Instrumentele chemie - Scheidingstechnieken 24.pdf

# Inleidende begrippen en karakteristieken van analysemethoden Dit hoofdstuk introduceert de fundamentele concepten en classificatie van analytische methoden, inclusief hun essentiële kenmerken en kalibratiestrategieën. ## 1. Inleiding tot analytische methoden Chemische analyses, cruciaal in diverse wetenschappelijke en industriële sectoren, hebben tot doel de aanwezigheid en concentratie van specifieke componenten (analyten) in een materiaal te achterhalen. Het ontwikkelen en valideren van een geschikte analysemethode is hierbij een essentiële stap, waarbij factoren als monstergrootte, samenstelling, vereiste nauwkeurigheid en snelheid een rol spelen [5](#page=5). ## 2. Indeling van analysemethoden Analytische methoden worden primair ingedeeld in klassieke (natte chemie) en instrumentele methoden [5](#page=5). ### 2.1 Klassieke analytische methoden Deze methoden maken gebruik van scheidingsprocessen zoals neerslag, extractie of destillatie, gevolgd door kwalitatieve identificatie op basis van eigenschappen zoals kleur, smeltpunt of oplosbaarheid. Kwantitatieve bepalingen worden uitgevoerd middels gravimetrie of titrimetrie [5](#page=5). ### 2.2 Instrumentele analytische methoden Instrumentele methoden meten specifieke fysische of chemische eigenschappen van componenten, zoals de absorptie of emissie van licht (spectroscopie), geleidbaarheid of elektrodepotentiaal (elektrochemie), massa-ladingverhouding (massaspectrometrie) of reactiesnelheid (kinetische methoden). Daarnaast worden efficiënte scheidingsmethoden zoals chromatografie en elektroforese ingezet om componenten in mengsels te isoleren alvorens ze te kwantificeren [5](#page=5). De keuze van een specifieke analysemethode is afhankelijk van: * **Aard en kwaliteit van de vereiste informatie**: Welke componenten moeten bepaald worden, kwalitatief of kwantitatief, en met welke nauwkeurigheid en precisie [6](#page=6). * **Randvoorwaarden**: Concentratiegebied (hoofd-, neven- of sporenelementen), aantal monsters (snelheid), en economische aspecten zoals kostprijs per monster en apparatuur [6](#page=6). ## 3. Verloop van een analyse Een typische analyse doorloopt de volgende stadia [6](#page=6): 1. **Keuze van de methode**: Selectie van de meest geschikte methode voor het analytische probleem. 2. **Monstername**: Afzonderen van een representatieve fractie van het te onderzoeken materiaal. 3. **Voorbereiding**: Homogeniseren van het monster en verwijderen van niet-relevante materialen. 4. **Opzuiveringen**: Scheiden van het te meten bestanddeel van interfererende stoffen, eventueel gevolgd door derivatisatie. 5. **Meting**: Het daadwerkelijk meten van het analytische signaal. 6. **Evaluatie van het resultaat**: Statistische of andere methodes om de betrouwbaarheid van de resultaten te beoordelen. ## 4. Karakteristieken van een methode De betrouwbaarheid van een analysemethode wordt beoordeeld aan de hand van diverse kenmerken [6](#page=6). ### 4.1 Precisie Precisie is de mate van spreiding in meetresultaten verkregen bij herhaalde metingen op hetzelfde monster. Het weerspiegelt de invloed van toevallige (random) fouten [7](#page=7) [8](#page=8). * **Herhaalbaarheid**: Metingen onder identieke omstandigheden (dezelfde analist, apparatuur, korte tijdsduur) [7](#page=7). * **Reproduceerbaarheid**: Metingen onder variabele omstandigheden (verschillende dagen, reagentia, laboratoria) [7](#page=7). Precisie wordt uitgedrukt als de **standaarddeviatie (s)**: $$ s = \sqrt{\frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}{n-1}} $$ waarbij $x_i$ individuele meetwaarden zijn en $\bar{x}$ het gemiddelde [7](#page=7). De **relatieve standaarddeviatie (RSD)** geeft de precisie in verhouding tot het gemiddelde aan: $$ \text{RSD} = \frac{s}{\bar{x}} \times 100\% $$ Voorbeeld: Een RSD van 5,63% betekent dat de standaarddeviatie 5,63% van de gemiddelde waarde bedraagt. Algemeen worden resultaten binnen 5% als aanvaardbaar beschouwd, afhankelijk van de methode [8](#page=8). > **Tip**: Resultaten worden vaak weergegeven als gemiddelde $\pm$ s. Bij een normale verdeling ligt 68% van de resultaten binnen $\bar{x} \pm s$ en 99,7% binnen $\bar{x} \pm 3s$ [8](#page=8). ### 4.2 Juistheid (Accuracy) Juistheid is de mate van overeenstemming tussen het gemiddelde van de metingen ($\xi$) en de werkelijke waarde ($\mu_0$). Het verschil hiertussen wordt de **bias** genoemd [8](#page=8): $$ \text{bias} = |\xi - \mu_0| $$ Juistheid wordt bepaald met gecertificeerde referentiematerialen of door middel van **spiking**: het toevoegen van een bekende hoeveelheid analyt aan een blanco monster met dezelfde matrix. Het **recovery** (terugvindingspercentage) wordt dan berekend [8](#page=8): $$ \text{recovery} = \frac{\text{gemeten hoeveelheid analyt}}{\text{toegevoegde hoeveelheid analyt}} \times 100\% $$ Indien een blanco met dezelfde matrix niet beschikbaar is, wordt de standaardadditie methode toegepast. Juistheid wordt beïnvloed door systematische fouten, die constant of proportioneel kunnen zijn [9](#page=9). ### 4.3 Gevoeligheid en Detectielimiet * **Gevoeligheid**: De mate waarin een methode kleine veranderingen in de analytconcentratie betrouwbaar kan meten. Dit wordt weerspiegeld door de helling van de ijklijn. Een gevoelige methode heeft een kalibratiecurve met een grote richtingscoëfficiënt [9](#page=9). * **Detectielimiet (LOD)**: De kleinste concentratie die met de methode aangetoond kan worden, waarbij het signaal nog onderscheidbaar is van de achtergrondruis. Het wordt berekend als [10](#page=10): $$ y_{\text{LOD}} = y_{\text{BLK}} + 3 s_{\text{BLK}} $$ Hierbij wordt $y_{\text{LOD}}$ ingevuld in de ijklijnvergelijking ($y = ax + b$) om de concentratie ($x_{\text{LOD}}$) te bepalen [10](#page=10). * **Kwantificatielimiet (LOQ)**: De laagste concentratie waarbij een kwantitatieve bepaling betrouwbaar mogelijk is. Het signaal moet hierbij minimaal gelijk zijn aan de blanco plus tien maal de standaarddeviatie van de blanco [10](#page=10). ### 4.4 Selectiviteit (Specificiteit) Selectiviteit geeft aan in hoeverre een analyt bepaald kan worden zonder interferentie van andere componenten in het monster. Een volledig specifieke methode is eerder uitzonderlijk; vaak zijn er stappen nodig om interferenties te minimaliseren [10](#page=10). ### 4.5 Robuustheid Robuustheid is de ongevoeligheid van een methode voor kleine variaties in omstandigheden zoals temperatuur, reagentia, pH, analysewachttijd of de analist. Een robuuste methode levert consistente resultaten bij kleine wijzigingen in deze parameters [10](#page=10). ### 4.6 Lineariteit en Dynamisch Bereik * **Lineariteit**: Het bestaan van een lineair verband tussen het analytische signaal en de concentratie van de analyt binnen een bepaald bereik. Dit verband wordt vaak weergegeven door de vergelijking van een rechte lijn [11](#page=11): $$ y = a \cdot x + b $$ waarbij $a$ de helling en $b$ het snijpunt met de y-as is, bepaald met de kleinste kwadratenmethode [11](#page=11). * **Dynamisch Bereik**: Het meetgebied tussen de kwantificatielimiet (LOQ) en de concentratie waarbij de kalibratiecurve begint af te wijken van lineariteit (limit of linearity, LOL) [11](#page=11). De **correlatiecoëfficiënt (r)** kwantificeert hoe goed de gemeten punten op een rechte lijn liggen, met waarden dicht bij 1 die duiden op een sterke lineaire relatie [12](#page=12). $$ r = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sqrt{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2 \sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}} $$ Voor nauwkeurig analytisch werk is doorgaans een correlatiecoëfficiënt van $r > 0.997$ vereist [12](#page=12). ## 5. Kalibratiemethoden Kalibratie stelt het verband vast tussen het analytische signaal en de analytconcentratie, meestal met behulp van standaarden. Een blanco meting wordt gebruikt om het signaal te corrigeren [13](#page=13). ### 5.1 Externe standaardmethode Bij deze methode worden standaarden met bekende concentraties onafhankelijk van het monster gemeten, waarna een ijklijn wordt opgesteld. De concentratie van de analyt in het monster wordt berekend door de gemeten waarde van het monster in de ijklijn in te vullen. Deze methode veronderstelt gelijke matrixeffecten tussen standaard en monster [13](#page=13). ### 5.2 Standaardadditiemethode Deze methode wordt toegepast wanneer matrixeffecten verwacht of aanwezig zijn. Hierbij worden standaardoplossingen direct aan het monster toegevoegd (spiking). Meerdere porties van het monster worden genomen, waarbij aan elk een toenemende hoeveelheid standaard wordt toegevoegd, en één portie blijft ongemoeid. De concentratie wordt bepaald uit het snijpunt van de geplotte meetwaarden met de x-as [13](#page=13). ### 5.3 Interne standaardmethode Een interne standaard (met vergelijkbare chemische eigenschappen als de analyt, maar afzonderlijk meetbaar) wordt toegevoegd aan zowel standaarden als monsters. Dit compenseert voor variaties in de meting, zoals verschillen in extractieopbrengst of injectievolume. De verhouding van het signaal van de analyt tot het signaal van de interne standaard wordt uitgezet tegen de concentratie [14](#page=14) [15](#page=15). ## 6. Concentratie uitdrukkingen in oplossing De hoeveelheid opgeloste stof kan op verschillende manieren worden uitgedrukt [15](#page=15). ### 6.1 Molaire concentratie (c) De hoeveelheid opgeloste stof uitgedrukt als aantal mol per liter oplossing [15](#page=15). $$ c = \frac{n}{V} $$ waarbij $n$ het aantal mol is ($n = \frac{m}{M}$ met $m$ de massa en $M$ de molaire massa) [15](#page=15). ### 6.2 Massaconcentratie ($m_c$) De hoeveelheid opgeloste stof uitgedrukt als massa per volume-eenheid, meestal in gram per liter (g/L) of milligram per liter (mg/L) [16](#page=16). $$ m_c = \frac{m}{V} $$ ### 6.3 Fractionele concentraties Deze geven het deel opgeloste stof in het totale mengsel weer. Ze kunnen uitgedrukt worden als [16](#page=16): * **Massafractie (m/m)**: Massa opgeloste stof / massa mengsel. * **Volumefractie (V/V)**: Volume opgeloste stof / volume mengsel. * **Massa/volume fractie (m/V)**: Massa opgeloste stof / volume mengsel. Deze fracties kunnen verder gespecificeerd worden met eenheden zoals procent (%), promille (‰), parts per million (ppm, $10^{-6}$), of parts per billion (ppb, $10^{-9}$) [16](#page=16). Voor verdunde waterige oplossingen geldt: * 1 ppm $\approx$ 1 mg/L [16](#page=16). * 1 ppb $\approx$ 1 µg/L [16](#page=16). --- # Chromatografische scheidingsmethoden Chromatografie is een verzameling technieken gebaseerd op de verdeling van componenten van een mengsel tussen een stationaire en een mobiele fase, met als doel identificatie en kwantificatie [20](#page=20). ### 2.1 Principe van chromatografie Elk chromatografisch systeem bestaat uit een stationaire fase (vast of vloeibaar) en een mobiele fase (vloeistof of gas) die erlangs stroomt. Wanneer een mengsel op de stationaire fase wordt aangebracht, worden de componenten meegevoerd door de mobiele fase. De snelheid waarmee elke stof migreert, is afhankelijk van de interactie met zowel de stationaire als de mobiele fase. Stoffen die sterker aan de stationaire fase hechten, migreren langzamer. Aan het einde van de kolom wordt een detector geplaatst die een signaal produceert dat, uitgezet tegen de tijd, resulteert in een chromatogram [20](#page=20) [21](#page=21). ### 2.2 Algemene termen in chromatografie * **Mobiele fase:** Vloeistof of gas dat door het systeem stroomt [21](#page=21). * **Stationaire fase:** Vast materiaal of vloeistof geïmmobiliseerd op een drager [21](#page=21). * **Ontwikkeling:** Proces waarbij componenten met de mobiele fase door de stationaire fase stromen [21](#page=21). * **Visualisatie of detectie:** Bepaling van gescheiden componenten na de scheiding [21](#page=21). * **Elutie:** Proces waarbij de stof van de stationaire fase wordt gewassen [21](#page=21). * **Eluens:** De mobiele fase [21](#page=21). * **Eluaat:** Oplossing die de kolom verlaat [21](#page=21). * **Retentie:** Het weerhouden of vertragen van een stof op de stationaire fase [21](#page=21). * **Retentietijd:** De tijd die een stof nodig heeft om te elueren [21](#page=21). * **Chromatogram:** Grafische weergave van de scheiding [21](#page=21). ### 2.3 Indeling van chromatografische technieken Chromatografische technieken kunnen worden ingedeeld op basis van de mobiele fase (vloeistof- of gaschromatografie) of het scheidingsmechanisme (adsorptie-, partitie-, ionenuitwisselings-, exclusie- en affiniteitschromatografie) (#page=21, 22, 23) [21](#page=21) [22](#page=22) [23](#page=23). * **Vloeistofchromatografie:** Gebruikt een vloeistof als mobiele fase, geschikt voor stoffen met een hoog kookpunt of thermische instabiliteit [21](#page=21). * **Gaschromatografie:** Gebruikt een gas als mobiele fase, geschikt voor vluchtige stoffen [21](#page=21). * **Planaire chromatografie:** De stationaire fase is een vlakke laag, in tegenstelling tot kolomchromatografie [22](#page=22). * **Adsorptiechromatografie:** Scheiding gebaseerd op adsorptie van moleculen aan een vaste stationaire fase door intermoleculaire krachten. Voorbeelden van stationaire fasen zijn silicagel en aluminiumoxide [22](#page=22). * **Partitiechromatografie:** Scheiding gebaseerd op de verdeling van componenten tussen de mobiele en een vloeibare stationaire fase [22](#page=22). * **Ionenuitwisselingschromatografie:** Scheiding gebaseerd op de interactie met ioniseerbare groepen op de stationaire fase, essentieel voor het scheiden van ionen [23](#page=23). * **Exclusiechromatografie:** Scheiding gebaseerd op moleculaire grootte en/of vorm. 'Size exclusion' chromatografie is een bekend voorbeeld [23](#page=23). * **Affiniteitschromatografie:** Scheiding gebaseerd op de specifieke biologische affiniteit van een analyt voor een ligand [23](#page=23). ### 2.4 Papierchromatografie Papierchromatografie is een eenvoudige techniek waarbij filtreerpapier, met cellulosevezels die water vasthouden, als stationaire fase dient. Het eluens is een vloeistof die slecht mengbaar is met water, waardoor het een vloeistof-vloeistofchromatografie is. Scheiding vindt plaats door verdeling tussen het water in het papier en het eluens. Deze techniek wordt voornamelijk voor kwalitatieve analyse gebruikt en is grotendeels vervangen door dunnelaagchromatografie [23](#page=23) [24](#page=24). ### 2.5 Dunnelaagchromatografie (TLC) Dunnelaagchromatografie (TLC) is vergelijkbaar met papierchromatografie, maar gebruikt een dunne laag adsorberende stof (vaak silicagel) op een plaat als stationaire fase [24](#page=24). #### 2.5.1 Principe Na het aanbrengen van het monster (spotten) op de plaat, migreert de mobiele fase (solvent, eluens) door capillaire krachten over de plaat, wat leidt tot scheiding van de componenten. Componenten die sterker interageren met de stationaire fase, migreren langzamer. Na ontwikkeling wordt de plaat gedroogd en geëvalueerd. High-performance dunnelaagchromatografie (HPTLC) maakt gebruik