Inleiding proefdierkunde Martinet 2025-2026.pdf

# Definitie en classificatie van proefdieren en dierproeven Dit onderwerp definieert wat een proefdier en een dierproef is, inclusief de wettelijke kaders, de verschillende categorieën van dieren die worden gebruikt, en de gradaties van ongerief die dieren kunnen ervaren. ### 1.1 Wat is een proefdier? Een proefdier is elk levend, gewerveld dier, inclusief vrij levende en zich voortplantende larvale vormen zoals kikkervisjes, dat wordt gebruikt of voorbestemd is voor proefdoeleinden. Proefdieren moeten afkomstig zijn van een erkende fokker of leverancier; dieren die in het wild zijn gevangen, zwerfdieren, verloren, achtergelaten of verwilderde dieren worden niet als proefdieren beschouwd. Het gebruik van mensapen als proefdieren is verboden sinds 2009. Niet-menselijke primaten mogen enkel worden toegelaten binnen specifieke toepassingsgebieden en uitzonderingen zijn mogelijk op basis van grondige wetenschappelijke motivatie [1](#page=1). ### 1.2 Categorieën en aantallen proefdieren In Vlaanderen werden in 2023 diverse proefdieren gebruikt. Aan de Universiteit Antwerpen werden in 2022 10.800 proefdieren gebruikt. Jaarlijks worden in de Europese Unie vele miljoenen proefdieren ingezet voor onderzoek en educatie, waarbij ook meer dan 9,5 miljoen dieren worden gekweekt maar niet gebruikt [2](#page=2) [3](#page=3). ### 1.3 Wat is een dierproef? Een dierproef omvat het aanwenden van een proefdier voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden waarbij het dier ongerief kan ondervinden. Dit omvat ook elke handeling die leidt tot de ontwikkeling van een genetisch gemodificeerde lijn, of het behoud van zo'n lijn waarvan het fenotype pijnlijk is of tot ongemak leidt [3](#page=3). #### 1.3.1 Wat zijn geen dierproeven? Verschillende activiteiten worden niet beschouwd als dierproeven: * Het observeren van een dier in de natuur [3](#page=3). * Het doden van een dier volgens een 'humane' methode [3](#page=3). * Proeven op dode gewervelde dieren [3](#page=3). * Proeven op ongewervelde dieren, met mogelijke uitzonderingen zoals octopussen (cephalopoden) [3](#page=3). #### 1.3.2 Vereisten en alternatieven Dierproeven mogen uitsluitend worden uitgevoerd als er geen alternatief beschikbaar is [3](#page=3). #### 1.3.3 Ongerief bij proefdieren Ongerief bij proefdieren gaat verder dan enkel pijn en kan ook stress, eenzaamheid, angst, ziekte of speciale voeding omvatten. De minimale pijndrempel wordt gedefinieerd als het prikken van een naald. Ongerief wordt ingedeeld in schalen van 1 tot 4: terminaal (SV1, waarbij de proef volledig onder verdoving plaatsvindt), beperkt (SV2), matig (SV3) of ernstig (SV4). Onderzoekers zijn verplicht om ongerief bij proefdieren te beperken [3](#page=3). > **Tip:** Het is cruciaal om het onderscheid te maken tussen een proefdier en een dierproef, en de definitie van 'ongerief' breed te interpreteren, inclusief psychologische stress. > **Tip:** Houd de wettelijke verboden en beperkingen voor specifieke diersoorten zoals mensapen en primaten altijd in gedachten. --- # Doel en methoden van dierproeven in de farmaceutische industrie Dierproeven in de farmaceutische industrie zijn essentieel om de veiligheid en effectiviteit van nieuwe geneesmiddelen te evalueren alvorens ze aan mensen worden toegediend [4](#page=4). ### 2.1 Algemene toxicologie Algemene toxicologie richt zich op de identificatie van mogelijke nadelige effecten van een stof op het lichaam. Dit omvat studies met enkelvoudige doses om de maximale getolereerde dosis (MTD) te bepalen, waarbij minimaal twee toedieningswijzen en twee verschillende diersoorten (knaagdier versus niet-knaagdier) worden gebruikt. Studies met herhaalde doses kunnen subchronisch (3 dagen tot 3 maanden) of chronisch (6 tot 12 maanden) zijn [5](#page=5). #### 2.1.1 Opgevolgde parameters in algemene toxicologie Tijdens deze studies worden diverse parameters gemonitord: * **Acute toxiciteit:** observatie van mortaliteit [5](#page=5). * **(Sub)chronische toxiciteit:** beoordeling van mortaliteit door accumulatie van de stof [5](#page=5). * **Klinische observaties:** algemene conditie, gedrag, en voedsel- en waterinname [5](#page=5). * **Lichaamsgewicht:** een afname van 10% wordt als een toxisch effect beschouwd [5](#page=5). #### 2.1.2 Effecten op specifieke orgaansystemen * **Centraal zenuwstelsel (CZS):** * **Sensorische functies en reflexen:** testen van visuele placing reflex, oogknipperreflex, pinch reflex en hindlimb extension reflex [6](#page=6). * **Spierkracht:** meting van grijpkracht via de wire suspension test [6](#page=6). * **Motorische coördinatie, evenwicht en behendigheid:** evaluatie met behulp van de stationary beam test, (accelerating) rotarod, treadmill, stap-analyse en de 'catwalk' [7](#page=7) [8](#page=8) [9](#page=9). * **Cognitieve functies (denkproces, geheugen):** gebaseerd op leerprocessen met positieve versterking (bv. voedsel, ontsnappen uit water) of negatieve versterking (wegnemen van negatieve prikkels zoals elektrische stroomstoten). Tests omvatten de Skinner box, avoidance learning, Morris water maze, Barnes maze en de novel object recognition test [10](#page=10) [11](#page=11) [12](#page=12) [9](#page=9). * **Angst (onderdrukking):** gemeten met de elevated plus maze en de open field test [12](#page=12) [13](#page=13). * **Hart en bloedvaten:** * **Meting van bloeddruk en hartritme:** kan gebeuren via de tail cuff methode, die gevoelig is voor stress en