BM_TP_04_12_25 - Enzimas.pdf

# Introdução às enzimas e suas propriedades Este tópico explora a natureza, função e características fundamentais das enzimas, destacando seu papel crucial na aceleração de reações biológicas. ### 1.1 Definição e natureza das enzimas Enzimas são catalisadores biológicos que aceleram significativamente a velocidade das reações químicas no organismo. A grande maioria das enzimas são proteínas, mas algumas moléculas de RNA, conhecidas como ribozimas, também possuem capacidade catalítica. Elas desempenham um papel essencial, pois sem sua ação, a maioria das reações celulares ocorreria a velocidades muito baixas ou nem ocorreria nas condições biológicas normais (temperatura, pH neutro e ambiente aquoso) [3](#page=3). ### 1.2 Mecanismo de ação enzimática As enzimas aumentam a velocidade das reações biológicas ao diminuir seletivamente a energia de ativação. A energia de ativação é a energia necessária para que uma reação ocorra. As enzimas não são consumidas durante o processo catalítico, permanecendo intactas ao final da reação e podendo ser reutilizadas em novos ciclos catalíticos [17](#page=17) [20](#page=20) [3](#page=3) [4](#page=4). É crucial entender que as enzimas não afetam o equilíbrio químico de uma reação, nem a sua constante de equilíbrio ($K_{eq}$). Elas apenas aceleram a taxa na qual o equilíbrio é atingido. A posição e a direção do equilíbrio são determinadas pela energia livre dos reagentes e produtos, que não é alterada pela presença da enzima [17](#page=17) [19](#page=19) [20](#page=20) [21](#page=21) [3](#page=3). > **Tip:** Embora a reação possa ser termodinamicamente favorável (Δ$G$ < 0), uma alta energia de ativação pode impedir que ela ocorra espontaneamente em uma velocidade detectável. As enzimas superam essa barreira [20](#page=20). ### 1.3 Propriedades das enzimas As enzimas exibem várias propriedades distintivas que as tornam catalisadores biológicos eficientes e específicos: #### 1.3.1 Alta especificidade Uma característica marcante das enzimas é a sua alta especificidade para o substrato. Elas são capazes de distinguir substratos com estruturas muito semelhantes e ignorar moléculas competidoras. Essa especificidade garante que cada enzima catalise apenas uma reação específica ou um pequeno conjunto de reações quimicamente semelhantes [4](#page=4). #### 1.3.2 Necessidade em pequenas quantidades Enzimas são necessárias em quantidades muito pequenas em comparação com a quantidade de substrato que processam. Isso se deve ao fato de não serem consumidas na reação e serem reutilizadas repetidamente [19](#page=19) [4](#page=4). #### 1.3.3 Suscetibilidade à regulação e inibição A atividade enzimática pode ser modulada e regulada. Isso pode ocorrer através de modificações covalentes reversíveis (como a fosforilação), ligação de reguladores alostéricos, ativação por proteólise, entre outros mecanismos [4](#page=4) [5](#page=5). #### 1.3.4 Importância da estrutura conformacional A integridade da conformação nativa da enzima é essencial para sua atividade catalítica. Desnaturação, dissociação de subunidades ou degradação levam à perda da forma tridimensional, resultando na perda da atividade catalítica. As estruturas primária, secundária, terciária e quaternária são todas cruciais para a função enzimática [4](#page=4). #### 1.3.5 Local ativo O local ativo é uma região específica na enzima onde o substrato se liga e a reação catalítica ocorre, convertendo o substrato em produto. A forma do local ativo é determinada pela estrutura terciária da enzima e deve ser complementar à do substrato para que a catálise aconteça. Alterações na forma geral da enzima afetam a forma do local ativo e, consequentemente, sua atividade catalítica [5](#page=5). > **Tip:** O poder catalítico e a especificidade das enzimas resultam de interações fracas não covalentes (como interações eletrostáticas, ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas) que elas estabelecem com o substrato [5](#page=5). #### 1.3.6 Influência de fatores externos A atividade das enzimas é influenciada por fatores como pH e temperatura. Cada enzima possui um pH ótimo, pois o estado de ionização dos resíduos de aminoácidos no local ativo e em outras partes da proteína é sensível às variações de pH. Da mesma forma, a temperatura afeta a velocidade da reação; uma diminuição na temperatura geralmente reduz a velocidade da reação, pois menos moléculas terão energia suficiente para superar a barreira de ativação. As enzimas também possuem uma temperatura ótima para sua atividade [19](#page=19) [20](#page=20). ### 1.4 Modelos de interação enzima-substrato O modelo "chave-fechadura" descreve