Summary
# Vries-breek en vries-ets technieken voor celmembraananalyse
1. Vries-breek en vries-ets technieken voor celmembraananalyse
Deze technieken worden gebruikt om de ultrastructuur van biologische membranen en cellen zichtbaar te maken, waarbij met name de organisatie van eiwitten in het membraan aan het licht komt. Ze maken gebruik van cryogene methoden om biologische monsters te bevriezen, waardoor ze stabiliteit krijgen voor analyse onder de elektronenmicroscoop .
## 1.1 Vries-breek techniek
### 1.1.1 Principe en toepassing
De vries-breek (freeze-fracture) techniek is essentieel voor het bestuderen van membraanstructuren. Wanneer cellulaire membranen snel worden ingevroren en vervolgens worden gebroken met een diepgekoeld mes, breken de membranen doorgaans tussen hun binnenste en buitenste bladen. Dit scheidingsproces onthult de interne architectuur van het membraan, inclusief de eiwitten die daarin zijn ingebed .
### 1.1.2 Visualisatie
Na het breken worden de blootgelegde oppervlakken van de membraanhelften bestoven met zware atomen (zoals platina en koolstof). Dit creëert een reliëf dat overeenkomt met het membraanoppervlak. Dit reliëf wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) of een scanning-elektronenmicroscoop (SEM). Een alternatieve methode is het maken van een replica van het gebroken oppervlak om de elektronenpassage in de TEM te verbeteren .
### 1.1.3 Resultaten
Vriesbreekanalyses tonen membraaneiwitten of eiwitaggregaten geassocieerd met de membraanhelft die het cytoplasma begrenst (P- of protoplasmatische zijde) of de extracellulaire membraanhelft (E-zijde). Dit levert waardevolle informatie over de laterale organisatie van membraaneiwitten, wat cruciaal is voor het begrijpen van het vloeibaar mozaïekmodel van biologische membranen .
> **Tip:** Vries-breek is vooral nuttig om de verdeling en aggregatie van transmembraaneiwitten in de lipidendubbellaag te visualiseren.
## 1.2 Vries-ets techniek
### 1.2.1 Principe en verbetering
De vries-ets (freeze-etching) techniek is een uitbreiding van de vries-breek methode die meer gedetailleerde 3D-structuren kan onthullen. Na het bevriezen van het monster wordt een dunne laag ijs verwijderd door sublimatie (het direct overgaan van vast naar gas) onder vacuüm. Dit proces, ook wel cryo-sublimatie genoemd, kan diepere structuren blootleggen en creëert een reliëf dat de onderliggende morfologie nauwkeuriger weergeeft dan enkel vries-breken .
### 1.2.2 Visualisatie
Net als bij vries-breken, worden de blootgelegde oppervlakken na het etsen bestoven met zware atomen en geanalyseerd met TEM of SEM .
### 1.2.3 Toepassing
Door het verwijderen van een dunne laag ijs, kunnen vries-ets technieken gedetailleerdere driedimensionale informatie verschaffen over celoppervlakken, organellen en membraansystemen .
> **Voorbeeld:** Vries-etsen kan nuttig zijn om de complexe structuur van de kernenvelop of de organisatie van eiwitten op het celoppervlak beter te bestuderen.
## 1.3 Cryo-elektronen-tomografie
Hoewel niet strikt een vries-breek of vries-ets techniek, is cryo-elektronen-tomografie (Cryo-ET) een geavanceerde methode voor 3D-reconstructie van cellulaire structuren, vaak in combinatie met vriesprocedures .
### 1.3.1 Principe
Cryo-ET maakt gebruik van een reeks 2D-projecties van een bevroren monster, genomen terwijl het monster of de detector rond een as wordt gekanteld. Door deze projecties te combineren met behulp van Fourier-analyse en terugprojecties, wordt een virtueel 3D-beeld van het originele object gereconstrueerd .
### 1.3.2 Nauwkeurigheid en detail
De nauwkeurigheid van de reconstructie neemt toe naarmate meer projecties met kleinere hoekintervallen kunnen worden gecombineerd. Dit vermindert artefacten die ontstaan door ontbrekende projecties (de "missing wedge"). Door meerdere identieke structuren, zoals nucleaire poriecomplexen (NPCs), te analyseren en te middelen, kunnen nog meer details zichtbaar worden gemaakt .
> **Tip:** Cryo-ET is uitermate geschikt voor het bestuderen van de architectuur van grote moleculaire machines en cellulaire organellen op subnanometerschaal.
## 1.4 Illustratieve Voorbeelden uit de Documentatie
De documentatie bevat diverse TEM- en SEM-opnames die de toepassing van deze technieken illustreren:
* **TEM-opname van een replica van een vriesbreekpreparaat van een wortelcel van de ui:** Toont de celkern (N), nucleaire membraan (NE), kernporiën (NP), celwand (CW), Golgi apparaat (G) en vacuole (V) .
* **TEM-opname van een replica van het oppervlak van een vriesbreekpreparaat van een darmepitheelcel van de muis:** Laat microvilli (MV), celmembraan (CM), mitochondriën (M), Golgi apparaat (G), nucleus (N) en kernporiën zien .
* **TEM-analyse van epitheel van de trachea/luchtpijp:** Beschrijft de aanwezigheid van gecilieerde cellen met cilia (C) en mucus-producerende cellen met mucus-gevulde secretiedruppels (MD), beiden begrensd door een dubbelbladige biologische membraan (UM). De microvilli (MV) worden ook genoemd .
* **SEM-analyse van epitheel van de trachea/luchtpijp:** Toont eveneens de twee celtypes met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak .
---
# Analyse van epitheel van de trachea/luchtpijp met behulp van microscopie
De microscopische analyse van het epitheel van de trachea, met name middels transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM), onthult de morfologische kenmerken van de gespecialiseerde cellen die de luchtwegen bekleden .
### 2.1 Structuur van het tracheaal epitheel
Het epitheel van de trachea is gelegen op een basaal membraan (BM), ook wel basale lamina genoemd, dat op zijn beurt rust op fibreus bindweefsel. Dit bindweefsel bevat onder andere fibrocyten, collageenvezels en elastinevezels .
### 2.2 Celtypen in het tracheaal epitheel
Binnen het tracheaal epitheel wisselen twee hoofdtypen cellen elkaar af:
#### 2.2.1 Gecilieerde cellen
Deze cellen kenmerken zich door de aanwezigheid van talrijke cilia, die essentieel zijn voor het transport van slijm en ingesloten deeltjes uit de luchtwegen. De cilia worden begrensd door een dubbelbladige biologische membraan, vergelijkbaar met microvilli. TEM-analyse toont dat deze cellen ook veel mitochondria bevatten, wat wijst op een hoge metabole activiteit, en enigszins glad endoplasmatisch reticulum (SER). De cilia kunnen in verschillende doorsneden worden waargenomen: longitudinaal, schuin en dwars (aangeduid als C') .
#### 2.2.2 Mucus-producerende cellen
Deze cellen, ook wel slijmbekercellen genoemd, zijn verantwoordelijk voor de productie en afscheiding van slijm, wat een beschermende en bevochtigende laag vormt in de trachea. SEM-analyse laat zien dat deze cellen een koepelvormig oppervlak hebben. Vanuit TEM-perspectief vertonen deze cellen een hoge concentratie van ruw endoplasmatisch reticulum (ER), een ontwikkeld Golgi-apparaat (G) en talrijke secretiedruppels gevuld met mucus (MD) .
### 2.3 Preparatie voor SEM-analyse
Voor scanning-elektronenmicroscopie worden monsters geleidend gemaakt voor elektriciteit. Dit wordt bereikt door een uiterst dun laagje (1,5-3 nanometer) goud of goud/palladium aan te brengen middels een sputter coater .
> **Tip:** Beide microscopische technieken, TEM en SEM, bieden complementaire informatie over de celmorfologie en oppervlaktestructuren van het tracheaal epitheel. Waar TEM details geeft over intracellulaire organellen, brengt SEM de oppervlaktekenmerken en de onderlinge rangschikking van de cellen in beeld.
> **Example:** De microscopische analyse toont aan dat de gecilieerde cellen, met hun vele cilia en mitochondria, primair betrokken zijn bij het mechanisch transport van slijm, terwijl de mucus-producerende cellen, met hun uitgebreide ER en Golgi, gespecialiseerd zijn in de synthese en secretie van slijm. Deze differentiatie is cruciaal voor de efficiënte bescherming en reiniging van de luchtwegen .
---
# Groeisubstraten en celinteracties in vitro
Dit onderwerp behandelt de essentiële componenten en processen voor het succesvol laten groeien van cellen in een laboratoriumomgeving, met een focus op de substraten en interacties die de celgroei en het gedrag reguleren.
### 3.1 Principes van celcultivering
Het starten van een cellijn uit weefsel, zoals een orgaan of tumor, omvat enzymatische behandeling, isolatie van cellen, en uitzaden in een groeirecipiënt. Als een confluente laag wordt bereikt, worden de cellen losgemaakt en gesplitst voor verdere groei. Cellen in cultuur vormen typisch een monolaag, waarbij kolonies ontstaan uit individuele cellen [10](#page=10) [9](#page=9).
### 3.2 Cultuurmedia
Cultuurmedia voorzien cellen van de noodzakelijke voedingsstoffen voor groei in vitro [11](#page=11).
#### 3.2.1 Minimum Essential Medium (MEM)
MEM is een voorbeeld van een celmedium en bevat:
* Isotonische zouten, zoals een NaHCO₃/H₂CO₃-buffer, vergelijkbaar met de buffer in bloed [11](#page=11).
* Glucose als energiebron [11](#page=11).
* Essentiële aminozuren en vitamines die de cel niet zelf kan synthetiseren [11](#page=11).
* Serum, dat nagenoeg essentieel is maar kwaliteitsvariatie kan vertonen [11](#page=11).
Andere klassieke celmedia omvatten DMEM, M199, McCoy’s en RPMI1640 [11](#page=11).
#### 3.2.2 Cultuurcondities en pH
Om celgroei te optimaliseren, worden culturen doorgaans gegroeid onder een atmosfeer van 5% CO₂ in lucht. Dit percentage is vergelijkbaar met het CO₂-gehalte in bloed en weefselvochten, wat bijdraagt aan het handhaven van een optimale pH van 7,4 in het medium, aangezien de atmosfeer slechts 0,03% CO₂ bevat [11](#page=11).
> **Tip:** Het is cruciaal om de cultuurcondities zo nauwkeurig mogelijk na te bootsen met de in vivo situatie om de cellen representatief te houden voor onderzoek [11](#page=11).
### 3.3 Cultuurrecipiënten
Verschillende recipiënten worden gebruikt voor celculturen, afhankelijk van de toepassing:
* **Gesloten flessen:** Deze worden gebruikt in een warme kamer en vereisen het toevoegen van CO₂ alvorens ze worden afgesloten [12](#page=12).
* **Open platen:** Deze worden typisch in CO₂-ovens geplaatst [12](#page=12).
* **Rollerflessen:** Deze zijn geschikt voor het kweken van een groot oppervlak met cellen met een beperkte hoeveelheid medium [12](#page=12).
### 3.4 Oorsprong van cellen en celbanken
Cellen voor onderzoek kunnen afkomstig zijn uit verschillende bronnen:
* **Andere laboratoria:** Cellen die al in cultuur zijn en doorgegeven worden [14](#page=14).
* **Eigen isolatie (primaire culturen):** Cellen direct uit weefsels van organismen [14](#page=14).
* **Celbanken:** Gecertificeerde collecties van cellijnen, zoals ATCC (The American Type Culture Collection) en ECACC (The European Collection of Cell Cultures) [14](#page=14).
### 3.5 Groeistrategieën en -procedures
#### 3.5.1 Groeistrategieën
Groeistrategieën zijn gericht op het faciliteren van celadhesie, proliferatie en differentiatie.
* **Fysische drager en bescherming:** Het groeistrument (substraat) dient als fysische ondersteuning voor cellen en beschermt hen tegen anoïkis, een vorm van geprogrammeerde celdood. Dit is met name essentieel voor adherente celculturen [15](#page=15).
* **Vervanging van de extracellulaire matrix (ECM):** Voor adherente celculturen is contact met een substraat noodzakelijk. Dit kan nagebootst worden door cellen te laten groeien op eiwitten uit de ECM [15](#page=15).
* **Signalen van omliggende cellen:** Cellen kunnen signalen nodig hebben van naburige cellen. Dit kan nagebootst worden door:
1. Het medium van een moedercultuur te gebruiken [15](#page=15).
2. Cellen te laten groeien op een feedercellaag, bestaande uit cellen die geïnhibeerd zijn voor celdeling maar nog wel metabolisch actief zijn [15](#page=15).
#### 3.5.2 Groeistrategieën - Substraten
Verschillende materialen dienen als groeistratus voor celculturen:
* **Glas:** Van nature negatief geladen [15](#page=15).
* **Voorbehandeld polystyreen:** Gebruikt in microplaten, flessen, multiplaten en rollers [15](#page=15).
* **Coatings:** Specifieke oppervlaktebehandelingen om celadhesie te bevorderen:
* Poly-D-lysine: Een stof met een sterke positieve lading [15](#page=15).
* Collageen: Een eiwit van de Extracellulaire Matrix (ECM) [15](#page=15).
* Geconditioneerd milieu: Medium dat continu gevormd wordt door feedercelculturen [15](#page=15).
> **Tip:** Het doel is om de in vitro-condities zo veel mogelijk te laten lijken op de in vivo-situatie [15](#page=15).
### 3.6 Interactie van cellen met hun micro-omgeving
In vivo staan cellen constant in contact met hun micro-omgeving, wat essentieel is voor hun functie en overleving. Dit contact kan fysisch zijn of via secretie van moleculen.
#### 3.6.1 Fysische en functionele interacties
* **Aspecifieke fysische interactie:** Maakt cellulaire adhesie en celspreiding mogelijk, wat gekoppeld is aan anchorage-independence [16](#page=16).
* **Specifieke functionele interactie:** Interactie met onderliggende cellen en de ECM kan leiden tot differentiatie-inductie. Dit gebeurt door stimulatie vanuit het basaal membraan of basale lamina [16](#page=16).
Een illustratief voorbeeld is de interactie van dierlijke huidcellen. De basale keratinocyten in de epidermis, die de stamcellen van de huid bevatten, worden gepolariseerd en functioneel gecontroleerd door hun contact met het basaal membraan (BM) [16](#page=16).
> **Tip:** Het begrijpen van deze interacties is cruciaal voor het succesvol modelleren van weefsels in vitro [16](#page=16).
#### 3.6.2 Interactie via secretie
Naast direct fysiek contact, interageren cellen ook door de secretie van moleculen, zoals groeifactoren, die signalen doorgeven aan omliggende cellen [16](#page=16).
### 3.7 Celldichtheids-afhankelijke inhibitie
Celproliferatie in cultuur wordt beïnvloed door de dichtheid van de cellen.
* **Contactinhibitie:** Cellen in een tweedimensionale (2D) monolaag stoppen met delen zodra ze een confluente laag vormen. Dit fenomeen, bekend als contactinhibitie, is mede te wijten aan competitie voor mitogenen [17](#page=17).
* **Herstarten van delingen:** Het toevoegen van vers medium kan de celdelingen opnieuw starten [17](#page=17).
* **Efficiënt splitsen:** Om de cultuur te behouden en verdere groei te faciliteren, worden cellen efficiënter gesplitst in dochterculturen, vaak met behulp van een trypsine-EDTA procedure [17](#page=17).
---
# Typen stamcellen: totipotent, pluripotent en multipotent
Stamcellen zijn cellen die het vermogen hebben om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren tot gespecialiseerde celtypen, en ze worden geclassificeerd op basis van hun ontwikkelingspotentieel [28](#page=28).
### 4.1 Algemene eigenschappen van stamcellen
Stamcellen bezitten twee fundamentele eigenschappen:
* **Zelfvernieuwing**: Het vermogen om zichzelf te delen en identieke kopieën te produceren [28](#page=28).
* **Differentiëren**: Het vermogen om te ontwikkelen tot volwassen celtypen die de organen en weefsels van een organisme vormen [28](#page=28).
### 4.2 Totipotente stamcellen
Een stamcel wordt beschouwd als "totipotent" wanneer deze de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot een volledig organisme, inclusief de placenta. Dit vermogen is aanwezig in de allereerste delingsfasen van de bevruchte eicel. De bevruchte eicel deelt zich aanvankelijk, en elke cel kan zich verder delen [28](#page=28) [29](#page=29).
> **Tip**: De totipotente fase is kortstondig en beperkt tot de zeer vroege embryonale ontwikkeling.
### 4.3 Pluripotente stamcellen
Ongeveer vier dagen na bevruchting heeft de bevruchte eicel meerdere delingscycli doorlopen, resulterend in ongeveer 140 totipotente stamcellen die een holle bal vormen die bekend staat als de blastocyst. De cellen binnen deze holle bal vormen de binnenste celmassa. Wanneer de blastocyst zich in de baarmoeder nestelt, differentiëren de buitenste cellen van de blastocyst tot de cellen die de placenta vormen. De binnenste celmassa is niet langer totipotent, maar wordt pluripotent. Pluripotente stamcellen hebben de potentie om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen van het lichaam [29](#page=29).
