LBII_HC_ppt5_Hybridisatie en afgeleiden 2.pdf

# Probehybridisatie en de basisprincipes ervan Probehybridisatie is een molebiologische techniek die berust op het principe van basencomplementariteit voor de specifieke detectie van een doelwitsequentie [5](#page=5). ### 1.1 Fundamenteel principe van probehybridisatie Het kerndoel van probehybridisatie is het identificeren en detecteren van een specifieke nucleïnezuursequentie (DNA of RNA) binnen een complex mengsel. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een complementaire, gemerkte enkelstrengs nucleïnezuurmolecule, de zogenaamde probe. De probe bindt specifiek aan zijn doelwitsequentie onder de juiste reactieomstandigheden [5](#page=5). #### 1.1.1 De probe Een probe is een enkelstrengs DNA- of RNA-molecule die specifiek ontworpen is om complementair te zijn aan de doelwitsequentie die gedetecteerd moet worden. Probes kunnen variëren in lengte en worden vaak chemisch gesynthetiseerd, hoewel enzymatische methoden ook mogelijk zijn [20](#page=20) [21](#page=21) [5](#page=5). > **Tip:** De keuze van de probe, inclusief lengte en GC-gehalte, beïnvloedt de bindingssterkte met het doelwit [20](#page=20). #### 1.1.2 Het doelwit Het doelwit van de hybridisatie is een enkelstrengs DNA- of RNA-sequentie. Als het doelwit dubbelstrengs DNA is, dient het eerst gedenatureerd te worden om het enkelstrengs te maken [11](#page=11) [5](#page=5). #### 1.1.3 Het hybridisatieproces Hybridisatie is het proces waarbij de gemerkte probe zich bindt aan de complementaire doelwitsequentie. Dit proces vindt plaats onder specifieke temperatuur- en zoutomstandigheden, die geoptimaliseerd zijn voor de specifieke probe-target combinatie [11](#page=11) [20](#page=20) [5](#page=5). ### 1.2 Methodes van hybridisatie Probehybridisatie kan worden uitgevoerd via verschillende methoden, afhankelijk van de toepassing en de aard van de dragers. #### 1.2.1 Hybridisatie in oplossing Hybridisatie in oplossing houdt in dat zowel de probes als de doelwitmoleculen vrij in de vloeibare fase aanwezig zijn. Dit kan worden toegepast in technieken zoals qPCR of bij target enrichment voorafgaand aan sequencing [5](#page=5). #### 1.2.2 Hybridisatie op een vaste drager Hybridisatie op een vaste drager is een veelgebruikte methode, waarbij het doelwit of de probes geïmmobiliseerd zijn op een vast oppervlak. Dit maakt het mogelijk om na de hybridisatie de niet-gebonden probes weg te wassen en het signaal van de gebonden probes te detecteren [5](#page=5) [9](#page=9). ##### 1.2.2.1 Membraan/Filterhybridisatie Bij membraanhybridisatie worden nucleïnezuren (meestal na denaturatie en transfer) op een membraan (zoals nylon of nitrocellulose) geblopt. Bekende voorbeelden zijn [12](#page=12) [9](#page=9): * **Southern blot:** Voor de detectie van DNA [10](#page=10) [9](#page=9). * **Northern blot:** Voor de detectie van RNA [12](#page=12). Het proces omvat doorgaans de volgende stappen: 1. **Denaturatie van het doelwit:** Om dubbelstrengs DNA om te zetten naar enkelstrengs [11](#page=11) [9](#page=9). 2. **Blotten:** Transfer van het enkelstrengs DNA of RNA naar een vast membraan. Methoden hiervoor zijn onder andere capillair, vacuüm, semi-droog en dot blotten [12](#page=12) [9](#page=9). 3. **Fixatie:** Het vastzetten van de geblotte nucleïnezuren op het membraan, vaak door verhitting (minimaal 80°C) of UV-belichting [17](#page=17). 4. **Prehybridisatie:** Het membraan wordt behandeld met niet-specifieke DNA-fragmenten (bv. salmon sperm DNA) om onbezette bindingsplaatsen op het membraan te bezetten en aspecifieke binding van de probe te voorkomen [18](#page=18). 5. **Hybridisatie:** Het membraan wordt geïncubeerd met de gemerkte probe onder geschikte omstandigheden [19](#page=19) [9](#page=9). 6. **Wassen:** Verwijderen van ongebonden en aspecifiek gebonden probe [9](#page=9). 7. **Detectie:** Visualisatie van de gebonden probe op basis van het gebruikte label [9](#page=9). > **Voorbeeld:** In een Southern blot wordt DNA uit een cellysate geëxtraheerd, gedenatureerd, geblot op een membraan, gehybridiseerd met een DNA-probe die specifiek is voor een bepaald gen, en vervolgens wordt de aanwezigheid van het gen gedetecteerd via het label van de probe [9](#page=9). ##### 1.2.2.2 Hybridisatie op een glazen drager Glazen dragers worden gebruikt in technieken waarbij de nucleïnezuren direct op het oppervlak worden geïmmobiliseerd, zoals bij in situ hybridisatie of microarrays [12](#page=12). * **In situ hybridisatie (ISH):** Hierbij wordt de hybridisatie uitgevoerd op weefselcoupes of cellen die zich nog op hun oorspronkelijke locatie bevinden. Fluorescent in situ hybridisatie (FISH) is een veelgebruikte variant [12](#page=12) [16](#page=16) [8](#page=8). ### 1.3 Merken en detectie van probes Probes moeten gemerkt zijn om detectie mogelijk te maken. De keuze van het label en de detectiemethode zijn cruciaal voor de gevoeligheid en specificiteit van de analyse [19](#page=19) [22](#page=22). #### 1.3.1 Types labels Er zijn verschillende soorten labels beschikbaar: * **Radioactieve labels:** Gebruiken radioactief gemerkte