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# Introduzione all'apoptosi e sue caratteristiche Questo argomento introduce il concetto di morte cellulare programmata, nota come apoptosi, descrivendone le caratteristiche distintive e i metodi per identificarla. ### 1.1 Definizione e contesto dell'apoptosi L'apoptosi è un processo di morte cellulare programmata. Si verifica in risposta a vari stimoli interni o esterni che segnalano la necessità di eliminare una cellula [2](#page=2). ### 1.2 Caratteristiche di una cellula in apoptosi Le cellule che subiscono apoptosi presentano caratteristiche morfologiche e biochimiche specifiche. Queste includono [2](#page=2): * **Condensazione della cromatina:** Il materiale genetico all'interno del nucleo si aggrega [2](#page=2). * **Frammentazione del nucleo:** Il nucleo si divide in piccoli frammenti [2](#page=2). * **Formazione di corpi apoptotici:** La cellula si ritira, formando vescicole o corpi contenenti organelli e materiale nucleare [2](#page=2). * **Integrità della membrana plasmatica:** Inizialmente, la membrana plasmatica rimane intatta, impedendo il rilascio del contenuto cellulare nell'ambiente circostante [2](#page=2). * **Rilevamento della fosfatidilserina:** La fosfatidilserina, un fosfolipide normalmente confinato al lato interno della membrana plasmatica, viene traslocata sulla superficie esterna della cellula. Questo spostamento è un segnale precoce e importante per il riconoscimento e la fagocitosi della cellula apoptotica da parte delle cellule immunitarie [3](#page=3). > **Tip:** L'integrità della membrana plasmatica durante l'apoptosi è cruciale per evitare l'infiammazione, a differenza della necrosi, dove la membrana si rompe rilasciando il contenuto cellulare. ### 1.3 Gli esecutori dell'apoptosi: le caspasi Le caspasi sono una famiglia di proteasi (enzimi che degradano le proteine) che svolgono un ruolo centrale nell'induzione e nell'esecuzione dell'apoptosi. Queste proteine agiscono come "forbici molecolari", scindendo substrati cellulari specifici e guidando così il processo di morte cellulare [2](#page=2). ### 1.4 Metodi di riconoscimento dell'apoptosi Il riconoscimento di una cellula in apoptosi può avvenire attraverso diverse tecniche: * **Analisi al microscopio:** L'osservazione microscopica può rivelare i cambiamenti morfologici caratteristici delle cellule apoptotiche, come la condensazione nucleare e la formazione di corpi apoptotici [2](#page=2). * **Rilevamento della fosfatidilserina:** Test biochimici e citofluorimetrici possono identificare la presenza di fosfatidilserina sulla superficie cellulare, spesso utilizzando la proteina Annexin V, che ha un'elevata affinità per questo fosfolipide. L'Annexin V marcata con un fluorocromo può quindi essere utilizzata per etichettare le cellule apoptotiche [3](#page=3). > **Example:** L'uso dell'Annexin V in combinazione con un colorante che rileva cellule con membrane danneggiate (come la Propidium Iodide) permette di distinguere cellule vive (negative per entrambi), cellule apoptotiche precoci (Annexin V positive, Propidium Iodide negative) e cellule necrotiche (positive per entrambi) tramite citometria a flusso. --- # Ruolo delle caspasi nell'apoptosi Le caspasi sono una famiglia di proteasi cisteiniche essenziali che svolgono un ruolo centrale nella morte cellulare programmata (apoptosi). La loro attività è fondamentale per innescare e perpetuare la cascata di eventi che portano alla disgregazione cellulare [4](#page=4). ### 2.1 Classificazione delle caspasi nell'apoptosi Le caspasi coinvolte nell'apoptosi sono generalmente classificate in due gruppi principali in base alla loro funzione: #### 2.1.1 Caspasi iniziatrici Queste caspasi sono le prime ad essere attivate e agiscono come sensori di segnali apoptotici. Una volta attivate, esse, a loro volta, tagliano e attivano le caspasi effettrici [5](#page=5). * **Esempi:** Le caspasi 8 e 9 sono considerate caspasi iniziatrici [5](#page=5). #### 2.1.2 Caspasi effettrici (esecutrici) Le caspasi effettrici