a complementaridade rígida entre enzima e substrato no local ativo. No entanto, este modelo é limitado, pois ignora a flexibilidade enzimática e as mudanças conformacionais que ocorrem durante a ligação do substrato. Além disso, não considera a estabilização do estado de transição, um fator crucial para a diminuição da energia de ativação. Modelos mais recentes e precisos consideram a indução de encaixe e a estabilização do estado de transição [13](#page=13) [21](#page=21). ### 1.5 Efeitos da enzima sobre parâmetros de reação Em uma reação que pode ocorrer com ou sem catálise enzimática: * **(a) Variação da energia livre padrão da reação ($\Delta G^0$):** A enzima **não altera** a variação da energia livre padrão da reação. Esta depende das condições padrão (temperatura, pressão, concentração inicial de substrato e produto) e da natureza do substrato e do produto [21](#page=21). * **(b) Energia de ativação da reação:** A enzima **diminui** a energia de ativação da reação. Ela estabiliza o estado de transição, facilitando a reação e permitindo que ela ocorra mais rapidamente [21](#page=21). * **(c) Velocidade inicial da reação:** A enzima **aumenta** a velocidade inicial da reação [21](#page=21). * **(d) Constante de equilíbrio da reação ($K_{eq}$):** A enzima **não altera** a constante de equilíbrio da reação. O equilíbrio é atingido mais rapidamente, mas a posição do equilíbrio permanece a mesma [17](#page=17) [21](#page=21). > **Example:** As enzimas são catalisadores altamente eficientes, podendo aumentar a velocidade de reações químicas em milhares ou milhões de vezes [19](#page=19). --- # Mecanismos de catálise enzimática e energia de ativação As enzimas aumentam a velocidade das reações químicas ao diminuírem a energia de ativação necessária para que a reação ocorra [11](#page=11) [21](#page=21). ### 2.1 A reação química e a energia de ativação A energia livre (G) de um sistema é representada em função do progresso da reação, partindo do substrato (S) para o produto (P). Uma reação química requer a superação de uma barreira energética entre o estado fundamental do substrato e o estado fundamental do produto [10](#page=10) [9](#page=9). * A velocidade das reações pode ser aumentada pelo aumento da temperatura, aumento da pressão ou adição de catalisadores [10](#page=10). * Uma energia de ativação mais elevada resulta numa reação mais lenta [10](#page=10). O topo desta barreira energética, a partir do qual o decaimento para substrato ou produto tem a mesma probabilidade, é o **estado de transição** (‡). A **energia de ativação** (ΔG‡) é a diferença entre os níveis de energia do estado fundamental e do estado de transição. Quanto maior a energia de ativação, mais lenta será a reação. Enquanto a energia livre (ΔG’º) indica se uma reação pode ocorrer, a energia de ativação (ΔG‡) determina a rapidez com que ela ocorre [11](#page=11) [12](#page=12). ### 2.2 O papel das enzimas na catálise As enzimas atuam como catalisadores, aumentando a velocidade de uma reação sem alterar o seu equilíbrio. Elas aceleram a interconversão entre substrato e produto, catalisando a reação em ambas as direções (S → P e P → S), mas não afetam a posição e direção do equilíbrio, apenas o atingem mais rapidamente por aumentarem a velocidade [12](#page=12) [9](#page=9). As reações catalisadas por enzimas podem envolver várias etapas, incluindo a formação e consumo de intermediários como o complexo enzima-substrato (ES) e o complexo enzima-produto (EP). A velocidade final da reação é determinada pela etapa (ou etapas) com a maior energia de ativação, conhecida como etapa limitante da velocidade [12](#page=12). > **Tip:** Embora as enzimas aumentem a velocidade de uma reação, elas não alteram a variação da energia livre padrão da reação (ΔG’º) nem a constante de equilíbrio (Keq). Estes parâmetros dependem apenas da natureza dos reagentes e produtos e das condições de temperatura e pressão, não sendo influenciados pela enzima [21](#page=21). ### 2.3 Mecanismos de diminuição da energia de ativação As enzimas diminuem a energia de ativação principalmente através da **estabilização do estado de transição**. O sítio ativo da enzima é complementar ao estado de transição da reação, permitindo interações ótimas entre a enzima e o substrato apenas quando este se encontra nesse estado. A complementaridade total entre a enzima e o substrato ocorre somente no estado de transição [11](#page=11) [14](#page=14). A ligação do substrato à enzima pode induzir uma mudança conformacional na enzima (fenómeno conhecido como **encaixe induzido**), que cria várias interações fracas adicionais com o substrato. Esta mudança conformacional