10. Reproductive Techniques in Laboratory Animals.pdf

# Geassisteerde voortplantingstechnieken (ART) Dit onderwerp behandelt diverse geassisteerde voortplantingstechnieken die worden toegepast in laboratoriumomstandigheden, zoals kunstmatige inseminatie, embryotransplantatie, in vitro fertilisatie en cryopreservatie. ### 1.1 Inleiding tot geassisteerde voortplantingstechnieken Geassisteerde voortplantingstechnieken (ART) omvatten een reeks medische en laboratoriumprocedures die worden gebruikt om de voortplanting te bevorderen. Deze technieken zijn essentieel geworden in de dierhouderij en voor onderzoek met laboratoriumdieren, waardoor de genetische diversiteit kan worden vergroot en waardevolle dierlijnen kunnen worden behouden [4](#page=4). ### 1.2 Kunstmatige inseminatie (AI) Kunstmatige inseminatie (AI) is een techniek waarbij sperma van een mannelijk dier wordt gedeponeerd in het vrouwelijke voortplantingskanaal, met behulp van instrumenten. De plaats van depositie kan variëren en omvat de vagina, cervix of uterus. Deze methode is wijdverbreid toegepast in de veeteelt, maar wordt niet gebruikt bij muizen [6](#page=6). ### 1.3 Embryotransplantatie (ET) Embryotransplantatie is een geassisteerde voortplantingstechniek waarbij een of meerdere embryo's uit het voortplantingskanaal van een donor worden verwijderd en vervolgens worden overgebracht naar een of meerdere ontvangende vrouwelijke dieren [8](#page=8). #### 1.3.1 Toepassing bij paarden Bij paarden kan één embryo per "flush" (spoeling) uit de donormerrie worden verkregen. Dit embryo kan vervolgens worden overgebracht naar een draagmerrie of surrogaat. Gezien de draagtijd van paarden van ongeveer elf maanden, kan een waardevolle donormerrie gedurende één seizoen vele veulens produceren door gebruik te maken van surrogaatmoeders [10](#page=10). ### 1.4 In vitro fertilisatie (IVF) In vitro fertilisatie (IVF) is een procedure waarbij een eicel wordt bevrucht door sperma buiten het lichaam van het dier, in een laboratoriumomgeving ("in vitro" betekent "in glaswerk"). De eerste IVF-baby werd geboren in 1978, gevolgd door IVF-kalveren in 1981, IVF-paarden in 1991 en IVF-biggen in 1993 [12](#page=12) [13](#page=13). #### 1.4.1 Onvruchtbaarheid en IVF Ongeveer één op de zeven tot één op de tien menselijke koppels is onvruchtbaar. Bij vruchtbare paren bedraagt de zwangerschapskans per cyclus ongeveer 25%, met cumulatieve zwangerschapskansen van 57% na 3 maanden, 72% na 6 maanden, 85% na 1 jaar en 93% na 2 jaar [14](#page=14). #### 1.4.2 Van oöcyt tot embryo Het proces van IVF omvat de superovulatie en het opvangen van volwassen oöcyten (eicellen). Vervolgens vindt de bevruchting plaats via IVF of ICSI (intracytoplasmatische sperma-injectie). De bevruchte eicellen worden vervolgens twee tot vijf dagen *in vitro* gekweekt, waarna één embryo wordt overgebracht. Dit resulteert in een zwangerschaps kans van ongeveer 25% [16](#page=16). #### 1.4.3 Intracystoplasmatische sperma-injectie (ICSI) Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) is een specifieke vorm van IVF waarbij één enkele zaadcel direct in de eicel wordt geïnjecteerd. Dit werd succesvol toegepast bij paarden op 27 oktober 2009 (SMICSI) [17](#page=17). #### 1.4.4 Proces van IVF bij vee Het proces begint met het verzamelen van onrijpe oöcyten, hetzij *post mortem* na slachting, hetzij bij levend vee door middel van punctie van de eierstokken. Deze oöcyten worden vervolgens *in vitro* gerijpt. Op woensdag zijn het bevruchte oöcyten, die daarna gedurende 7 tot 10 dagen *in vitro* worden gekweekt tot blastocyst-stadium. Dit stadium kenmerkt zich door de ontwikkeling van embryo's die gaan