van kleinere, uniformere deeltjes voor hogere efficiëntie en lagere detectielimieten (#page=24, 25) [24](#page=24) [25](#page=25). #### 2.5.2 Spotten - opbrengen van het staal Monsters en standaarden worden als spot of band op de plaat aangebracht, op dezelfde hoogte en zonder de dunne laag te beschadigen. Kleine spots/banden worden verkregen door een vluchtig oplosmiddel te gebruiken en eventueel tussen het aanbrengen van kleine volumes door te drogen. Spotten kan manueel (capillair, micropipet) voor kwalitatieve/semi-kwantitatieve analyses, of geautomatiseerd voor kwantitatieve bepalingen [25](#page=25). #### 2.5.3 Basiscomponenten van het chromatografisch systeem * **Stationaire fasen:** * **Adsorbentia (vaste stationaire fasen):** Silicagel (SiO₂) is een veelgebruikt polair adsorbens met zure eigenschappen door SiOH groepen. Het vochtgehalte beïnvloedt de activiteit; verwarming kan de activiteit verhogen. Silicagel wordt gecombineerd met een minder polaire mobiele fase (normale fase, NP-chromatografie) [26](#page=26). * **Chemisch gebonden stationaire fasen:** Apolariteit wordt verkregen door fenyl-, C8- of C18-koolwaterstoffen aan het silica te binden. Deze worden gecombineerd met een meer polaire mobiele fase (omgekeerde fase chromatografie) [26](#page=26). * **HPTLC:** Maakt gebruik van kleinere (< 5 µm) en uniformere deeltjes, resulterend in smallere banden, snellere analyses en lagere detectielimieten [27](#page=27). * **De mobiele fase:** De keuze van de mobiele fase is cruciaal en kan gemakkelijk worden aangepast. De mobiele fase moet de componenten transporteren, zelf vluchtig zijn voor detectie, en de componenten kunnen scheiden. Vaak wordt een mengsel van solventen gebruikt om de gewenste polariteit te bereiken [27](#page=27). * **De ontwikkelkamer:** Een afgesloten kamer waarin de mobiele fase wordt geplaatst, waardoor een verzadigde atmosfeer ontstaat die verdamping van het eluens vanaf de plaat voorkomt. De plaat wordt zo geplaatst dat de spots boven het solventniveau blijven [27](#page=27) [28](#page=28). #### 2.5.4 Detectie * **Kwalitatief:** Gekleurde componenten zijn zichtbaar met het blote oog. Kleurloze componenten kunnen zichtbaar worden gemaakt met UV-licht (voor UV-absorberende stoffen) of door chemische reacties (sproei- of dip-techniek). De identificatie gebeurt aan de hand van de Rf-waarde (retentiefactor), de verhouding van de afgelegde afstand van de component tot die van de loopvloeistof (liggend tussen 0 en 1) [28](#page=28). $$R_f = \frac{\text{afstand afgelegd door de component}}{\text{afstand afgelegd door de loopvloeistof}}$$ * **Kwantitatief:** Een reeks standaardoplossingen met bekende concentratie en een onbekend staal worden gebruikt. De vlekken worden gescand met een densitometer (densitogram). De oppervlakte onder de pieken wordt uitgezet tegen de concentratie van de standaarden om de concentratie van het onbekende af te leiden [29](#page=29) [30](#page=30). #### 2.5.5 Voor- en nadelen van dunnelaagchromatografie Voordelen zijn snelle analyses, gelijktijdige analyse van meerdere stalen en laag solventverbruik. Met HPTLC worden goede precisie, juistheid en gevoeligheid bereikt, hoewel lager dan bij HPLC. Het aantal te scheiden componenten per analyse is echter kleiner [31](#page=31). ### 2.6 Chromatografische begrippen Voor analytische doeleinden zijn gaschromatografie (GC) en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) de meest toegepaste technieken [32](#page=32). #### 2.6.1 De verdelingscoëfficiënt De verdelingscoëfficiënt ($K_D$) beschrijft de verdeling van een opgeloste stof tussen de mobiele en stationaire fase. Het is de verhouding van de concentratie van de stof in de stationaire fase tot de concentratie in de mobiele fase [32](#page=32). $$K_D = \frac{C_s}{C_m}$$ Een groter verschil in $K_D$ tussen componenten leidt tot een groter verschil in migratiesnelheid en dus tot een betere scheiding [32](#page=32). #### 2.6.2 De retentietijd De retentietijd ($t_R$) is de tijd die een component nodig heeft om de kolom te doorlopen. Deze bestaat uit de dode tijd ($t_m$), de tijd die een stof doorbrengt in de mobiele fase, en de tijd die de stof doorbrengt in de stationaire fase ($t'_R$) [33](#page=33). $$t_R = t'_R + t_m$$ De dode tijd is de tijd die een niet-vastgehouden component nodig heeft om de kolom te passeren [33](#page=33). #### 2.6.3 Resolutie Resolutie is een kwantitatieve maat voor de scheiding van twee pieken, gebaseerd op het verschil in retentietijd en de piekbreedte (#page=33, 34) [33](#page=33) [34](#page=34). $$R_s = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{w_1 + w_2}$$ waar $t_{R1}$ en $t_{R2}$ de retentietijden zijn, en $w_1$ en $w_2$ de piekbreedtes op de basislijn zijn. Resolutie wordt beïnvloed door de retentiefactor, selectiviteit en efficiëntie van de kolom [34](#page=34). #### 2.6.4 Retentiefactor (of capaciteitsfactor) De retentiefactor ($k$) geeft aan hoe sterk een analyt wordt weerhouden op de kolom. Het is de verhouding van het aantal moleculen in de stationaire fase tot het aantal moleculen in de mobiele fase [35](#page=35). $$k = \frac{n_s}{n_m}$$ Het kan ook berekend worden uit het chromatogram als de verhouding van de gecorrigeerde retentietijd tot de dode tijd [35](#page=35). $$k = \frac{t'_R}{t_m} = \frac{t_R - t_m}{t_m}$$ De retentiefactor is dimensieloos en onafhankelijk van kolomlengte en flowsnelheid, wat het een betere parameter maakt voor vergelijking tussen systemen. Ideale waarden liggen tussen 2 en 10 [35](#page=35). #### 2.6.5 Selectiviteit Selectiviteit ($\alpha$), of relatieve retentie, is de verhouding van de gecorrigeerde retentietijden van twee verbindingen en geeft de afstand tussen piekmaxima weer [35](#page=35). $$\alpha = \frac{t'_{R2}}{t'_{R1}} = \frac{K_{D2}}{K_{D1}}$$ Een hogere $\alpha$ (>1) betekent een betere scheiding van de pieken. Selectiviteit kan worden beïnvloed door de samenstelling van de mobiele en stationaire fase, en de temperatuur [35](#page=35) [36](#page=36). #### 2.6.6 Bandverbreding - piekverbreding Bandverbreding is het fenomeen dat de componenten de kolom verlaten als bredere banden, wat resulteert in bredere pieken in het chromatogram. Dit kan worden veroorzaakt door [36](#page=36): * **Eddy-diffusie:** Verschillende afstanden die deeltjes afleggen in de kolom [36](#page=36). * **Longitudinale diffusie:** Verplaatsing van moleculen van hoge naar lage concentratie ten gevolge van willekeurige beweging. Dit is vooral significant in gassen door de grotere moleculaire afstanden [37](#page=37). * **Massatransfer:** Het proces van overgang tussen mobiele en stationaire fase, dat tijd nodig heeft voor het instellen van het evenwicht. Een hogere stroomsnelheid van de mobiele fase kan leiden tot minder tijd voor evenwicht en bredere pieken [37](#page=37). De mate van bandverbreding bepaalt de chromatografische efficiëntie, uitgedrukt als het aantal theoretische platen (N) [37](#page=37). $$N = 16 \left( \frac{t_R}{w} \right)^2$$ waar $t_R$ de retentietijd en $w$ de piekbreedte op de basislijn is. De plaathoogte (HETP - Height Equivalent of a Theoretical Plate) is een betere maatstaf voor het scheidend vermogen, waarbij een lagere HETP duidt op een hogere efficiëntie [37](#page=37) [38](#page=38). $$HETP = \frac{L}{N}$$ waar $L$ de lengte van de kolom is [38](#page=38). ### 2.7 Gaschromatografie (GC) Gaschromatografie (GC) scheidt componenten die in dampvorm gebracht kunnen worden. De meest courante vorm is gas-vloeistofchromatografie (GLC), waarbij de stationaire fase een vloeibare film is op een drager, en de mobiele fase een inert gas [38](#page=38). #### 2.7.1 Principe Het monster wordt geïnjecteerd in dampvorm en meegenomen door de mobiele gasfase door een kolom in een oven. Componenten verplaatsen zich met verschillende snelheden afhankelijk van hun vluchtigheid en interactie met de stationaire fase. De scheiding is gebaseerd op zowel vluchtigheid als oplosbaarheid in de stationaire fase. Gescheiden componenten worden gedetecteerd en omgezet in een chromatogram. GC biedt voordelen zoals snelle analyses, hoge resolutie en gevoeligheid (tot 1 ppm met FID) [38](#page=38) [39](#page=39). #### 2.7.2 Onderdelen van de gaschromatograaf * **Draaggas:** Een inert, zuiver gas (bv. helium, stikstof) dat de mobiele fase vormt [39](#page=39). * **Injectiepoort:** Waar het monster in dampvorm wordt gebracht, zo smal mogelijk bandje [40](#page=40). * **Split/splitless injector:** Geschikt voor capillaire GC, kan in split of splitless mode werken. In split mode wordt een deel van het monster naar de kolom gestuurd, wat resulteert in een smal bandje. Splitless mode is voor monsters met lage concentraties, waarbij aanvankelijk een lage kolomtemperatuur wordt ingesteld voor reconcentratie [40](#page=40) [41](#page=41). * **PTV injector:** Programmed Temperature Vaporization injector, geschikt voor grotere volumes door snelle temperatuurwisselingen [41](#page=41). * **(Cool-)On-column injectie:** Monster wordt direct in de kolom geïnjecteerd bij lagere temperaturen [41](#page=41). * **Head space analyse:** Analyse van vluchtige stoffen in vaste of vloeibare monsters door de gasfase boven het monster te analyseren [42](#page=42). * **Kolom:** Kan een gepakte kolom (gevuld met stationaire fase) of een capillaire kolom (stationaire fase op de wand) zijn. Capillaire kolommen hebben een hoger scheidend vermogen maar lagere staalcapaciteit. De polariteit van de stationaire fase is belangrijk; polaire componenten scheiden best op een polaire fase, apolaire componenten op een apolaire fase [43](#page=43). * **Kolomoven:** Regelt de temperatuur van de kolom, kan isothermisch of met temperatuurprogrammering zijn. Temperatuurprogrammering versnelt de analyse van componenten met grote verschillen in kookpunt [45](#page=45). * **Detector:** Meet de gassamenstelling bij de uitlaat van de kolom. Veelgebruikte detectoren zijn FID (vlamionisatiedetector, gevoelig voor organische verbindingen) TCD (thermische geleidbaarheidsdetector, universeel) en ECD (elektron capture detector, gevoelig voor elektronegatieve groepen) [46](#page=46) [47](#page=47). #### 2.7.3 Kwantitatieve analyses * **Identificatie:** Gebaseerd op retentietijd door vergelijking met standaarden [47](#page=47). * **Kwantificatie:** Piekhoogte en piekoppervlakte zijn evenredig met de concentratie [48](#page=48). * **Externe standaard methode:** Vergelijking van piekoppervlakten/hoogten van standaarden en het onbekende monster [48](#page=48). * **Interne standaard methode:** Een interne standaard wordt toegevoegd aan alle monsters en standaarden om toestel- en procedurefouten te elimineren door de verhouding van piekoppervlakten te gebruiken [49](#page=49). ### 2.8 Vloeistofchromatografie Vloeistofchromatografie (LC) scheidt ionen of moleculen opgelost in een vloeistof. Indeling vindt plaats op basis van de stationaire fase: liquid-solid chromatography (LSC, bv. adsorptiechromatografie zoals TLC) en liquid-liquid chromatography (LLC, bv. partitiechromatografie zoals papierchromatografie). Ionenchromatografie (IC) scheidt ionen op basis van hun lading [50](#page=50). #### Hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) HPLC perst de mobiele fase onder hoge druk (tot 200 bar) door een gepakte kolom, wat resulteert in een snelle scheiding en een zeer goede resolutie [50](#page=50). #### 2.9 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) De HPLC-instrumentatie omvat vloeistofreservoirs, een ontgasser, een hogedrukpomp, een injector, de kolom en een detector. Alle onderdelen die in contact komen met de mobiele fase zijn gemaakt van corrosiebestendig materiaal zoals roestvrij staal of PEEK. Het minimaliseren van 'dood volume' is cruciaal voor efficiëntie [51](#page=51). * **Mobiele fase:** Speelt een belangrijke rol in het scheidingsproces en beïnvloedt de selectiviteit. De keuze is afhankelijk van de stationaire fase en de aard van de componenten. Gradiëntelutie (verandering van de samenstelling van de mobiele fase tijdens de analyse) wordt vaak gebruikt om alle componenten te elueren. De 'solventsterkte' geeft aan hoe goed een solvent de interactie kan verbreken en een analyt kan elueren [51](#page=51) [52](#page=52). * **Stationaire fase:** Meestal gebaseerd op silicadeeltjes met gebonden functionele groepen [52](#page=52). * **Normale fase (NP-HPLC):** Polaire stationaire fase en apolaire mobiele fase; gebruikt voor sterk hydrofobe componenten [52](#page=52). * **Omgekeerde fase (RP-HPLC):** Veruit de meest courante vorm. Apolaire stationaire fase (bv. silica met C8 of C18 ketens) en een polaire mobiele fase (bv. water met een modifier) (#page=52, 53) [52](#page=52) [53](#page=53). * **Injectiesysteem:** Gebruikt een injectieklep met een lus van bekend volume om het monster nauwkeurig op de kolom te brengen [53](#page=53). * **Kolom:** Meestal van roestvrij staal, met chemisch gebonden apolaire fasen (Si-R met R=C2, C8, of C18) voor reversed phase chromatografie, of met polaire stationaire fasen voor normal phase chromatografie (#page=53, 54) [53](#page=53) [54](#page=54). * **Leidingen (tubings) en fittings:** Kleine inwendige diameter (0.25 mm) om het extra-kolom volume te minimaliseren. Materialen zijn inert staal of PEEK, met elk hun voor- en nadelen qua reactiviteit en drukbestendigheid [54](#page=54). * **Pompen:** Meestal dubbele pistonpompen voor een gelijkmatige flow. Kunnen de samenstelling van de mobiele fase mengen (gradiënt elutie) [55](#page=55). * **Detectoren voor HPLC:** Meten continu een eigenschap van de vloeistof [56](#page=56). * **UV absorptie:** Detecteert verbindingen die UV-licht absorberen (180-350 nm) [56](#page=56). * **Fluorescentie:** Detecteert fluorescerende moleculen, zeer specifiek en gevoelig [56](#page=56). * **Conductometrie:** Meet de geleidbaarheid van de mobiele fase, nuttig bij ionuitwisselingschromatografie [56](#page=56). * **Massa spectrometrie (MS):** Scheidt en bepaalt ionen op basis van hun massa-ladingverhouding, gekoppeld aan HPLC voor uitgebreide analyse [56](#page=56). #### 2.9.8 Praktische elementen bij HPLC Gebruik zuivere, gefilterde en ontgaste solventen. Een guard kolom beschermt de analytische kolom. Vermijd extreme pH en puur water voor reversed phase kolommen. Silica kolommen vermijden hoge waterconcentraties en alkalische pH [57](#page=57). ### 2.10 Ionenuitwisselingschromatografie (IEC) IEC scheidt ionen door middel van een stationaire fase, een ionenwisselaar, die ioniseerbare groepen bevat. De stationaire fase kan een kation- of anionuitwisselaar zijn [57](#page=57) [58](#page=58). #### 2.10.1 Selectiviteit van ionenwisselaars De selectiviteitscoëfficiënt ($K_{A/B}$) beschrijft de affiniteit van een hars voor een bepaald ion ten opzichte van een ander. Factoren die de verdeling bepalen zijn de aard van de uitgewisselde ionen (lading, gehydrateerde grootte) en de concentratie van de ionen (#page=60, 61). Sterk zure kationuitwisselaars met sulfonzuurgroepen zijn stabiel over een breed pH-gebied. Zwak