geen continue monitoring toelaat, maar wel goedkoop en eenvoudig is. Telemetrie vereist een chirurgische ingreep en is duurder, maar vermindert stress bij dieren en maakt continue monitoring mogelijk [14](#page=14). * **Analyse van electrocardiogram (ECG):** belangrijk vanwege cardiovasculaire problemen die een significante reden zijn voor het terugtrekken van geneesmiddelen. Een verlengd QT-interval kan wijzen op een risico op 'torsade de pointes' [13](#page=13) [15](#page=15). * Telemetrie kan ook gebruikt worden voor andere metingen, zoals EEG-metingen in muizen [16](#page=16). * **Ademhaling:** * **Respiratoire parameters via plethysmografie:** meting van ademhalingsfrequentie, tidal volume, long compliantie (de rekbaarheid van de longen) en luchtwegresistentie. De compliantie wordt vergeleken met een ballon (lage compliantie) of een plastic zakje (hoge compliantie) [16](#page=16). * **Bepaling van arteriële zuurstofsaturatie:** [16](#page=16). * Plethysmografie kan niet-invasief worden uitgevoerd op bewuste dieren, wat stress kan veroorzaken maar een normaal ademhalingspatroon behoudt. Invasieve plethysmografie vereist orotracheale intubatie en anesthesie, wat het ademhalingspatroon kan beïnvloeden, maar geen stress veroorzaakt en compliantie- en resistentiemetingen mogelijk maakt [17](#page=17). * **Spijsvertering:** * Analyse en opvolging van stoelgang (constipatie, diarree) [18](#page=18). * Meting van gastro-intestinale motiliteit met behulp van beads (model voor vast voedsel) of kleurstof Evans blue (model voor vloeibare maaltijden of dranken) [18](#page=18). ### 2.2 Safety pharmacology Safety pharmacology onderzoekt de mogelijke ongewenste effecten van een geneesmiddel op vitale orgaansystemen, zoals het centrale zenuwstelsel, hart- en vaatstelsel en ademhalingssysteem [13](#page=13) [5](#page=5). ### 2.3 Opvolgen carcinogeniciteit Dit betreft het onderzoeken van het potentieel van een stof om kanker te veroorzaken. Methoden omvatten macroscopisch onderzoek, postmortem analyse en genetische testen (vaak in vitro) om afwijkingen in genetisch materiaal op te sporen [19](#page=19). ### 2.4 Fertilititeitstesten Fertiliteitstesten evalueren de invloed van een geneesmiddel op de vruchtbaarheid. Dit omvat het toedienen van de stof aan zowel mannelijke als vrouwelijke dieren, gevolgd door paring en analyse van de foetussen uit de uterus [19](#page=19). ### 2.5 Opvolgen teratogeniciteit Teratogeniciteitstesten onderzoeken de invloed van een stof op de ontwikkeling van de foetus. Hierbij wordt macroscopisch onderzoek uitgevoerd, inclusief skeletonderzoek en visceraal onderzoek van de foetussen, om aangeboren afwijkingen zoals spina bifida, microuria, afwijkingen aan ribben of wervels, en intracraniale afwijkingen te detecteren [20](#page=20) [21](#page=21). ### 2.6 Farmacokinetiek Farmacokinetiek bestudeert wat het lichaam met de stof doet, inclusief de processen absorptie, distributie, metabolisme en excretie (ADME) [22](#page=22). * **Absorptie:** het proces waarbij een stof vanaf de toedieningsplaats in de bloedbaan terechtkomt [22](#page=22). * **Distributie:** de verdeling van de stof over het lichaam en het bereiken van doelorgaansystemen [22](#page=22). * **Metabolisme:** de chemische omzetting van de stof in metabolieten [22](#page=22). * **Excretie:** de eliminatie van de stof uit het lichaam via huid, longen, nieren of lever [22](#page=22). De toedieningsroute en formulering van een geneesmiddel zijn bepalend voor de farmacokinetiek. Quantitative whole-body autoradiography (QWBA) is een techniek om de distributie van radioactief gemerkte stoffen te bepalen [22](#page=22). ### 2.7 Locale tolerantie Locale tolerantietesten beoordelen de afwezigheid van corrosie, irritatie of sensitisatie na behandeling van de huid of mucosa. Dit is niet vereist voor orale therapeutica [23](#page=23). * **Corrosie:** irreversibele schade aan de huid of penetratie door de cornea, leidend tot necrose, bloedingen of littekens [23](#page=23). * **Irritatie:** reversibele schade aan de huid na één of meerdere behandelingen, resulterend in droge huid of kloven [23](#page=23). * **Sensitisatie:** een immunologisch gemedieerde allergische reactie na meerdere behandelingen, met symptomen als jeuk, zwelling en oedeem [23](#page=23). De Draize test, oorspronkelijk ontwikkeld voor cosmetica en huishoudproducten, wordt gebruikt om corrosie en irritatie te evalueren, hoewel deze methode controversieel is en de huidtest ervan verboden is in de EU. De oogtest wordt nog gebruikt, maar met aanpassingen. Voor sensitisatie wordt de Local Lymph Node Assay (LLNA) gebruikt [24](#page=24). ### 2.8 Bloed- en urineonderzoek * **Bloedonderzoek:** omvat tellingen van rode en witte bloedcellen, bloedplaatjes, analyse van bloedstolling, serumanalyses (zouten, mineralen, leverenzymen, glucose, lipiden) en endocrinologische analyses (hormonen) [25](#page=25). * **Urineonderzoek:** analyse van pH, dichtheid, glucose, eiwitten, ketonen (met sticks) en microscopische analyse van kristallen en cellen [25](#page=25). ### 2.9 Postmortem analyse Na het experiment wordt een postmortem analyse uitgevoerd, die macroscopisch onderzoek van organen (grootte, vorm, kleur, positie), gewichtsmetingen van organen (absoluut en relatief ten opzichte van lichaamsgewicht) en histologische analyse van weefsels omvat [25](#page=25). --- # De 3 R's concept en alternatieve methoden Dit onderwerp behandelt het ethische kader van de 3 R's (Vervanging, Vermindering, Verfijning) voor dierproeven en verkent diverse in vitro en in vivo alternatieven en methoden voor ongeriefminimalisatie. ### 3.1 Introductie tot de 3 R's Het concept van de 3 R's, voorgesteld door Russell en Burch in 1959 in 'The principles of human experimental research', dient als ethisch leidraad voor het gebruik van proefdieren. Dit concept omvat Vervanging, Vermindering en Verfijning. Tegenwoordig wordt hier vaak een vierde R, Verantwoordelijkheid (Responsibility), aan toegevoegd [30](#page=30). ### 3.2 De kernprincipes van de 3 R's #### 3.2.1 Vervanging (Replacement) Vervanging houdt in dat proefdieren worden vervangen door niet-gewervelde dieren, embryo's, larvale vormen, celculturen, computermodellen en andere in vitro tests om een wetenschappelijk doel te bereiken [30](#page=30) [31](#page=31). * **Voorbeelden van alternatieven:** * **Invertebraten:** * **Drosophila melanogaster (fruitvlieg):** Dit model is goedkoop, klein, gemakkelijk te kweken, heeft een korte levenscyclus (9-10 dagen bij 25°C), makkelijk te onderscheiden geslachten, produceert veel eieren (tot 100/dag), heeft slechts 4 paar chromosomen en een volledig in kaart gebracht genoom. Het is een veelgebruikt model in de genetica [32](#page=32). * **Caenorhabditis elegans (rondworm):** Dit model is eveneens goedkoop, klein en gemakkelijk te kweken. Het is een transparante nematode van 1 mm, hermafrodiet, heeft een korte levenscyclus (3-7 dagen afhankelijk van temperatuur) en een volledig in kaart gebracht genoom [33](#page=33). * **Larven van de grote wasmot (Galleria mellonella):** Deze larven kunnen worden geïncubeerd bij kamertemperatuur of 37°C, zijn relatief groot (gemakkelijke injectie), en beschikken over een aangeboren immuunsysteem (cellulaire immuniteit door hemocyten en humorale immuniteit met defensiemoleculen). Ze zijn interessant voor het bestuderen van geneesmiddelen tegen bacteriën en schimmels [34](#page=34). * **Embryo's of larven:** * **Zebravis embryo (Danio rerio):** Zebravisjes leggen het hele jaar door eieren (100-200/week), hebben een uitwendige bevruchting en ontwikkeling, een snelle embryonale ontwikkeling, en embryo's met eischaal zijn doorzichtig. Stoffen worden gemakkelijk opgenomen via het water, het genoom is vergelijkbaar met dat van de mens, en embryo's/larven zijn tot 120 uur na fertilisatie geen proefdier [35](#page=35). * **Voorbeeld: Effecten van cafeïne op zebravis embryo's:** Cafeïne, een stimulerend middel, kan bij zebravis embryo's leiden tot teratogeniciteit, zoals afwijkingen aan dooier en staart, vertraagde hatching, vertraagde hartslag, staartafwijkingen, kortere lichaamslengte, oedeem rond het hart, malformaties van de dooier, en abnormaal staartweefsel [36](#page=36) [37](#page=37) [38](#page=38) [39](#page=39). * **In vitro tests:** * **Bovine Cornea Opacity & Permeability (BCOP) test:** Vervangt de Draize oogtest. Deze test gebruikt runderhoornvliezen om opaciteit (door eiwitdenaturatie of stromale zwelling) en permeabiliteit (door beschadiging van het epitheel) te meten. De doorlaatbaarheid wordt gemeten door de toevoeging van fluoresceïne en analyse met een spectrofotometer. Een in vitro score wordt berekend als opaciteit + (15 x permeabiliteit) om de irritatiegraad te bepalen [40](#page=40) [41](#page=41). * **EpiOcular eye irritation test:** Maakt gebruik van in vitro gekweekte humane keratinocyten op een microporeus membraan, die een gelaagd epitheel vormen dat hoornvliesepitheel nabootst. De metabolische activiteit wordt gemeten met de MTT-assay, een colorimetrische methode [42](#page=42) [43](#page=43). * **Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) test:** Behelst het plaatsen van testsubstanties op de chorioallantoïsche membraan van bevruchte kippeneieren om tekenen van hemorragie, coagulatie of cellyse te evalueren [43](#page=43) [44](#page=44). * **Vervanging van de Draize huidtest:** Dit kan door het gebruik van humane keratinocyten, gekweekt op een vaste matrix, die histologisch vergelijkbaar zijn met de menselijke epidermis [44](#page=44). #### 3.2.2 Vermindering (Reduction) Vermindering richt zich op het gebruik van methoden die leiden tot vergelijkbare informatie met minder dieren, of meer informatie met hetzelfde aantal dieren. Dit kan bereikt worden door [30](#page=30) [31](#page=31): * Correct experimenteel design [31](#page=31). * Gebruik van statistiek om de benodigde groepsgrootte te berekenen [31](#page=31). * Hergebruik van proefdieren [31](#page=31). * Combinatie van dierproeven op dezelfde groep dieren [31](#page=31). * In vivo imaging voor longitudinale studies bij dezelfde dieren [31](#page=31). * Rapporteren van negatieve data [31](#page=31). #### 3.2.3 Verfijning (Refinement) Verfijning beoogt het ongerief bij dierproeven op te heffen of te verminderen, en daarmee het dierenwelzijn te verhogen, wanneer vervanging niet mogelijk is. Dit omvat [30](#page=30) [32](#page=32): * Gebruik van anesthetica en analgetica [32](#page=32). * Verminderen van stress door bijvoorbeeld lawaai te vermijden, het aantal dieren per kooi te beperken, en onnodig transport te vermijden [32](#page=32). * Kooiverrijking [32](#page=32). ### 3.3 Alternatieve methoden en initiatieven Naast de 3 R's zijn er ook andere initiatieven die het dierenwelzijn en de ethische overwegingen rond dierproeven bevorderen. #### 3.3.1 De 3 H's Initiatief Dit initiatief focust op Huisvesting (Housing), Handling en Gewenning (Habituation). * **Huisvesting (Housing):** Maakt