1-methoden en technieken.pptx

# Basisprincipes van microscopie Hieronder vindt u een gedetailleerd studieoverzicht van de basisprincipes van microscopie, gebaseerd op de verstrekte documentatie en gericht op de gevraagde pagina's. ## 1\. Basisprincipes van microscopie Dit onderwerp introduceert de fundamentele concepten die ten grondslag liggen aan lichtmicroscopie, met een focus op de instrumentele componenten, vergroting, en de cruciale beperkingen en bepalende factoren van resolutie. ### 1.1 Componenten van een lichtmicroscoop Een standaard lichtmicroscoop is samengesteld uit drie essentiële lenssystemen die samenwerken om een vergoot beeld van een preparaat te creëren: * **Condensor:** Dit lenssysteem bevindt zich onder het objectplatform en heeft als functie het licht van de lichtbron te bundelen en te concentreren op het te observeren preparaat. * **Objectief:** Dit is de lens die zich het dichtst bij het preparaat bevindt. Het objectief creëert de primaire vergroting van het object en speelt een cruciale rol in de resolutie van het beeld. * **Oculair:** Deze lens bevindt zich bij het oog van de waarnemer. Het oculair neemt het door het objectief gecreëerde beeld over en vergroot dit verder. De totale vergroting die door een lichtmicroscoop wordt bereikt, is het product van de vergroting van het objectief en de vergroting van het oculair. Dit kan wiskundig worden uitgedrukt als: $$ \\text{Eindvergroting} = \\text{Vergroting objectief} \\times \\text{Vergroting oculair} $$ ### 1.2 Resolutie en vergroting Resolutie, de kleinste afstand tussen twee punten waarbij deze punten nog als afzonderlijk kunnen worden waargenomen, is een fundamentele beperking van elk optisch instrument. In tegenstelling tot vergroting, die de schijnbare grootte van een object vergroot, bepaalt resolutie de mate van detail die zichtbaar is. De minimale resolutie van het menselijk oog ligt rond de $0.1$ millimeter. Een standaard lichtmicroscoop kan objecten tot ongeveer $0.2$ micrometer scheiden, terwijl een elektronenmicroscoop een resolutie kan bereiken van ongeveer $0.1$ nanometer. De maximale nuttige vergroting wordt bepaald door de resolutie van de microscoop. Zonder voldoende resolutie resulteert verdere vergroting in "lege vergroting", waarbij het beeld wel groter wordt, maar geen nieuwe details worden onthuld. De relatie tussen de resolutie van het oog en de microscoop is als volgt: $$ \\text{Resolutie oog} = \\text{Resolutie microscoop} \\times \\text{Vergrotingsfactor} $$ ### 1.3 Factoren die de resolutie bepalen De resolutie van een lichtmicroscoop is hoofdzakelijk afhankelijk van de eigenschappen van het objectief en de eigenschappen van het gebruikte licht. Twee belangrijke factoren zijn: * **Numerieke apertuur (NA):** De numerieke apertuur van een objectief is een maat voor het vermogen om licht te verzamelen en een object op te lossen. Het wordt gedefinieerd als het product van de brekingsindex van het medium tussen het objectief en het preparaat ($N$) en de sinus van de halve openingshoek van het objectief ($\\alpha$). $$ NA = N \\cdot \\sin \\alpha $$ Een hogere NA leidt tot een betere resolutie. * **Golflengte van het licht ($\\lambda$):** De resolutie is omgekeerd evenredig met de golflengte van het gebruikte licht. Kortere golflengten resulteren in een hogere resolutie. De resolutie ($R$) kan worden benaderd met de volgende formule: $$ R = K \\cdot \\frac{\\lambda}{NA} $$ Hierbij is $K$ een constante die afhangt van de gebruikte microscopische techniek. Het zichtbare lichtspectrum heeft golflengten variërend van ongeveer $390$ tot $700$ nanometer. Voor elektronenmicroscopen worden versnelde elektronen gebruikt, die effectieve golflengten hebben die aanzienlijk korter zijn (rond $0.2$ nanometer), wat de extreem hoge resolutie van deze instrumenten verklaart. > **Tip:** Begrijp het onderscheid tussen vergroting en resolutie. Vergroting maakt iets groter, maar resolutie bepaalt hoeveel detail u kunt zien. Een microscoop met hoge vergroting maar lage resolutie zal ongedetailleerde, "korrelige" beelden produceren. ### 1.4 Contrastverhogende technieken In veel biologische preparaten, met name levende cellen, is het contrast laag. Om deze structuren beter zichtbaar te maken, worden diverse microscopische technieken toegepast: * **Helderveldmicroscopie:** De standaardmethode waarbij het monster tegen een heldere achtergrond wordt bekeken. * **Fasecontrastmicroscopie:** Deze techniek zet faseverschillen in licht, veroorzaakt door variaties in de optische dichtheid van het preparaat, om in helderheidsverschillen. Dit resulteert vaak in een kenmerkend halo-effect rond structuren. * **Interferentiecontrastmicroscopie:** Vergelijkbaar met fasecontrast, maar gebruikt interferentie van licht om pseudo-reliëf effecten te creëren, wat een meer driedimensionaal ogend beeld oplevert. * **Fluorescentiemicroscopie:** Maakt gebruik van fluorescerende moleculen (fluorochromen) die licht van een bepaalde golflengte absorberen en vervolgens