentraties alcohol om de paraffine te verwijderen. * **Voordelen FFPE:** Minder belangrijk volume van het biopt, technisch eenvoudig, eenvoudig te stockeren, optimale morfologische kwaliteit, geschikt voor immunohistochemie. * **Nadelen FFPE:** Duur en arbeidsintensief, eiwitactiviteit wordt uitgeschakeld, DNA/RNA fragmentatie beperkt moleculair onderzoek. **C. Maken van vriescoupes:** Dit proces is sneller en omvat: 1. **Versnijden:** Het weefsel wordt versneden. 2. **Invriezen:** Snelle invriezing, vaak met vloeibare stikstof (-196°C) of isopentaan. 3. **Snijden met cryostaat:** Coupes worden gesneden bij een temperatuur van ongeveer -20°C. * **Voordelen vriescoupes:** Zeer snel (geschikt voor peroperatieve diagnostiek), beter voor detectie van componenten die oplossen in paraffine (bv. vet), enzymactiviteit blijft bewaard, uitgebreid moleculair onderzoek mogelijk (goede preservatie van RNA/DNA). * **Nadelen vriescoupes:** Alleen geschikt voor kleine fragmenten, technisch niet eenvoudig, vereist dure diepvrieskasten met beveiliging, suboptimale morfologische kwaliteit (vriesartefacten). #### 3.1.3 Kleuren van coupes Omdat cellen en weefsels van nature kleurloos en transparant zijn, is kleuring essentieel om structuren zichtbaar te maken. Kleuringen kunnen niet-specifiek (alle cellen op dezelfde manier kleuren) of specifiek zijn, waarbij bepaalde moleculen of structuren selectief worden gekleurd. * **Zure kleurstoffen (acidofiel/eosinofiel):** Reageren met basische componenten in cellen, zoals cytoplasmatische eiwitten en extracellulaire vezels (collageen). Ze kleuren roze met H&E. * **Basische kleurstoffen (basofiel):** Reageren met zure componenten in cellen, zoals DNA (heterochromatine, nucleolus) in de kern, en RNA in ribosomen en ruw endoplasmatisch reticulum. Ze kleuren donkerblauw/paars met H&E. **Veelgebruikte kleuringen:** * **Hematoxyline en Eosine (H&E):** * **Eosine:** Zure kleurstof, kleurt basische/acidofiele structuren roze (bv. cytoplasma). * **Hematoxyline:** Basische kleurstof, kleurt zure/basofiele structuren donkerblauw/paars (bv. nucleus, RER). * **Periodic acid-Schiff (PAS) reactie:** Kleurt koolhydraten en koolhydraatrijke macromolecules magenta/donkerrood. Dit omvat glycogeen, mucus, basale membranen, brush borders en reticuline vezels. De reactie berust op de oxidatie van glycolgroepen tot aldehydgroepen, die vervolgens reageren met Schiff-reagens. * **Enzymhistochemische kleuringen:** Gebruiken lokale enzymatische reacties, vaak toegepast op vriescoupes (bv. ATPase-kleuring voor spiervezeltypen). * **Trichroom Masson kleuring:** Gebruikt drie kleurstoffen om bindweefsel te visualiseren. Hematoxyline kleurt kernen blauw. Fuchsine kleurt cytoplasma en fibrine roze/helderrood. Anilineblauw kleurt collageen blauw/groen. * **Andere kleuringen:** * **Nissl en methyleenblauw:** Kleurt neuronen en RER in neuronen. * **Reticuline kleuring:** Kleurt reticuline vezels zwart. * **Von Gieson (+/- elastica):** Kleurt collageen rood, kernen blauw, cytoplasma en rode bloedcellen geel. Kan gecombineerd worden om elastine vezels blauw/zwart te kleuren. ### 3.2 Gespecialiseerde moleculaire detectietechnieken #### 3.2.1 Immunohistochemie (IHC) Immunohistochemie is een techniek om de lokalisatie van een specifiek antigeen (meestal een eiwit) in een weefselcoupe aan te tonen met behulp van specifieke antistoffen (As). Het is een 'chemie' in weefsel ('histo') gebaseerd op immuunreacties. * **Principe:** Antilichamen, specifiek voor het te detecteren antigeen, binden hieraan. De antistof-antigeen interactie wordt zichtbaar gemaakt met behulp van labels. * **Soorten antilichamen:** * **Monoklonale antistoffen:** Geproduceerd door één klonale populatie B-cellen, binden aan één specifiek epitoop (bindingsplaats) op het antigeen. * **Polyclonale antistoffen:** Een mix van antistoffen die tegen verschillende epitopen van hetzelfde antigeen zijn gericht. * **Detectiemethoden:** * **Directe methode:** Een gelabelde primaire antistof bindt direct aan het antigeen. Eenvoudig maar minder gevoelig. * **Indirecte methode:** Een ongelabelde primaire antistof bindt aan het antigeen, gevolgd door een gelabelde secundaire antistof die bindt aan de primaire