de huisvesting aangenamer door te overwegen of dieren alleen of met soortgenoten gehuisvest moeten worden, de beschikbare ruimte te maximaliseren (bv. met platformen), onderdak en nestmateriaal aan te bieden, en objecten te gebruiken die behandeld zijn met geuren van soortgenoten (bv. feromonen) [45](#page=45). * **Handling:** Bevat aanbevelingen voor de manipulatie van dieren, met voorbeelden zoals 'tunneling' en 'cupping' [46](#page=46). * **Gewenning (Habituation):** Gebruikt methoden die een positieve associatie met menselijke handelingen opwekken en negatieve ervaringen minimaliseren, bijvoorbeeld door dieren te trainen en na de handeling een beloning te geven (voeding, extra kooiverrijking) [46](#page=46). ### 3.4 Juridische en ethische context * Dierproeven worden beschermd volgens het Koninklijk Besluit van 29 mei 2013 (oorspronkelijke wet 14/08/1986) [29](#page=29). * Het testen van cosmetica op dieren is verboden sinds 2005 [29](#page=29). * Dierproeven voor de ontwikkeling van tabaksproducten zijn verboden sinds 2011 [29](#page=29). * Opleidingen met betrekking tot dierproeven zijn wettelijk verplicht sinds 2004, met verschillende niveaus: Dierenverzorger (Categorie A), Biotechnicus (Categorie B), en Proefleider (Categorie C) [29](#page=29). * Bij het beoordelen van de aanvaardbaarheid van dierproeven moeten ethische (weging ongerief vs. belang proef), wetenschappelijke (relevantie voor mens, herhaling, in vitro mogelijkheid), economische (kosten-baat) en juridische aspecten in acht worden genomen [29](#page=29). > **Tip:** Het onthouden van de specifieke voorbeelden van vervangende methoden (zoals de fruitvlieg, de worm, de zebravis embryo, en de verschillende in vitro tests) is cruciaal voor examens. Zorg dat je de voordelen van elk van deze modellen kunt benoemen. > **Tip:** Begrijp de fundamentele principes achter elke R en hoe ze praktisch worden toegepast om ongerief te minimaliseren en dierenwelzijn te bevorderen. --- # Praktische aspecten van het werken met proefdieren Dit gedeelte behandelt de essentiële praktische overwegingen en technieken die komen kijken bij het uitvoeren van dierproeven, van de ethische goedkeuring tot de uiteindelijke humane beëindiging. ### 4.1 Ethische commissie en projectaanvraag De Ethische Commissie Dierproeven (ECD) speelt een cruciale rol in het beoordelen en goedkeuren van dierproeven [47](#page=47). #### 4.1.1 Samenstelling en taak van de ECD * **Samenstelling:** De ECD bestaat uit minimaal zeven leden met expertise in ethiek, alternatieve methoden, dierwelzijn en -gezondheid, experimentele setup, onderzoeksmethoden, en statistische analyse [47](#page=47). * **Taak:** De commissie evalueert geplande dierproeven en formuleert adviezen aan de laboratoriumdirecteur of proefleiders met betrekking tot ethische aspecten [47](#page=47). #### 4.1.2 Vereisten voor een projectaanvraag ECD Een projectaanvraag bij de ECD moet de volgende aspecten bevatten [48](#page=48): * Algemene feiten en gevolgtrekkingen die leiden tot een werkhypothese. * Formulering van de werkhypothese. * Gedetailleerde beschrijving van de dierproef, waaronder: * Keuze van het proefdier (species, stam, specifieke eigenschappen) met motivatie [48](#page=48). * Aantal proefdieren met motivatie [48](#page=48). * Toepassing van het 3 V's concept (Vervanging, Vermindering, Verfijning) [48](#page=48). * Omschrijving van de verschillende behandelingen [48](#page=48). * Chemische substanties en hun dosering [48](#page=48). * Toedieningswijze van producten [48](#page=48). * Methoden voor het preleveren van organen of weefsels [48](#page=48). * Anesthesie (premedicatie, anestheticum, dosis, duur, toedieningswijze) [48](#page=48). * Gebruikte meetmethodes [48](#page=48). * Methode van opoffering [48](#page=48). * Beschrijving van het geanticipeerde ongemak voor de proefdieren [48](#page=48). * Beschrijving van humane eindpunten [48](#page=48). ### 4.2 Huisvesting van proefdieren De huisvesting van proefdieren is cruciaal voor hun welzijn en de betrouwbaarheid van experimentele resultaten. Er zijn verschillende niveaus van huisvesting, elk met specifieke vereisten [49](#page=49). #### 4.2.1 Germ-free (kiemvrij) * **Definitie:** Dieren die geen kiemen (micro-organismen) op of in hun lichaam dragen [49](#page=49). * **Kenmerken:** * Aseptische geboorte via keizersnede om overdracht van vaginale flora te vermijden [49](#page=49). * Pups worden niet gezoogd; kunstmatige voeding is noodzakelijk om de overdracht van microbiot via melk te voorkomen [49](#page=49). * Huisvesting in kiemvrije isolatoren [49](#page=49). * Alle materialen en nutriënten moeten gesteriliseerd worden [49](#page=49). * **Gnotobionten:** Gnotobionten zijn kiemvrije dieren die geïnfecteerd zijn met één of meerdere gekende micro-organismen [49](#page=49). #### 4.2.2 Specific pathogen free (SPF) * **Definitie:** Dieren die vrij zijn van een specifieke lijst van pathogenen [51](#page=51). * **Kenmerken:** * Er is een lijst van geteste pathogenen beschikbaar, die regelmatig wordt bijgewerkt [51](#page=51). * De isolatiemethode is gericht op het voorkomen van infecties met deze specifieke pathogenen [51](#page=51). * Er wordt een barrière voorzien tussen conventionele en SPF-dieren [51](#page=51). #### 4.2.3 Conventioneel animalarium * Dit type huisvesting biedt een minder strikte controle op pathogenen dan SPF of germ-free omstandigheden [52](#page=52). * Toegangsvoorwaarden omvatten doorgaans 48 uur geen contact met