licht met een langere golflengte uitzenden. Dit maakt de detectie van specifieke moleculen of structuren mogelijk. Verschillende kleuringen met verschillende fluorochromen kunnen worden gecombineerd om meerdere componenten tegelijk te visualiseren (bv. nucleus met DAPI/Hoechst, mitochondriën met MitoTracker Red CMXRos, cytoskelet met Alexa Fluor 488). * **Confocale microscopie:** Deze geavanceerde techniek maakt het mogelijk om optische coupes van een preparaat te verkrijgen door gebruik te maken van een pinhole die verstrooid licht elimineert. Door meerdere optische coupes te "stapelen", kan een gedetailleerd driedimensionaal beeld worden gereconstrueerd. Voor het observeren van levende cellen worden vaak omgekeerde (inverted) microscopen gebruikt, waarbij de objectieven zich onder het monster bevinden, wat de manipulatie van cellen op het objectplatform vergemakkelijkt. * * * # Contrastverhogende technieken en fluorescentiemicroscopie Dit deel behandelt methoden om het contrast in ongekleurde preparaten te verbeteren en introduceert de principes van fluorescentiemicroscopie. ### 2.1 Technieken voor contrastverbetering in ongekleurde preparaten Voor het visualiseren van structuren in cellen en weefsels die inherent weinig kleur absorberen, zijn er specifieke technieken ontwikkeld om het contrast te verhogen. Zonder kleuring zijn veel biologische preparaten transparant, wat de observatie bemoeilijkt. #### 2.1.1 Fasecontrastmicroscopie Fasecontrastmicroscopie is een techniek die gebruikmaakt van interferentie om verschillen in brekingsindex van verschillende delen van het preparaat om te zetten in helderheidsverschillen. Dit is met name nuttig voor het observeren van levende, ongekleurde cellen en weefsels. De techniek maakt gebruik van een speciaal ontworpen condensor met een faseplaat en een objectief met een ringvormige apertuur. * **Principe:** Verschillende delen van een biologisch preparaat, zoals organellen binnen een cel, hebben verschillende brekingsindices. Wanneer licht door deze structuren gaat, wordt het niet alleen verzwakt, maar ook uit fase gebracht ten opzichte van het licht dat eromheen gaat. De faseplaat in het objectief en de ringvormige apertuur in de condensor manipuleren de faseverschillen op zodanige wijze dat ze interfereren en resulteren in zichtbare helderheidsverschillen. * **Kenmerkend effect:** Typisch wordt een halo-effect waargenomen rondom de structuren die geobserveerd worden. #### 2.1.2 Interferentiecontrastmicroscopie Interferentiecontrastmicroscopie, ook bekend als differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie, is een geavanceerdere techniek die nog meer gedetailleerde pseudo-relief beelden kan produceren dan fasecontrast. Deze methode maakt gebruik van gepolariseerd licht en interferentie om kleine hoogte- en brekingsindexverschillen te detecteren. * **Principe:** Twee lichtbundels worden door het preparaat gestuurd, waarbij één bundel door een referentiedeel gaat en de andere door het preparaat zelf. Eventuele faseverschillen die ontstaan door verschillen in optische dikte (product van dikte en brekingsindex) worden gedetecteerd door interferentie wanneer de bundels weer worden samengevoegd. * **Kenmerkend effect:** Produceert beelden met een schijnbaar reliëf, wat de driedimensionale structuur van het preparaat benadrukt. > **Tip:** Beide technieken, fasecontrast en interferentiecontrast, zijn essentieel voor de studie van levende cellen omdat ze geen kleuring vereisen, wat de levensvatbaarheid van de cellen niet aantast. Omkeer (inverted) microscopen worden vaak gebruikt in combinatie met deze technieken voor het observeren van cellen die op de bodem van een kweekfles groeien. ### 2.2 Fluorescentiemicroscopie Fluorescentiemicroscopie is een krachtige techniek die gebruikmaakt van fluorescentie, het verschijnsel waarbij een stof licht van een bepaalde golflengte absorbeert en vervolgens licht van een langere golflengte uitzendt. #### 2.2.1 Epifluorescentie Epifluorescentie is de meest voorkomende vorm van fluorescentiemicroscopie. Bij deze techniek wordt het excitatie-licht via de objectieflens op het preparaat gericht. Het uitgezonden fluorescentielicht wordt vervolgens ook door dezelfde objectieflens opgevangen en naar de detector geleid. * **Werking:** Een specifieke golflengte van licht (excitatie licht) wordt door een filter geselecteerd en door de condensor op het preparaat gericht. Moleculen in het preparaat die de juiste eigenschappen hebben (fluorochromen, autofluorescentie) absorberen dit licht en zenden vervolgens licht uit met een langere golflengte (emissielicht). Een tweede filter, het emissiefilter, scheidt dit emissielicht van het excitatie licht, zodat alleen het fluorescentie signaal gedetecteerd kan worden. * **Belangrijke fenomenen:** * **Photobleaching:** Langdurige blootstelling aan intens licht kan leiden tot het onherstelbaar afbreken van de fluorochromen, waardoor het fluorescentiesignaal afneemt. > **Tip:** Om photobleaching te