> **Voorbeeld**: De binnenste celmassa van de blastocyst vertegenwoordigt een pluripotent stadium, omdat deze alle cellen van het foetus kan vormen, maar geen placenta.
### 4.4 Multipotente stamcellen
Naarmate de individuele cellen binnen de binnenste celmassa verder differentiëren, worden ze steeds meer gespecialiseerd. Multipotente stamcellen hebben het potentieel om zich te ontwikkelen tot een beperkt aantal verschillende celtypen, die meestal tot een specifieke weefsellijn behoren [30](#page=30).
> **Voorbeeld**: Hemopoëtische stamcellen zijn multipotent omdat ze zich kunnen ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde bloedcellen, zoals rode bloedcellen, bloedplaatjes en witte bloedcellen, maar ze zijn beperkt tot de ontwikkeling van bloedcellen [30](#page=30).
---
# Quality control and contamination in cell cultures
Kwaliteitscontrole is essentieel om de zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen te waarborgen, aangezien contaminatie met micro-organismen en vreemde cellen een significant probleem kan vormen [37](#page=37).
### 5.1 Contaminatie met micro-organismen
Micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels en met name antibiotica-resistente mycoplasma's kunnen celculturen contamineren. Mycoplasma's zijn parasieten die deels intracellulair leven en het cellulaire metabolisme verstoren, vaak door verzuring van het medium. Ze zijn moeilijk detecteerbaar met standaardmethoden en nog moeilijker te elimineren [37](#page=37).
#### 5.1.1 Detectie en eliminatie van mycoplasma's
Detectie van mycoplasma's kan plaatsvinden via methoden zoals cytoplasmatische DNA-kleuring, ELISA en PCR [37](#page=37).
#### 5.1.2 Effecten van mycoplasma contaminatie
Mycoplasma contaminatie kan diverse negatieve effecten hebben op eukaryote cellen, waaronder:
* Veranderde niveaus van eiwit-, RNA- en DNA-synthese [38](#page=38).
* Verandering in cellulair metabolisme [38](#page=38).
* Inductie van chromosomale aberraties (numeriek en structureel) [38](#page=38).
* Verandering in de samenstelling van het celmembraan, wat leidt tot expressieveranderingen van oppervlakteantigenen en receptoren [38](#page=38).
* Alteratie van de cellulaire morfologie [38](#page=38).
* Inductie of inhibitie van lymfocytenactivatie [38](#page=38).
* Inductie of suppressie van cytokinenexpressie [38](#page=38).
* Verhoogde of verlaagde viruspropagatie [38](#page=38).
* Interferentie met diverse biochemische en biologische assays [38](#page=38).
* Invloed op signaaltransductie [38](#page=38).
* Bevordering van cellulaire transformatie [38](#page=38).
* Alteratie van proliferatiekenmerken (groei, vitaliteit) [38](#page=38).
* Totale degeneratie en verlies van de celcultuur [38](#page=38).
Bij hybrideoma's kunnen specifieke effecten optreden, zoals inhibitie van cel Fusie, beïnvloeding van de selectie van fusieproducten, interferentie met screening van monoklonale antilichaamreactiviteit, productie van antilichamen tegen mycoplasma in plaats van het doelantigeen, en verminderde opbrengst van monoklonale antilichamen [38](#page=38).
### 5.2 Contaminatie met vreemde cellen
Vreemde cellen kunnen eveneens celculturen contamineren. Een significant deel van de 'oudere' cellijnen blijken varianten te zijn van HeLa, een humane cervix-tumorcellijn. Bovendien zijn veel zogenaamd 'menselijke' cellijnen daadwerkelijk van muizen of ratten afkomstig [37](#page=37).
#### 5.2.1 Detectie van vreemde celcontaminatie
Detectie van dergelijke contaminaties is mogelijk door middel van genetische fingerprinting en karyotypering [37](#page=37).
### 5.3 Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van celculturen
De (genetische) zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur kunnen worden gemeten door middel van karyotypering, waarbij het aantal en de vorm van de chromosomen in individuele cellen worden bepaald [39](#page=39).
> **Tip:** Karyotypering is een cruciale techniek om de genetische integriteit van celculturen te beoordelen [39](#page=39).
### 5.4 Inerente genetische instabiliteit
Cellen in cultuur vertonen vaak een evoluerende genetische instabiliteit, wat zich uit in veranderingen in het genotype, weerspiegeld door de chromosoomvorm en -aantal. Dit fenomeen is niet te vermijden, maar de beperking ervan is mogelijk door regelmatig terug te keren naar stock-cultures. Stock-cultures dienen ingevroren te worden met een anticristallijn cryoprotectief middel zoals glycerol of DMSO in vloeibare stikstof bij -196°C [40](#page=40).
---
# Toepassingen van fluorescentiemicroscopie en beeldvorming
Fluorescentiemicroscopie en beeldvorming bieden geavanceerde technieken voor het visualiseren van cellulaire structuren en dynamische processen met hoge specificiteit en resolutie.
### 6.1 Principes van epifluorescentiemicroscopie
Epifluorescentiemicroscopie is een standaardtechniek waarbij de excitatie- en emissiepaden van fluorescent licht gescheiden worden met behulp van dichroïsche spiegels en filters. Een klassieke opstelling maakt gebruik van een digitale registratiecamera, zonder directe oculaire observatie [81](#page=81).
#### 6.1.1 Gecombineerde beeldvormingstechnieken
Vaak worden verschillende fluorescentiekanalen gecombineerd om complexe structuren en processen in detail te bestuderen. Dit resulteert in overlay-beelden waarin morfologie, specifieke moleculen of organellen in verschillende kleuren zichtbaar worden gemaakt.
* **Voorbeeld:** Een typisch overlay-beeld kan morfologie (bv. met DIC - Nomarski) combineren met de kleuring van kernen (DNA) met een blauw fluorochroom en mitochondria met een rood fluochroom [82](#page=82).
* **Voorbeeld:** Driedubbele fluorescentie kan worden toegepast om endotheliale cellen van longarteriën te bestuderen, waarbij het cytoskelet (actine) groen, mitochondria rood, en DNA blauw wordt aangekleurd met specifieke fluorescerende reagentia [83](#page=83).
### 6.2 Confocale laser scanning microscopie (CLSM)
Confocale laser scanning microscopie (CLSM) is een geavanceerde techniek die optische secties van een monster mogelijk maakt, waardoor de resolutie en contrast verbeteren [84](#page=84).
#### 6.2.1 Werkingsprincipe van CLSM
Het principe van CLSM berust op het gebruik van een puntvormige lichtbron (laser) en een pinhole vóór de detector. De laserstraal scant het monster punt voor punt. Alleen het fluorescentielicht dat afkomstig is van het exacte focale vlak bereikt, na te zijn gefilterd door de pinhole, de detector (bv. een PMT - Photomultiplier Tube). Licht dat afkomstig is van boven of onder het focale vlak wordt door de pinhole effectief geblokkeerd, wat leidt tot een aanzienlijke reductie van achtergrondruis en een verbeterde axiale resolutie. De beeldvorming gebeurt door het scannen van het monster in 3 dimensies (XYZ) [84](#page=84).
* **Typische opstelling:** Een CLSM-opstelling omvat laserlichtbronnen, een elektronisch filter- en spiegelhuis voor het scheiden van de verschillende excitatie- en emissiegolflengtes, en de objectieflens [85](#page=85).
#### 6.2.2 Voordelen van Confocale Microscopie
Confocale microscopie biedt meerdere voordelen ten opzichte van conventionele fluorescentiemicroscopie:
* **Verbeterde resolutie:** Door het elimineren van out-of-focus licht wordt een scherpere en gedetailleerdere beeldvorming verkregen, met name in de axiale richting (#page=84, 85) [84](#page=84) [85](#page=85).
* **Optische secties:** De mogelijkheid om optische 'plakjes' te maken van het monster maakt 3D-reconstructies mogelijk [84](#page=84).
* **Analyse van dynamische processen:** Confocale microscopie is beter geschikt voor time-lapse studies van levende cellen en de analyse van dynamische biologische processen [87](#page=87).
#### 6.2.3 Vergelijking met Conventionele Microscopie en Deconvolutie
Hoewel confocale microscopie superieure axiale resolutie biedt, kunnen recente softwarematige bewerkingen, zoals deconvolutie-algoritmes, ook bij conventionele digitale beelden zeer aanvaardbare hoge resoluties opleveren. Echter, voor het analyseren van dynamische processen blijft confocale microscopie vaak de voorkeurstechniek [86](#page=86) [87](#page=87).
> **Tip:** Bij het interpreteren van driedubbele overlay-beelden is het cruciaal om de specifieke fluorochroom die aan elke structuur is gekoppeld, te kennen om misinterpretatie te voorkomen.
>
> **Tip:** Voor het bestuderen van dunne monsters of oppervlaktestructuren kan epifluorescentiemicroscopie met de juiste filters al zeer goede resultaten opleveren [81](#page=81).
>
> **Tip:** CLSM is uitermate geschikt voor het bestuderen van de lokalisatie van moleculen binnen cellen en weefsels, en voor het volgen van de beweging van organellen of vesicles [87](#page=87).
---
# Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie
Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie is een softwarematige bewerkingstechniek die wordt toegepast op conventionele digitale beelden om een hogere resolutie te verkrijgen [86](#page=86).
### 7.1 Principe van deconvolutie
Deconvolutie is een wiskundig proces dat wordt gebruikt om de oorspronkelijke afbeelding te herstellen door rekening te houden met het effect van de optische instelling van de microscoop op het signaal. In de microscopie wordt het beeld dat we waarnemen beïnvloed door de beperkingen van het optische systeem, zoals diffractie en verstrooiing van licht. Deze effecten worden samengevat in de zogenaamde "point spread function" (PSF). De deconvolutie-algoritmes proberen dit effect te ongedaan te maken door de waargenomen beelddata te 'delen' door de PSF, of een benadering daarvan, om zo een scherper en gedetailleerder beeld te verkrijgen [88](#page=88).
### 7.2 Vergelijking met confocale microscopie
Hoewel confocale microscopie traditioneel bekend staat om zijn vermogen om beelden met hoge resolutie te produceren, kunnen moderne deconvolutie-algoritmes toegepast op conventionele fluorescentiemicroscopen ook zeer aanvaardbare hoge resoluties opleveren. Deconvolutie is daarom een waardevolle techniek om de beeldkwaliteit te verbeteren wanneer confocale microscopie niet beschikbaar of niet de meest geschikte methode is [86](#page=86).
### 7.3 4D Live Cell Imaging
Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie is een essentieel onderdeel van geavanceerde beeldvormingstechnieken zoals 4D Live Cell Imaging. 4D Live Cell Imaging combineert de ruimtelijke dimensies (XYZ) met de tijdsdimensie (time lapse) en, indien van toepassing, de spectrale dimensie (verschillende golflengtes) [89](#page=89).
#### 7.3.1 3D multi-kleur imaging
Dit aspect van 4D imaging omvat het simultaan registreren van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies op meerdere posities [89](#page=89).
#### 7.3.2 Time lapse recording
Time lapse recording maakt het mogelijk om dynamische processen gedurende een bepaalde periode te volgen. Hierbij wordt op vaste tijdspunten telkens een 3D beeld genomen bij verschillende golflengtes. Deze beelden worden vervolgens geassembleerd tot een versnelde film (movie) [89](#page=89).
* **Voorbeeld van time lapse:** Een opnametijd van 2 uur, met opnames elke 60 seconden, kan worden afgespeeld met een speelsnelheid van 30 frames per seconde [89](#page=89).
* **Voorbeeld:** Muisfibroblasten worden opgenomen gedurende 8 uur met time lapse opnames elke 30 seconden, afgespeeld met 10 frames per seconde [91](#page=91).
### 7.4 Opstelling voor 4D Live Cell Imaging
Een typische opstelling voor 4D Live Cell Imaging omvat de volgende componenten:
* Een incubatiekamer die temperatuur en gasvoorziening reguleert [90](#page=90).
* Een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde voorwerptafel en objectieflens [90](#page=90).
* Een digitale camera voor beeldopname [90](#page=90).
* Een trillingsvrije tafel om bewegingsartefacten te minimaliseren [90](#page=90).
* Een joystick voor Z-focus en XY-positionering [90](#page=90).
* Lampvoeding en een computer voor controle en dataverwerking [90](#page=90).
---
# Verschillen tussen lichtmicroscopie en elektronenmicroscopie preparaten
Dit onderwerp behandelt de technieken en materialen die gebruikt worden voor het prepareren van monsters voor respectievelijk lichtmicroscopie (LM) en elektronenmicroscopie (EM), met de nadruk op de verschillen in snijtechnieken en inbedmiddelen.
### 8.1 Snijden van preparaten
Het snijden van preparaten voor microscopie is essentieel om dunne secties te verkrijgen die licht of elektronen kunnen doorlaten voor beeldvorming. De keuze van het inbedmateriaal en de snijtechniek is sterk afhankelijk van het type microscopie dat wordt toegepast [48](#page=48).
#### 8.1.1 Snijden voor lichtmicroscopie (LM)
Voor lichtmicroscopie worden preparaten doorgaans ingebed in paraffine. Dit materiaal is relatief zacht, waardoor coupes met een dikte van ongeveer 5 tot 10 micrometer ($µm$) kunnen worden verkregen. Paraffine wordt verwarmd tot ongeveer 55°C om te smelten en het weefsel te doordringen, waarbij de meeste epitopen behouden blijven, wat belangrijk is voor immuunhistochemie. Voor het snijden van paraffine-ingebed materiaal wordt een microtoom met een stalen mes gebruikt. De resulterende coupes worden op glazen draagglasjes geplaatst voor analyse [48](#page=48).
#### 8.1.2 Snijden voor elektronenmicroscopie (EM)
Elektronenmicroscopie vereist aanzienlijk dunnere coupes dan lichtmicroscopie, typisch rond de 70 nanometer (nm), om doorgang van elektronen mogelijk te maken. Hiervoor worden hardere inbedmiddelen zoals harsen en plastics gebruikt. Deze materialen ondergaan polymerisatie bij temperaturen van 60-65°C. Het snijden van deze harde materialen vereist gespecialiseerde microtomen uitgerust met glazen of diamanten messen. De coupes voor EM worden op metalen roosters, aangeduid als grids (vaak van koper of nikkel), geplaatst. Een nadeel van harsen en plastics is dat ze, in tegenstelling tot paraffine, vaak moeilijk uit het weefsel te verwijderen zijn, wat ze minder geschikt maakt voor immuunkleuringen [48](#page=48).
### 8.2 Principes van lichtmicroscopie
De resolutie van een lichtmicroscoop, gedefinieerd als de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven, wordt begrensd tot ongeveer 200 nm. Deze limiet wordt voornamelijk bepaald door de golflengte van zichtbaar licht en de kwaliteit van het objectief, niet door het oculair. De diameter van een gemiddelde dierlijke cel ligt tussen de 10 en 20 $µm$ [52](#page=52).
Celculturen kunnen vaak in hun geheel op dekglaasjes worden geanalyseerd. Dikker materiaal, zoals weefsels of orgaan-culturen, vereist snijden in secties na fixatie en inbedding (bijvoorbeeld in paraffine), of het gebruik van cryosecties van bevroren materiaal gevolgd door fixatie. Alternatief kunnen speciale microscopen worden ingezet [52](#page=52).
De effectieve resolutie wordt mede beïnvloed door de aard van het preparaat [52](#page=52):
* **Gefixeerde en gekleurde preparaten:** Deze worden vaak gekleurd met middelen zoals hemato-xyleine/eosine en geanalyseerd op basis van lichtabsorptie in een klaarveldmicroscoop (bright-field microscopy) [52](#page=52).
* **Levende cellen:** Deze bevatten doorgaans te weinig contrast voor standaard microscopie en vereisen speciale microscopische technieken voor observatie [52](#page=52).
#### 8.2.1 Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop
Het klassieke lichtmicroscoop (LM), ook wel klaarveldmicroscoop genoemd vanwege het gebruik van doorvallend wit licht, bestaat uit optische en fijnmechanische onderdelen. De optiek omvat drie hoofdsystemen: de condensor, het objectief en de oculairen [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55).
* **Condensor:** Bundelt het doorvallende licht op het preparaat. De belichting, bepaald door de condensor, beïnvloedt de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit, in samenwerking met het objectief [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55).
* **Lichtbron:** Produceert wit licht dat via een spiegel naar de condensor wordt geleid [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55).
* **Objectief:** Staat in nauwe (soms zeer nauwe) werkafstand tot het preparaat en vormt een vergroot beeld [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55).
* **Oculair:** Vergroot het beeld dat door het objectief is gevormd, waarna het op het netvlies van de waarnemer wordt geprojecteerd [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55).
