Werkcollege kalibratie micropipet_Student.pptx

# Kalibratie van semi-automatische pipetten Dit onderwerp behandelt de procedures en richtlijnen voor het nauwkeurig kalibreren van semi-automatische pipetten, met aandacht voor factoren zoals nauwkeurigheid, precisie en de impact van temperatuur en druk. ## 1.1 Begrippen nauwkeurigheid en precisie Bij de kalibratie van semi-automatische pipetten zijn twee kernbegrippen van belang: * **Nauwkeurigheid (juistheid):** Dit verwijst naar hoe dicht de gemeten waarde bij de werkelijke, theoretische waarde ligt. Een nauwkeurig instrument geeft resultaten die dicht bij de ware waarde liggen. * **Precisie (spreiding):** Dit beschrijft de reproduceerbaarheid van de metingen. Het geeft aan hoe dicht de opeenvolgende metingen bij elkaar liggen. Een hoge precisie betekent een kleine spreiding tussen de resultaten. ## 1.2 Principes van pipetkalibratie De kalibratie van een semi-automatische pipet is vergelijkbaar met instrumentele analyse, waarbij de gemeten massa van een vloeistof wordt omgezet naar een volume. Dit gebeurt met behulp van een conversiefactor. ### 1.2.1 Benodigdheden voor kalibratie Voor een correcte kalibratie zijn de volgende hulpmiddelen essentieel: * **Type water:** Gedeïoniseerd of gedestilleerd water wordt aanbevolen vanwege de gecontroleerde eigenschappen. * **Analytische balans:** Een nauwkeurige balans is nodig om de massa van de pipetteerde vloeistof te wegen. * **Pipetkalibratie werkblad:** Een gestandaardiseerd werkblad (vaak in Excel) wordt gebruikt voor het vastleggen van gegevens en berekeningen. ### 1.2.2 Procedure voor kalibratie De kalibratieprocedure omvat de volgende stappen: 1. **Instellen van het volume:** * Meet bij het **maximum volume** van de pipet. * Meet ook bij het **minimum volume** of tien procent van het maximum volume, afhankelijk van welk van de twee het grootste is. 2. **Voorbereiding van de pipet:** Voer eerst "pre-wetting" uit door de zuiger 3 tot 5 keer te bewegen met lucht in de tip. Dit zorgt ervoor dat de tip bevochtigd is met de te pipetteren vloeistof. 3. **Uitvoeren van metingen:** * Voer voor elk ingesteld volume 10 metingen uit. * Tarreren van de balans mag alleen tussen de metingen door, niet tijdens een reeks metingen voor een specifiek volume. 4. **Registratie van temperatuur en druk:** Meet de watertemperatuur en de omgevingsdruk na het uitvoeren van de metingen. Deze factoren beïnvloeden de dichtheid van het water en daarmee de conversiefactor. ## 1.3 De Z-factor De Z-factor is een cruciale conversiefactor die de dichtheid van het water in relatie tot temperatuur en druk weergeeft. * **Definitie:** De Z-factor wordt uitgedrukt in $\mu \text{L} / \text{mg}$. * **Afhankelijkheid:** De Z-factor is afhankelijk van zowel de temperatuur als de druk van de omgeving en de vloeistof. Er bestaan conversietabellen of formules om deze factor te bepalen op basis van de gemeten temperatuur en druk. > **Tip:** Bij het berekenen van de Z-factor, onthoud dat temperatuur en druk samen de dichtheid van het water bepalen, wat direct invloed heeft op de omzetting van massa naar volume. ## 1.4 Berekening en beoordeling van resultaten Na het verzamelen van de meetgegevens worden deze verwerkt om te bepalen of de pipet binnen de specificaties valt. ### 1.4.1 Berekening van het volume 1. **Bereken de gemiddelde massa ($M_{\text{gem}}$):** Dit is het gemiddelde van de 10 gemeten massa's voor een specifiek volume. 2. **Omzetten naar milligram:** Vermenigvuldig de gemiddelde massa in gram met 1000 om deze naar milligram om te zetten. 