minimaliseren, gebruik zo min mogelijk lichtintensiteit en blootstellingstijd, en overweeg het gebruik van anti-fade reagentia in de preparaten. #### 2.2.2 Analyse van overlappende beelden (Overlay) Bij het gebruik van meerdere fluorescentiemarkeringen (fluorochromen) in één preparaat, kan men beelden van de verschillende kanalen combineren om de ruimtelijke relaties tussen verschillende moleculen of structuren te bestuderen. * **Principe:** Elk fluorchroom zendt licht uit in een specifiek golflengtebereik. Met behulp van specifieke filters voor elk fluorchroom worden aparte beelden verkregen. Deze beelden worden vervolgens digitaal samengevoegd, waarbij elke kleur een ander fluorchroom vertegenwoordigt. * **Voorbeeld:** Een cel kan worden gekleurd met: * DAPI of Hoechst voor de nucleus (blauw fluorescentie). * Alexa Fluor 488 voor cytoskeletale structuren zoals actine filamenten (groen fluorescentie). * MitoTracker Red voor mitochondriën (rood fluorescentie). Door deze beelden te overlappen, kan men de locatie van de mitochondriën ten opzichte van de celkern en het cytoskelet bestuderen. Dit is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire processen zoals celbeweging, energieproductie en celdeling. > **Voorbeeld:** Een analyse van menselijke longcellen (MRC-5 lijn) met MitoTracker Red CMXRos, Alexa Fluor 488-geconjugeerd aan phalloidine, en DAPI. Deze kleuringen visualiseren respectievelijk het intracellulaire mitochondriale netwerk, cytoskeletale actine filamenten, en de nucleus. De overlay van deze beelden maakt het mogelijk om de interactie en locatie van deze cellulaire componenten te bestuderen. #### 2.2.3 Confocale microscopie Confocale microscopie is een geavanceerde vorm van fluorescentiemicroscopie die optische coupes van een preparaat kan maken, waardoor beelden met een hoge resolutie en zonder de storende achtergrondfluorescentie verkregen worden. * **Principe:** Het kernprincipe is de 'pinhole' (kleine opening) in de detectiepad. Alleen licht dat afkomstig is uit het brandpunt van de objectieflens wordt door de pinhole doorgelaten. Licht dat van boven of onder het brandpunt komt, wordt effectief geblokkeerd. Door het preparaat punt voor punt af te tasten en de verzamelde signalen te combineren, wordt een optische coupe gecreëerd. * **Stack:** Een verzameling van opeenvolgende optische coupes, genomen op verschillende dieptes binnen het preparaat, vormt een 'stack'. Deze stack kan vervolgens worden gebruikt om een driedimensionale reconstructie van het preparaat te maken, wat gedetailleerde inzichten biedt in de ruimtelijke organisatie van cellulaire structuren. > **Voorbeeld:** Beelden van HeLa Kyoto cellen met Tubuline-GFP, GPI-YFP, en H2B-mCherry, verkregen met confocale microscopie, tonen de distributie van verschillende eiwitten en celonderdelen in 3D. Deze technieken vormen de basis voor veel hedendaags biologisch onderzoek, waardoor onderzoekers fundamentele inzichten verkrijgen in de complexe structuren en processen binnen levende organismen. * * * # Weefsel- en celpreparatie voor microscopie Dit deel beschrijft de methoden voor het verkrijgen van weefsels en cellen en de daaropvolgende preparatietechnieken voor microscopisch onderzoek. ### 3.1 Verkrijgen van weefsels en cellen Weefsels en cellen kunnen op verschillende manieren worden verkregen voor microscopisch onderzoek. #### 3.1.1 Chirurgische wegname en biopsie * **Operatieve wegname van organen/weefsels:** Dit is een invasieve methode waarbij organen of delen van weefsels chirurgisch worden verwijderd. * **Biopsie:** Dit is een minder invasieve procedure waarbij een klein stukje weefsel wordt weggenomen voor onderzoek. Er zijn verschillende typen biopsieën: * **Endoscopische biopsie:** Weefsel wordt weggenomen via een endoscoop. * **Naaldbiopsie:** Weefsel wordt verkregen met behulp van een naald. * **Excisie biopsie:** Het gehele afwijkende weefsel wordt chirurgisch verwijderd. * **Punch biopsie:** Een ronde stans wordt gebruikt om een cilindervormig stukje weefsel te verkrijgen. * **Incisie biopsie:** Een deel van een grotere laesie wordt weggenomen. #### 3.1.2 Verkrijgen van afzonderlijke cellen Afzonderlijke cellen kunnen worden verkregen via diverse methoden: * **Operatief:** Dit kan verwijzen naar cellen die vrijkomen tijdens chirurgische procedures. * **Biopsie:** Soms kunnen cellen ook direct worden verkregen uit biopsiemateriaal. * **Fijne naald aspiratie (cytologie):** Cellen worden opgezogen uit een laesie of orgaan met een fijne naald. * **Cervixborstel (cytobrush):** Gebruikt voor het verkrijgen van cellen van de cervix. * **Mondschraper:** Voor het afnemen van cellen uit de mondholte. * **Lichaamsvloeistoffen:** Cellen kunnen worden geïsoleerd uit vloeistoffen zoals bloed, urine, of ascitesvocht. ### 3.2 Paraffine techniek De paraffine techniek is een veelgebruikte methode voor het prepareren van weefsels voor histologisch onderzoek. Het proces bestaat uit de volgende stappen: #### 3.2.1 Fixatie * **Doel:** Het conserveren