nucleotiden (bv. 35S, 33P). Detectie gebeurt via autoradiografie of phospho-imaging [23](#page=23) [36](#page=36) [37](#page=37). * **Fluorescente labels (fluorochromen):** Fluorescente gemerkte nucleotiden (bv. FITC, Cy3, Cy5). Detectie gebeurt met fluorescentiemicroscopen en CCD-camera's. Deze worden vaak gebruikt in FISH en microarrays [23](#page=23) [36](#page=36) [38](#page=38). * **Biotine-labels:** Biotine-16-dUTP wordt vaak gebruikt voor indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36) [39](#page=39). * **Digoxigenine-labels:** Digoxigenine-11-dUTP wordt ook gebruikt voor indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36) [39](#page=39). > **Tip:** Bij biotine- en digoxigenine-labels is een spacer nodig om sterische hinder te vermijden bij de herkenning van het label en de vorming van de dubbele helix [24](#page=24). #### 1.3.2 Methoden voor het inbouwen van labels Labels kunnen op verschillende manieren in probes worden ingebouwd: * **Chemische synthese:** Labels kunnen tijdens de synthese van oligonucleotiden worden ingebouwd [21](#page=21). * **Enzymatische synthese:** * **PCR met labeling:** Merking kan plaatsvinden met gemerkte primers (eindstandig) of gemerkte dNTP's (intern) [25](#page=25) [26](#page=26). * **Nick-translatie:** Gebruikt DNAse I en DNA-polymerase I om nieuwe, gemerkte nucleotiden in te bouwen in dsDNA [25](#page=25) [27](#page=27). * **Random primed labeling:** Het DNA wordt gedenatureerd en gehybridiseerd met random oligonucleotiden, gevolgd door in vitro verlenging met gemerkte dNTP's [25](#page=25) [28](#page=28) [29](#page=29). * **Eind labeling:** Met enzymen zoals T4 polynucleotide kinase (voor radioactieve labels) of terminaal transferase (voor het toevoegen van dNTP's aan het 3'-uiteinde) [25](#page=25) [30](#page=30) [31](#page=31). * **RNA probe bereiding:** Via in vitro transcriptie van gekloneerd DNA [25](#page=25) [33](#page=33) [34](#page=34). #### 1.3.3 Detectiemethoden De detectie van het label hangt af van het type label dat gebruikt is: * **Directe detectie:** Voor radioactieve en fluorescente labels [36](#page=36). * **Indirecte detectie:** Vaak gebruikt voor biotine en digoxigenine. Hierbij wordt een reporter molecule (bv. een enzym zoals HRP of AP, colloïdaal goud, of een fluorochroom) gebonden aan een antilichaam dat specifiek het label herkent [36](#page=36) [39](#page=39) [40](#page=40) [41](#page=41). ##### 1.3.3.1 Reporters en zichtbaar maken van het signaal Bij indirecte detectie worden reporters gebruikt om het signaal zichtbaar te maken. Gangbare reporters zijn [39](#page=39): * **Enzymen:** * **Horse radish peroxidase (HRP):** Kan reageren met chromogenen (bv. DAB, AEC, TMB) of chemiluminogenen (bv. luminol). De reactie kan ook versterkt worden met bijvoorbeeld diacylhydrazide [44](#page=44) [45](#page=45) [46](#page=46). * **Alkalische fosfatase (AP):** Reageert met chromogenen (bv. BCIP met NBT) of chemiluminogenen (bv. AMPPD, CSPD). De ECL (Enhanced Chemiluminescence) reactie kan de gevoeligheid aanzienlijk verhogen [44](#page=44) [47](#page=47) [48](#page=48). * **Colloïdaal goud:** Geeft een zichtbare kleur [39](#page=39). * **Fluorochromen:** Gebruikt met de juiste detectieapparatuur [39](#page=39). > **Tip:** Bij een laag aantal doelwitmoleculen kan signaalversterking essentieel zijn om detectie mogelijk te maken. Dit kan door het gebruik van meer labels of reporters per probe, signaalamplificatie met steptavidine-biotine-complexen, of (elektro)chemiluminescentie [43](#page=43). ### 1.4 Algemene overwegingen bij probehybridisatie Bij probehybridisatie is het essentieel om aandacht te besteden aan de reactieomstandigheden en het wasproces. * **Optimalisatie van reactieomstandigheden:** De binding van de probe aan het doelwit wordt beïnvloed door factoren zoals temperatuur, zoutconcentratie, lengte van de probe en GC-gehalte [20](#page=20). * **Wassen:** Grondig wassen na de hybridisatie is cruciaal om aspecifieke binding te verwijderen en een hoge signaal-ruisverhouding te verkrijgen [49](#page=49). * **Fixatie van DNA:** Zorg voor adequate fixatie van het DNA op de drager om verlies tijdens de procedure te voorkomen [17](#page=17). * **Blokkering:** Behandeling met een eiwitrijke oplossing kan nodig zijn om te voorkomen dat detectiereagenten (zoals streptavidine) direct op het membraan binden [43](#page=43). --- # Synthese, modificatie en detectie van probes en labels Dit deel behandelt de synthese, het aanbrengen van labels en de detectiemethoden van probes en primers, zowel via chemische als enzymatische routes [20](#page=20). ### 2.1 Principes van probes en primers Probes en primers worden onderscheiden door hun lengte en bereidingsmethode [20](#page=20). * **Primers:** * Lengte: typisch 19-25 nucleotiden [20](#page=20). * Bereiding: chemische synthese [20](#page=20). * Labeling: kunnen gemerkt worden met bijvoorbeeld fluorescente of biotine-labels [20](#page=20). * Interactie: hun interactie met het target kan versterkt worden door de inbouw van MGB (Minor Groove Binder) of LNA (Locked Nucleic Acid) [20](#page=20). * **Probes:** * Lengte: variabele grootte [20](#page=20). * Bereiding: chemische synthese of enzymatische bereiding (bijvoorbeeld via PCR of kloneren) [20](#page=20). * Labeling: kunnen gemerkt worden met fluorochroom, biotine of digoxigenine [20](#page=20). * Interactie: de interactie met het target kan versterkt worden met 3’MGB of LNA-inbouw [20](#page=20). Bindingsterkte van een probe aan zijn target is afhankelijk van de lengte van de probe en het GC-gehalte [20](#page=20). ### 2.2 Bereiding van probes #### 2.2.1 Chemische synthese van oligo's Chemische synthese maakt het mogelijk om oligo's te produceren met een lengte tot wel 100 nucleotiden, hoewel langere oligo's aanzienlijk duurder worden. De meest gebruikte methode is de fosforamidietmethode, waarbij nucleotiden één voor één worden opgebouwd [21](#page=21). Tijdens de synthese kunnen de oligo's worden gemerkt door de inbouw van gemerkte dNTP's, zoals FITC-dUTP, Cy3-dUTP, DIG-dUTP of biotine-dUTP. Dit brengt echter extra kosten met zich mee. Alternatieven voor de standaard dNTP's, zoals ddNTP (dideoxynucleotide) of LNA, kunnen ook worden ingebouwd. Deze oligo's kunnen zowel als primer als probe dienen en worden doorgaans door gespecialiseerde bedrijven vervaardigd [21](#page=21). #### 2.2.2 Enzymatische synthese van probes Enzymatische methoden voor de bereiding van probes omvatten verschillende technieken, waaronder PCR, nick-translatie, random priming, eindlabeling en RNA-probe synthese via transcriptie [25](#page=25). * **PCR met eindstandige labeling:** Hierbij wordt een gemerkte primer gebruikt [25](#page=25). * **PCR met interne labeling:** Hierbij worden gemerkte dNTP's gebruikt die in de PCR-producten worden ingebouwd [25](#page=25). * **Merking op dsDNA achteraf:** * **Nick-translatie:** Bij deze methode wordt dsDNA behandeld met DNAse I, wat leidt tot enkelstrengige breuken. Vervolgens katalyseert DNA polymerase I de 3'-verlenging en een 5'-overschrijving met gemerkte nucleotiden [27](#page=27). * **Random priming labeling:** Deze methode omvat de denaturatie van DNA-fragmenten, gevolgd door annealing met willekeurige oligonucleotiden (6 nt). Vervolgens vindt *in vitro* verlenging plaats door DNA polymerase, zoals Klenow fragment, met de toevoeging van gemerkte dNTP's/dUTP's [29](#page=29). * **Eind labeling met een PNK (fosforylatie):** Dit proces wordt uitgevoerd met T4 polynucleotide kinase na defosforylatie, wat resulteert in een 5'-fosfaatgroep. Deze methode wordt voornamelijk gebruikt voor radioactieve labeling [30](#page=30). * **Eind labeling met een terminaal transferase:** Dit enzym kan gemerkte dNTP's aan de 3'-uiteinden van DNA-strengen toevoegen. Een uitdaging hierbij kan zijn dat de sequentie van de probe niet direct wordt gemarkeerd. Dit kan worden opgelost door te werken met een dideoxy-NTP, waardoor de ketenstop wordt geïnduceerd na incorporatie van één gemerkte nucleotide [31](#page=31) [32](#page=32). * **Bereiding van RNA probes via transcriptie:** RNA probes kunnen worden gemaakt door transcriptie van gekloneerd DNA [25](#page=25). * **Run-off transcriptie:** Een plasmide met een SP6 promotor wordt gekloneerd en na insert gelineariseerd met een restrictie-enzym. Vervolgens vindt *in vitro* transcriptie plaats met SP6 polymerase, NTP's en gemerkte NTP's om een gemerkte RNA probe te produceren [34](#page=34). ### 2.3 Inbouw en detectie van labels in probes Verschillende soorten labels kunnen in probes worden ingebouwd voor detectiedoeleinden. De keuze van het label bepaalt mede de detectiemethode [23](#page=23). * **Radioactief gemerkte dNTP's:** Deze maken directe detectie mogelijk [23](#page=23) [36](#page=36). * **Fluorescent gemerkte dNTP's:** Deze kunnen zowel voor directe als indirecte detectie worden gebruikt [23](#page=23) [36](#page=36). * **Biotine-16-dUTP:** Dit label vereist indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36). * **Digoxigenine-11-dUTP:** Dit label vereist eveneens indirecte detectie [23](#page=23) [36](#page=36). Bij het gebruik van biotine of digoxigenine is de inbouw van een spacer essentieel om sterische hinder te voorkomen. Dit is belangrijk voor de herkenning van het label en voor de vorming van de dubbele helix [24](#page=24). #### 2.3.1 Detectiemethoden De detectiemethoden zijn afhankelijk van het type label dat in de probe is ingebouwd [36](#page=36). * **Directe detectie:** * **Radioactiviteit:** * **Autoradiografie:** Maakt gebruik van röntgengevoelige films [37](#page=37). * **Phospho-imaging:** Een directere methode die herbruikbaar is [37](#page=37). * **Fluorochromen:** * Deze worden gedetecteerd met fluorescentiemicroscopen en CCD-camera's [38](#page=38). * Toepassingen omvatten FISH (fluorescente in situ hybridisatie) met labels zoals FITC, TRIT, AMCA [38](#page=38). * In microarrays worden labels als CY3 en CY5 gebruikt [38](#page=38). * Voor real-time PCR (qPCR) worden labels zoals JOE, FAM, HEX, TAMRA, CY3, CY5 ingezet [38](#page=38). * Fluorochromen worden over het algemeen niet toegepast in membraanhybridisaties [38](#page=38). * **Indirecte detectie:** * **Digoxigenine en