Cel1_sessie7_2025.pdf

# Diffractie en interferentie van golven Diffractie en interferentie zijn fundamentele golfverschijnselen die optreden wanneer golven zich voortplanten en elkaar ontmoeten of interactie hebben met obstakels. ### 1.1 Huygens principe en superpositie van golven Het **Huygens principe** stelt dat elk punt van een golffront fungeert als een bron van nieuwe golfjes die zich voortplanten met de snelheid van de golf in het medium. Het golffront op een later moment is het raakvlak aan deze nieuwe golfjes. Dit principe is toepasbaar op alle soorten golven, inclusief elektromagnetische golven zoals licht [1](#page=1). Wanneer golven van twee of meer bronnen elkaar overlappen, is het **superpositieprincipe** van toepassing. Dit principe stelt dat de resulterende amplitude op een bepaald punt de vectoriële som is van de amplitudes van de individuele golven op dat punt [1](#page=1) [2](#page=2). #### 1.1.1 Constructieve interferentie **Constructieve interferentie** treedt op wanneer golven zich in fase bevinden. Dit betekent dat de maxima en minima van de golven op hetzelfde moment optreden. In dit geval versterken de golven elkaar, wat resulteert in een golf met een grotere amplitude. Voor gelijke golven vindt constructieve interferentie plaats wanneer het faseverschil een geheel veelvoud is van de golflengte ($n\lambda$), ofwel wanneer het weglengteverschil een geheel veelvoud is van de golflengte ($n\lambda$) [1](#page=1) [2](#page=2). > **Tip:** Denk bij constructieve interferentie aan twee golven die "samenwerken" om een grotere golf te creëren. #### 1.1.2 Destructieve interferentie **Destructieve interferentie** treedt op wanneer golven zich in tegenfase bevinden. Dit betekent dat een maximum van de ene golf samenvalt met een minimum van de andere golf. Hierdoor heffen de golven elkaar (gedeeltelijk) op, wat resulteert in een verminderde amplitude of zelfs de afwezigheid van golven in die richting. Voor gelijke golven vindt destructieve interferentie plaats wanneer het faseverschil een oneven veelvoud is van de halve golflengte ($(\frac{1}{2} + n)\lambda$ of $(2n+1)\frac{\lambda}{2}$), ofwel wanneer het weglengteverschil een oneven veelvoud is van de halve golflengte [1](#page=1) [2](#page=2). > **Tip:** Destructieve interferentie kan gezien worden als twee golven die elkaar "tenietdoen". De specifieke richtingen waarin constructieve en destructieve interferentie optreden, worden bepaald door de afstand tussen de bronnen en de golflengte van de golven. Voor twee coherente puntbronnen met een afstand $d$ ertussen, wordt de hoek $\theta$ waaronder destructieve interferentie optreedt gegeven door de voorwaarde: $$d \sin \theta = \left(n + \frac{1}{2}\right) \lambda$$ waarbij $n$ een geheel getal is. De eerste donkere strook (minimale hoek voor destructieve interferentie) wordt bereikt voor $n=0$ [2](#page=2): $$d \sin \theta = \frac{\lambda}{2}$$ [2](#page=2). ### 1.2 Diffractie van elektromagnetische golven Wanneer een parallelle bundel licht door een zeer smalle spleet valt, treedt **diffractie** op. In plaats van simpelweg de projectie van de spleet te vormen, ontstaat er een patroon van afwisselend heldere en donkere stroken op een scherm dat zich op enige afstand bevindt [3](#page=3). Dit fenomeen kan worden verklaard met het Huygens principe, waarbij elk punt in de spleet als een bron van nieuwe golfjes wordt beschouwd. De interactie (interferentie) van deze golfjes leidt tot het waargenomen patroon [3](#page=3). De **eerste donkere strook** ontstaat onder een hoek $\theta$ waarbij het verschil in weglengte van de lichtstralen aan de uiterste zijden van de spleet gelijk is aan de golflengte $\lambda$. Op deze hoek is de golf afkomstig van het midden van de spleet in tegenfase met de golf afkomstig van de bovenzijde van de spleet. Door het continue karakter van de golven en de superpositie, is elke golf boven het midden in tegenfase met een corresponderende golf daaronder, wat leidt tot volledige destructieve interferentie [3](#page=3). De **tweede donkere strook** ontstaat wanneer het verschil in weglengte tussen de lichtstralen aan de uiterste zijden van de spleet gelijk is aan $2\lambda$. Dit kan worden geredeneerd door de spleet te beschouwen als opgebouwd uit twee helften, waarbij de redenering voor het eerste minimum wordt toegepast op deze twee helften. Algemeen geldt dat de donkere stroken ontstaan wanneer het weglengteverschil tussen de uiterste randen van de spleet een geheel veelvoud is van de golflengte [3](#page=3). > **Voorbeeld:** Het diffractiepatroon van licht door een enkele spleet is een klassiek voorbeeld van hoe interferentie, veroorzaakt door diffractie, leidt tot specifieke heldere en donkere banden (maxima en minima). --- # Optische instrumenten en microscopie Dit hoofdstuk bespreekt het onderscheidend vermogen van optische instrumenten, lensaberraties, het principe van de lichtmicroscoop en