3. **Bereken het volume:** Vermenigvuldig de massa in milligram met de Z-factor om het uiteindelijke volume in $\mu \text{L}$ te verkrijgen: $$V_{\text{gemeten}} = M_{\text{gem}}(\text{mg}) \times Z_{\text{factor}}$$ ### 1.4.2 Beoordeling van nauwkeurigheid en precisie De gemeten resultaten worden getoetst aan de tolerantielimieten om te bepalen of de pipet "passed" of "failed" is. * **Nauwkeurigheid:** * Nauwkeurigheid wordt berekend als het verschil tussen het gemiddelde gemeten volume ($V_{\text{gemeten}}$) en het werkelijk ingestelde volume ($V_{\text{werkelijk}}$): $$\text{Nauwkeurigheid} = V_{\text{gemeten}} - V_{\text{werkelijk}}$$ * Als de nauwkeurigheid buiten de toegestane limieten valt, kan dit duiden op een systematische fout van de laborant of een probleem met de pipet zelf. * **Precisie:** * Precisie wordt beoordeeld op basis van de spreiding van de 10 metingen. Een veelgebruikte maat hiervoor is de standaarddeviatie (S.D.). * De onzekerheid in het volume wordt vaak bepaald met de formule: $$\text{Onzekerheid} = \text{absolute waarde van } (V_{\text{gemeten}} - V_{\text{werkelijk}}) + 2 \times \text{S.D.}$$ * Als de precisie buiten de toegestane limieten valt, is dit doorgaans een indicatie van een fout in de pipet zelf. ### 1.4.3 Acties bij falen van kalibratie * **FAIL bij nauwkeurigheid:** * Indien de fout primair systematisch is, kan het volume van de pipet worden bijgesteld met behulp van het stelsleuteltje. * Draaien met de klok mee (CW) vergroot het volume. * Draaien tegen de klok in (CCW) verkleint het volume. * Dit duidt echter ook vaak op een systematische fout van de laborant die gecorrigeerd moet worden. * **FAIL bij precisie:** * Dit wordt doorgaans gezien als een fout van de pipet zelf en vereist mogelijk reparatie of vervanging. > **Tip:** Oefen met het handmatig berekenen van de Z-factor, de gemiddelde massa, het volume en de nauwkeurigheid met een rekenmachine, zoals vereist kan worden op een examen. Zorg ervoor dat je de concepten van standaarddeviatie en de berekening van de totale onzekerheid begrijpt. ## 1.5 Beperkingen van micropipetten Er zijn limieten voor de volumes waarmee een micropipet betrouwbaar kan werken. Werken buiten deze limieten, met name bij zeer kleine volumes die de ondergrens van de pipet naderen, kan leiden tot onnauwkeurige en onbetrouwbare resultaten. ## 1.6 Temperatuur en druk als vormende factoren De temperatuur en druk van de omgeving spelen een cruciale rol in de nauwkeurigheid van pipetmetingen. Deze twee factoren bepalen samen de dichtheid van de vloeistof die wordt gepipetteerd. * De dichtheid van water varieert met temperatuur: warmer water is minder dicht. * Omgevingsdruk kan ook een lichte invloed hebben op de dichtheid, hoewel dit effect over het algemeen kleiner is dan dat van temperatuur. De gecombineerde invloed van temperatuur en druk wordt verwerkt via de Z-factor, die de massa van gepipetteerd water omzet naar het corresponderende volume, rekening houdend met deze omgevingscondities. Zonder correctie voor deze factoren kunnen de gemeten volumes significant afwijken van de werkelijkheid. --- # Factoren die pipetmeetresultaten beïnvloeden Dit onderwerp behandelt de essentiële factoren die de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van pipetmetingen beïnvloeden, met speciale aandacht voor de dichtheid van de te pipetteren stof, temperatuur, druk en het type water dat gebruikt wordt voor kalibratie. ### 2.1 Betrouwbaarheid van pipetmetingen De betrouwbaarheid van een pipetmeting wordt bepaald door twee hoofdaspecten: accuraatheid en precisie. Accuraatheid verwijst naar hoe dicht de gemeten waarde ligt bij de werkelijke waarde (juistheid), terwijl precisie de spreiding tussen opeenvolgende metingen aangeeft. ### 2.2 Factoren die de dichtheid beïnvloeden De dichtheid van de te pipetteren vloeistof is een cruciale factor. Deze dichtheid is niet constant, maar varieert afhankelijk van externe omstandigheden zoals temperatuur en druk. Dit fenomeen is met name relevant bij het kalibreren van pipetten, waar vaak water wordt gebruikt. #### 2.2.1 Temperatuur en druk Temperatuur en atmosferische druk hebben een directe invloed op de dichtheid van vloeistoffen. Voor nauwkeurige pipetmetingen, vooral bij kalibratie, is het essentieel om rekening te houden met deze factoren. Samen vormen temperatuur en druk de basis voor een zogenaamde $Z$-factor. * **De $Z$-factor:** Deze