posiciona corretamente os grupos funcionais da enzima no sítio ativo para catalisar a reação e estabiliza o estado de transição [14](#page=14) [16](#page=16). #### 2.3.1 Interações não covalentes e energia de ligação O poder catalítico e a especificidade das enzimas estão intrinsecamente ligados às **interações não covalentes** entre a enzima e o substrato, que contribuem para a diminuição da energia de ativação. Estas interações incluem ligações de hidrogénio, interações iónicas e interações hidrofóbicas [15](#page=15). A formação de cada uma destas interações fracas não covalentes no complexo enzima-substrato é acompanhada pela libertação de energia livre, denominada **energia de ligação**. Esta energia de ligação é a principal fonte de energia livre utilizada pelas enzimas para diminuir a energia de ativação. As interações fracas entre a enzima e o substrato fornecem a força propulsora para a catálise enzimática [15](#page=15). > **Tip:** A energia de ligação libertada pelas interações não covalentes entre a enzima e o substrato compensa a energia necessária para a ativação da reação [15](#page=15). #### 2.3.2 Contribuição da energia de ligação para o poder catalítico A energia de ligação contribui para o poder catalítico das enzimas de várias formas: * **Diminuição da entropia do substrato:** A energia de ligação mantém o substrato orientado e alinhado com a enzima através de interações fracas não covalentes, aproximando-o e orientando-o na posição apropriada para reagir [16](#page=16). * **Diminuição da solvatação:** A formação de ligações fracas não covalentes entre a enzima e o substrato leva à dessolvatação do substrato. A interação enzima-substrato substitui a maioria das ligações de hidrogénio entre o substrato e as moléculas de água, removendo a camada de solvatação que impediria a reação [16](#page=16). * **Mudança conformacional da enzima (encaixe induzido):** A ligação do substrato induz uma mudança conformacional na enzima, gerando interações fracas adicionais e posicionando os grupos funcionais do sítio ativo corretamente para a catálise [16](#page=16). #### 2.3.3 Especificidade enzimática A energia de ligação é também fundamental para a extraordinária **especificidade** das enzimas pelos seus substratos. A especificidade resulta da formação de múltiplas interações fracas não covalentes entre a enzima (E) e o substrato (S). O sítio ativo da enzima possui grupos funcionais organizados de forma a formar um grande número de interações fracas com o substrato no estado de transição. Como resultado, a enzima não será capaz de interagir com a mesma intensidade com outras moléculas, garantindo a sua seletividade [16](#page=16). > **Example:** Imagine uma fechadura (enzima) e uma chave (substrato). A chave só entra e gira (catalisa a reação) se tiver o formato exato dos entalhes da fechadura. Enzimas são semelhantes, os seus sítios ativos são desenhados para interagir com substratos específicos, especialmente quando estes atingem o estado de transição. ### 2.4 Efeitos da catálise enzimática em parâmetros de reação Para uma reação que pode ocorrer com ou sem catálise enzimática: * **(a) Variação da energia livre padrão da reação (ΔG’º):** A enzima **não altera** [21](#page=21). * **(b) Energia de ativação da reação (ΔG‡):** A enzima **diminui** [11](#page=11) [21](#page=21). * **(c) Velocidade inicial da reação:** A enzima **aumenta** [21](#page=21). * **(d) Constante de equilíbrio da reação (Keq):** A enzima **não altera** [21](#page=21). > **Tip:** Lembre-se que a enzima afeta a cinética (velocidade) da reação, mas não a sua termodinâmica (equilíbrio e viabilidade). --- # Fatores que afetam a atividade enzimática e cofatores A atividade enzimática é um processo complexo influenciado por diversos fatores, incluindo a presença de cofatores e coenzimas, bem como as condições ambientais como pH e temperatura, e a integridade estrutural da enzima [19](#page=19) [8](#page=8). ### 3.1 Cofatores e coenzimas Certas enzimas necessitam de moléculas auxiliares não proteicas para que possam desempenhar a sua função catalítica. Estas moléculas são classificadas como cofatores ou coenzimas [8](#page=8). * **Cofatores:** Geralmente são íons metálicos inorgânicos ou moléculas metalorgânicas [8](#page=8). * **Coenzimas:** São moléculas orgânicas [8](#page=8). Quando firmemente, ou covalentemente, ligados a uma enzima, os cofatores e coenzimas são denominados **grupo prostético**. A combinação da enzima com o seu grupo prostético resulta numa enzima cataliticamente ativa. Algumas enzimas requerem tanto uma coenzima quanto um ou mais cofatores para serem ativas. A parte proteica da enzima sem