verschillende microscopische technieken [10](#page=10) [11](#page=11) [12](#page=12) [13](#page=13) [14](#page=14) [15](#page=15) [16](#page=16) [17](#page=17) [18](#page=18) [19](#page=19) [20](#page=20) [21](#page=21) [22](#page=22) [23](#page=23) [24](#page=24) [25](#page=25) [26](#page=26) [27](#page=27) [4](#page=4) [5](#page=5) [6](#page=6) [7](#page=7) [8](#page=8) [9](#page=9). ### 2.1 Onderscheidend vermogen van optische instrumenten Het onderscheidend vermogen van een optisch instrument is de mate waarin twee dicht bij elkaar gelegen objecten nog als afzonderlijke objecten waargenomen kunnen worden. Dit vermogen wordt beperkt door diffractie [4](#page=4). #### 2.1.1 Diffractie door een spleet en een circulaire opening Bij diffractie door een spleet van breedte $W$ treden de opeenvolgende minima in intensiteit op bij hoeken $\theta$ gegeven door: $$ \sin\theta = \frac{n\lambda}{W} $$ met $n = 1, 2, 3, \dots$ Tussen deze donkere stroken bevinden zich heldere stroken door constructieve interferentie, waarbij de intensiteit afneemt naarmate men verder van de centrale projectie van de spleet verwijderd is [4](#page=4). Voor een lichtbundel die door een kleine circulaire opening met diameter $D$ gaat, treedt een circulair diffractiepatroon op. Het eerste minimum treedt op onder een hoek $\theta$ gegeven door: $$ \sin\theta = \frac{1.22\lambda}{D} $$ #### 2.1.2 Criterium van Rayleigh Het criterium van Rayleigh stelt dat twee puntvormige objecten nog juist van elkaar onderscheiden kunnen worden wanneer het centrale maximum van het diffractiepatroon van het ene voorwerp samenvalt met het eerste minimum van het diffractiepatroon van het andere voorwerp [4](#page=4). Voor kleine hoeken ($\sin\theta \approx \theta$) wordt de minimale hoek $\theta_{min}$ waaronder twee voorwerpen nog gescheiden kunnen worden gezien vanuit de opening gegeven door: $$ \theta_{min} = \frac{1.22\lambda}{D} $$ met $\theta$ in radialen [4](#page=4). #### 2.1.3 Toepassing op microscoop en oog Bij de microscoop, met een objectief van diameter $D$ en een afstand $d$ van de lens tot de twee punten $S_1$ en $S_2$ op een afstand $s$ van elkaar, geldt dat de minimale scheidbare afstand $s$ wordt gegeven door: $$ s = 1.22 \left(\frac{d}{D}\right) \lambda $$ Omdat $d/D$ bij een microscoop dicht bij 1 ligt, is de kleinste detail dat gezien kan worden van de grootteorde van de golflengte van het gebruikte licht, ongeveer $0.5 \text{ µm}$ [5](#page=5). Voor het menselijk oog met een pupilgrootte van $2.5 \text{ mm}$ en groen licht met een golflengte van $555 \text{ nm}$ (in het oog effectief $408 \text{ nm}$ door brekingsindex), is de resolutie: $$ \theta_{min} = \frac{1.22\lambda}{D} = \frac{1.22 \times 408 \times 10^{-9} \text{ m}}{2.5 \times 10^{-3} \text{ m}} = 2.0 \times 10^{-4} \text{ radialen} $$ Op een afstand van $10 \text{ m}$ kunnen twee punten met deze resolutie nog gescheiden worden op een afstand van $2 \text{ mm}$ [5](#page=5). ### 2.2 Lensaberraties Lensaberraties zijn fouten in lenzen die ervoor zorgen dat een puntvormig voorwerp niet noodzakelijk in een punt wordt afgebeeld. De belangrijkste zijn sferische aberratie, chromatische aberratie en beeldvlakkromming [6](#page=6). #### 2.2.1 Sferische aberratie Deze aberratie wordt veroorzaakt door het verschil in focusafstand tussen axiale en buitenste zones van een lens, waarbij stralen verder van de optische as sterker worden afgebogen. Een oplossing is het gebruik van een diafragma met variabele apertuur om buitenste stralen af te snijden [6](#page=6). #### 2.2.2 Chromatische aberratie Doordat de brekingsindex afhangt van de golflengte (kortere golflengtes worden sterker gebroken), heeft licht met kortere golflengtes (bv. violet) een kleinere brandpuntsafstand dan licht met langere golflengtes (bv. rood). Dit resulteert in een veelkleurige halo rond de afbeelding van een puntvormig voorwerp bij wit licht. Oplossingen omvatten het gebruik van samengestelde, achromatische lenzen gemaakt van verschillende glassoorten [6](#page=6). #### 2.2.3 Beeldvlakkromming Bij beeldvlakkromming wordt een voorwerp in een plat vlak afgebeeld in een gekromd vlak (Petzval-oppervlak). Dit kan worden verholpen door het gebruik van lenzensystemen, zogenaamde aplanatische lenzenstelsels, die een voorwerp in een plat vlak afbeelden. Plan Apo objectieven zijn gecorrigeerd voor zowel chromatische aberraties als beeldvlakkromming [6](#page=6) [7](#page=7). ### 2.3 Principe van de lichtmicroscoop Een microscoop bereikt grotere vergrotingen dan een loep door het gebruik van een systeem van twee lenzen: de objectief en het oculair [7](#page=7). * **Objectief:** Deze sterk convergerende lens met een kleine brandpuntsafstand bevindt zich dicht bij het voorwerp en vormt een reëel beeld ($I_o$) van het object [7](#page=7) [8](#page=8). * **Oculair:** Dit werkt als een loep en vormt van het beeld $I_o$ een virtueel beeld ($I_e$) [8](#page=8). De totale