van de weefselstructuur, het stoppen van cellulaire functies en het op zijn plaats houden van cellulaire componenten. * **Veelgebruikt fixativum:** Formaldehyde. * **Werking:** Fixatoren voorkomen autolyse (zelfvertering) en postmortale veranderingen door weefselcomponenten te stabiliseren, vaak door cross-linking van eiwitten. * **Typen fixatoren:** Enkelvoudige en samengestelde fixatoren worden gebruikt, afhankelijk van de specifieke vereisten. #### 3.2.2 Inbedding Na fixatie ondergaat het weefsel een proces van dehydratatie en infiltratie: * **Dehydratatie:** Het weefsel wordt geleidelijk aan blootgesteld aan oplopende concentraties alcohol (bijvoorbeeld van 70% naar 100%) om het water te verwijderen. * **Overbrenging naar infiltratiemiddel:** Vervolgens wordt het weefsel overgebracht naar een oplosmiddel zoals tolueen of xyleen, dat de alcohol vervangt en compatibel is met paraffine. * **Infiltratie met paraffine:** Het weefsel wordt geïmpregneerd met gesmolten paraffine. * **Inbedden:** Het geïnfiltreerde weefsel wordt in een mal geplaatst en de paraffine wordt gestold, waardoor een vaste blok ontstaat waarin het weefsel is ingesloten. #### 3.2.3 Snijden * Het paraffineblok met het ingebedde weefsel wordt vervolgens met een microtoom in zeer dunne coupes (typisch 3-5 micrometer dik) gesneden. #### 3.2.4 Monteren en kleuren * **Deparaffineren:** De paraffinecoupes worden eerst ontdaan van de paraffine door ze opnieuw bloot te stellen aan oplosmiddelen zoals xyleen, gevolgd door een reeks dalende alcoholconcentraties terug naar water. * **Kleuringsprocedure:** De coupes worden vervolgens gekleurd met specifieke kleurstoffen om verschillende cellulaire en weefselstructuren zichtbaar te maken. * **Monteren:** Na kleuring worden de coupes op een objectglas gemonteerd en afgedekt met een dekglaasje, vaak in een medium dat de kleuring conserveert. ### 3.3 Cryosectie techniek De cryosectie techniek is een snelle methode om weefselcoupes te verkrijgen, vooral nuttig wanneer fixatie en inbedding in paraffine niet wenselijk zijn. #### 3.3.1 Invriezen * Het weefsel wordt snel ingevroren met behulp van vloeibare stikstof (ongeveer -180°C) of droogijs (vaste CO₂, ongeveer -70°C). #### 3.3.2 Inbedden en snijden * **Inbedden:** Het ingevroren weefsel wordt vaak ingebed in een cryoprotectief medium zoals OCT (Optimal Cutting Temperature) compound. * **Bewaren en snijden:** Het ingebedde weefsel wordt bewaard en gesneden op een cryostaat bij temperaturen rond -20°C. #### 3.3.3 Voordelen en toepassingen * **Snelheid:** Cryosectie is aanzienlijk sneller dan de paraffine techniek, wat essentieel is tijdens chirurgische ingrepen voor snelle diagnostiek. * **Kwaliteit:** De coupes zijn over het algemeen van lagere kwaliteit dan bij paraffine coupes, met minder detail. * **Geschikt voor:** * Detectie van componenten die oplossen (bv. vetten) of denatureren (bv. bepaalde eiwitten zoals GFP) tijdens de paraffine techniek. * Detectie van enzymactiviteit. * Bewaring van RNA, DNA en bepaalde eiwitstructuren die gevoelig zijn voor de paraffinefixatie en -inbedding. * **Vervolgonderzoek:** Cellen en weefsels geprepareerd via cryosectie kunnen vaak nog worden gebruikt voor verdere moleculaire analyses. ### 3.4 Kleuren (contrasteren) Kleuring is essentieel om structuren in weefselcoupes zichtbaar te maken, aangezien de meeste weefselcomponenten kleurloos zijn. #### 3.4.1 Hematoxyline en Eosine (H&E) * **Hematoxyline:** Kleurt zure componenten zoals de celkern in paars-blauw. Het is een basofiele kleurstof. * **Eosine:** Kleurt basische componenten zoals cytoplasma en extracellulaire matrix in roze. Het is een acidofiele kleurstof. * **Toepassing:** H&E is de meest gebruikte standaardkleuring in de histologie voor algemene morfologische analyse. #### 3.4.2 PAS kleuring (Periodiek zuur - Schiff's reagent) * **Werking:** Perjoodzuur breekt koolhydraten af, waarbij aldehydegroepen vrijkomen. Deze aldehyden reageren vervolgens met Schiff's reagent, wat resulteert in een fuchsia-rode kleuring. * **Toepassing:** Kleurt suikers en slijm, zoals in slijmbekercellen van de darmvillus. Het kan ook worden gebruikt om basale membranen aan te tonen. #### 3.4.3 Overige speciale kleuringsmethoden Er zijn talloze speciale kleuringsmethoden beschikbaar om specifieke weefselcomponenten, eiwitten, vetten, mineralen, etc. aan te tonen. Voorbeelden zijn kleuringsmethoden voor bindweefsel, vetten, pigmenten en micro-organismen. ### 3.5 Speciale technieken voor microscopie Naast standaard kleurtechnieken zijn er diverse geavanceerde methoden om specifieke moleculen of structuren te visualiseren. #### 3.5.1 Autoradiografie * **Principe:** Radioactief gelabelde moleculen (bijvoorbeeld $^3$H-thymidine, dat wordt opgenomen door delende cellen) worden toegediend aan levende cellen of weefsels. * **Procedure:** Een coupe van het behandelde weefsel wordt blootgesteld aan een fotografische emulsie. * **Visualisatie:** Zwarte zilverkorrels verschijnen in de emulsie op