Ppt1_Herhaling&PCRbasis.pdf

# Afspraken en organisatie van het labo Deze sectie van de cursus geeft een gedetailleerd overzicht van de afspraken met betrekking tot lessen, practica en examens, inclusief de beschikbaarheid van docenten en lesmateriaal [3](#page=3) [7](#page=7). ### 1.1 Algemene afspraken voor lessen (HC) Tijdens de hoorcolleges (HC) is het cruciaal om notities te nemen. Het gebruik van laptops is toegestaan, maar het gebruik van telefoons dient vermeden te worden. Er wordt een strikte houding verwacht wat betreft stilte, orde en respect. Indien er vragen zijn, dient men de hand op te steken om deze te stellen. Tijdige aanwezigheid is vereist; wie te laat is, komt beter niet [4](#page=4). ### 1.2 Afspraken voor practica (labo) De praktische sessies (labo) worden georganiseerd per specifieke groep en docent: * 2FBTA: Tamariche Buyle-Huybrecht [5](#page=5). * 2FBTB: Ilse Beck [5](#page=5). * 2FBTC: Tamariche Buyle-Huybrecht [5](#page=5). * 2MLTA: Tine Bourgois [5](#page=5). * 2MLTB: Tine Bourgois [5](#page=5). * 2MLTC: Rita Verhelst [5](#page=5). Aanwezigheid bij de labosessies is noodzakelijk om te kunnen slagen voor het vak. De labosessies bieden unieke inhoud en oefenkansen. Verdere specifieke afspraken voor het labo worden toegelicht tijdens de eerste labosessie. Er wordt zowel directe als uitgestelde feedback voorzien [5](#page=5). ### 1.3 Afspraken voor werkcolleges (WC) Voor de werkcolleges (WC) wordt verwacht dat studenten de voorgaande lessen al hebben meegenomen om een maximale leerwinst te behalen. Actief oefeningen maken en de verwerking van het labowerk zijn centrale elementen van de werkcolleges. Aanwezigheid bij de werkcolleges is noodzakelijk om te kunnen slagen. Er wordt directe feedback gegeven tijdens de werkcolleges [6](#page=6). ### 1.4 Beschikbaarheid lesmateriaal en communicatie Alle tijden voor hoorcolleges, werkcolleges en labosessies worden in de basis besproken. Lesmateriaal, inclusief de cursus en slides, kan gedeeld worden via ingesproken slides of online leerpaden. Vragen kunnen na de les of via Padlet gesteld worden. Een link naar het Padlet wordt voorzien [3](#page=3) [7](#page=7). ### 1.5 Afspraken voor examens De examens voor Labo Biotechnologie II bestaan uit twee delen [13](#page=13) [14](#page=14): #### 1.5.1 Deel A: Schriftelijk examen Dit deel van het examen telt voor 13/20 van het eindresultaat [14](#page=14). #### 1.5.2 Deel B: Examen met behulp van computer (BYOD) Dit deel van het examen telt voor 7/20 van het eindresultaat. Het is een Bring Your Own Device (BYOD) examen, wat betekent dat studenten een werkende, volledig opgeladen laptop moeten meebrengen om het examen te kunnen afleggen [14](#page=14). #### 1.5.3 Toegelaten leermateriaal en taal * **Leermateriaal:** Een niet-grafische rekenmachine is toegestaan. Andere types rekenmachines zijn niet toegestaan [14](#page=14). * **Antwoordtaal:** De standaardtaal voor antwoorden is Nederlands, waarbij specifieke vakterminologie wordt gebruikt. Indien voorafgaande toestemming van de docent is verkregen, is het mogelijk om in het Engels te antwoorden [14](#page=14). #### 1.5.4 Inhoud en studietips voor examens Het examen dekt theorie, inzicht, technologie, onderzoeksstrategie, en technische en digitale skills (vooral in het BYOD examen). De cursus bouwt systematisch op, en inzicht is gebaseerd op kennis en begrip [15](#page=15). > **Tip:** Begrijp de materie voordat je begint met studeren [15](#page=15). > **Tip:** Studeer regelmatig om de kennis te consolideren [15](#page=15). #### 1.5.5 Typische examenvraagtypes Het examen kan bestaan uit multiple choice vragen, open vragen en vraagstukken. Typische vraagtypes omvatten [16](#page=16): * Het interpreteren of voorspellen van resultaten [16](#page=16). * Het voorstellen van een onderzoeksstrategie [16](#page=16). * Het herkennen van een techniek of het uitleggen van het principe van een techniek [16](#page=16). * Het vinden van fouten in een techniek [16](#page=16). * Het bepalen wanneer welke techniek het meest geschikt is om te gebruiken [16](#page=16). * Oefenvragen die de stof behandelen [16](#page=16). --- # Concepten van moleculaire biologie en genetische variatie Dit onderwerp verkent de fundamentele principes van het centrale dogma van de moleculaire biologie en de verschillende manieren waarop genetische informatie kan variëren. ### 2.1 Het centrale dogma van de moleculaire biologie Het centrale dogma van de moleculaire biologie beschrijft de stroom van genetische informatie binnen een biologisch systeem. Deze stroom verloopt primair van DNA naar RNA en vervolgens naar eiwit [20](#page=20). * **DNA-replicatie:** DNA produceert kopieën van zichzelf om genetische informatie door te geven [20](#page=20). * **Transcriptie:** DNA wordt omgezet in RNA. De promotoractiviteit reguleert dit proces [20](#page=20). * **Translatie:** RNA wordt gebruikt als sjabloon voor de synthese van polypeptiden, die vervolgens opvouwen tot functionele proteïnen [20](#page=20). In eukaryoten ondergaat RNA maturatie, een proces dat kan bestaan uit [20](#page=20): * Splitsing (splicing) * Cap-structuur aan