vergroting ($m$) is het product van de vergroting van het objectief ($m_o$) en het oculair ($m_e$): $$ m = m_o m_e $$ De vergroting van het objectief wordt gegeven door: $$ m_o = \frac{i_o}{p_o} = 1 - \frac{i_o}{f_o} $$ waarbij $p_o$ de voorwerpsafstand is (negatief) en $i_o$ de beeldafstand (positief) [8](#page=8). De vergroting van het oculair wordt gegeven door: $$ m_e = \frac{i_e}{p_e} = 1 - \frac{i_e}{f_e} $$ waarbij $p_e$ de voorwerpsafstand is (negatief) en $i_e$ de beeldafstand (negatief) [9](#page=9). Met $N$ als de afstand van het nabijheidspunt ($25 \text{ cm}$) en $i_e \approx -N$, wordt de totale vergroting bij benadering: $$ m \approx -\frac{i_o N}{f_o f_e} $$ De formule laat zien dat een zo klein mogelijke $f_o$ nodig is voor de grootste vergroting [9](#page=9). #### 2.3.1 Köhler verlichting Köhler verlichting zorgt voor een homogene, heldere veldbelichting van het preparaat, essentieel voor transmissielichtmicroscopie. De lichtweg voor belichting en beeldvorming zijn gescheiden [10](#page=10). * **Lichtbron:** Meestal een halogeenlamp. Het uitgezonden spectrum varieert met de dimming; dimlicht bevat veel rood en geel licht. Filters kunnen gebruikt worden om intensiteit te verminderen en rode componenten te reduceren [10](#page=10). #### 2.3.2 Het objectief Objectieven zijn verwisselbaar en hebben een zeer kleine brandpuntsafstand. De **numerieke apertuur (NA)** van een objectief wordt gedefinieerd als [11](#page=11): $$ \text{NA} = n \sin\alpha $$ met $n$ de brekingsindex van het medium tussen objectief en preparaat (lucht $n=1$, immersieolie $n=1.52$) en $\alpha$ de halve hoek waaronder de objectieflens vanuit het preparaat wordt gezien. De hoogste NA voor een droge lens is ongeveer 1, voor een immersieobjectief 1.51 [11](#page=11). De resolutie ($s$) kan direct uit de NA worden afgeleid: $$ \text{resolutie} = \frac{0.61\lambda}{\text{NA}} $$ De golflengte $\lambda$ dient hierbij in lucht te worden genomen. De beste resolutie in lichtmicroscopie met een immersieobjectief (NA 1.4) en groen licht (500 nm) bedraagt $0.22 \text{ µm}$ [11](#page=11) [12](#page=12). Objectieven worden ingedeeld op gebruik (bv. droog, immersie, fase-contrast) [12](#page=12). * **Achromaten:** Gecorrigeerd voor chromatische aberraties voor rood en blauw licht [12](#page=12). * **Apoachromaten:** Sterk gecorrigeerd voor chromatische aberraties voor alle kleuren [12](#page=12). * **Plan-objectieven:** Gecorrigeerd voor beeldvlakkromming (aplanatisch) [12](#page=12). De beste objectieven zijn **Plan-apo objectieven** [12](#page=12). Objectieven voor fluorescentiemicroscopie moeten ook UV-transmissie hebben. Tubuslengtes van $160 \text{ mm}$ of $170 \text{ mm}$ maken het wisselen van objectieven zonder veel aanpassing van scherpstelling mogelijk [12](#page=12). Een voorbeeld van informatie op een objectief: "Ph3 Neofluar 40/0.85 Oil 160/0.17". Dit betekent: fase ring, UV-transparant vergroting x40 / NA 0.85 immersieobjectief, tubuslengte 160 mm / coverslip dikte 0.17 mm [12](#page=12). #### 2.3.3 Condensor De condensor focust een uniforme kegel van licht op het specimen. Voor optimale microscopie moet de apertuur van de condensor aangepast zijn aan de NA van het objectief (idealiter 70-90% van de objectief apertuur) [12](#page=12) [13](#page=13). * Te open diafragma veroorzaakt strooilicht en verlies van contrast [13](#page=13). * Te klein diafragma leidt tot resolutieverlies [13](#page=13). In **donkerveldmicroscopie** wordt de directe lichtbundel geblokkeerd; alleen verstrooid licht van het object wordt waargenomen, wat resulteert in een donkere achtergrond [13](#page=13). #### 2.3.4 Oculair Het oculair vergroot het door het objectief gevormde beeld, meestal met een factor 10. De meeste oculairen van het Huygens-type bestaan uit een veldlens en een ooglens. Een meetplaatje kan hier worden geplaatst voor grootte-metingen [13](#page=13). #### 2.3.5 Invert microscoop De invert microscoop is aangepast voor observatie van celculturen in dikke recipiënten. De lichtbron en condensor bevinden zich boven het specimen, en de objectieflens onder de recipiënt [14](#page=14). ### 2.4 Fasecontrastmicroscopie Fasecontrastmicroscopie is gebaseerd op de faseverandering van lichtgolven door variaties in brekingsindex binnen het specimen. Dit maakt observatie van levende, ongekleurde cellen mogelijk [14](#page=14). Het principe berust op het creëren van een faseverschil tussen de niet-afgebogen bundel (centraal maximum) en de diffractiebundels. Een speciale faseringsring in de condensor creëert een circulaire spleet, terwijl een faseplaat in het objectief de fase van de directe bundel en de verstrooide bundels manipuleert. Door deze manipulatie en daaropvolgende destructieve interferentie ontstaat een donker beeld in een homogeen midden, met intensiteitsverschillen die overeenkomen met brekingsindexverschillen in het specimen [14](#page=14) [15](#page=15). > **Tip:** Fasecontrastmicroscopie