plaatsen waar radioactiviteit is gedetecteerd, wat de locatie van de radioactief gelabelde moleculen aangeeft. * **Toepassing:** Identificatie van delende cellen of de lokalisatie van specifieke moleculen na toediening van een radioactieve precursor. #### 3.5.2 Enzymhistochemie * **Principe:** Detecteert de aanwezigheid en activiteit van specifieke enzymen in weefselcoupes. * **Voorbeeld (Peroxidase):** In aanwezigheid van waterstofperoxide ($H\_2O\_2$) en een substraat zoals DAB (3,3'-diaminobenzidine), produceert peroxidase een onoplosbaar bruin neerslag op de plaats van enzymactiviteit. * **Toepassing:** Wordt vaak gebruikt als label in immunohistochemie en voor het detecteren van enzymatische activiteit. #### 3.5.3 Immunocytochemie en Immunohistochemie * **Principe:** Maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan doelantigenen (eiwitten) in cellen of weefsels. * **Labels:** Het antilichaam is gekoppeld aan een marker die zichtbaar wordt gemaakt: * **Fluorochroom:** (bv. FITC, TRITC, Alexa dyes) voor fluorescentiemicroscopie. * **Enzym:** (bv. peroxidase, alkaline fosfatase) dat een kleurreactie genereert. * **Colloïdaal goud:** Gekoppeld aan proteïne A (uit \_Staphylococcus aureus), wat zichtbaar is onder de elektronenmicroscoop of na zilverversterking. * **Typen antilichamen:** * **Polyclonale antilichamen:** Geproduceerd tegen meerdere epitopen van een antigen. * **Monoklonale antilichamen:** Geproduceerd tegen één specifiek epitoop, wat meer specificiteit biedt (vaak verkregen via hybridoma technologie). * **Direct vs. Indirect:** * **Directe immunocytochemie:** Het primaire antilichaam is direct gelabeld. * **Indirecte immunocytochemie:** Een gelabeld secundair antilichaam bindt aan het primaire antilichaam, wat de signaalintensiteit versterkt. #### 3.5.4 In situ hybridisatie (ISH) * **Principe:** Detecteert de aanwezigheid van specifieke nucleïnezuren (DNA of RNA) in cel- of weefselcoupes door gebruik te maken van complementaire, gelabelde sondes. * **Procedure:** Een gelabelde probe (bv. met een fluorochroom of een enzym) hybridiseert met het doel-nucleïnezuur in de cel of het weefsel. * **Toepassing:** * Detectie van virale DNA of RNA in geïnfecteerde cellen (bv. humaan papillomavirus). * Detectie van mRNA-expressie van specifieke genen. * **FISH (Fluorescentie In Situ Hybridisatie):** Een variant van ISH waarbij fluorescerende labels worden gebruikt om chromosoomaberraties te detecteren, zoals trisomie 21 (Downsyndroom) of afwijkingen van specifieke chromosoomregio's. ### 3.6 Elektronenmicroscopie preparatie Voor elektronenmicroscopie (TEM en SEM) zijn zeer gespecialiseerde preparatiemethoden vereist vanwege de hoge resolutie en de aard van de gebruikte elektronenbundels. #### 3.6.1 Fixatie * **Fixatie:** Er wordt gebruik gemaakt van chemische fixatie met fixatieven zoals glutaaraldehyde en osmiumtetroxide ($OsO\_4$), die eiwitten en lipiden zeer effectief stabiliseren en contrast toevoegen. #### 3.6.2 Inbedden en snijden (TEM) * **Inbedden:** Het weefsel wordt ingebed in kunstharsen (bv. epoxyharsen) die geschikt zijn voor ultramicrotomie. * **Snijden:** Met een ultramicrotoom worden coupes van zeer geringe dikte (typisch 50-100 nanometer) gesneden. #### 3.6.3 Monteren en contrasteren (TEM) * **Monteren:** De ultradunne coupes worden gemonteerd op metalen gridjes. * **Contrasteren:** De coupes worden vervolgens behandeld met zware metalen zouten (bv. uranielacetaat en loodcitraat) om de contrasten te verhogen, aangezien biologisch materiaal weinig contrast heeft voor elektronen. #### 3.6.4 SEM preparatie Voor Scanning Electron Microscopy (SEM) wordt meestal het gehele oppervlak van het object bekeken. Het object wordt gefixeerd, gedroogd (vaak via kritisch punt drogen om artefacten te minimaliseren) en vervolgens bedekt met een dunne laag geleidend metaal (bv. goud of platina) om ladingopbouw te voorkomen. ### 3.7 Geavanceerde microscopie technieken Naast de klassieke licht- en elektronenmicroscopie zijn er diverse geavanceerde technieken ontwikkeld voor specifieke toepassingen. * **Atomic Force Microscopy (AFM):** Meet het oppervlak van een monster met een uiterst fijne naald die over het oppervlak "aftast". Biedt topografische informatie op nanoschaal. * **Tweedelige (2-photon) microscopie:** Vergelijkbaar met confocale microscopie maar maakt gebruik van twee fotonen van lagere energie om exciteren te veroorzaken, wat leidt tot minder fotobleaching en diepere penetratie in dikkere monsters. * **Lightsheet microscopie:** Verlicht het monster met een dunne "sheet" van licht, wat zorgt voor efficiënte 3D-beeldvorming met minimale fototoxiciteit. Ideaal voor grotere 3D-specimens. * **Superresolutie microscopie:** Technieken zoals SIM (Structured Illumination Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) en STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) maken het mogelijk om structuren te visualiseren met een resolutie die de diffractielimiet van licht overstijgt, waardoor