sono substrati delle caspasi iniziatrici e vengono attivate da queste ultime. La loro funzione principale è quella di tagliare una vasta gamma di substrati cellulari, portando all'esecuzione dei processi morfologici e biochimici caratteristici dell'apoptosi. L'attivazione delle caspasi effettrici genera un'amplificazione del segnale apoptotico [5](#page=5). * **Esempi:** Le caspasi 3, 6 e 7 sono esempi di caspasi effettrici [5](#page=5). ### 2.2 Meccanismo di attivazione e cascata apoptotica Il processo apoptotico mediato dalle caspasi segue una cascata ben definita: 1. **Iniziazione:** Segnali apoptotici attivano le caspasi iniziatrici [5](#page=5). 2. **Attivazione delle effettrici:** Le caspasi iniziatrici attivate tagliano e attivano le caspasi effettrici [5](#page=5). 3. **Esecuzione:** Le caspasi effettrici attivate eseguono l'apoptosi tagliando i loro bersagli cellulari [5](#page=5). > **Tip:** L'attivazione delle caspasi è un processo altamente regolato e specifico. L'attivazione delle caspasi iniziatrici è il passo chiave per innescare la cascata. ### 2.3 Conseguenze dell'attività delle caspasi Il taglio proteolitico operato dalle caspasi sui loro substrati può portare a diversi esiti funzionali all'interno della cellula, influenzando sia la perdita che il guadagno di attività biologica di specifiche proteine. Questo amplio spettro di azioni contribuisce alla complessa dinamica della morte cellulare programmata [4](#page=4). > **Tip:** È importante notare che l'attività proteolitica delle caspasi non è solo distruttiva; in alcuni casi, può portare alla generazione di nuove attività biologiche che facilitano il processo apoptotico. --- # Vie di attivazione dell'apoptosi: estrinseca e intrinseca Le due principali vie di attivazione dell'apoptosi sono la via estrinseca, mediata da recettori di morte, e la via intrinseca, legata al mitocondrio. ### 3.1 La via estrinseca (o via del recettore) La via estrinseca di attivazione dell'apoptosi è innescata da segnali extracellulari. Lo stimolo primario è costituito da proteine denominate fattori di morte, come il TNF (fattore di necrosi tumorale). Queste proteine sono prodotte da cellule del sistema immunitario in risposta a condizioni quali radiazioni ionizzanti, agenti chimici o infezioni virali [7](#page=7) [8](#page=8). Quando un fattore di morte si lega a specifici recettori di morte (DR) presenti sulla superficie cellulare, si verifica la formazione di un complesso di segnalazione intracellulare noto come DISC (Death-Inducing Signaling Complex). Questo complesso recluta, attraverso proteine adattatrici come FADD, le procaspasi 8. In questo ambiente di stretta associazione, la bassa attività intrinseca delle procaspasi 8 è sufficiente per innescare l'autoclivaggio reciproco, portando alla loro attivazione [8](#page=8). > **Tip:** La via estrinseca è spesso definita "via del recettore" poiché inizia con il legame di ligandi extracellulari ai recettori di morte cellulare. > **Example:** Il TNF-alfa che si lega al suo recettore TNFR1 è un classico esempio di innesco della via estrinseca. ### 3.2 La via intrinseca (o via del mitocondrio) La via intrinseca dell'apoptosi è avviata da segnali intracellulari. Questa via è fortemente influenzata dal mitocondrio e viene innescata da una varietà di stimoli interni, tra cui danni genetici irreparabili, ipossia (mancanza di ossigeno), elevate concentrazioni citosoliche di calcio, infezioni virali, stress ossidativo e accumulo di proteine mal ripiegate nel reticolo endoplasmatico [10](#page=10) [9](#page=9). #### 3.2.1 Permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna (MOMP) Uno degli eventi chiave della via intrinseca è la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna (MOMP - Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization). In condizioni fisiologiche, la proteina Bax è inattiva nel citosol come monomero. Tuttavia, in risposta a stimoli apoptotici, Bax viene traslocato nei mitocondri, subisce cambiamenti conformazionali e si inserisce nella membrana