delen, morulae/blastocysten, en de expansie en hatching van blastocysten [19](#page=19) [20](#page=20). > **Tip:** *In vitro* cultuur van embryo's kan leiden tot het "Large Offspring Syndrome" (LOS), een fenomeen waarbij de nakomelingen abnormaal groot zijn [21](#page=21). #### 1.4.5 ART-geïnduceerde verstoringen ART-geïnduceerde procedures kunnen leiden tot diverse complicaties bij de nakomelingen, waaronder: * Intra-uteriene groeirestrictie [23](#page=23). * Premature geboorte [23](#page=23). * Laag geboortegewicht [23](#page=23). * Mogelijke aangeboren en genetische afwijkingen [23](#page=23). * Verminderde levensvatbaarheid [23](#page=23). Specifiek gerelateerd aan het Large Offspring Syndrome: * Verhoogde prenatale sterfte [23](#page=23). * Grote placenta's en foetussen [23](#page=23). * Partusproblemen [23](#page=23). * Hogere perinatale mortaliteit [23](#page=23). * Ademhalingsproblemen [23](#page=23). * Weigering om te zuigen [23](#page=23). * Skeletafwijkingen [23](#page=23). * Vergrote organen [23](#page=23). * Cerebellaire dysplasie [23](#page=23). * Gedragsafwijkingen [23](#page=23). ### 1.5 Geassisteerde reproductie bij vee Bij runderen omvat ART de punctie van eierstokken voor het verkrijgen van onrijpe oöcyten, gevolgd door *in vitro* fertilisatie en kweek tot embryo's. De resulterende embryo's worden vervolgens getransplanteerd naar ontvangsterkoeien [34](#page=34). #### 1.5.1 Resultaten van IVF bij runderen De *in vitro* cultuur van oöcyten bij runderen resulteert in ongeveer 90% maturatie, 70-80% cleavage (deling) en 30-45% blastocyst-vorming. De oöcytterugwinning uit follikels levert ongeveer 6-8 oöcyten per koe op. Van de verkregen embryo's resulteert één op de twee embryo's in een succesvolle zwangerschap (52% voor verse embryo's, 46% voor bevroren embryo's). Er werden wereldwijd meer dan één miljoen *in vitro*-geproduceerde (IVP) embryo's van runderen geregistreerd in 2019 [35](#page=35) [38](#page=38). ### 1.6 Geassisteerde reproductie bij paarden Bij paarden wordt ART toegepast door middel van eierstokpunctie voor het verkrijgen van onrijpe oöcyten, gevolgd door ICSI en vervolgens embryotransplantatie [36](#page=36). #### 1.6.1 Resultaten van ICSI bij merries Bij merries leidt ICSI tot ongeveer 60% maturatie van oöcyten, 70-80% cleavage en 20% blastocyst-vorming. De oöcytterugwinning per follikel varieert van 50-60%. Eén op de twee ICSI-embryo's resulteert in een succesvolle zwangerschap (60% voor bevroren embryo's). In 2021 werden meer dan 200 equine ICSI-embryo's geregistreerd in Gent [37](#page=37) [38](#page=38). ### 1.7 Cryopreservatie Cryopreservatie, het invriezen van gameten (zaadcellen en eicellen) en embryo's, is een cruciale component van ART voor langdurige opslag en toekomstig gebruik. Deze techniek maakt het mogelijk genetisch waardevol materiaal te bewaren en te transporteren. Bevroren embryo's van runderen en paarden tonen een hoge succesrate voor zwangerschap na ontdooiing en transplantatie [35](#page=35) [37](#page=37) [4](#page=4). ### 1.8 Overige ART-technieken Naast de eerder genoemde technieken omvat ART ook klonen en gentherapie. Deze geavanceerdere technieken bieden verdere mogelijkheden voor reproductie en genetische modificatie in laboratoriumdieren en potentieel in de veehouderij [4](#page=4). --- # Cryopreservatie van gameten en embryo's Cryopreservatie is een techniek die het mogelijk maakt om gameten en embryo's te bewaren bij extreem lage temperaturen, om hun biologische activiteit te behouden voor toekomstig gebruik. Dit proces is van cruciaal belang in diverse gebieden, waaronder de veeteelt, reproductieve geneeskunde en biotechnologisch