individuele moleculen kunnen worden waargenomen. * **NSOM (Near-Field Scanning Optical Microscopy):** Maakt gebruik van een zeer kleine apertuur of punt om licht te emitteren of te detecteren dichtbij het monsteroppervlak, wat een hogere resolutie mogelijk maakt. * **STED (Stimulated Emission Depletion) microscopie:** Een techniek die de excitatie van fluorochromen selectief onderdrukt rond de randen van de excitatiebundel, waardoor een kleinere effectieve excitatiezone ontstaat en een hogere resolutie wordt bereikt. * * * # Geavanceerde microscopietechnieken Dit onderwerp introduceert diverse geavanceerde microscopiemethoden die verder gaan dan de conventionele lichtmicroscopie om structuren met hogere resolutie en meer detail te visualiseren. ### 4.1 Confocale microscopie Confocale microscopie is een techniek die een optische coupe van een preparaat creëert, wat resulteert in beelden met een verbeterd contrast en een hogere resolutie. Het principe is gebaseerd op het gebruik van een 'pinhole' (klein gaatje) in de beeldvormingsweg. Alleen licht dat door het specimen komt en zich op hetzelfde scherptevlak bevindt als het pinhole, bereikt de detector. Licht dat afkomstig is van buiten het scherptevlak, wordt effectief weggefilterd. * **Principe:** Door optische coupes te maken, wordt achtergrondverstrooiing geminimaliseerd. * **Stack:** Een combinatie van meerdere optische coupes kan worden samengesteld tot een driedimensionale reconstructie van het specimen. ### 4.2 Elektronenmicroscopie Elektronenmicroscopie maakt gebruik van een bundel elektronen in plaats van fotonen om beelden te genereren, wat een aanzienlijk hogere resolutie mogelijk maakt. Dit komt doordat elektronen een veel kortere golflengte hebben dan zichtbaar licht. * **Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM):** * **Principe:** Elektronenstralen gaan \_door het ultradunne preparaat. Verschillen in absorptie en verstrooiing door de atomen in het preparaat creëren het contrast. * **Preparatie:** 1. **Fixatie:** Met fixatiemiddelen zoals glutaaraldehyde en osmiumtetroxide ($OsO\_4$) om de structuur te behouden en eiwitfunctie te stoppen. 2. **Inbedden:** In kunsthars om het specimen te ondersteunen voor het snijden. 3. **Snijden:** In zeer dunne coupes (typisch 50 nm). 4. **Monteren:** Op metalen gridjes. 5. **Contrasteren:** Met zware metalen om de zichtbaarheid te vergroten. * **Beeld:** Levert gedetailleerde beelden van de interne structuur van cellen en materialen. * **Scanning elektronenmicroscopie (SEM):** * **Principe:** Een bundel elektronen scant het \_oppervlak van het preparaat. Secundaire elektronen die door het oppervlak worden uitgestoten, worden gedetecteerd om een beeld te vormen. * **Preparatie:** Vereist ook fixatie en vaak een geleidende coating (bijvoorbeeld goud) om ladingophoping te voorkomen. * **Beeld:** Levert beelden met een groot scherptediepte, waardoor de driedimensionale morfologie van het oppervlak duidelijk zichtbaar wordt. ### 4.3 Atoomkrachtmicroscopie (AFM) Atoomkrachtmicroscopie is een contactloze of contact-afhankelijke techniek die de topografie van een oppervlak op atomair niveau kan scannen. * **Principe:** Een scherpe punt, bevestigd aan een flexibele cantilever (een soort veertje), scant het oppervlak. De interactiekrachten tussen de punt en het oppervlak veroorzaken een uitslag van de cantilever, die wordt gedetecteerd door een laser. ### 4.4 Superresolutiemicroscopietechnieken Deze technieken overstijgen de diffractielimiet van lichtmicroscopie (ongeveer 200-250 nm) en maken visualisatie van moleculen mogelijk. Verschillende methoden zijn ontwikkeld: * **Near-field Scanning Optical Microscopy (NSOM) / Scanning Near-field Optical Microscopy (SNOM):** * **Principe:** Maakt gebruik van een microscopische apertuur die zich zeer dicht (in het nabije veld) boven het preparaat bevindt om verstrooid licht op te vangen, waardoor resoluties onder de diffractielimiet mogelijk zijn. * **Structured Illumination Microscopy (SIM) en Spatially Modulated Illumination Microscopy (SMI):** * **Principe:** Gebruikt patronen van belichting (gestructureerde verlichting) om ruimtelijke frequentie-informatie te 'verschuiven' naar een bereik dat door de detector kan worden vastgelegd. * **Resultaat:** Verbetering van de resolutie met een factor 2. * **Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy:** * **Principe:** Een fluorescerende molecuul wordt eerst geëxciteerd met een bepaalde golflengte. Vervolgens wordt een tweede laserbundel met een hogere golflengte gebruikt om de excitatie van de fluorescerende moleculen in een ringvormige zone te 'depleteren' (uitdoven) via gestimuleerde emissie. Alleen het centrale gebied van de fluorescente emissie blijft over, wat leidt tot een kleinere effectieve emissiebron en dus hogere resolutie. * **Photoactivated Localization Microscopy (PALM) en Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM):** * **Principe:** Deze technieken maken gebruik van speciale fluorescerende