mitocondriale. Bak, invece, è una proteina integrale della membrana mitocondriale che, durante l'apoptosi, cambia conformazione e oligomerizza, portando alla formazione di pori sulla membrana [13](#page=13). > **Tip:** La MOMP è un punto di non ritorno nell'apoptosi, poiché porta al rilascio di fattori pro-apoptotici dal compartimento intermembrana mitocondriale nel citosol. #### 3.2.2 Assemblaggio dell'apoptosoma Il rilascio di citocromo c (Cit c) dal mitocondrio nel citosol è un evento critico. Il Cit c si lega ad Apaf-1, una proteina che funge da fattore di attivazione della procaspasi 9, inducendo un cambiamento conformazionale in Apaf-1. Questo legame promuove l'assemblaggio di multiple molecole di Apaf-1, formando un complesso proteico chiamato apoptosoma. L'apoptosoma, una volta assemblato, recluta le molecole di procaspasi 9, che vengono attivate reciprocamente attraverso l'autoclivaggio [10](#page=10) [11](#page=11). > **Example:** L'Apaf-1, in presenza di Cit c e dATP, forma un heptamero che costituisce il nucleo dell'apoptosoma. ### 3.3 Interconnessione tra le vie estrinseca e intrinseca Le due vie dell'apoptosi non sono completamente indipendenti, ma possono interagire e amplificarsi a vicenda. I mitocondri possono amplificare il segnale pro-apoptotico proveniente dalla via estrinseca. Questo avviene attraverso l'attivazione della proteina Bid (una proteina BH3-only pro-apoptotica) da parte della caspasi 8, prodotta nella via estrinseca. La forma troncata di Bid (tBid) è in grado di inibire le proteine anti-apoptotiche della famiglia Bcl-2 e di indurre la permeabilizzazione della membrana mitocondriale. In questo modo, la via estrinseca può innescare la via intrinseca, creando un segnale pro-apoptotico amplificato [24](#page=24). > **Tip:** La proteina Bid funge da ponte cruciale tra la via estrinseca e quella intrinseca, permettendo una risposta apoptotica più robusta in condizioni di stress cellulare severo. --- # Regolazione dell'apoptosi da parte delle proteine Bcl-2 e IAP La regolazione dell'apoptosi è un processo fondamentale per mantenere l'omeostasi tissutale, e le proteine della famiglia Bcl-2 e le proteine IAP giocano ruoli cruciali nel determinare l'equilibrio tra la sopravvivenza e la morte cellulare [16](#page=16). ### 4.1 La famiglia di proteine Bcl-2 La famiglia delle proteine Bcl-2 è composta da numerosi membri che agiscono principalmente come regolatori della permeabilità della membrana mitocondriale esterna. Queste proteine controllano il rilascio di fattori pro-apoptotici, come il citocromo c, dai mitocondri verso il citosol [17](#page=17). #### 4.1.1 Classificazione e domini BH I membri della famiglia Bcl-2 sono classificati in base alla presenza di sequenze a-elicoidali conservate, note come domini di omologia a Bcl2 (BH). Esistono diversi tipi di domini BH [17](#page=17): * **BH1-2-3**: Proteine come Bax e Bak che sono considerate proteine effettrici pro-apoptotiche [19](#page=19). * **BH3-only**: Un gruppo di proteine che include Bad, Noxa, PUMA e Bid, che agiscono come sensori di stress e danni cellulari, attivando la via apoptotica [19](#page=19). * **Bcl2**: Le proteine effettive come Bcl-2, che sono anti-apoptotiche [19](#page=19). #### 4.1.2 Meccanismo d'azione Le proteine Bcl-2 si associano alla membrana mitocondriale esterna, dove operano come "spazzini" di fattori pro-apoptotici. Esse sono potenti inibitori dell'apoptosi in risposta a molti insulti citotossici. I vari membri della famiglia sono capaci di interagire tra loro, formando complessi molecolari. Queste interazioni possono modulare la funzione reciproca delle proteine, favorendo o inibendo la formazione di pori sulla membrana mitocondriale [18](#page=18) [19](#page=19). > **Tip:** La complessità delle interazioni all'interno della famiglia Bcl-2 è fondamentale. Una proteina anti-apoptotica (come Bcl-2) può inibire una proteina pro-apoptotica (come Bax), prevenendo così l'apertura del poro mitocondriale e il rilascio del citocromo c. ### 4.2 Le proteine IAP (Inibitori