biotine:** Deze labels worden altijd indirect gedetecteerd met behulp van reporters [39](#page=39). * **Reporters:** Dit kunnen enzymen (AP en HRP), colloïdaal goud of fluorochromen zijn [39](#page=39). * **Signaalamplificatie:** Om een detecteerbaar signaal te verkrijgen bij een laag aantal targets, kunnen methoden zoals signaalamplificatie met een streptavidine-biotine complex worden gebruikt. Ook (elektro)chemiluminescentie kan worden ingezet. Bij een laag aantal targets kan het ook helpen om meer labels of reporters per probe te gebruiken [42](#page=42) [43](#page=43). * **Blokkering:** Bij indirecte detectie is het cruciaal om te blokkeren met een eiwitrijke oplossing om te voorkomen dat antilichamen of streptavidine direct op het membraan binden [43](#page=43). * **Biotine detectie met antilichamen:** Biotine kan ook worden gedetecteerd met behulp van specifieke antilichamen [40](#page=40). #### 2.3.2 Reporters zichtbaar maken * **Enzymen:** * **HRP (Horse Radish Peroxidase):** * Kan een chromogene reactie geven met oplosbare of onoplosbare chromogenen (bv. DAB, AEC, TMB) [44](#page=44). * Kan ook chemiluminescentie produceren met een chemiluminogeen (bv. luminol) [44](#page=44). * HRP-ECL (Enhanced Chemiluminescence) met luminol is ongeveer 1000 keer gevoeliger in de aanwezigheid van diacylhydrazide [46](#page=46). * **AP (Alkalische Fosfatase):** * Geeft een kleurreactie met BCIP plus NBT (oplosbaar chromogeen) [44](#page=44) [47](#page=47). * Kan chemiluminescentie produceren met AMPPD, CSPD, of LuminoPhos. AP-ECL met AMPPD is ongeveer 400 keer gevoeliger in de aanwezigheid van CTAB en een fluoresceïnederivaat [44](#page=44) [48](#page=48). Bij de detectie van labels is de juiste hybridisatie-temperatuur (Th) en -tijd cruciaal, gevolgd door grondig wassen [49](#page=49). --- # Hybridisatiecondities en specificiteit Dit onderwerp verkent de optimale omstandigheden voor hybridisatie, inclusief factoren die de bindingssterkte beïnvloeden, het concept van stringentie en methoden om specificiteit te waarborgen tijdens de wasstappen. ### 3.1 Factoren die de hybridisatie beïnvloeden De hybridisatie van een probe met zijn target (DNA of RNA) wordt beïnvloed door diverse factoren die de stabiliteit en specificiteit van de hybride bepalen [50](#page=50). #### 3.1.1 Concentratie van probe en target De concentraties van de probe en het target zijn gecorreleerd. Bij een zeer laag aantal targets wordt een lage concentratie van de probe gebruikt, wat resulteert in een relatieve overmaat van de probe. De probe bindt aan lineair, enkelstrengs doelwit DNA of RNA [50](#page=50). #### 3.1.2 Eigenschappen van de probe en het target De binding van de probe wordt bepaald door: * **Grootte en GC-gehalte:** Grotere moleculen en een hoger percentage Guanine-Cytosine (GC) basenparen verhogen de bindingssterkte [50](#page=50). * **Basevolgorde:** De specifieke sequentie van de basen is cruciaal voor complementaire binding [50](#page=50). * **Type probe:** Het onderscheid tussen DNA/DNA, DNA/RNA en RNA/RNA hybriden heeft invloed op de hybridisatiecondities [57](#page=57). #### 3.1.3 Reactiecondities De omgevingsfactoren tijdens de reactie spelen een significante rol. Dit omvat [50](#page=50): * **Temperatuur:** Temperatuur is een sleutelfactor die de stabiliteit van de hybride beïnvloedt [50](#page=50). * **Stoffen in de omgeving:** Verschillende stoffen kunnen de helixvorming beïnvloeden [50](#page=50). * **Tijdsduur:** De duur van de hybridisatie is eveneens een belangrijke parameter [50](#page=50). ### 3.2 Hmax en kruishybridisatie * **Hmax** staat voor de maximale belading van het target met probe. De hoeveelheid probe wordt gekozen in het lineaire gebied van de verzadigingscurve om kruishybridisatie tegen te gaan [53](#page=53). * **Match:** Treedt op wanneer alle basen van de probe perfect hybridiseren met het target [53](#page=53). * **Kruishybridisatie:** Vindt plaats wanneer niet alle basen van de probe hybridiseren met het target, wat duidt op de aanwezigheid van één of meerdere mismatches [53](#page=53). > **Tip:** De probe concurreert met de oorspronkelijke complementaire streng voor renaturatie. De probe-target interactie is gemakkelijker dan target-target renaturatie vanwege de lengte en de overmaat van de probe [55](#page=55). ### 3.3 Stringentie en specificiteit Stringentie verwijst naar de reactiecondities waaronder de hybridisatie plaatsvindt. Het percentage mismatch en de stringentie bepalen samen de specificiteit van de probe-target binding [53](#page=53) [56](#page=56). #### 3.3.1 Hoge stringentie Bij hoge stringentie wordt alleen een stabiele hybride gevormd met 0% mismatch. De hybridisatietemperatuur ligt hierbij minimaal 5°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). #### 3.3.2 Lage stringentie Bij lage stringentie wordt ook een stabiele hybride gevormd in de aanwezigheid van mismatches. De hybridisatietemperatuur ligt hierbij 15°C onder de smelttemperatuur ($T_m$) [56](#page=56). #### 3.3.3 De smelttemperatuur ($T_m$) De smelttemperatuur is de temperatuur waarbij 50% van de hybriden is gedissocieerd. Een