zure kationuitwisselaars (met COOH-groepen) zijn pH-afhankelijk. Anionenwisselaars zijn pH-gevoeliger. Harsen met meer kruisverbindingen zijn selectiever voor ionen met verschillende groottes door een dichtere poriestructuur [60](#page=60) [61](#page=61) [62](#page=62). #### 2.10.2 Capaciteit van de ionenwisselaar De totale capaciteit hangt af van het aantal ionactieve groepen per gewichtseenheid, uitgedrukt in millimol of milliequivalenten per gram. De effectieve capaciteit kan drastisch verminderd zijn voor ionen met grote afmetingen in harsen met veel kruisverbindingen [63](#page=63). #### 2.10.3 Mobiele fase De mobiele fase is meestal een waterige buffer. De pH en ionische sterkte bepalen de retentietijd. Bij gradiëntelutie worden de pH of ionische sterkte gewijzigd om de elutie te optimaliseren [63](#page=63). #### 2.10.4 Detector Meestal wordt de geleidbaarheid van de mobiele fase na elutie gemeten. Een ion-onderdrukkingskolom wordt vaak tussen de analytische kolom en de detector geplaatst om de mobiele fase-ionen te verwijderen en de achtergrondgeleidbaarheid te verminderen [64](#page=64). --- # Massaspectrometrie Massaspectrometrie is een analytische techniek die moleculen ioniseert, segregeert op basis van hun massa-tot-ladingverhouding en detecteert om hun identificatie en structuur te bepalen. ## 3. Massaspectrometrie Bij massaspectrometrie (MS) worden te analyseren moleculen geïoniseerd en gefragmenteerd. De gevormde ionen worden vervolgens gescheiden op basis van hun massa-tot-lading (m/z) verhouding. Na detectie levert dit een massaspectrum op, dat gebruikt kan worden voor de identificatie van de component en het achterhalen van zijn structuur [65](#page=65). ### 3.1 Principe van massaspectrometrie De ionisatie van moleculen (M) leidt tot de vorming van ionen (M$^+$). Meestal worden positieve ionen gevormd door het verwijderen van één elektron uit het molecuul [65](#page=65): $$M \quad \longrightarrow \quad M^{\cdot+} + e^-$$ [65](#page=65). Het ion M$^+$ wordt het moleculaire ion genoemd. De massa (m) en lading (z) van dit ion zijn belangrijk voor MS. De massaspectrometer meet de verhouding van massa tot lading (m/z). Als de lading $z=1$ is, dan is de m/z verhouding gelijk aan de massa van het ion. De massa van het ion is gerelateerd aan de massa van het oorspronkelijke molecuul [65](#page=65). De gevormde ionen zijn vaak instabiel en zullen deels dissociëren, wat in MS fragmentatie wordt genoemd. Het resultaat is een verzameling ionen. De relatieve hoeveelheid van elk ion wordt weergegeven in een massaspectrum, dat karakteristiek is voor een component [65](#page=65). **Voorbeeld van een massaspectrum:** Het massaspectrum van methanol is weergegeven in figuur 6.1. De belangrijkste ionen zijn [65](#page=65): * m/z 32: CH$_3$OH$^{\cdot+}$ (moleculair ion, 70%) [66](#page=66). * m/z 31: CH$_2$OH$^+$ (basispiek, 100%) [66](#page=66). * m/z 29: CHO$^+$ (60%) [66](#page=66). * m/z 15: CH$_3^+$ (20%) [66](#page=66). De piek met de hoogste massa (hier 32) kan afkomstig zijn van het moleculaire ion. De belangrijkste (grootste) piek, hier m/z 31, wordt de basispiek genoemd. Het is gebruikelijk om massaspectra te tekenen als staafdiagrammen met de basispiek op 100% [66](#page=66). ### 3.2 De massaspectrometer Een massaspectrometer bestaat uit verschillende componenten: een inlaatsysteem, een ionisatiebron, een massa-analysator en een detector [66](#page=66). * **Inlaatsysteem:** Hier wordt het monster via verdamping de massaspectrometer ingebracht [66](#page=66). * **Ionisatiebron:** Zet de moleculen om in ionen [66](#page=66). * **Massa-analysator:** Scheidt de ionen op basis van hun m/z verhouding [66](#page=66). * **Detector:** Registreert de ionen en de verkregen informatie [66](#page=66). Het gehele apparaat werkt onder vacuüm [66](#page=66). #### 3.2.1 Elektronenimpact (EI) ionisatie Bij de elektronenimpact (EI) ionisatiebron worden monster moleculen gebombardeerd met elektronen van hoge energie (meestal 70 eV). Deze elektronen worden gevormd door een verwarmde metaaldraad (filament). De elektronenbundel staat dwars op de monsterinlaat. Bij botsing met monstermoleculen dragen de elektronen kinetische energie over, wat leidt tot excitatie, fragmentatie en ionisatie [66](#page=66) [67](#page=67). De gevormde positieve ionen worden versneld in een elektrisch veld en komen in de massa-analysator. Hier worden ze afgebogen door een magnetisch veld, afhankelijk van hun m/z verhouding, snelheid en de sterkte van het magnetisch veld. Door variatie van het elektrische of magnetische veld, kunnen ionen met verschillende m/z verhoudingen de exit slit bereiken [67](#page=67). Na de exit slit worden de ionen gedetecteerd als een elektrische stroom, bijvoorbeeld door een elektronenmultiplier. De kromming van de ionenbaan kan worden gewijzigd door het magnetisch veld te veranderen of de snelheid van de ionen te beïnvloeden [67](#page=67). #### 3.2.2 Ionisatiesystemen Naast Elektronenimpact (EI) zijn er diverse andere ionisatiemethoden, waaronder chemische ionisatie, veld ionisatie en MALDI [67](#page=67). ##### Elektron Impact (EI) EI is de meest gebruikte ionisatiemethode in combinatie met GC-MS omdat het zowel moleculaire ionen als fragmentionen genereert. Echter, EI kan problemen opleveren, zoals spectra van isomeren die moeilijk te onderscheiden zijn, of te sterke fragmentatie die leidt tot weinig diagnostische ionen. In dergelijke gevallen zijn zachtere ionisatiemethoden zoals chemische ionisatie of MALDI geschikter [68](#page=68). ##### Chemische ionisatie (CI) CI is een zachtere ionisatiemethode die minder fragmentatie veroorzaakt, waardoor voornamelijk (pseudo-)moleculaire ionen worden gevormd. De ionisatie van de analyten verloopt via een serie stappen. Een reactiegas (bv. methaan, isobutaan, ammoniak) wordt in de bron geïntroduceerd en initieel geïoniseerd door EI. Deze primaire ionen reageren verder met reactiegasmoleculen tot secundaire ionen. Analyten reageren met deze secundaire ionen door protonoverdracht, elektrontrekking of associatiereacties [68](#page=68). ##### Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) APCI is een zachte en robuuste ionisatietechniek voor analyten van lage tot gemiddelde polariteit. De analyten moeten vluchtig en thermisch stabiel zijn. Het principe is vergelijkbaar met CI, maar de ionisatie vindt plaats onder atmosferische druk, wat leidt tot een hogere ionisatie-efficiëntie (tot 10000 maal groter dan in EI). Slechts een klein deel van de gevormde ionen bereikt echter de MS [68](#page=68). Bij APCI wordt het loopmiddel met de analyten verneveld met gas (meestal stikstof) en komt in een hete buis, waardoor de vloeistof verdampt en de analyten in gasfase komen. Een hoge spanning op een naald veroorzaakt een corona-ontlading, wat leidt tot reacties met het vernevelingsgas en solventmoleculen, die de analyten ioniseren [68](#page=68). ##### Electrospray Ionisation (ESI) ESI is een zeer zachte ionisatietechniek die bij atmosferische druk plaatsvindt en geschikt is voor polaire verbindingen, van lage tot zeer hoge moleculaire massa (bv. proteïnes). Ionen worden gevormd in de vloeistoffase en omgezet naar gasfase ionen [69](#page=69). De analyten komen opgelost de bron binnen via een metalen naald met hoge spanning (3-4 kV). Met een gasstroom wordt een aërosol van sterk geladen deeltjes gevormd. Verdamping verkleint de druppels, waardoor de ladingsdichtheid toeneemt. Op de Rayleigh limiet wordt de elektrostatische afstoting groter dan