dell’Apoptosi) Le proteine IAP rappresentano un'altra classe di regolatori negativi dell'apoptosi. Il loro meccanismo d'azione principale consiste nel complessarsi alle caspasi attivate (in particolare le caspasi 3, 7 e 9) e nell'inibire la loro attività proteolitica, bloccando così la cascata di eventi che portano alla morte cellulare [21](#page=21). #### 4.2.1 Interazione con fattori pro-apoptotici Durante la permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna, oltre al citocromo c, vengono rilasciati altri fattori dal mitocondrio. Tra questi vi sono proteine come Smac/Diablo, che hanno la funzione di inibire l'attività delle proteine IAP. Questo meccanismo assicura che l'attivazione delle caspasi non venga indefinitamente bloccata da IAP, permettendo all'apoptosi di procedere una volta innescata [21](#page=21). ### 4.3 Altri meccanismi di modulazione dell'apoptosi Oltre alle proteine Bcl-2 e IAP, esistono altri meccanismi che contribuiscono a modulare la risposta apoptotica [22](#page=22). #### 4.3.1 Recettori esca e c-FLIP L'esistenza di recettori esca e di molecole come c-FLIP (FLICE-inhibitory protein) permette una fine regolazione della risposta apoptotica, in particolare nelle vie estrinseche che coinvolgono i recettori di morte [22](#page=22). * **Recettori esca**: Questi recettori mancano del dominio citosolico necessario per l'induzione dell'apoptosi, o presentano un dominio troncato. La loro funzione è quella di sequestrare i segnali che normalmente si legherebbero ai recettori di morte attivi, limitando così la propagazione del segnale apoptotico [23](#page=23). * **c-FLIP**: Questa proteina limita l'apoptosi legandosi alle proteine adattatrici sui recettori di morte. Sebbene strutturalmente simile alle caspasi, c-FLIP manca della cisteina essenziale nel sito attivo, impedendole di esercitare attività proteolitica. Di conseguenza, c-FLIP può competere con la pro-caspasi 8 per il legame alle proteine adattatrici, ma senza essere in grado di attivarla efficacemente o di attivarla in maniera inefficace. Questo permette una modulazione della risposta apoptotica indotta dai recettori di morte, prevenendo l'attivazione incontrollata delle caspasi effettrici [23](#page=23). > **Example:** In alcune cellule T, l'espressione di c-FLIP può prevenire l'apoptosi indotta da segnali estrinseci, consentendo ai linfociti di sopravvivere a stimoli che altrimenti porterebbero alla loro morte. --- ## Errori comuni da evitare - Rivedete tutti gli argomenti accuratamente prima degli esami - Prestate attenzione alle formule e definizioni chiave - Praticate con gli esempi forniti in ogni sezione - Non memorizzate senza comprendere i concetti sottostanti

| Term | Definition | |------|------------| | Apoptosi | Processo di morte cellulare programmata, fondamentale per lo sviluppo e il mantenimento degli organismi, che porta alla rimozione ordinata delle cellule danneggiate o non più necessarie. | | Caspasi | Una famiglia di proteasi a cisteina che svolgono un ruolo centrale nell'apoptosi, agendo come esecutori della degradazione cellulare attraverso il taglio proteolitico di specifici substrati. | | Fosfatidilserina | Un fosfolipide normalmente localizzato sul lato citosolico della membrana plasmatica, la cui esposizione sulla superficie esterna della cellula è un segnale distintivo precoce dell'apoptosi. | | Annexin V | Una proteina legante il calcio che ha un'elevata affinità per la fosfatidilserina, utilizzata comunemente in esperimenti per identificare le cellule in apoptosi in base all'esposizione della fosfatidilserina. | | Caspasi iniziatrici | Caspasi che si attivano in risposta a segnali apoptotici iniziali e che, a loro volta, attivano le caspasi effettrici. Esempi includono la Caspasi 8 e la Caspasi 9. | | Caspasi effettrici/esecutrici | Caspasi che vengono attivate dalle caspasi iniziatrici e che svolgono il lavoro effettivo di degradazione cellulare durante l'apoptosi, tagliando substrati cellulari chiave. Esempi includono le Caspasi 3, 6 e 7. | | Fattore di morte (TNF) | Una