de 5'-uiteinde * Polyadenylatie aan de 3'-uiteinde De afbraak van RNA wordt beïnvloed door de natuurlijke half-life, die kan worden beïnvloed door de verkorting van de poly(A)-staart tijdens het afsterven van cellen of ziekteprocessen. Daarnaast zijn er cel- en ziekte-specifieke regulerende RNA's in eukaryoten [20](#page=20). #### 2.1.1 Genen, transcripten en genexpressie Een **gen** is een basiseenheid van erfelijkheid die codeert voor een functioneel molecuul, meestal een eiwit of een RNA-molecuul. Een **transcript** is het RNA-molecuul dat wordt gesynthetiseerd vanuit een gen. **Transcriptie** is het proces waarbij een DNA-sequentie wordt gekopieerd naar een RNA-sequentie. **Translatie** is het proces waarbij de sequentie van een messenger-RNA (mRNA) wordt omgezet in een sequentie van aminozuren om een polypeptide te vormen. De **opvouwing** van een polypeptide leidt tot de vorming van een functioneel proteïne [20](#page=20) [21](#page=21). ### 2.2 DNA-gerelateerde begrippen Verschillende moleculen en structuren spelen een rol in het manipuleren en organiseren van DNA [23](#page=23): * **Restrictie-enzymen:** Enzymen die DNA knippen op specifieke herkenningssequenties [23](#page=23). * **DNase:** Een enzym dat DNA afbreekt [23](#page=23). * **Exonuclease:** Een enzym dat nucleotiden van het uiteinde van een DNA-streng verwijdert, hetzij vanaf het 5'-uiteinde of het 3'-uiteinde [23](#page=23). * **DNA-polymerase:** Enzymen die de synthese van nieuwe DNA-strengen katalyseren [23](#page=23). * **RNA-polymerase:** Enzymen die de synthese van RNA-moleculen uit een DNA-template katalyseren [23](#page=23). * **Nucleosoom:** De basiseenheid van chromatine, bestaande uit DNA dat is opgewonden rond een kern van histon-eiwitten [23](#page=23). * **Haploïd:** Een cel of organisme dat slechts één set chromosomen heeft [23](#page=23). * **Diploïd:** Een cel of organisme dat twee sets chromosomen heeft, één van elke ouder [23](#page=23). #### 2.2.1 Soorten DNA DNA kan in verschillende vormen voorkomen, elk met specifieke locaties en functies binnen een cel [24](#page=24): * **Genomisch DNA:** Het volledige DNA-gehalte van een organisme, gelegen in de celkern [24](#page=24). * **Plasmide DNA:** Kleine, circulaire DNA-moleculen die voorkomen in bacteriën en sommige eukaryoten, onafhankelijk van het chromosomale DNA kunnen repliceren [24](#page=24). * **Chloroplast DNA:** DNA dat zich in chloroplasten bevindt, die verantwoordelijk zijn voor fotosynthese in planten en algen [24](#page=24). * **Mitochondriaal DNA:** DNA dat zich in mitochondriën bevindt, die betrokken zijn bij celademhaling [24](#page=24). ### 2.3 Genetische variatie Genetische variatie verwijst naar de verschillen in DNA-sequenties tussen individuen binnen een populatie. Deze variatie kan optreden in zowel coderende als niet-coderende sequenties van het DNA [25](#page=25). #### 2.3.1 Genetische eenheden en manifestatie * **Gen:** Een segment DNA dat codeert voor een functioneel product [21](#page=21) [25](#page=25). * **Allel:** Een van de verschillende varianten van een gen [25](#page=25). * **Locus (meervoud: loci):** De specifieke locatie van een gen op een chromosoom [25](#page=25). * **Genotype:** De genetische samenstelling van een individu met betrekking tot een bepaald kenmerk of reeks kenmerken [25](#page=25). * **Fenotype:** De observeerbare fysieke of biochemische eigenschappen van een individu, die een gevolg zijn van de interactie tussen het genotype en de omgeving [25](#page=25). #### 2.3.2 Repeat sequenties Repeat sequenties zijn segmenten van DNA die zich meerdere keren herhalen in het genoom [26](#page=26). * Deze repeats kunnen tot 500 basenparen (bp) lang zijn [26](#page=26). * Ze bevinden zich op specifieke plaatsen en zijn verspreid over het genoom [26](#page=26). * Een voorbeeld is de 300 bp Alu-repeat die bij primaten voorkomt. SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) zijn een type repeat sequenties die in labo 1 en 2 worden besproken [26](#page=26). #### 2.3.3 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) SNPs zijn de meest voorkomende vorm van genetische variatie in het menselijk genoom [27](#page=27). * Ze kunnen variatie veroorzaken in zowel coderende als niet-coderende gebieden van het DNA [27](#page=27). * Een SNP is een variatie in slechts één nucleotide op een specifieke positie in het genoom [27](#page=27). * SNPs worden in labo 3 en 4 verder behandeld [27](#page=27). --- # Principe en toepassing van PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek die in vitro een exponentiële amplificatie van een specifieke DNA-sequentie mogelijk maakt. Deze methode is essentieel om een grote hoeveelheid van een welbepaald DNA-fragment te verkrijgen, mits de sequentie aan de uiteinden bekend is om de juiste primers te kunnen kiezen [31](#page=31) [32](#page=32). ### 3.1 De techniek van PCR PCR is een cyclisch en exponentieel proces dat in vitro plaatsvindt. Het doel is de amplificatie van DNA wat resulteert in een grote hoeveelheid van een specifiek DNA-fragment [31](#page=31) [32](#page=32). #### 3.1.1 Benodigdheden voor PCR Om PCR succesvol