andere knaagdieren en het dragen van specifieke laboratoriumkleding [52](#page=52). * Individueel geventileerde kooien (IVC) worden ook gebruikt [52](#page=52). #### 4.2.4 SPF animalarium vereisten * **Toegangsprocedure:** Vereist 48 uur geen contact met andere knaagdieren (inclusief dieren uit conventionele ruimtes), verplicht douchen, en het dragen van geautoclaveerde kledij en klompen [57](#page=57). * **Fysieke beveiliging:** SPF-ruimtes hebben hermetisch afgesloten muren en gescheiden pulsatie/extractie systemen [57](#page=57) [58](#page=58). * **Luchtfiltering en -verversing:** HEPA-filtering en een luchtdruk met overdruk zijn essentieel. De lucht wordt minimaal 5 keer per uur ververst [59](#page=59). * **Materialen:** Alle materialen die de SPF-ruimte ingaan, moeten geautoclaveerd worden [59](#page=59). * **Alternatieven voor autoclaveren:** Indien autoclaveren niet mogelijk is, kan materiaal worden gesteriliseerd via een sas met desinfectiemiddelen zoals ammoniumverbindingen, of door het vernevelen van waterstofperoxide (H2O2) [59](#page=59). ### 4.3 Merken van proefdieren Het correct identificeren van proefdieren is essentieel voor het bijhouden van gegevens en het voorkomen van verwarring. #### 4.3.1 Tijdelijke markering * Kleurcodes op de staart of vacht kunnen gebruikt worden voor tijdelijke identificatie [60](#page=60). #### 4.3.2 Permanente markering * **Tattoo:** Een permanente markering die direct op de huid wordt aangebracht [60](#page=60). * **Knippen van tenen:** Een methode waarbij een teen wordt ingekort [60](#page=60). * **Ponsen van oren:** Het creëren van een specifiek patroon in de oren [60](#page=60). * **Metaal oorlabel:** Een fysiek label dat in het oor wordt aangebracht [60](#page=60). * **Subcutaan inplanten van chip:** Een microchip die onder de huid wordt geïmplanteerd voor elektronische identificatie [60](#page=60). ### 4.4 Immobilisatie van proefdieren Verschillende experimenten vereisen dat proefdieren worden geïmmobiliseerd. Er zijn diverse methoden beschikbaar [62](#page=62). #### 4.4.1 Immobilisatie met de hand * **Rat:** Ratten zijn over het algemeen volgzaam. Het dier wordt bij voorkeur rond de schouders vastgepakt, met aandacht voor de gevoelige staart [62](#page=62). * **Muis:** Muizen, afhankelijk van de stam, kunnen snel geagiteerd raken en wennen niet altijd goed aan frequente manipulatie [63](#page=63). * Pak de basis van de staart vast (om pijn te voorkomen) [63](#page=63). * Laat het dier een oppervlak (bv. rooster van een kooi) vastgrijpen [63](#page=63). * Pak het nekvel met de andere hand [63](#page=63). * Fixeer de staart [63](#page=63). * **Konijn:** Bij konijnen is het essentieel om altijd de achterhand te ondersteunen. Pak het dier bij het nekvel en bedek de ogen of kop om het te kalmeren [63](#page=63). #### 4.4.2 Immobilisatie met restrainers * Restrainers zijn apparaten die speciaal ontworpen zijn om dieren veilig vast te zetten voor procedures zoals injecties [64](#page=64). * Voorbeelden zijn "the bunny snuggle" voor injecties in de staart [64](#page=64). #### 4.4.3 Immobilisatie via anesthesie Anesthesie is een proces om de waarneming van pijn en andere negatieve gevoelens te blokkeren [65](#page=65). * **Algemeen versus lokaal:** Anesthesie kan algemeen (het hele lichaam) of lokaal (een specifiek gebied) zijn [65](#page=65). * **Mono-anesthesie versus gebalanceerde anesthesie:** Dit verwijst naar het gebruik van één anestheticum versus een combinatie van middelen [65](#page=65). ##### 4.4.3.1 Inhalatieanesthesie met fluoraan * **Werkingsmechanisme:** Fluoraan is een gehalogeneerde koolwaterstof die wordt vermengd met zuurstof en lucht en via een verdamper wordt toegediend. De exacte werking is niet volledig begrepen, maar het induceert bewustzijnsdaling, lichte pijnstilling en beperkte spierverslapping [65](#page=65) [66](#page=66). * **Potentie:** De sterkte wordt uitgedrukt in MAC (minimale alveolaire concentratie). Voorbeelden van MAC-waarden zijn: Halothaan (0,7%), Isofluraan (1,2%), Enfluraan (1,6%), Sevofluraan (2-2,5%), Desfluraan (7%) [65](#page=65). * **Toediening:** Inductie van narcose gebeurt in een anesthesiekamer, onderhoud met een masker [66](#page=66). * **Afvoer overtollig gas:** Overtollig gas moet correct worden afgevoerd of geabsorbeerd met actieve kool [66](#page=66). * **Voordelen:** Nauwelijks gemetaboliseerd, snelle recovery [66](#page=66). * **Nadelen/Nevenwerkingen:** Lage bloeddruk, ritmestoornissen, onderdrukking van de ademhaling [66](#page=66). ##### 4.4.3.2 Injectie van barbituraten * **Werkingsmechanisme:** Barbituraten zijn GABA agonisten, wat de werking van gamma-aminoboterzuur (GABA) versterkt. Dit heeft een sterk dempende werking op het centrale zenuwstelsel [67](#page=67). * **Effecten:** Variëren van lichte sedatie tot diepe, onomkeerbare coma en dood. Ze worden gebruikt als slaapmiddel, kalmeringsmiddel, anti-epilepticum, inductiemiddel bij narcose en euthanaticum [67](#page=67). * **Veelgebruikte middelen:** Thiopental (Penthotal®) en pentobarbital (Nembutal®) [67](#page=67). * **Nevenwerkingen:** Dosisafhankelijke respiratoire en cardiale repressie. Bij lage doseringen kunnen cardiale effecten optreden zoals ritmestoornissen, tachycardie en verminderde myocardiale contractiliteit [67](#page=67). ##### 4.4.3.3 Injectie van ketamine/xylazine * **Ketamine:** * **Type:** Dissociatief anestheticum, dat de corticale-subcorticale connecties verstoort. Hierdoor komen prikkels vanuit het ruggenmerg