onderzoek [25](#page=25) [27](#page=27). ### 2.1 Het proces van cryopreservatie Cryopreservatie omvat het bewaren van embryo's of gameten bij temperaturen onder het vriespunt, typisch in vloeibare stikstof bij -196°C. Dit kan betrekking hebben op verdund sperma, individuele eicellen (oöcyten) of embryo's in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling, van bevruchting tot het blastocyststadium. Het primaire doel is om het biologische proces van deze cellen te stoppen en te behouden, waardoor ze later kunnen worden gebruikt voor bevruchting of onderzoek [25](#page=25) [29](#page=29). #### 2.1.1 Rol van cryoprotectiva Een essentieel onderdeel van cryopreservatie is het gebruik van cryoprotectiva (CPA's). Deze stoffen, zoals glycerol, ethyleenglycol en dimethylsulfoxide (DMSO), zijn cruciaal om schade door ijsvorming te voorkomen. Zonder CPA's kunnen ijskristallen zich vormen in het medium rond de cellen, wat leidt tot mechanische schade en celdood [26](#page=26) [29](#page=29). > **Tip:** Het begrip cryopreservatie is gebaseerd op de observatie dat bepaalde stoffen, zoals glycerol, de levensvatbaarheid van sperma na vriesdrogen bij lage temperaturen kunnen herstellen [26](#page=26). #### 2.1.2 Slow freezing versus vitrificatie Er zijn twee hoofdmethoden voor cryopreservatie: slow freezing (langzaam invriezen) en vitrificatie (glasvorming) [29](#page=29). * **Slow freezing:** Deze methode maakt gebruik van een langzame koeling en een lage concentratie aan cryoprotectiva. Het principe is om gecontroleerd ijsvorming te induceren buiten de cellen, terwijl de celmembranen worden beschermd door de CPA's. Deze methode wordt traditioneel veel gebruikt voor sperma en embryo's in de veeteelt [27](#page=27) [29](#page=29). * **Vitrification:** Vitrificatie gebruikt een hoge concentratie aan cryoprotectiva en een zeer snelle afkoelsnelheid. Het doel is om de vorming van geordende ijskristallen te voorkomen en de oplossing in een amorfe, glasachtige toestand te brengen. Dit minimaliseert de celbeschadiging door ijsvorming aanzienlijk [29](#page=29) [33](#page=33). > **Tip:** De vitrificatiemethode is gebaseerd op het principe van glasvorming, waarbij de oplossing zo snel wordt afgekoeld dat watermoleculen geen tijd hebben om geordende kristallen te vormen en in een amorfe staat "bevriezen" [33](#page=33). ### 2.2 Toepassingen van cryopreservatie Cryopreservatie van gameten en embryo's heeft diverse belangrijke toepassingen: #### 2.2.1 Behoud van genetisch materiaal * **Veehouderij:** Het invriezen van sperma, en in mindere mate eicellen en embryo's, is een standaardpraktijk in de veehouderij. Dit maakt het mogelijk om superieure mannelijke en vrouwelijke genetica te bewaren en te verspreiden over grote geografische gebieden, wat de fokkerij-efficiëntie aanzienlijk verbetert [27](#page=27). * **Behoud van diersoorten:** Cryopreservatie speelt een rol bij het behoud van bedreigde diersoorten door genetisch materiaal te bewaren [31](#page=31). #### 2.2.2 Reproductieve Geneeskunde * **Fertiliteitsbehandelingen:** Het invriezen van eicellen en embryo's maakt het mogelijk om deze te gebruiken voor in-vitrofertilisatie (IVF) of andere vruchtbaarheidsbehandelingen. Dit biedt vrouwen de mogelijkheid om hun vruchtbaarheid te bewaren voor later gebruik, bijvoorbeeld bij ziekte of vanwege sociale redenen [31](#page=31). * **Oöcytenbanken:** Oöcyten kunnen worden ingevroren voor onderzoeksdoeleinden [31](#page=31). #### 2.2.3 Redden van gameten In sommige situaties is het mogelijk om gameten te redden van een overleden dier, wat de genetische waarde van dat dier ten goede kan komen [31](#page=31). ### 2.3 Vitrificatiestappen De vitrificatieprocedure voor oöcyten omvat doorgaans een reeks stappen met oplopende concentraties van cryoprotectiva: 1. **Equilibratie:** De oöcyten worden blootgesteld aan een oplossing met een lagere concentratie CPA's (bijvoorbeeld 7,5-10% ethyleenglycol, 7,5-10% dimethylsulfoxide) [32](#page=32). 