uit te voeren, zijn de volgende componenten absoluut noodzakelijk [33](#page=33): * **ss DNA-templates:** Het DNA dat geamplificeerd moet worden [33](#page=33). * **Primerkoppel:** Een equimolaire mix van twee korte DNA-sequenties die complementair zijn aan de uiteinden van het te amplificeren fragment. De specificiteit van de PCR is afhankelijk van deze primers [32](#page=32) [33](#page=33) [39](#page=39). * **dNTP's (deoxynucleotide trifosfaten):** De bouwstenen voor de nieuwe DNA-strengen, ook in equimolaire concentraties aangeleverd. Deze kunnen al dan niet gemerkt zijn [33](#page=33). * **Hittebestendig DNA-polymerase:** Een enzym dat DNA kan synthetiseren, bestand tegen de hoge temperaturen die tijdens de denaturatiestap worden gebruikt. Een voorbeeld hiervan is Taq-polymerase [33](#page=33). * **DNA polymerase buffer:** Een oplossing die de optimale omstandigheden voor het DNA-polymerase biedt, inclusief de aanwezigheid van Mg\(^{2+}\) ionen, die vaak als cofactor fungeren [33](#page=33). #### 3.1.2 Het cyclische proces van PCR Het PCR-proces bestaat uit een reeks cycli, waarbij elke cyclus drie stappen omvat. Tussen de 25 en 45 cycli worden doorlopen [36](#page=36). 1. **Denaturatie:** Het dubbelstrengs DNA wordt verhit tot ongeveer 94°C tot 96°C gedurende 30 seconden. Dit proces scheidt de twee DNA-strengen van elkaar [34](#page=34) [36](#page=36). 2. **Annealing (hybridisatie):** De temperatuur wordt verlaagd naar 55°C tot 72°C gedurende 30 seconden. Bij deze temperatuur kunnen de primers binden aan hun complementaire sequenties op de enkelstrengs DNA-templates [36](#page=36). 3. **Elongatie (extensie):** De temperatuur wordt ingesteld op 72°C. Het hittebestendige DNA-polymerase begint vanaf de primers met de synthese van een nieuwe DNA-streng, waarbij het de template als leidraad gebruikt. Deze stap duurt ongeveer 1 minuut [36](#page=36). Na de laatste cyclus volgt vaak een finale elongatiestap van 8 minuten bij 72°C om ervoor te zorgen dat alle DNA-strengen volledig worden voltooid [36](#page=36). #### 3.1.3 Exponentiële amplificatie De amplificatie van DNA tijdens PCR verloopt exponentieel. Na elke cyclus wordt het aantal kopieën van het doel-DNA verdubbeld, wat leidt tot een zeer snelle toename van het aantal DNA-moleculen. De formule die de exponentiële synthese van begrensd DNA benadert, is [35](#page=35) [40](#page=40): $$ \text{Aantal product} \approx (2^n - 2(n+1)) \times x $$ [40](#page=40). Waarin: * $n$ staat voor het aantal cycli [40](#page=40). * $2^n$ staat voor de onbegrensde reactieproducten [40](#page=40). * $x$ staat voor het aantal template moleculen [40](#page=40). > **Tip:** Begrijp dat de exponentiële groei de kracht van PCR verklaart, maar in de praktijk zijn er limieten door reactiecomponenten die opraken of productinhibitie. #### 3.1.4 Visualisatie van PCR-producten De geamplificeerde DNA-fragmenten, de zogenaamde amplicons, worden visueel gemaakt na afloop van de PCR. Een veelgebruikte methode is gelelektroforese, waarbij de grootte van de DNA-fragmenten wordt bepaald op basis van hun migratiesnelheid door een gel [37](#page=37) [38](#page=38) [41](#page=41). De informatie die uit de visualisatie gehaald kan worden, omvat: * **Migratie-afstand:** Dit correleert met de grootte van het DNA-fragment [38](#page=38). * **Relatieve bandintensiteit:** Dit kan een indicatie geven van de hoeveelheid van het specifieke DNA-fragment [38](#page=38). * **Specificiteit van de reactie:** Het waarnemen van een band op de verwachte grootte duidt op een specifieke amplificatie [38](#page=38). > **Tip:** Het interpreteren van een gel is cruciaal. Een enkele, scherpe band op de juiste positie duidt op een succesvolle en specifieke PCR. Meerdere banden of banden op onverwachte posities kunnen wijzen op niet-specifieke amplificatie of problemen met de primers. #### 3.1.5 Specificiteit van de PCR-reactie De specificiteit van de PCR-reactie wordt bepaald door de match of mismatch tussen de primers en de DNA-template. Correct gekozen primers zullen alleen binden aan de beoogde sequenties, wat leidt tot de amplificatie van het gewenste DNA-fragment [32](#page=32) [39](#page=39). ### 3.2 Klassieke PCR en toepassingen Klassieke PCR is een detectiemethode die op het einde van de reactie plaatsvindt en wordt beschouwd als eindpuntbepaling. Deze methode is voornamelijk kwalitatief en laat grote verschillen in hoeveelheden opvallen. Analyse gebeurt typisch via gelelektroforese [41](#page=41). #### 3.2.1 Toepassingen van klassieke PCR Klassieke PCR kan gebruikt worden om te achterhalen wat de eigenschappen van het template DNA zijn. Bovendien zijn er diverse toepassingen voor het PCR-product zelf [42](#page=42). Voorbeelden van toepassingen zijn onder andere: * **Diagnostiek:** Detectie van pathogenen (virussen, bacteriën) of genetische afwijkingen. * **Forensisch onderzoek:** DNA-fingerprinting voor identificatie. * **Moleculaire biologie onderzoek:** Kloneren van genen, sequentiebepaling, genexpressieanalyse (in combinatie met andere technieken). * **Genetische modificatie:** Amplificatie van DNA-fragmenten voor genetische manipulatie. ### 3.3 Belangrijke factoren in PCR Verschillende factoren kunnen de efficiëntie en succes van een PCR-reactie beïnvloeden. Optimalisatie van deze factoren is cruciaal voor betrouwbare resultaten [43](#page=43). 