produceert geen halo-vorming aan de randen, maar wel intensiteitsverschillen die de structuur van ongekleurde cellen zichtbaar maken. ### 2.5 Differentieel interferentie contrast (DIC) microscoop De DIC-microscoop (ook Nomarski-microscoop) verbetert ook het contrast in transparante samples, maar gebruikt gepolariseerd licht en prisma's. Twee orthogonale gepolariseerde lichtbundels worden gefocusseerd op het preparaat, enigszins gescheiden. Na interactie met het preparaat worden deze bundels weer samengevoegd met dezelfde polarisatie, waardoor interferentie optreedt die afhankelijk is van het optisch weglengteverschil [16](#page=16). DIC vertoont een rand-schaduw in plaats van halo's, biedt over het algemeen betere resolutie dan fasecontrast, en kan dikkere samples waarnemen [16](#page=16). ### 2.6 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van stoffen die licht absorberen bij een bepaalde golflengte (excitatie) en dit weer uitzenden bij een langere golflengte (emissie). Dit wordt gebruikt voor gevoelige en specifieke detectie van moleculen, zoals antilichamen en DNA-proben, vaak met behulp van fluorochromen zoals FITC (groene emissie), TRITC (rode emissie), DAPI (blauwe emissie) en PI (rode emissie) [17](#page=17). De lichtweg omvat: 1. **Lichtbron:** Meestal een kwiklamp [18](#page=18). 2. **Excitatiefilter:** Selecteert de excitatiegolflengte van het fluorochroom [18](#page=18). 3. **Dichroïsche spiegel/prisma:** Weerkaatst excitatielicht en laat emissielicht door [18](#page=18). 4. **Emissiefilter:** Blokkeert excitatiegolflengte en laat emissiegolflengte door [18](#page=18). Het beeld toont de gefluoresceerde structuren tegen een donkere achtergrond [18](#page=18). > **Voorbeeld:** Bij een delende longcel kunnen met drie antilichamen chromosomen (blauw), keratine filamenten (rood) en microtubulinen (geel) zichtbaar gemaakt worden [19](#page=19). ### 2.7 Confocale microscopie Confocale microscopie maakt het mogelijk om optische secties van dikkere weefsels te verkrijgen, tot $100 \text{ µm}$, en driedimensionale beelden te reconstrueren [19](#page=19). Het principe berust op het gebruik van een laserbundel die het specimen afscant, met lichtcollectie via een fotomultiplicator. Een kleine apertuur (confocale opening) voor de fotomultiplicator blokkeert licht dat buiten het scherpe brandvlak valt, wat resulteert in optische secties met een zeer kleine scherptediepte. Door deze secties op verschillende dieptes te verzamelen en met software te combineren, ontstaat een 3D-voorstelling [19](#page=19) [20](#page=20). ### 2.8 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie verhoogt het oplossend vermogen aanzienlijk ten opzichte van lichtmicroscopie, tot ongeveer $1 \text{ nm}$. Dit is gebaseerd op het golflengtekarakter van bewegende elektronen en het gebruik van magneetspoelen als elektronenlenzen [21](#page=21). #### 2.8.1 Golflengte van elektronen Volgens de kwantumtheorie hebben bewegende deeltjes, zoals elektronen, een golfkarakter met een golflengte $(\lambda)$ gegeven door: $$ \lambda = \frac{h}{m_e v} $$ met $h$ de constante van Planck, $m_e$ de massa en $v$ de snelheid van het elektron. Bij een versnellingspotentiaal van $60 \text{ kV}$ is de golflengte van elektronen $0.005 \text{ nm}$, circa 100.000 keer kleiner dan die van zichtbaar licht [21](#page=21). #### 2.8.2 Elektronenlenzen en aberraties Elektronen kunnen niet met glaslenzen worden gefocusseerd. Hiervoor worden magneetspoelen met ringvormige weekijzeren poolschoenen gebruikt om lokale sterke magnetische velden op te wekken. Net als bij glaslenzen treden ook bij elektromagnetische lenzen aberraties op, zoals sferische aberraties en beeldveldvervorming, wat het scheidend vermogen beperkt tot $1 \text{ nm}$ [21](#page=21). #### 2.8.3 Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM) De bouw van een TEM lijkt sterk op die van een lichtmicroscoop. De "lichtbron" is een wolfraamdraad die door verhitting elektronen uitzendt. Deze worden versneld tot een smalle bundel door een potentiaalverschil tussen $40$ en $100 \text{ kV}$. Condensorlenzen concentreren de bundel op het preparaat [22](#page=22). Contrast bij TEM wordt verkregen door het verstrooiingspatroon van elektronen door het preparaat. Het preparaat is meestal een dunne coupe (ca. $50 \text{ nm}$) op een koperen grid. Voor contrast worden verbindingen van elementen met een hoog atoomnummer (hoge Z) gebruikt, zoals osmiumtetroxide (bindt aan eiwitten) en uranylacetaat (affiniteit voor DNA). De schaduwtechniek, waarbij metaal wordt bestoven, kan ook worden toegepast [23](#page=23). Meerdere lenzen (objectief, diffractie, tussenlens) vormen een vergrote afbeelding die via projectorlenzen op een fluorescerend beeldscherm wordt geprojecteerd. Vergrotingen variëren van circa 1000x tot 500.000x. Fotografische emulsie wordt gebruikt voor het beste resultaat [23](#page=23). > **Voorbeeld:** Elektronenmicrografie kan verschillende stadia van lymfocytenafbraak (apoptose) en necrose visualiseren, met zichtbare veranderingen in de kernmorfologie [24](#page=24). #### 2.8.4 Scanning Elektronenmicroscoop (SEM) Een SEM scant het preparaat punt per punt met een elektronenbundel. Secundaire en/of gereflecteerde primaire elektronen worden gedetecteerd en moduleren de lichtintensiteit op een kathodestraalbuis, waardoor een beeld van het oppervlak wordt gevormd [24](#page=24) [25](#page=25). > **Kenmerk:** Het beeld heeft een driedimensionaal uitzicht doordat het aantal secundaire elektronen afhankelijk is van de hoek van de elektronenbundel met het oppervlak [25](#page=25). SEM wordt gebruikt voor de studie van oppervlakken en heeft een resolutie van ongeveer $10 \text{ nm}$ met effectieve vergrotingen tot 20.000x. Biologische monsters moeten elektrisch geleidend gemaakt worden door ze te bedekken met een dun laagje goud of platina [25](#page=25). ### 2.9 Scanning Probe Microscoop (SPM) SPM's gebruiken een mechanische probe voor beeldvorming, waardoor dynamische processen en effecten van toegevoegde moleculen bestudeerd kunnen worden. Details tot een fractie van $10^{-10} \text{ m}$ kunnen worden onderscheiden [26](#page=26). Er zijn twee typen SPM's: 1. **Scanning Tunnelmicroscoop (STM):** De tip wordt dicht bij een geleidend oppervlak gebracht. Een aangelegde spanning veroorzaakt een kwantummechanische tunnelstroom die exponentieel afhankelijk is van de afstand tussen tip en oppervlak. Door de hoogte van de tip constant te houden, wordt het oppervlak in kaart gebracht [26](#page=26) [27](#page=27). 2. **Atomic Force Microscoop (AFM):** Deze kan beelden maken van niet-geleidende oppervlakken. Een fijne punt (tip) staat in contact met een gevoelige krachtsensor. Interatomaire krachten tussen de tip en het oppervlak worden waargenomen. De krachtsensor voldoet aan de wet van Hooke ($F = -kz$), waarbij uitwijkingen tot $0.1 \text{ nm}$ gedetecteerd kunnen worden [27](#page=27). SPM's zijn niet-invasieve methoden om oppervlaktekenmerken van biologische structuren met hoge nauwkeurigheid in kaart te brengen [27](#page=27). --- # Verschillende microscopische technieken Dit hoofdstuk behandelt diverse microscopische methoden die essentieel zijn voor het bestuderen van structuren op een microschaal, variërend van cellen tot moleculen, elk met specifieke toepassingen en technische principes. ### 3.1 De breedveld lichtmicroscoop De breedveld lichtmicroscoop is een fundamenteel instrument in de biologie en geneeskunde. Het principe is gebaseerd op het doorlichten van een preparaat met zichtbaar licht om een versterkt beeld te verkrijgen [10](#page=10). #### 3.1.1 Belichting en beeldvorming Een homogene, heldere veldbelichting is cruciaal voor transmissielichtmicroscopie. De Köhler-verlichtingstechniek, ontwikkeld aan het eind van de negentiende eeuw, zorgt voor een uniforme belichting van het preparaat, zelfs met een kleine lamp. De lichtweg voor belichting en beeldvorming worden apart behandeld. Het gebruikte lichtspectrum is van belang; halogeenlampen zenden licht uit dat varieert in kleurintensiteit met de dimming. Te veel rood licht kan worden gereduceerd met filters om een correct beeld te verkrijgen [10](#page=10). #### 3.1.2 Het objectief Objectieven zijn verwisselbare lenzenstelsels met een kleine brandpuntsafstand die zich aan de revolver onderaan de tubus bevinden. De resolutie van een objectief wordt bepaald door de numerieke apertuur (NA), gedefinieerd als $NA = n \sin \alpha$, waarbij $n$ de brekingsindex van het medium is en $\alpha$ de halve openingshoek. Droge objectieven hebben een maximale NA van ongeveer 1, terwijl immersieobjectieven een NA tot 1,51 kunnen bereiken. De minimale afstand tussen twee scheidbare punten (resolutie) wordt gegeven door [11](#page=11): $$resolutie = \frac{0,61 \lambda}{NA}$$ [11](#page=11). De beste resolutie in lichtmicroscopie is ongeveer 0,22 µm met een immersieobjectief (NA 1,4) en groen licht (500 nm) [12](#page=12). Objectieven worden ingedeeld naar gebruik (droog, immersie, fase-contrast) en correctiegraad voor aberraties: * **Apoachromaten:** Sterk gecorrigeerd voor chromatische aberraties over alle kleuren. * **Achromaten:** Gecorrigeerd voor chromatische aberraties voor rood en blauw licht. * **Plan-objectieven:** Alle hedendaagse objectieven zijn aplanaten; de beste zijn Plan-apo objectieven [12](#page=12). Voor fluorescentiemicroscopie is de transmissie van UV-licht door het objectief belangrijk, aangeduid met "Neofluar", "Fluor", of "UV". Een tubuslengte van 160 mm of 170 mm minimaliseert het verlies van scherpstelling bij het wisselen van objectief. Een typische aanduiding op een objectief is "Ph3 Neofluar 40/0.85 Oil 160/0.17", wat staat voor fase-contrast, UV-transparant, 40x vergroting, NA 0,85 immersie, voor een tubuslengte van 160 mm en een coverslipdikte van 0,17 mm. Als "160/-" onderaan staat, is de coverslipdikte niet relevant [12](#page=12). #### 3.1.3 Condensor De condensor focust een uniforme lichtkegel op het preparaat. Een apochromatische lens wordt meestal gebruikt om aberraties te vermijden. Het diafragma van de condensor regelt de apertuur en moet worden aangepast aan de NA van het objectief; idealiter wordt 70-90% van het objectief belicht. Een te wijd open diafragma veroorzaakt strooilicht, terwijl een te klein diafragma resolutieverlies geeft [12](#page=12) [13](#page=13). Naast helderveld microscopie bestaat donkerveld microscopie, waarbij de achtergrond zwart is en alleen verstrooid licht wordt opgevangen door het object [13](#page=13). #### 3.1.4 Het oculair Het oculair vergroot het beeld gevormd door het objectief, meestal met een factor 10. Huygens-oculairs bestaan uit een veldlens en een ooglens met een diafragma. Meetplaatjes kunnen in het beeldvlak van het objectief worden geschoven voor metingen [13](#page=13). #### 3.1.5 Invert microscoop De invert microscoop is ontworpen voor observatie van celculturen in dikkere containers, waarbij de lichtbron en condensor zich boven het specimen bevinden en de objectieflens onder de recipiënt [14](#page=14). ### 3.2 Fase contrast microscopie Fase-contrast microscopie wordt gebruikt voor gedetailleerde observatie van levende cellen en andere ongekleurde transparante samples, gebaseerd op faseverschillen veroorzaakt door de brekingsindex van het specimen. Verschillen in brekingsindex tussen cel en medium leiden tot een faseverschuiving van de lichtgolf. Het principe berust op het creëren van een faseverschil van $\lambda/4$ tussen de directe en afgebogen lichtbundels, die na manipulatie met speciale glasplaten (faseplaat) resulteren in destructieve interferentie (een verschil van $\lambda/2$). Dit resulteert in een donker beeld tegen een homogene achtergrond, waarbij intensiteitsverschillen de structuur van het preparaat weergeven. Speciale fase-contrast objectieven met een faseplaat corrigeren dit verschil [14](#page=14) [15](#page=15). ### 3.3 Differentieel interferentie contrast (DIC) microscopie De Differentieel Interferentie Contrast (DIC) microscoop, ook wel Nomarski microscoop genoemd, gebruikt gepolariseerd licht en prisma's om het contrast in ongekleurde transparante samples te verbeteren. Twee orthogonale gepolariseerde lichtbundels worden parallel op het preparaat gefocusseerd, gescheiden door ongeveer 2 µm. Na het samensmelten van deze bundels tot dezelfde polarisatie ontstaat interferentie, afhankelijk van het optische weglengteverschil. DIC-microscopie produceert een rand-schaduw in plaats van de halo's die bij fase-contrast optreden en kan dikkere samples (>100 µm) beter afbeelden met een hogere resolutie [16](#page=16). ### 3.4 Fluorescentie microscopie Fluorescentie microscopie wordt gebruikt voor de detectie van specifieke moleculen in preparaten, vaak in immunohistochemie en in-situ hybridisatie. Fluorescerende stoffen absorberen licht bij een excitatie golflengte en zenden dit uit bij een langere emissie golflengte. Voor gevoelige detectie worden deze stoffen gebonden aan antilichamen of DNA-probes. Veelgebruikte fluorochromen zijn FITC (groene emissie), TRITC (rode emissie), DAPI (blauwe emissie, kernkleuring) en Propidium Iodide (rode emissie, kernkleuring) [17](#page=17). De lichtweg omvat een lichtbron (vaak een kwiklamp), een excitatiefilter dat selectief licht met de excitatie golflengte doorlaat, een dichroïsche spiegel die de excitatiegolflengte weerkaatst en de emissiegolflengte doorlaat, en een emissiefilter die de excitatiegolflengte blokkeert en de emissiegolflengte doorlaat. Het beeld toont de gefluoresceerde structuren tegen een donkere achtergrond [18](#page=18). > **Voorbeeld:** Een beeld van een delende longcel met blauwe DNA-kleuring, rode keratine en gele tubuline, waarbij chromosomen, keratine filamenten en microtubulinen zichtbaar zijn [19](#page=19). ### 3.5 Confocale microscopie Confocale microscopie wordt toegepast voor het verkrijgen van optische secties van dikkere weefsels (tot circa 100 µm) en voor driedimensionale reconstructies. Door de kleine scherptediepte van objectieven met een hoge NA en het gebruik van een laserbundel die het x-y vlak afscant, wordt licht van buiten het brandvlak onderdrukt door een confocale apertuur. De optica is vergelijkbaar met fluorescentiemicroscopie, maar met een laser als lichtbron en scanningspiegels voor de x-y scanning. De lichtcollectie gebeurt via een fotomultiplicator die het emissielicht omzet in een elektrische puls. Software genereert beelden op basis van de intensiteitssignalen, en door optische secties op verschillende dieptes te combineren, kunnen 3D-voorstellingen worden gemaakt [19](#page=19) [20](#page=20). > **Voorbeeld:** Vergelijking van een hippocampus sectie met gewone breedveld fluorescentie microscopie (a) en confocale microscopie (b), waarbij