* **Prisma:** Buigt de lichtweg om een comfortabele kijkpositie voor de onderzoeker mogelijk te maken [53](#page=53) [54](#page=54) [55](#page=55).
De microscoop kan, afhankelijk van de preparaatconditie en de gebruikte lenzen, gebruik maken van lucht, water of olie als medium tussen het objectief en het preparaat om de resolutie te verbeteren. De ontwikkeling van de lichtmicroscoop is aanzienlijk geweest, met mijlpalen zoals het gebruik door Robert Hooke in 1660, verbeteringen in de 19e en 20e eeuw, en de introductie van fluorescentie-, digitale en confocale technieken in de tweede helft van de 20e eeuw [51](#page=51) [54](#page=54).
---
# Staalbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
Staalbereiding voor TEM omvat een reeks kritische stappen om biologisch materiaal zo te prepareren dat het met voldoende resolutie en contrast kan worden geanalyseerd met een elektronenmicroscoop .
### 9.1 Algemene beginselen van TEM-analyse
TEM werkt met elektronen met een zeer korte golflengte, die buiten het bereik van het menselijk oog liggen. Beeldvorming ontstaat door de strooiing van elektronen op de atomen van het doorstraalde weefsel. Dichte structuren absorberen elektronen meer dan minder dichte structuren, wat resulteert in variaties in de doorgelaten elektronen. Biologisch materiaal vertoont van nature weinig densiteitsverschillen, wat de noodzaak voor contrastering benadrukt. De structuur die in TEM wordt waargenomen is een tweedimensionale projectie van de ultradunne sectie .
### 9.2 Stappen in de staalbereiding
#### 9.2.1 Fixatie
Het eerste cruciale proces is fixatie, waarbij biologische monsters (bijvoorbeeld weefselstukjes of losse cellen) worden behandeld met chemische stoffen zoals glutaaraldehyde. Fixatie dient om de fijne celstructuren zoveel mogelijk intact te houden en het materiaal doorlaatbaar te maken voor de componenten die in latere stappen nodig zijn .
#### 9.2.2 Spoeling en kleuring
Na fixatie en het uitspoelen van het fixatief, wordt het biologisch materiaal behandeld met verbindingen van zware metalen. Voorbeelden van deze 'kleurstoffen' zijn osmiumtetroxide, uranylacetaat en kaliumpermanganaat. Deze stoffen binden zich specifiek aan bepaalde celregio's, zoals lipiderijke membranen van organellen, DNA-clusters in de celkern en eiwitrijke structuren zoals cytoskelet-elementen. Zware metalen weerkaatsen elektronen, waardoor de gemerkte structuren in de elektronenmicroscoop donker verschijnen. Dit proces wordt 'kleuring' genoemd, hoewel het geen echte kleuren betreft in de optische zin. Het doel is het verhogen van de densiteitsverschillen om contrast te creëren. Osmiumtetroxide, gebruikt als tweede fixatief, draagt ook bij aan membraancontrast .
#### 9.2.3 Dehydratatie
Om extreem dunne coupes (60 tot 90 nanometer dik) te kunnen snijden die stabiel blijven en elektronen doorlaten, moeten de 'gekleurde' monsters eerst ontwaterd worden. Dit gebeurt door het materiaal stapsgewijs bloot te stellen aan ethanol- of acetonoplossingen met toenemende concentratie, omdat de meeste inbeddingsharsen hydrofoob zijn .
#### 9.2.4 Inbedding in hars
Na dehydratatie wordt het materiaal geleidelijk geïnfiltreerd met de nog niet gepolymeriseerde hars. Vervolgens wordt het hars-doordrongen materiaal in een houder geplaatst, bijvoorbeeld een gelatine capsule. Polymerisatie van de hars vindt plaats door middel van warmte (in een oven), magnetronstraling of katalyse met ultraviolet licht, wat resulteert in harde, snijbare blokjes materiaal .
#### 9.2.5 Trimming en ultradun snijden
Het maken van coupes met een dikte van ongeveer 70 nanometer vereist speciale messen, vervaardigd uit gekliefd glas of diamant, en wordt uitgevoerd met een ultramicrotoom .
#### 9.2.6 Opvangen van coupes
Water in een klein bakje achter het mes zorgt voor smering van het snijvlak en voor het opvangen van de coupes. De zeer fragiele coupes worden vervolgens vanaf het wateroppervlak op een metaalschijfje met een roosterpatroon, een zogenaamd gridje, 'opgeschept' .
### 9.3 Voorbeeld van TEM-analyse
Een voorbeeld van TEM-analyse toont een ultradunne sectie van typische dierlijke cellen, zoals twee secretorische pancreascellen in nauw contact. Op de beelden zijn structuren zichtbaar zoals de kern (N), mitochondriën (M), lysosomen (L), ruw endoplasmatisch reticulum (RER) en de dubbelbladige plasmamembranen (PM). De vergroting kan rond de 40.000 keer zijn, met insets tot wel 200.000 keer, wat de hoge resolutie van TEM-analyse illustreert .
> **Tip:** De 'kleuring' met zware metalen is essentieel voor contrastvorming in TEM, omdat biologisch materiaal zelf weinig variaties in elektronenabsorptie vertoont .
> **Voorbeeld:** De toepassing van osmiumtetroxide, zowel voor fixatie als voor contrast, is een veelgebruikte methode om celmembranen in TEM-beelden beter zichtbaar te maken .
---
# Celgroei en celtransfer in celcultuur
Celgroei en celtransfer zijn fundamentele processen in celcultuur die essentieel zijn voor het onderhouden van celpopulaties en het uitvoeren van experimenten.
### 10.1 Groeipatronen van cellen in cultuur
Cellen in cultuur vertonen verschillende groeipatronen, afhankelijk van hun aard en de omstandigheden.
#### 10.1.1 Contactinhibitie en confluente lagen
Normale cellen in cultuur groeien en delen totdat ze een confluente tweedimensionale (2D) monolaag vormen. Op dit punt treedt contactinhibitie op, wat betekent dat celproliferatie stopt. Dit wordt deels veroorzaakt door competitie om mitogenen. Om de celdeling te hervatten, kan vers medium worden toegevoegd [17](#page=17).
#### 10.1.2 Afwijkend groeiprofiel van tumorcellen
Tumorcellen kunnen daarentegen het vermogen tot contactinhibitie hebben verloren. Hierdoor kunnen ze door blijven groeien en zich ophopen in dense foci, zelfs in drie dimensies (3D). Dit resulteert in een niet-confluente, opeengehoopte groei in plaats van een nette monolaag [18](#page=18).
#### 10.1.3 Groei in 2D en 3D culturen
Het nabootsen van de in vivo omgeving kan worden bereikt door celgroei in zowel 2D als 3D culturen. Een voorbeeld hiervan zijn MDCK cellen, die epitheelcellen zijn. Ze kunnen groeien als een 2D cultuur op een filter, of in een omgeving met specifieke extracellulaire componenten kunnen ze cysten vormen, wat een 3D structuur nabootst. In deze omstandigheden organiseren eiwitten zich apicaal of basolateraal binnen de cel [19](#page=19).
### 10.2 Celtransfer procedure
Celtransfer, ook wel celdeling of uitplaten genoemd, is noodzakelijk om celculturen te behouden en te vermeerderen, vooral wanneer cellen confluency hebben bereikt [17](#page=17) [20](#page=20).
#### 10.2.1 Celtransfer van suspensiecultures
Voor suspensiecultures gebeurt celtransfer door eenvoudige verdunning met vers medium, eventueel na zacht centrifugeren en heropname van de cellen [20](#page=20).
#### 10.2.2 Celtransfer van adherente cellen
Bij adherente cellen vindt celtransfer plaats zodra de celmonolaag confluente is, doorgaans elke 3 tot 7 dagen. Dit proces omvat de volgende stappen [20](#page=20):
1. **Behandeling met Trypsine/EDTA (TE):** De celcultuur wordt behandeld met een oplossing van trypsine en EDTA [20](#page=20).
* **Trypsine:** Dit is een maagprotease dat bij korte blootstelling de oppervlakte-eiwitten van de cellen degradeert [20](#page=20).
* **EDTA (ethyleendiaminetetraäcetaat):** EDTA cheleert calcium en magnesium ionen. Deze ionen zijn essentieel voor intercellulaire adhesie en de binding van cellen aan het substraat. Door de chelatiie wordt deze adhesie verstoord [20](#page=20).
2. **Losmaken van cellen:** Door de actie van trypsine en EDTA komen de cellen los van het substraat en van elkaar. Ze vormen een suspensie van levende, opgebolde cellen. Het is ideaal als deze suspensie monoccellaire cellen bevat, zonder meercellige aggregaten [20](#page=20).
3. **Verdunning (uitplaten):** De cel suspensie wordt vervolgens verdund. Voor 'normale' cellen is dit typisch een verdunning van 1 over 3, terwijl tumorcellen, die sneller delen, vaker worden verdund, bijvoorbeeld 1 over 30. De verdunde cellen worden uitgezaaid in nieuwe recipiënten [20](#page=20).
4. **Inhibitie van trypsine:** Overgebleven trypsine wordt geïnhibeerd, vaak door natuurlijk aanwezige protease-inhibitoren in het serum van het medium [20](#page=20).
> **Tip:** Het werken met cellen, inclusief celtransfer, moet plaatsvinden in een steriele omgeving zoals een laminaire flowbank om contaminatie te voorkomen [21](#page=21).
### 10.3 Celadhesie en -spreiding
Nadat cellen zijn losgemaakt en opnieuw zijn uitgeplaat, ondergaan ze een proces van adhesie en spreiding op het nieuwe substraat [22](#page=22).
#### 10.3.1 Stappen bij celadhesie en -spreiding
Dit proces omvat de volgende stappen:
1. **Uitzakken door gravitatie:** De cellen zakken aanvankelijk uit onder invloed van zwaartekracht [22](#page=22).
2. **Initieel contact met substraat:** De cellen maken minimaal contact met het substraat, aangezien ze nog opgebold zijn [22](#page=22).
3. **Progressieve spreiding:** In de uren daarna ondergaan de cellen een proces van progressieve spreiding over het substraat. Dit vereist energie en veranderingen in het cytoskelet. Dit leidt tot een groter celcontactoppervlak en een versterkte binding aan het substraat [22](#page=22).
4. **Sterke binding en substraatmodificatie:** Uiteindelijk vormen de cellen een sterke binding met het substraat door dit zelf te modificeren met door hen aangemaakte extracellulaire matrix (ECM) moleculen [22](#page=22).
Ondanks deze sterke adhesie kunnen cellen doorgaans, zij het langzaam, migreren over het celoppervlak. Dit gebeurt door tijdelijke en focale inhibitie van celadhesie op de plek waar de cel loskomt, en gelijktijdige opbouw van adhesie in de richting van migratie [22](#page=22).
---
# Histologische technieken voor microscopisch onderzoek
Histologische technieken zijn essentieel om cellen en weefsels observeerbaar te maken onder een microscoop, door ze voldoende dun te snijden en contrast te verhogen [42](#page=42).
### 11.1 Doel van histologische technieken
Het doel van histologische technieken is het prepareren van cellen en weefsels zodanig dat ze doorlaatbaar worden voor licht (lichtmicroscopie, LM) of elektronen (elektronenmicroscopie, EM) en dat er voldoende contrast is om structuurdetails waar te nemen. Biologisch materiaal is van nature vaak te dik en heeft te weinig contrast voor directe microscopische observatie [42](#page=42).
### 11.2 Algemeen principe
De algemene stappen in histologische preparatie omvatten:
* Fixeren
* Inbedden en snijden
* Kleuren of contrasteren
Deze stappen zorgen ervoor dat weefsels dun genoeg worden gesneden en dat er contrast wordt aangebracht [42](#page=42).
### 11.3 Fixeren
Fixatie is noodzakelijk om afbraakprocessen in weefsels tegen te gaan na het wegnemen uit de in vivo situatie. Dit gebeurt door denaturatie van eiwitten, waardoor de activiteit van afbraakenzymen wordt gestopt en de structurele componenten behouden blijven [45](#page=45).
#### 11.3.1 Fixatiemethoden
* **Chemische fixatieven:**
* Formol (voor LM) [45](#page=45).
* Glutaraldehyde (voor EM) [45](#page=45).
* Osmiumtetroxide (OSO4) [45](#page=45).
Deze fixatieven werken door eiwitten te cross-linken (bv. formaldehyde, glutaraldehyde) of te laten neerslaan (precipiteren) (bv. met alcohol of aceton). Chemische fixatieven resulteren over het algemeen in een betere morfologie [45](#page=45).
* **Invriezen (koudefixatie):**
Dit laat snel doorwerken van materiaal toe en bewaart epitopen beter voor immuunkleuringen. Koudefixatie wordt veel gebruikt in pathologielaboratoria voor snelle diagnoses [45](#page=45).
#### 11.3.2 Artefacten
Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in vivo situatie worden artefacten genoemd. Dit kan een structuurverandering zijn (bv. een holte rond kraakbeencellen) of het op een andere plaats voorkomen van componenten (bv. glycogeendrift in een leverpreparaat) [45](#page=45).
### 11.4 Inbedden
Inbedden is het omwikkelen en doordringen van het gefixeerde materiaal met een substantie die het weefsel hard maakt, zodat het snijdbaar wordt in dunne plakken (coupes). Deze inbedmiddelen zijn meestal hydrofoob [46](#page=46).
#### 11.4.1 Ontwateren en clearing
Omdat biologisch materiaal veel water bevat (tot 60%), moet dit eerst verwijderd worden voordat hydrofobe inbedmiddelen kunnen binnendringen. Dit gebeurt door het weefsel te ontwateren in een oplopende reeks alcoholbaden (30%, 50%, 70%, 90% & absolute ethanol). Vervolgens wordt 'clearing' uitgevoerd met tolueen, dat mengbaar is met zowel alcohol als het inbedmiddel [47](#page=47).
#### 11.4.2 Inbedmiddelen
* **Paraffine:** Een klassiek inbedmiddel voor LM. Het is relatief zacht en wordt gesmolten op ongeveer 55°C. Een groot aantal epitopen blijft bij deze temperatuur bewaard [48](#page=48).
* **Harsen en plastics:** Hardere inbedmiddelen die coupes tot 60-70 nm mogelijk maken, geschikt voor EM. Polymerisatie gebeurt bij 60-65°C. Deze middelen zijn minder geschikt voor immuunkleuringen omdat ze moeilijk uit het weefsel te verwijderen zijn [48](#page=48).
### 11.5 Snijden
Het ingebedde, harde materiaal wordt gesneden in dunne plakken (coupes) met een microtoom [48](#page=48).
#### 11.5.1 Dikte van coupes
* **Paraffine:** 5-10 µm dikte, doorlaatbaar voor licht (LM) [48](#page=48).
* **Hars, plastics:** 70 nm dikte, doorlaatbaar voor elektronen (EM) [48](#page=48).
#### 11.5.2 Apparatuur en plaatsing
* **Microtoom:**
* Voor LM: uitgerust met stalen messen [48](#page=48).
* Voor EM: uitgerust met glazen of diamanten messen [48](#page=48).
* **Plaatsing van coupes:**
* LM: coupes worden op glazen draag glaasjes aangebracht [48](#page=48).
* EM: coupes worden op metalen (Cu, Ni) roostertjes (grids) geplaatst [48](#page=48).
### 11.6 Kleuren en contrasteren
Hoewel niet gedetailleerd besproken in de verstrekte pagina's, wordt het kleuren of contrasteren van secties genoemd als een finale stap om structuurdetails zichtbaar te maken voor microscopisch onderzoek. Een voorbeeld hiervan is H/E gekleurde secties [42](#page=42) [44](#page=44).
> **Tip:** Het is cruciaal om te begrijpen dat elke stap in dit proces, van fixatie tot het snijden, potentiële artefacten kan introduceren die de waarneming kunnen beïnvloeden [45](#page=45).
> **Voorbeeld:** Een carcinoom in het colon kan gepresenteerd worden als een weefselsectie met grote wanorde in de onderste delen van het beeld na preparatie [44](#page=44).
---
# Histologische kleurtechnieken en hun toepassingen
Histologische kleurtechnieken zijn essentieel voor het visualiseren van weefselstructuren en celcomponenten in microscopische preparaten, waardoor gedetailleerde diagnostiek en onderzoek mogelijk worden [65](#page=65).
### 12.1 Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E)
De hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) is een fundamentele techniek die al meer dan een eeuw wordt gebruikt en cruciaal is voor weefselidentificatie en het herkennen van morfologische veranderingen, met name in de kankerdiagnose [65](#page=65).
#### 12.1.1 Principes van H&E kleuring
* **Hematoxyline:** Dit kleurt nucleïnezuren diep blauw-paars aan via een complex en nog niet volledig begrepen mechanisme. Het toont voornamelijk de kernen van cellen [65](#page=65).
* **Eosine:** Dit is een roze kleurstof die niet-specifiek eiwitten aankleurt. Het kleurt het cytoplasma en de extracellulaire matrix roze [65](#page=65).