citochina pro-infiammatoria, prodotta da alcune cellule immunitarie, che può legarsi ai recettori di morte cellulare e innescare la via estrinseca dell'apoptosi. | | Recettori di morte (DR) | Una famiglia di recettori transmembrana (come TNFR1) che, una volta attivati da specifici ligandi (come il TNF), possono avviare la cascata apoptotica attraverso la formazione del complesso DISC. | | DISC (Death-Inducing Signaling Complex) | Un complesso proteico multifunzionale che si forma nel citoplasma in seguito al legame di un ligando a un recettore di morte, reclutando pro-caspasi e proteine adattatrici per attivare le caspasi iniziatrici. | | FADD (Fas-Associated Death Domain) | Una proteina adattatrice che lega il dominio di morte del recettore di morte e recluta le pro-caspasi 8 nel DISC, facilitando la loro attivazione. | | Via estrinseca dell'apoptosi | Una via di attivazione dell'apoptosi che inizia con il legame di ligandi specifici (fattori di morte) a recettori di morte presenti sulla superficie cellulare. | | Via intrinseca dell'apoptosi | Una via di attivazione dell'apoptosi che origina da stimoli intracellulari, come danno al DNA o stress ossidativo, che portano a modifiche della permeabilità della membrana mitocondriale esterna. | | Mitocondrio | Organello cellulare deputato alla produzione di energia e coinvolto in diversi processi cellulari, inclusa la via intrinseca dell'apoptosi attraverso il rilascio di fattori pro-apoptotici. | | Citocromo c (Cit c) | Una proteina della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale che, in seguito alla permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna, viene rilasciata nel citoplasma dove partecipa all'assemblaggio dell'apoptosoma. | | Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor 1) | Una proteina citosolica che, in presenza di citocromo c e dATP, si assembla formando l'apoptosoma, il complesso che attiva la Caspasi 9. | | Apoptosoma | Un complesso proteico a forma di ruota formato da molecole di Apaf-1 assemblate in seguito al rilascio di citocromo c dal mitocondrio. È responsabile del reclutamento e dell'attivazione delle pro-caspasi 9. | | MOMP (Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization) | Permeabilizzazione della membrana mitocondriale esterna, un evento chiave nella via intrinseca dell'apoptosi che permette il rilascio di molecole pro-apoptotiche dal compartimento intermembrana mitocondriale nel citoplasma. | | Bax e Bak | Proteine pro-apoptotiche della famiglia Bcl-2 che si inseriscono nella membrana mitocondriale esterna e formano pori, contribuendo alla MOMP e al rilascio di citocromo c. | | Famiglia di proteine Bcl-2 | Una famiglia di proteine che regolano la permeabilità della membrana mitocondriale esterna, essenziali nel controllo del bilancio tra sopravvivenza e morte cellulare; comprende sia proteine pro-apoptotiche (come Bax, Bak) sia anti-apoptotiche (come Bcl-2, Bcl-XL). | | Domini di omologia a Bcl2 (BH) | Sequenze di amminoacidi conservate presenti nei membri della famiglia Bcl-2, che mediano le interazioni proteina-proteina e sono importanti per la funzione regolatoria di queste proteine. | | Proteine IAP (Inibitori dell'Apoptosi) | Una famiglia di proteine che possono legarsi e inibire direttamente l'attività delle caspasi attivate, agendo come regolatori negativi dell'apoptosi. | | Smac/Diablo | Proteine rilasciate dai mitocondri durante la MOMP che inibiscono le proteine IAP, antagonizzando la loro azione inibitoria sulle caspasi e promuovendo così l'apoptosi. | | c-FLIP (FLICE-inhibitory protein) | Una proteina che assomiglia alle caspasi ma manca dell'attività catalitica, che può interferire con l'attivazione della Caspasi 8, agendo come un inibitore dell'apoptosi mediata dai recettori di morte. | | Bid (pro-apoptotica BH3 only) | Una proteina della famiglia Bcl-2 che funge da ponte tra la via estrinseca e quella intrinseca dell'apoptosi. Viene tagliata dalla Caspasi 8 (formando tBid) e transloca sulla membrana mitocondriale per promuovere la MOMP. |