de oppervlaktespanning, waardoor de druppel uiteenspat. Dit proces kan zich herhalen, en uiteindelijk worden uit deze geladen druppeltjes gasfase ionen uitgestoten die gemeten kunnen worden [69](#page=69). ESI leidt tot weinig fragmentatie en maakt meervoudige lading van grote moleculen mogelijk (vanaf circa 1200 Dalton, met een lading van ongeveer 1 per 1000 Da). Dit maakt de meting van macromoleculen met massaspectrometrie mogelijk [69](#page=69). #### 3.2.3 Massa analyse De massa-analysator is een essentieel onderdeel van de massaspectrometer. Er zijn verschillende typen, waaronder de kwadrupool-, magnetische, ionenvangst (ion trap) en TOF (time of flight) analysators. De magnetische analysator is reeds besproken [70](#page=70). ##### Kwadrupool massa-analysator Een kwadrupool analysator bestaat uit twee paren parallelle staven. Tegenover elkaar liggende staven zijn elektrisch verbonden en er wordt een variabele spanning aangelegd. Onder invloed van deze spanning leggen de ionen een oscillerende baan af tussen de staven. Bij een specifieke spanning bereiken slechts ionen met een bepaalde massa het einde van de baan; alle andere ionen worden gevangen door de staven. Door de spanning continu te variëren (massa scanning), passeren ionen van verschillende massa na elkaar de staven en bereiken de detector. Dit type wordt daarom een quadrupool massa filter genoemd [70](#page=70). ##### Ionenvangst analysator De ionenvangst analysator (ion trap analyzer) is een compacte massafilter die sterk lijkt op een kwadrupool. Ionen worden in een geëvacueerde holte opgeslagen door geschikte elektrische velden aan te leggen. Vervolgens kunnen de ionen selectief worden uitgestoten op basis van hun moleculaire massa [70](#page=70). ##### Time of Flight (TOF) analysator Bij een TOF analysator worden ionen onder invloed van een elektrisch veld naar de analysator geleid. De grootte van het elektrische veld bepaalt de kinetische energie van de ionen. Ionen met dezelfde lading hebben dezelfde kinetische energie. De snelheid van deze ionen is afhankelijk van hun massa volgens $E_k = mv^2/2$; lichtere deeltjes bewegen sneller dan zwaardere. Dit resulteert in een verschil in tijd om de detector te bereiken. De tijd die ionen nodig hebben om de detector te bereiken is gecorreleerd met hun m/z verhouding. Wanneer de TOF-detector wordt gecombineerd met MALDI, waarbij voornamelijk éénwaardige ionen worden gevormd, kan de massa van de deeltjes direct uit het massaspectrum worden afgelezen. Deze analysator wordt voornamelijk toegepast voor de detectie van biopolymeren zoals proteïnen en bacteriën [71](#page=71). #### Het scheidend vermogen of resolutie De resolutie (R) van een massaspectrometer is het vermogen om twee ionen met een verschillende m/z waarde te scheiden. Het wordt gedefinieerd als $R = m/\Delta m$, waarbij $m$ de gemeten massa is en $\Delta m$ het verschil in massa dat meetbaar is [71](#page=71). Resolutie is van groot belang in MS [71](#page=71). **Voorbeeld:** Twee stoffen hebben een massa van 32. De accurate massa van de ene is 32.0263 ± 0.0001, terwijl de andere 31.9898 ± 0.0001 is. De ene stof is CH$_3$OH, de andere O$_2$ [71](#page=71). Wanneer de m/z op 4 of 5 decimalen wordt gemeten, spreekt men van hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS). Wanneer de massa slechts tot op het laatste gehele getal wordt bepaald, spreekt men van lage resolutie MS (LRMS). Een kwadrupool-massafilter heeft een lage resolutie, terwijl met een magnetische sector analysator een zeer hoge resolutie kan worden bereikt [71](#page=71). --- # Elektroforetische technieken Elektroforese is een scheidingsmethode gebaseerd op de beweging van ionen in een elektrisch veld, resulterend in een elektroferogram [72](#page=72). ### 4.1 Inleiding tot elektroforese Elektroforese maakt gebruik van de beweging van geladen deeltjes in een elektrisch veld om scheiding te bewerkstelligen. Anionen (negatief geladen ionen) migreren naar de anode (positieve pool), terwijl kationen (positief geladen ionen) naar de kathode (negatieve pool) bewegen met een constante migratiesnelheid [72](#page=72). #### 4.1.1 Elektroforetische mobiliteit De snelheid waarmee een ion in een elektrisch veld beweegt, wordt gedefinieerd door de elektroforetische mobiliteit ($\mu_{EF}$) [73](#page=73): $v = \mu_{EF} E$ [73](#page=73). De elektroforetische mobiliteit wordt verder bepaald door: $\mu_{EF} = \frac{q}{6\pi\eta r}$ [73](#page=73). Waarbij: * $q$: lading van het ion [73](#page=73). * $E$: veldsterkte (V/cm) [73](#page=73). * $\eta$: viscositeit van het milieu [73](#page=73). * $r$: straal van het deeltje [73](#page=73). * $v$: snelheid [73](#page=73). Uit deze vergelijking volgt dat de mobiliteit afhankelijk is van de ion-kenmerken (lading $q$ en straal $r$) en de eigenschappen van het milieu (viscositeit $\eta$) [73](#page=73). De scheiding verbetert met: * Toename van de analyseduur [73](#page=73). * Hogere gebruikte veldsterkte ($E_{veld}$) [73](#page=73). * Groter verschil in de verhouding $q/r$ tussen de ionen [73](#page=73). #### 4.1.2 Invloed van pH op amfolieten De pH heeft een significante invloed op de migratiesnelheid van amfolieten, zoals aminozuren, peptiden en proteïnen. Aminozuren bezitten zowel zure (-COOH, $pK_1 \approx 2.0-2.5$) als basische (-NH$_2$, geconjugeerd zuur $pK \approx 9-9.5$) functionele groepen [73](#page=73). * Bij lage pH (lager dan $pK_1$) zal de carboxylgroep protoneren (-COOH) en de aminogroep protoneren (-NH$_3^+$), wat resulteert in een netto positieve lading (zure vorm). De amfoliet migreert dan naar de kathode [73](#page=73) [74](#page=74). * Bij hoge pH (hoger dan $pK$ van de aminogroep) zal de carboxylgroep gedeprotoneerd zijn (-COO$^-$) en de aminogroep gedeprotoneerd zijn (-NH$_2$), wat resulteert in een netto negatieve lading (basische vorm). De amfoliet migreert dan naar de anode [74](#page=74). * Bij het iso-elektrisch punt ($pI$), de pH waarbij de netto lading van het molecuul nul is (zwitterion vorm), is de mobiliteit nagenoeg nul. Dit punt kan berekend worden als het gemiddelde van de $pK$ waarden van de ioniseerbare groepen [73](#page=73): $pI = \frac{pK_1 + pK_2}{2}$ [73](#page=73). Experimenteel wordt het iso-elektrisch punt gedefinieerd als de pH waarbij het proteïne niet migreert in een elektrisch veld [74](#page=74). De mobiliteit wordt ook beïnvloed door de lading ($q$) en de afmetingen (straal $r$) van het ion; een hogere lading en kleinere afmetingen leiden tot sterkere aantrekking tot de tegengestelde elektrode [74](#page=74). Klassieke elektroforese met poreuze gels is tijdrovend, inefficiënt en moeilijk te automatiseren. Capillaire elektroforese biedt daarentegen snelle en efficiënte scheidingen [74](#page=74). ### 4.2 Capillaire elektroforetische technieken Capillaire elektroforese (CE) wordt uitgevoerd in capillairen met interne diameters variërend van 25 tot 100 µm, typisch gemaakt van kwarts (fused silica). Ze kunnen naakt, gecoat of gevuld met gel worden gebruikt. Er worden hoge veldsterktes toegepast, tot wel 30 kV [74](#page=74). Een standaard CE-opstelling omvat een capillair waarvan de uiteinden in twee buffertankjes met elektroden geplaatst zijn. De elektroden zijn aangesloten op een spanningsbron. Aan het einde van het capillair bevindt zich een detector voor on-line detectie [74](#page=74). In tegenstelling tot veel biochemische toepassingen, wordt CE ook veelvuldig gebruikt in de farmaceutische analyse als alternatief voor omgekeerde fase (RP) scheidingen, mede