#### 12.1.2 Diagnostische relevantie van H&E
* **Nucleaire details:** Goed gefixeerde cellen vertonen significante intranucleaire details met H&E kleuring [65](#page=65).
* **Heterochromatine condensatie:** Verschillende patronen van heterochromatine condensatie (hematoxyline-kleuring) in de kernen zijn diagnostisch belangrijk voor cel- en kankertypes [65](#page=65).
* **Nucleoli:** Nucleoli worden gekleurd met eosine [65](#page=65).
* **Cytoplasmatische kenmerken:** Een duidelijke blauwe gloed in het cytoplasma duidt op de aanwezigheid van overvloedige polyribosomen. De Golgi-zone kan worden geïdentificeerd als een ongekleurd gebied naast de kern [65](#page=65).
#### 12.1.3 Beperkingen en toepassingen van H&E
* **Onverenigbaarheid met immunofluorescentie:** Hematoxylinekleuring is onverenigbaar met immunofluorescentie [65](#page=65).
* **Tegenkleuring:** Hematoxyline, vaak zonder eosine, is nuttig als tegenkleuring voor immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken (zoals alkalische fosfatase of peroxidase) [66](#page=66).
### 12.2 Specifieke kleurtechnieken
Naast H&E worden diverse specifieke kleurtechnieken gebruikt om bepaalde celcomponenten of structuren aan te kleuren [68](#page=68).
#### 12.2.1 Indifferente kleurstoffen
Deze kleurstoffen kleuren voornamelijk vetten aan. Een voorbeeld hiervan is Oil Red O, dat gebruikt wordt om vetcellen aan te kleuren [68](#page=68) [69](#page=69).
#### 12.2.2 Immunohistochemische kleuring
Immunohistochemische kleuringen maken gebruik van antigen-antilichaambinding om specifieke bestanddelen aan te kleuren. Het antilichaam wordt hierbij voorzien van een kleurstof, een fluorescente label, of colloïdaal goud [68](#page=68).
> **Voorbeeld:** Immunocytochemische kleuring met DAB kan specifiek microtubuli of connexine 43 op coupes van muishart aankleuren [70](#page=70).
#### 12.2.3 Enzymkleuringen
Enzymkleuringen demonstreren de activiteit van specifieke enzymen door gebruik te maken van een enzymspecifiek substraat. De reactie leidt tot de vorming van een waarneembare neerslag [68](#page=68).
> **Voorbeeld:** G6PD kleuring met behulp van de tetrazoniumzoutmethode kan de activiteit van glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) in erytrocyten aantonen. Dit maakt het mogelijk om G6PD-bevattende erytrocyten te onderscheiden van G6PD-deficiënte erytrocyten. De figuur toont erytrocyten van een gezonde persoon (A), een persoon met homozygote G6PD-deficiëntie (B), en een persoon met heterozygote G6PD-deficiëntie (C) [71](#page=71).
---
# Mucoviscidose en de rol van CFTR eiwit
Mucoviscidose, ook wel cystische fibrose of taaislijmziekte genoemd, is een genetische aandoening die wordt gekenmerkt door de productie van taai en visceus slijm. Dit leidt tot veranderingen in de samenstelling van secretieproducten van diverse klieren, waaronder de pancreas en zweetklieren, en de bronchi. De ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het CFTR-gen op chromosoom 7, wat resulteert in een verstoorde productie van het CFTR-eiwit (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Dit eiwit speelt een cruciale rol in het transport van chloride-ionen door het celmembraan [93](#page=93).
### 13.1 Het CFTR eiwit en zijn functie
Het CFTR-eiwit is een ionenkanaal dat zich bevindt in het celmembraan en verantwoordelijk is voor het transport van chloride-ionen. Bij gezonde individuen (wild type) wordt het CFTR-eiwit naar het apicale membraan getransporteerd via het Golgi-netwerk. Bij patiënten met mucoviscidose, met name door de meest voorkomende mutatie die een deletie van een aminozuur op positie 508 van het CFTR-eiwit veroorzaakt, wordt het eiwit echter vastgehouden in het endoplasmatisch reticulum (ER) en vervolgens afgebroken. Dit fenomeen staat bekend als subcellulaire mislocalisatie [93](#page=93).
### 13.2 Diagnose en detectie van CFTR
De detectie van het CFTR-eiwit op weefselcoupes kan plaatsvinden middels immunohistochemie. Hierbij worden verschillende antilichamen gebruikt die zowel het wild type als de mutante vormen van het CFTR-eiwit moeten kunnen herkennen [93](#page=93).
#### 13.2.1 Immunohistochemie van CFTR in bronchiaal epitheel en zweetklieren
Onderzoek met immunohistochemie heeft de aanwezigheid van CFTR in het bronchiaal epitheel van gezonde controles aangetoond. Vergelijkingen tussen gezonde controles en patiënten met cystische fibrose in de huid (zweetklieren) lieten eveneens de toepassing van immunohistochemie zien voor het lokaliseren van CFTR [94](#page=94) [95](#page=95).
### 13.3 Elektronenmicroscopie (EM) als diagnostische techniek
Elektronenmicroscopie (EM) is een techniek die structuren zichtbaar kan maken tot op een grootte van 1 nanometer (nm). Dit is significant kleiner dan wat met een lichtmicroscoop mogelijk is, aangezien de golflengte van zichtbaar licht (400-800 nm) beperkingen oplegt aan de resolutie. EM maakt gebruik van een elektronenbundel in plaats van licht [98](#page=98) [99](#page=99).
#### 13.3.1 Principes van elektronenmicroscopie
Bij transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt een elektronenbundel door een ultradun preparaat gestuurd, waarbij de verstrooiing van elektronen op zware atoomkernen de beeldvorming veroorzaakt (#page=98, 99). Elektromagnetische magneten dienen als lenzen om de elektronenbundel te focussen. TEM heeft een resolutie van ongeveer 1 nm en is gebaseerd op elektronenverstrooiing. Beeldvorming gebeurt op een fluorescerend scherm [98](#page=98) [99](#page=99).
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) scant het oppervlak van het preparaat met een elektronenbundel. Hierbij treden terugkaatsing van elektronen en generatie van secundaire elektronen op, die worden gedetecteerd om een driedimensionaal beeld te creëren (#page=98, 99, 100). Het preparaat hoeft bij SEM niet ultradun te zijn, maar moet wel gecoat worden met een zwaar metaal [100](#page=100) [98](#page=98) [99](#page=99).
#### 13.3.2 Technische vereisten en preparatie voor EM
Het werken met elektronen vereist een hoog vacuüm om interactie met gasmoleculen te voorkomen. Daarnaast is hoogspanning nodig om de elektronen snelheid te geven, en worden elektrische en magnetische velden gebruikt als lenzen .
De fixatie- en kleuringstechnieken moeten worden aangepast aan de vereisten van vacuümtechnologie en de elektronenbundel. Dit omvat technieken zoals negatieve kleuring, waarbij virusdeeltjes de exclusie van een zwaar metaal vertonen, wat resulteert in een witte weergave tegen een donkere achtergrond (#page=102, 103). Een ander voorbeeld is 'shadowing' of 'rotary shadowing', waarbij het preparaat onder een schuine hoek wordt bestoven met een metaal zoals platina of goud (#page=102, 104, 105, 106) .
Voor TEM zijn ultradunne secties (50-100 nm) nodig, verkregen na fixatie met glutaaraldehyde en osmiumtetroxide, gevolgd door kleuring met uraniumacetaat en lood. Onbehandeld biologisch materiaal geeft weinig contrast in een TEM; zware metalen binden zich aan specifieke structuren en verschijnen donker, terwijl structuren met minder affiniteit lichter worden weergegeven .
#### 13.3.3 Voorbeelden van TEM-analyse
TEM-analyse kan worden toegepast op diverse biologische structuren:
* **Negatieve kleuring:** Zo is het corona virus geanalyseerd met deze techniek .
* **Shadow casting:** Plantenvirussen zijn gevisualiseerd door schuine bestuiving met chroom. Nucleïnezuren kunnen worden gevisualiseerd door rotary shadowing .
* **Metaalbestuiving:** Collageenvezels zijn geanalyseerd door bestuiving met platinum, waarbij het karakteristieke repetitiepatroon zichtbaar werd. Polioviirus partikels zijn eveneens geanalyseerd middels bestuiving met platinum .
> **Tip:** Het begrijpen van de principes achter elektronenmicroscopie is cruciaal voor het interpreteren van structurele informatie op subcellulair niveau, wat relevant kan zijn voor het bestuderen van eiwitmisvouwing en -lokalisatie bij genetische ziekten zoals mucoviscidose.
---
# Principes van lichtmicroscopietechnieken
Lichtmicroscopietechnieken maken gebruik van zichtbaar licht en lenzen om structuren te vergroten en zichtbaar te maken, waarbij verschillende methoden worden ingezet om contrast te genereren, met name bij levende of ongekleurde preparaten.
### 14.1 Contrastverhoging in lichtmicroscopie
Contrast in lichtmicroscopie is essentieel omdat veel biologische structuren, vooral levende cellen, transparant zijn en nauwelijks zichtbaar onder een standaard klaarveldmicroscoop. Er zijn twee hoofdmanieren om contrast te verhogen: histologische kleuring en het benutten van optische dichtheidsverschillen [60](#page=60).
#### 14.1.1 Histologische kleuring
Histologische kleuring maakt gebruik van kleurstoffen die specifieke componenten van het weefsel aankleuren. Deze kleurstoffen absorberen bepaalde golflengtes van het invallende licht, wat resulteert in kleurvorming. De kleuring is niet willekeurig, maar berust op chemische verschillen binnen het weefsel. Ionische binding, een elektrostatische aantrekking tussen tegengesteld geladen deeltjes, is het dominante bindingsmechanisme bij histologische kleuring [60](#page=60) [64](#page=64).
##### 14.1.1.1 Hematoxyline en Eosine (H&E)-kleuring
Hematoxyline en eosine (H&E) is een veelgebruikte routinekleuring in de histologie [64](#page=64).
* **Hematoxyline:** Technisch gezien geen kleurstof op zichzelf, hematoxyline vereist een beitsmiddel, meestal een metaalkation zoals aluminium, om zich aan het weefsel te hechten. In complex met aluminiumzouten wordt hematoxyline kationisch en werkt het als een basische kleurstof. Het is positief geladen en bindt zich aan negatief geladen, basofiele celcomponenten, zoals nucleïnezuren in de celkern, wat resulteert in een blauwe of donkerpaarse kleur. Het kleurt voornamelijk nucleïnezuren door een complex mechanisme [64](#page=64) [65](#page=65).
* **Eosine:** Eosine is anionisch en werkt als een zure kleurstof. Het is negatief geladen en bindt zich aan positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals de aminogroepen van eiwitten in het cytoplasma, wat resulteert in een roze kleur. Eosine kleurt niet-specifiek eiwitten aan [64](#page=64) [65](#page=65).
H&E-kleuring is cruciaal voor het identificeren van verschillende weefseltypes en morfologische veranderingen die relevant zijn voor diagnostiek, zoals kankerdiagnose. Het toont cytoplasmatische, nucleaire en extracellulaire matrixkenmerken. Kertalen vertonen details zoals condensatiepatronen van heterochromatine die diagnostisch van belang zijn. Nucleoli worden aangekleurd met eosine. Overvloedige polyribosomen kunnen een blauwe gloed in het cytoplasma veroorzaken. De Golgi-zone kan worden geïdentificeerd door de afwezigheid van kleuring naast de kern. Een beperking van hematoxyline is dat het onverenigbaar is met immunofluorescentie. Hematoxyline (vaak zonder eosine) kan echter nuttig zijn als tegenkleuring in immunohistochemische of hybridisatieprocedures die colorimetrische substraten gebruiken [65](#page=65) [66](#page=66).
##### 14.1.1.2 Periodic Acid Schiff (PAS)-kleuring
PAS-kleuring kleurt vrije suikers aan. Dit wordt bijvoorbeeld gebruikt om het intervilleuze slijm in de darm aan te kleuren, dat door de slijmbekercellen wordt gesecreteerd, evenals de microvilli [57](#page=57).
#### 14.1.2 Technieken voor ongekleurde preparaten
Voor levende of ongekleurde preparaten, die anders transparant zouden zijn, worden speciale technieken toegepast die gebruikmaken van verschillen in brekingsindex en optische dichtheid om contrast te genereren [59](#page=59) [60](#page=60).
##### 14.1.2.1 Fasecontrastmicroscopie
Fasecontrastmicroscopie, uitgevonden door Zernike, benut kleine faseverschuivingen in licht die ontstaan door kleine brekingsverschillen in het preparaat. Deze faseverschuivingen worden omgezet in amplitudeveranderingen (licht en donker), waardoor zichtbaar contrast ontstaat. Deze techniek is ideaal voor het observeren van ongekleurde preparaten zoals gekweekte levende cellen of vriescoupes van ongefixeerd weefsel. De optische weg in een fasecontrastmicroscoop verschilt van een klaarveldmicroscoop doordat er speciale componenten zijn die de faseverschuiving manipuleren [59](#page=59) [60](#page=60) [61](#page=61).
##### 14.1.2.2 Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) Microscopie
DIC-microscopie, ook bekend als Nomarski-microscopie, maakt gebruik van de interferentie van doorvallend gepolariseerd licht om verschillen in het preparaat te detecteren. Het vereist gespecialiseerde prisma's en interferentiefilters in de microscoop. Net als fasecontrastmicroscopie, creëert DIC een zwart-wit beeld door de faseverschuivingen te herleiden tot amplitudeveranderingen [59](#page=59) [60](#page=60).
##### 14.1.2.3 Digitale Microscopie
Digitale microscopie maakt gebruik van ultragevoelige videocamera's en computerverwerking van beelden. Deze techniek is dynamisch en maakt zowel real-time als time-lapse opnamen mogelijk [59](#page=59).
> **Tip:** Fasecontrast- en DIC-microscopie zijn essentieel voor het bestuderen van levende, ongekleurde cellen en weefsels, omdat ze structuren zichtbaar maken zonder de cel te beschadigen met kleurstoffen [59](#page=59).
### 14.2 Voorbeelden van lichtmicroscopische analyse
* **Kleuring van darmvillus:** Met PAS-kleuring wordt intervilleus slijm en microvilli aangekleurd. Met hematoxyline worden celkernen, lymfocyten en fibroblasten aangekleurd. De basaalmembraan kan ook zichtbaar worden gemaakt [57](#page=57).
* **Kleuring van dunne darm (muis):** Met H&E-kleuring worden de verschillende lagen van de dunne darm, zoals de villi, lamina propria, submucosa en crypten, zichtbaar gemaakt. Slijmbekercellen zijn ook herkenbaar [58](#page=58).
> **Voorbeeld:** In een H&E-gekleurde coupe van de dunne darm, zullen de celkernen van de enterocyten die de villi bekleden donkerblauw/paars kleuren (door hematoxyline), terwijl het cytoplasma roze zal zijn (door eosine) [57](#page=57) [58](#page=58) [64](#page=64).
---
# Principes en toepassingen van fluorescentiemicroscopie
Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende kleurstoffen (fluorochromen) om specifieke moleculen in biologische monsters te visualiseren, detecteren en kwantificeren [72](#page=72).
### 15.1 Fundamentele principes van fluorescentie
Fluorescentiemicroscopie berust op het principe dat een fluorofoor, na absorptie van fotonen met een bepaalde golflengte (excitatie), fotonen uitzendt met een langere golflengte (emissie). De absorptiestraling wordt doorgelaten door een excitatiefilter, terwijl een barrièrefilter de emissiestraling tegenhoudt; er is idealiter geen overlap tussen deze filters [73](#page=73).
#### 15.1.1 Het proces van fluorescentie
1. **Excitatie:** Licht van een specifieke golflengte, afkomstig van een exciterende lichtbron (bijvoorbeeld een kwikdamplamp, LED of laser), wordt gebruikt om de fluorochroom te exciteren (#page=72, 74) [72](#page=72) [74](#page=74).
2. **Absorptie:** De fluorochroom absorbeert de fotonen en gaat over naar een hogere energietoestand.
3. **Emissie:** Vanuit de geëxciteerde toestand keert de fluorochroom terug naar zijn grondtoestand, waarbij hij fotonen uitzendt als fluorescentie. De golflengte van de geëmitteerde fotonen is altijd groter dan of gelijk aan die van de geabsorbeerde fotonen [73](#page=73).
#### 15.1.2 Epifluorescentiemicroscopie opstelling
Een typische epifluorescentiemicroscoop bestaat uit de volgende componenten [74](#page=74):
1. **Excitatiebron:** Vaak een kwikdamplamp (Hg) of xenonlamp (Xe). Moderne systemen kunnen ook lasers gebruiken, met name voor confocale microscopie [72](#page=72) [74](#page=74).
2. **Golflengtefilters in een filterkubus:**
* **Excitatiefilter:** Selecteert de golflengte van het excitatielicht.
* **Dichroïsche spiegel (beamsplitter):** Reflecteert het excitatielicht naar het preparaat en laat het emissielicht door naar de detector.