empirische berekening voor DNA/DNA hybriden met probes $\ge$ 100 bp is: $$T_m = 81.5 + 0.41(\%GC) – 600/l – 1.5(\%mismatch) + 16.6 (\log_{10} Na^+) – 63(\%formamide) (°C)$$ Deze formule is niet geldig voor DNA/RNA of RNA/RNA hybriden, noch bij gebruik van LNA (Locked Nucleic Acid) of MGB (Minor Groove Binder) probes. De hybridisatietemperatuur kan verlaagd worden door aanpassing van de formamide- of zoutconcentratie. Voor *in situ* hybridisatie (ISH) wordt altijd een temperatuur van 37°C aangehouden. De stringentie tijdens de wasstappen is ook afhankelijk van de $T_m$ [57](#page=57). #### 3.3.4 Factoren die de stringentie verhogen De stringentie kan worden verhoogd door: * Verlaging van de zoutconcentratie [58](#page=58). * Verhoging van de pH [58](#page=58). * Verhoging van de formamideconcentratie [58](#page=58). * Verhoging van de temperatuur [58](#page=58). > **Tip:** Tijdens de hybridisatie kan gekozen worden voor hoge of matige stringentie (ongeveer $T_m - 25°C$). Achteraf worden kruishybriden (met mismatches) weggewassen bij hoge stringentie [58](#page=58). ### 3.4 Toepassingen en overwegingen * **Detectie van mutaties:** Bij de detectie van mutaties kan een percentage mismatch toegestaan worden, afhankelijk van de gekozen stringentie [56](#page=56). * **Detectie van verwante genotypen:** Bij de detectie van aan virussen verwante genotypen of families van virussen is het mogelijk dat een percentage mismatch ontstaat [56](#page=56). ### 3.5 Componenten van de hybridisatiebuffer De hybridisatiebuffer kan diverse componenten bevatten ter verbetering van de probe-target interactie en stabiliteit [59](#page=59): * **Citraatbuffer en Denhardt's reagentia:** Bevatten Ficoll 400, polyvinylpyrrolidon 40, en BSA (Bovine Serum Albumin) [59](#page=59). * **Volume exclusion:** Verbetert de probe interactie via dextraansulfaat, PEG 6000-8000, of PVP 40 [59](#page=59). * **DTT (Dithiothreitol):** Heeft reducerende eigenschappen [59](#page=59). * **DMSO (Dimethylsulfoxide):** Vermindert interne hairpin structuren in nucleïnezuren [59](#page=59). * **Triton X100, SDS, Tween-20:** Bevorderen de diffusie van componenten binnen cellen [59](#page=59). * **RNAse inhibitor:** Essentieel bij RNA hybridisaties [59](#page=59). ### 3.6 Hybridisatietijd en C0t½ De hybridisatietijd hangt af van de specifieke situatie, inclusief de stringentie, het percentage mismatch en de lengte van de probe. Een richtlijn is twee tot driemaal de C0t½ waarde. De incubatietijd kan variëren van enkele tientallen seconden tot overnachting, vooral bij lange probes [60](#page=60). De C0t½ (concentratie van het reagens maal tijd voor half-renaturatie) wordt empirisch berekend met de volgende formule: $$C0t_{\frac{1}{2}} (\text{uur}) = 2 \cdot (\frac{1}{x} \cdot \frac{y}{5} \cdot \frac{z}{10})$$ waarbij: * $x$ = gewicht van de toegevoegde probe in microgram [60](#page=60). * $y$ = complexiteit van de probe uitgedrukt in kilobasen (Kb) [60](#page=60). * $z$ = reactievolume in milliliters (ml) [60](#page=60). ### 3.7 Afwerking en hergebruik Na detectie worden signalen vastgelegd met scintillogrammen, luminometers of tegenwoordig voornamelijk digitale imager systemen. Bewaarcondities zijn koel en donker. Nylonmembranen zijn herbruikbaar voor nieuwe hybridisatierondes (reprobing) [61](#page=61). ### 3.8 Samenvatting van de hybridisatieprocedure 1. **Denaturatie:** Het doelwit en de probe moeten gedenatureerd worden om enkelstrengs structuren te verkrijgen [62](#page=62). 2. **Hybridisatie:** Hybridisatie vindt plaats met de gelabelde probe onder condities die aangepast zijn aan de probe en het doel [62](#page=62). 3. **Wassen:** Wassen is noodzakelijk om niet-specifieke bindingen en kruishybriden te verwijderen [62](#page=62). 4. **Wassen bij smelttemperatuur:** Wassen dicht bij de smelttemperatuur verhoogt de specificiteit door instabiele hybriden te verwijderen [62](#page=62). 5. **Detectie:** De detectie hangt af van het type label dat op de probe is aangebracht [62](#page=62). --- # Afgeleide hybridisatietechnieken en hun toepassingen Dit overzicht behandelt diverse afgeleide hybridisatietechnieken en hun toepassingen in diagnostiek en onderzoek, variërend van eenvoudige dot blots tot complexe in situ hybridisaties [64](#page=64). ### 4.1 Algemene principes van hybridisatietechnieken Hybridisatietechnieken maken gebruik van het principe van complementaire baseparing om specifieke nucleïsche zuursequenties te detecteren. Hierbij wordt een gelabelde enkelstrengs probe gebruikt die hybridiseert met een complementaire doelsequentie (DNA of RNA) op een membraan of binnen cellen/weefsels (#page=65, 80) [65](#page=65) [80](#page=80). ### 4.2 Dot blot De dot blot is een eenvoudige membraanhybridisatietechniek waarbij DNA- of RNA-monsters direct op een filter worden aangebracht in de vorm van "dots". Na denaturatie kan een gelabelde probe hybridiseren met de doelsequentie. Deze techniek wordt onder andere gebruikt voor detectie [65](#page=65) [66](#page=66) [67](#page=67). ### 4.3 Colony and Plaque Lift Colony lift en plaque lift zijn technieken die worden gebruikt