2. **Vitrification:** Vervolgens worden de oöcyten ondergedompeld in een hogere concentratie CPA's (bijvoorbeeld 15-20% ethyleenglycol, 15-20% dimethylsulfoxide) aangevuld met 0,5 M sucrose. Deze hoge concentratie en snelle onderdompeling zorgen voor vitrificatie [32](#page=32). > **Example:** De concentraties van cryoprotectiva worden zorgvuldig gekozen om de cellen te beschermen tegen zowel uitdroging als ijsvorming, terwijl de vitrificatie wordt bevorderd [32](#page=32). De effectiviteit van cryopreservatie, met name de vitrificatie, is vergelijkbaar met de natuurlijke processen die bij sommige dieren worden waargenomen om extreme kou te overleven, zoals de alaskabrug kikker die kan overleven door te bevriezen. Dit illustreert de adaptieve voordelen van het beheersen van ijsvorming op cellulair niveau [28](#page=28). --- # Kloning en gentherapie Dit onderwerp behandelt kloning door middel van kerntransplantatie en de mogelijke toepassingen ervan, evenals gentherapie. ### 3.1 Kloning door middel van kerntransplantatie Reproductieve kloning wordt gedefinieerd als de doelbewuste productie van genetisch identieke individuen, waarbij elk nieuw geproduceerd individu een kloon is van het origineel. Dit kan worden uitgevoerd door middel van embryo splitsing of door middel van kerntransplantatie [40](#page=40). #### 3.1.1 Somatische cel kloning Somatische cel kloning door middel van kerntransplantatie is een techniek waarbij de celkern van een somatische cel wordt overgebracht naar een eicel waarvan de eigen celkern is verwijderd (enucleatie). Dit proces, gevolgd door activatie, resulteert in een gekloond embryo dat zich kan ontwikkelen tot een gekloond blastocyst. Dit gekloonde blastocyst kan vervolgens worden geïmplanteerd in de baarmoeder van een surrogaatmoeder om een gekloond nageslacht te produceren [41](#page=41). > **Tip:** Het sleutelconcept hierbij is het behoud van het volledige genetische materiaal (2n) uit de somatische celkern. #### 3.1.2 Toepassingen van somatische cel kloning Somatische cel kloning heeft diverse toepassingen gekend, waaronder het klonen van huisdieren, wat een commerciële activiteit is geworden. In de vee- en paardenfokkerij wordt somatische cel kloning ook toegepast. Er zijn voorbeelden bekend van gekloonde polo paarden die succesvol waren in competities [42](#page=42) [43](#page=43). > **Voorbeeld:** Het klonen van een waardevol renpaard om zo genetisch identieke nakomelingen te produceren die mogelijk dezelfde prestaties kunnen leveren. --- # Algemene conclusies en toepassingen van ART Dit onderwerp vat de algemene stand van zaken van ART samen, de prevalentie ervan bij mensen en dieren, en de toekomstige ontwikkelingen zoals geslachtsbepaling van sperma en gentherapie. ### 4.1 Prevalentie en algemene toepassingen van ART Kunstmatige reproductieve technologieën (ART) zijn aanwezig bij mensen, huisdieren en laboratoriumdieren. In België wordt ongeveer 5% van de baby's geboren na toepassing van ART. Binnen de veehouderij worden jaarlijks ongeveer 9000 IVF-kalveren geboren, naast duizenden kalveren via kunstmatige inseminatie (AI) [44](#page=44). ### 4.2 Toekomstige ontwikkelingen in ART Naast de reeds gevestigde ART-procedures, zijn er diverse andere technieken die worden toegepast of verder ontwikkeld. Deze omvatten onder andere [44](#page=44): * **Geslachtsbepaling