* **Emissiefilter (stopfilter):** Blokkeert het resterende excitatielicht en laat de fluorescentie van de fluorochroom door naar de detector.
3. **Detector:** Kan het menselijk oog zijn, of een camera (digitaal/analoog) voor beeldregistratie [74](#page=74).
#### 15.1.3 Fluorochromen en hun spectra
Het excitatie- en emissiespectrum van een fluorofoor, zoals fluoresceïne (of Alexa 488), beschrijft bij welke golflengtes het licht absorbeert en bij welke golflengtes het licht uitzendt (#page=73, 74). Een voorbeeld is Alexa 488, met een excitatiepiek rond 488 nm en een emissiepiek rond 519 nm [73](#page=73) [74](#page=74).
> **Tip:** Het begrijpen van de excitatie- en emissiespectra is cruciaal voor het selecteren van de juiste filters en fluorochromen om signaal-ruisverhouding te optimaliseren en crossover tussen verschillende fluorochromen te minimaliseren.
### 15.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie
Fluorescentiemicroscopie is een veelzijdige techniek die gebruikt kan worden om moleculen in levende en gefixeerde cellen en weefsels aan te kleuren, te visualiseren en te kwantificeren.
#### 15.2.1 Detectie van ionen
* **Ion-gevoelige kleurstoffen:** Deze fluorochromen veranderen hun fluorescentie-eigenschappen (intensiteit of spectrum) in reactie op de concentratie van specifieke ionen, zoals calcium. Fura-2 is een voorbeeld van een calcium-gevoelige kleurstof die gebruikt wordt om intracellulaire calciumconcentraties te meten en cellulaire responsen te bestuderen [75](#page=75).
> **Example:** Door Fura-2 te gebruiken, kan men veranderingen in intracellulaire $\text{Ca}^{2+}$ concentratie visualiseren in respons op stimuli, zoals zichtbaar in de afbeeldingen van bewegende cellen waar groene gebieden de hoogste $\text{Ca}^{2+}$ concentratie aangeven [75](#page=75).
#### 15.2.2 Immunofluorescentie microscopie
Bij immunofluorescentie worden specifieke eiwitten gedetecteerd met behulp van antilichamen waaraan een fluorochroom is gekoppeld (geconjugeerd). Dit maakt het mogelijk om de lokalisatie en distributie van specifieke eiwitten in cellen en weefsels nauwkeurig te bepalen [75](#page=75) [77](#page=77).
#### 15.2.3 Fluorescente eiwit tagging
Eiwitten kunnen genetisch gemodificeerd worden om ze te laten coderen voor fluorescente eiwitten (bv. Green Fluorescent Protein - GFP, Blue Fluorescent Protein - BFP, Yellow Fluorescent Protein - YFP) (#page=75, 80). Hierdoor kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden gevolgd en bestudeerd, wat inzicht geeft in hun dynamiek, lokalisatie en interacties [75](#page=75) [80](#page=80).
> **Example:** Het inbouwen van genen voor Blue Fluorescent Protein en Yellow Fluorescent Protein in embryonale stamcellen resulteert in blauw en groen fluorescerende embryo's, die gebruikt kunnen worden om vroege en late ontwikkelingsstadia te bestuderen [79](#page=79).
#### 15.2.4 Visualisatie van organellen
Fluorescentiemicroscopie kan gebruikt worden om specifieke organellen, zoals lysosomen en mitochondria, te labelen en te visualiseren in gecultiveerde cellen [76](#page=76).
#### 15.2.5 Analyse van eiwitlokalisatie en colocalisatie
Het is mogelijk om meerdere eiwitten tegelijkertijd aan te kleuren met verschillende fluorochromen. Dit maakt het mogelijk om de interactie en de ruimtelijke relatie tussen verschillende moleculen binnen een cel te onderzoeken (#page=78, 79) [78](#page=78) [79](#page=79).
> **Example:** Dubbele fluorescentie kan worden gebruikt om cytoskelet-kabels (actine in groen) en 'voetjes' (vinculine in rood) tegelijkertijd aan te kleuren. Dit toont de colocalisatie van deze structuren aan, wat belangrijk is voor het begrijpen van celadhesie en beweging [79](#page=79).
#### 15.2.6 Combinatie met andere microscopietechnieken
Fluorescentiemicroscopie kan worden gecombineerd met andere beeldvormingstechnieken, zoals Differential Interference Contrast (DIC) of Nomarski microscopie, om morfologische informatie te integreren met de fluorescentiedata. Dit leidt tot rijke, gecombineerde beelden die een completer beeld geven van de celstructuur en -functie [82](#page=82).
> **Example:** Een driedubbele overlay kan morfologie (met DIC-Nomarski), kernen (DNA met blauw fluorochroom) en mitochondria (met rood fluochroom) combineren in één beeld, wat een gedetailleerde analyse van de celstructuur en componenten mogelijk maakt [82](#page=82).
#### 15.2.7 Verschillende soorten fluorescente eiwitten
Er bestaat een breed scala aan fluorescente eiwitten die verschillen in hun emissie- en excitatiegolflengtes, wat flexibiliteit biedt bij het ontwerpen van multiplexing experimenten [80](#page=80).
#### 15.2.8 Beeldregistratie
Moderne epifluorescentiemicroscopen maken vaak gebruik van digitale camera's voor beeldregistratie, zonder noodzakelijkerwijs oculairs te gebruiken, wat efficiënte dataverzameling en analyse mogelijk maakt. Gekleurde beelden worden vaak opgeslagen als 24-bit beelden, waarbij de individuele kleurkanalen (bv. blauw, rood) als 8-bit beelden worden geregistreerd [81](#page=81) [82](#page=82).
---
# Geavanceerde microscopische technieken voor volumetrische analyse
Dit onderwerp richt zich op de methoden en technieken die worden gebruikt om cellen en weefsels te prepareren en te observeren voor microscopische analyse, met name met betrekking tot het verkrijgen van driedimensionale (volumetrische) informatie [42](#page=42) [7](#page=7).
### 16.1 Principes van celpreparatie voor observatie
Het doel van preparatie is om cellen en weefsels zichtbaar te maken onder een lichtmicroscoop (LM) of elektronenmicroscoop (EM). Biologisch materiaal heeft van nature weinig lichtdoorlatendheid en contrast, wat de observatie bemoeilijkt. De belangrijkste methoden die hierbij worden toegepast zijn fixeren, inbedden en snijden, en kleuren of contrasteren [42](#page=42) [7](#page=7).
#### 16.1.1 Celcultuur als preparatiemethode
Celcultuurtechnieken, die historisch teruggaan tot 1907 met 'tissue culture' (TC) maken het mogelijk om cellen in vitro te bestuderen [8](#page=8).
* **2D monolaagcultures:** Deze simuleren organen/weefsels, hoewel echte 3D-culturen uitzonderlijk zijn. Ze zijn ontwikkeld uit orgaanexplanten (primaire cultures) en later uit stabiele, geïmmortaliseerde cellijnen, die van tumorale oorsprong kunnen zijn of verkregen na 'crisis' selectie [8](#page=8).
* **Cellijnen:** Meestal wordt gewerkt met stabiele cellijnen, hoewel deze na passages kunnen veranderen. Immortalisatie kan ook bereikt worden door selectie of introductie van virale oncogenen [8](#page=8).
* **Stadia van celcultivering:** Het proces omvat enzymatische behandeling van weefsel, centrifugeren of laten uitzakken van cellen, uitzetten in een groeirecipiënt, en bij confluente lagen, het losmaken en splitsen van de cellen [9](#page=9).
#### 16.1.2 Cultuurcondities en media
Om in vitro groeiende cellen vergelijkbaar te maken met in vivo situaties, moeten de cultuurcondities juist zijn [11](#page=11).
* **MEM (Minimum Essential Medium):** Bevat isotonische zouten, een energiebron (glucose), essentiële aminozuren en vitamines, en serum [11](#page=11).
* **Andere media:** Klassieke celmedia zijn onder andere DMEM, M199, McCoy’s, en RPMI1640 [11](#page=11).
* **Atmosfeer:** Culturen worden meestal gegroeid onder een atmosfeer van 5% CO2 in lucht om een pH van 7.4 te handhaven, vergelijkbaar met lichaamsvloeistoffen [11](#page=11).
#### 16.1.3 Groeisubstraten en -procedures
Het substraat beschermt cellen tegen anoïkis (een vorm van geprogrammeerde celdood) en is essentieel voor adherente celculturen [15](#page=15).
* **Materialen:** Glas (negatief geladen), voorbehandeld polystyreen, en coatings zoals poly-D-lysine, collageen of geconditioneerd medium van feeder cell cultures [15](#page=15).
* **Interactie:** Cellen hebben zowel aspecifieke fysische interactie als specifieke functionele interactie met het onderliggende substraat en de extracellulaire matrix (ECM), wat differentiatie kan induceren. Dit bootst de in vivo micro-omgeving na [16](#page=16).
#### 16.1.4 Celdichtheidsafhankelijke inhibitie en celtransfer
* **Contactinhibitie:** Cellen in cultuur delen tot ze een confluente monolaag vormen, waarna de proliferatie stopt door contactinhibitie, mede door concurrentie voor mitogenen [17](#page=17).
* **Celtransfer (Splitsen):** Om de celcultuur te behouden, worden cellen gesplitst. Dit gebeurt door verdunning bij suspensiecultures, of bij adherente cellen door behandeling met trypsine/EDTA. Trypsine degradeert oppervlakte-eiwitten, terwijl EDTA calcium en magnesium cheleert, wat intercellulaire adhesie en cel-substraatbinding beïnvloedt. De cellen komen los, vormen een suspensie, die vervolgens wordt verdund en uitgezaaid in nieuwe recipiënten [17](#page=17) [20](#page=20).
#### 16.1.5 Celadhesie en -spreiding
Na het losmaken en uitplaten ondergaan cellen adhesie en spreiding over het substraat. Dit proces omvat [22](#page=22):
1. Uitzakken onder invloed van gravitatie [22](#page=22).
2. Initieel contact met het substraat [22](#page=22).
3. Progressieve spreiding over het substraat, wat energie en cytoskelet-wijzigingen vereist [22](#page=22).
4. Versterkte cel-substraatbinding door eigen ECM-moleculen [22](#page=22).
Cellen kunnen ook migreren door tijdelijke inhibitie van adhesie op een locatie en opbouw elders [22](#page=22).
#### 16.1.6 Stamcellen in celcultuur
Stamcellen zijn cruciaal in celonderzoek vanwege hun vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie [27](#page=27) [28](#page=28).
* **Totipotente stamcellen:** Kunnen een volledige foetus ontwikkelen [28](#page=28).
* **Pluripotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot veel, maar niet alle celtypen. Embryonale stamcellen (ES) worden bijvoorbeeld gemaakt uit de binnenste celmassa van de blastocyst [29](#page=29) [31](#page=31) [32](#page=32).
* **Multipotente stamcellen:** Kunnen zich ontwikkelen tot een beperkt aantal gespecialiseerde celtypen, zoals hemopoëtische stamcellen die bloedcellen produceren [30](#page=30).
* **Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs):** Zijn ethisch minder beladen dan embryonale stamcellen [34](#page=34).
* **Organoïden:** Gemaakte organen in vitro vanuit stamcellen [36](#page=36).
#### 16.1.7 Kwaliteitscontrole van celculturen
Kwaliteitscontrole is essentieel om contaminatie en genetische instabiliteit te voorkomen [37](#page=37).
* **Contaminatie:** Kan optreden door micro-organismen (bacteriën, gisten, schimmels, mycoplasma's) of door vreemde cellen. Mycoplasma's zijn parasitair, intracellulair, verstoren het metabolisme en zijn moeilijk te detecteren en te elimineren. Veel cellijnen blijken ook contaminaties te bevatten, zoals de HeLa cellijn of cellijnen die van muis of rat afkomstig zijn. Mycoplasma contaminatie kan diverse effecten hebben op celculturen, waaronder veranderingen in synthese, metabolisme, morfologie en proliferatie [37](#page=37) [38](#page=38).
* **Zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit:** Kan worden gemeten door karyotypering (aantal en vorm van chromosomen) [39](#page=39).
* **Genetische instabiliteit:** Het genotype van gecultiveerde cellen evolueert vaak, wat beperkt kan worden door regelmatig terug te keren naar stock-cultures die ingevroren zijn in vloeibare stikstof [40](#page=40).
### 16.2 Histologische technieken voor microscopische observatie
Histologische technieken zijn noodzakelijk om cellen en weefsels voldoende dun te snijden en contrast te verhogen voor LM- en EM-analyse [42](#page=42).
#### 16.2.1 Fixeren
Fixeren stopt de afbraakprocessen van weefsel na verwijdering uit de in vivo situatie door denaturatie van eiwitten [45](#page=45).
* **Methoden:**
* **Chemische fixatieven:** Formol (LM), glutaraldehyde (EM), OSO4. Deze cross-linken of precipiteren eiwitten, waardoor structurele componenten behouden blijven [45](#page=45).
* **Invriezen (koude fixatie):** Snel en laat goede epitopen voor immuunkleuringen behouden. Wordt vaak gebruikt voor snelle diagnoses in pathologie [45](#page=45).
* **Artefacten:** Veranderingen die ontstaan tijdens fixatie en afwijken van de in vivo situatie worden artefacten genoemd [45](#page=45).
#### 16.2.2 Inbedden
Het gefixeerde materiaal wordt doordrongen en omwikkeld met een inbedmiddel dat hard wordt en het materiaal snijdbaar maakt in dunne plakken [46](#page=46).
* **Inbedmiddelen:** Paraffine, hars, plastics. Deze zijn meestal hydrofoob [46](#page=46) [47](#page=47).
* **Ontwateren:** Omdat biologisch materiaal veel water bevat, moet dit eerst worden verwijderd in een stijgende reeks alcoholbaden (30% tot absolute ethanol) [47](#page=47).
* **Clearing:** Gebruik van tolueen, dat mengbaar is met alcohol en het inbedmiddel [47](#page=47).
#### 16.2.3 Snijden
Het ingebedde, harde materiaal wordt gesneden in dunne plakken (coupes) met een microtoom [48](#page=48).
* **Paraffine:** 5-10 µm dik, doorlaatbaar voor licht (LM). Coupes worden op glazen draagglas geplaatst [48](#page=48).
* **Hars, plastics:** 70 nm dik, doorlaatbaar voor elektronen (EM). Harsen zijn harder en moeilijker weg te etsen dan paraffine, wat ze minder geschikt maakt voor immuunkleuringen. Coupes voor EM worden op metalen roosters (grids) geplaatst [48](#page=48).
### 16.3 Lichtmicroscopie
De ontwikkeling van de lichtmicroscoop is aanzienlijk geweest, met verbeteringen in resolutie en introductie van fluorescentie- en confocale technieken [51](#page=51).
#### 16.3.1 Principes van lichtmicroscopie
* **Resolutie:** De effectieve resolutie van 200 nm wordt bepaald door het objectief en de golflengte van het licht [52](#page=52).
* **Preparaten:** Celcultures kunnen 'in toto' worden behandeld, terwijl dikker materiaal (weefsels) versneden wordt of geanalyseerd met speciale microscopen [52](#page=52).
* **Contrast:** Gekleurde preparaten maken detectie op basis van lichtabsorptie mogelijk (klaarveldmicroscopie). Levende cellen hebben vaak te weinig contrast en vereisen speciale technieken [52](#page=52).
#### 16.3.2 Het klassieke licht- of klaarveldmicroscoop
Dit type microscoop maakt gebruik van doorvallend wit licht. Het bestaat uit drie lenssystemen [53](#page=53):
* **Condensor:** Bundelt het licht op het preparaat [53](#page=53).
* **Objectief:** Vormt een vergroot beeld van het preparaat [53](#page=53).
* **Oculair:** Vergroot het beeld verder voor de waarnemer [53](#page=53).
De beeldkwaliteit wordt mede bepaald door de aard van het preparaat (gefixeerd/gekleurd versus levend) en de optische elementen zoals lucht, water en olie [54](#page=54) [55](#page=55).
#### 16.3.3 Typen lichtmicroscopen
* **Histologie-microscoop:** Voor de analyse van weefselcoupes [56](#page=56).
* **Discussie-microscoop met digitale camera:** Geschikt voor interactieve analyse en beeldvorming [56](#page=56).
* **Geïnverteerde lichtmicroscoop:** Ideaal voor observatie van levende celcultures, waarbij de objectieven zich onder het monster bevinden [56](#page=56).
#### 16.3.4 Kleuringen in lichtmicroscopie
* **HE-kleuring (Hematoxyline – Eosine):** Hematoxyline kleurt zure (basofiele) componenten zoals kernen blauw, terwijl eosine eosinofiele/acidofiele stoffen roze kleurt [57](#page=57).
* **PAS-kleuring (Periodic Acid Schiff):** Kleurt vrije suikers, zoals het slijm in slijmbekercellen en microvilli [57](#page=57).
* **Voorbeelden:** Analyse van darmvilli met PAS en hematoxyline en dunne darmcoupes met HE [57](#page=57) [58](#page=58).