antistof. Dit versterkt het signaal omdat meerdere secundaire antistoffen aan één primaire antistof kunnen binden. Dit is de meest gebruikte methode in de klinische praktijk vanwege de hogere gevoeligheid. * **Labels:** Kunnen enzymen zijn (bv. horseradish peroxidase - HRP, die reageert met een chromogeen zoals diaminobenzidine (DAB) om een precipitaat te vormen) of fluorochromen (voor fluorescentie-gebaseerde detectie). * **Toepassingen:** Aantonen van eiwitten op nucleair, cytoplasmatisch of membraanniveau. Voorbeelden zijn Ki67 (proliferatiemarker), CD138/syndecan (celadhesiemolecuul) en vimentine (cytoskelet). #### 3.2.2 Fluorescentie *in situ* Hybridisatie (FISH) FISH is een techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties aan te tonen in weefselcoupes of cellen. * **Principe:** Gebruikt gelabelde probes, die complementair zijn aan de te detecteren sequentie, om deze te hybridiseren. De probes kunnen een fluorescerend label dragen voor detectie. * **Toepassingen:** Detectie van genamplificaties, translocaties, of viral RNA. * **Chromogene *in situ* Hybridisatie (CISH):** Combineert elementen van IHC en FISH, waarbij een chromogeen wordt gebruikt om de detectie zichtbaar te maken. Dit maakt beoordeling van de morfologie mogelijk. ### 3.3 Artefacten bij microscopisch onderzoek Artefacten zijn structuren of veranderingen die niet aanwezig waren in het levende weefsel, maar ontstaan tijdens het preparatieproces. Ze kunnen de interpretatie van de morfologie bemoeilijken. * **Krimp:** Kan optreden tijdens fixatie of dehydratie, wat leidt tot ruimte tussen weefselcomponenten. * **Cholesterolkristallen:** Kunnen ontstaan door kristallisatie van cholesterol tijdens fixatie en verwerking. * **Oplossen van vet:** Vet kan oplossen tijdens de paraffine-inbedding, wat leidt tot holtes en veranderingen in de structuur. * **Scheurtjes en plooitjes:** Kunnen ontstaan door mechanische stress tijdens het snijden of hanteren van de coupes. ### 3.4 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie maakt gebruik van elektronenstralen in plaats van licht om beelden te genereren, wat resulteert in een aanzienlijk hogere resolutie. * **Resolutie:** De theoretische resolutie van een elektronenmicroscoop kan tot 0,2 nanometer (nm) bedragen, wat een factor 1000 beter is dan die van een lichtmicroscoop. * **Principes:** * **Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM):** Elektronen gaan door het monster. Vereist ultradunne coupes (40-80 nm), ingebed in kunsthars en gekleurd met zware metalen die elektronen absorberen of verstrooien (bv. uranylacetaat, loodcitraat). * **Scanning Elektronenmicroscopie (SEM):** Een elektronenbundel scant het oppervlak van het monster, en de reflectie van de elektronen wordt gedetecteerd om een 3D-beeld te creëren. * **Weefselvoorbereiding voor TEM:** Vereist specifieke fixatie (bv. met glutaaraldehyde en osmiumtetroxide), dehydratie, inbedding in kunstharsen, en snijden met diamantmessen. > **Tip:** Het correct interpreteren van microscopische beelden vereist oefening en kennis van mogelijke artefacten. Vergelijken met referentiemateriaal en literatuur is essentieel. > > **Tip:** Voor de interpretatie van 3D-structuren in 2D-coupes is het belangrijk te herkennen hoe verschillende doorsneden (transversaal, longitudinaal, obliek) de schijnbare vorm van structuren kunnen beïnvloeden. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Histologie | De studie van de microscopische anatomie van biologische weefsels en cellen. Het onderzoekt de structuur, functie en organisatie van deze elementen op cellulair en subcellulair niveau. | | Morfologie | De studie van de vorm en structuur van organismen en hun specifieke delen. In de histologie verwijst het naar de microscopische vorm van cellen en weefsels. | | OLA | Een opleidingsonderdeel (OLA) is een afzonderlijk deel van een grotere cursus of opleiding dat specifieke leerdoelen en evaluatiemethoden heeft. | | Hoorcollege | Een klassieke lesvorm waarbij de docent theoretische stof presenteert aan een groep studenten, vaak met behulp van dia"s of andere visuele hulpmiddelen. | | Oefenzitting | Een interactieve les waarbij studenten onder begeleiding van een docent