van sperma:** Deze technologie maakt het mogelijk om het geslacht van het genetisch materiaal te bepalen voordat de inseminatie plaatsvindt. Dit kan de efficiëntie van fokprogramma's vergroten [44](#page=44). * **Genetische testing:** Met genetische tests kunnen specifieke genen of genetische afwijkingen worden geïdentificeerd bij embryo's of individuen [44](#page=44). * **Genbewerking (gene editing):** Dit omvat geavanceerde technieken zoals CRISPR-Cas9 om het DNA van organismen te modificeren. Dit opent deuren voor de correctie van genetische defecten en de verbetering van gewenste eigenschappen [44](#page=44). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Geassisteerde Voortplantingstechnieken (ART) | Een verzameling medische en laboratoriumprocedures die worden gebruikt om voortplanting te ondersteunen, met name wanneer natuurlijke conceptie moeilijk is. Dit omvat technieken zoals in vitro fertilisatie, embryotransplantatie en kunstmatige inseminatie. | | Kunstmatige inseminatie | De procedure waarbij sperma handmatig in het vrouwelijke voortplantingskanaal wordt ingebracht met behulp van instrumenten, in plaats van door natuurlijke copulatie. | | Embryotransplantatie | Het proces waarbij één of meerdere embryo's uit het voortplantingssysteem van een donor worden verwijderd en vervolgens worden overgebracht naar een of meerdere ontvangende vrouwtjes om tot een zwangerschap te leiden. | | In vitro fertilisatie (IVF) | Een medische procedure waarbij een eicel buiten het lichaam, in een laboratoriumomgeving (in glaswerk), wordt bevrucht door een spermacel. | | Cryopreservatie | Het proces van het langdurig bewaren van biologisch materiaal, zoals gameten (sperma en eicellen) of embryo's, bij extreem lage temperaturen, meestal in vloeibare stikstof (-196°C), om hun levensvatbaarheid te behouden. | | Gameten | Geslachtscellen die nodig zijn voor seksuele voortplanting. Bij mannetjes zijn dit spermacellen en bij vrouwtjes zijn dit eicellen. | | Vitrificatie | Een cryopreservatietechniek waarbij snel koelen, vaak met hoge concentraties cryoprotectiva, resulteert in de vorming van een glasachtige, amorfe structuur in plaats van ijskristallen, wat de schade aan cellen minimaliseert. | | Cryoprotectant (CPA) | Een stof die wordt toegevoegd aan biologische monsters alvorens deze te bevriezen om de vorming van schadelijke ijskristallen te voorkomen en de celmembranen te beschermen tegen schade door vrieskou. | | Kloning | Het proces van het creëren van een genetisch identiek individu. Dit kan worden bereikt door middel van embryo splitsing of kerntransplantatie, waarbij het genetisch materiaal van een somatische cel in een eicel wordt geplaatst. | | Kerntransplantatie | Een techniek waarbij de kern van een somatische cel wordt geïsoleerd en ingebracht in een geênucleëerde eicel (een eicel waarvan de kern is verwijderd), om zo een nieuw embryo te creëren dat genetisch identiek is aan de donor van de somatische cel. | | Somatische cel | Elke cel in het lichaam die geen geslachtscel is. Het genetisch materiaal van een somatische cel kan worden gebruikt voor kloningstechnieken. | | Large Offspring Syndrome (LOS) | Een aandoening die soms wordt waargenomen bij nakomelingen die zijn verwekt via geassisteerde voortplantingstechnieken, gekenmerkt door een groter postuur, verhoogde geboortegewichten en mogelijke ontwikkelingsafwijkingen. | | Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) | Een geavanceerde vorm van in vitro fertilisatie waarbij één enkele spermacel direct in het cytoplasma van een eicel wordt geïnjecteerd, vaak gebruikt bij gevallen van ernstige mannelijke onvruchtbaarheid. |