om specifieke klonen te detecteren in een populatie van bacteriële kolonies of faag plaques (#page=67, 68). Het proces omvat de transfer van kolonies/plaques naar een filter, gevolgd door DNA-release, denaturatie, prehybridisatie, hybridisatie met een gelabelde probe, en detectie [67](#page=67) [68](#page=68). ### 4.4 Southern blot Southern blotting is een techniek voor de detectie van specifieke DNA-sequenties in een DNA-monster. Hierbij wordt DNA eerst gedenatureerd, op een gel geplaatst, en vervolgens overgebracht (geblot) naar een membraan. Een gelabelde probe hybridiseert vervolgens met de doel-DNA-sequentie [70](#page=70). #### 4.4.1 Toepassingen van Southern blot Southern blot heeft diverse klinische en genetische toepassingen: * **Repeat expansie:** Detectie van repetitieve DNA-sequenties die kunnen wijzen op bepaalde genetische aandoeningen [72](#page=72). * **Ziekte van Huntington:** Een voorbeeld van een genetische ziekte die met Southern blot kan worden gedetecteerd [73](#page=73). * **Genetische manipulatie:** Screening naar onbedoeld geïntroduceerd rDNA in genetisch gemodificeerde planten [74](#page=74). * **Typing/fingerprinting:** Identificatie van bacteriële stammen op basis van de verplaatsing van insertion sequences (transposons) en het bepalen van graden van verwantschap (#page=78, 79) [78](#page=78) [79](#page=79). ### 4.5 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) RFLP, in combinatie met Southern blot, wordt gebruikt voor de detectie van polymorfismen in DNA-sequenties [75](#page=75). #### 4.5.1 Toepassingen van RFLP * **Detecteren van SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms):** Dit gebeurt door het gebruik van restrictie-enzymen (RE) die gevoelig zijn voor specifieke nucleotidenvariaties (#page=75, 76) [75](#page=75) [76](#page=76). * **Detecteren van specifieke methylatie:** Dit vereist het gebruik van methylatie-gevoelige restrictie-enzymen [75](#page=75). * **Detecteren van andere mutaties:** RFLP kan ook worden ingezet voor de detectie van diverse andere DNA-mutaties [77](#page=77). ### 4.6 Northern blot Northern blotting is de tegenhanger van Southern blot voor de detectie van RNA-sequenties, met name messenger RNA (mRNA). Het wordt gebruikt om de relatieve aanwezigheid en expressie van genen te bestuderen, inclusief verschillende isovormen van een gen (#page=70, 71). Een voorbeeld is de vergelijking van genexpressie in pancreasweefsel en pancreas kanker, waarbij verschillende isovormen van EGFR detecteerbaar zijn [70](#page=70) [71](#page=71). ### 4.7 FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) en ISH (In Situ Hybridisation) FISH en ISH zijn technieken die hybridisatie toepassen binnen een morfologische context, zoals specifieke weefsels of celtypes. De doelwitmoleculen kunnen DNA of RNA zijn [80](#page=80). #### 4.7.1 Principes en voorbereiding * **Target:** DNA of RNA [80](#page=80). * **Merking probe:** Probes kunnen fluorescerend zijn (voor FISH, detectie met fluorescentiemicroscoop) of gemerkt met biotine (detectie via streptavidine- of enzymconjugaat) [80](#page=80). * **Preparaten:** Technieken zijn toepasbaar op metafase chromosomen, interfasepraeparaten, cytospins, weefselcoupes en biofilms [83](#page=83). * **Voorbehandeling:** Essentiële stappen omvatten fixatie van preparaten, target vrijmaken met proteasen, permeabilisatie van cellen met vetoplossende middelen, en DNAse/RNAse behandeling afhankelijk van het doelwit [89](#page=89). * **Hybridisatie en wassen:** Vereist het bereiken van de juiste stringentie bij een geschikte temperatuur [89](#page=89). * **Detectie:** Met fluorescentiemicroscopie voor FISH, of via enzymatische reacties voor biotine-gemerkte probes [80](#page=80). #### 4.7.2 Toepassingen van FISH en ISH * **Detectie van specifieke DNA-sequenties:** Opsporen van cellen met DNA-afwijkingen, zoals chromosomale afwijkingen (translocaties, amplificaties, deleties) in oncologie (#page=85, 94) [85](#page=85) [94](#page=94). * **Microbiële screening:** PNA-FISH screening op bloed of biofilms om specifieke bacteriën te identificeren op basis van rRNA-targets (#page=85, 86) [85](#page=85) [86](#page=86). * **Genexpressiebeeldvorming:** Visualisatie van genexpressiepatronen (locatie en celtype) in multicellulaire organismen en weefsels met mRNA-specifieke FISH (#page=85, 87) [85](#page=85) [87](#page=87). * **Diagnostiek in oncologie:** Bepaling van genamplificaties, zoals de HER2-genamplificatie bij borstkanker, door de verhouding HER2/CEN17 te meten (#page=96, 97) [96](#page=96) [97](#page=97). #### 4.7.3 Praktische overwegingen bij FISH * **Controles:** Zowel positieve (probe detecteert gewenst doel) als negatieve (zonder probe, om autofluorescentie te controleren) controles zijn essentieel [91](#page=91). * **Automatisering:** Hoewel vaak handmatig uitgevoerd, bestaan er gedeeltelijk en volledig geautomatiseerde systemen [91](#page=91). * **Probe types:** Gebruik van totale probes, centromeer-specifieke probes, of gen-specifieke probes is mogelijk [92](#page=92). * **Uitdagingen:** Balans is vereist tussen behoud van DNA/RNA-targets en snelle fixatie/processing. Problemen kunnen ontstaan door loslaten van coupes, diffusie, onvoldoende gevoeligheid van probes, uitspoeling, basenverlies (depurinering) en verlies van celmorfologie [98](#page=98). ### 4.8 LIPA (Line Probe Assay) LIPA is een reverse hybridisatietechniek die wordt toegepast als omgekeerde hybridisatie. Verdere details over LIPA zelf zijn niet gespecificeerd binnen de verstrekte pagina's [63](#page=63). ### 4.9 DNA micro-array DNA micro-array is eveneens een reverse hybridisatietechniek. Verdere details over DNA micro-arrays zelf zijn niet gespecificeerd binnen de verstrekte pagina's [63](#page=63). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Probehybridisatie | Een moleculair-biologisch techniek waarbij een gemerkte enkelstrengs nucleïnezuursequentie (de probe) bindt aan een complementaire doelwitsequentie (DNA of RNA) onder specifieke omstandigheden. Dit proces is de basis voor het detecteren van specifieke nucleïnezuursequenties. | | Enkelstrengs DNA (ssDNA) | Een DNA-molecuul dat bestaat uit slechts één polynucleotideketen, in tegenstelling tot dubbelstrengs DNA (dsDNA) dat uit twee complementaire ketens bestaat. | | Dubbelstrengs DNA (dsDNA) | Een DNA-molecuul dat bestaat uit twee complementaire polynucleotideketens die spiraalsgewijs om elkaar heen gewikkeld zijn, met basenparen verbonden door waterstofbruggen. | | Denaturatie | Het proces waarbij de dubbele helix van DNA wordt gesplitst in twee enkelstrengse ketens, meestal door verhitting of chemische middelen. Dit is essentieel om een probe te laten binden aan een DNA-doelwit. | | Blotten | Een techniek om nucleïnezuren (DNA of RNA) of eiwitten van een gel naar een vast membraan (zoals nitrocellulose of nylon) over te brengen voor verdere analyse, zoals hybridisatie. | | Nylonmembraan | Een veelgebruikt synthetisch polymeermembraan dat wordt gebruikt voor het vangen van nucleïnezuren tijdens blotting procedures, vanwege zijn stabiliteit en bindingscapaciteit. | | Prehybridisatie | Een stap in de blotting procedure die wordt uitgevoerd na het blotten en fixeren, en voor de hybridisatie met de gemerkte probe. Het doel is om onbezette bindingsplaatsen op het membraan te blokkeren met niet-specifiek DNA of RNA om aspecifieke binding van de probe te voorkomen. | | Hybridisatie | Het proces waarbij twee complementaire enkelstrengse nucleïnezuurmoleculen (zoals DNA met DNA, RNA met RNA, of DNA met RNA) aan elkaar binden onder specifieke zout- en temperatuurcondities om een dubbelstrengs structuur te vormen. | | Label | Een detecteerbaar molecuul dat aan een probe is gekoppeld, waardoor de probe na hybridisatie kan worden gedetecteerd. Voorbeelden zijn radioactieve isotopen, fluorescentie-kleurstoffen, biotine of digoxigenine. | | Probes | Korte, enkelstrengse nucleïnezuursequenties (DNA of RNA) die zijn ontworpen om complementair te zijn aan een specifieke doelwitsequentie. Ze zijn gemerkt met een label om detectie mogelijk te maken na hybridisatie. | | Chemische synthese | Een methode om oligo-nucleïden te produceren in een laboratorium door sequentiële toevoeging van nucleotiden, vaak gebruikt voor het maken van korte, specifieke probes en primers. | | Enzymatische synthese | Een methode om probes te produceren met behulp van enzymen, zoals DNA-polymerasen, reverse transcriptase of RNA-polymerasen, vaak gebruikmakend van een template of een gekloneerd gen. | | Radioactief label | Een label dat bestaat uit een radioactieve isotoop (bv. $^32$P, $^35$S) die aan een probe is gekoppeld. Detectie gebeurt meestal via autoradiografie of phospho-imaging. | | Fluorescent label | Een label dat bestaat uit een molecuul dat licht uitzendt wanneer het wordt aangeslagen met licht van een specifieke golflengte. Detectie gebeurt met fluorescentiemicroscopen of CCD-camera's. | | Biotine | Een vitamine die vaak als label wordt gebruikt. Biotine-gemerkte probes worden indirect gedetecteerd met behulp van streptavidine-enzymcomplexen of streptavidine-fluorescentieconjugaten. | | Digoxigenine | Een steroïde hormoon dat vaak als label wordt gebruikt. Digoxigenine-gemerkte probes worden indirect gedetecteerd met behulp van antilichamen tegen digoxigenine die gekoppeld zijn aan enzymen of fluorescentie-moleculen. | | Indirecte detectie | Een detectiemethode waarbij de probe niet direct detecteerbaar is, maar een tussenliggend molecuul (reporter) nodig is dat aan de probe is gekoppeld en dat vervolgens zichtbaar wordt gemaakt met een substraat of een ander detectiesysteem. | | Signaalamplificatie | Technieken die worden gebruikt om het signaal van een gedetecteerde probe te versterken, waardoor detectie van lage hoeveelheden doelwit mogelijk wordt. Voorbeelden zijn de streptavidine-biotine complex methode of chemiluminescentie. | | Reporterenzym | Een enzym dat wordt gekoppeld aan een detective molecule (zoals een antilichaam of streptavidine) om na binding aan de probe een detecteerbaar signaal te genereren, bijvoorbeeld door het omzetten van een chromogeen of chemiluminogeen substraat. | | Chromogeen | Een stof die een kleur produceert