1. **Temperatuur- en tijdsprofiel:** Elke stap in de PCR-cyclus (denaturatie, annealing, elongatie) vereist specifieke temperaturen en tijden voor optimale resultaten [36](#page=36) [43](#page=43). 2. **Het DNA-polymerase:** De keuze van het polymerase is belangrijk, met name de hittebestendigheid en de specifieke eigenschappen zoals processiviteit en efficiëntie [33](#page=33) [43](#page=43). 3. **dNTP concentraties:** De concentratie van de vier dNTP's moet voldoende zijn om de synthese van het DNA-product te ondersteunen, maar te hoge concentraties kunnen inhibitie veroorzaken [33](#page=33) [43](#page=43). 4. **De primers:** De lengte, sequentie, concentratie en thermodynamische eigenschappen van de primers zijn van essentieel belang voor de specificiteit en efficiëntie van de amplificatie [32](#page=32) [33](#page=33) [43](#page=43). 5. **Reactievolume:** Het totale volume van de reactie kan invloed hebben op de efficiëntie van de interacties tussen de componenten [43](#page=43). 6. **Zuiverheid en hoeveelheid template DNA:** Hoogwaardig template DNA zonder inhibitoren is noodzakelijk. De hoeveelheid template moet ook geoptimaliseerd worden; te veel of te weinig kan problemen geven [43](#page=43). 7. **Grootte en structuur amplificatieproduct:** De lengte van het te amplificeren fragment kan de efficiëntie van de PCR beïnvloeden. Langere fragmenten vereisen doorgaans langere elongatietijden en specifiekere polymerases [43](#page=43). 8. **Algemene set-up:** De correcte mix van alle componenten en het volgen van de juiste procedure is fundamenteel [41](#page=41) [43](#page=43). 9. **Apparatuur en materialen:** Het gebruik van een betrouwbare thermocycler en hoogwaardige verbruiksartikelen is belangrijk [43](#page=43). 10. **PCR problemen - troubleshooting:** Het identificeren en oplossen van veelvoorkomende problemen (bv. geen product, niet-specifieke producten) is een belangrijk aspect van het werken met PCR [43](#page=43). 11. **PCR toepassingsgebieden:** Het selecteren van de juiste PCR-methode en parameters voor een specifiek doel is cruciaal [43](#page=43). --- # Factoren en optimalisatie van PCR PCR-reacties worden beïnvloed door een complex samenspel van factoren die geoptimaliseerd moeten worden voor succesvolle amplificatie van specifieke DNA-sequenties [44](#page=44). ### 4.1 Het temperatuur- en tijdsprofiel van de PCR-cyclus Elke PCR-cyclus bestaat uit drie hoofdfasen met specifieke temperatuur- en tijdsinstellingen die cruciaal zijn voor de efficiëntie en specificiteit [44](#page=44). #### 4.1.1 Denaturatie De denaturatiefase breekt de dubbelstrengs DNA-template in enkelstrengs DNA, waardoor primers kunnen binden. Dit gebeurt doorgaans bij een temperatuur van 94°C gedurende 3 tot 5 minuten voor de eerste cyclus en 20 tot 30 seconden voor volgende cycli [44](#page=44). #### 4.1.2 Annealing Tijdens de annealingfase binden de primers aan hun complementaire sequenties op de enkelstrengs DNA-template. De annealingtemperatuur (Ta) is cruciaal voor de specificiteit van de PCR [46](#page=46) [48](#page=48). * **Ta te hoog**: Leidt tot een te lage bindingsaffiniteit, waardoor primers niet specifiek of helemaal niet binden [48](#page=48). * **Ta te laag**: Leidt tot aspecifieke binding van primers aan niet-complementaire sequenties, wat resulteert in niet-specifieke producten [48](#page=48). De annealingtijd moet ook geoptimaliseerd worden; te lang kan leiden tot aspecifieke binding, terwijl te kort de bindingsvorming kan belemmeren [48](#page=48). #### 4.1.3 Elongatie De elongatiefase is waar het DNA-polymerase nieuwe DNA-strengen synthetiseert vanaf de primers. De optimale temperatuur is meestal 72°C. De duur is afhankelijk van de lengte van het te amplificeren fragment [44](#page=44): * Tot 400 bp: 20 seconden [44](#page=44). * 400-1200 bp: 40 seconden [44](#page=44). ### 4.2 Het DNA-polymerase Het DNA-polymerase is het enzym dat verantwoordelijk is voor de DNA-synthese tijdens PCR. Verschillende thermostabiele polymerasen zijn beschikbaar, elk met hun eigen eigenschappen die de PCR-uitkomst kunnen beïnvloeden [50](#page=50). #### 4.2.1 Belangrijke DNA-polymerasen * **Taq DNA-polymerase** (van *Thermus aquaticus*): Dit is een veelgebruikt polymerase met een goede verlengingssnelheid en 5' naar 3' exonuclease activiteit. Het produceert DNA-uiteinden met een 3' A-uiteinde [51](#page=51). * **Pfu DNA-polymerase** (van *Pyrococcus furiosus*): Dit polymerase heeft een hogere nauwkeurigheid (fidelity) vanwege de 3' naar 5' exonuclease (proofreading) activiteit en is thermostabieler. Het produceert DNA-uiteinden zonder A-uiteinde [51](#page=51). * Andere polymerasen zoals Vent, Tth, en Pfx worden ook gebruikt, vaak met aangepaste eigenschappen voor specifieke toepassingen [50](#page=50). #### 4.2.2 Eigenschappen van polymerasen | Eigenschap | Taq DNA Polymerase | Pfu DNA Polymerase | | :----------------------------- | :------------------------ | :------------------------ | | Thermostabiliteit (t½ bij 95°C) | ~40 min | >120 min | | 5’ → 3’ exonuclease activiteit | Ja | Nee | | 3’ → 5’ exonuclease activiteit | Nee | Ja | | Verlengingssnelheid (nt/sec) | 75 | 60 | | Resulterend DNA-uiteinde | 3’ A | - | | Moleculair gewicht (kDa) | 94 | 92 | | Prijs / 500 Units | 242 EUR (goedkoper) | 400 EUR (duurder) | | Fidelity | Lager | Hoger | #### 4.2.3 Effect van exonuclease-activiteit * **5' → 3' exonuclease activiteit**: Kan de primer van het 5'-uiteinde van de template verwijderen, wat de verlenging kan belemmeren [52](#page=52). * **3' → 5' exonuclease activiteit (proofreading)**: Corrigeert fouten die tijdens de DNA-synthese worden gemaakt, wat leidt tot een hogere nauwkeurigheid van het PCR-product [52](#page=52). ### 4.3 dNTP's (deoxynucleotide trifosfaten) De dNTP's (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) zijn de bouwstenen voor de nieuwe DNA-strengen [53](#page=53). * Ze moeten in **equimolaire hoeveelheden** aanwezig zijn in het reactiemengsel, bij een pH van ongeveer 7 [53](#page=53). * De **optimale concentratie** is belangrijk; "less is more" kan soms leiden tot betere resultaten [53](#page=53). * **Gemodificeerde dNTP's** kunnen worden gebruikt voor specifieke toepassingen zoals sequencing (bijv. ddNTP's) of voor labelling (bijv. fluorescente, radioactieve, digoxigenin, of biotin-gekoppelde dNTP's) [53](#page=53). ### 4.4 Oligonucleotide primers Primers zijn korte, enkelstrengs DNA-moleculen die specifiek binden aan de template en als startpunt dienen voor DNA-polymerase [56](#page=56). #### 4.4.1 Primer-DUO Primers werken in paren: upstream en downstream, of forward en reverse [57](#page=57). #### 4.4.2 Concentratie en amplificatie Primers moeten equimolair aanwezig zijn, typisch tussen 0,1 en 1 µM in het reactiemengsel. Een hogere primerconcentratie leidt tot meer product, maar kan de specificiteit verminderen [58](#page=58). #### 4.4.3 Primer design criteria Goed primer design is essentieel voor specifieke en efficiënte amplificatie [59](#page=59). * **Lengte**: 14 tot 40 nucleotiden, met 20 nucleotiden als gangbaar [59](#page=59). * **GC-gehalte**: 45% tot 60% [59](#page=59). * **Smelt-temperatuur (Tm)**: Tussen 50°C en 65°C. De Tm van de forward en reverse primer moet zo dicht mogelijk bij elkaar liggen, wat geholpen kan worden door een Tm-calculator [59](#page=59). * De benaderende formule voor Tm is: $Tm = 2 \cdot (\#A+\#T) + 4 \cdot (\#C+\#G)$ [60](#page=60). * **Minimalisering van complementariteit**: Zowel zelf-complementariteit (dimeren) als inter-complementariteit tussen primers moet geminimaliseerd worden, met name aan het 3'-uiteinde [59](#page=59). * **GC/AT-balans**: Een uitgebalanceerde distributie is wenselijk [59](#page=59). * **Vermijden van herhalingen**: Langere herhalingen van G of C (langer dan 3 basen) moeten vermeden worden [59](#page=59). * **3'-einde**: Idealiter eindigt een primer met een C of G nucleotide om de bindingsstabiliteit te verhogen [59](#page=59). * **Specificiteit verificatie**: Gebruik bio-informatica tools zoals BLAST om de specificiteit van de primers te verifiëren [59](#page=59). #### 4.4.4 Annealingstemperatuur (Ta) De annealingtemperatuur (Ta) ligt typisch ongeveer 5°C lager dan de Tm van de primers ($Ta \approx Tm - 5^\circ C$). Een gradiënt PCR kan worden gebruikt om de optimale Ta te vinden. Het is belangrijk te onthouden dat de Tm van de primer verschilt van die van het amplicon [60](#page=60). #### 4.4.5 Primer dimer vorming Primer dimer vorming treedt op wanneer primers met elkaar binden in plaats van met de template, wat resulteert in de amplificatie van aspecifieke, korte producten. Dit is een teken dat het primerdesign herzien moet worden of dat de PCR-condities geoptimaliseerd moeten worden [61](#page=61) [62](#page=62) [63](#page=63) [91](#page=91). #### 4.4.6 Primer design en validatie software Diverse tools zijn beschikbaar voor primer design en validatie, waaronder Primer3 (freeware) en PrimerBLAST op NCBI [64](#page=64). #### 4.4.7 Merkingsmogelijkheden van primers Primers kunnen aan hun 5'-uiteinde worden gemerkt met bijvoorbeeld fluorescente labels, radioactieve isotopen of digoxigenin/biotin, wat gebruikt kan worden voor detectie of hybridisatie [66](#page=66). #### 4.4.8 Gebruik van primers voor sequentie toevoeging Primers kunnen worden ontworpen om specifieke sequenties toe te voegen aan de uiteinden van het PCR-product, zoals markers, promotors, of herkenningsplaatsen voor restrictie-enzymen [69](#page=69). #### 4.4.9 Gebruik van primers voor mutaties Door primers te ontwerpen met gewenste mismatches, kunnen gerichte mutaties in het PCR-product worden geïntroduceerd [71](#page=71). ### 4.5 Reactievolume Het optimale reactievolume voor PCR ligt meestal tussen 15 en 50 µl [75](#page=75). ### 4.6 Zuiverheid en componenten De zuiverheid van het template-DNA en de aanwezigheid van bepaalde inhibitoren kunnen de PCR sterk beïnvloeden [76](#page=76). #### 4.6.1 Hoeveelheid template DNA De hoeveelheid template DNA ligt doorgaans tussen 100 en 500 ng [76](#page=76). #### 4.6.2 Inhibitoiren