dankzij de mogelijkheid van on-line detectie met bijvoorbeeld een UV-detector. Het resulterende signaal wordt een elektroferogram genoemd, vergelijkbaar met een chromatogram [75](#page=75). **Voordelen van Capillaire Elektroforese:** * Potentieel voor zeer hoge scheidingsefficiëntie (tot 30 miljoen platen per meter) [75](#page=75). * Snelle analysetijden (5 tot 30 minuten) [75](#page=75). * Vereist minder dure en toxische solventen dan HPLC; voornamelijk waterige buffers worden gebruikt [75](#page=75). * Zeer kleine monstervolumes (nanoliters) zijn nodig, wat een voordeel is voor monstervoorziening, maar een nadeel voor de gevoeligheid in concentratietermen [75](#page=75). #### 4.2.1 Capillaire zone-elektroforese (CZE) CZE is de zuivere vorm van elektroforese waarbij naast het elektroforetische effect (EF) ook het elektro-osmotische effect (EOF) de mobiliteit bepaalt [75](#page=75). Het EOF ontstaat door de structuur van de capillairwand (SiO$_2$). Silanolgroepen aan het oppervlak ioniseren boven pH 3, wat de wand een negatieve lading geeft. Positieve ionen uit de buffer vormen een dubbellaag: een niet-mobiele laag van niet-gehydrateerde kationen en een mobiele laag van gehydrateerde kationen. Bij het aanleggen van een hoge spanning bewegen de vrije kationen naar de kathode, waarbij de bulkoplossing wordt meegesleept. Dit verklaart de beweging van neutrale componenten en de potentiaal die geassocieerd wordt met dit effect wordt de stromingspotentiaal genoemd [76](#page=76). > **Tip:** De grootte van de EOF wordt beïnvloed door bufferconcentratie, viscositeit en pH [76](#page=76). Een belangrijk voordeel van de EOF is dat alle deeltjes, ongeacht hun lading, in één richting bewegen. In de gebruikelijke situatie (negatief geladen capillairwand) beweegt de EOF naar de kathode [76](#page=76). * **Kationen:** Migreren het snelst omdat de elektroforetische flow en de EOF in dezelfde richting wijzen [76](#page=76). * **Neutrale deeltjes:** Bewegen met de snelheid van de EOF en kunnen onderling niet gescheiden worden [76](#page=76). * **Anionen:** Bereiken de detector als laatsten; ze worden door de elektroforetische flow naar de anode getrokken, maar de EOF voert ze mee naar de kathode (de EOF is groter dan de EF) [76](#page=76). [ ] [77](#page=77). De volgorde van elutie bij CZE is doorgaans: kationen, neutrale deeltjes, anionen. Deze methode kan organische verbindingen, anorganische ionen en peptiden scheiden [77](#page=77). #### 4.2.2 Micellaire elektrokinetische capillaire chromatografie (MEKC) MEKC combineert capillaire elektroforese met de vorming van micellen. Micellen zijn sferische aggregaten van tensioactieve stoffen (bv. Na-dodecylsulfaat) met een geladen buitenkant en een hydrofoob interieur. Hun beweging is het resultaat van de som van elektroforetische en elektro-osmotische effecten [77](#page=77). Neutrale moleculen kunnen interageren met het hydrofobe deel van de micellen. De verdeling van deze moleculen tussen de micel en de omringende vloeistof, bepaald door de interactiesterkte, leidt tot scheiding. De micellen fungeren als een stationaire fase, waarbij de interactiesterkte de elutievolgorde bepaalt, met als belangrijk verschil dat de micellen zelf bewegen [77](#page=77). > **Example:** Scheiding van opgeloste stoffen via MEKC: stoffen verdelen zich tussen de micel en de oplossing. Niet elke stof interacteert even sterk met de micellen, wat resulteert in een scheiding [78](#page=78). #### 4.2.3 Capillaire elektrochromatografie (CEC) CEC is een hybride techniek tussen HPLC en CE. Een RP-stationaire fase wordt gepakt in een fused silica capillair (50-200 µm interne diameter) met kleine deeltjes (1-5 µm). Het elektrische veld drijft de mobiele fase door de stationaire fase, waardoor een hoge druk pomp niet nodig is [78](#page=78). #### 4.2.4 Capillaire gel-elektroforese Deze techniek wordt uitgevoerd in met gel gevulde capillairen en is typisch voor de scheiding van DNA-fragmenten (van minder dan 100 tot meer dan 2000 baseparen). De scheiding is gebaseerd op de grootte van de ionen, vergelijkbaar met klassieke gelelektroforese, waarbij de gel fungeert als moleculaire zeef. Het kan gebruikt worden voor het scheiden van ionische componenten met verschillende grootte maar vergelijkbare lading (of lading/grootte verhouding), zoals DNA-fragmenten en SDS-proteïnen. Het is een geminiaturiseerde vorm van klassieke gelelektroforese [78](#page=78). #### 4.2.5 Capillaire isoelektrische focussering (IEF) Capillaire IEF wordt gebruikt om peptiden en proteïnen te scheiden op basis van hun iso-elektrisch punt ($pI$). Zie ook klinische chemie [78](#page=78). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Analyten | Componenten in een monster die onderzocht worden tijdens een chemische analyse. Ze zijn het specifieke doelwit van de analyse. | | Kwalitatieve analyse | Bepaalt welke componenten (elementen of moleculen) aanwezig zijn in een materiaal, zonder hun exacte hoeveelheid vast te stellen. | | Kwantitatieve analyse | Bepaalt de exacte concentratie of hoeveelheid van de aanwezige componenten in een materiaal. | | Klassieke analytische methoden | Traditionele chemische analysetechnieken die vaak gebruik maken van neerslagvorming, extractie, titratie of gravimetrie, ook wel 'natte chemie' genoemd. | | Instrumentele analytische methoden | Analysetechnieken die gebruik maken van gespecialiseerde instrumenten om fysische eigenschappen van componenten te meten, zoals absorptie van licht of massa/ladingverhouding. | | Bemonstering | Het proces van het afzonderen van een representatieve fractie van het te onderzoeken materiaal om een betrouwbare analyse te garanderen. | | Voorbereiding van staal | Omvat stappen zoals homogeniseren van het monster en het verwijderen van interfererende materialen voorafgaand aan de analyse. | | Opzuiveringen (separaties) | Processen waarbij het te meten bestanddeel wordt gescheiden van andere stoffen die de meting kunnen beïnvloeden. | | Juistheid (Bias) | De mate van overeenstemming tussen het gemiddelde van de metingen en de werkelijke waarde van de te bepalen component. Een systematische fout veroorzaakt bias. | | Precisie | De mate van spreiding in meetresultaten verkregen door herhaalde metingen onder gelijke omstandigheden. Het beschrijft de reproduceerbaarheid van de metingen. | | Herhaalbaarheid | Precisie gemeten onder strikt identieke omstandigheden, zoals door dezelfde analist met dezelfde apparatuur binnen een korte tijd. | | Reproduceerbaarheid | Precisie gemeten onder variabele condities, zoals op verschillende dagen, met verschillende reagentia of door verschillende laboratoria. | | Standaarddeviatie (SD) | Een statistische maat die de spreiding van individuele meetwaarden rond het gemiddelde aangeeft. Een lagere SD duidt op hogere precisie. | | Relatieve standaarddeviatie (RSD) | De standaarddeviatie uitgedrukt als een percentage van het gemiddelde. Dit geeft een betere indicatie van de precisie in verhouding tot de gemeten waarde. | | Gevoeligheid | De mate waarin een methode in staat is om kleine veranderingen in de concentratie van een analyt betrouwbaar te meten. Het is gerelateerd aan de helling van de ijklijn. | | Detectielimiet (LOD) | De kleinst mogelijke concentratie van een analyt die met een bepaalde methode nog betrouwbaar kan worden aangetoond, onderscheiden van de achtergrondruis. | | Kwantificatielimiet (LOQ) | De laagste concentratie van een analyt waarbij de concentratie op een betrouwbare en kwantitatieve manier