aan in de subcortex, maar worden niet doorgegeven aan de cortex, waardoor het dier zich niet bewust is van zijn omgeving [68](#page=68). * **Mechanisme:** Niet-competitieve NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptor antagonist [68](#page=68). * **Effecten:** Induceert een oppervlakkige slaap (ogen blijven open), goede analgesie [69](#page=69). * **Nevenwerkingen:** Verhoogt hartritme, bloeddruk en hartdebiet; weinig respiratoire depressie tenzij bij overdosering; verhoogde tonus van skeletspieren; verhoogde speekselsecretie; excitatie bij ontwaken; potentieel hallucinogeen [69](#page=69). * **Partydrug context:** Milde dosis geeft een roes, hoge dosis kan een bijna-doodervaring ('K-hole') veroorzaken [69](#page=69). * **Xylazine:** * **Type:** Alfa2-adrenerge sedativum (agonist van de alfa2-adrenerge receptor) [69](#page=69). * **Effecten:** Sedatie, spierrelaxatie, milde analgesie. Het induceert geen anesthesie [69](#page=69). * **Mechanisme:** Het blokkeert de werking van noradrenaline op alfa2-receptoren [69](#page=69). ### 4.5 Toediening van testsubstanties Het correct toedienen van testsubstanties is essentieel voor experimentele nauwkeurigheid. #### 4.5.1 Topicale toediening * **Beschrijving:** De testsubstantie wordt lokaal op de huid of slijmvliezen aangebracht, bijvoorbeeld als crème, zalf, oogdruppel of neusspray [70](#page=70). * **Werking:** Meestal lokaal, soms systemisch (bv. transdermale pleisters) [70](#page=70). * **Voordelen:** Heel toegankelijk [70](#page=70). * **Nadelen:** Geen accurate dosering, kan irritatie veroorzaken [70](#page=70). #### 4.5.2 Enterale toediening (via het maag-darmkanaal) * **Anale route (zetpil):** Biedt accurate dosering, maar is niet toepasbaar bij kleine proefdieren [71](#page=71). * **Orale route (peroraal):** * **Via drinkwater/voer:** * **Voordelen:** Gemakkelijk [71](#page=71). * **Nadelen:** Accuraatheid van dosering en timing kan twijfelachtig zijn (afhankelijk van consumptie). Consumptie bij muizen: water 4-7 ml/dag, voer 3-6 g/dag. Kan leiden tot slechte smaak of irritatie. Alleen geschikt voor chemisch stabiele en wateroplosbare substanties [71](#page=71). * **Via sonde (gavage):** * **Voordelen:** Accurate dosering [71](#page=71). * **Nadelen:** Vereist handigheid en training [71](#page=71). #### 4.5.3 Parenterale toediening (niet via het maag-darmkanaal) Dit gebeurt doorgaans via injectie of infuus [72](#page=72). * **Intracutaan (I.C.) / intradermaal (I.D.):** In de lederhuid [72](#page=72). * **Subcutaan (S.C.):** Onder de huid [72](#page=72). * **Intramusculair (I.M.):** In de spier. Meestal in de achterpoten [72](#page=72) [73](#page=73). * **Intraperitoneaal (I.P.):** In de buikholte. Bij voorkeur in het linker onderste kwadrant om de lever te vermijden [72](#page=72) [73](#page=73). * **Intraveneus (I.V.):** In een ader. Relatief moeilijk bij muizen, maar zeer nauwkeurig en met snelle werking van substanties. Kan een relatief groot volume toelaten [72](#page=72) [73](#page=73). * **Intracerebraal (I.C.):** Direct in de hersenen [72](#page=72). * **Intracerebroventriculair (I.C.V.):** In de hersenventrikels. Voordeel is het omzeilen van de bloed-hersenbarrière [72](#page=72) [74](#page=74). * **Epiduraal:** In de epidurale ruimte [72](#page=72). * **Intrathecaal (I.T.):** In het ruggenmergkanaal [72](#page=72). * **Intra-articulair (I.A.):** In een gewricht [72](#page=72). #### 4.5.4 Belangrijke aandachtspunten bij parenterale toediening * Gebruik steriele en scherpe naalden van de juiste grootte en dikte (gauge) [75](#page=75). * Vermijd luchtbellen [75](#page=75). * De oplossing moet op kamer- of lichaamstemperatuur zijn om pijn te voorkomen [75](#page=75). * Gebruik fysiologische zoutoplossing als solvent indien mogelijk [75](#page=75). #### 4.5.5 Chronische toediening * **Uitdagingen:** Dagelijkse gavages of injecties zijn tijdsrovend, leiden tot stress en kunnen complicaties veroorzaken (bv. peritonitis) [75](#page=75). * **Oplossing:** Osmotische minipompjes (Alzet) bieden een continue toediening [75](#page=75). * **Voordelen:** Constante concentratie van actieve stof, geen overdosering (toxische effecten), geen verlies van effect door te lage dosering [76](#page=76). * **Nadelen:** Kostprijs [75](#page=75). * **Alternatief:** Infuuspompjes zijn implanteerbaar en programmeerbaar [77](#page=77). ### 4.6 Isolatie van lichaamsvloeistoffen Het verkrijgen van lichaamsvloeistoffen voor analyse is een veelvoorkomende procedure. #### 4.6.1 Bloedname (muizen & ratten) * **Staartvenen:** Een veelgebruikte methode voor bloedname [78](#page=78). * **Retro-orbitale sinus:** Deze methode mag **enkel onder terminale anesthesie** worden uitgevoerd [78](#page=78). * **Dorsal pedal vein:** Bloedname uit de vene op de rug van de voet [79](#page=79). * **Vena facialis:** Bloedname uit de gelaatsvene [79](#page=79). * **Vena temporalis superficialis:** Bloedname uit de oppervlakkige slaapader [80](#page=80). * **Andere methoden:** V. saphena, decapitatie (met exsanguinatie, 30 mL/kg), en cardiale punctie (terminaal) kunnen ook worden gebruikt [81](#page=81). #### 4.6.2 Faeces & urine * Kan spontaan optreden tijdens manipulatie van het proefdier [81](#page=81). * Urine kan verkregen worden via een katheter in de blaas [81](#page=81). * Metabole kooien zijn speciaal ontworpen om urine en faeces te verzamelen [81](#page=81). ### 4.7 Humane doden van proefdieren Het humaan doden van proefdieren is een essentieel onderdeel van