factor is een conversieparameter die de invloed van temperatuur en druk op de dichtheid van de vloeistof kwantificeert. De $Z$-factor wordt gebruikt om gemeten massa's om te zetten naar volumes, en vice versa, rekening houdend met de specifieke omgevingscondities. De relatie kan worden uitgedrukt met de formule: $Z = \frac{\mu L}{mg}$ Dit betekent dat de $Z$-factor de conversie van massa (in milligram) naar volume (in microliter) faciliteert. #### 2.2.2 Het gebruik van water voor kalibratie Voor de kalibratie van pipetten wordt aanbevolen om gedeïoniseerd of gedestilleerd water te gebruiken. Dit type water heeft een bekende en relatief constante dichtheid onder standaardomstandigheden, wat essentieel is voor nauwkeurige kalibratie. ### 2.3 Kalibratieprocedure voor pipetten Het kalibreren van een pipet is een proces dat nauwkeurigheid vereist en bestaat uit meerdere stappen: 1. **Voorbereiding:** * Kies het juiste tabblad in een rekenblad (bijvoorbeeld Excel) dat overeenkomt met het bereik van de te kalibreren pipet (bv. $100 \, \mu L$ - $1000 \, \mu L$). * Zoek de relevante $Z$-waarde op voor de heersende temperatuur en druk (bv. $T = 21^\circ C$ en $p = 1013 \, hPa$). 2. **Uitvoering van metingen:** * Gebruik een analytische balans om de massa van het gepipetteerde volume te meten. * Meet bij het maximum volume van de pipet en ook bij een minimum volume, dat idealiter $10\%$ van het maximum volume is (of het grootste van de twee indien dit de 10% overstijgt). * Voer minstens 10 metingen uit voor elk volume. Tussentijds tarreren van de balans is toegestaan. * Voer een "pre-wetting" procedure uit door de pipet tip 3 tot 5 keer te spoelen met het te pipetteren medium voordat de eigenlijke metingen beginnen. Dit zorgt voor een gelijkmatige bevochtiging van de tip en reduceert oppervlaktespanningseffecten. * Voer eerst de massametingen uit en bepaal daarna de watertemperatuur. 3. **Berekening en beoordeling:** * Vul de gemeten massa's in het rekenblad in. * Het rekenblad berekent de gemiddelde massa ($M_{gem}$) in gram, die vervolgens wordt omgerekend naar milligram ($m \times 1000 \, mg$). * Gebruik de $Z$-factor om de gemeten massa om te zetten naar een volume in $\mu L$. De formule hiervoor is: $V (\mu L) = M_{gem} (\text{in } mg) \times Z$ * Beoordeel de resultaten als 'passed' of 'failed' op basis van de accuraatheid en precisie. > **Tip:** Het is cruciaal om de $Z$-factor correct te gebruiken, aangezien deze de link vormt tussen de gemeten massa en het verwachte volume onder de specifieke omstandigheden. ### 2.4 Beoordeling van pipetmeetresultaten De beoordeling van de pipetmeetresultaten is gebaseerd op de accuraatheid en precisie: * **Accuraatheid (juistheid):** Als een pipet faalt op accuraatheid, kan dit duiden op een systematische fout, mogelijk veroorzaakt door de laborant of een verkeerde instelling van de pipet. De accuraatheid wordt vaak geëvalueerd aan de hand van de afwijking tussen het gemiddeld gemeten volume en het ingestelde volume. * **Precisie:** Als een pipet faalt op precisie, is de spreiding tussen de metingen te groot. Dit kan wijzen op een defect aan de pipet zelf of op variabele techniek van de laborant. #### 2.4.1 Foutenanalyse en correctie * **Systematische fouten (Accuraatheid):** Worden vaak veroorzaakt door de laborant (bv. pipetteertechniek) of door een verkeerde afstelling van de pipet. Aanpassingen aan het volume van de pipet kunnen de accuraatheid verbeteren: * **CW (Clockwise - met de klok mee) draaien:** Vergroot het volume. * **CCW (Counter-clockwise - tegen de klok in) draaien:** Verkleint het volume. * **Willekeurige fouten (Precisie):** Deze fouten zijn inherent aan het meetproces en kunnen worden gereduceerd door een consistente en correcte pipetteertechniek. Ze zijn vaak de fout van de laborant. ### 2.5 Berekening van onzekerheid Bij het beoordelen van de resultaten wordt ook rekening gehouden met de onzekerheid. De onzekerheid wordt berekend als de absolute waarde van de afwijking plus twee keer de standaarddeviatie ($S.D.