kan worden bepaald. | | Selectiviteit (Specificiteit) | De mate waarin een methode een specifiek analyt kan bepalen zonder interferentie van andere vergelijkbare componenten in het monster. | | Robuustheid | De ongevoeligheid van een methode voor kleine, onbedoelde variaties in de analyseomstandigheden, zoals temperatuur of pH. | | Kalibratiemethode | Een procedure om het verband tussen het analytische signaal en de concentratie van een analyt vast te stellen, meestal met behulp van standaarden. | | Externe standaardmethode | Een kalibratiemethode waarbij standaarden met bekende concentraties afzonderlijk worden gemeten om een ijklijn op te stellen, waarna de concentratie van onbekende monsters wordt bepaald. | | Standaardadditiemethode | Een kalibratiemethode waarbij bekende hoeveelheden analyt worden toegevoegd aan het monster zelf om matrix-effecten te compenseren en de concentratie te bepalen. | | Interne standaardmethode | Een kalibratiemethode waarbij een stof met vergelijkbare chemische eigenschappen als het analyt wordt toegevoegd aan zowel standaarden als monsters om variaties in de analyse te corrigeren. | | Molaire concentratie (c) | De hoeveelheid opgeloste stof uitgedrukt als het aantal mol per liter oplossing ($n/V$). | | Massaconcentratie (mc) | De hoeveelheid opgeloste stof uitgedrukt als het aantal gram per liter oplossing ($m/V$). | | Fractionele concentraties | Geeft de fractie van de opgeloste stof in het gehele mengsel weer, uitgedrukt in percentages (%), promille (‰), parts per million (ppm) of parts per billion (ppb). | | Chromatografie | Een verzameling scheidingstechnieken gebaseerd op de verdeling van componenten tussen een stationaire en een mobiele fase. | | Mobiele fase | De fase (vloeistof of gas) die door het chromatografische systeem stroomt en de componenten van het monster meevoert. | | Stationaire fase | De vaste of vloeibare fase die niet beweegt en waarlangs de mobiele fase stroomt, waar interacties plaatsvinden die tot scheiding leiden. | | Elutie | Het proces waarbij componenten van de stationaire fase worden gewassen door de mobiele fase. | | Retentietijd (tr) | De tijd die een component nodig heeft om de kolom te doorlopen en te elueren, gemeten vanaf het moment van injectie. | | Chromatogram | Een grafische weergave van de scheiding, die het detectorsignaal uitzet tegen de tijd, waarbij pieken de gescheiden componenten representeren. | | Dunnelaagchromatografie (TLC) | Een chromatografische techniek waarbij een dunne laag van een adsorberende stof op een plaat wordt gebruikt als stationaire fase. | | Gaschromatografie (GC) | Een chromatografische techniek waarbij de mobiele fase een gas is en de stationaire fase een vloeistof of vaste stof, gebruikt voor vluchtige verbindingen. | | Vloeistofchromatografie (LC) | Een chromatografische techniek waarbij de mobiele fase een vloeistof is, gebruikt voor minder vluchtige of thermisch instabiele verbindingen. | | HPLC (High Performance Liquid Chromatography) | Een geavanceerde vorm van vloeistofchromatografie die hoge druk gebruikt voor snelle en efficiënte scheidingen. | | Verdelingscoëfficiënt (KD) | Een evenwichtsconstante die de verdeling van een stof tussen de stationaire en mobiele fase beschrijft. | | Resolutie | Een maat voor de kwaliteit van de scheiding tussen twee pieken in een chromatogram, gebaseerd op piekbreedte en verschil in retentietijd. | | Retentiefactor (k) | Een dimensieloze parameter die de retentie van een analyt op de kolom aangeeft, onafhankelijk van de kolomlengte en flow rate. | | Selectiviteit (α) | Een maat voor het verschil in retentie tussen twee componenten, gedefinieerd als de verhouding van hun gecorrigeerde retentietijden. | | Bandverbreding (piekverbreding) | Het fenomeen waarbij de pieken in een chromatogram breder worden tijdens het doorlopen van de kolom, wat de scheidingskwaliteit vermindert. | | Theoretische platen (N) | Een maat voor de efficiëntie van een chromatografische kolom, gerelateerd aan de retentietijd en piekbreedte. Hoe hoger N, hoe efficiënter de kolom. | | Plaathoogte (HETP) | De hoogte van een theoretische plaat, een indicator van de scheidende capaciteit van een kolom; een lagere HETP duidt op een betere kolom. | | Massaspectrometrie (MS) | Een analytische techniek die moleculen ioniseert, scheidt op basis van hun massa-ladingverhouding (m/z) en detecteert, om massa-spectra te genereren. | | Moleculair ion (M.+) | Het ion dat ontstaat wanneer een molecule een elektron verliest of wint, en de oorspronkelijke molecuulmassa behoudt. | | Basispiek | De piek met de hoogste relatieve intensiteit in een massaspectrum, die vaak wordt genormaliseerd tot 100%. | | Fragmentatie | Het proces waarbij geïoniseerde moleculen dissociëren in kleinere, geladen fragmenten, wat kenmerkend is voor een molecuul. | | Elektron Impact (EI) | Een ionisatiemethode waarbij moleculen worden gebombardeerd met hoogenergetische elektronen, wat leidt tot ionisatie en fragmentatie. | | Chemische ionisatie (CI) | Een 'zachtere' ionisatiemethode dan EI, waarbij analyten reageren met secundaire ionen van een reactiegas, wat minder fragmentatie oplevert. | | Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) | Een ionisatietechniek die bij atmosferische druk werkt en vergelijkbaar is met CI, maar hogere ionisatie-efficiëntie biedt voor vluchtige analyten. | | Electrospray Ionisation (ESI) | Een zeer zachte ionisatietechniek bij atmosferische druk, geschikt voor polaire moleculen en biomoleculen, waarbij ionen in de vloeibare fase worden gevormd en vervolgens in de gasfase worden gemeten. | | Massa-analysator | Het onderdeel van de massaspectrometer dat ionen scheidt op basis van hun massa-ladingverhouding (m/z). | | Kwadrupool massa-analysator | Een type massa-analysator dat gebruik maakt van variërende elektrische velden om ionen te selecteren op basis van hun m/z-waarde. | | Ionenvangst analysator (Ion trap) | Een compacte massa-analysator die ionen opslaat en selectief uitstoot op basis van hun massa. | | Time of Flight (TOF) analysator | Een massa-analysator die de tijd meet die ionen nodig hebben om een gedefinieerde afstand af te leggen onder invloed van een elektrisch veld, wat gecorreleerd is met hun m/z. | | Elektroforese | Een scheidingsmethode die gebruik maakt van de beweging van geladen deeltjes (ionen) in een elektrisch veld. | | Elektroforetische mobiliteit (µEF) | Een maat voor de snelheid waarmee een ion beweegt in een elektrisch veld, afhankelijk van lading, grootte en de viscositeit van het medium. | | Iso-elektrisch punt (pI) | De pH-waarde waarbij een amfoliet (molecuul met zowel zure als basische groepen) netto elektrisch neutraal is en niet migreert in een elektrisch veld. | | Capillaire elektroforese (CE) | Een elektroforetische techniek uitgevoerd in dunne capillairen, die snelle en efficiënte scheidingen mogelijk maakt. | | Elektro-osmotische flow (EOF) | De stroming van de bufferoplossing in een capillair onder invloed van een elektrisch veld, veroorzaakt door de lading op de wand van de capillair. | | Micellaire elektrokinetische capillaire chromatografie (MEKC) | Een techniek die capillaire elektroforese combineert met micelvorming, waarbij neutrale moleculen zich verdelen tussen de micellen en de vloeistof voor scheiding. | | Capillaire elektrochromatografie (CEC) | Een hybride techniek die elementen van HPLC en CE combineert, waarbij de mobiele fase door een stationaire fase in een capillair wordt gestuwd door een elektrisch veld. |