dierproeven, met als doel het minimaliseren van fysisch en mentaal lijden [82](#page=82). #### 4.7.1 Definitie en timing * **Definitie:** Dier doden met een minimum aan fysisch en mentaal lijden, procedure aangepast aan het proefdier [82](#page=82). * **Wanneer:** Aan het einde van een experiment of wanneer humane eindpunten zijn bereikt [82](#page=82). #### 4.7.2 Humane eindpunten * **Definitie:** De eerste indicatie in een dierexperiment van (mogelijke) pijn en/of ongerief die kan leiden tot het humaan doden van het dier of het wegnemen/verlichten van de pijnlijke/stressvolle procedures, binnen de context van de te behalen wetenschappelijke eindpunten [82](#page=82). * **Waarom toepassen:** * **Morele overwegingen:** Verminderen van pijn en ongerief [82](#page=82). * **Wetenschappelijke overwegingen:** Voorkomen van beïnvloeding van onderzoeksresultaten [82](#page=82). * **Wettelijke overwegingen:** Naleving van regelgeving [82](#page=82). * **Vaststellen van pijn/ongerief bij muizen:** * **Mouse grimace scale:** Pijn vaststellen via gezichtsuitdrukkingen (ogen dichtknijpen, neus opkrullen, wangen opblazen, oor- en snorhaarpositie). Een score van 0 duidt op normaal, 1 op matige pijn/ongerief, en 2 op ernstige pijn/ongerief [83](#page=83). * **Afwijkend gedrag/lichaamskenmerken:** * **Normaal gedrag:** Exploratie, klimmen, graaf- en nestgedrag, grooming, barbering [83](#page=83). * **Abnormaal gedrag:** Passief, sedatief gedrag; onverzorgde vacht, (bijt)wonden, pilo-erectie; stereotype gedrag; doorgroeiende tanden; gewichtsverlies (>20%); verlies lichaamstemperatuur [83](#page=83). #### 4.7.3 Methoden van humaan doden * **Mechanisch-fysische methoden:** * Dislocatie van cervicale wervels [84](#page=84). * Decapitatie (guillotine of schaar) [84](#page=84). * Electrocutie (uitsluitend op bewusteloze dieren) [84](#page=84). * Penschiettoestel ('captive bolt') of percuterende slag op het hoofd [84](#page=84). * Schot in het hoofd [84](#page=84). * **Farmaco-chemische methoden:** * **Overdosis anestheticum:** Bijvoorbeeld barbituraten (3x de anesthesiedosis) [84](#page=84). * **Inhalatie CO2:** * Niet geschikt voor neonaten [84](#page=84). * De snelheid van CO2-invoer is cruciaal: een onmiddellijke 100% CO2 kan dyspneu en stress veroorzaken [84](#page=84). * Aanbevolen snelheid: 10-30% van het kamervolume per minuut, wat zorgt voor snel bewustzijnsverlies gevolgd door overlijden [84](#page=84). * CO2-flow dient minstens 1 minuut aangehouden te worden na respiratoir arrest om overlijden te garanderen [84](#page=84). #### 4.7.4 Humane doden van pups Specifieke methoden worden gehanteerd voor het humaan doden van pups [84](#page=84). ### 4.8 De muis als proefdier De muis (Mus musculus) is het meest gebruikte proefdier vanwege diverse voordelen [85](#page=85). #### 4.8.1 Voordelen van de muis als proefdier * **Grootte:** Klein proefdier, wat leidt tot goedkopere huisvesting [85](#page=85). * **Biologie:** Bouwplan van een zoogdier [85](#page=85). * **Levensverwachting:** Korte levensverwachting (2-3 jaar), waarbij 1 muisjaar overeenkomt met ongeveer 30 mensjaren, wat studies naar ouderdomsziekten mogelijk maakt [85](#page=85). * **Voortplanting:** * Snel geslachtsrijp (mannetjes na 50 dagen, vrouwtjes na 50-60 dagen) [85](#page=85). * Snelle voortplanting met een dracht van 18-21 dagen [85](#page=85). * Gemiddeld 8-9 nesten per jaar, met ongeveer 6 pups per nest [85](#page=85). * Kweek is mogelijk gedurende 7-9 maanden [85](#page=85). * **Genoom:** Ongeveer 96% van het muisgenoom is identiek aan dat van de mens, wat het ideaal maakt voor medisch onderzoek [85](#page=85). * **Genetische manipulatie:** Gemakkelijk genetisch te manipuleren [85](#page=85). #### 4.8.2 Bijzondere muizenlijnen * **Naakte muizen:** * Ontstaan door disruptie van het FOXN1 gen, wat resulteert in geen vacht en een rudimentaire of afwezige thymus [86](#page=86). * **Kenmerken:** Immunodeficiëntie, geen afstoting na transplantatie van levende cellen of weefsel, geen doding van virus-geïnfecteerde cellen [86](#page=86). * **Toepassingen:** Veel gebruikt in studies van het immuunsysteem en bij kankeronderzoek [86](#page=86). * **Levensverwachting:** 6-12 maanden [86](#page=86). * **Knockout muizen:** * Een bestaand gen is geïnactiveerd door vervanging of disruptie met artificieel DNA [86](#page=86). * Vaak leiden ze tot veranderingen in het muis fenotype (uiterlijk, gedrag, fysische of biochemische kenmerken) [86](#page=86). * Interessante modelorganismen voor het ophelderen van genfuncties [86](#page=86). * **Transgene muizen:** * Bezitten een vreemd gen (transgen) afkomstig van een ander organisme [86](#page=86). * Het transgen geeft de muizen een extra eigenschap [86](#page=86). * Voorbeelden: Leptine knockout muis, GFP transgene muis (groen fluorescerend proteïne afkomstig van de kwal *Aequorea victoria*) [86](#page=86). ### 4.9 Anatomische oriëntatie bij de muis Een gedetailleerde kennis van de anatomie van de muis is essentieel voor correcte procedures zoals dissectie en bloedname. #### 4.9.1 Algemene oriëntatie * Oriëntatie in termen van "links en rechts" vanuit het perspectief van de muis [87](#page=87). * Identificatie van vrouwtjes en mannetjes op basis van de ano-genitale afstand (kleiner bij vrouwtjes) en de aanwezigheid van testes onder de staart bij mannetjes [89](#page=89). #### 4.9.2 Dissectie van de muis * De cursus bevat gedetailleerde afbeeldingen van de dissectie van de muis, inclusief de nek-halsregio de