moleculen die met tussenpozen 'aan' en 'uit' gezet kunnen worden. Door slechts een kleine fractie van de moleculen tegelijkertijd te laten fluoresceren, kan hun positie met hoge precisie worden bepaald. Door dit proces vele malen te herhalen en de posities van alle gelokaliseerde moleculen te combineren, wordt een superresoluut beeld opgebouwd. * **STORM:** Maakt gebruik van 'switchable' fluorochroomen. * **PALM:** Maakt gebruik van fotogeactiveerde fluorochroomen. ### 4.5 Andere Geavanceerde Technieken * **2-Photon Microscopy:** * **Principe:** Vergelijkbaar met confocale microscopie, maar maakt gebruik van twee fotonen met de helft van de energie om excitatie te bewerkstelligen. Dit heeft als voordeel dat de excitatie plaatsvindt in het focuspunt, wat leidt tot minder photobleaching en betere penetratie in diepere weefsels. * **Lightsheet Microscopy:** * **Principe:** Het specimen wordt van opzij belicht met een dunne 'lichtschaaf' bundel, terwijl het beeld vanuit een loodrechte hoek wordt opgenomen. Dit is zeer geschikt voor het beeldvormen van grotere 3D-specimens met minimale schade en snel. > **Tip:** De keuze van de microscopietechniek hangt sterk af van het type specimen, de gewenste resolutie, de aard van de te bestuderen structuren (oppervlak versus interne structuur, levend versus gefixeerd) en de benodigde informatie (morfologie, lokalisatie van moleculen, dynamiek). * * * ## Veelgemaakte fouten om te vermijden * Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens * Let op formules en belangrijke definities * Oefen met de voorbeelden in elke sectie * Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Condensor | Een optisch element in een microscoop dat licht focust op het preparaat, essentieel voor het creëren van een gelijkmatig verlicht beeld en het maximaliseren van de resolutie. | | Objectief | Het lenzensysteem in een microscoop dat zich het dichtst bij het preparaat bevindt en het primaire vergrote beeld produceert, cruciaal voor de resolutie van het beeld. | | Oculair | Het lenzensysteem in een microscoop dat het beeld van het objectief verder vergroot en direct bekeken wordt door de gebruiker, de eindvergroting bepaalt. | | Eindvergroting | De totale vergroting die een microscoop kan bereiken, berekend door de vergroting van het objectief te vermenigvuldigen met de vergroting van het oculair. | | Resolutie | De kleinste afstand tussen twee punten waarbij deze punten nog als afzonderlijk waargenomen kunnen worden; een hogere resolutie betekent een gedetailleerder beeld. | | Numerieke Apertuur (NA) | Een maat voor het lichtverzamelend vermogen van een objectief; een hogere NA leidt tot een betere resolutie en een helderder beeld. Het wordt berekend met de formule $NA = n \cdot \sin(\alpha)$, waarbij $n$ de brekingsindex van het medium is en $\alpha$ de halve openingshoek. | | Lege vergroting | Een situatie waarbij de vergroting van de microscoop wordt verhoogd zonder dat de resolutie verbetert, wat resulteert in een groter, maar minder gedetailleerd beeld. | | Heldeveld microscopie | Een standaard microscopietechniek waarbij het preparaat wordt verlicht door een heldere lichtbundel, waarbij structuren zichtbaar worden door absorptie of reflectie van licht. | | Fasecontrast microscopie | Een techniek die gebruikt wordt om contrast te creëren in transparante, ongekleurde monsters door faseverschuivingen van licht die door verschillende delen van het monster gaan, om te zetten in amplitudeverschillen. Het wordt vaak gekenmerkt door een halo-effect rond de structuren. | | Interferentiecontrast microscopie | Een techniek die interferentie van lichtgolven gebruikt om het contrast in transparante monsters te verhogen, wat leidt tot een pseudo-reliëf uiterlijk dat de diepte en structuur van het preparaat benadrukt. | | Fluorescentiemicroscopie | Een microscopietechniek die gebruik maakt van fluorescentie, waarbij specifieke moleculen in het monster licht van een bepaalde golflengte absorberen en dit uitzenden op een langere golflengte, wat leidt tot een beeld dat oplicht. | | Epifluorescentie | Een veelgebruikte methode binnen de fluorescentiemicroscopie waarbij de excitatie- en emissiebundels door hetzelfde objectief paden. | | Photobleaching | Het fotochemische proces waarbij een fluorofoor onherstelbaar beschadigd raakt door blootstelling aan licht, wat resulteert in een afname van de fluorescentie-intensiteit. | | Confocale microscopie | Een optische microscopietechniek die een optische coupe van een preparaat maakt door middel van een pinhole die ongewenste licht van buiten het focusvlak elimineert, wat resulteert in verhoogd contrast en resolutie. Een stack van deze coupes kan een 3D reconstructie vormen. | | Fixatie | Het proces waarbij biologische monsters worden behandeld om hun structuur te behouden en de biochemische activiteit te stoppen, vaak met behulp van chemicaliën zoals formaldehyde om eiwitten op hun plaats te houden en denaturatie te voorkomen. | | Paraffine techniek | Een