Verschillende stoffen kunnen PCR remmen, waaronder EDTA, heparine, hemoglobine, fosfaat, ionaire detergentia, fenolen en porfyrines [76](#page=76). #### 4.6.3 Positieve componenten Bepaalde componenten kunnen, in lage concentraties, de PCR positief beïnvloeden: * **BSA (Bovine Serum Albumin)**: Bindt inhibitoren en stabiliseert het polymerase [77](#page=77). * **DMSO (Dimethyl sulfoxide)**: Bevordert annealing [77](#page=77). * **Betaïne**: Bevordert annealing [77](#page=77). * **Glycerol en PEG6000**: Stabiliseren het Taq-polymerase [77](#page=77). * **SDS en Triton X100**: Voorkomen aggregatie van het polymerase [77](#page=77). ### 4.7 Grootte en structuur van het amplicon De grootte en secundaire structuur van het te amplificeren fragment kunnen de efficiëntie beïnvloeden [78](#page=78). * Secundaire structuren in het amplicon moeten worden geminimaliseerd [78](#page=78). * Te lange sequenties (>1000 bp) kunnen problematisch zijn; tot 1000 bp is optimaal [78](#page=78). * Het aantal cycli moet geoptimaliseerd worden om competitie tussen primers en renaturatie te voorkomen [78](#page=78). ### 4.8 Algemene set-up: Mastermix Een mastermix is een geconcentreerde oplossing die alle componenten van de PCR bevat (buffer, dNTP's, primers, polymerase), behalve het template DNA. Dit verhoogt de reproduceerbaarheid en efficiëntie, en minimaliseert pipetteerfouten en contaminatie [79](#page=79) [84](#page=84). #### 4.8.1 Oefening mastermix berekening Voor een reactie van 25 µl per staal voor 4 stalen, met de gegeven componenten, moet het volume van elke component worden berekend voor de mastermix en het definitieve reactiemengsel, rekening houdend met een extra volume voor pipetteren [85](#page=85). ### 4.9 Controles en betrouwbaarheid Verschillende controles zijn essentieel om de betrouwbaarheid van PCR-resultaten te waarborgen [80](#page=80). #### 4.9.1 Soorten controles * **Negatieve controle (watercontrole)**: Bevat alle PCR-componenten behalve het template DNA. Detecteert contaminatie [80](#page=80) [83](#page=83). * **Positieve controle**: Bevat template DNA waarvan bekend is dat het het doelgen bevat. Verifieert dat de PCR-reactie werkt [80](#page=80) [83](#page=83). * **Interne controle**: Een spike-in DNA of een tweede primerset die parallel amplificeert in elk monster. Detecteert inhibitie of falen van de reactie in specifieke monsters [80](#page=80) [83](#page=83). #### 4.9.2 Voorkomen van contaminatie * Scheid pre- en post-PCR werkzaamheden strikt [81](#page=81). * Gebruik aparte werkzones en/of PCR-LAF-kasten [81](#page=81). * Draag handschoenen en ververs ze regelmatig [81](#page=81). * Gebruik wegwerpmaterialen waar mogelijk [81](#page=81). * Gebruik verschillende pipetten voor reagentia en DNA-stalen [81](#page=81). * Gebruik tips met filters [81](#page=81). #### 4.9.3 Betrouwbaarheid en specificiteit van PCR De nauwkeurigheid (fidelity) van PCR kan worden verhoogd door hogere dNTP-concentraties, lagere annealingtemperaturen, hogere primerconcentraties en lagere enzymconcentraties. De specificiteit kan worden verhoogd met behulp van PCR-afgeleiden zoals nested PCR, touchdown PCR of hot-start PCR [89](#page=89) [90](#page=90). #### 4.9.4 Probleemoplossing bij PCR * **Band op verwachte hoogte of andere hoogte in waterstaal**: Wijst op contaminatie [91](#page=91). * **Band op primer-dimeer hoogte in waterstaal**: Bewijs van primer-dimeer vorming, wat een herziening van primerdesign of optimalisatie van PCR-condities vereist [91](#page=91). * **Geen enkele band op gelelektroforese (ook niet in waterstaal)**: Kan duiden op een mislukte PCR, controleer primerdesign, template-integriteit, optimalisatie van condities, of afwezigheid van template. Een positieve controle kan helpen bij de diagnose [92](#page=92). * **Beschadigd template-DNA (door shearing, endonucleasen, UV)**: Kan de PCR-opbrengst beïnvloeden [93](#page=93). ### 4.10 PCR-apparatuur PCR-apparatuur, zoals thermocyclers, moet accuraat, uniform en reproduceerbaar zijn, met snelle temperatuurwissels en een verwarmd deksel om verdamping te voorkomen [86](#page=86). --- # Toepassingsgebieden en problemen bij PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) kent diverse analytische en preparatieve toepassingen, waarbij het ook belangrijk is om veelvoorkomende problemen te herkennen en op te lossen [94](#page=94). ### 5.1 Analytische toepassingen van PCR Analytische toepassingen van PCR richten zich op het detecteren en kwantificeren van specifieke DNA-sequenties [94](#page=94). #### 5.1.1 Detectie van aanwezigheid/afwezigheid PCR kan worden ingezet om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifieke DNA-sequentie in een monster te bepalen. Dit is bijvoorbeeld relevant bij diagnostiek, zoals het aantonen van pathogenen of genetische afwijkingen [94](#page=94). #### 5.1.2 Kwantificatie van DNA Naast detectie kan PCR ook gebruikt worden om de hoeveelheid van een specifiek DNA-doelwit te bepalen. Dit wordt vaak gedaan met behulp van real-time PCR (qPCR), hoewel de basisprincipes van amplificatie van het doelwit gelden [94](#page=94). #### 5.1.3 Analyse van mutaties