$). Onzekerheid $= |V_{gem} - V_{werkelijk}| + 2 \times S.D.$ > **Voorbeeld:** Stel dat de gemiddelde meting $V_{gem} = 99.5 \, \mu L$ is en de werkelijke ingestelde waarde $V_{werkelijk} = 100.0 \, \mu L$. De standaarddeviatie is $S.D. = 0.1 \, \mu L$. > > De absolute afwijking is $|99.5 - 100.0| = 0.5 \, \mu L$. > > De totale onzekerheid is dan $0.5 \, \mu L + 2 \times 0.1 \, \mu L = 0.5 \, \mu L + 0.2 \, \mu L = 0.7 \, \mu L$. ### 2.6 Limieten van micropipetten Micropipetten hebben operationele limieten om betrouwbare resultaten te garanderen. Het werken buiten deze limieten (bv. te kleine volumes pipetteren in verhouding tot de pipetcapaciteit) kan leiden tot significant verminderde accuraatheid en precisie. ### 2.7 Examenvoorbereiding Voor het examen is het van belang dat studenten in staat zijn om met een rekenmachine de benodigde berekeningen uit te voeren, inclusief het bepalen van de gemiddelde massa, het omrekenen naar volumes met behulp van de $Z$-factor, en het beoordelen van de resultaten aan de hand van de gegeven toleranties. Het begrijpen van de formules die in het rekenblad worden gebruikt, is essentieel. --- # Praktische oefeningen en berekeningen voor pipetkalibratie Dit deel behandelt de praktische toepassing van pipetkalibratie, inclusief het gebruik van werkbladen, Excel-oefeningen en de berekening van nauwkeurigheid, precisie en onzekerheid. ### 3.1 Principes van pipetkalibratie Pipetkalibratie is essentieel voor het waarborgen van de nauwkeurigheid en precisie bij het werken met dure stoffen en kleine volumes. #### 3.1.1 Nauwkeurigheid en precisie * **Nauwkeurigheid** verwijst naar hoe dicht een meetwaarde bij de werkelijke waarde ligt (juistheid). * **Precisie** verwijst naar de spreiding tussen herhaalde meetwaarden. #### 3.1.2 Dichtheid en de Z-factor De dichtheid van de vloeistof, met name water, is cruciaal voor de conversie van massa naar volume. De dichtheid is afhankelijk van temperatuur en druk. * De **Z-factor** is een conversiefactor die temperatuur en druk meeneemt en wordt gebruikt om de gemeten massa om te zetten naar een volume. De formule hiervoor is: $z = \frac{\text{volume in }\mu\text{L}}{\text{massa in }\text{mg}}$ #### 3.1.3 Kalibratieprocedure De procedure voor het kalibreren van een pipet omvat de volgende stappen: 1. **Voorbereiding:** * Gebruik gedeïoniseerd of gedestilleerd water. * Gebruik een analytische balans. * Voer metingen uit bij het maximum volume en een minimum volume (minimaal 10% van het maximum, of het grootste van de twee). 2. **Uitvoering:** * Voer minimaal 10 metingen uit voor elk volume. * Tarreren van de balans is enkel toegestaan tussen de metingen door. * Voer eerst de metingen uit en meet daarna pas de watertemperatuur. * Voer een "pre-wetting" uit met de pipet 3 tot 5 keer. #### 3.1.4 Limieten en betrouwbaarheid Er zijn limieten voor het gebruik van micropipetten om betrouwbare resultaten te garanderen. De temperatuur en druk vormen samen de Z-factor. ### 3.2 Werkbladen en Excel-oefeningen Voor de praktische toepassing van pipetkalibratie worden werkbladen en Excel-oefeningen gebruikt. #### 3.2.1 Het kalibratie werkblad Een typisch werkblad voor pipetkalibratie bevat velden voor: * Het invoeren van de pipetrange. * Het opzoeken van de Z-waarde op basis van temperatuur en druk. * Het invoeren van de gemeten massa's. * Een beoordeling of de kalibratie "passed" of "failed" is. #### 3.2.2 Excel-oefening De Excel-oefening helpt bij het begrijpen van de gebruikte formules. Groene cellen in het werkblad zijn bedoeld om in te vullen. * **Stap 1:** Kies het juiste tabblad in Excel op basis van de pipetrange (bv. 100 μL - 1000 μL). * **Stap 2:** Zoek de Z-waarde op voor de gegeven temperatuur (bv. 21°C) en druk (bv. 1013 hPa). * **Stap 3:** Vul de gemeten massa's in. * **Stap 4:** Beoordeel de resultaten ("passed" of "failed"). #### 3.2.3 Dichtheid als functie van temperatuur en druk De dichtheid van water wordt