veelgebruikte methode voor weefselvoorbereiding waarbij weefsel wordt gefixeerd, gedehydrateerd via oplopende alcoholconcentraties, ingebed in paraffine, gesneden in dunne coupes, gedeparaffineerd, gekleurd en gemonteerd. | | Dehydratatie | Het proces waarbij water uit een weefselmonster wordt verwijderd, meestal door opeenvolgende onderdompelingen in oplopende alcoholconcentraties, voorafgaand aan inbedding in een oplosmiddel zoals tolueen of xyleen. | | Deparaffineren | Het verwijderen van paraffine uit weefselcoupes, meestal door onderdompeling in oplosmiddelen zoals xyleen of tolueen, gevolgd door het terugbrengen van alcoholconcentraties in water, zodat de coupes kunnen worden gekleurd. | | Cryosectie techniek | Een snelle methode voor weefselvoorbereiding waarbij weefsel snel wordt ingevroren, vaak met vaste CO2 of vloeibare N2, en vervolgens wordt gesneden op lage temperaturen, ideaal voor het bestuderen van componenten die gevoelig zijn voor oplosmiddelen of denaturatie. | | OCT (Optimal Cutting Temperature) compound | Een wateroplosbaar medium dat wordt gebruikt bij cryosectie om weefsels te ondersteunen en te stabiliseren tijdens het invriezen en snijden, waardoor de kwaliteit van de secties wordt verbeterd. | | Kleuren (contrasteren) | Het proces waarbij kleurstoffen worden gebruikt om specifieke structuren of componenten in biologische monsters zichtbaar te maken, wat essentieel is voor hun waarneming onder de microscoop. | | Hematoxyline en Eosine (H&E) | Een veelgebruikte dubbele kleuring waarbij hematoxyline (paars-blauw) zure componenten zoals celkernen kleurt, en eosine (roze) basische componenten zoals cytoplasma kleurt. | | PAS kleuring (Periodic Acid-Schiff) | Een histologische kleuringstechniek die specifieke koolhydraten en slijmproducten identificeert door hun reactie met perjoodzuur en Schiff's reagens, resulterend in een magenta kleur. | | Autoradiografie | Een techniek die gebruik maakt van radioactief gelabelde moleculen om hun locatie en activiteit in biologische monsters te volgen, waarbij de radioactiviteit wordt gedetecteerd met fotografische emulsie. | | Enzymhistochemie | Een techniek die de locatie van enzymen in weefsels of cellen bepaalt door middel van een biochemische reactie die een zichtbaar product oplevert, zoals de peroxidase-gebaseerde reactie met DAB. | | DAB (3,3'-diaminobenzidine) | Een chromatogene substraat dat, in aanwezigheid van peroxidase en waterstofperoxide, een bruin precipitaat vormt dat zichtbaar is onder de microscoop, vaak gebruikt in immunohistochemie en enzymhistochemie. | | Immunocytochemie | Een techniek die antilichamen gebruikt om specifieke antigenen (eiwitten) in cellen of weefsels te detecteren en te visualiseren, wat kan worden gedaan via directe of indirecte methoden. | | Immunohistochemie (IHC) | Een uitbreiding van immunocytochemie die specifieke antigenen in weefselcoupes identificeert en visualiseert met behulp van antilichamen, vaak gelabeld met enzymen of fluorochromen. | | Polyclonaal antilichaam | Een antilichaam geproduceerd door meerdere B-celklonen die gericht zijn tegen verschillende epitopen van een antigeen. | | Monoclonale antilichamen | Antilichamen geproduceerd door een enkele B-celklon, die allemaal gericht zijn tegen hetzelfde specifieke epitoop op een antigeen. | | Hybridoma | Een cel die ontstaat door de fusie van een B-cel en een myeloomcel, gebruikt voor de productie van monoklonale antilichamen. | | In situ hybridisatie (ISH) | Een techniek die complementaire nucleïnezuursequenties (DNA of RNA) in cellen of weefsels detecteert door gebruik te maken van gelabelde sondes. | | FISH (Fluorescentie In Situ Hybridisatie) | Een specifieke vorm van ISH die fluorescerende probes gebruikt om DNA of RNA-sequenties in chromosomen of intacte cellen te visualiseren, vaak gebruikt voor de detectie van chromosoomaberraties. | | Elektronenmicroscoop | Een microscoop die een bundel van elektronen gebruikt om een beeld van een monster te creëren, waardoor veel hogere resoluties en vergrotingen mogelijk zijn dan met lichtmicroscopen. | | TEM (Transmission Electron Microscopy) | Transmissie-elektronenmicroscopie, waarbij elektronen door een ultradunne coupe van het monster worden gestuurd om een gedetailleerd intern beeld te verkrijgen. | | SEM (Scanning Electron Microscopy) | Scanning-elektronenmicroscopie, waarbij een elektronenbundel over het oppervlak van het monster scant en de gereflecteerde of secundaire elektronen detecteert om een 3D-beeld van het oppervlak te creëren. | | AFM (Atomic Force Microscopy) | Atoomkrachtmicroscopie, een type rastertunnelmicroscoop dat de fysieke interactie tussen een scherpe punt en het oppervlak van een monster analyseert om gedetailleerde topografische beelden te verkrijgen. | | Superresolutie microscopie | Een groep microscopietechnieken die de diffractielimiet van licht overschrijden, waardoor het mogelijk wordt om structuren te visualiseren die kleiner zijn dan de golflengte van het gebruikte licht. |