en verwantschappen PCR is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van genetische variaties, waaronder mutaties. Dit heeft toepassingen in diagnostiek, forensisch onderzoek (identificatie) en het vaststellen van verwantschappen [94](#page=94). ### 5.2 Preparatieve toepassingen van PCR Preparatieve PCR-toepassingen zijn gericht op het produceren van grotere hoeveelheden van een specifiek DNA-fragment voor verder gebruik [95](#page=95). #### 5.2.1 Isolatie van genomische en cDNA klonen PCR kan gebruikt worden om specifieke fragmenten van genomisch DNA of cDNA te amplificeren. Deze geamplificeerde fragmenten kunnen vervolgens worden gebruikt voor verdere moleculaire biologische technieken zoals klonering en sequencing [95](#page=95). #### 5.2.2 Modificatie en toevoeging van sequenties Door het ontwerpen van primers met specifieke sequenties, kunnen nieuwe genetische informatie of modificaties aan het PCR-product worden toegevoegd [95](#page=95). ##### 5.2.2.1 Inbouwen van mutaties Met PCR kunnen doelgerichte mutaties in een DNA-sequentie worden geïntroduceerd. Dit is waardevol voor functionele studies van genen of voor het creëren van gemodificeerde eiwitten [95](#page=95). ##### 5.2.2.2 Inbouwen van gemerkte dNTPs Het is mogelijk om gemerkte dNTPs (nucleotiden) in het PCR-product in te bouwen, zowel intern in de sequentie als aan de uiteinden. Deze labels kunnen radioactief, fluorescent of ander type zijn en worden gebruikt voor detectie of analyse [95](#page=95). ### 5.3 Veelvoorkomende problemen en troubleshooting Bij het uitvoeren van PCR kunnen diverse problemen optreden die de betrouwbaarheid en opbrengst van de reactie beïnvloeden. #### 5.3.1 Optimale reactiecondities Het succes van een PCR-reactie hangt af van verschillende factoren, waaronder de temperatuurcyclus, de concentratie van reagentia en het ontwerp van de primers [96](#page=96). ##### 5.3.1.1 De smelttemperatuur (Tm) en annealing temperatuur (Ta) De smelttemperatuur (Tm) van een primer is de temperatuur waarbij de helft van de primer-DNA-hybriden gedissocieerd is. De annealing temperatuur (Ta) van de PCR-reactie is cruciaal voor de specificiteit van de primerbinding. Een Ta die te laag is, kan leiden tot aspecifieke bindingen en meerdere banden in het PCR-product. Een Ta die te hoog is, kan de primerbinding verhinderen en resulteren in een zwak of afwezig PCR-product [97](#page=97) [98](#page=98). > **Tip:** De annealing temperatuur (Ta) wordt doorgaans ingesteld op ongeveer 5°C lager dan de laagste Tm van de gebruikte primers om een efficiënte en specifieke annealing te garanderen [97](#page=97). ##### 5.3.1.2 Gebruik van dNTP's dNTP's (deoxyribonucleotide trifosfaten) zijn de bouwstenen voor de nieuwe DNA-streng die tijdens de PCR wordt gesynthetiseerd. Een correcte concentratie is essentieel voor een efficiënte amplificatie [98](#page=98). > **Oefening:** Schets de algemene structuur van een dNTP [98](#page=98). #### 5.3.2 Contaminatie Contaminatie van PCR-reagentia met doelwit-DNA is een veelvoorkomend probleem dat kan leiden tot valspositieve resultaten [98](#page=98). > **Oefening:** Hoe zou je contaminatie van PCR-reagentia met doelwit-DNA controleren [98](#page=98)? #### 5.3.3 Interpretatie van resultaten Het interpreteren van PCR-resultaten vereist kennis van de verwachte uitkomst en mogelijke afwijkingen [98](#page=98). ##### 5.3.3.1 Meerdere banden Wanneer een PCR-reactie, waarbij één band wordt verwacht, resulteert in twee of meer zichtbare banden op een gel, kan dit duiden op aspecifieke amplificatie of de aanwezigheid van meerdere DNA-fragmenten van vergelijkbare grootte in het monster. Dit kan worden veroorzaakt door een te lage annealing temperatuur of niet-specifieke primerbinding [98](#page=98). > **Oefening:** Hoe kan je dit interpreteren: je voert een PCR uit, verwacht 1 band, maar er zijn er 2 of meer te zien [98](#page=98)? #### 5.3.4 Verhogen van de betrouwbaarheid Verschillende strategieën kunnen worden toegepast om de betrouwbaarheid van een PCR-reactie te verhogen. Dit omvat het optimaliseren van de reactiecondities, het gebruik van hoogwaardige reagentia en het uitvoeren van controles [96](#page=96). > **Oefening:** Geef een manier om gemerkt PCR product te bekomen [98](#page=98). > **Oefening:** Bedenk 3 situaties waarin je PCR zou gebruiken [98](#page=98). --- ## Veelgemaakte fouten om te vermijden - Bestudeer alle onderwerpen grondig voor examens - Let op formules en belangrijke definities - Oefen met de voorbeelden in elke sectie - Memoriseer niet zonder de onderliggende concepten te begrijpen

| Term | Definition | |------|------------| | Polymerase chain reaction (PCR) | Een moleculaire techniek die wordt gebruikt om specifieke DNA-fragmenten exponentieel te amplificeren in vitro. Dit proces maakt het mogelijk om grote hoeveelheden van een bepaald DNA-stuk te verkrijgen voor analyse of manipulatie. | | Centraal dogma van de moleculaire biologie | Het principe dat genetische informatie stroomt van DNA naar RNA door transcriptie, en van RNA naar eiwitten door translatie. Dit is een fundamenteel concept in de moleculaire biologie. | | Gen | Een segment van DNA dat de instructies bevat voor de synthese van een functioneel product, zoals een eiwit of een functioneel RNA-molecuul. Genen zijn de basiseenheden van erfelijkheid. | | Genetische variatie | Verschillen in DNA-sequenties tussen individuen binnen een populatie. Dit kan leiden tot verschillen in fenotype en is cruciaal voor evolutie en diversiteit. | | DNA-replicatie | Het proces waarbij een DNA-molecuul wordt gekopieerd om twee identieke dochtermoleculen te produceren. Dit is essentieel voor celdeling en erfelijkheid. | | Semi-conservatief | Beschrijft het replicatiemechanisme van DNA, waarbij elke nieuwe dubbele helix bestaat uit één originele (ouderlijke) streng en één nieuw gesynthetiseerde streng. | | Bidirectioneel | Verwijst naar de replicatievorken die zich in twee tegengestelde richtingen voortbewegen vanaf een oorsprong van replicatie (ori). | | Leading strand | De DNA-streng die continu wordt gesynthetiseerd in de 5’ naar 3’ richting tijdens de replicatie, omdat deze beweegt in de richting van de replicatievork. | | Lagging strand | De DNA-streng die discontinu wordt gesynthetiseerd in korte fragmenten, bekend als Okazaki-fragmenten, omdat de synthese tegengesteld is aan de beweging van de replicatievork. | | Primer | Een kort stukje enkelstrengs DNA of RNA dat dient als startpunt voor DNA-synthese door DNA-polymerase. In PCR is een primerpaar essentieel om de te amplificeren regio te definiëren. | | Denaturatie | Het proces waarbij de dubbele helixstructuur van DNA wordt verbroken door hitte (typisch rond 95°C), wat resulteert in twee enkelstrengs DNA-moleculen die kunnen dienen als template. | | Annealing | Het proces waarbij primers specifiek binden aan complementaire sequenties op de enkelstrengs DNA-templates tijdens de PCR. De temperatuur hiervoor (annealingstemperatuur, Ta) is cruciaal voor specificiteit. | | Elongatie | De fase van PCR waarin DNA-polymerase de primer verlengt door nucleotiden toe te voegen, een nieuw DNA-streng te synthetiseren die complementair is aan het template-DNA. | | Amplicon | Het DNA-fragment dat wordt gegenereerd tijdens de PCR-reactie. Dit is de geamplificeerde sequentie tussen de twee primers. | | Exponentiële amplificatie | Het principe van PCR waarbij het doel-DNA-fragment in elke cyclus verdubbelt, wat leidt tot een zeer snelle toename van het aantal kopieën. | | End-point determination | Een kwalitatieve analyse in PCR waarbij het product pas aan het einde van de reactie wordt gevisualiseerd, wat informatie geeft over de aanwezigheid van het amplicon maar niet over de hoeveelheid tijdens de reactie. | | Gelelektroforese | Een techniek die wordt gebruikt om DNA-fragmenten te scheiden op basis van grootte door een elektrisch veld toe te passen op een gelmatrix. | | Specificiteit van PCR | De mate waarin PCR een specifiek doel-DNA-fragment amplificeert zonder andere sequenties te produceren. Dit wordt sterk beïnvloed door primerontwerp en annealingstemperatuur. | | Primer dimeer | Onbedoelde producten gevormd door de interactie en amplificatie van primers met zichzelf of met elkaar, wat kan leiden tot aspecifieke banden in PCR. | | Tm (Melting temperature) | De temperatuur waarbij 50% van een dubbelstrengs DNA-molecuul gedissocieerd is tot enkelstrengs moleculen. Dit is een belangrijke parameter voor het ontwerpen van primers. | | Ta (Annealing temperature) | De optimale temperatuur voor het binden van primers aan de DNA-template tijdens de PCR. Deze temperatuur ligt doorgaans iets lager dan de Tm van de primers. | | DNA-polymerase | Een enzym dat verantwoordelijk is voor het synthetiseren van DNA-strengen. Verschillende thermostabiele DNA-polymerases worden gebruikt in PCR, zoals Taq-polymerase. | | dNTPs (Deoxyribonucleoside triphosphaten) | De bouwstenen (A, T, C, G) die door DNA-polymerase worden gebruikt om nieuwe DNA-strengen te synthetiseren tijdens replicatie en PCR. | | Mastermix | Een geconcentreerde oplossing die alle benodigde reagentia voor PCR (buffer, dNTPs, enzym, primers) bevat, behalve het template-DNA, om de voorbereiding van meerdere monsters te vereenvoudigen en te standaardiseren. | | Negatieve controle | Een controle in PCR die geen template-DNA bevat om contaminatie van reagentia te detecteren. Een band in de negatieve controle duidt op contaminatie. | | Positieve controle | Een controle in PCR die een bekend DNA-fragment bevat dat gegarandeerd zal worden geamplificeerd. Dit bevestigt dat de PCR-condities correct zijn en de componenten functioneren. | | Interne controle | Een controle die in hetzelfde monster wordt geamplificeerd als het doel-DNA, maar met een andere primer set. Het dient om variaties in monsterbehandeling of PCR-efficiëntie te monitoren. | | Contaminatie | De ongewenste aanwezigheid van vreemd DNA of reagentia die de PCR-resultaten kunnen beïnvloeden. Strikt laboratoriumprotocol is nodig om dit te voorkomen. | | FIDELITY (Trouw) | De nauwkeurigheid van een DNA-polymerase, d.w.z. hoe goed het nucleotiden correct inbouwt zonder fouten te maken. Polymerases met hoge fidelity hebben 3’→5’ exonuclease activiteit (proofreading). |