bepaald door de temperatuur en druk. Er kan gebruik gemaakt worden van conversietabellen om de juiste Z-waarde te vinden. ### 3.3 Berekeningen voor pipetkalibratie Het examen vereist dat studenten in staat zijn om de nodige berekeningen met een rekenmachine uit te voeren. #### 3.3.1 Berekening van het gemiddelde volume De gemeten massa's worden omgezet naar milligram ($m_{gem}$). Vervolgens worden deze omgezet naar het volume in microliters ($V_{gem}$) met behulp van de Z-factor: $V_{gem} = m_{gem} \times Z$ #### 3.3.2 Berekening van nauwkeurigheid Nauwkeurigheid wordt berekend als het verschil tussen het gemiddelde gemeten volume en het werkelijk ingestelde volume: Nauwkeurigheid = $V_{gem} - V_{werkelijk}$ #### 3.3.3 Beoordeling (passed/failed) Er worden limieten gehanteerd om te bepalen of een pipet voldoet aan de specificaties. * **FAIL bij accuracy:** Kan wijzen op een systematische fout van de laborant. * **FAIL bij precision:** Wijst doorgaans op een fout van de pipet zelf. #### 3.3.4 Onzekerheid De onzekerheid wordt berekend met de standaarddeviatie (S.D.): Onzekerheid = $|V_{gem}| + 2 \times \text{S.D.}$ > **Tip:** De standaarddeviatie (S.D.) wordt doorgaans gegeven in de opgave bij de berekening van de onzekerheid. #### 3.3.5 Afstellen van het volume Als een pipet niet voldoet, kan het volume worden bijgesteld met een sleuteltje: * CW (Clockwise): Vergroot het volume. * CCW (Counter-Clockwise): Verkleint het volume. > **Example:** Een pipet kalibreren voor 100 μL. De gemeten massa is 99.5 mg en de Z-waarde is 1.002 μL/mg. Het gemeten volume is dan $99.5 \times 1.002 = 99.7 \mu L$. Als het ingestelde volume 100 μL was, is de nauwkeurigheid $-0.3 \mu L$. Als de standaarddeviatie $0.1 \mu L$ is, dan is de onzekerheid $|99.7| + 2 \times 0.1 = 99.9 \mu L$. --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Nauwkeurigheid | De mate waarin een gemeten waarde overeenkomt met de werkelijke of theoretische waarde. Het verwijst naar de correctheid van de meting. | | Precisie | De mate van overeenstemming tussen opeenvolgende metingen onder identieke omstandigheden. Het beschrijft de spreiding van de resultaten. | | Dichtheid | De massa per volume-eenheid van een stof, meestal uitgedrukt in kilogram per kubieke meter ($kg/m^3$) of gram per milliliter ($g/mL$). | | Kalibratie pipet | Het proces van het verifiëren en aanpassen van de nauwkeurigheid van een pipet om ervoor te zorgen dat deze de juiste volumes dispenseert. | | Conversiefactor (Z-factor) | Een factor die wordt gebruikt om de gemeten massa van een vloeistof (meestal water) om te zetten naar een volume, rekening houdend met de dichtheid van de vloeistof bij een specifieke temperatuur en druk. | | Gedeïoniseerd water | Water dat ontdaan is van ionen door middel van ionenwisselaarharsen, wat resulteert in een zeer zuivere waterkwaliteit. | | Gedestilleerd water | Water dat verkregen is door verdamping en condensatie, waardoor onzuiverheden en mineralen worden verwijderd. | | Analytische balans | Een zeer nauwkeurige weegschaal die gebruikt wordt om kleine massa's met een hoge precisie te meten, vaak gebruikt bij laboratoriumanalyses. | | Pre-wetting | De procedure waarbij de pipetkop meerdere keren wordt gevuld en geleegd met de te pipetteren vloeistof voordat de daadwerkelijke meting wordt uitgevoerd, om de interne wanden te bevochtigen en verdamping te minimaliseren. | | Z-factor | De conversiefactor die de relatie tussen massa en volume van een vloeistof bij specifieke temperatuur- en drukcondities weergeeft. Het wordt gebruikt om gemeten massa's om te zetten naar volumes in microliters. | | Systematische fout | Een fout die de metingen consequent in dezelfde richting beïnvloedt, wat resulteert in een verschuiving van de gemeten waarden ten opzichte van de werkelijke waarde. | | Standaard Deviatie (S.D.) | Een statistische maat die de spreiding of variabiliteit van een dataset aangeeft ten opzichte van het gemiddelde. Een lage S.D. duidt op een hoge precisie. |