estes grupos auxiliares é inativa [8](#page=8). ### 3.2 Fatores que afetam a atividade enzimática A atividade catalítica das enzimas é influenciada por vários fatores ambientais e estruturais. #### 3.2.1 pH O pH do meio ambiente afeta significativamente a atividade enzimática. Cada enzima possui um pH ótimo no qual a sua atividade é máxima. Isso ocorre porque o pH influencia o estado de ionização dos resíduos de aminoácidos presentes no sítio ativo e em outras partes da estrutura proteica. Mudanças no estado de ionização podem alterar a conformação da enzima e a sua capacidade de ligar o substrato e catalisar a reação [19](#page=19). > **Tip:** O pH ótimo de uma enzima é geralmente próximo do pH fisiológico do seu local de atuação no organismo. #### 3.2.2 Temperatura Embora não explicitamente detalhado nas páginas fornecidas para este tópico, é um fator conhecido que a temperatura também é crucial para a atividade enzimática. Temperaturas elevadas podem levar à desnaturação da enzima (perda da sua estrutura tridimensional e, consequentemente, da sua função), enquanto temperaturas muito baixas podem diminuir a velocidade da reação. Existe uma temperatura ótima para cada enzima, onde a sua atividade é máxima. #### 3.2.3 Estrutura da enzima A estrutura da enzima, em todos os seus níveis (primário, secundário, terciário e quaternário), é essencial para a sua atividade catalítica. Alterações conformacionais na estrutura da enzima podem afetar drasticamente a sua função [22](#page=22). * **Exemplo de alteração estrutural:** A substituição de um aminoácido com um grupo R carregado negativamente, como o ácido glutâmico, por um aminoácido com um grupo R pequeno e apolar, como a alanina ou a glicina, pode desestabilizar a conformação do centro ativo. Isso prejudica as interações essenciais para a reação enzimática, levando à perda da atividade catalítica. Por outro lado, a substituição de alanina por glicina pode não afetar a função, pois ambos os aminoácidos compartilham características químicas e estruturais semelhantes (pequenos e hidrofóbicos) [22](#page=22). ### 3.3 Outras considerações sobre a atividade enzimática * **Especificidade:** As enzimas exibem alta especificidade, o que significa que são capazes de catalisar reações envolvendo um isómero específico (por exemplo, D-hidratos de carbono ou L-aminoácidos), mas não o seu enantiómero. Essa especificidade é determinada pela interação do substrato com o centro ativo da enzima [19](#page=19). * **Equilíbrio da reação:** As enzimas não alteram a constante de equilíbrio de uma reação; elas apenas aceleram a velocidade com que o equilíbrio é atingido [19](#page=19). * **Concentração:** As enzimas são utilizadas em concentrações muito menores do que os substratos, pois não são consumidas durante a reação e podem ser reutilizadas [19](#page=19). * **Eficiência:** As enzimas são catalisadores extremamente eficientes, podendo aumentar a velocidade de reações químicas em milhares ou milhões de vezes [19](#page=19). --- # Técnicas de análise de proteínas: Eletroforese com SDS A eletroforese com SDS é uma técnica fundamental para a separação de proteínas baseada principalmente na sua massa molecular, utilizando o dodecil sulfato de sódio (SDS) para modificar as propriedades de carga e forma das proteínas [23](#page=23). ### 4.1 O papel do SDS na eletroforese O SDS (dodecil sulfato de sódio) é um detergente aniónico amplamente utilizado na eletroforese para garantir que a separação das proteínas ocorra predominantemente com base na sua massa molecular [23](#page=23). #### 4.1.1 Mecanismo de ligação do SDS às proteínas O SDS liga-se de forma não covalente às proteínas. Esta ligação ocorre através de duas interações principais [23](#page=23): * **Interações hidrofóbicas:** A cauda hidrofóbica (não polar) do SDS interage fortemente com as regiões hidrofóbicas da proteína. Estas interações são responsáveis por "desdobrar" ou desnaturar a proteína, rompendo as suas estruturas terciárias e quaternárias, resultando numa conformação mais linear ou alongada [23](#page=23). * **Interações com resíduos positivos:** O grupo sulfato hidrofílico (polar) do SDS pode interagir com resíduos de aminoácidos positivos na proteína, como a lisina e a arginina. Embora contribua, esta interação é considerada menos significativa para a carga final [23](#page=23). #### 4.1.2 Consequências da ligação do SDS A ligação extensiva do SDS às proteínas tem duas consequências cruciais para a eletroforese: * **Conferir carga negativa:** O grupo sulfato do SDS é altamente carregado negativamente. Ao ligar-se às proteínas, o SDS confere a estas uma carga negativa dominante e uniforme, mascarando