wanneer deze door een enzym wordt omgezet. | | Chemiluminogeen | Een stof die licht produceert wanneer deze door een enzym wordt omgezet, wat resulteert in een chemiluminescent signaal. | | Stringentie | De mate van specificiteit van de binding tijdens hybridisatie. Hoge stringentie vereist perfecte of bijna perfecte complementariteit tussen probe en doelwit, terwijl lage stringentie ook hybriden met enkele mismatches toestaat. | | Tm (Smeltemperatuur) | De temperatuur waarbij 50% van de dubbelstrengs DNA-moleculen is gedenatureerd tot enkelstrengse moleculen. Het is een belangrijke parameter voor het bepalen van de juiste hybridisatie- en wascondities. | | RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) | Een techniek die gebruik maakt van restrictie-enzymen om DNA te knippen en vervolgens de lengteverschillen tussen fragmenten te analyseren via Southern blot. Deze verschillen kunnen optreden door polymorfismen of mutaties in het DNA. | | Southern blot | Een techniek om specifieke DNA-sequenties te detecteren. DNA wordt opgelost, geëlektroforeerd, op een membraan geblott, en vervolgens gehybridiseerd met een complementaire, gelabelde probe. | | Northern blot | Een techniek om specifieke RNA-sequenties te detecteren. RNA wordt opgelost, geëlektroforeerd, op een membraan geblott, en vervolgens gehybridiseerd met een complementaire, gelabelde probe. Wordt gebruikt om genexpressie te bestuderen. | | FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) | Een techniek die fluorescent gelabelde probes gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties direct in hun natuurlijke omgeving te lokaliseren binnen cellen, weefsels of chromosomen. | | ISH (In Situ Hybridisation) | Een algemene term voor hybridisatietechnieken die worden uitgevoerd op intacte cellen of weefsels om de locatie van specifieke nucleïnezuursequenties te bepalen. FISH is een veelvoorkomende vorm van ISH die fluorescentie gebruikt. | | Metafase preparaat | Een preparaat dat metafase chromosomen bevat, de meest gecondenseerde vorm van chromosomen tijdens celdeling. Dit wordt vaak gebruikt voor FISH-analyse van chromosomale afwijkingen. | | Interfase preparaat | Een preparaat dat cellen in de interfase bevat, de fase van de celcyclus tussen mitoses. FISH op interfasecellen wordt gebruikt om chromosomale afwijkingen te detecteren zonder dat de cel zich deelt. | | Genexpressie | Het proces waarbij de informatie in een gen wordt gebruikt om een functioneel genproduct te synthetiseren, meestal een eiwit of RNA-molecuul. | | Microarray | Een glazen drager met duizenden DNA-probes die in een grid zijn geordend. Hiermee kunnen tegelijkertijd de expressie van duizenden genen worden gemeten of genetische variaties worden geanalyseerd. | | LIPA (Line Probe Assay) | Een techniek die reverse hybridisatie combineert met strips die specifieke probes bevatten om genetische varianten, zoals mutaties, snel te identificeren. | | Kloneren | Het proces van het maken van identieke kopieën van een DNA-fragment, een gen, of een heel organisme. Dit kan worden bereikt via verschillende moleculair-biologische technieken. | | PCR (Polymerase Chain Reaction) | Een techniek om specifieke DNA-segmenten exponentieel te vermenigvuldigen in vitro. | | qPCR (Kwantitatieve Polymerase Chain Reaction) | Een variant van PCR die ook de hoeveelheid van het geamplificeerde DNA in real-time meet, wat kwantificering van het oorspronkelijke doelwit mogelijk maakt. | | Target enrichment | Een voorbereidende stap om de concentratie van een specifiek doelwitnucleïnezuur te verhogen alvorens verder te analyseren, bijvoorbeeld voor sequencing of hybridisatie. | | R-loop | Een structuur die ontstaat wanneer een DNA-duplex tijdelijk een van zijn strengen verliest ten gunste van een RNA-hybride. | | Dot blot | Een eenvoudige hybridisatietechniek waarbij DNA of RNA direct op een membraan wordt aangebracht in discrete "dots", gevolgd door hybridisatie met een gelabelde probe. | | Colony lift / Plaque lift | Technieken om kolonies van bacteriën of faagplaques van een cultuurmedium over te brengen naar een filter, zodat DNA uit deze kolonies of plaques kan worden geanalyseerd met hybridisatie. | | Specifieke celverdeling | De verspreiding van cellen met een bepaalde eigenschap of expressiepatroon binnen een organisme of weefsel. | | Genotypering | Het bepalen van het genotype van een individu, inclusief de aanwezigheid van specifieke allelen of mutaties. | | Typen/Fingerprinting | Technieken die worden gebruikt om individuele organismen of stammen te identificeren of te classificeren op basis van hun genetische profiel. | | HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) | Een eiwit dat een rol speelt bij celgroei en deling. Amplificatie van het HER2-gen, wat leidt tot overexpressie van het eiwit, is vaak geassocieerd met bepaalde vormen van kanker, met name borstkanker. | | CEN17 (Centromere van chromosoom 17) | Het centromeer van chromosoom 17, dat dient als referentiepunt bij genetische analyses, zoals de bepaling van genamplificatie van het HER2-gen op hetzelfde chromosoom. |