#### 16.3.5 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen
Deze technieken verhogen het contrast in ongekleurde preparaten:
* **Fasecontrastmicroscopie:** Gebaseerd op faseverschuivingen van licht door brekingsverschillen, omgezet in amplitudeveranderingen (licht/donker) [59](#page=59) [60](#page=60) [61](#page=61).
* **DIC (Differentieel Interferentie-Contrast) microscopie (Nomarski):** Werkt met interferentie van gepolariseerd licht [59](#page=59).
* **Digitale microscopie:** Gebruikt computerverwerking van beelden met ultragevoelige videocamera's voor real-time en time-lapse opnamen [59](#page=59).
* **Fluorescentiemicroscopie:** Voor 'life cell imaging' [59](#page=59).
Het principe achter fasecontrast en DIC is het benutten van verschillen in optische dichtheid binnen het preparaat, die leiden tot faseverschuivingen in het licht, welke vervolgens worden omgezet in een zichtbaar contrast [60](#page=60) [61](#page=61).
---
Dit onderwerp behandelt geavanceerde microscopische technieken die worden gebruikt voor het verkrijgen van driedimensionale informatie en kwantitatieve analyse van biologische monsters.
### 16.1 Kleuringstechnieken in de lichtmicroscopie
Kleuring is essentieel om contrast te creëren in transparante biologische monsters, waardoor structuren zichtbaar worden die anders onzichtbaar zouden blijven [63](#page=63).
#### 16.1.1 Hematoxyline en Eosine (H&E) kleuring
De H&E-kleuring is een veelgebruikte routinekleuring in de histologie voor weefseldiagnostiek, waaronder kankerdiagnose [65](#page=65).
* **Hematoxyline:** Wordt gebruikt in combinatie met een beitsmiddel (vaak aluminiumzouten) en werkt als een kationische, basische kleurstof. Het kleurt negatief geladen, basofiele celbestanddelen, zoals nucleïnezuren in de celkern, blauw tot donkerpaars. Het toont details binnen de kern, zoals de condensatiepatronen van heterochromatine [64](#page=64) [65](#page=65).
* **Eosine:** Werkt als een anionische, zure kleurstof. Het kleurt positief geladen, acidofiele componenten, zoals eiwitten in het cytoplasma, roze. Nucleoli kleuren ook met eosine [64](#page=64) [65](#page=65).
**Toepassingen van H&E:**
* Visualisatie van diverse weefseltypes en morfologische veranderingen [65](#page=65).
* Hematoxyline alleen (zonder eosine) kan dienen als tegenkleuring voor immunohistochemische procedures die colorimetrische substraten gebruiken [66](#page=66).
**Beperkingen:** H&E-kleuring is onverenigbaar met immunofluorescentie [65](#page=65).
#### 16.1.2 Specifieke kleurtechnieken
Naast routinekleuringen zijn er specifieke technieken:
* **Indifferente kleurstoffen:** Deze kleuren specifiek vetten aan. Een voorbeeld is Oil Red O voor het aankleuren van vetcellen [68](#page=68) [69](#page=69).
* **Immunohistochemische kleuring:** Maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan bepaalde celbestanddelen (antigenen). Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, fluorescente label of colloïdaal goud. Een voorbeeld is de kleuring voor microtubuli of connexine 43 op muishartcoupes [68](#page=68) [70](#page=70).
* **Enzymkleuringen:** Toont de activiteit van specifieke enzymen aan door het gebruik van een enzym-specifiek substraat, wat resulteert in een waarneembare neerslag. Een voorbeeld is de kleuring voor glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten [68](#page=68) [71](#page=71).
### 16.2 Fluorescentiemicroscopie
Fluorescentiemicroscopie maakt gebruik van fluorescerende moleculen, **fluorochromen**, die licht absorberen bij een bepaalde golflengte (excitatie) en dit uitzenden bij een langere golflengte (emissie) [72](#page=72) [73](#page=73).
#### 16.2.1 Principes van fluorescentiemicroscopie
* **Excitatiebron:** Kan een kwikdamplamp, LED's of een laser zijn [72](#page=72) [74](#page=74).
* **Golflengtefilters:** Een filterkubus bevat een excitatiefilter, een dichroïsche spiegel (beamsplitter) en een emissiefilter of stopfilter [74](#page=74).
* **Detectie:** Het emissielicht wordt waargenomen door het oog of een camera [74](#page=74).
* **Excitatie- en emissiespectrum:** Elk fluorofoor heeft een specifiek excitatie- en emissiespectrum. Het emissielicht heeft een golflengte die groter of gelijk is aan de golflengte van het geabsorbeerde licht [73](#page=73).
#### 16.2.2 Toepassingen van fluorescentiemicroscopie
* **Kwantificeren van moleculen in levende cellen:** Met behulp van ion-gevoelige kleurstoffen waarvan de fluorescentie afhangt van de ionenconcentratie, zoals Fura-2 voor intracellulaire Ca²⁺ [75](#page=75).
* **Immunofluorescentie microscopie:** Detectie van specifieke eiwitten met antilichamen waaraan een fluorofoor is gekoppeld [75](#page=75).
* **Tagging van eiwitten met fluorescente eiwitten:** Hiermee kunnen specifieke eiwitten in levende cellen worden gedetecteerd. Voorbeelden hiervan zijn Blue Fluorescent Protein (BFP) en Yellow Fluorescent Protein (YFP) [75](#page=75) [79](#page=79).
* **Visualisatie van organellen:** Zoals lysosomen en mitochondria [76](#page=76).
* **Visualisatie van specifieke eiwitten in gefixeerde cellen of weefsels** [77](#page=77).
* **Dubbele fluorescentie:** Aankleuring van meerdere eiwitten tegelijkertijd, bijvoorbeeld cytoskelet-kabels (actine in groen) en 'voetjes' (vinculine in rood) om colocalisatie aan te tonen [79](#page=79).
#### 16.2.3 Typische fluorescentiemicroscopen
* **Epifluorescentiemicroscopen:** Klassieke opstellingen met digitale registratie, soms zonder oculair [81](#page=81).
* **Conforme Laser Scanning Microscopie (CLSM):** Gebruikt een laser als exciterende lichtbron voor hoge resolutie en optische secties. Een pinhole (klein gaatje) in de detectorweg voorkomt dat licht van buiten het focale vlak de detector bereikt, wat resulteert in scherpere beelden [72](#page=72) [83](#page=83) [84](#page=84).
#### 16.2.4 Moderne fluorescentiemicroscopie en beeldvorming
* **Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie:** Softwarematige bewerking van conventionele digitale beelden om de resolutie te verbeteren door ruis en onscherpte te verwijderen [86](#page=86) [88](#page=88).
* **4D Live Cell Imaging:** Combinatie van snelle 3D multi-kleuren imaging en time-lapse opnames om dynamische processen in levende cellen te bestuderen over tijd, in 3 dimensies en met meerdere fluorochromen [89](#page=89) [90](#page=90).
* **3D multi-kleur imaging:** Simultaane registratie van verschillende fluorochromen in de XYZ-dimensies [89](#page=89).
* **Time-lapse recording:** Registratie van processen gedurende een bepaalde periode met opnames op vaste tijdspunten [89](#page=89) [91](#page=91).
* **3D Fluorescentie:** Het opbouwen van een driedimensionaal beeld uit een stapel (stack) van fluorescentiebeelden, vaak in combinatie met CLSM of deconvolutie [92](#page=92).
### 16.3 Virtuele Microscopie
Virtuele microscopie is een digitale simulatie van klassieke microscopie via de pc, waarbij cel- en weefselpreparaten in hun totaliteit bij hoge resolutie worden ingescand, resulterend in een digitaal beeld waarop genavigeerd en gezoomd kan worden [95](#page=95).
### 16.4 Flowcytometrie
Flowcytometrie is een techniek voor het tellen en bestuderen van microscopisch kleine deeltjes (zoals cellen) in een stromende vloeistof [97](#page=97).
* **Principe:** Gebaseerd op lichtverstrooiing en fluorescentie. Individuele cellen in suspensie, gelabeld met fluorescerende stoffen, passeren één voor één een laserstraal. De gemeten fluorescentie en verstrooid licht bepalen de celtypen en aantallen [97](#page=97).
* **Toepassing:** Het analyseren en/of sorteren van cellen [96](#page=96).
### 16.5 Elektronenmicroscopie (EM)
EM gebruikt een bundel elektronen in plaats van licht voor beeldvorming, wat een veel hogere resolutie mogelijk maakt dan lichtmicroscopie. De golflengte van elektronen is aanzienlijk kleiner dan die van zichtbaar licht [98](#page=98).
#### 16.5.1 Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
* **Principe:** Een elektronenbundel wordt door een ultradun monster gestuurd. Elektronenverstrooiing op zware atoomkernen in het preparaat vormt het beeld [98](#page=98) [99](#page=99).
* **Resolutie:** Tot 1 nanometer (nm) theoretisch nog kleiner [98](#page=98) [99](#page=99).
* **Componenten:** Een elektronenkanon als bron, elektromagnetische lenzen voor bundelvorming, en een fluorescentiescherm of fotografische plaat voor beeldvorming [98](#page=98) [99](#page=99).
* **Vacuüm:** Vereist een hoog vacuüm omdat elektronen gemakkelijk worden gestopt door gasmoleculen .
* **Contrast:** Biologisch materiaal heeft van zichzelf weinig contrast. Contrast wordt verhoogd door het gebruik van zware metalen die elektronen strooien .
* **Fixatie en kleuring:** Gebruikt aangepaste technieken zoals negatieve kleuring (exclusie van zwaar metaal door virusdeeltjes) of 'shadowing' (schuine bestuiving met metalen zoals platina of goud) .
* **Ultradunne secties:** Preparaten worden gefixeerd (bv. met glutaaraldehyde en osmiumtetroxide), gekleurd met zware metalen (bv. uranylacetaat en loodcitraat), gedehydrateerd en ingebed in hars om ultradunne coupes (50-100 nm) te snijden met een ultramicrotoom .
* **Interpretatie:** Kan complex zijn door artefacten, waarbij verschillende doorsneden van eenzelfde structuur sterk uiteenlopende beelden kunnen geven. 3D reconstructie kan via stapeling van secties of cryo-elektronentomografie .
#### 16.5.2 Scanning-elektronenmicroscopie (SEM)
* **Principe:** Een elektronenbundel scant het oppervlak van het preparaat. Terugkaatsing van elektronen en generatie van secundaire elektronen worden gedetecteerd en verwerkt tot een 3D-beeld [98](#page=98) [99](#page=99).
* **Toepassing:** Geschikt voor het in beeld brengen van oppervlakken van weefsels, macromoleculaire aggregaten of materialen. Kan ook gebruikt worden voor het afscannen van het oppervlak van cellen [99](#page=99).
* **Preparatie:** Het preparaat kan groter en dikker zijn dan voor TEM, maar moet wel gecoat worden met een zwaar metaal [98](#page=98).
#### 16.5.3 Speciale EM technieken
* **Vries-breek (Freeze-fracture) en Vries-ets (Freeze-etching):** Technieken die het membraanstructuur blootleggen door het monster te breken bij lage temperaturen en eventueel ijs te verwijderen door sublimatie. Visualisatie na bestuiving met zware atomen .
* **Cryo-elektronen-tomografie:** Maakt 3D reconstructies van objecten mogelijk door een serie 2D projecties te maken terwijl het object of de detector rond een as gekanteld wordt. Dit helpt bij het reconstrueren van complexe structuren zoals nucleaire pore complexen (NPC's) .
* **SBF-SEM & FIB-SEM:** Serial Block Face-SEM en Focused Ion Beam-SEM waarbij materiaal in de microscoop wordt verwijderd met een ultramicrotoom of ionenlaser voor seriale beeldbewerking .
### 16.6 Voorbeelden van geavanceerde microscopische analyse
* **Mucoviscidose (Cystic Fibrosis):** Lokalisatie van het CFTR-eiwit via immunohistochemie om de subcellulaire mislocatie bij patiënten te bestuderen [93](#page=93).
* **Bronchiaal epitheel en Huid (zweetklieren):** Immunohistochemische analyse van CFTR-expressie in controles versus patiënten [94](#page=94) [95](#page=95).
* **Trachea-epitheel:** TEM-analyse toont twee celtypes: cellen met cilia en slijm-producerende cellen. SEM-analyse toont vergelijkbare celtypes met een koepelvormig oppervlak bij de slijm-producerende cellen .
De geavanceerde microscopische technieken bieden diverse methoden om de structuur en functie van biologische monsters op verschillende schalen te bestuderen, van moleculair niveau tot cel- en weefselarchitectuur.
---
## 16 Geavanceerde microscopische technieken voor volumetrische analyse
Deze sectie bespreekt geavanceerde microscopische technieken die worden gebruikt voor de volumetrische analyse van biologische monsters, met een focus op de detectie van specifieke moleculen en de analyse van grotere driedimensionale volumes .
### 16.1 Scanning Electron Microscopy (SEM) voor cellulaire analyse
Scanning Electron Microscopy (SEM) kan worden gebruikt om oppervlaktestructuren van cellen gedetailleerd te bestuderen. Om monsters geleidend te maken voor SEM-analyse, worden ze bedekt met een dun laagje goud of goud/palladium (ongeveer 1,5-3 nanometer) met behulp van een sputter coater. Een voorbeeld hiervan is de analyse van epitheel van de trachea, waarbij twee celtypes zichtbaar zijn: cellen met lange cilia en mucus-producerende cellen met een koepelvormig oppervlak. De vergroting bij dergelijke analyses kan oplopen tot circa 4.000 keer .
### 16.2 Detectie van specifieke eiwitten met behulp van Transmission Electron Microscopy (TEM)
Transmission Electron Microscopy (TEM) kan worden ingezet voor de detectie van specifieke eiwitten binnen cellen of virussen. Dit wordt mogelijk gemaakt door het gebruik van antilichamen die specifiek binden aan het te detecteren eiwit. Een voorbeeld is de detectie van het capsid-eiwit van het HIV-partikel, dat kan worden aangetoond wanneer het partikel uit de cel 'budt' .
### 16.3 Analyse van grotere volumes met SBF-SEM en FIB-SEM
Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) zijn technieken die geschikt zijn voor de analyse van grotere driedimensionale volumes. Beide methoden verwijderen dunne lagen van het monsterblok in de vacuümkamer van de SEM .
* **SBF-SEM:** Maakt gebruik van een diamantmes om sequentiële lagen van het monster te verwijderen .
* **FIB-SEM:** Gebruikt een focused ion beam om het materiaal laag voor laag te etsen .
Deze technieken maken een gedetailleerde reconstructie van de ultrastructuur van grotere weefselvolumes mogelijk .
> **Tip:** Bij het gebruik van SEM-technieken is het cruciaal om monsters elektrisch geleidend te maken om oppervlakkige lading te voorkomen en een helder beeld te verkrijgen .
> **Tip:** Immunodetectie met behulp van TEM vereist specifieke antilichamen om de lokalisatie van eiwitten met hoge resolutie te bevestigen .