oefeningen maken of specifieke vaardigheden toepassen die verband houden met de studiestof. | | Toledo | Een digitaal leerplatform, waarschijnlijk een learning management system (LMS) zoals Canvas of Blackboard, dat wordt gebruikt voor het delen van lesmateriaal, opdrachten en communicatie tussen docenten en studenten. | | Artefact | Een structuur die aanwezig is in een microscopische coupe, maar die niet tot het oorspronkelijke weefsel behoort en ontstaan is door externe invloeden tijdens het preparatieproces. | | Lichtmicroscoop | Een optisch instrument dat zichtbaar licht gebruikt om vergrote beelden van kleine objecten of structuren te produceren. Het heeft een beperkter oplossend vermogen dan een elektronenmicroscoop. | | Resolutie (oplossend vermogen) | De minimale afstand tussen twee punten die nog als afzonderlijk herkenbaar zijn. Een hogere resolutie betekent dat kleinere details kunnen worden onderscheiden. | | Condensor | Een lenssysteem in een microscoop dat licht bundelt en richt op het preparaat, wat essentieel is voor een optimale belichting van het object. | | Objectief | Het primaire vergrotende lenzensysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het te observeren preparaat bevindt en een initieel, vergroot beeld vormt. | | Oculair | De lens in een microscoop waardoor de waarnemer het beeld van het objectief bekijkt, wat resulteert in de eindvergroting van het beeld. | | Helderveldmicroscopie | Een standaard microscopische techniek waarbij het preparaat belicht wordt met helder licht en contrast ontstaat door de absorptie van licht door de specimenonderdelen. | | Fasecontrastmicroscopie | Een techniek die faseverschillen in licht die door verschillende delen van het specimen gaan, omzet in helderheidsverschillen, waardoor transparante objecten, zoals levende cellen, zichtbaar worden. | | Fluorescentiemicroscopie | Een methode die gebruikmaakt van fluorescentie om beelden te creëren. Moleculen in het specimen zenden licht uit na excitatie door een specifieke golflengte, wat zichtbaar gemaakt wordt. | | Fixatie | Een proces waarbij chemische middelen worden gebruikt om de structuur van weefsels en cellen te behouden na het nemen van een monster, door eiwitten te stabiliseren en autolyse te voorkomen. | | Paraffinecoupe | Een dun sneetje weefsel dat is ingebed in paraffine, gesneden met een microtoom en vervolgens gekleurd voor microscopisch onderzoek. Dit is een veelgebruikte methode voor permanente preparaten. | | Vriescoupe | Een dun sneetje weefsel dat direct uit bevroren materiaal is gesneden, vaak met een cryostaat. Deze techniek is snel en behoudt enzymatische activiteit, wat nuttig is voor peroperatieve diagnostiek. | | Acidofiel (eósinefiel) | Een celcomponent of weefselstructuur die een zure kleurstof (zoals eosine) met een negatieve lading aantrekt, waardoor het roze of rood kleurt in H&E-kleuringen. | | Basofiel | Een celcomponent of weefselstructuur die een basische kleurstof (zoals hematoxyline) met een positieve lading aantrekt, waardoor het blauw of paars kleurt in H&E-kleuringen. Dit geldt vaak voor celkernen die DNA bevatten. | | Immunohistochemie (IHC) | Een techniek die antistoffen gebruikt om specifieke eiwitten (antigenen) in weefselcoupes aan te tonen en te lokaliseren, wat helpt bij de diagnose en classificatie van ziekten. | | In Situ Hybridisatie (ISH) | Een moleculaire techniek die wordt gebruikt om de aanwezigheid en locatie van specifieke DNA- of RNA-sequenties in cellen of weefsels aan te tonen, met behulp van complementaire, gelabelde sondes (probes). | | Elektronenmicroscoop | Een microscoop die elektronenbundels gebruikt in plaats van licht om beelden te creëren, waardoor aanzienlijk hogere resoluties en vergrotingen mogelijk zijn dan met een lichtmicroscoop. | | Transmissie Elektronenmicroscopie (TEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij een elektronenbundel door een ultradun weefselcoupe gaat. De beeldvorming is gebaseerd op de absorptie of verstrooiing van elektronen door het specimen. | | Scanning Elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie dat de interactie van elektronen met het oppervlak van een specimen bestudeert om een driedimensionaal beeld te creëren. |