groene neurofilamenten en blauwe kernkleuring zichtbaar zijn [20](#page=20). ### 3.6 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie verlaagt het oplossend vermogen tot ongeveer 1 nm door gebruik te maken van de golfeigenschappen van elektronen. De golflengte van elektronen wordt gegeven door de de Broglie-relatie: $\lambda = \frac{h}{m_e v}$, waarbij $h$ de constante van Planck is en $m_e$ en $v$ de massa en snelheid van het elektron. Bij een versnellingspotentiaal van 60 kV is de golflengte ongeveer 0,005 nm. Magnetische spoelen dienen als lenzen voor elektronenbundels. Sferische aberraties en beeldveldvervorming beperken het scheidend vermogen van commerciële microscopen tot 1 nm [21](#page=21). #### 3.6.1 Transmissie Elektronenmicroscoop (TEM) De TEM vertoont structurele overeenkomsten met de lichtmicroscoop. De elektronenbron is een wolfraamdraad die door verhitting elektronen uitzendt, versneld door een potentiaalverschil (40-100 kV). Condensorlenzen concentreren de bundel op het preparaat. Contrast wordt verkregen door de verstrooiing van elektronen door het preparaat, dat meestal een 50 nm dunne coupe is op een koperen grid. Contraststoffen zoals osmiumtetroxide en uranylacetaat worden gebruikt om de verstrooiing te verhogen. De verstrooide elektronen worden uit de bundel verwijderd door een diffractiediafragma. Lenzen (objectief-, diffractie-, tussenlens) vormen een vergrote afbeelding die via projectorlenzen op een fluorescerend scherm wordt geprojecteerd. Het beeld wordt voornamelijk gevormd door delen met een hoge concentratie contraststoffen als donkere structuren op een heldere achtergrond. De vergroting is continu regelbaar van circa 1000x tot 500.000x. Fotografie is essentieel voor het verkrijgen van definitieve resultaten [22](#page=22) [23](#page=23). > **Voorbeeld:** Elektronenmicrografie van een lymfocyt in verschillende stadia van apoptose en necrotische lymfocyten, waarbij de kernmorfologie bij apoptose duidelijk te zien is [24](#page=24). #### 3.6.2 Scanning Elektronenmicroscoop (SEM) De SEM scant het preparaat punt voor punt met een elektronenbundel en detecteert secundaire en/of gereflecteerde primaire elektronen (#page=24, 25). De bundel wordt gefocusseerd tot een spot van ongeveer 10 nm op het preparaat. Een synchroon aftastend scherm op een kathodestraalbuis vormt het beeld van het oppervlak. Het beeld heeft een driedimensionaal uitzicht doordat de intensiteit van secundaire elektronen afhankelijk is van de hoek van de bundel met het oppervlak. De SEM heeft een oplossend vermogen van ongeveer 10 nm en een effectieve vergroting tot 20.000x, voornamelijk gebruikt voor de studie van cellen en weefsels als geheel. Biologische monsters moeten elektrisch geleidend worden gemaakt, meestal door een dun laagje goud of platina aan te brengen [24](#page=24) [25](#page=25). ### 3.7 Scanning probe microscopie (SPM) Scanning probe microscopie (SPM) gebruikt een mechanische probe om beelden te vormen, wat de studie van dynamische processen en de toevoeging van biologische moleculen mogelijk maakt. Details tot op fracties van 10⁻¹⁰ meter kunnen in driedimensionale beelden worden onderscheiden. SPM's bestaan uit een probe (met een scherpe tip), piëzo-elektrische keramieken voor precieze positionering, elektronica en een computer voor beeldopbouw [26](#page=26). #### 3.7.1 Scanning Tunnel Microscopie (STM) Bij STM wordt een tip dicht bij het oppervlak gebracht. Een aangelegde spanning creëert een kwantummechanische tunnelstroom, die exponentieel afhankelijk is van de afstand tussen tip en oppervlak. Door een elektronisch systeem constant te houden, wordt de hoogte van de tip gereguleerd, wat resulteert in een reliëfbeeld van het oppervlak. STM vereist echter geleidende oppervlakken [26](#page=26) [27](#page=27). #### 3.7.2 Atomic Force Microscopie (AFM) De Atomic Force Microscoop (AFM) is ontwikkeld om niet-geleidende oppervlakken af te beelden, wat essentieel is voor biologische monsters. Een fijne punt, verbonden met een krachtsensor, tast het oppervlak af. Interatomaire krachten tussen de tip en het oppervlak worden waargenomen. De krachtsensor volgt de wet van Hooke ($F = -kz$), waarbij $k$ de krachtconstante is en $z$ de uitwijking. Uitwijkingen tot 0,1 nm kunnen worden gedetecteerd en in functie van het gescande oppervlak worden uitgezet, wat leidt tot een driedimensionaal reliëfbeeld. SPM is een niet-invasieve methode voor het nauwkeurig in kaart brengen van uitwendige kenmerken van biologische structuren [27](#page=27). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Diffractie | Het fenomeen waarbij golven zich om obstakels heen verspreiden en zich daardoor niet meer rechtlijnig voortplanten, wat resulteert in een patroon van heldere en donkere gebieden bij de verstoring van de golf. | | Interferentie | Het verschijnsel dat optreedt wanneer twee of meer golven elkaar ontmoeten, wat leidt tot een wederzijdse versterking (constructieve interferentie) of uitdoving (destructieve interferentie) van de golven. | | Huygens principe | Een principe dat stelt dat elk punt op een golffront fungeert als een nieuwe bron van cirkelvormige secundaire golven; het golffront op een later tijdstip wordt gevormd door de omhullende van deze secundaire golven. | | Constructieve interferentie | Treedt op wanneer twee golven in fase zijn, wat resulteert in een grotere amplitude van de gecombineerde golf, met name wanneer de golffronten elkaar versterken. | | Destructieve interferentie | Treedt op wanneer twee golven in tegenfase zijn, wat resulteert in een kleinere of nul amplitude van de gecombineerde golf, aangezien de golffronten elkaar uitdoven. | | Golflengte | De ruimtelijke afstand tussen twee opeenvolgende overeenkomstige punten van een golf, zoals twee toppen of twee dalen, aangeduid met de Griekse letter lambda ($\lambda$). | | Onderscheidend vermogen | Het vermogen van een optisch instrument om twee dicht bij elkaar gelegen punten als afzonderlijke entiteiten waar te nemen, wat direct gerelateerd is aan de golflengte van het gebruikte licht en de diameter van de opening. | | Criterium van Rayleigh | Een criterium dat stelt dat twee puntvormige objecten nog net van elkaar onderscheiden kunnen worden wanneer het centrale maximum van het diffractiepatroon van het ene object samenvalt met het eerste minimum van het diffractiepatroon van het andere object. | | Aberratie | Een fout of afwijking in de optische prestaties van een lens of een systeem van lenzen, die leidt tot vervormingen in het beeld, zoals sferische aberratie of chromatische aberratie. | | Sferische aberratie | Een lensfout waarbij lichtstralen die niet door het optische centrum van de lens gaan, anders worden gefocusseerd dan de stralen die dicht bij de as vallen, wat leidt tot een onscherp beeld. | | Chromatische aberratie | Een lensfout veroorzaakt door het feit dat de brekingsindex van glas varieert met de golflengte van licht, waardoor verschillende kleuren licht op verschillende brandpunten worden gefocusseerd. | | Beeldvlakkromming | Een lensfout waarbij een object dat in een plat vlak ligt, wordt afgebeeld in een gekromd vlak in plaats van in een plat beeld, wat leidt tot onscherpte aan de randen van het beeld. | | Numerieke apertuur (NA) | Een maat voor het lichtverzamelend vermogen van een objectief en de resolutie die het kan bereiken, gedefinieerd als het product van de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het preparaat en de sinus van de halve openingshoek. | | Resolutie | De kleinst mogelijke afstand tussen twee objecten die nog als afzonderlijk kunnen worden waargenomen; in de microscopie is dit vaak gerelateerd aan de golflengte van het licht en de numerieke apertuur. | | Fasecontrast microscopie | Een techniek die gebruikmaakt van faseverschillen in lichtgolven die door transparante objecten gaan om contrast te creëren in ongekleurde monsters, wat leidt tot zichtbare structuren met verschillende helderheidsgraden. | | Differentieel interferentie contrast (DIC) microscoop | Een microscopische techniek die gepolariseerd licht gebruikt en kleine verschillen in optische weglengte binnen een preparaat omzet in zichtbaar contrast, wat resulteert in een reliëfachtig beeld zonder de halo-effecten van fasecontrast. | | Fluorescentiemicroscopie | Een techniek waarbij specifieke moleculen in een monster worden geëtiketteerd met fluorochromen die licht absorberen bij een bepaalde golflengte en uitzenden bij een langere golflengte, waardoor deze structuren oplichten tegen een donkere achtergrond. | | Confocale microscopie | Een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die optische secties van een monster neemt door gebruik te maken van een puntvormige lichtbron en een puntvormige detector, wat resulteert in beelden met een hoge resolutie en de mogelijkheid tot driedimensionale reconstructie. | | Elektronenmicroscopie | Een type microscoop dat elektronen gebruikt in plaats van licht om beelden te creëren, wat een aanzienlijk hogere resolutie en vergroting mogelijk maakt dan bij lichtmicroscopie, dankzij het kortere golflengtekarakter van elektronen. | | Scanning probe microscoop (SPM) | Een microscoop die een fysieke probe gebruikt om een oppervlak af te tasten en gedetailleerde driedimensionale beelden te creëren, met toepassingen variërend van atomaire schaal tot het bestuderen van dynamische biologische processen. | | Scanning tunnel microscoop (STM) | Een type scanning probe microscoop dat gebruikmaakt van kwantummechanische tunnelstroom tussen een scherpe tip en een geleidend oppervlak om de topografie op atomair niveau in kaart te brengen. | | Atomic force microscoop (AFM) | Een type scanning probe microscoop dat de interatomaire krachten tussen een scherpe tip en een oppervlak meet om driedimensionale beelden te genereren, ook van niet-geleidende materialen. |