---
## Veelgemaakte fouten om te vermijden
- Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens
- Let op formules en belangrijke definities
- Oefen met de voorbeelden in elke sectie
- Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen
Glossary
| Term | Definition |
|------|------------|
| Vries-breek | Een techniek die wordt gebruikt om informatie te verkrijgen over membraanstructuren door cellulaire membranen te breken, meestal tussen de binnenste en buitenste bladen, met behulp van een diepgekoeld mes. Dit proces onthult de eiwitten en eiwitaggregaten die geassocieerd zijn met de cytoplasmatische of extracellulaire helft van de membraan. |
| Vries-ets | Een techniek die, naast vries-breken, wordt toegepast om meer driedimensionale structuren zichtbaar te maken. Hierbij wordt een dunne laag ijs verwijderd door sublimatie (overgang van vaste fase naar gasfase) onder vacuüm, wat resulteert in een verhoogde diepte en detail van de geanalyseerde structuren. |
| Sublimatie | Het proces waarbij een stof direct overgaat van de vaste fase naar de gasfase, zonder eerst de vloeibare fase te doorlopen. In de context van vries-etsen wordt ijs gesublimeerd om de onderliggende structuren bloot te leggen. |
| Replica | Een negatieve afdruk van een oppervlak, gemaakt door het te bestuiven met zware atomen. Deze replica wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) of scanning-elektronenmicroscoop (SEM) om een beter beeld te krijgen van de oorspronkelijke structuur, met name voor verbeterde elektronenpassage in TEM. |
| Cytoplasmatische membraanhelft (P-face) | Het deel van de dubbele biologische membraan dat grenst aan het cytoplasma. Bij vriesbreekanalyse worden eiwitten en eiwitaggregaten die aan deze zijde van de membraan zijn geassocieerd, zichtbaar gemaakt. |
| Extracellulaire membraanhelft (E-face) | Het deel van de dubbele biologische membraan dat grenst aan de extracellulaire ruimte. Vriesbreekanalyse kan ook de eiwitten en eiwitaggregaten onthullen die aan deze zijde van de membraan zijn geassocieerd. |
| Cryo-elektronen-tomografie | Een techniek voor 3D-reconstructie van een object. Dit wordt bereikt door een serie 2D-projecties te maken terwijl het object of de detector rond een as wordt gekanteld. De reconstructie gebeurt door middel van Fourier-analyse van terugprojecties, wat een gedetailleerd virtueel 3D-beeld oplevert. |
| Nucleair pore complex (NPC) | Een complex van eiwitten dat de nucleaire envelop doordringt en de uitwisseling van moleculen tussen de celkern en het cytoplasma reguleert. Cryo-elektronen-tomografie kan de driedimensionale structuur van NPC's met hoge resolutie in kaart brengen. |
| Trachea-epitheel | Het epitheel dat de binnenwand van de luchtpijp (trachea) bekleedt, bestaande uit verschillende celtypen die gespecialiseerd zijn in functies zoals beweging en slijmproductie. |
| Basale membraan (BM) | Een dunne laag extracellulaire matrix die de epitheelcellen ondersteunt en scheidt van het onderliggende bindweefsel; ook wel basale lamina genoemd. |
| Fibrocyten | Cellulaire componenten van bindweefsel die verantwoordelijk zijn voor de synthese van collageen en andere extracellulaire matrixcomponenten. |
| Collageenvezels | Sterke, vezelige eiwitstructuren in het bindweefsel die structurele ondersteuning en weerstand tegen rek bieden. |
| Elastinevezels | Flexibele vezels in het bindweefsel die elasticiteit en veerkracht mogelijk maken, waardoor weefsels kunnen terugkeren naar hun oorspronkelijke vorm na rek. |
| Gecilieerde cellen | Epitheelcellen die voorzien zijn van cilia, kleine, haarachtige uitsteeksels die ritmisch bewegen om deeltjes en slijm te transporteren, bijvoorbeeld in de luchtwegen. |
| Mitochondria | Celorganellen die verantwoordelijk zijn voor cellulaire ademhaling en de productie van energie in de vorm van ATP. |
| Glad endoplasmatisch reticulum (SER) | Een netwerk van membranen in de cel dat betrokken is bij lipidesynthese, ontgifting en calciumopslag. |
| Mucus-producerende cellen | Gespecialiseerde epitheelcellen die slijm (mucus) produceren en afscheiden, wat helpt bij het bevochtigen, beschermen en reinigen van oppervlakken zoals de luchtwegen. |
| Ruv endoplasmatisch reticulum (ER) | Een netwerk van membranen in de cel, bezaaid met ribosomen, dat betrokken is bij de synthese en modificatie van eiwitten voor secretie of inbedding in membranen. |
| Golgi-apparaat (G) | Een celorganel dat eiwitten en lipiden verwerkt, sorteert en verpakt voor transport binnen of buiten de cel. |
| Secretiedruppels (MD) | Vesikels of blaasjes binnen de cel die afscheidingsproducten, zoals mucus, bevatten voordat ze worden vrijgegeven. |
| Term | Definitie |
| Groeirecipiënt | Een container, zoals een petrischaal, waarin cellen worden uitgeplaatst om te groeien in een laboratoriumomgeving. |
| Monolaagcultuur | Een celcultuur waarbij cellen zich verspreiden en een enkele laag vormen op het oppervlak van het groeimedium. |
| Confluentie | De toestand waarbij een celcultuur een volledige laag cellen heeft gevormd, waarbij de cellen elkaar raken en de groei stopt door contactinhibitie. |
| Enzymatische behandeling | Het proces waarbij enzymen worden gebruikt om weefsel af te breken en cellen van elkaar te scheiden, vaak als voorbereiding op celcultivering. |
| Isotonische zouten | Zouten die een vergelijkbare osmotische druk hebben als de vloeistof in cellen, wat helpt om de celintegriteit te behouden tijdens cultivering. |
| Energiebron (glucose) | Een suiker die door cellen wordt gebruikt als primaire bron van energie voor hun metabole processen. |
| Essentiële aminozuren | Aminozuren die het lichaam niet zelf kan synthetiseren en die via de voeding of het celmedium moeten worden aangeleverd voor eiwitsynthese. |
| Serum (in celmedium) | Een vloeistof die aan celmedia wordt toegevoegd en die groeifactoren, hormonen en andere voedingsstoffen bevat die essentieel zijn voor celgroei en -overleving. |
| CO2-incubator | Een apparaat dat een gecontroleerde omgeving met een specifieke concentratie koolstofdioxide (CO2) en temperatuur biedt, noodzakelijk voor het handhaven van de juiste pH in celculturen. |
| pH | Een maat voor de zuurgraad of alkaliteit van een oplossing; een pH van 7,4 is optimaal voor de meeste dierlijke celculturen. |
| In vitro | Een term die verwijst naar processen die plaatsvinden buiten een levend organisme, zoals in een laboratoriumomgeving. |
| In vivo | Een term die verwijst naar processen die plaatsvinden binnen een levend organisme. |
| Stamcel | Een cel met het vermogen tot zelfvernieuwing en differentiatie tot gespecialiseerde celtypen die organen en weefsels vormen. |
| Totipotent | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot een volledige foetus, inclusief de placenta. |
| Pluripotent | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot veel, maar niet alle, verschillende celtypen, zoals de cellen van de binnenste celmassa van een blastocyst. |
| Multipotent | Een stamcel die de potentie heeft om zich te ontwikkelen tot verschillende soorten meer gespecialiseerde cellen binnen een specifieke weefsellijn, zoals hemopoëtische stamcellen die zich differentiëren tot bloedcellen. |
| Differentiatie | Het proces waarbij een minder gespecialiseerde cel verandert in een meer gespecialiseerd celtype, kenmerkend voor de ontwikkeling van volwassen celtypen. |
| Zelfvernieuwing | Het vermogen van een stamcel om zichzelf te delen en kopieën van zichzelf te produceren, waardoor de stamcelpopulatie behouden blijft. |
| Blastocyst | Een holle bal van ongeveer 140 totipotente stamcellen die zich vormt ongeveer 4 dagen na de bevruchting van een eicel. |
| Binnenste celmassa | De groep cellen binnenin de blastocyst die het potentieel hebben om zich te ontwikkelen tot de foetus. |
| Placenta | Het orgaan dat zich ontwikkelt uit de buitenste cellen van de blastocyst en essentieel is voor de voeding en ontwikkeling van de foetus. |
| Mycoplasma (PPLO) | Een type micro-organisme dat celculturen kan contamineren. Mycoplasma's zijn parasitair, kunnen deels intracellulair leven, verstoren het cellulair metabolisme (vaak door verzuring van het medium) en zijn moeilijk te detecteren en te elimineren. |
| Vreemde celcontaminatie | Het voorkomen van cellen van een andere oorsprong dan de bedoelde cellijn in een celcultuur. Dit kan variëren van micro-organismen tot cellen van andere diersoorten die per ongeluk zijn geïntroduceerd. |
| Karyotypering | Een techniek die wordt gebruikt om het aantal en de vorm van chromosomen in individuele cellen te bepalen. Dit is een methode om de genetische zuiverheid, homogeniteit en stabiliteit van een celcultuur te meten. |
| Genetische instabiliteit | De neiging van gekweekte cellen om hun genotype, gereflecteerd door chromosoomvorm en -aantal, te laten evolueren, vaak in negatieve zin. Dit kan beperkt worden door regelmatig terug te keren naar stock-cultures. |
| Stock-cultures | Gevriesde voorraad van een cellijn die wordt gebruikt om de genetische stabiliteit van de celcultuur te behouden. Deze worden ingevroren met cryoprotectieve middelen zoals glycerol of DMSO in vloeibare stikstof. |
| Cryoprotectief middel | Een stof, zoals glycerol of DMSO, die wordt toegevoegd aan cellen om schade te voorkomen tijdens het invriesproces. Deze middelen helpen de vorming van ijskristallen te minimaliseren, die cellen kunnen beschadigen. |
| Cellulair metabolisme | Het geheel van biochemische processen die plaatsvinden in een cel om te overleven en te functioneren. Mycoplasma-contaminatie kan dit metabolisme verstoren, bijvoorbeeld door verzuring van het kweekmedium. |
| Cytokine expressie | De productie en afgifte van cytokines, kleine eiwitten die een rol spelen in celcommunicatie, met name in het immuunsysteem. Mycoplasma kan de inductie of suppressie van cytokine expressie beïnvloeden. |
| Cellulaire transformatie | Het proces waarbij een normale cel verandert in een kankercel, gekenmerkt door ongecontroleerde groei en proliferatie. Mycoplasma kan cellulaire transformatie bevorderen. |
| Fluorescentiemicroscopie | Een microscopische techniek die gebruik maakt van fluorescentie om beelden te genereren. Fluorescerende moleculen in het preparaat zenden licht uit wanneer ze worden geëxciteerd door een specifieke golflengte, wat resulteert in een helder beeld tegen een donkere achtergrond. |
| Beeldvorming | Het proces van het creëren van visuele representaties van objecten of fenomenen, in dit geval met behulp van microscopische technieken zoals fluorescentiemicroscopie. |
| Epifluorescentiemicroscoop | Een klassieke opstelling voor fluorescentiemicroscopie waarbij de excitatie- en emissielichtpaden gescheiden zijn. Het licht wordt door de objectieflens op het preparaat gericht en de fluorescentie wordt ook door dezelfde lens opgevangen. |
| DIC (Differentieel Interferentie Contrast) | Een beeldvormingstechniek, ook bekend als Nomarski-microscopie, die wordt gebruikt om morfologische details van transparante monsters te visualiseren door gebruik te maken van interferentieprincipes om optische gradiënten zichtbaar te maken. |
| Fluorochroom | Een fluorescerende kleurstof die specifiek bindt aan bepaalde structuren in een cel of weefsel, zoals DNA of mitochondria, om deze zichtbaar te maken onder de fluorescentiemicroscoop. |
| Confocaal laser scanning microscoop (CLSM) | Een geavanceerde fluorescentiemicroscoop die een laserstraal gebruikt om het preparaat punt voor punt af te tasten. Een pinhole filter verwijdert onscherp licht van buiten het focale vlak, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en contrast, en de mogelijkheid om 3D-reconstructies te maken. |
| Pinhole | Een optisch element in een confocale microscoop dat fungeert als een spleet of gat. Het laat alleen licht van het gewenste focale vlak door naar de detector, waardoor onscherp licht van boven of onder het focusvlak wordt geblokkeerd. |
| PMT (Photomultiplier Tube) | Een zeer gevoelige detector die wordt gebruikt in confocale microscopen om het zwakke fluorescentielicht dat door de pinhole komt, te meten en om te zetten in een elektrisch signaal. |
| Deconvolutie-algoritmes | Softwarematige bewerkingen die worden toegepast op conventionele digitale beelden om onscherpte te verminderen en de resolutie te verbeteren. Deze algoritmes proberen het oorspronkelijke, scherpe beeld te reconstrueren door de effecten van optische diffusie te "ontwarren". |
| Time lapse microscopie | Een techniek waarbij opeenvolgende beelden van een levend monster over een langere periode worden opgenomen. Dit maakt het mogelijk om dynamische processen, zoals celbeweging of veranderingen in intracellulaire structuren, te bestuderen. |
| Deconvolutie-fluorescentiemicroscopie | Een techniek waarbij softwarematige bewerkingen, bekend als deconvolutie-algoritmes, worden toegepast op conventionele digitale beelden om een hogere resolutie te verkrijgen. Dit proces helpt bij het verbeteren van de beeldkwaliteit door het verwijderen van onscherpte die wordt veroorzaakt door optische aberraties. |
| 4D Live Cell Imaging | Een geavanceerde microscopietechniek die een combinatie biedt van snelle 3D-multi-kleurenimaging en time-lapse opnames. Dit maakt het mogelijk om dynamische processen in levende cellen gedurende langere perioden in zowel ruimtelijke als temporele dimensies te bestuderen. |
| 3D multi-kleur imaging | Het simultaan vastleggen van beelden van verschillende fluorochromen binnen de XYZ-dimensies, wat resulteert in een driedimensionaal beeld dat informatie bevat over de ruimtelijke verdeling van meerdere moleculen. Dit wordt vaak gedaan op meerdere posities om een groter gebied te bestrijken. |
| Time lapse recording | Een methode waarbij processen gedurende een welbepaalde periode worden geregistreerd door op vaste tijdspunten beelden te maken. Deze opeenvolgende beelden worden vervolgens geassembleerd tot een versnelde film, waardoor snelle veranderingen zichtbaar worden gemaakt. |
| Fluorochromen | Moleculen die fluorescentie vertonen, dat wil zeggen, die licht absorberen bij een bepaalde golflengte en dit vervolgens weer uitzenden bij een langere golflengte. In fluorescentiemicroscopie worden deze gebruikt om specifieke structuren of moleculen in een monster zichtbaar te maken. |
| Golflengtes (λ’s) | De specifieke lengtes van elektromagnetische straling die door fluorochromen worden geabsorbeerd en uitgezonden. Het selecteren van de juiste golflengtes is cruciaal voor het exciteren van fluorochromen en het detecteren van hun emissie, wat essentieel is voor multi-kleurenimaging. |
| Paraffine | Een klassiek inbedmiddel voor lichtmicroscopie dat relatief zacht is en sneden van 5-10 µm dikte toelaat, waardoor het geschikt is voor het bestuderen van weefsels met behoud van veel epitopen. |
| Harsen en plastics | Hardere inbedmiddelen die sneden tot 60-70 nm dikte mogelijk maken, wat essentieel is voor elektronenmicroscopie, maar minder geschikt voor immuunkleuringen vanwege de polymerisatie temperatuur en moeilijkheid tot verwijdering. |
| Microtoom | Een instrument dat gebruikt wordt voor het snijden van ingebed materiaal in zeer dunne plakjes (coupes). Voor paraffine worden stalen messen gebruikt, terwijl voor harsen en plastics glazen of diamanten messen worden ingezet. |
| Grids (metalen roostertjes) | Kleine metalen (zoals koper of nikkel) roostertjes waarop coupes voor elektronenmicroscopie worden aangebracht voor analyse. |
| Resolutie (lichtmicroscopie) | Het oplossend vermogen van een lichtmicroscoop, gedefinieerd als de kleinste afstand waarmee twee punten nog net gescheiden worden weergegeven. Deze wordt beperkt tot ongeveer 200 nm en is afhankelijk van het objectief en de golflengte van het zichtbaar licht. |
| Klaarveldmicroscoop (helderveld-LM) | Een type lichtmicroscoop dat doorvallend wit licht gebruikt om preparaten te bekijken, waarbij beelden worden gevormd op basis van lichtabsorptie. Het bestaat uit drie lenssystemen: de condensor, het objectief en de oculairen. |
| Condensor | Een onderdeel van de lichtmicroscoop dat het doorvallende licht bundelt op het preparaat, wat de lichtsterkte, resolutie en beeldkwaliteit beïnvloedt. |
| Objectief | Het lenssysteem van een microscoop dat zich het dichtst bij het preparaat bevindt en een eerste, vergroot beeld vormt. Het objectief speelt een cruciale rol in het bepalen van de resolutie van de microscoop. |
| Oculair | Het lenssysteem van een microscoop dat het door het objectief gevormde beeld verder vergroot en projecteert op het netvlies van de waarnemer. |
| Fixatie | Een voorbewerkingstap waarbij biologisch materiaal wordt behandeld met chemische stoffen, zoals glutaaraldehyde, om de fijne structuren in cellen zo intact mogelijk te bewaren en ze doorlaatbaar te maken voor vervolgstappen. |
| Kleuring (in TEM) | Een proces waarbij biologisch materiaal wordt behandeld met verbindingen van zware metalen, zoals osmiumtetroxide of uranylacetaat, die zich binden aan specifieke celregio's en deze donker doen verschijnen in de elektronenmicroscoop door elektronenweerkaatsing. |