borstholte (thorax) met organen zoals het hart, de longen en de thymus en de buikholte (abdomen) met diverse organen zoals milt, nieren, en de voortplantingsorganen [92](#page=92) [95](#page=95) [97](#page=97). ### 4.10 Practicum en examen #### 4.10.1 Vereisten voor het practicum * Meenemen van practicumnota's (beschikbaar op BB) en labojas . * Deelnemers werken per drie aan één dissectie . #### 4.10.2 Verplichtingen en examenpunten * **Voorbereiding:** Deelnemers dienen de practicumnota's vooraf door te nemen . * **Aanwezigheid:** Aanwezigheid is verplicht; afwezigheden worden genoteerd en vereisen een medisch attest bij ziekte . * **Examenverdeling:** Twee derde van de punten is voor Dierkunde (theorie-examen) en één derde voor Inleiding proefdierkunde (theorie-examen, practicum en permanente evaluatie) . * **Bonus-malussysteem practicum:** * Score '0': geen invloed op theoriescore . * Score '+1': +1 punt bij theoriescore . * Score '-1': 1 punt aftrek van theoriescore . * Score '-2': 2 punten aftrek van theoriescore . * **Belangrijk:** Het practicum proefdierkunde is leerstof; vragen over de dissectie kunnen ook op het theorie-examen voorkomen . --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Proefdier | Ieder levend, gewerveld dier dat wordt gebruikt of voorbestemd is voor proefdoeleinden, inclusief larvale vormen. | | Dierproef | Het aanwenden van een proefdier voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden waarbij het dier ongerief kan ondervinden. Dit omvat ook handelingen die leiden tot de ontwikkeling van een genetisch gemodificeerde lijn met pijnlijk fenotype. | | Ongerief | Meer dan alleen pijn; het omvat ook stress, alleen-zijn, angst, ziekte en speciale voeding die een proefdier kan ervaren tijdens een dierproef. | | Maximum tolerated dose (MTD) | De hoogste dosis van een stof die een proefdier kan verdragen zonder onacceptabele toxiciteit te vertonen. Deze wordt bepaald in studies met enkelvoudige dosis. | | Safety pharmacology | Een tak van de farmacologie die de potentiële schadelijke effecten van een geneesmiddel op vitale fysiologische systemen (zoals hart, bloedvaten en ademhaling) onderzoekt. | | Farmacokinetiek | De studie van hoe een geneesmiddel door het lichaam wordt opgenomen, verdeeld, gemetaboliseerd en uitgescheiden (ADME). | | Carcinogeniciteit | Het vermogen van een stof om kanker te veroorzaken. Dit wordt onderzocht via macroscopisch onderzoek, postmortem analyse en genetische testen. | | Teratogeniciteit | Het vermogen van een stof om aangeboren afwijkingen (misvormingen) bij de foetus te veroorzaken. Dit wordt geëvalueerd door macroscopisch en skeletonderzoek van de foetus. | | Locale tolerantie | De afwezigheid van corrosie, irritatie of sensitisatie van de huid of slijmvliezen na blootstelling aan een substantie. De Draize test en de local lymph node assay (LLNA) zijn voorbeelden van tests die dit onderzoeken. | | Histologische analyse | Microscopisch onderzoek van weefsels om celstructuren en afwijkingen te bestuderen. Dit gebeurt vaak na paraffine-inbedding van het weefsel. | | 3 R's concept | Een ethisch principe dat richtlijnen biedt voor het werken met proefdieren, bestaande uit Vervanging (Replacement), Vermindering (Reduction) en Verfijning (Refinement) van dierproeven. | | Vervanging (Replacement) | Het vervangen van proefdieren door alternatieve methoden, zoals in vitro tests, celculturen, computermodellen of het gebruik van lagere organismen (bv. ongewervelden). | | Vermindering (Reduction) | Het gebruik van methoden die leiden tot vergelijkbare informatie met minder dieren, of meer informatie met hetzelfde aantal dieren, bijvoorbeeld door een correct experimenteel design en statistische berekeningen. | | Verfijning (Refinement) | Het gebruik van methoden die het ongerief bij dierproeven opheffen of verminderen, en het dierenwelzijn verhogen, zoals het gebruik van anesthetica, analgetica en kooiverrijking. | | Germ-free dieren | Dieren die volledig vrij zijn van micro-organismen. Ze worden aseptisch geboren en gevoed met kunstmatige voeding, vaak gehouden in speciale isolatoren. | | Specific Pathogen Free (SPF) dieren | Dieren die vrij zijn van een specifieke lijst van pathogenen. Ze worden gehouden in ruimtes met speciale barrières om infecties met deze ziekteverwekkers te voorkomen. | | Conventioneel animalarium | Een faciliteit waar conventionele dieren worden gehouden, wat betekent dat ze niet specifiek vrij zijn gemaakt van ziekteverwekkers zoals in SPF-omgevingen. | | Immobilisatie | Het tijdelijk vastzetten van een proefdier om procedures veilig en nauwkeurig uit te kunnen voeren. Dit kan met de hand, met een restrainer of via anesthesie. | | Anesthesie | Een proces om de waarneming van pijn en andere negatieve gevoelens te blokkeren, variërend van lichte sedatie tot algehele narcose. | | Enterale toediening | De toediening van substanties via het maag-darmkanaal, bijvoorbeeld oraal via drinkwater, voer of gavage. | | Parenterale toediening | De toediening van substanties die niet via het maag-darmkanaal loopt, doorgaans via injectie of infuus (bv. intraveneus, intramusculair, subcutaan). | | Humane eindpunten | De eerste indicaties van pijn of ongerief bij een proefdier die gebruikt kunnen worden om het dier humaan te doden of de pijn te verlichten, teneinde onnodig lijden te voorkomen. | | Decapitatie | Het onthoofden van een dier, vaak gebruikt als methode voor humane euthanasie bij kleine proefdieren zoals muizen. |