efetivamente a carga intrínseca das proteínas. Todas as proteínas, independentemente da sua composição de aminoácidos, adquirem uma relação carga-massa semelhante [23](#page=23). * **Confirir forma alongada:** A natureza detergente do SDS e a sua capacidade de interagir com regiões hidrofóbicas levam ao desdobramento das proteínas, tornando-as mais lineares e alongadas [23](#page=23). #### 4.1.3 Separação baseada na massa molecular Devido à carga negativa uniforme e à forma alongada adquiridas após a ligação ao SDS, as proteínas, quando submetidas a um campo elétrico, migram em direção ao polo positivo (ânodo). A velocidade de migração torna-se então dependente quase exclusivamente do seu tamanho molecular. Proteínas menores, com menor resistência à migração através da matriz do gel, movem-se mais rapidamente e mais longe do que as proteínas maiores [23](#page=23). > **Tip:** A eletroforese com SDS, também conhecida como SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis), é frequentemente utilizada em conjunto com a eletroforese bidimensional ou como etapa de preparação para outras técnicas, como o Western Blot. > **Exemplo:** Numa amostra contendo proteínas de 20 kDa, 50 kDa e 100 kDa, após tratamento com SDS e submissão a SDS-PAGE, espera-se que a proteína de 20 kDa migre mais rapidamente e atinja uma posição mais distante no gel, enquanto a proteína de 100 kDa migrará mais lentamente e ficará mais perto do ponto de aplicação. --- ## Erros comuns a evitar - Revise todos os tópicos cuidadosamente antes dos exames - Preste atenção às fórmulas e definições chave - Pratique com os exemplos fornecidos em cada seção - Não memorize sem entender os conceitos subjacentes

| Termo | Definição | |------|------------| | Enzima | Molécula, geralmente uma proteína, que atua como um catalisador biológico, acelerando reações químicas específicas sem ser consumida no processo. | | Catálise | Processo pelo qual a velocidade de uma reação química é aumentada por uma substância (catalisador) que não é consumida na reação. | | Reação biológica | Reação química que ocorre em organismos vivos, geralmente mediada por enzimas para garantir que ocorram a taxas fisiologicamente relevantes. | | Energia de ativação | A energia mínima necessária para que uma reação química ocorra, representando a barreira energética que os reagentes devem superar para se converterem em produtos. | | Equilíbrio químico | Estado de uma reação reversível onde as taxas das reações direta e inversa são iguais, resultando em concentrações constantes de reagentes e produtos. | | Substrato | Molécula sobre a qual uma enzima atua, sendo convertida em produto. | | Local ativo | Região específica na estrutura tridimensional de uma enzima onde o substrato se liga e onde a catálise ocorre. | | Cofator | Molécula não proteica, orgânica ou inorgânica, que é essencial para a atividade catalítica de algumas enzimas. | | Coenzima | Cofator orgânico, frequentemente derivado de vitaminas, que atua em conjunto com uma enzima para catalisar uma reação. | | Grupo prostético | Parte não proteica de uma metaloproteína ou glicoproteína que está firmemente ligada ou covalentemente ligada à cadeia polipeptídica. | | Estado de transição | Um arranjo de átomos de alta energia que ocorre no pico de uma barreira de energia durante uma reação química, onde as ligações antigas estão sendo quebradas e novas estão sendo formadas. | | Encaixe induzido | Modelo de ligação enzima-substrato onde a enzima e/ou o substrato sofrem uma alteração conformacional após a ligação, otimizando o ajuste e a catálise. | | Interações não covalentes | Forças de atração fracas entre átomos ou moléculas, como ligações de hidrogénio, interações hidrofóbicas e forças de van der Waals, que são cruciais na estrutura e função das biomoléculas. | | Energia de ligação | A energia liberada quando interações fracas não covalentes se formam entre uma enzima e seu substrato, contribuindo para a diminuição da energia de ativação. | | Eletroforese | Técnica de laboratório usada para separar moléculas carregadas, como proteínas e ácidos nucleicos, com base em seu tamanho e carga elétrica, passando uma corrente elétrica através delas. | | SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) | Um surfactante aniónico amplamente utilizado em bioquímica para desnaturar proteínas, conferir-lhes uma carga negativa uniforme e permitir sua separação por eletroforese com base no tamanho. | | Desnaturação | Processo no qual a estrutura tridimensional de uma proteína é alterada, geralmente pela exposição a calor, pH extremo ou produtos químicos, resultando na perda de sua função biológica. |