| Dehydratatie | Het proces waarbij water uit het monster wordt verwijderd door wasstappen met oplopende concentraties van ethanol of aceton, noodzakelijk om het materiaal in hydrofobe kunstharsen te kunnen inbedden. |
| Inbedding in hars | Het infiltreren van het voorbewerkte biologische materiaal met een vloeibare kunsthars die vervolgens wordt gepolymeriseerd, meestal door warmte, magnetronstraling of UV-licht, om harde, snijbare blokjes te verkrijgen. |
| Ultradun snijden | Het proces van het maken van extreem dunne coupes (60-90 nm dik) van het ingebedde materiaal met behulp van speciale messen (glas of diamant) en een ultramicrotoom. |
| Gridje | Een klein metalen schijfje met een roosterpatroon waarop de ultradunne coupes worden opgevangen na het snijden, zodat ze in de elektronenmicroscoop geanalyseerd kunnen worden. |
| Elektronenstrooiing | Het fenomeen waarbij elektronen die door het monster worden gestuurd, worden afgebogen of geabsorbeerd door de atomen van het materiaal, wat leidt tot beeldvorming in de elektronenmicroscoop. |
| Contrasteren (in TEM) | Het verhogen van de densiteitsverschillen binnen het biologische monster door het gebruik van zware metalen, wat resulteert in een toename van de elektronenstrooiing en daarmee een verbeterd contrast in het microscopisch beeld. |
| Osmiumtetroxide (OsO4) | Een chemische stof die zowel als fixatief als als contrasteringsmiddel in TEM wordt gebruikt, specifiek voor het verbeteren van het contrast van membranen. |
| Uranylacetaat | Een verbinding van zware metalen die wordt gebruikt als contrasteringsmiddel om specifieke celregio's, zoals DNA-clusters, donkerder te maken in TEM-beelden. |
| Loodcitraat | Een veelgebruikt contrasteringsmiddel in TEM, vaak in combinatie met uranylacetaat, om de densiteit van biologische structuren te verhogen en zo het contrast te verbeteren. |
| Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) | Een microscopische techniek waarbij een bundel elektronen door een extreem dun monster wordt gestuurd om een beeld te vormen, waardoor zeer hoge resoluties en vergrotingen mogelijk zijn. |
| Contactinhibitie | Het fenomeen waarbij cellen in cultuur stoppen met delen zodra ze een confluente tweedimensionale monolaag vormen, vaak als gevolg van concurrentie voor groeifactoren (mitogenen). |
| Monolaag (monolayer) | Een enkele laag cellen die zich op een substraat heeft verspreid en gehecht, kenmerkend voor de meeste 2D celculturen. |
| Mitogenen | Stoffen die celdeling stimuleren; concurrentie voor deze stoffen kan bijdragen aan contactinhibitie in celculturen. |
| Dochterculturen | Nieuwe celculturen die worden gecreëerd door een bestaande cultuur op te splitsen, meestal na behandeling met trypsine-EDTA om de cellen los te maken. |
| Trypsine-EDTA | Een veelgebruikte oplossing in celkweektechnieken; trypsine breekt oppervlakte-eiwitten af, terwijl EDTA calcium en magnesium cheleert, wat leidt tot loslaten van cellen van het substraat en van elkaar. |
| Adherente cellen | Cellen die hechting aan een substraat vereisen om te groeien en te overleven in celcultuur. |
| Suspensiecellen | Cellen die in de kweekvloeistof zweven en geen hechting aan een substraat nodig hebben. |
| Celtransfer | Het proces van het verplaatsen van cellen van een bestaande cultuur naar nieuwe recipiënten, vaak door het splitsen van de cultuur. |
| Celadhesie | Het proces waarbij cellen zich hechten aan een substraat of aan andere cellen. |
| Celspreiding | Het proces waarbij cellen zich na hechting progressief over een substraat verspreiden, wat energie en cytoskeletale veranderingen vereist. |
| Extracellulaire matrix (ECM) | Een netwerk van moleculen buiten de cel dat structurele ondersteuning biedt en de celinteractie beïnvloedt; cellen kunnen hun eigen ECM produceren en modificeren. |
| Fixeren | Het proces waarbij weefsels worden bewaard met behoud van hun oorspronkelijke structuur, voornamelijk door denaturatie van eiwitten. Dit stopt afbraakprocessen en behoudt structurele componenten, waardoor weefsels geschikt worden voor verdere histologische procedures. |
| Denaturatie van eiwitten | Een proces waarbij de driedimensionale structuur van eiwitten wordt veranderd, wat leidt tot verlies van hun biologische functie. In de histologie wordt dit bereikt door bevriezing of chemische fixatie, om enzymatische afbraak van weefsels te voorkomen. |
| Chemische fixatieven | Stoffen zoals formaldehyde (formol) en glutaraldehyde die worden gebruikt om weefsels te fixeren door eiwitten te cross-linken of te precipiteren, wat de in-vivo structuur behoudt en artefacten minimaliseert. |
| Artefacten | Veranderingen die tijdens de fixatie in een weefsel ontstaan en afwijken van de in-vivo situatie. Dit kan leiden tot structuurveranderingen of het op een andere plaats voorkomen van componenten in het weefselpreparaat. |
| Inbedden | Het proces waarbij gefixeerd weefsel wordt omwikkeld en doordrongen met een substantie die hard wordt, waardoor het materiaal snijdbaar wordt in dunne plakken (coupes) voor microscopisch onderzoek. |
| Inbedmiddel | Een substantie, zoals paraffine, hars of plastic, die in het weefsel binnendringt en hard wordt om het snijden van dunne coupes mogelijk te maken. Deze middelen zijn vaak hydrofoob. |
| Dehydrateren | Het verwijderen van water uit biologisch materiaal, meestal met behulp van een stijgende reeks alcoholbaden, om de penetratie van hydrofobe inbedmiddelen mogelijk te maken. |
| Clearing | Een stap in het dehydratatieproces waarbij een substantie zoals tolueen wordt gebruikt, die mengbaar is met zowel alcohol als het inbedmiddel, om de laatste restjes alcohol te vervangen. |
| Coupes | Zeer dunne plakken van weefsel die zijn gesneden met een microtoom. Deze coupes zijn essentieel voor microscopisch onderzoek, omdat ze licht of elektronen doorlaten. |
| Paraffine coupes | Coupes gemaakt van weefsel dat is ingebed in paraffine. Deze zijn typisch 5-10 µm dik en geschikt voor lichtmicroscopie (LM). |
| Hars/plastic coupes | Coupes gemaakt van weefsel dat is ingebed in hars of plastic. Deze zijn aanzienlijk dunner, tot 60-70 nm, en geschikt voor elektronenmicroscopie (EM). |
| Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) | Een veelgebruikte histologische kleuring die al meer dan een eeuw essentieel is voor het identificeren van weefseltypes en morfologische veranderingen, met name in de kankerdiagnose. Hematoxyline kleurt nucleïnezuren diep blauw-paars, terwijl eosine eiwitten roze kleurt, waardoor kernen blauw en cytoplasma en extracellulaire matrix roze worden. |
| Heterochromatine | Een vorm van chromatine die dicht is opgevouwen en minder genen bevat die actief zijn voor transcriptie. De patronen van heterochromatinecondensatie, zichtbaar door hematoxylinekleuring, zijn diagnostisch belangrijk bij het onderscheiden van cel- en kankertypes. |
| Immunofluorescentie | Een techniek die gebruikmaakt van antilichamen die gelabeld zijn met fluorescerende moleculen om specifieke antigenen in weefsels of cellen te detecteren. H&E-kleuring is onverenigbaar met immunofluorescentie. |
| Immunohistochemische kleuring | Een techniek die antilichamen gebruikt om specifieke antigenen in weefselcoupes te identificeren en te lokaliseren. Het antilichaam is gekoppeld aan een kleurstof, een fluorescente label of colloïdaal goud om de detectie mogelijk te maken. |
| Indifferente kleurstoffen | Kleurstoffen die niet-specifiek bepaalde componenten in weefsels aankleuren, zoals vetten. Deze kleurstoffen worden gebruikt om de aanwezigheid en distributie van deze componenten te visualiseren. |
| Enzymkleuringen | Technieken die de activiteit van specifieke enzymen in weefsels aantonen. Dit gebeurt door het gebruik van een substraat dat specifiek door het enzym wordt gemetaboliseerd, wat resulteert in de vorming van een waarneembare neerslag op de plaats van enzymactiviteit. |
| Tetrazoniumzoutmethode | Een specifieke methode die gebruikt kan worden voor enzymkleuringen, zoals aangetoond bij de kleuring van glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) activiteit in erytrocyten. |
| Glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PD) | Een enzym dat een cruciale rol speelt in de pentosefosfaatroute, met name in rode bloedcellen. Enzymkleuringen kunnen de activiteit van G6PD aantonen, wat nuttig is voor het diagnosticeren van G6PD-deficiëntie. |
| Mucoviscidose | Een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door de productie van taai, visceus slijm, wat leidt tot veranderingen in de samenstelling van secretieproducten van klieren zoals de pancreas, bronchi en zweetklieren. |
| CFTR eiwit | Staat voor Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator; een eiwit dat betrokken is bij het transport van chloride-ionen door het celmembraan. Mutaties in het CFTR-gen verstoren de productie of functie van dit eiwit. |
| Immunohistochemie | Een techniek die wordt gebruikt om de lokalisatie van specifieke eiwitten, zoals het CFTR-eiwit, op weefselcoupes te detecteren met behulp van antilichamen. |
| Wild type | Verwijst naar de normale, niet-gemuteerde vorm van een gen of eiwit. Bij het CFTR-eiwit betekent dit dat het correct wordt geproduceerd en naar de apicale membraan wordt getransporteerd. |
| Mutatie | Een verandering in de genetische code. Een veelvoorkomende mutatie bij mucoviscidose is de deletie van een aminozuur op positie 508 van het CFTR-eiwit, wat leidt tot retentie en afbraak van het eiwit in het endoplasmatisch reticulum. |
| Subcellulaire mislocatie | De verkeerde plaatsing van een eiwit binnen de cel. Bij mucoviscidose kan het gemuteerde CFTR-eiwit subcellulair misplaatst zijn, waardoor het zijn functie niet kan uitoefenen. |
| Elektronenmicroscopie (EM) | Een microscopische techniek die elektronen gebruikt in plaats van licht om beelden te genereren, waardoor veel hogere vergrotingen en resoluties mogelijk zijn dan bij lichtmicroscopie. |
| Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) | Een type elektronenmicroscopie waarbij een elektronenbundel over het oppervlak van een preparaat wordt gescand. Het genereert een driedimensionaal beeld van het oppervlak door de detectie van teruggekaatste en secundaire elektronen. |
| Vacuümtechnologie | Essentieel voor elektronenmicroscopie omdat elektronen gemakkelijk worden gestopt door gasmoleculen. Een hoog vacuüm is nodig om de elektronenbundel ongehinderd te laten reizen. |
| Fixatie- en kleuringstechnieken | Methoden die worden gebruikt om biologische monsters voor te bereiden voor elektronenmicroscopie. Fixatie stabiliseert de celstructuren, terwijl kleuring met zware metalen contrast creëert door de interactie van de metalen met specifieke moleculen in het monster. |
| Negatieve kleuring | Een preparatietechniek in TEM waarbij het monster wordt omgeven door een zwaarmetaal-oplossing. Het metaal vult de ruimtes rondom het monster, waardoor het monster zelf wit afsteekt tegen een zwarte achtergrond. |
| PAS-kleuring | Een histologische kleuringstechniek die vrije suikers aankleurt, vaak gebruikt om slijm en microvilli aan te tonen in biologische preparaten. |
| Hematoxyline | Een kleurstof die, vaak in combinatie met een beitsmiddel zoals aluminiumzouten, kationisch is en reageert met negatief geladen, basofiele celbestanddelen zoals nucleïnezuren in de celkern, wat resulteert in een blauwe of donkerpaarse kleur. |
| Eosine | Een anionische, zure kleurstof die reageert met positief geladen, acidofiele componenten in het weefsel, zoals aminogroepen in eiwitten in het cytoplasma, wat resulteert in een roze kleur. |
| HE-kleuring (Hematoxyline en Eosine) | Een veelgebruikte histologische kleuringstechniek die hematoxyline en eosine combineert om verschillende weefselstructuren zichtbaar te maken, waarbij kernen blauw/paars en cytoplasma/extracellulaire matrix roze kleuren. |
| Fasecontrastmicroscopie | Een lichtmicroscopietechniek die kleine faseverschuivingen in licht, veroorzaakt door brekingsverschillen in het preparaat, omzet in amplitudeveranderingen (licht/donker), waardoor ongekleurde preparaten, zoals levende cellen, zichtbaar worden. |
| Differentieel Interferentie-Contrast (DIC) microscopie | Een techniek die gebruikmaakt van verschillen in interferentie van doorvallend gepolariseerd licht om beeldcontrast te genereren, vereist gespecialiseerde optica zoals prisma's en interferentiefilters. |
| Klaarveldmicroscoop | Een standaard lichtmicroscoop waarbij het preparaat verlicht wordt door wit licht en het beeld wordt gevormd door de absorptie en verstrooiing van dit licht door het preparaat. |
| Basofiel | Een celcomponent of weefselstructuur die een sterke affiniteit heeft voor basische kleurstoffen en daardoor een blauwe of paarse kleur aanneemt, zoals de celkern die rijk is aan nucleïnezuren. |
| Acidofiel (Eosinofiel) | Een celcomponent of weefselstructuur die een sterke affiniteit heeft voor zure kleurstoffen en daardoor een roze kleur aanneemt, zoals eiwitten met aminogroepen. |
| Ionische binding | Het primaire bindingsmechanisme in histologische kleuringstechnieken, waarbij elektrostatische aantrekking plaatsvindt tussen ionen met tegengestelde ladingen, waarvan er één in het weefsel en de ander in de kleurstof aanwezig is. |
| Beitsmiddel | Een verbinding, vaak een metaalkation zoals aluminium, die helpt bij het hechten van een kleurstof, zoals hematoxyline, aan het weefsel, waardoor de kleuring effectiever wordt. |
| Microvilli (Borstelzoom/Staafjeszoom) | Kleine, vingerachtige uitsteeksels aan het apicale oppervlak van epitheelcellen, die de oppervlakte vergroten voor absorptie en die zichtbaar gemaakt kunnen worden met PAS-kleuring. |
| Epifluorescentie | Een methode binnen de fluorescentiemicroscopie waarbij het preparaat wordt geactiveerd met excitatielicht van korte golflengte, zoals ultraviolet of blauw licht. Het fluorochroom in het preparaat zendt vervolgens emissielicht uit met een langere golflengte, wat wordt gedetecteerd. |
| Confocale laser scanning microscopie (CLSM) | Een geavanceerde techniek binnen de fluorescentiemicroscopie die gebruikmaakt van een laser als exciterende lichtbron. CLSM maakt het mogelijk om optische doorsneden van een preparaat te verkrijgen, wat resulteert in beelden met een hogere resolutie en minder achtergrondruis. |
| Excitatiespectrum | Het bereik aan golflengten van licht dat door een fluorochroom kan worden geabsorbeerd om fluorescentie te induceren. Dit spectrum geeft aan bij welke golflengten de fluorochroom het meest efficiënt licht absorbeert. |
| Emissiespectrum | Het bereik aan golflengten van licht dat door een fluorochroom wordt uitgezonden nadat het excitatielicht heeft geabsorbeerd. De golflengte van het emissiespectrum is altijd groter dan of gelijk aan die van het excitatiespectrum. |
| Barrièrefilter | Een filter dat wordt gebruikt in fluorescentiemicroscopen om het excitatielicht tegen te houden en alleen het emissielicht door te laten naar de detector. Dit zorgt ervoor dat de zwakke fluorescentie van het preparaat duidelijk zichtbaar is. |
| Ion-gevoelige kleurstoffen | Fluorescerende moleculen waarvan de fluorescentie-eigenschappen veranderen in reactie op de concentratie van specifieke ionen, zoals calciumionen ($Ca^{2+}$). Ze worden gebruikt om de intracellulaire ionenconcentraties te meten en te visualiseren. |
| Immunofluorescentie microscopie | Een techniek waarbij specifieke eiwitten in cellen of weefsels worden gedetecteerd met behulp van antilichamen waaraan een fluorochroom is gekoppeld. Dit maakt de lokalisatie en distributie van deze eiwitten zichtbaar. |
| Fluorescente eiwitten | Eiwitten die zelf fluorescentie vertonen, zoals Green Fluorescent Protein (GFP) en Yellow Fluorescent Protein (YFP). Ze kunnen worden gebruikt om specifieke eiwitten in levende cellen te taggen en te volgen, waardoor hun dynamiek en lokalisatie bestudeerd kan worden. |
| Colocalisatie | Het verschijnsel waarbij twee of meer verschillende fluorescerende signalen zich op dezelfde locatie binnen een cel of weefsel bevinden. Dit duidt op een mogelijke functionele interactie of nabijheid van de gevisualiseerde moleculen. |
| Celcultuur | Een techniek waarbij cellen buiten het lichaam in een gecontroleerde omgeving worden gekweekt, vaak op een voedingsbodem in een petrischaal of kweekfles, om ze te bestuderen of te manipuleren. |
| Passages | Het proces waarbij een celcultuur wordt gesplitst en de cellen worden overgebracht naar nieuwe kweekmedia en recipiënten, waardoor de cultuur kan blijven groeien en de cellen worden vermenigvuldigd. |
| Cellijn | Een populatie van cellen die afkomstig is van een enkele oorspronkelijke cel en die in staat is tot onbeperkte deling (geïmmortaliseerd), vaak verkregen uit tumoren of na selectieprocessen. |
| Immortalisatie | Het proces waarbij cellen het vermogen krijgen om zich onbeperkt te delen, wat kan gebeuren door genetische manipulatie, virale infectie met oncogenen, of selectie na een "crisis"-fase in de cultuur. |
| Senescence | Een proces van celveroudering waarbij cellen stoppen met delen en uiteindelijk afsterven, wat een natuurlijke beperking is voor de levensduur van de meeste normale celculturen. |